CN1234077A - C.Elegans 时钟基因clk－1的结构和功能保守 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及clk－1基因,其具有在细胞生理水平上的有关于发育速率和寿命的功能,其中的clk－1突变体较之于野生型具有更长的寿命和改变的细胞代谢。还提供了诊断或预测患者的癌症的方法,包括步骤:a)取患者的组织标本;b)分析步骤a)所得的组织标本的DNA以测定人类clk－1基因是否改变,其中的人类clk－1基因的改变是癌症的标志。还提供了治疗患者的导致组织和/或器官的生理速率下降的病理状态的方法。

Description

C.Elegans时钟基因clk-1 的结构和功能保守
本发明涉及鉴定clk-1以及表明clk-1基因补充clk-1表型并恢复正常的寿命。
线虫Caenorhabditis elegans的clk-1基因的活性控制该蠕虫的生活是如何地快以及它们的死亡有多迅速。在clk-1突变体中，下调了生理过程中宽范围的时间控制。这使得诸如蠕虫早期细胞周期，其胚胎和胚胎后发育的各种过程，以及诸如游泳，咽泵，和排粪的节律性成虫行为的平均周期延长(A.Wong等，遗传139,1247(1995))。clk-1突变体还有延长的寿命。这种发育和行为的时空控制的多效变更确定了时钟(clk)表型，这也在带有任一clk-2,clk-3和gro-1基因突变的蠕虫中表现出来(A.Wong等，遗传139,1247(1995))；S.Hekimi等，遗传141,1351(1995))。这四个基因的突变在遗传上相互作用影响发育率和寿命(B.Lakowski等，科学272,1010(1996))。
clk-1突变体蠕虫的许多表型源自据信由各自独立的生物钟控制的过程的变化(A.Wong等，遗传139,1247(1995))。这些过程具有从亚秒到数小时的很不相同的周期，且不能预先知道其与任何机理相关联(A.Wong等，遗传139,1247(1995))。我们推测clk-突变影响中枢生物钟的功能，其能确保这些不同的过程的控制和瞬时协调，并控制有机体对温度变化的反应(A.Wong等，遗传139,1247(1995))。clk-1表型的一个关键特征是clk-1突变表现出母体效应：源于杂种雌雄同体(clk/+)的纯合突变(clk-1/clk-1)子代是表型野生型的；只有源于纯合母体的纯合突变体才表现出clk表型。母体拯救不仅影响早期事件如胚胎发育，还延及成熟期表型如排粪和寿命(A.Wong等，遗传139,1247(1995))。这点和其它证据(A.Wong等，遗传139,1247(1995)；S.M.Jazwinski，科学273,54(1996))提示了普遍的时间调控机制-“时钟”的存在，其内在速率是确定的，或“设置好的”，其在发育早期并随后在蠕虫整个生命周期中影响各种时间控制过程。
非常需要提供clk-1而且证明clk-1基因补充clk-1表型并恢复正常的寿命。
本发明的一个目的是提供clk-1并证明clk-1基因补充clk-1表型并恢复正常寿命。
按照本发明，提供了补充clk-1表型并恢复正常寿命的clk-1基因。
所克隆的clk-1基因应使我们更好地理解其生物学功能和其可能的实验或药物用途。也可让我们鉴定其它与clk-1相关的基因。若人clk-1基因在转化的细胞和细胞系中有变化，则提示其与癌症相关并可用于癌症诊断。
按照本发明，提供了clk-1基因，其在细胞生理水平上具有与发育速率和寿命有关的功能，其中的clk-1突变体与野生型相比具有更长的寿命和变化的细胞代谢。
按照本发明，提供了诊断和/或预测患者的癌症的方法，包括步骤：
a)从所述患者取组织标本；
b)分析步骤a)所得的组织标本的DNA以测定人clk-1基因是否改变，其中人clk基因的改变是癌症的标志。
按照本发明，提供了长寿的小鼠模型，包括鼠clk-1基因的基因剔除。
按照本发明，提供了增加动物或患者寿命的方法，包括下调clk-1基因和/或其同系物的表达的步骤。
按照本发明，提供了治疗那些引起患者的组织和/或器官的生理速率减慢的病理状态的方法，包括对所说病人用一种药剂给药以促进组织和/或器官的clk-1基因特异性超表达以增加生理速率。
图1示clk-1的克隆；
图2示由clk-1(e2519)所表现的生命延长被含有野生型clk-1基因的染色体外列阵的存在而拯救。
图3A示线虫CLK-1(序列13)，大鼠COQ7(序列14)和酵母Cat5p/Coq7p序列(序列17)以及鼠(序列15)和人CLK-1(序列16)同系物的部分序列的排列；
图3B示在CLK-1序列(序列13)和其同系物内的重复；
图4示线虫clk-1基因恢复酵母Δcat5/coq7无效突变体利用甘油作为碳源的能力；
图5示TOC-1 C.elegans序列(序列18)与人(序列19)和小鼠(序列20)的同源序列的比较；
图6示表达构建体pPD9577.20P；
图7示三种基因型的每个动物的排粪周期长度；以及
图8示野生型(N2)和表达CLK-1∷GFP并带有clk-1的两个野生型染色体拷贝的动物的存活时间。
Caenorhabditis elegans clk-1基因的突变影响生物学时间调控并延长寿命。按照本发明，我们报告了clk-1的鉴定并证明克隆的基因补充了clk-1表型并恢复正常的寿命。CLK-1在包括人的真核生物中是保守的，并在结构上类似于酵母代谢调节剂Cat5p/Coq7p。这些蛋白含有核心82残基(TRC)区域的串联重复。clk-1补充ΔCat5/coq7突变体表型，证明了clk-1和CAT5/COQ7有共同的生物学功能并且clk-1在细胞生理水平上起作用。而且，这支持了动物衰老以细胞代谢为基础的观点。
clk位于第Ⅲ连锁群，在基因dpy-17和lon-1之间(A.Wong等，遗传139,1247(1995)；S.Hekimi等，遗传141,1351(1995)；图1)。顶线示clk-1区域的遗传图。以前已将clk-1绘到该区域(A.Wong等，遗传139,1247(1995))；S.Hekimi等，遗传141,1351(1995))而我们明确了其位置，得到了图示所示的图位。
本文列出一些测拯救活性的粘粒(C.Mello和A.Fire，细胞生物学方法，48,451(1995))。持续了许多代的稳定的拯救仅得自ZC400。+表示拯救了全部表型；±表示仅拯救了排粪表型；-表示无拯救。pRA41是带有内部SacⅠ缺失的ZC400的衍生物。pRA41的插入片段含有三个预期的基因，ZC395.10,ZC395.3和ZC395.2(ACeDB；F.H.Eeckman等，细胞生物学方法，48,583(1995))。ZC 395.2中的缺失消除了clk-1拯救活性，而pRA40拯救clk-1，提示ZC395.2是clk-1基因。S=SacⅠ,X=XbaⅠ,E=EcoRⅠ。线虫EST CEES×93F(ACeDB；F.H.Eeckman等，细胞生物学方法，48,583(1995))配对于toc-1的3’端。
我们第一次描述了clk基因是toc-1和clk-1两个基因的操纵子的一部分。然而，除了其在某种意义上类似于转运二价阳离子的穿膜转运蛋白家族(CDF家族)的成员(Paulsen I.T.和Saier M.H.，膜生物学杂志，156:99-103(1997))外，我们几乎不知道toc-1编码的蛋白质(TOC-1)的具体细节。现在，我们通过数据库检索已鉴定了我们称之为htoc-1的toc-1的真正的人类同系物。我们使用了几个基因文库入口(基因文库登录号：AA214573,AA134438,AA134439,AA213498,AA505430)得到了预测带有与TOC-1具高度同源性的蛋白质的共有序列(图5)。相同的残基以黑体表示并该残基上面用黑点标示。当时，还没有得到人的该序列的中间部分而仅得到了小鼠的该序列的C-末端部分。
还从数据库入口(基因文库登录号：AA 03268A,AA 033329,AA097624)建立了同源的小鼠序列(mtoc-1)并且也示于图5中。
我们重新测序了源于e2519,qm30和qm51的clk-1。e2519中,G→A的转换引入了新的HindⅢ位点并引起了绝对保守的残基中的E→K的错义变更(见图3)。qm30导致了起始于e2519中损伤的3′端的12个核苷酸并包括了整个最后的外显子的590bp的缺失。qm51改变了第2内含子剪接受体中的绝对保守的末端G。测序具有基本相同于e2519表型的等位基因qm11显示它们有相同的损伤。不太可能独立地得到两次相同的突变，这提示了原先的等位基因的丢失。
测定源自候选区域的重叠粘粒(图1)的基于微注射到clk-1突变体的拯救突变表型的能力。发现粘粒ZC400同时拯救了较强的(qm30)和较弱(e2519)的clk-1等位基因的突变表型，并完全地重现了母体效应。若干代(10-20)后，含有ZC400的染色体外列阵失去了其完全拯救clk-1突变体的慢生长表型的能力但保持了拯救慢排粪能力。这种发育表型拯救的丢失可能反映了C.elegans的普遍现象，而转基因列阵在种系和早期胚胎中的列阵的转录沉默可能源自其复杂的重复结构(C.Mello和A.Fire，细胞生物学方法，48,451(1995))。如果是这样，则其暗示了clk-1(+1)的更晚的合子表达足以拯救成年行为缺陷，但拯救慢发育需要母体或早期合子表达。
注射AC400亚克隆将clk-1定位到1.9kb EcoRⅠ片段。含此片段的染色体外列阵使至少一代的发育和行为速率恢复到野生型速度。然而，稳定转化的谱系没有表现了慢生长表型的改善，但我们观察到这种蠕虫在成年时以野生型的速率排粪。预计此片段含有单一的在三个clk-1等位基因中被改变的基因，ZC395.2，从而证实了此基因的身份为clk-1(图1)。较弱的clk-1等位基因是错义突变；而较强的一个涉及整个外显子的破坏。
我们事先已证明clk-1突变体的所有表型都可完全地母体拯救，所有的等位基因呈现出相同的表型模式并且所有的等位基因均不能互相补充全部表型。若是这样，本文所提供的分子证据无可争辨地证明clk-1基因的突变导致了clk-1突变蠕虫中所见的全部表型。
clk-1基因适好位于预测的基因，ZC 395.3(图1)的下游。用反转录PCR，我们建立了这两个基因的5′和3′端以及其剪接模式。我们发现clk-1完全地反式剪接(D.A.Zorio等，自然372,270(1994)；J.Spieth等，细胞73,521(1993))到剪接前导序列SL2(在其5端)，而上游基因则反式剪接到SL1，在这两种情况均位于与起始密码子AUG密码子紧密相邻的上游。该上游基因的3′端位于自clk-15′端的105bp处。反式剪接模式和基因间距离是构建入C.elegans的操纵子中的基因中典型的(T.Blumenthal,TreadsGenet,11,132(1995))，提示这两个基因共享该上游基因的5′启动子。clk-1中的内含子是被正常预测的，但ZC 395.3(图1C)的真正产物并无第一个预测的外显子。该基因可能编码类似于二价金属离子转运蛋白家族的蛋白质，所以我们将带有clk-1的操纵子中的转运蛋白样蛋白质命名为toc-1。虽然，在C.elegans的操纵子中有同时出现功能相关的基因并被协调表达的情况(T.Blumenthal,Trends Genet,11,132(1995))，但clk-1(见下文)和toc-1间无明显的功能关系。
clk-1突变体的一个表型是其延长的寿命。为证明clk-1(e2519)中的损伤而非遗传背景的差异导致了突变蠕虫的延长的寿命，我们检测了带有含ZC400的染色体列阵qm Ex109的以及那些带有含clk-1 1.9kb EcoRⅠ片段的qmEx96染色体外列阵的完全拯救的e2519突变体蠕虫的寿命。
作为成虫，e2519；qm Ex96蠕虫表现出其排粪循环的完全拯救，即使其发育是缓慢的。我们发现qmEx96或qmEx109的存在恢复了野生型寿命到e2519突变蠕虫的程度。e2519；qmEx109蠕虫的寿命与N2蠕虫的寿命难分伯仲(图2)。clk-1(e2519)所表现寿命延长为含野生型的clk-1基因的染色体外列阵的存在而拯救。图示了自0天于2.5小时的时间内被产作卵后的给定天数的蠕虫存活的百分率；N2(□),clk-1(e2519)(●),e2519；qmEx109(Δ)(图2)。对于e2519；qmEx96(Δ)，使用了6小时的限制孵化。带有标准误差的平均寿命分别是20.4±0.8,28.1±1.4,20.2±0.9和20.4±0.7天。将蠕虫整个生命周期均维持在18℃并如前述(B.Lakowski等，科学272,1010(1996))给其寿命计分。样本大小为除了e2519；qmEx109是48外，每个表型为50个蠕虫。
预测clk-1编码187残基蛋白CLK-1，其类似于酿酒酵母基因(CAT5/COQ7的产物)(Cat5p/Coq7p；M.Proft等，EMBO J.14,6116(1995)；B.N.Marbois等，生物化学杂志，271,2995(1996))。也描述了Cat 5p/Coq7p的大鼠同系物(T.Jonassen等，Arch.Biochem.Biophys.330,285(1996))。，虽然无论是从长度来看还是从组成来看(图3A)，其N-末端没表现出类似性，这三个蛋白在177个残基上有33％的相同性。CLK-1在线虫，酵母和啮齿类间是高度保守的。在该大鼠蛋白质的长度内，CLK-1与其酵母和大鼠同系物间的相同性分别为42％和53％。导入的缺口标以虚线。clk-1和CAT5/COQ7的功能减少的等位基因都是已知的，并均都发生于绝对保守的残基(本文以箭头指出，B外加框，下文)；Coq 7-1中G→D(B.N.Marbois等，生化杂志，271,2995(1996)和e2519中E→K。大鼠序列(基因文库登录号U46149)似乎在残基82-84和151-154的附近含有测序错误(标以黑点)。用该大鼠基因的序列，我们能鉴定并部分测序clk-1的鼠和人类同系物。
在可得的43和126个氨基酸的预测序列中，人类和小鼠蛋白与大鼠蛋白分别有93％和97％的相同性。这五个序列与任何其它已知的序列不相关，并且几乎没有任何其生化功能的启示。
该蛋白序列被分别剪接并排列以显示82个残基的串联重复的核心区域的存在，我们称CLK-1中的串联重复区域(或Cat5p/Coq7p或大鼠(DQ)；图3B)为TRC区域。图3A中所示的每个序列被剪接并排列以显示串联重复的TRC区域的存在。N和C末端区域都有单一的插入位点；这些已从该排列中排除，以小黑点标记。那些在四个或更多个该6个区域内相同的残基以黑体表示，那些在类似四个或多个区域内相似的以深灰色表示。有疏水残基的绝对保守位点以φ标示。
总之，在所有的重复中，残基在8个位置上绝对保守，并且在另外的12个位置上，全部残基是类似的。对于每一蛋白质，其两个TRC区域是并列的而没有任何连接序列。对于每一区域，似乎仅有一个允许插入的位点，其侧面是预测为螺旋的区域(图3B)。在这些螺旋区域中，保守的疏水残基的间距(CLK-1的残基34-56和116-144)提示了蛋白一蛋白互相作用的界面，如二聚化表面(图3B)。在该蛋白质的一级结构中所见的二区域结构应该是在蛋白质的三级结构水平上的两个相同区域的反映；这些蛋白质可能由仅含有一个区域但能同源二聚化的前体进化而来。
两个最强的clk-1等位基因(A.Wong等，遗传139,1247(1995))是qm30(消除了35个密码子的590bp缺失，包括整个最后的外显子以及该基因的全部3′非翻译区)以及qm51(消除了第二个内含子的剪接受体位点的点突变(图1))。次严重的等位基因e2519是导致谷氨酸到赖氨酸变化的点突变(E148K；图1和3)。由于在e2519蠕虫中所检测的表型是野生型和qm30间的定量中间体，所以与野生型蠕虫相比，似乎存在clk表型的严重度与残留的clk基因活性间的相关性。
什么是酵母同系物CAT5/COQ7的功能？野生型酵母在以葡萄糖作为碳源时生长最快。当存在葡萄糖时，包括那些涉及糖异生的许多基因的表达受到强烈的阻抑。当将酵母转移到非可发酵的碳源如甘油和乙醇时，编码糖异生酶烯醇丙酮酸羧激酶的PCK1的脱阻抑需要CAT5/COQ7的活性(M.Proft等，EMBO J.14,6116(1995))。该PCK1阻抑由在其启动子中的碳源应答因子(CSRE)所介导(M.Proft等，EMBO J.14,6116(1995))。除了对特异的CSRE转录激活复合物的形成是必需的外，CAT5/COQ7似乎还涉及糖异生的其它酶，以及呼吸作用的和乙醛酸循环的那些酶的表达的控制(M.Proft等，EMBO J.14,6116(1995))。但是，其在所有这些过程中的作用似乎是间接的并且可能是复杂的调控机制的部分。比如，CAT5/COQ7受部分葡萄糖阻抑，并且其在脱阻抑条件下的表达需要CAT1/SNF1和CAT8以及CAT5/COQ7本身的活性(M.Proft等，EMBO J.14,6116(1995))。
CAT5/COQ7特征还在于涉及泛醌(辅酶Q)生物合成(B.N.Marbois等，生化杂志，271,2995(1996))。cat5/coq7突变体不合成此脂溶性二电子载体，而该载体是非发酵性生长所必需的。在带有CAT5/COQ7中点突变的酵母株中的泛醌生物合成中间体的化学特征(B.N.Marbois等，生化杂志，271,2995(1996)；图3)表明了5-去甲氧泛醌(生物合成途径的晚期中间体)的积累。然而，据报道缺失了CAT5/COQ7的菌株积累了3-六异戊烯基-4-羟基苯甲酸(较早的中间体)的积累(B.N.Marbois等，生物化学杂志，271,2995(1996))。因此，虽然其作用方式还不清楚，但CAT5/COQ7似乎在两个或多个步骤控制了泛醌的合成。CAT5/COQ7突变的多效作用提示存在呼吸链成份，线粒体生物起源和糖异生作用的共调节，而CAT5/COQ7可能是联系葡萄糖脱阻抑和呼吸作用的连接(M.Proft等，EMBO J.14,6116(1995))。因此，CAT5/COQ7似乎在代谢的多重平行的过程中是重要的。这与我们的clk-1调节C.elegans的许多完全不同的生理和代谢过程的观点是相同的。
为了检测结构相似类是否延及功能等价，我们构建了Δcat5/coq7酵母菌株，其正所如料不能生长于甘油上(M.Proft等，EMBO J.14,6116(1995)；B.N.Marbois等，生物化学杂志，271,2995(1995))。
全部酵母操作均在SEY 6210背景(MATa,leu2-3,ura3-52,his3-Δ250,lys2-801,trp1-Δ901 suc2-Δ9)中。酵母细胞在标准条件(YNB,YEPD和YEPD)下生长。用乙酸锂法以剪切的变性的载体DNA转化该菌株。用PCR-介导的方法(用ML134和ML135作为引物)破裂CAT5/COQ7基因座。用含有编码绿色荧光蛋白的破裂组件和HIS3基因的DNA片段完全取代CAT 5/COQ 7基因(R.K.Niedenthal等，酵母，12,773(1996))。用PCR产物转化单倍体细胞并在不含组氨酸的基本培养基上选择HIS 3整体。通过用引物ML 136,ML 137和ML 138的PCR分析证实基因破坏。Δcat5/coq7株不能在含有乙醇的YEPG或YEPE3上生长(M.Proft等，EMBOJ.14,6116(1995))。所用的引物是
ML134,TTTTCATATACGGGATTTTCAGGAAAAAAAACAATAGAAA-TCTATAAAACATGAGTAAAGGAGAAGAAC(SEQ ID NO:1)；ML135,CCGTTTTCCTTTCAATTCTCCTTTTCTGGCATAACGCGACTGATGTAT-GCCACGCGCGCCTCGTTCAGAATG(SEQ ID NO:2)；ML136,CGTACTCTGTCTATATTTCCC(SEQ ID NO:3)；ML137,GCGTTAAAATGCGTAAGGATG(SEQ ID NO:4)；ML138,CCACTTGCCACCTATCACC(SEQ ID NO:5)。
在含有组成型启动子和该ADH1基因的3’序列的表达盒中导入含有编码C.elegans clk-1的序列的多拷贝质粒，这使其将在甘油上生长的能力赋于Δcat5/coq株(图4)。测定野生型株(A.Wong等，遗传139,1247(1995))或带有CAT5/COQ7基因缺失并含有带有CAT5/COQ7插入(S.Hekimi等，遗传141,1351(1995)),clk-1插入(B.Lakowski等，科学272,1010(1996))或单独(S.M.Jazwinski，科学273,54(1996))的质粒pVT 102-U(多拷贝和组成型ADH1启动子)的酶母细胞在含有3％甘油的YEP平板上生长，并在30℃下温育7天。在划线分离前该转化子生长于含有2％葡萄糖的选择性培养基。
CAT5/COQ7基因座通过用Pfu多聚酶(Stratagene)和引物SHP69和SHP7的PCR直接扩增酵母基因组DNA而来。相应于整个clk-1编码序列的cDNA也用pfu多聚酶通过PCR扩增得到，该PCR的引物是已通过用SHP59引发而合成的单链cDNA上嵌套引物SHP57/SHP59和SHP57/SHP58。用HindⅢ消化每个酵母和线虫PCR产物并连接到HindⅢ消化和脱磷酸化的pVT 102-U(T.Vernet等，基因52,225(1987))。单独将它们转化到感受态的TG1细胞并回收所需的重组体质粒，分别再转化到Δcat5/coq7株。除了恢复在甘油上的生长(图4)外，含有CAT5/COQ7和clk-1的质粒都能恢复Δcat5/coq7株在乙醇中生长(YEPE3培养基)的能力。所用的引物是SHP57,CAGAAGCTTCCCAGTTACTCAAGATGTTCCG(SEQ ID NO:6)；SHP58,C-AGAAGCTTTGTTCAAATTTTCTCAGC(SEQ ID NO:7)；SHP59,ATGGAA-GAAAAGGGACAC(SEQ ID NO:8)；SHP69,CAGAAGCTTCTATAAAA-CATGTTTCC(SEQ ID NO:9)；SHP70,CAGAAGCTTAAATTCTTTCGGCA-CTCC(SEQ ID NO:10)。
通过clk-1的Δcat5/coq7无效的功能互补与已报道的通过鼠同系物的酵母突变体的功能互补(T.Jonassen等,Arch.Biochem.Biophys.330,285(1996)是一致的并且是这三个基因的共同生化功能的表明。除了其在调控机制中的共同生化功能和作用之外，人们必须注意要试图理解以cat 5/coq7突变株的表型缺陷表示的在clk-1蠕虫中所见的生理缺陷，这是由于酵母具有一些大多数其它真核生物中没有发现的专门化的代谢调控系统。然而，我们目前已在研究是否葡萄糖代谢和泛醌生物合成在clk-1突变体中受影响。尽管如此，种间的功能互补产生了这种可能性，即调控不同的下游调控物的代谢协调的中枢机制在包括人类的所有的真核生物中是保守的。
按照本发明，我们已表明clk-1影响C.elegans的寿命。然而，酵母细胞中通clk-1的Δcat5/coq7的功能互补暗示该基因的特征的其它方面：其在单个细胞水平上起作用(在单细胞的C.elegans卵中已说明的表型；A.Wong等，遗传139,1247(1995))。一些研究提示生物体衰老的细胞等价物为对增殖能力的限制(称为细胞衰老；综述于J.Campisi，细胞，84,497(1996)；L.Guarente,Cell 86,9(1996))。从而，需要测定是否Δcat5/coq7突变体比野生型酵母细胞活的更长。
总之，我们已鉴定了C.elegans的clk-1基因并已表明其在结构和功能上同源于酵母的中枢代谢调节物。这支持了我们以前的推测，即clk-1突变体的长寿可能是伴随着有害的副产物产生速率的减少和较慢的细胞代谢的结果(B.Lakowski等，科学272,1010(1996))。我们的发现也证明这样的观点，即多细胞生物体的衰老是由于其细胞的衰老(J.Campisi，细胞84,497(1996)；L.Guarente，细胞，86,9(1996))。
参照下列实施例将会更容易地理解本发明，而这些实施例只是为了说明本发明而非限制其范围。
实施例1
表达CLK-1∷GFP融合蛋白的报告基因
我们也构建了表达含有在其C末端融合到绿色荧光蛋白质(GFP)的完整的CLK-1氨基酸序列的融合蛋白的报告基因。该报告基因表达CLK-1操纵子前后的蛋白(图6)。
该构建体利用了载体pPD95.77(Andrew Fire博士惠赠)，其设计为让目的蛋白转录融合到绿色荧光蛋白(GFP)上。在这种情况下，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增clk-1操纵子(包括5′上游区域，估计当其延伸到下一个预计基因时含有全部启动子，toc-1,clk-1和toc-1/clk-1基因间区域)并克隆到pPD95.77中。所用的引物是SHP121(AAAAGGGTCGACCGAAAAGAGAACTAGACGG(SEQ ID NO:11)和SHP122(AAGGGGATCCAATTTTCTCACGCAATCGC(SEQ ID NO:12))。这些引物分别具有构建入其5′端以允许该扩增的产物的定向克隆的限制性位点SalⅠ和BamHⅠ。在图中，外显子DNA以方框代表；阴影表示编码序列。除了排除了终止密码子以使可以翻译过gfp外，完整地包含了clk-1基因。图中clk-1和gfp间散乱的区域是该载体的多克隆位点(102bp)的部分并编码提供CLK-1和GFP间的接头的34个氨基酸。
基于注射和染色体外列阵的形成，报道基因构建体完全拯救了clk-1(qm30)突变体的表型，提示融合到GFP部分不能显著地抑制CLK-1的功能。我们发现clk-1表达于所有细胞的各个阶段。此外，荧光显微镜显示CLK-1∷GFP融合蛋白定位于线粒体。通过用线粒体特异性活体染料(G6-罗丹明)共定位证实了该定位。
也将报道基因注射入野生型蠕虫并检测了带有染色体外列阵的个体的表型改变。据估计，源自染色体外列阵的CLK-1∷GFP的表达连同源自内源性野生型基因的正常的CLK-1的表达相应于clk-1活性的超表达。在测定生理速率时，我们检测了衰老蠕虫的排粪周期长度。检测了三个基因型(野生型，clk-1(qm30)和以野生型背景表达CLK∷GFP的动物(图7))的排粪周期两次(成年期的第一天和第四天)。
评定每个动物的五个中间-排粪期的分数计算了平均值并作图。在整个实验中，将动物维持在20℃。以2秒的间隔将周期长度作图。
见前面所述，我们发现clk突变体的排粪速率在第一天比野生型的动物的平均值低的多。然而，这两个基因型间在第4天无显著差异(图7上面和中间的图)。这提示野生型在第1天和第4天间的排粪的正常的减慢是由于clk-1的下调节。此外，我们发现具显著比例的超表达clk-1活性的动物在第四天没有减慢排粪(图的下图7)。应该记住带有游离的胞外列阵的动物是嵌合的，这可解释所观察的效果的多样性。所有这些研究成果提示clk-1活性的下调构成了衰老过程中生理速率减缓的基础，而后者可通过人工增加clk-1活性而防止。
我们在前面已认为clk-1突变动物活得更长是由于其生理速率的降低。我们现已观察到超表达clk-1的动物的排粪速率似乎增加到超过衰老动物中的野生型(成年期四天)。排粪仅代表蠕虫的生理的一个指标，但所观察到的升高可能反映了生理速率的普遍升高。因此，我们已检测了超表达clk-1的动物(以野生型背景表达CLK-1∷GFP的动物)的寿命。我们发现这些动物确实比野生型活的明显要短(图8)。
在整个实验中，将动物维持在20℃。样本大小为100个。
这些新的结果提示clk-1活性的水平控制生理速率和寿命。在突变体中发现的降低的clk-1活性水平导致了较慢的生理速率及增加的寿命，而升高的活性则导致较快的生理速率(如成年期的第4天所见)和变短的寿命。这提示人工下调其它生物体的clk-1基因或其同系物的表达(如通过反义治疗或药理手段)将会导致延长的寿命。若人工下调可针对具体的组织或器官，将会引起该组织或器官的特定的生理减慢以及伴随的较慢的衰老过程所致的降解的速率。或者，该组织或器官的特异性的clk-1超表达可以升高那些由于病理状态而减慢的功能速率的组织或器官的生理速率。
虽然已结合其具体的实施方案描述了本发明，应理解其能进一步改进并且本发明试图包括任何按照本发明的一般原理并包括下列的对本发明公开的偏离的变更，使用或采用本发明。这些诸如背离可来自本发明涉及的现有技术中的已知的或习惯手段以及应用了前述的实质特征，以及按照所附的权利要求书的范围内的技术方案。
序列表
(1)一般资料(ⅰ)申请人：McGILLUNIVERSITY等。(ⅱ)发明名称：C.Elegans时钟基因clk-1的结构和功能保守(ⅲ)序列数：20(ⅳ)通信地址
(A)收件人：SWABEY OGILVY RENAULT
(B)街道：1981 McGill College Ave.-Suite 1600
(C)城市：Montreal
(D)州：QC
(E)国家：Canada
(F)邮码：H3A2Y3(ⅴ)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM兼容
(C)操作系统：DOS
(D)软件：FastSEQ for Windows,2.0版(ⅵ)当前申请资料：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类：(ⅶ)在先申请资料：
(A)申请号：60/028,977
(B)申请日：21-OCT-1996
(A)申请号：60/033,196
(B)申请日：1996年12月18日(ⅷ)代理人信息：
(A)名称：Cote,France
(B)注册号：4166
(C)档案号：1770-160PCT(ⅸ)电信资料：
(A)电话：514-845-7126
(B)电传：514-288-8389
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        20                  25                  30Ala Asp Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Leu Ala Val Leu Gln Gly Ser Ser
    35                  40                 45Val Gly Ser Val Iie Lys Lys Met Trp Asp Glu Glu Lys Glu His Leu
50                  55                  60Asp Thr Met Glu Arg Leu Ala Ala Lys His Asn Val Pro His Thr Val65                  70                  75                  80Phe Ser Pro Val Phe Ser Val Ala Ala Tyr Ala Leu Gly Val Gly Ser
            85                  90                  95Ala Leu Leu Gly Lys Glu Gly Ala Met Ala Cys Thr Ile Ala Val Glu
        100                 105                 110Glu Leu Ile Gly Gln His Tyr Asn Asp Gln Leu Lys Glu Leu Leu Ala
    115                 120                 125Asp Asp Pro Glu Thr His Lys Glu Leu Leu Lys Ile Leu Thr Arg Leu
130                 135                 140Arg Asp Glu Glu Leu His His His Asp Thr Gly Val Glu His Asp Gly145                 150                 155                 160Met Lys Ala Pro Ala Tyr Ser Ala Leu Lys Trp Ile Ile Gln Thr Gly
            165                 170                 175Cys Lys Gly Ala Ile Ala Ile Ala Glu Lys Ile
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(2)序列14资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：179aa
(B)类型：氨基酸
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        20                  25                  30Met Ala Val Leu Gly Arg Thr Ser Val Gly Pro Val Ile Gln Lys Met
    35                  40                  45Trp Asp Gln Glu Lys Asn His Leu Lys Lys Phe Asn Glu Leu Met Val
50                  55                  60Ala Phe Arg Val Arg Pro Thr Val Leu Met Pro Leu Trp Asn Val Ala65                  70                  75                   80Gly Phe Ala Leu Gly Ala Gly Thr Ala Leu Leu Gly Lys Glu Gly Gly
            85                  90                  95Met Ala Cys Thr Val Ala Val Glu Glu Ser Ile Ala His His Tyr Asn
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130
(2)序列16资料：(ⅰ)序列特征：
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(2)序列17资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：272aa
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(C)链型：单链
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        100                 105                 110Tyr Phe Val Leu Ala His Arg Tyr Pro His Leu Lys Pro Val Leu Lys
    115                 120                 125His Ile Trp Asp Gln Glu Ile His His His Asn Thr Phe Asn Asn Leu
130                 135                 140Gln Leu Lys Arg Arg Val Arg Pro Ser Leu Leu Thr Pro Leu Trp Lys145                 150                 155                 160Ala Gly Ala Phe Ala Met Gly Ala Gly Thr Ala Leu Ile Ser Pro Glu
            165                 170                 175Ala Ala Met Ala Cys Thr Glu Ala Val Glu Thr Val Ile Gly Gly His
        180                 185                 190Tyr Asn Gly Gln Leu Arg Asn Leu Ala Asn Gln Phe Asn Leu Glu Arg
    195                 200                 205Thr Asp Gly Thr Lys Gly Pro Ser Glu Glu Ile Lys Ser Leu Thr Ser
210                 215                 220Thr Ile Gln Gln Phe Arg Asp Asp Glu Leu Glu His Leu Asp Thr Ala225                 230                 235                 240Ile Lys His Asp Ser Tyr Met Ala Val Pro Tyr Thr Val Ile Thr Glu
            245                 250                 255Gly Ile Lys Thr Ile Cys Arg Val Ala Ile Trp Ser Ala Glu Arg Ile
        260                 265                 270
(2)序列18资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：428aa
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:18:Met Val Ser Phe Ser Trp Val Ser Arg Ser Leu His His Plo Gln Gly1               5                  10                  15Lys Arg Gly Leu Ile Ser Thr Leu Ile Cys Leu Ala Cys Val Gly Ile
        20                  25                  30Leu Ala Tyr Cys Val Ser Thr Ser His Ser Ile Val Leu Met Ser Thr
    35                  40                  45Leu Trp Ile Thr Ile Phe Ser Phe Cys Ser Gln Phe Ala Ser Leu Tyr
50                  55                  60Ser Met Ser Ile Thr Glu Lys Pro Thr His Lys Phe Ser Tyr Gly Leu65                  70                  75                  80Ala Arg Val Pro Val Leu Ala Val Phe Ser Thr Thr Val Leu Ala Gln
            85                  90                  95Leu Phe Ser Ile Phe Leu Ser Lys Glu Ser Phe Glu His Leu Leu Ser
        100                 105                 110Pro Asp His His Gly Ser His Asp Ala Ser Ala Ala His Glu His Glu
    115                 120                 125Val Glu Glu Ile Gly Gly Trp Pro Tyr Phe Val Gly Ser Ala Ala Ser
130                 135                 140Ser Val Ala Leu Leu Leu Ser Ala Tyr Ala Leu Lys Asn Gln Pro Phe145                 150                 155                 160Gln His Val Leu Gln Ser Ala Thr Ala Ser Ser Leu Gln Glu His Ala
            165                 170                 175Ala Asp Leu Ser His Ala Val Cys Trp Val Ile Pro Gly Leu Ser Arg
        180                 185                 190Leu Leu Leu Pro Arg Ile Asn Ser Met Val Leu Leu Ala Leu Thr Thr
    195                 200                 205Thr Gly Leu Asn Leu Leu Cys Glu His Phr Lys His Asp Phe Ala Trp
210                 215                 220Ala Asp Pro Val Cys Cys Leu Leu Leu Ser Val Ala Val Phe Ser Thr225                 230                 235                 240Met Tyr Pro Leu Ser Thr Tyr Thr Gly Met Ile Leu Leu Gln Thr Thr
            245                 250                 255Pro Pro His Leu Ile Asn Gln Ile Asp Arg Cys Ile Ser Glu Ala Ser
        260                 265                 270His Ile Asp Gly Val Leu Glu Leu Lys Ser Gly Arg Phe Trp Gln Leu
    275                 280                 285Asp Phe Asn Ser Leu Val Gly Thr Val Asp Val Arg Val Arg Arg Asp
290                 295                 300Ala Asp Glu Gln ASn Val Leu Ala His Val Thr Glu Lys Phe Ser Ser305                 310                 315                 320Val Ile Thr Val Leu Thr Val Gln Val Val Lys Asp Ala Ala Trp Ser
            325                 330                 335Ala Gly Glu Gln Val Pro Tyr Ser Asn Gly His Ile His Lys Ser Glu
        340                 345                 350Gly Asn His Ser His Asp Asn Gly His Gly His Ser His Asp His Asn
    355                 360                 365Asp His Gly His Ser His Gly His Asp Asp His Gly His Asp Ser His
370                 375                 380Gly His Ser His Asp His Asn Glu His Asp His Gly His Ser His Gly385                 390                 395                 400Gly Asn Asn Asp Asn His Gly His Ser His Ser Ala Gly Ser Asp Asn
            405                 410                 415His His Gly His Ser His Asp Gly Val Phe Tyr His
        420                 425
(2)序列19资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：234aa
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:19:Met Gly Thr Ile His Leu Phe Arg Lys Pro Gln Arg Ser Phe Phe Gly1               5                  10                  15Lys Leu Leu Arg Glu Phe Arg Leu Val Ala Ala Asp Arg Ser Met Gly
        20                  25                  30Arg Tyr Met Leu Phe Gly Val Ile Asn Leu Ile Cys Thr Gly Phe Leu
    35                  40                  45Leu Met Trp Cys Ser Ser Thr ASn Ser Ile Ala Leu Xaa Ala Tyr Thr
50                  55                  60Tyr Leu Thr Ile Phe Asp Leu Phe Ser Leu Met Thr Cys Leu Ile Ser65                  70                  75                  80Tyr Trp Val Thr Leu Arg Lys Pro Ser Pro Val Tyr Ser Phe Gly Phe
            85                  90                  95Glu Arg Leu Glu Val Leu Ala Val Phe Ala Ser Thr Val Leu Ala Gln
        100                 105                 110Leu Gly Ala Leu Phe Ile Leu Lys Glu Ser Ala Glu Arg Xaa Leu Glu
    115                 120                 125Gln Ser Xaa Leu Xaa Leu Cys Ile Pro Xaa Ser Val Tyr Ser Gly Lys
130                 135                 140Val Xaa Leu Gln Thr Thr Pro Pro His Val Ile Gly Gln Leu Asp Lys145                 150                 155                 160Leu Ile Arg Glu Val Ser Thr Leu Asp Gly Val Leu Glu Val Arg Asn
            165                 170                 175Glu His Phe Trp Thr Leu Gly Phe Gly Ser Leu Ala Gly Ser Val His
        180                 185                 190Val Arg Ile Arg Arg Asp Ala Asn Glu Gln Met Val Leu Ala His Val
    195                 200                 205Thr Asn Arg Leu Tyr Thr Leu Val Ser Thr Leu Thr Val Gln Ile Phe
210                 215                 220Lys Asp Asp Trp Ile Arg Pro Gly Phe Thr225                 230
(2)序列20资料：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：183aa
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单链
(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:Tyr Pro Met Ser Val Tyr Ser Gly Lys Val Leu Leu Gln Thr Thr Pro1               5                  10                  15Pro His Val Ile Gly Gln Leu Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Ser Thr
        20                  25                  30Leu Asp Gly Val Leu Glu Val Arg Asn Glu His Phe Trp Thr Leu Gly
    35                  40                  45Phe Gly Ser Leu Ala Gly Ser Val His Val Arg Ile Arg Arg Asp Ala
50                  55                  60Asn Glu Gln Met Val Leu Ala His Val Ser Asn Arg Leu Cys Thr Leu65                  70                  75                  80Val Ser Thr Leu Thr Val Gln Ile Phe Lys Asp Asp Trp Ile Arg Pro
            85                  90                  95Ala Leu Ser Ser Gly Pro Val Ala Pro Asn Val Leu Asn Phe Ser Asp
        100                 105                 110His His Val Ile Pro Met Pro Leu Leu Lys Asn Val Asp Glu Arg Thr
    115                 120                 125Pro Val Thr Ser Thr Pro Ala Lys Pro Ser Ser Pro Ser Pro Glu Phe
130                 135                 140Ser Phe Asn Thr Pro Gly Lys Asn Val Ser Pro Val Ile Leu Leu Asn145                 150                 155                 160Thr Gln Thr Arg Pro Tyr Ser Leu Gly Leu Asn Arg Gly His Thr Pro
            165                 170                 175Tyr Ser Ser Val Phe Ser Gln
        180

Claims (5)

1．clk-1基因，其在细胞生理水平上具有涉及发育速率和寿命的功能，其中的clk-1突变体较之于野生型有更长的寿命和改变了的细胞代谢。
2．诊断和/或预测患者的癌症的方法，包括步骤：
a)从所述患者取组织标本；
b)分析步骤a)所得的组织标本的DNA以测定人clk-1基因是否改变，而其中的人clk-1基因的改变是癌症的标志。
3．长寿的小鼠模型，包括基因剔除权利要求1的鼠clk-1。
4．增加动物或患者寿命的方法，包括下调权利要求1的clk-1基因和/或其同系物的表达。
5．治疗患者的导致组织和/或器官的生理速率减缓的病理状态的方法，包括给予所说患者一种药剂以促进组织和/或器官特异性的clk-1超表达从而提高生理速率。
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