ES2671326T3 - ARNpno, composiciones y usos - Google Patents

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Abstract

Secuencia de ARN aislada o sintética que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1, una secuencia ortóloga o una secuencia análoga en el plano funcional para uso como medicamento.

Description

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descripción
ARNpno, composiciones y usos
La presente invención se refiere al uso de secuencias de ARN particulares como medicamento. Se refiere más precisamente al uso de ARN pequeños nucleolares(ARNpno) de los que los inventores han demostrado la implicación en los mecanismos de envejecimiento. Los ARNpno de la invención pueden usarse en particular para aumentar la resistencia al estrés de un sujeto, para luchar contra los efectos nocivos del envejecimiento, típicamente para prevenir o tratar una enfermedad degenerativa, en particular neurodegenerativa, una laminopatía, en particular el síndrome de Hutchinson-Gilford (HGPS) (conocido también con el nombre de progeria), diabetes, obesidad o un cáncer así como, más generalmente, para prolongar la duración de vida de un sujeto. Los ARNpno de la invención pueden usarse igualmente en el tratamiento de la infertilidad.
Se describen igualmente vectores, células, animales transgénicos, composiciones capaces de expresar un ARNpno según la invención y kits que comprenden ácidos nucleicos, vectores, módulos y/o células descritos en el presente texto, así como métodos que usan uno de los productos anteriormente citados de la invención como herramienta de identificación de una molécula activa en la prevención o el tratamiento de una patología, una anomalía, un trastorno o un deterioro aparente o funcional ligado a un mecanismo de envejecimiento.
Antecedentes tecnológicos
Los mecanismos de envejecimiento (es decir, el declive progresivo de la capacidad de sobrevivir y reproducirse con la edad) han dejado atónitas a la sociedad y la comunidad científica durante siglos. Las dos teorías que prevalecen actualmente mantienen por un lado que el envejecimiento sería el resultado de una vía evolutiva preprogramada genéticamente, y por otro, que el envejecimiento sería la consecuencia normal de la existencia en el transcurso de la cual se acumulan daños celulares y moleculares. Estos daños incluirían daños oxidativos provocados por radicales libres, mitocondrias defectuosas, mutaciones somáticas, el acortamiento progresivo de los telómeros, la muerte celular programada y la proliferación de células deterioradas etc. (Semsei I. (2000) On the nature of aging. Mech Aging Dev 117: 93-108).
Se ha mostrado que, en organismos tales como levadura y ratón, la reducción del aporte calórico ejerce un impacto positivo decisivo sobre el alargamiento de la duración de la vida (Sohal, R S, Weindruch, R (1998) Oxidative stress, caloric restriction, and aging. Science 273: 59-63; Finch, C E, Revkun, G. (2001) The genetics of aging. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 2: 435-462). Estudios recientes han puesto en evidencia que la restricción calórica sería igualmente eficaz en los primates, como los seres humanos (Roth, G S, Lasnikov, V, Lesnikov, M, Ingram, D K, Land, M A (2001) Dietary caloric restriction prevents the age-related decline in plasma melatonin levels of Rhesus monkeys. J Clin Endocrinol Metab. 86: 3292-5 ; Roth G S, Lañe M A, Ingramn D K, Mattison J a, Elahi D, Tobin J D, Muller D, Metter E J (2002) Biomarkers of caloric restriction may predict longevity in humans. Science. 297: 811-813; Walford R L, Mock D, Verdery R, MacCallum T. (2002) Calorie restriction in biosphere 2: alterations in physiologic, hematologic, hormonal, and biochemical parameters in humane restricted for a 2-year period. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 57: 211-24). Desgraciadamente, es probable que la mayoría de los seres humanos no sean capaces de seguir el régimen dietético estricto requerido para beneficiarse de este descubrimiento.
Numerosos grupos de investigación se dedican desde hace años a la identificación de los genes y las vías de señalización implicados en el proceso de envejecimiento. Los estudios que se reseñan se han realizado en numerosos organismos como la levadura Saccharomyces cerevisiae, el gusano Caenorhabditis elegans y la mosca de la fruta Drosophila melanogaster (Fontana et al., 2010), y han permitido la identificación de una lista creciente de genes. Muchos de entre ellos están implicados en la señalización hormonal y están conservados dentro de una gran variedad de organismos eucarióticos. Resulta evidente, al menos para las especies inferiores, que las vías responsables del desarrollo y el crecimiento al inicio de la vida conservan influencia a lo largo de toda la vida y condicionan incluso en parte su duración. Estos estudios han puesto en evidencia indirectamente por otro lado la importancia de la capacidad metabólica y de la resistencia al estrés para evaluar la duración de la vida de un sujeto.
Por ejemplo, los mutantes del gen clk-1 de Caenorhabditis elegans se han implicado en la disminución de la producción extramitocondrial de especies reactivas de oxígeno (Hekimi, S, Guarente, L. (2003) Genetics and the specificity of the aging process. Science 299: 1351-1354). La solicitud de patente WO 98/17823 describe la función del gen clk-1 en el proceso de desarrollo y la longevidad. Reivindica especialmente un método para aumentar la duración de la vida de un individuo mediante la regulación de la expresión del gen clk-1.
Se ha descrito por otro lado una mutación del gen Matusalén (que codifica un receptor acoplado a proteínas G) como capaz de aumentar aproximadamente un 35 % la duración de la vida de mosca de la fruta (documento US 6.303.768).
El acortamiento de telómeros es conocido por otro lado como un mecanismo responsable del envejecimiento celular. En los vertebrados, la telomerasa es una transcriptasa inversa de tipo ribonucleoproteína (RNP) cuyo papel es mantener el longitud de los telómeros por adición de ADN telomérico al extremo de los cromosomas en las células eucarióticas en división (Kíss, 2002). En los seres humanos, una mutación en la secuencia H/ACA del ARNpno de la telomerasa origina una enfermedad genética pleiotrópica, la disqueratosis congénita, cuyos pacientes presentan
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telómeros más cortos (Mitchell et al., 1999; Vulliamy et al., 2001). A pesar de Ios esfuerzo realizados por la comunidad científica por descifrar Ios mecanismos de envejecimiento e identificar nuevas dianas terapéuticas que permitan retardar este proceso y/o combatir sus efectos nocivos, las herramientas disponibles siguen siendo insuficientes. La necesidad de herramientas que permitan “envejecer bien”, es decir, sin las enfermedades y molestias asociadas generalmente al envejecimiento, se hace sentir tanto más cuanto que Ios progresos de la medicina asociados a la mejora general de las condiciones de vida han permitido ya a la población humana, en solamente decenas de años, aumentar su esperanza de vida de manera muy significativa.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere al uso en un contexto profiláctico o terapéutico de secuencias de ARN de interés de las que Ios inventores han demostrado la implicación particular en Ios mecanismos de envejecimiento. Han demostrado en particular la capacidad de estas secuencias de aumentar de manera espectacular la duración de la vida de un sujeto, frenando Ios mecanismos de envejecimiento y luchando contra Ios efectos nocivos asociados. Las secuencias de la invención permiten así luchar contra las enfermedades asociadas al envejecimiento tales como enfermedades degenerativas, laminopatías y cánceres, pero igualmente contra diabetes y obesidad. Se han revelado por otro lado eficaces en el tratamiento de problemas de infertilidad o esterilidad (concretamente, dificultad o imposibilidad de dar vida), así como en el aumento de la resistencia de Ios sujetos, en particular sujetos que hayan alcanzado su madurez sexual, preferiblemente sujetos ancianos, al estrés.
Un primer objeto de la invención se refiere a una secuencia de ARN aislada o sintética que comprende la secuencia SEQ ID NO : 1, una secuencia homóloga, preferiblemente una secuencia ortóloga o una secuencia análoga en el plano funcional, para uso como medicamento.
Los inventores han demostrado que a la secuencia de ARN SEQ ID NO : 1 descubierta en la mosca de la fruta corresponden secuencias ortólogas en Ios mamíferos tales como primates y ser humano, y en roedores tales como ratón y rata. La invención cubre así igualmente el uso de una u otra de las aplicaciones descritas en el presente texto, de una secuencia de ARN aislada o sintética elegida preferiblemente entre la secuencia SEQ ID NO : 2 de origen humano y una de las secuencias SEQ ID NO : 3 y SEQ ID NO : 4 de origen múrido. Las secuencias SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 22, 24, 26 y 28 identificadas en la tabla n0 1 del presente texto son ejemplos de secuencias ortólogas de la secuencia SEQ ID nO : 1.
Es otro objeto de la invención una secuencia de ADN que codifica una secuencia de ARN de interés según la invención.
La invención se refiere también a un vector que permite la expresión in vitrn, ex vivo o in vivo de una secuencia de ARN según la invención.
La invención se refiere igualmente a una célula que comprende una secuencia de ARN según la invención o transformada con la ayuda de un vector según la invención, así como a una composición que comprende un producto según la invención y un soporte aceptable en el plano dietético o farmacéutico.
La invención se refiere por otro lado al uso de una secuencia de ARN, un vector, una célula o una composición según la invención, de manera continua o secuencial, para restaurar o modular la expresión de dicha secuencia de ARN in vivo, in vitro o ex vivo.
Es otro objeto de la invención un ratón transgénico cuyo genoma se ha modificado genéticamente para prevenir o modificar, preferiblemente alterar, la expresión de una secuencia de ARN de interés según la invención, típicamente de una y/u otra de las secuencias SEQ ID NO : 3 y SEQ ID NO : 4.
Descripción detallada
La invención es el resultado de la divulgación por Ios inventores de la influencia de una pequeña secuencia de ARN nucleolar (ARNpno:^28S-1153 llamado “juventud” identificado en el presente texto como SEQ ID NO :1) sobre la duración de la vida de moscas de la fruta. Este ARNpno se ha identificado en el marco de un cribado sistemático de Ios ARNpno asociados al genoma de la mosca de la fruta (Huang et al., 2005) sin que se le haya asociado ninguna función hasta hoy.
Los inventores han caracterizado esta secuencia y han mostrado especialmente que una deleción genómica de 632 pares de bases de la región F4 del genoma de la mosca de la fruta, que contiene la secuencia ARNpno:^28S-1153, acorta la duración de la vida de las moscas de la fruta aproximadamente un 30 %. Han divulgado luego que la sobreexpresión de esta secuencia de ARN, con la ayuda por ejemplo de un transgén que contiene el ADN genómico que codifica este ARNpno, aumenta de manera espectacular la duración de la vida de las moscas de la fruta aproximadamente un lOo %. Las moscas que sobreexpresan la secuencia de ARN de la invención viven así hasta dos veces más tiempo. Los inventores han identificado y detectado por otro lado la expresión de secuencias “juventud" ortólogas en ratón y en ser humano.
Características de las secuencias de ARN y otros productos de la invención
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Como se explica anteriormente, la invención se refiere a una secuencia ribonucleotídica (secuencia de ARN), aislada o sintética, que presenta las características funcionales de la secuencia SEQ ID NO : 1 identificada originalmente en la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), para uso como medicamento en un sujeto susceptible de beneficiarse de él, típicamente en un animal o un insecto, por ejemplo un mamífero o un roedor, preferiblemente en un ser humano.
Se entiende por “medicamento” una sustancia que posee propiedades preventivas o curativas. En el marco de la invención, un medicamento está destinado a curar, favorecer la curación, aliviar o prevenir, en un sujeto tal como se define anteriormente, una patología, anomalía o alteración ligada a un proceso de envejecimiento anormal o simplemente indeseable.
En la mosca de la fruta, la secuencia de ARN de interés está comprendida en la región genómica identificada como región F4, situada ella misma en el cromosoma 2R. Esta secuencia nucleotídica, para la primera especie de mosca de la fruta (Drosophila melanogaster) estudiada por los inventores, está constituida por 148 pares de bases. Se identifica en el presente texto como SEQ ID NO : 1.
Los homólogos/ortólogos, así como los análogos y variantes funcionales de la secuencia SEQ ID NO: 1, son, del mismo modo que esta última, secuencias de interés objetos de la presente invención.
El término “homólogo” se usa en el contexto de la presente invención para designar una estructura cuya secuencia nucleotídica es idéntica o suficientemente cercana a la de la secuencia SEQ ID NO : 1, identificada en esta primera especie de mosca de la fruta, para ser considerada como su equivalente en otra especie (de mosca de la fruta, insecto o cualquier otro animal). Una secuencia se considera homóloga de la secuencia SEQ ID NO : 1 si presenta con esta última, o con uno de sus fragmentos de al menos 50 nucleótidos consecutivos, una identidad de secuencia de al menos un 70 %, 80 % u 85 %, preferiblemente de al menos un 90 o 95 %, aún más preferiblemente de al menos un 96, 97, 98 o 99 % obtenida por ejemplo por el programa de alineamiento de secuencias blastN (Altschul et al., 1990), o también por el programa INFERNAl por "INFERence of RNA ALignment (Inferencia de alineamiento de ARN)", que identifica secuencias de ADN a partir de la estructura de ARN y su similitud de secuencia. Dos secuencias genéticas homólogas de dos especies diferentes se consideran ortólogas si descienden de una secuencia única presente en el último ancestro común a las dos especies.
El porcentaje de identidad se determina comparando dos secuencias cuyo alineamiento óptimo se ha realizado. El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones para las que aparece un residuo idéntico en las dos secuencias en la misma posición dividido entre el número de posiciones totales y multiplicado por 100. El alineamiento óptimo de las dos secuencias puede obtenerse, por ejemplo, con un algoritmo de investigación de la homología local (Smith yWatherman, 1981) o sistemas equivalentes conocidos por el especialista en la materia.
El término “análogo” designa cualquier mimético que sea un compuesto químico existente en la naturaleza y aislado a partir de este último, o fabricado artificialmente, y que posea al menos una de las funciones endógenas de la secuencia nucleotídica que imita (secuencia de ARN equivalente en el plano funcional), por ejemplo el conjunto de funciones endógenas de la secuencia nucleotídica que imita. Un ejemplo de compuesto análogo consiste por ejemplo en una secuencia que permite el corte y empalme de los mismos genes. Un objeto particular de la invención se refiere así a una secuencia análoga de SEQ ID NO :1 que permite el corte y empalme de uno o varios genes elegidos entre los genes Ir56d, buttonhead, klarsicht, CG3262, CG30502 (“2-hidrolasa de ácido graso”- fa2h), CG11125, CG9339 y CG40006 de Drosophila melanogaster. Los experimentos realizados por los inventores han demostrado que el gen CG9339 (denominado: skywalker) (Uytterhoeven et al., 2011) no se corta y empalma correctamente en el mutante F4, indicando que el ARNpno juventud está implicado en el corte y empalme alternativo de este gen (véase la Figura 17). Se han obtenido igualmente resultados similares para un transcrito del gen klarsicht, para el que se observa menos ARN cortado y empalmado en el mutante F4 que en las moscas de control de tipo silvestre Canton-S (Figura 18A), así como para el gen CG30502, que codifica el gen fa2h (Figura 18B), habiéndose implicado este último en el ser humano con diversas formas de desmielinización, tales como neurodegeneraciones ligadas a la acumulación de hierro, leucodistrofias (típicamente aquellas ligadas a las mutaciones del gen fa2h) y una paraplejia espástica hereditaria (típicamente la paraplejia espástica hereditaria SPG35) (Dick et al., 2008; 2010 ; Pierson et al., 2012).
El término “variante funcionar designa cualquier ácido nucleico que presente una o varias modificaciones o mutaciones (es decir, por ejemplo una deleción, una sustitución o una adición de una o varias bases) con relación a las secuencias parentales descritas en la presente solicitud, y que permita una de las aplicaciones descritas en el marco de la presente invención.
Una secuencia considerada en la invención como homóloga, preferiblemente ortóloga, de una secuencia de referencia es un ejemplo de variante funcional en la invención de dicha secuencia de referencia. Tal secuencia puede ser natural, recombinante o sintética.
La secuencia SEQ ID NO : 1 es una secuencia muy conservada en el transcurso de la evolución y presente en numerosas especies animales. Los inventores han mostrado así especialmente que esta secuencia está presente en las otras 12 especies de moscas de la fruta cuyo genoma es conocido. Los ejemplos de secuencias
homólogas/ortólogas de la secuencia de ARN SEQ ID NO: 1 comprenden así las secuencias de ARN SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 22, 24, 26 y 28 identificadas en la tabla n0 1 del presente texto (véase la Figura 9).
Los inventores ha identificado por otra parte una secuencia de ARN ortóloga en el ser humano, localizada en el cromosoma 11, en posición 12822722-12822811. Se trata de la secuencia identificada en el presente texto como 5 SEQ ID NO : 2. Los inventores han identificado también dos secuencias de ARN ortólogas en ratón (se trata de las secuencias identificadas respectivamente como SEQ ID NO: 3 y 4 en el presente texto), localizadas en el cromosoma 15, en posición 30336889-30337017 (SEQ ID NO : 7) y en el cromosoma 18, en posición 64950126495091 (SEQ ID NO : 8).
Las secuencias nucleotídicas de interés identificadas en la mosca de la fruta, el hombre y el ratón se enumeran en la 10 tabla 1 siguiente.
Tabla n° 1
Especie
Secuencias de ARN (de 5' a 3') SEQ ID NO:
Drosophila melanogaster
AAAGCGUUAGAUAUUAAACUGUGGUUGAAUUCACAAA AUAGGCCACAGUUAUGCAAUAAACGCUAGAAAAAAAAC GGUAGUAUUUAAUAACGUGUUGACUAACAUCUGCGGAU AAGAAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA 1
Hombre
GUAAGUGUAGCCUAGAAAUUGGGGCUGGAUUUGAAAA UUAGCCCCAAUUCUGCAAUUUUCACCGCAAUAAAAGCU UCUCCAGUUAUACAUGGUGAUUGGUCUUGAUGGGCUAU UGUGGACAGAGGAGGGUGCUAGGUUGGGGUGGACGGG GCCACAGCU 2
Ratón-1
AAAGGGGUUGAAGAAUGGUAUGGAUUCAGAAUGAACU AUCAGAGAAACUCCAGAGCCAGCAGGAAACAUUAUAGA GCCUUUGCUACAAUGUCCUGUUUCUUUCUUGGCUUUUA GUUCUGUUCCACAGAU 3
Ratón-2
GAAAGCAUUUAAUAUUUACCAAUAGUUUAUUCCGAGCU AGGGUAAAGCAGUCAGUGCUAGAAAAAUGAGAAAACAC AAUACAUAAGACCUCUCAAGGGGAGAUGCUGUUACUGU AUAUACUG 4
Drosophila simulans
AAAGCGUUAGGUAUAAACCUGUGGUUGAAUUCACAAAA UAGGCCACAGUUAUGCAAUAAACGCUAGAAAAAAAACG GUAGUAUUUAAUAACGUGUUGACUAACAUCUGCGGAUA AAACAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA 9
Drosophila sechellia
AAAGCGUUAGGUAUUAACCUGUGGUUUAAUUCACAAAA UAGGCCACAGUUAUGCAAUAAACGC UAGAAAAAAAACG GUAGUAUUUAAUAACGUGUUGACUAACAUCUGCGGAUA AAAUAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA 11
Drosophila yakuha
CAAGCGUUGUAUAAUAUUAAACUGUGGAAACUUCACAA AUAGGCCACAGUUAUGCAAGAAACGCUAGAAAAACUUG GUAGUAUUUAAUAACGUGCUGACUAACGUCUGCGGAUA AAAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAUUA 13
Drosophila erecta
CAUGCGUUGAAUAAUAUUAAACUGUGGACGAAUUCCCA AAUAAGCCACAGUUAUGCAAGAAACGCUAGAAAAAAUA GGUAGUAUUUAAUAACGUGCUGACUAACAUCUGCGGAU AAGAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAAUA 15
Drosophila ananassae
UUAGGCGUUCAAAACAUUAAACGLÍUGGCUGAUUUAUGA UUAGGCUAGUGUUAUGCACGCAACGCUAGAGAAAAUUG GUAGUAUUUAAUAAUGCGUUGGUGGCAAAUCUAUCGA UUUUGAUCUUCGCAUUUUGAGGUACUAGCACAGUU 17

Claims (17)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    reivindicaciones
    1. Secuencia de ARN aislada o sintética que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1, una secuencia ortóloga o una secuencia análoga en el plano funcional para uso como medicamento.
  2. 2. Secuencia de ARN para uso según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha secuencia ortóloga es de origen humano y consiste en la secuencia SEQ ID NO : 2 o es de origen múrido y consiste en una secuencia elegida entre SEQ ID NO : 3 y SEQ ID NO : 4.
  3. 3. Secuencia de ARN para uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque dicha secuencia es un ARN pequeño nucleolar (ARNpno).
  4. 4. Secuencia de ARN para uso según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha secuencia análoga en el plano funcional permite el corte y empalme de un gen de Drosophila melanogaster elegido entre Ir56d, buttonhead, klarsicht, CG3262, CG30502 (fa2h), CG11125, CG9339 y CG40006.
  5. 5. Secuencia de ARN según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en la prolongación de la duración de la vida de un sujeto, el aumento de la resistencia a un estrés o la lucha contra los efectos nocivos del envejecimiento en un sujeto.
  6. 6. Secuencia de ARN según una de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en la prevención o el tratamiento en un sujeto de una enfermedad degenerativa, en particular una enfermedad neurodegenerativa, una laminopatía, diabetes, obesidad o un cáncer.
  7. 7. Secuencia de ARN para uso según la reivindicación 6, en la que el cáncer es un cáncer inducido por radicales libres.
  8. 8. Secuencia de ARN según una de las reivindicaciones 1 a 3 para uso en el tratamiento de infertilidad o la estimulación de fertilidad de un sujeto.
  9. 9. Secuencia de ARN para uso según una de las reivindicaciones 5 a 8, caracterizada porque el sujeto es un animal o un insecto, típicamente un mamífero, preferiblemente un ser humano, aún más preferiblemente un sujeto que no expresa la secuencia de ARN según una de las reivindicaciones 1 a 3 o que expresa una versión anormal de dicha secuencia de ARN, un sujeto sometido a condiciones de estrés tales como ayuno, choque térmico o estrés oxidativo y/o un sujeto que padece una enfermedad degenerativa, una laminopatía, diabetes, obesidad, un cáncer o un problema de fertilidad.
  10. 10. Secuencia de ARN para uso según la reivindicación 9, caracterizada porque el genoma del sujeto, que no expresa la secuencia de ARN según una de las reivindicaciones 1 a 3 o expresa una versión anormal de dicha secuencia de ARN, contiene una secuencia de ADN que comprende una mutación, estando dicha secuencia en estado silvestre elegida entre SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO :8; y eligiéndose preferiblemente dicha mutación entre una deleción, sustitución o adición de uno o varios pares de bases.
  11. 11. Secuencia de ADN que codifica una secuencia de ARN para uso según una de las reivindicaciones 1 a 10.
  12. 12. Vector que permite la expresión de una secuencia de ARN para uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, elegido por ejemplo entre un plásmido, cósmido, vector vírico y fago, que se compone preferiblemente de un promotor y/o elementos reguladores que favorecen la expresión de dicha secuencia de ArN en células intestinales u ováricas.
  13. 13. Célula que comprende una secuencia de ARN para uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, o transformada con la ayuda de un vector para uso según la reivindicación 12.
  14. 14. Composición que comprende una secuencia de ARN según una de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según la reivindicación 12 o una célula según la reivindicación 13 y un soporte aceptable en el plano dietético o farmacéutico.
  15. 15. Uso de una secuencia de ARN según una de las reivindicaciones 1 a 10, un vector según la reivindicación 12, una célula según la reivindicación 13 o una composición según la reivindicación 14, de manera continua o secuencial, para restaurar o modular la expresión de dicha secuencia de ARN in vitro o ex vivo.
  16. 16. Ratón transgénico en el genoma del cual se han modificado una y/u otra de las secuencias SEQ ID NO : 3 y SEQ ID NO : 4 para prevenir o modificar la expresión de una y/u otra de dichas secuencias.
    FIGURA 1
    64000
    F4
    Mapa de la región genómica del locus P[Gal4J4C
    (P[Gal4]4C insertado en 66936)
    imagen1
    65000
    66000
    67000
    64913
    CG13334 :similar a lactato deshidrgenasa
    ,fl------------------------
    66473
    663771
    ARNpno
    <67331)
    68000 69000
    CG13333: gen proneural
    70000
    -4
    67675
    6Í12S
    T"
    68100
    ADN genómico del transgén de ARNpno
    Deleción F4 632 pb
    66936 i
    67568
    imagen2
    bolsillo
    HanannaI—
    MacaInnn
    ARNpno y ARNpca
    ARN arquéales
    eucarioticos
    secuencia CAB
    secuencia CAB
    giro en curva
    bols¡ltó\9uia /bol,¡l¡AgUla
    — Hacwnnn
    OI
    secuencia ACA
    secuencia H secuencia ACA
    Uridina
    Seudouridina
    figura 2
    imagen3
    Duración (días)
    figura 3
    Tiempo medio (muerte de moscas)
    eeooo<£Sef§
    CO
    Oí
    imagen4
    ’«nl-CS F4 mutante F4;G5
    >
    bs
    Tiempo medio (muerte de moscas)
    imagen5
    co
    -vi
    FIGURA 4 (continuación)
    Cont-CS F4 muíante F4:G5
    O
    Porcentaje de moscas muertas después de 14 h
    imagen6
    A) CONTROL: CS- pared del estómago e intestino
    imagen7
    imagen8
    imagen9
    figura 5
    B) MUTANTE: F4- pared del estómago e intestino
    imagen10
    FIGURA 5 (continuación)
    C) CONTROL: CS- ovarios
    imagen11
    D) MUTANTE: F4- ovarios
    imagen12
    FIGURA 5 (continuación)
    A) Expresión orientada de ARNpno a enterocitos bajo el control de Myo1A-Gal4 (Myo1A-Gal4;UAS-mCD8- GFP)
    imagen13
    B) Expresión orientada a enterocitos por Myo1A-Gal4 en el fondo genético mutante F4 (MyolA- GaI4,F4/F4;UAS-8M/+)
    imagen14
    C) Expresión orientada a los citoblastos intestinales (ISc) (esg-Gal4,UAS-GFP)
    imagen15
    figura 6
    D) Expresión orientada a enteroblastos: Su(H)-GBE-Gal4;UAS-mCDB-GFP.
    imagen16
    E) Expresión orientada a citoblastos intestinales (ISc) (DI-Gal4,UAS-GFP)
    imagen17
    FIGURA 6 (continuación)
    A) Expresión orientada bajo el control de esg-Ga!4 (esg-Gal4,F4/F4;UAS-8M/+)
    imagen18
    B) Expresión orientada bajo el control de Su(H)-Gal4 (Su(H)-GBE-GaI4,F4/F4;UAS-8M/+)
    imagen19
    figura 7
    C) Expresión orientada bajo el control de Üelta-Gal4 (Delta-Gal4,F4/F4;UAS-8M/+)
    imagen20
    FIGURA 7 (continuación)
    .........i............»......... i .......i ' • • ' i..... -~i....... i........
    imagen21
    +/IVT85W/*'J‘0‘<K +/+ít.í/M‘o.Üv +/K8Ít-.í/M
    imagen22
    -fc.
    05
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    c
    70
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    S 8 g S S S 3
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  17. 1 . . ■ ■ l ________ . J_____~.L-__I . 1 . , . , t ■ ■ .
    Choque térmico (36 °C)
    imagen24
    í
    c
    □
    O
    A)
    # STOCKHOLM 1.0
    Dmel-psÍ28S1153 Dsim-psi28S1153 Dsec-pSÍ28S1153 Dyak-psi28S1153 Dere-psi28S1153 Dana-psi28Sll53 Dpse-pSÍ28S1153 Dper-psi28S1153 Dwil-psi28S1153 Dmoj-psi28S1153 Dvir-psi28S1153 Dgri-pSÍ28S1153
    #=GC SS cons
    imagen25
    AAAAGCGUUAG- - - AUAUUAAACUGUGGUtJ - GAA - UUCACAAAA GAAAGCGUUAG---GUAUAAACCUGüGGUU-GAA-UUCACAAAA
    GAAAGCGUUAG--GUAUUAACCUGUGGUÍJ-UAA-UUCACAAAA
    GCÁAGCGUUGUAUAAUAUUAAACUGUGGAA-- -ACUUC-ACAAA GCAUGCGUUGAAUAAUAUUAAACUGUGGAC-GAA-UUC-CCAAA UUAGGCGUUC-AAAACAUUAAACGUUGGCU--GA-UUU-AUGAU CAuGGCGCUC-Á-AACAUUAAUCGGUGGCC-UGA-UCC-ACACG CAUGGCGCUCj - A - AACAUUAAUCGGUGGCC - UGA UCC ACACG AGAGGCGUUC-- AACAUUUAACUUUAGCCGU-UCUUU-UAAAC CCCUGCGUUG- - -AGCAGUAAAUUGUCGCU-G-A-UUG-ÁUAAU UUAUGCGUUC--AACAGUAAAUUGUCGCG-G-A-UAG-AUUAC
    UUGUGCGUUC- - -GACAGUAAAUUUUCGAU-G-ACUG- --UAGA * * * * * * * * *
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    imagen26
    UAGGCCAC-AGUUAUGCAA-uAAACGCUAGAAAAA-- -AAACGGUAGUAUUUAAUAACGUG
    UAGGCCAC-AGUUAUGCAA-UAAACGCUAGAAAAA--AAACGGUAGUAUUUAAUAACGUG
    UAGGCCAC-AGUUAUGCAA-UAAACGCUAGAAAAA---AAACGGUAGUAUUUAAUAACGUG UAGGCCAC AGUUAUGCAA GAAACGCUAGA-AAA - -ACUUGGUAGUAUUUAAUAACGUG
    UAAGCCAC-ÁGUUAUGCAA-GAAACGCUAGA-AAA AAUAGGUAGUAUUUAAUAACGUG
    UAGGCUAG-UGUUAUGCAC-GCAACGCUAGA-GAA AAUUGGUAGUAUUUAAUAAUGCG
    UCGGCCAC-AUUUAUGCAC-GCAGCGCCAGA-U- -AAUAGUAGGCAGCAUUUAAUAAUGUA UCGGCCAC-AUUUAUGCAC-GCAGCGCCAGA-U- -AAUAGUAGGCAGCAUUUAAUAAUGUA UAAGCUAUUUGUUAUGCAA-GUAACGCUAGA-AUAUAAUUÜCUGCAACAUUUAAUAAUGCU
    UAGGCGAC-GAUAAUGCAA-ACAACGGUAGA---AAAAACUAACGACAUUUAAUAAUACA
    UAGGCGAC-AGUUAUGCAAGGCAACGCUAGA----AUAAGCAGACGACAUUUAAUAAUGCA
    UAGGCGAA-AAUUAUGCAAGGCAACGCUAGA-CCAAUUAGAUGACGACAUUUAAUAAUGCA ★ ★★★ ★★★★★★ ★ ★ ★ ★★★ ★★★★★★★★★
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    imagen27
    UUGACUAACAUCUGCGGAUAA.GA-AGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA UUGACUAACAUCUGCGGAUAAAACAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA UUGACUAACAUCUGCGGAUAAAAUAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA CUGACUAACGUCUGCGGAUAAA -AGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAUUA CUGACUAACAUCUGCGGAUAAG--AGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAAUA UUGGUGGCAAAUCUAUCGAUUUUGAUCUUCGCAUUUUGAGGUACUAG-CACAGUU UUGGUlJCCAA-AU--GACUC--AGACUUUUGCAUUUUGAGGUGUUAGCCACAACG UUGGUUCCAA-AU--GACUC--AGACUUUUGCAUUUUGAGGUGUUAGCCACAAAG
    UUGGUCGUAUACU AACA-AAAAUCUCAGCAUUUUGAGGUGUCUGCUACAAUU
    UUGACCACUAAAU---CCCA--UGAACAUUGCAUUUUGAGGUGUC-GCGACAUGU UUGGCCGACAAAC---UCCA--CGGCCUUUGCGUUUUGAGGUGUC-GCCACAUGU
    UUGGCCGAUUAAC---UCAG-------AU-CUUGCAUUUUGAGGUGUC-GCCACAUGU
    * * ** ********* * * *
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    figura 9
    imagen28
    # STOCKHOLM 1.0
    Dmel-psi28S1153 AAAAGCGUUAGAUAUGAAACUGUGGUUGAAUUCACAAAAU
    hgl8-chr11_12 8 2 2 7 2 2 -12 8 2 2 8 8 0 GUAAGUGUA-GCCUAGAAAUUGGGGCUGGAUUUGAA-AAU
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    #=GC SS cons //
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    UAG C CCCAAUUCUGCAAUUÜUCACCGCAAUAAAAiGCUUCUCCAGUUAUACAUGGUGAUÜGGÜCUUGAUGGG
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    (((((......................))))).................))))))).)))))))..)))..))).
    figura 10
    A) Homólogo de ratón-1
    # STOCKHOLM 1.0
    Dmel-psÍ28S1153 AAAAGCGUUAGAUAUUAAACUGUGGUUGAA'
    mm9-chr15_3 0336889-30337017 AAAGGGGUUGAAGAAUG-------GU--AUGGA
    ★★★★★★★ ★ ★ ★★ ★ ★
    #=GC SS_cons ...((((((....................................................................
    //
    UUCACAAAAUAGGCCACAGUUAUGCAAUAAACGCUAGAAAAAAAACGGUAGUAUUUAAUA UUCAGA--AUG------------AACUAUCAGAGAAACUCOAGAGCCAGCA-GGAAACAUU--AUA
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    ACGUGUUGACUAACAUCUGCGGAUAAGAAGCUUUGCGUUUUGAGGUACUAACCACAGUA GAGC CUUUG CUACAAUGU C CU GUUU C-UUUCUUGGCU--UUUAGUUCUGUUCCACAGAU
    ★ ★ * ★★★ ****** ★ * ic ie * * * * * ******
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    figura 11
    B) Homólogo de ratón-2
    imagen29
    FIGURA 11 (continuación)
    Control (CS)
    Mu tan te (F4)
    imagen30
    figura 12
    d) Jóvenes (4 días) Viejas (40 días)
    imagen31
    CS F4 es F4íG5 CS F4 GS E4;CS ¿foMi MvoJ4
    14 F4;*M
    FIGURA 12 (continuación)
    FIGURA 13
    Distancia recorrida (mm)
    M
    S 8
    oooooooooo
    imagen32
    fl)
    o
    o
    V)
    3
    C7
    Distancia movida (mm) 3
    yi
    o
    o
    en i\>
    o
    ít> íD fi>
    o
    O) tn «i
    imagen33
    A)
    Número de huevos puestos por hembra/día durante 17 días
    imagen34
    B)
    Número total de huevos puestos por hembra durante 17 días
    1000 900 300 700 600 600 400 300 200 100 0
    Cont-CS Muíante F4 4M F4;4M
    figura 14
    imagen35
    A)
    Muerte de un enterocito
    imagen36
    ISC EB EC EE BL M
    ISC: Citoblastos intestinales EB: Enteroblastos Ente roe ¡tos
    EE: Células enteroendocrinas BL: Lámina basal M: Células musculares viscerales PM: Membrana peritrófica
    B)
    imagen37
    imagen38
    figura 15
    imagen39
    EC moribunda
    Estrés alimentario
    Herída/daño
    Diferenciación
    citocina
    División
    /JakZStat
    División
    FIGURA 16
    imagen40
    Control (CS)
    Mutante-F4
    500pb
    1) CG9339: skywalker: 345-400-432-462pb
    2) RP49 control de 300 pb
    3) Control sin contaminación por ADN genomico
    figura 17
    imagen41
    FIGURA 18
    imagen42
    Klarsicht
    ONM
    ribosomas
    nesprinaj
    MANI
    Mota
    SREBPJ
    Lámina nuclear
    apical
    núcleo
    Citoplasma
    emerina
    Nucleoplasma
    Cromatina
    (laminas A B y C)
    figura 19
    FIGURA 20
    imagen43
    no humam
    18S humam
    Humano
    Ratón
    ni
    imagen44
    figura 21
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