BR112016010342B1

BR112016010342B1 - Uso de uma sequência de rna isolada ou sintética, vetor que permite a expressão de uma sequência de rna, composição e uso de uma sequência de rna

Info

Publication number: BR112016010342B1
Application number: BR112016010342-4A
Authority: BR
Inventors: Jean-René Martin
Original assignee: Ninovax
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2014-11-07
Publication date: 2023-01-31
Also published as: ES2671326T3; EA037923B1; TR201807186T4; CN106232816A; US9951332B2; EP3066199A1; WO2015067727A1; HUE037525T2; JP6879738B2; AU2014345581B2; JP2017502650A; AU2014345581A1; JP2020010707A; EA201690951A1; KR102269438B1; US20160298112A1; FR3012739A1; PT3066199T; KR20160079112A; CN106232816B

Abstract

SEQUÊNCIA DE RNA ISOLADA OU SINTÉTICA, SEQUÊNCIA DE DNA, VETOR QUE PERMITE A EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE RNA, CÉLULA QUE COMPREENDE UMA SEQUÊNCIA DE RNA, COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE UMA SEQUÊNCIA DE RNA, UTILIZAÇÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE RNA, CAMUNDONGO TRANSGÊNICO, MÉTODO QUE PERMITE AVALIAR A EFICÁCIA COSMÉTICA DE UM COMPOSTO DE TESTE, E, MÉTODO QUE PERMITE AVALIAR A EFICÁCIA TERAPÊUTICA DE UM COMPOSTO DE TESTE. A presente invenção se refere à utilização de sequências de RNA específicas como medicamento. Esta se refere mais particularmente à utilização de pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs), dos quais os inventores demonstraram o envolvimento nos mecanismos de envelhecimento. Os snoRNAs da invenção podem ser utilizados, em particular, para aumentar a resistência ao estresse de um indivíduo, para combater os efeitos deletérios do envelhecimento, tipicamente para prevenir ou tratar uma doença degenerativa, uma laminopatia, a diabetes, a obesidade ou um câncer, assim como, de modo mais geral, para prolongar a duração de vida de um indivíduo. Os snoRNAs da invenção também podem ser utilizados no tratamento da infertilidade. Além disso, a invenção se refere aos vetores, às células, aos animais transgênicos e às composições com capacidade para expressar um snoARN de acordo com a invenção, assim (...).

Description

[001] A presente invenção refere-se ao uso de sequências particulares de RNA como um medicamento. Mais precisamente, a mesma refere-se ao uso de pequenos RNAs nucleolares (snoRNAs) que os inventores demonstraram estarem envolvidos nos mecanismos de envelhecimento. Os snoRNAs da invenção podem ser usados em particular para o aumento da resistência de estresse de um indivíduo, a fim de lutar contra os efeitos deletérios do envelhecimento, tipicamente para a prevenção ou tratamento de uma doença degenerativa, em particular neurodegenerativa, uma laminopatia, em particular síndrome de Hutchinson-Gilford (SHG) (também conhecida como progéria), diabetes, obesidade ou um câncer e, de forma mais genérica, a fim de prolongar a vida de um indivíduo. Os snoRNAs da invenção também podem ser usados no tratamento de infertilidade.

[002] A invenção refere-se adicionalmente a vetores, células, animais transgênicos e composições capazes de expressar um snoRNA da invenção, e métodos que usam quaisquer produtos acima da invenção como ferramenta para a identificação de uma molécula ativa na prevenção ou tratamento de uma patologia, anormalidade, desordem ou uma deterioração aparente ou funcional ligada a um mecanismo de envelhecimento.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[003] Os mecanismos de envelhecimento (isto é, declínio progressivo na capacidade de sobrevivência e reprodução com a idade) deixaram a sociedade e a comunidade científica perplexas por séculos. Atualmente, existem duas teorias dominantes, sendo que uma afirma que o envelhecimento resulta de um caminho evolucionário geneticamente programado e a outra que o envelhecimento é uma consequência normal da existência durante a qual os danos celulares e moleculares se acumulam. Esses danos incluiriam danos de oxidação induzidos por radicais livres, mitocôndrias defeituosas, mutações somáticas, diminuição progressiva de telômeros, morte programada de célula e proliferação de células danificadas, etc. (Semsei I. (2000) On the nature of aging. Mech Aging Dev 117:93-108).

[004] Foi mostrado, em organismos como leveduras e camundongos, que a redução calórica exerce um impacto positivo decisivo na prolongação da duração de vida (Sohal, R S, Weindruch, R (1998) Oxidative stress, caloric restriction, and aging. Science 273:59-63; Finch, C E, Revkun, G. (2001) The genetics of aging. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 2:435-462). Estudos recentes mostraram que restrição calórica também seria eficaz em primatas, incluindo humanos (Roth, G S, Lasnikov, V, Lesnikov, M, Ingram, D K, Land, M A (2001) Dietary caloric restriction prevents the age-related decline in plasma melatonin levels of rhesus monkeys. J Clin Endocrinol Metab. 86: 3292-5; Roth G S, Lane M A, Ingramn D K, Mattison J A, Elahi D, Tobin J D, Muller D, Metter E J (2002) Biomarkers of caloric restriction may predict longevity in humans. Science. 297: 811-813; Walford R L, Mock D, Verdery R, MacCallum T. (2002) Calorie restriction in biosphere 2: alterations in physiologic, hematologic, hormonal, and biochemical parameters in humane restricted for a 2-year period. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 57: 211-24). Infelizmente, é provável que a maioria dos humanos não seja capaz de seguir a dieta restrita necessária para se beneficiar dessa constatação.

[005] Por diversos anos, muitos grupos de pesquisa se dedicaram a identificar os genes e sinalizar os caminhos envolvidos no processo de envelhecimento. Os estudos aqui relatados são conduzidos em diversos organismos, incluindo Saccharomyces cerevisiae como leveduras, Caenorhabditis elegans como vermes e Drosófila melanogaster como moscas (Fontana et al., 2010), e permitiram a identificação de uma lista crescente de genes. Muitos deles estão envolvidos em uma sinalização hormonal e são conservados em uma grande variedade de organismos eucarióticos. Tornou-se claro que, ao menos para espécies inferiores, os caminhos responsáveis pelo desenvolvimento e crescimento no princípio da vida possuem uma influência vitalícia e até mesmo condiciona de forma parcial a sua duração. Esses estudos também mostraram de forma indireta a importância de capacidade metabólica e resistência ao estresse para a avaliação da vida de um indivíduo.

[006] Por exemplo, os mutantes do gene clk-1 de Caenorhabditis elegans foram envolvidas na redução de produção mitocondrial extra das espécies reativas a um oxigênio (Hekimi, S, Guarente, L. (2003) Genetics and the specificity of the aging process. Science 299:1351-1354). A patente WO 98/17823 descreve a função do gene clk-1 no processo de desenvolvimento e longevidade. A mesma reivindica particularmente um método para o aumento do tempo de vida de um indivíduo através da regulação da expressão do gene clk-1.

[007] Uma mutação do Gene Matusalém (que codifica para uma proteína G acoplada ao receptor) também foi descrita como capaz de aumentar o tempo de vida de Drosófila por volta de 35% (US 6.303.768).

[008] A diminuição de telômero também é conhecida como um mecanismo responsável pelo envelhecimento celular. Em vertebrados, a telomerase é uma ribonucleoproteína (RNP) de transcriptase reversa cujo papel é manter o comprimento dos telômeros através da adição de DNA telomérico à extremidade dos cromossomos na divisão de células eucarióticas (Kiss, 2002). Em humanos, uma mutação na caixa H/ACA de snoRNA da telomerase causa uma doença genética pleiotrópica congênita de disceratose, cujos pacientes apresentam baixa de telômeros (Mitchell et al., 1999; Vulliamy et al., 2001). Apesar de o esforço da comunidade científica para a decodificação dos mecanismos de envelhecimento e identificação de novos alvos terapêuticos para atrasar este processo e/ou combater seus efeitos deletérios, as ferramentas disponíveis ainda são insuficientes. A necessidade de ferramentas que permitam “envelhecer bem”, isto é, sem doenças e desconforto em geral associados à velhice, é sentida ainda mais agora que o progresso médico combinado com melhora geral nas condições de vida já permite que a população humana, em apenas algumas décadas, tenha a expectativa de vida aumentada de maneira significativa.

RESUMO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção refere-se ao uso terapêutico ou profilático das sequências de RNA de interesse para o qual os inventores demonstraram envolvimento particular nos mecanismos de envelhecimento. Eles mostraram especialmente a capacidade destas sequências de aumentar de forma espetacular o tempo de vida de um indivíduo parando os mecanismos de envelhecimento e combatendo os efeitos deletérios associados aos mesmos. As sequências da invenção também combatem doenças relacionadas ao envelhecimento como doenças degenerativas, laminopatias e cânceres, assim como diabetes e obesidade. Eles provaram eficácia especial no tratamento de infertilidade ou esterilidade (isto é, dificuldade em concepção ou inabilidade em concepção) assim como aumento na resistência de indivíduos, em particular indivíduos que alcançaram a maturidade sexual, de preferência indivíduos mais velhos, para enfatizar.

[010] Uma primeira matéria da invenção refere- se a uma sequência de RNA sintética ou isolada que compreende a sequência SEQ ID NO: 1, uma sequência homóloga, de preferência uma sequência ortóloga, ou uma sequência funcionalmente análoga, para uso como um medicamento.

[011] Os inventores demonstraram que a sequência de RNA SEQ ID NO: 1 constatada em Drosófila corresponde a sequências ortólogas em mamíferos como primatas e seres humanos e em roedores como camundongos e ratos. A invenção também abrange o uso, de uma forma ou outra das aplicações descritas neste texto de uma sequência de RNA sintética ou isolada de preferência escolhidas dentre a sequência SEQ ID NO: 2 de origem humana e as sequências SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 de origem murina. As sequências SEQ ID NO: 2, 3, 4, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 22, 24, 26, e 28 identificadas na Tabela 1 deste texto são exemplos de sequências ortólogas à SEQ ID NO: 1.

[012] Outra matéria da invenção é uma codificação de sequência de DNA para uma sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção.

[013] A invenção também se refere a uma expressão in vitro, ex vivo ou in vivo permitindo vetor de uma sequência de RNA de acordo com a invenção.

[014] A invenção também se refere à célula que compreende uma sequência de RNA de acordo com a invenção ou transformada por um vetor de acordo com a invenção, assim como uma composição que compreende um produto de acordo com a invenção e um apoio aceitável dietético ou farmacêutico.

[015] A invenção também se refere ao uso de uma sequência de RNA, vetor, célula ou uma composição de acordo com a invenção, de forma contínua ou sequencial, a fim de restaurar ou modular a expressão da dita sequência de RNA in vivo, in vitro ou ex vivo.

[016] Outro objeto da invenção é um camundongo transgênico cujo genoma foi geneticamente modificado a fim de evitar ou modificar, de preferência alterar, a expressão de uma sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção, tipicamente uma e/ou outra dentre as sequências SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

[017] A invenção também abrange um método para avaliação da eficácia cosmética ou terapêutica de um composto teste para combater os efeitos deletérios de envelhecimento ou estresse, ou para combater a infertilidade, o dito método compreende i) exposição de uma célula ou população de células que não expressa a sequência de RNA da invenção ou que expressa uma versão anormal da dita sequência de RNA; ou um camundongo transgênico de acordo com a invenção, ii) avaliação dos efeitos, se existir, do composto teste no fenótipo da(s) dita(s) célula(s) ou dito camundongo transgênico, e iii) determinação da eficácia cosmética ou terapêutica do dito composto teste, uma restauração da atividade e/ou expressão da dita sequência de RNA sendo correlacionada com a eficácia do dito composto teste.

[018] A invenção também cobre ainda um método para avaliação da eficácia terapêutica ou cosmética de um composto teste a fim de combater os efeitos deletérios de envelhecimento ou estresse, ou para combater a infertilidade, sendo que o dito método compreende i) a exposição de uma célula de acordo com a invenção que compreende uma sequência de RNA de acordo com a invenção ou uma população de células que compreendem uma célula de acordo com a invenção; ii) avaliação dos efeitos, se houver, do composto teste no fenótipo da dita célula ou população de células, e iii) determinação da eficácia terapêutica ou cosmética do dito composto teste, um aumento da atividade e/ou expressão da dita sequência de RNA sendo correlacionada com a eficácia do dito composto teste.

[019] A invenção também se refere a kits que compreendem ácidos nucléicos, vetores, cassetes e/ou células conforme descritas previamente.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[020] A invenção resulta de uma demonstração feita pelos inventores da influência de uma pequena sequência de DNA nucleolar (snoRNA:W28S-1153 chamado “juventude”, identificado neste texto como SEQ ID NO: 1) no tempo de vida da Drosófila. Este snoRNA foi identificado como parte de uma varredura sistemática de snoRNAs associados ao genoma da Drosófila (Huang et al., 2005) sem que qualquer função seja atribuída à mesma até hoje.

[021] Os inventores caracterizaram esta sequência e mostraram de forma notável que uma exclusão genômica de 632 pares de base da região F4 do genoma de Drosófila que contém o snoRNA:W28S-1153, diminui o tempo de vida da Drosófila em torno de 30%. Eles então demonstraram que a superexpressão desta sequência de RNA, por exemplo, como o uso de um transgene que contém DNA genômico que codifica para este snoRNA, aumenta espetacularmente o tempo de vida da Drosófila em torno de 100%. As moscas que têm superexpressão da sequência de RNA da invenção vivem até duas vezes mais. Adicionalmente, os inventores identificaram e detectaram a expressão as sequências de “juventude” ortólogas em camundongos e humanos.

CARACTERÍSTICAS DAS SEQUÊNCIAS DE RNA E OUTROS PRODUTOS DA INVENÇÃO

[022] Conforme explicado anteriormente, a invenção faz referência a uma sequência de ribonucleotídeo sintético ou isolado (Sequência de RNA) com as características funcionais da sequência SEQ ID NO: 1 identificada originalmente em Drosófila (Drosófila melanogaster), para uso como um medicamento em um indivíduo que pode se beneficiar do mesmo, tipicamente um animal ou inseto, por exemplo, um mamífero ou um roedor, de preferência um ser humano.

[023] “Medicamento” significa uma substância que possui propriedades preventivas ou curadoras. No contexto da invenção, um medicamento é projetado a fim de curar, promover cura, alívio ou evitar, em um indivíduo conforme definido anteriormente, uma patologia, anormalidade ou deficiência relacionada a um processo de envelhecimento anormal ou simplesmente indesejado.

[024] Na Drosófila, a sequência de RNA de interesse é compreendida na região genômica identificada como região F4, sendo que a mesma é localizada sobre o cromossomo 2R. Esta sequência de nucleotídeo é, para as primeiras espécies de Drosófila (Drosófila melanogaster) estudada pelos inventores, constituída de 148 pares de base. A mesma é identificada neste texto como SEQ ID NO: 1.

[025] As homólogas/ortólogas assim como variantes e análogas funcionais da sequência SEQ ID NO: 1 são, da mesma forma, sequências de interesse que são objetos da presente invenção.

[026] O termo “homólogo” é usado no contexto da presente invenção a fim de designar uma estrutura cuja sequência de nucleotídeo é idêntica ou suficientemente próxima à sequência SEQ ID NO: 1, identificada nesta primeira espécie de Drosófila, a ser considerada equivalente da mesma em outras espécies (Drosófila, inseto ou qualquer outro animal). Uma sequência é considerada como um homólogo da sequência SEQ ID NO: 1 se a mesma tem com isso, ou com um fragmento da mesma ao menos 50 nucleotídeos consecutivos, uma identidade de sequência de ao menos 70%, 80% ou 85%, de preferência ao menos 90 ou 95 %, mais de preferência ao menos 96, 97, 98 ou 99% obtidas, por exemplo, pelo programa de alinhamento de sequência blastN (Altschul et al., 1990), ou pelo programa INFERNAL para "INFERence of RNA ALignment", que identifica as sequências de DNA a partir da estrutura de RNA e suas similaridades de sequência. Duas sequências geneticamente homólogas de duas espécies diferentes são consideradas ortólogas se as mesmas descendem a partir de uma sequência única presente no último ancestral comum das duas espécies.

[027] A porcentagem de identificação é determinada pela comparação de duas sequências para as quais um alinhamento aperfeiçoado foi feito. A porcentagem de identidade é calculada através da determinação do número de posições para o qual um resíduo idêntico aparece nas duas sequências na mesma posição dividido pelo número total de posições e multiplicado por 100. O alinhamento aperfeiçoado das duas sequências pode ser obtido, por exemplo, com um algoritmo de busca de homologia local (Smith & Watherman, 1981) ou sistemas equivalentes conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.

[028] O termo “análogo” designa qualquer mimético que é um composto químico existente na natureza e isolado do mesmo, ou produzido de forma artificial, e que tem ao menos uma das funções endógenas da sequência de nucleotídeo que a mesma imita (Sequência de RNA funcionalmente equivalente), por exemplo, todas as funções endógenas da sequência de nucleotídeo que a mesma imita. Um exemplo de um composto análogo consiste em, por exemplo, uma sequência que permite o splicing dos mesmos genes. Um objetivo particular da invenção, portanto, refere-se a uma sequência análoga à SEQ ID NO: 1 que permite o splicing de um ou mais genes escolhidos dentre Ir56d, buttonhead, klarsicht, CG3262, CG30502 (hidroxilase-2 de ácidos graxos - fa2h), CG11125, CG9339, e CG40006 de Drosófila melanogaster. Os experimentos conduzidos pelos inventores demonstraram, por exemplo, que o gene CG9339 (chamado skywalker) (Uytterhoeven et al., 2011) não tem splicing correto no mutante F4, indicando que o snoRNA de juventude está envolvido no splicing alternativo deste gene (consulte a Figura 17). Resultados similares também foram obtidos em uma cópia do gene klarsicht, para o qual RNA com menos splicing é observado no mutante F4 do que nas moscas de controle silvestres Canton-S (Figura 18A), assim como para o gene CG30502, que codifica o gene fa2h (Figura 18B), sendo que o último foi envolvido em humanos em diversas formas de desmielinização, como neurodegeneração relacionada ao acúmulo de ferro, leucodistrofias (tipicamente aquelas relacionadas às mutações do gene fa2h) e paraplegia espástica hereditária (tipicamente paraplegia espástica hereditária SPG35) (Dick et al., 2008; 2010; Pierson et al., 2012).

[029] O termo “variante funcional” significa qualquer ácido nucléico que tem uma ou mais modificações ou mutação (isto é, por exemplo, uma exclusão, substituição ou adição de uma ou mais bases) relativa a sequências parentais descritas nesta patente, e permitindo as aplicações descritas no contexto da presente invenção.

[030] Uma sequência considerada homóloga, de preferência uma ortóloga, de uma sequência referência no sentido da invenção é um exemplo de uma variante funcional no sentido da invenção da dita sequência de referência. Tal sequência pode ser natural, recombinante ou sintética.

[031] A sequência SEQ ID NO: 1 é uma sequência altamente conservada durante a evolução e está presente em diversas espécies de animais. Os inventores, portanto, mostraram de forma notável que esta sequência está presente em 12 outras espécies de Drosófila cujo genoma é conhecido. Os exemplos de sequências homólogas/ortólogas à sequência de RNA SEQ ID NO: 1 portanto compreende também as sequências de RNA SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 22, 24, 26, e 28 identificadas na Tabela 1 deste texto (consulte Figura 9).

[032] Os inventores também identificaram uma sequência de RNA ortóloga nos seres humanos, localizada no cromossomo 11, na posição 12822722-12822811. É a sequência identificada neste texto como SEQ ID NO: 2. Os inventores também identificaram duas sequências ortólogas de RNA em camundongos (estas são as sequências identificadas, respectivamente, como SEQ ID NO: 3 e 4 neste texto), localizada no cromossomo 15, na posição 30336889-30337017 (SEQ ID NO: 7) e no cromossomo 18, na posição 6495012-6495091 (SEQ ID NO: 8).

[033] As sequências de nucleotídeo de interesse identificadas na Drosófila, humanos e camundongos estão listadas na Tabela 1 abaixo.TABELA 1:

[034] Uma matéria particular da invenção refere-se ao uso da sequência de RNA SEQ ID NO: 1 para a identificação de um gene alvo, caracterizado na dita sequência SEQ ID NO: 1 capaz do reconhecimento de uma sequência alvo dentro de um gene de uma Drosófila melanogaster gene de preferência escolhido dentre Ir56d, buttonhead, klarsicht, CG3262, CG30502 (hidroxilase-2 de ácidos graxos - fa2h) e CG11125, CG9339, CG40006, sendo que a dita sequência alvo é de preferência escolhida dentre SEQ ID NO: 31 (TGGTTGAATTCACAAAA), SEQ ID NO: 32 (TTGAATTCACAAAATA), SEQ ID NO: 33 (AATTCACAAAATAGGC), SEQ ID NO: 34 (AAGCGTTAGATATTAA), SEQ ID NO: 35 (ACATCTGCGGATAAGA), SEQ ID NO: 36 (AAGCTTTGCGTTTTGA), e SEQ ID NO: 37 (AGAAGCTTTGCGTTTT), ou uma sequência análoga da mesma.

[035] No contexto da presente invenção, as sequências de RNA de interesse estão, de preferência, sob a forma de snoRNAs. No contexto da invenção, o termo “snoRNAs” engloba um grupo de RNAs não codificados presentes em todas as células eucarióticas. Eles estão localizados no núcleo e mais particularmente no nucléolo onde os mesmos são associados a proteínas coma s quais eles formam ribonucleoproteínas nucleolares pequenas ou snoRNPs. Eles são, em geral, produzidos a partir de introns de pré-mRNA. Na escala evolucionária, estes RNAs não codificados estão presentes de archaea a mamíferos. Os snoRNAs podem ter diversas funções, como modificação de RNA ribossômico, como 2'-O-metilação de ribose ou pseudouridilação de diversas classes de RNA. Eles foram envolvidos no processo nucleolítico de RNAs ribossômicos ou mesmo na síntese de DNA telomérico (Kiss, 2002; Kiss et al., 2010; Ye, 2007). Existem duas classes principais de snoRNAs: a que compreende uma caixa C/D e a que compreende uma caixa H/ACA (Figura 2A). As caixas C/D servem como um guia para 2’-O-metilação de ribose em locas específicos, enquanto a caixas H/ACA direcionam a conversão de uridina em pseudouridina (Kiss, 2002; Gardner et al., 2010; Huang et al., 2005) (Figura 2B).

[036] O snoRNA:W28S-1153 (juventude) de interesse, identificado em uma primeira espécie de Drosófila, pertence à classe H/ACA, isto é, a sua estrutura compreende uma caixa H/ACA. A mesma, portanto, estaria envolvida em pseudouridilação (isto é, a conversão de uridina em pseudouridina) durante a maturação de RNA ribossômico, e regularia a síntese de proteína de certos genes.

[037] Os snoRNAs de acordo com a invenção podem ser modificados quimicamente, tipicamente para o aumento da resistência dos snoRNAs para nucleases, a fim de conferir uma afinidade/seletividade melhor e, portanto, uma funcionalidade melhor dos snoRNAs. As modificações referem-se tipicamente a uma ligação de nucleosídeo ou internucleosídeo. Elas podem se referir a açúcar, por exemplo (tipicamente a posição 2' do açúcar), a base nitrogenada do nucleosídeo (que compreende tipicamente um substituo na posição 2, 4 ou 6) ou um (ou mais) grupos fosfatos.

[038] A modificação pode consistir em, por exemplo, uma aminação, halogenação, por exemplo, fluoretação ou alcalinização, por exemplo, metilação. Um grupo de açúcar modificado pode, portanto, ser escolhido, por exemplo, a partir dentre grupos de 2'-O-metílico e 2’-O-metoxietílico.

[039] Um nucleotídeo modificado pode ser um nucleotídeo que compreende uma base heterocíclica incapaz de criar ligações de hidrogênio com bases de DNA ou RNA heterocíclicas.

[040] A modificação da ligação de internucleosídeo é, por exemplo, escolhida dentre ligações de fosforotioato, metilfosfonato, fosfotriester, fosforoditioato e fosfoselenato.

[041] A presente invenção também se refere a sequências de deoxiribonucleotídeo (DNA) responsável pela expressão das sequências de RNA de interesse da invenção. A sequência de DNA que permite a expressão da sequência de RNA SEQ ID NO: 1 é a sequência identificada na presente invenção como SEQ ID NO: 5, a que permite a expressão da sequência SEQ ID NO: 2 é a sequência identificada na presente invenção como SEQ ID NO: 6, a que permite a expressão da sequência SEQ ID NO: 3 é a sequência identificada na presente invenção como SEQ ID NO: 7, e que permite a expressão da sequência SEQ ID NO: 4 é a sequência identificada na presente invenção como SEQ ID NO: 8.

[042] Um objeto da invenção, portanto, refere- se também a uma sequência de DNA isolada ou sintética selecionada do grupo que compreende SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, e SEQ ID NO: 30, e caracterizada de forma que permite a expressão de uma sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção.

[043] Conforme os snoRNAs, os DNAs de acordo com a invenção podem ser quimicamente modificados (consulte as modificações químicas possíveis acima).

[044] A invenção também se refere a qualquer cassete de expressão recombinante caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucléico de interesse de acordo com a invenção, conforme definido neste texto. O termo cassete de expressão designa um constructo/construção de ácido nucléico que compreende uma sequência de ácido nucléico que permite a expressão de uma sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção e uma região reguladora, ligada de forma operacional. A expressão "ligada de forma operacional" indica que os componentes são combinados de forma que a expressão da sequência de ácido nucléico (responsável pela expressão da sequência de RNA de interesse) e/ou o direcionamento da sequência de RNA de interesse estão sob o controle dos promotores transcricionais. Tipicamente, a sequência promotora é colocada à montante da sequência de ácido nucléico, em uma distância a partir da última compatível com o controle de expressão. As sequências espaçadoras podem estar presentes entre os elementos reguladores e a sequência de codificação, contanto que os mesmos não impeçam a expressão e/ou direcionamento da sequência de RNA de interesse.

[045] Outro objetivo da invenção refere-se a qualquer vetor (expressão) que compreende um ácido nucléico ou um cassete conforme definido anteriormente que permita a expressão de uma sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção em uma célula hospedeira ou um organismo hospedeiro. O vetor pode ser um DNA ou RNA, circular ou de outra forma, filamento simples ou duplo. O mesmo é tipicamente um plasmídeo, fago, vetor viral (escolhido, por exemplo, dentre vetor adenoviral, vetor retroviral, um vetor associado a adenovírus, um vetor lentiviral, um vetor poxvirus, um vetor herpético, etc.), um cromossomo artificial ou cosmídeo. De forma vantajosa, é um vetor capaz de transformar uma célula eucariótica, de preferência uma célula animal, tipicamente uma célula humana, de preferência uma célula de origem intestinal ou ovariana. Tais vetores são bem conhecidos aos indivíduos versados na técnica e são descritos particularmente no pedido de patente WO 06/085016 ou nos artigos de Barton e Medzhitov, 2002; Tiscornia et al., 2004; Xia et al., 2002 et Shen et al., 2003.

[046] Um vetor preferencial que permite a expressão de uma sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção pode ser escolhido dentre, por exemplo, um plasmídeo, um cosmídeo, um vetor viral ou um fago. Um vetor preferencial utilizável em particular na Drosófila é o vetor pChs-Gal4, no qual é inserido, à montante do fator de transcrição Gal4, uma sequência de DNA específica, conhecidas por regular a expressão de um dado gene em um dado tecido, como por exemplo Myo1A-Gal4, snail-Gal4, Su (H)-GBE-Gal4, Delta-Gal4. De forma simultânea, um segundo vetor (pUAs- snoRNA) que compreende o gene efetor de interesse, aqui o snoRNA, é de preferência posicionado à jusante das sequências regulatórias de SAM (Sequência de Ativação à Montante), sedo que a última é reconhecida pelo fator de transcrição P[GAL4]. Cada um desses dois vetores é, então, introduzido por transgênese em um animal. Essas duas linhas de animais são então cruzadas. Esse sistema é chamado de: sistema de expressão binária P[GAL4] (Brand e Perrimon, 1993; Elliott e Brand, 2008). Portanto, mais especificamente, os vetores Myo1A-Gal4, snail-Gal4, Su(H)-GBE-Gal4 e Delta-Gal4 compreendem elementos que promovem e regulam a expressão da dita sequência de RNA em células intestinais, enquanto os vetores nanos-Gal4, ou MTD-(maternal-Tubulina)-Gal4 compreendem elementos promotores e reguladores que promovem a expressão da dita sequência de RNA os ovários.

[047] Os vetores da invenção podem compreender ainda uma origem de replicação, um gene de seleção, um gene repórter e/ou uma sequência de recombinação, etc. os vetores podem ser construídos por técnicas de biologia molecular padrão, bem conhecidas pelos indivíduos versados na técnica, com o uso de, por exemplo, enzimas de restrição, ligação, clonagem, replicação, etc. Exemplos específicos de vetores no sentido da invenção são fornecidos nas partes experimentais. Estes vetores podem incluir, por exemplo, o sistema binário P[GAL4] (mencionado acima) (Brand e Perrimon, 1993; Elliott e Brand, 2008).

[048] A invenção também se refere a uma célula que compreende uma sequência de RNA de acordo com a invenção ou transformada por meios de um constructo ou vetor de acordo com a invenção. A célula é, de preferência, uma célula intestinal ou ovariana. Ainda mais preferencialmente, é uma célula-tronco intestinal, um enteroblasto, um enetrócito, uma célula enteroendócrina, uma célula nurse ou um oócito.

[049] A invenção também compreende o uso de um produto de acordo com a invenção, tipicamente uma sequência de RNA, uma sequência de DNA, um vetor ou uma célula de acordo com a invenção, de forma contínua ou sequencial, a fim de restaurar ou modular, tipicamente ampliar, in vitro, ex vivo ou in vivo, a expressão da sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção.

[050] A invenção também se refere a um camundongo transgênico cujo genoma (tipicamente SEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8) foi geneticamente modificado, com o uso de técnicas bem conhecidas pelos indivíduos versados na técnica, a fim de evitar ou modificar, por exemplo aumentar o diminuir, a expressão, de preferência alterar a expressão de um ou outro da SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

[051] O camundongo é modificado geneticamente de forma vantajosa através de técnicas de recombinação homóloga (knock-in, knock-out, knock-down) conhecidas pelos indivíduos versados na técnica, incluindo, por exemplo, o uso do sistema CRE/LOX.

[052] A invenção também se refere a composições que compreendem uma sequência de RNA, uma sequência de DNA, um constructo, um vetor ou uma célula de acordo com a invenção.

[053] As sequências de RNA da invenção são muito estáveis e muito resistentes in vitro. Entretanto, no caso de uma administração em um indivíduo a ser tratado, as composições de acordo com a invenção podem ainda compreender vantajosamente um suporte aceitável dietética e farmaceuticamente.

[054] A expressão “suporte dieteticamente aceito” designa um carreador que permite que o indivíduo ingira e digira sem risco que a composição compreenda uma sequência de RNA, um constructo, um vetor ou uma célula de acordo com a invenção que compreende tal sequência, e capaz de proteger a dita sequência de qualquer ataque, em particular relacionado à digestão de alimentos, que pode ser alterado antes de o mesmo produzir sua ação terapêutica.

[055] A expressão “suporte farmaceuticamente aceitável” designa um carreador que permite a administração livre de riscos d composição que compreende uma sequência de RNA, um constructo, um vetor ou uma célula de acordo com a invenção que compreende tal sequência, de acordo com uma das várias de administração possíveis descritas abaixo.

[056] Vantajosamente, o carreador da presente composição facilita a penetração do RNA de interesse, do constructo ou do vetor de expressão de acordo com a invenção no interior de células, idealmente no interior de células particulares conforme identificado neste texto, do indivíduo sendo tratado, e/ou proteger o RNA, o constructo ou o vetor de expressão de qualquer dano que possa prejudicar sua eficácia.

[057] A escolha do carreador assim como o conteúdo da substância ativa no carreador é determinada em geral em relação à solubilidade e propriedades químicas da substância ativa, o modo de administração e as características do indivíduo a ser tratado.

[058] Os carreadores ou suportes utilizáveis e farmaceuticamente aceitáveis incluem polímeros catiônicos naturais como quitosana ou atelocolágeno ou polímeros sintéticos, como poli(L-lisina), polietileneimina (PEI) ou dendrímeros, que formam complexos com os ácidos nucléicos da invenção; lipossomos; lipossomas catiônicos; lipossomas galactosilados; lipossomas revestidos por um ligando que permite que os mesmos direcionem um tipo de célula imunolipossomas revestidas por um anticorpo específico para a célula alvo (Zheng et al., 2009); lipossomas posicionadas no interior de uma nano partícula formada por polímeros (Carmona et al., 2009) ou mesmo filmes com diversas camadas de policátion e poliânions.

[059] Os excipientes, como lactose, citrato de sódio, carbonato de sódio, fosfato bicálcio e agentes desintegradores como amido, ácidos algínicos e certos silicatos complexos combinados com lubrificantes como estreato de magnésio, sulfato lauril sódico e talco podem ser usados a fim de preparar tabletes. A fim de preparar uma pastilha, é vantajoso o uso de lactose e glicol polietileno de alto peso molecular. As suspensões aquosas contêm emulsificadores ou agentes que facilitam a suspensão. Os diluentes como sacarose, etanol, polietileno glicol, Propilenoglicol, Glicerol e cloroforme ou misturas destes também são utilizáveis.

[060] Os adjuvantes como sais de alumínio (por exemplo hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio), surfactantes (como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos e emulsões), Adjuvante de Freund completos e incompletos, adjuvante de MPL-TDM (monofosforil lipídico A, dicorinomicolato de trealose sintético), tirosina, alumínio, saponinas como StimulonTM, e citocinas também podem ser adicionadas a fim de melhorar a eficácia da composição.

[061] As sequências de RNA da invenção podem ser preparadas com um agente, como microesferas injetáveis, partículas biodegradáveis, compostos poliméricos (como ácido polilático ou ácido poliglicólico), grânulos ou lipossomas que podem fornecer liberação controlada ou contínua do produto.

[062] Os exemplos de suportes dieteticamente aceitáveis compreendem, por exemplo, açúcares, saponinas, etc.

[063] A composição pode incluir ainda um ou mais outros ingredientes ativos escolhidos de preferência dentre um agente utilizável no tratamento de uma laminopatia, em particular no tratamento de síndrome de Hutchinson-Gilford ou SHGP (também conhecida como progéria e que consiste em envelhecimento precoce e acelerado em humanos), obesidade, diabetes, câncer, doenças degenerativas, em particular neurodegenerativas (por exemplo, leucodistrofia ou paraplegia espástica hereditária ainda identificado como PEH 35), um estresse ou infertilidade.

[064] Um princípio ativo no tratamento de obesidade pode ser, por exemplo, leptina ou um de seus derivados.

[065] Um princípio ativo no tratamento de diabetes pode ser, por exemplo, insulina ou um de seus derivados.

[066] Um princípio ativo no tratamento de câncer pode ser, por exemplo, um agente quimioterapêutico citotóxico convencional selecionado a partir de um inibidor de replicação de DNA (como agentes de ligação de DNA, em particular intercalando ou compostos alcalinizadores), um agente anti-metabólico (como inibidores de polimerase de DNA ou um inibidor de topoisomerase I ou II), um agente anti- mitogênico (por exemplo, um alcaloide), e um agente bloqueador de crescimento de um tumor cancerígeno (como um inibidor de tirosinase ou um anticorpo monoclonal).

[067] O RNA de acordo com a invenção (possivelmente compreendido ou expressado com o uso de outro produto de acordo com a invenção descrita neste texto) e o outro composto ou compostos ativos, podem ser administrados de forma simultânea, se aplicável em uma mesma composição, ou de forma sequencial.

[068] Os produtos da invenção (sequências de ácido nucléico, vetores, células, composições) podem ser adaptados parta administração intravenosa, oral, sublingual, parenteral, retal, tópica, transdérmica, subcutânea, por mucosa, intramuscular, intrapulmonar, intranasal, vaginal, etc., de acordo com protocolos padrões bem conhecidos aos profissionais versados na técnica.

[069] De preferência, o produto é adaptado para administração oral e apresentada de uma forma sólida ou líquida. O produto pode estar sob a forma de alimento, tablete, cápsula, pílula, drágea, pastilha, grânulos ou solução oral. O caso de administração parenteral, o mesmo está de preferência sob a forma de solução líquida, uma emulsão ou uma suspensão. No caso de administração intravenosa, intradérmica ou subcutânea, o mesmo está tipicamente sob a forma de uma solução para injeção.

[070] A sequência de nucleotídeo de interesse também pode ser administrada por eletroporação, no interior dos músculos ou através da pele do indivíduo.

[071] A dosagem (ou quantidade terapeuticamente eficaz) é facilmente determinada pela pessoa versada de forma que os efeitos desejados (isto é, aumento do tempo de vida, combate aos efeitos deletérios de envelhecimento, estresse e/ou infertilidade) são alcançados. A dose específica do produto deve ser ajustada ao indivíduo em questão e à aplicação desejada. A mesma depende de diversos fatores, incluindo o peso, estado de saúde, sexo e alimentação do indivíduo, a via de administração, absorção e taxas de excreção, e combinações possíveis com uma ou mais outras moléculas ativas.

[072] A dose diária total do produto administrado em um indivíduo humano em uma dose única ou em diversas doses pode ser, por exemplo, compreendida entre 1 μg e 20 mg por quilo, de preferência entre 100 μg e 5 mg. As administrações podem ser semanais ou diárias ou mesmo repetidas diversas vezes por dia. Os RNAs ou composições de acordo com a invenção que compreendem os mesmos podem ser administrados sob a forma de uma unidade de dose que compreende 0,05 a 20 mg de RNA, de preferência 0,1 a 5 mg.

[073] Em uma modalidade particular, uma sequência de RNA de interesse da invenção é usada em uma composição terapêutica, por exemplo uma vacina.

[074] Em outra modalidade particular, uma sequência de RNA de interesse da invenção é usada em uma composição cosmética.

APLICAÇÕES DOS PRODUTOS DA INVENÇÃO

[075] A presente invenção refere-se em particular a um produto conforme descrito nesse texto que consiste em, ou compreende, uma sequência de RNA ou uma sequência de DNA de interesse de acordo com a invenção para uso como um medicamento.

[076] A mesma também se refere a um produto ou composição de acordo com a invenção para uso i) para evitar ou tratar uma patologia, uma anormalidade, uma desordem ou uma deterioração aparente ou funcional relacionada a um mecanismo de envelhecimento, ii) a fim de estender o tempo de vida de um indivíduo, ou iii) a fim de aumentar a resistência de um indivíduo ao estresse.

[077] Em um aspecto particular, a presente invenção refere-se ao uso de tal produto em uma quantidade terapeuticamente eficaz para a preparação de uma composição farmacêutica destinada a i) prevenir ou tratar uma patologia, uma anormalidade, uma desordem ou uma deterioração funcional ou aparente relacionada a um mecanismo de envelhecimento, ii) estender o tempo de vida de um indivíduo, ou iii) para aumentar a resistência de um indivíduo ao estresse.

[078] Ainda em outro aspecto particular, a presente invenção refere-se ao uso de tal produto para a preparação de uma composição cosmética.

[079] O termo “tratamento” conforme usado neste documento refere-se à melhora ou resolução dos sintomas, diminuindo a progressão da doença ou processo de envelhecimento, parando a progressão da doença ou resolução da doença.

[080] Os inventores demonstraram a eficácia surpreendente das sequências de RNA de acordo com a invenção em processos de retardo de envelhecimento e combate a patologias e efeitos deletérios associado a este(s) processo(s).

[081] Os inventores demonstraram de forma notável que a superexpressão na Drosófila de snoRNA:W28S-1153 da sequência SEQ ID NO: 1 dobra de forma espetacular o tempo de vida da dita Drosófila. Em particular, eles demonstram que a mosca mutante para snoRNA:W28S-1153 ter mais lesões neurodegenerativas que a mosca silvestre aos 40 dias de idade (Figura 12). Em geral, a superexpressão snoRNA:W28S-1153 de moscas tem menos, ou até mesmo nenhuma lesão cerebral, que mostra a natureza de proteção do snoRNA de acordo com a invenção em relação a patologias neurodegenerativas. Ademais, os inventores mostraram que a superexpressão em moscas com 40 dias de vida de snoRNA:W28S-1153 tem desempenhos sensoriais e motor (representado aqui pela distância de trajeto durante um teste que quantifica a atividade de locomoção) melhor do que moscas silvestres e estão, portanto, protegidas dos efeitos deletérios associados aos mecanismos de envelhecimento (Figura 13).

[082] Os inventores demonstraram que a superexpressão de uma sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção permite a extensão da vida de um indivíduo, atrasando os mecanismos de envelhecimento e combatendo os efeitos deletérios associados a estes mecanismos. Em particular, eles mostraram que essa superexpressão é neuroprotetora e serve em particular para evitar ou tratar uma doença degenerativa, em particular neurodegenerativa, tipicamente doença neurodegenerativas associadas ao acúmulo de ferro que resulta na desmielinização no cérebro como, por exemplo, doença neurodegenerativas causadas por uma ou mais mutações do gene fa2h. A invenção permite ainda particularmente o tratamento de leucodistrofias (tipicamente aquelas relacionadas a mutações do gene fa2h) ou paraplegia espástica hereditária (tipicamente S paraplegia espástica hereditária PG35). A mesma ainda permite a prevenção ou tratamento de diabetes, um câncer, ou um problema de fertilidade ou esterilidade (Figura 14), e ainda favorece a manutenção da atividade locomotora do indivíduo tratado.

[083] O “Indivíduo” significa qualquer ser vivo que pode se beneficiar de tal tratamento, independentemente de seu sexo ou idade. De preferência, o indivíduo é um indivíduo adulto. O indivíduo pode ser um inseto como uma Drosófila, ou um animal, por exemplo, um mamífero (de preferência um primata ou seres humanos) ou um roedor (de preferência um camundongo ou rato).

[084] De preferência, o indivíduo i) não expressa a sequência de RNA de interesse ou expressa uma versão anormal da dita sequência de RNA, ii) é um indivíduo que está sob condição de estresse (particularmente um indivíduo que já alcançou a maturidade sexual, de preferência um indivíduo ancião) como jejum, choque térmico, estresse oxidativo (como exposição a Paraquat) ou um estresse (no intestino) responsável por uma proliferação ou desregulação celular detectável da via de sinalização Delta/Notch, e/ou iii) é um indivíduo que sofre de uma doença relacionada a ou promovida pelo envelhecimento, tipicamente uma doença degenerativa, em particular neurodegenerativa, uma laminopatia como progéria, obesidade, diabetes, câncer ou problemas de fertilidade (particularmente que inclui infertilidade ou esterilidade).

[085] Em uma modalidade particular, o genoma do indivíduo pode se beneficiar da invenção i) não expressa uma sequência de RNA de interesse conforme descrito neste texto, ii) expressa uma versão anormal da dita sequência de RNA de interesse, ou iii) contém uma sequência de DNA que compreende uma mutação responsável pela não expressão ou expressão anormal (isto é, não funcional) da dita sequência de RNA de interesse.

[086] A versão normal (silvestre) da sequência de DNA pode ser escolhida, por exemplo, dentre as sequências SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 30, identificadas anteriormente. A mutação que pode afetar a versão normal da sequência de DNA, isto é, para impedir a expressão de uma sequência de RNA de interesse de acordo com a invenção, é tipicamente escolhida dentre uma exclusão, uma adição e/ou uma substituição de um ou mais nucleotídeos.

[087] O termo “longevidade” ou “tempo de vida” refere-se ao tempo de vida para qual o um indivíduo é programado como uma espécie biológica, vivendo sob condições ideais e na ausência de doença ou acidente. “Longevidade máxima” ou “tempo de vida máximo” é a tempo de vida máximo que o indivíduo de uma dada espécie pode alcançar. Para fins práticos, a longevidade máxima de um indivíduo é estimada pela idade máxima alcançada por um dos membros de uma população. “Longevidade média” ou “tempo de vida médio” é a idade na qual 50% de uma dada população sobrevive.

[088] Um método amplamente reconhecido para a medição da eficácia de um tratamento de "extensão de tempo de vida" é referência à longevidade máxima ou longevidade média. Se um tratamento aumenta significativamente a longevidade máxima ou média de um grupo de indivíduos em relação a um grupo de indivíduos de controle, então a mesma é considerada uma extensão de tempo de vida e retardo de envelhecimento.

[089] Na Drosófila, a maturidade sexual é alcançada, em média, com um dia de idade. O tempo de vida médio é em torno de 30 dias. O tempo de vida máximo é compreendido entre em torno de 60 e 80 dias dependendo da espécie e linha de Drosófila e as condições de vida ou criação. Em camundongos, a maturidade sexual é alcançada, em média, 42 dias após o nascimento. O tempo de vida médio é em torno de 832 dias. Em seres humanos, a maturidade sexual é alcançada entre 9 e 14 anos de idade. O tempo de vida médio é 73 anos para homens e 79 anos para mulheres. O tempo de vida máximo é atualmente 122 anos, 5 meses e 14 dias.

[090] O termo “envelhecimento” no contexto desta invenção é um processo de mudança gradual e espontânea que varia da maturação, passando pela infância e puberdade, até o declínio funcional do indivíduo. O envelhecimento, portanto, compreende o componente positivo do desenvolvimento e maturação e o componente negativo de declínio.

[091] As sequências de RNA de interesse da invenção aumentam a longevidade máxima ou média (ou tempo de vida) de um indivíduo. De preferência, estas sequências estendem o tempo de vida e atrasam o envelhecimento de um indivíduo ou de uma subpopulação indivíduos adultos, definidas, por exemplo, por sexo e/ou idade (isto é, para uma idade mínima ou uma idade máxima ou por uma faixa de idade).

[092] Com o uso da presente invenção, a extensão do tempo de vida da Drosófila é tipicamente considerada, assim como mamíferos que incluem camundongos e, em particular, seres humanos, em cerca de 50% ou mesmo 100%, enquanto melhorou as condições de envelhecimento.

[093] Com o uso de sequências de RNA da presente invenção, também é possível combater "os efeitos deletérios de envelhecimento". No contexto da presente invenção, esta expressão significa o componente negativo do envelhecimento, isto é, o declínio do indivíduo. O declínio progressivo, com a idade, de capacidades fisiológicas varia de um órgão para o outro e de um indivíduo para outro. O declínio fisiológico de um indivíduo leva à habilidade reduzida para responder a um estímulo do ambiente e aumenta a suscetibilidade e vulnerabilidade a doenças e deficiências. Os efeitos deletérios de envelhecimento englobam o acúmulo de mudanças não desejadas que têm um impacto no enfraquecimento de um dado indivíduo e que pode precipitar sua morte. Estas mudanças podem ser atribuídas ao desenvolvimento, aos processos de envelhecimento inatos, a possíve4is anormalidades genéticas, ao ambiente e a doenças que afetam ou afetaram o indivíduo.

[094] Ademais, com o uso da presente invenção, é possível evitar ou tratar doenças degenerativas, em particular neurodegenerativa, tipicamente doenças degenerativas que afetam o sistema nervoso central e/ou periférico.

[095] Em uma modalidade preferencial, a invenção permite evitar ou tratar neurodoença degenerativas associadas ao acúmulo de ferro que leva à desmielinização no cérebro, em particular neurodoenças degenerativas induzidas por uma ou mais mutações do gene fah2. A invenção, portanto, permite o tratamento de leucodistrofias (tipicamente aquelas ligadas a mutações do gene fa2h) ou paraplegia espástica hereditária (tipicamente paraplegia espástica hereditária SPG35)

[096] Em outras modalidades, a invenção irá evitar ou tratar uma patologia selecionada dentre miopatia, Síndrome de Hunter, disqueratose congênita, Síndrome de Prader-Willi, Doença de Alzheimer, Doença de Parkinson, Doença de Huntington, esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica (ELA).

[097] Em outra modalidade, a presente invenção irá evitar ou tratar laminopatias como Síndrome de Hutchinson-Gilford (ou progéria), displasia mandibuloacral (MAD), distrofia muscular de Emery-Dreifuss, síndrome de Werner atípica, dermopatia restritiva, acinesia fetal letal e LIRLLC (Lipoatrofia generalizada, diabetes insulino- resistente, pápulas leucomelanodermia, esteatose hepática e cardiomiopatia hipertrófica), de preferência Síndrome de Hutchinson-Gilford.

[098] Ainda em outra modalidade, a presente invenção irá evitar ou tratar a diabetes ou obesidade.

[099] A mesma pode inda participar da prevenção ou tratamento de câncer ou processo neoplásico. O câncer é tipicamente um câncer selecionado dentre carcinoma, sarcoma, linfoma, melanoma, tumor pediátrico ou leucemia. O mesmo pode, por exemplo, ser câncer de mama, câncer de ovário, câncer no endométrio, câncer de próstata, câncer no esôfago, câncer de cólon, câncer retal, câncer renal, câncer de pulmão, câncer de tireoide, osteosarcoma, melanoma, leucemia, neuroblastoma, etc.

[0100] Em uma modalidade particular, esta invenção é particularmente útil para o combate ao câncer induzido por radicais livres como câncer de cólon e câncer de estômago.

[0101] Também é possível combater os problemas de infertilidade ou esterilidade com o uso do produto de acordo com a invenção. “Infertilidade” ou “esterilidade” significam dificuldade de concepção ou incapacidade de concepção. No contexto para este uso, o indivíduo é tipicamente fêmea, sexualmente madura e apresenta dificuldades, por exemplo, para a reprodução prematura. Tipicamente, o indivíduo é estéril, infértil ou teve uma redução precoce ou prematura da fertilidade. As sequências de RNA de interesse de acordo com a invenção permitem o tratamento de infertilidade ou restauração, aumento, aperfeiçoamento ou estimulação da fertilidade do indivíduo tratado.

[0102] A presente invenção refere-se ainda a um método para o tratamento de uma patologia, anormalidade, desordem, efeito deletério ou deterioração funcional ou aparente relacionada a um mecanismo de envelhecimento ou a um estresse, como descrito neste texto.

MÉTODOS QUE PERMITEM A AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA TERAPÊUTICA OU PREVENTIVA DE UM COMPOSTO TESTE

[0103] A invenção fornece ainda um método para avaliação da eficácia terapêutica ou cosmética de um composto teste a fim de combate os efeitos deletérios de envelhecimento ou um estresse assim como combater as patologias associadas a tal estresse tal mecanismo de envelhecimento ou para combate à infertilidade.

[0104] O “Composto teste” significa qualquer composto potencialmente envolvido no combate aos efeitos deletérios de envelhecimento, ao estresse ou à infertilidade. Por exemplo, o mesmo pode ser uma molécula natural ou química, um metal, um agente de irradiação, etc.

[0105] Um composto pode ser testado para sua potencial eficácia terapêutica, isto é, sua habilidade de evitar, tratar ou aperfeiçoar o tratamento de doenças e efeitos deletérios de envelhecimento ou de um estresse, por exemplo, laminopatia, uma doença degenerativa ou um câncer conforme descrito anteriormente, a fim de evitar, tratar ou aperfeiçoar o tratamento de diabetes ou obesidade, ou para prevenir, tratar ou aperfeiçoar o tratamento de infertilidade.

[0106] Um composto pode ainda ser testado pela sua eficácia cosmética potencial, isto é, sua habilidade de melhorar a aparência física do indivíduo e melhorar o combate a uma deterioração aparente do indivíduo relacionadas a um mecanismo de envelhecimento. O composto teste pode se provar eficaz, por exemplo, no tratamento cosmético da epiderme, pelos do corpo e/ou sistema capilar, unhas, lábios, órgãos genitais externos, dentes ou mucosa.

[0107] Em uma primeira modalidade, o método descrito na invenção compreende as etapas a seguir: i) Exposição de uma célula, uma população de células ou um tecido, que não expressa a sequência de RNA de acordo com a invenção ou que expressa uma versão anormal da dita sequência de RNA; ou um camundongo transgênico de acordo com a invenção, ii) Avaliação dos efeitos, se houver, do composto teste no fenótipo da(s) dita(s) célula(s) ou dito tecido ou dito camundongo transgênico, e iii) Determinação da eficácia terapêutica ou cosmética do dito composto teste, uma restauração da atividade e/ou expressão da dita sequência de RNA sendo correlacionada com a eficácia do dito composto teste.

[0108] A eficácia terapêutica ou cosmética do dito composto teste pode ser avaliado ou determinado com referência a um valor de controle. Este valor de controle pode ser estabelecido a partir de níveis de atividade e/ou expressão da dita sequência de RNA em uma célula, uma população de células ou um tecido que não expressa, ou expressa uma versão anormal da dita sequência de RNA ou em um camundongo transgênico de acordo com a invenção.

[0109] Se a atividade e/ou expressão da dita sequência de RNA presente na célula, população de células, tecido ou camundongo transgênico exposto ao composto teste é maior do que a atividade e/ou expressão da sequência de RNA na célula, a população de células ou tecido que não expressa, ou expressa uma versão anormal da dita Sequência de RNA ou no dito camundongo transgênico da invenção, então o composto teste tem eficácia terapêutica ou cosmética.

[0110] Em uma segunda modalidade, o método descrito na invenção compreende as etapas a seguir: i) Exposição de uma célula de acordo com a invenção que compreende uma sequência de RNA de acordo com a invenção, uma população de células ou um tecido que compreende uma célula de acordo com a invenção, ii) Avaliação dos efeitos, se houver, do composto teste sobre o fenótipo da dita célula ou população de células ou do dito tecido, e iii) Determinação da eficácia terapêutica ou cosmética do dito composto teste, um aumento da atividade e/ou expressão da dita sequência de RNA sendo correlacionada com uma eficácia do dito composto teste.

[0111] De acordo com este aspecto da invenção, um valor de controle pode ser estabelecido a partir do nível de atividade e/ou expressão da dita sequência de RNA em uma célula ou uma população de células que expressa a dita sequência de RNA.

[0112] Neste caso, se a atividade e/ou expressão da dita sequência de RNA presente na célula ou população de células exposta ao composto teste é maior do que a atividade e/ou expressão da sequência de RNA na célula ou população de células que expressa a dita sequência de RNA, então o composto teste tem eficácia terapêutica ou cosmética.

[0113] O nível de atividade e/ou expressão da sequência de RNA pode ser quantificado com o uso de técnicas conhecidas pelo versado na técnica, tipicamente pelo PCR quantitativo ou imunohistoquímica (coloração por anticorpos direcionadas em oposição aos genes/proteínas regulados pelo snoRNA de interesse).

[0114] O efeito terapêutico também pode ser avaliado, por exemplo, pela determinação do tempo de vida das células, através da medição da quantidade de divisões celulares, etc.

[0115] De preferência, a célula ou população de células exposta ao composto teste é de origem intestinal ou ovariana. As células preferenciais podem ser escolhidas dentre as células mencionadas neste texto, tipicamente dentre enteroblastos, enterócitos, célula enteroendócrinas, célula- tronco intestinais, células nurse, tipicamente células nurse da câmara ovariana, oócitos, ooblastos, etc.

[0116] Outros aspectos e vantagens da presente invenção irão aparecer na leitura das figuras e exemplos a seguir, que devem ser considerados como ilustrativos e não limitadores.

LEGENDA DAS FIGURAS

[0117] Figura 1: mapa da região genômica de locus P[Gal4]4C, posição do snoRNA de juventude e a exclusão de F4.

[0118] Figura 2: A) Motivo de caixa H/ACA, B) diagrama de pseudouridilação. (Extraído de: Kiss et al., (2010) Molecular Cell, 37, 597-606).

[0119] Figura 3: Longevidade das moscas fêmeas. Diminuição cumulativa (em %) na quantidade de moscas vivas como uma função da quantidade de dias. Cont.-CS = moscas de controle silvestres. F4 = Mutante F4e, G5= moscas que carregam o transgene de snoRNA genômico G5, F4;G5= moscas que carregam o transgene de snoRNA G5 no fundo genético Mutante F4, a fim de restaurar o fenótipo silvestre (em parênteses: a quantidade de moscas).

[0120] Figura 4: teste de resistência de estresse (choque térmico, jejum, Paraquat) executado em camundongos com três dias de vida. A) Choque térmico: os mutantes F4 são mais resistentes que os de controle (fêmeas apenas). As moscas com superexpressão do snoRNA (G5), assim como mutantes F4 fornecidos com o transgene (F4;G5) são mais resistentes do que os de controle (machos e fêmeas). B) Jejum: os Mutantes F4 são mais resistentes que os de controle (machos e fêmeas). As moscas com superexpressão do snoRNA (G5) são mais resistentes (fêmeas apenas). As moscas Fêmeas Mutantes F4 fornecidas com o transgene (F4;G5) são similares às moscas de controle; portanto o silvestre é restaurado pelo transgene. C) Paraquat: Os Mutantes F4 são mais resistentes que os de controle (machos e fêmeas). As moscas com superexpressão do snoRNA (G5) são mais resistentes (fêmeas apenas). As moscas Mutantes F4 fornecidas com o transgene (F4;G5) são similares às moscas de controle, portanto as de tipo silvestre são restauradas pelo transgene.

[0121] Figura 5: hibridização In situ no intestino e ovários. A) nos camundongos de controle silvestre (CantonS), o snoRNA é expresso em células epiteliais do intestino. Azul: coloração de DNA dentro do núcleo por DAPI. Vermelho: coloração de snoRNA. Perceba que a coloração por snoRNA (pontos vermelhos) é distinta e complementar à do núcleo (azul), demonstrando que o último é localizado dentro do nucléolo. B) No Mutante F4 (exclusão de snoRNA), a coloração azul é vista (DAPI), mas sem coloração vermelha, em razão de o snoRNA ser excluído e, portanto, não expresso. C) Moscas de controle silvestre (Canton-S). O snoRNA é expresso em células nurse ovarianas. D) moscas com Mutante F4. O snoRNA não é expresso nos ovários.

[0122] Figura 6: A expressão alvo do snoRNA nas células epiteliais do intestino, através de quatro linhas de direcionamento de Gal4 separados, que direcionam a expressão de um gene repórter GFP (UAS-GFP) . Detecção da expressão do snoRNA por hibridização in-situ (vermelho e/ou laranja) (coluna da esquerda: a1,b1,c1,d1,e1), coloração do núcleo com DAPI (azul) (segunda coluna: a2,b2,c2,d2,e2), expressão de GFP por imunocoloração (anticorpo anti-GFP revelado pelo FITC (verde) (terceira coluna: a3,b3,c3,d3,e3). Coluna à direita (a4,b4,c4,d4,e4) superimposição das três imagens anteriores que mostram a colocalização. É notável que existe uma coloração dupla apenas em (A) (Myo1A-Gal4), que mostra que o snoRNA é expresso apenas nos enterócitos. A) Expressão de alvo do snoRNA em enterócitos, sob o controle de Myo1A-Gal4 (Myo1A-Gal4;UAS-mCD8-GFP). B) Expressão de alvo em enterócitos por Myo1A-Gal4, no fundo genético de Mutante F4 (Myo1A-Gal4, F4/F4;UAS-snoRNA-8M/+). C) Expressão de alvo no intestino sob o controle de esg-Gal4 (esg-Gal4,UAS-GFP) que colore as células-tronco intestinais (ISCs). D) Expressão de alvo no intestino sob o controle de Su(H)-Gal4 (Su(H)-GBE- Gal4;UAS-mCDB-GFP), que colore enteroblastos. E) Expressão de alvo no intestino sob o controle de Delta-Gal4 (Dl-Gal4,UAS- GFP) que colore as células-tronco intestinais (ISCs).

[0123] Figura 7: Expressão de alvo do snoRNA nos outros tipos de célula do epitélio intestinal através de três outras linhas de direcionamento de Gal4 separadas, que direcionam a expressão do snoRNA (UAS-8M), demonstrando que o snoRNA pode ser expresso de forma tópica em outros tipos de célula. A) Expressão de alvo sob o controle de esg-Gal4 (esg-Gal4, F4/F4;UAS-8M/+) B) Expressão de alvo sob o controle de Su(H)-Gal4 (Su(H)-GBE-Gal4, F4/F4;UAS-8M/+). C) Expressão de alvo sob o controle de Delta-Gal4 (Delta-Gal4,F4/F4;UAS-8M/+).

[0124] Figura 8: Resistência a diversos estresses seguindo a expressão de alvo (reexpressão de snoRNA no Fundo genético de Mutante F4) do snoRNA dentro do intestino de moscas com três dias de idade. A) Jejum: Expressão de alvo de snoRNA (UAS-8M) sob o controle de Myo1A-Gal4. Há um aumento claro na resistência das moscas que expressam o snoRNA (Myo,F4/F4; 8M/+) em relação às duas linhas de controle. B) Jejum: Expressão de alvo de snoRNA (UAS-8M) sob o controle de esg-Gal4. Há um claro aumento na resistência de moscas que expressam o snoRNA (esg,F4/F4; 8M) em relação às duas linhas de controle. C) Jejum: Expressão de alvo de snoRNA (UAS-8M) sob o controle de Su(H)-Gal4. Há um claro aumento na resistência de moscas que expressam o snoRNA (Su(H),F4/F4; 8M) em relação às duas linhas de controle. D) Choque térmico a 36°C: Expressão de alvo de snoRNA (UAS-8M) sob o controle de Su(H)-Gal4. Há um claro aumento na resistência em moscas que expressam o snoRNA (Su(H),F4/F4; 8M) em relação às duas linhas de controle.

[0125] Figura 9: A) Homologias nas doze espécies de Drosófila cujo genoma é conhecido; B) estrutura de consenso das 12 espécies de Drosófila.

[0126] Figura 10: Homólogo humano no cromossomo 11.

[0127] Figura 11: 2 genes homólogos em Mus musculus (camundongo-1 e camundongo-2).

[0128] Figura 12: Histologia cerebral: neurodegeneração visível no cérebro de moscas com 40 dias de idade. As moscas de controle (Canton-S silvestre) (al) apresentam lesões de neurodegeneração (vacúolos/lacunas) enquanto as moscas Mutantes F4 (a2) apresentam mais lesões. As moscas que expressam o snoRNA no fundo genético mutante (resgatado: F4;G5) (bl) apresentam menos lesões que CS e F4, como mostram moscas com superexpressão de snoRNA (G5) (b2). As moscas Mutantes F4 que reexpressam o snoRNA especificamente em enterócitos (Myo,F4/F4;UAS-snoRNA) (c2) também têm menos lesões que as que não expressam o mesmo (Myo,F4/F4) (cl). Em (d), a quantificação de lesões em moscas jovens (4 dias de vida) e moscas velhas (40 dias de vida) para estes diversos genótipos. Todos esses resultados mostram que a expressão do snoRNA protege contra lesões neurodegenerativas em moscas velhas (0, +, ++, +++ = grau de gravidade de lesões com base em seus números e áreas)

[0129] Figura l3: um parâmetro sensório-motor (atividade locomotora) quantificado pelo acompanhamento do vídeo, aqui representado pela distância percorrida durante 7 horas de gravação. As moscas com quarenta dias de vida são comparadas a moscas jovens com quatro dias de vida. A) Distância percorrida por fêmeas. B) Distância percorrida por machos.

[0130] Figura l4: Fertilidade das moscas (quantidade de ovos postos A) por fêmea/dia e B) por fêmea e, 17 dias). No geral, as Mutantes F4 colocaram um pouco mais de ovos do que as d e controle (CS), mas com um pequeno atraso. A expressão do transgene (snoRNA) na Mutante F4 (F4;G4 - também chamada de F4;4M) reduz a fertilidade. A superexpressão do transgene (G4 - também chamado de 4M) aumenta a fertilidade (quantidade de ovos colocados).

[0131] Figura 15: Diagrama do epitélio intestinal (Extraído de: Jiang e Edgar, Exp. Cell. Res., 2011). A) Modelo de regeneração de epitélio intestinal na Drosófila adulta. B) Modelo de função de Notch nas células enteroendócrinas na Drosófila (embrião, larva, ninfa, adulto) e em mamíferos. Dl= Delta, N= Notch, NO = sem sinal de Notch. Este diagrama mostra claramente a similaridade perfeita entre o epitélio intestinal de Drosófila e o de humanos.

[0132] Figura 16: mecanismo de retrocontrole que regula a homeostase de intestino e a regeneração (intestino médio) na Drosófila (Extraído de: Jiang e Edgar, Exp. Cell. Res., 2011). (mesma abreviação da Figura 15).

[0133] Figura 17: O snoRNA de juventude é envolvido no splicing alternativo do gene CG9339 (skywalker). O comparativo RT-PCR foi feito em alguns genes alvos potenciais a fim de checar se, na Mutante F4, alguns destes genes não têm splicing correto em relação às moscas silvestres (Control-CS). Dentre outros, quatro transcrições de 345-400-432-462 BP de gene CG9339 (Skywalker) foram analisadas. O gene rp49 (fragmento de 300-bp) é usado como um controle interno, assim como um controle com RNA (sem RT antecipado) a fim de demonstrar que o RNA usado não é contaminado por traços de DNA. Perceba a ausência da transcrição do gene CG9339 (skywalker) de 345-bp no Mutante F4 (seta).

[0134] Figura 18: O snoRNA de juventude é envolto em regulação de nível de RNA de dois outros genes: klarsicht e gene CG30502 (fa2h). A) Para klarsicht, a amplificação de um fragmento de 464-BP (compreendido em um éxon) mostra que há menos produto transcrito no Mutante F4 do que em moscas de controle silvestres (Canton-S) . B) Para fa2h, a amplificação de um fragmento de 42 9-bp (compreendido em um éxon) mostra que há menos material transcrito no Mutante F4 do que em moscas de controle silvestre (Canton-S).

[0135] Figura 19: O modelo que descreve o papel de klarsicht. A) klarsicht, através de seu domínio KASH, interage com a lâmina, localizada na superfície interna da membrana nuclear (de acordo com: Patterson et al., 2004). B) Vista esquemática que mostra a estrutura e função de lâminas nucleares. As lâminas são localizadas sobre a superfície interna da membrana nuclear e serve para manter a estabilidade do núcleo, organizar a cromatina e ligar os poros nucleares (NPC). Diversas proteínas que interagem com as lâminas também são diagramadas (de acordo com: Coutinho et al., Immunity & Ageing, 2009).

[0136] Figura 20: As snoRNA das sequências de juventude de mamíferos ortólogo são expressas em camundongos e humanos (Detecção por RT-PCR de camundongos e humanos homólogos). A expressão destes snoRNAs indica que há grandes chances de os mesmos serem funcionais. Em humanos, o 159-bp snoRNA (SEQ ID NO: 2) é expresso dentro do intestino e cérebro e levemente nos ovários e rins (marcado com um asterisco vermelho para mais precisão). Em camundongos, o 129-bp snoRNA-1 (SEQ ID NO: 3) é expresso apenas no cérebro. Em contraste, o 122-bp snoRNA-2 (SEQ ID NO: 4) é expresso dentro do intestino, cérebro e ovários, mas o mesmo não ocorre nos rins.

[0137] Figura 21: As moscas com mutação para o snoRNA de juventude (Mutante F4) mostram hipertrofia de gordura corporal. As alterações significativas das mesmas são observadas em moscas com 40 dias de vida comparadas aos seus respectivos controles, também com 40 dias de vida. Estas lesões são mostradas por rotulagem de anticorpo com 3-anti- caspase ativado, que rotula as células submetidas a apoptose. A) “CS” moscas de controle. A gordura corporal, cercada por uma linha pontilhada branca, é homogênea e leve. B) Moscas Mutantes F: observe células agregadas grandes (seta branca). C) Nas moscas que carregam o transgene snoRNA (G5): a gordura corporal, sem agregação, lembra a gordura corporal do controle de “CS”. D) Nas moscas com o transgene G5 no fundo genético de Mutante F4 (F4;G5), estas moscas penas mostram algumas células agregadas e estas agregadas são menores, o que indica que o transgene resgata de forma parcial as lesões de gordura corporal devido à mutação. Estes resultados sugerem fortemente um rompimento no metabolismo de carboidratos e gorduras.

PARTE EXPERIMENTAL 1) CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E MOLECULAR DE SNORNA:W28S-1153 (JUVENTUDE) LOCALIZADO EM LOCUS P[GAL4]4C

[0138] Este experimento é parte da procura pela base neural envolvida em comportamento locomotor na Drosófila e o estudo do relacionamento entre a estrutura e a função do complexo central e especialmente o corpo elipsoide. Neste contexto, a varredura de uma biblioteca de filamentos de inibidores aperfeiçoados de P[GAL4] permitiu a identificação do filamento de P[GAL4]4C que é expresso especificamente no corpo elipsoide (Figura 1). As abordagens geneticamente diferentes, notavelmente a expressão de alvo de toxina do tétano, mostraram que o bloqueio destes neurônios gera defeitos na atividade locomotora (Martin et al., 2002). Em uma segunda etapa, a fim de caracterizar de forma adicional estes neurônios em detalhes e determinar melhor suas funções dentro da rede neural envolvida na atividade locomotora, a inserção de locus do filamento de P[GAL4]4C foi caracterizada de forma genética e molecular. O resgate de PCR foi feito e permitiu a exibição do ponto de inserção do elemento P de P[GAL4]4C no cromossomo 2R (à direita: isto é, no braço direito), na posição 50A, entre dois genes: CG13333 e CG13334 (Figura 1). Então, a fim de serem capazes de mostrar os fenótipo e funções respectivas destes dois genes, as mutações foram geradas nos mesmos por reexcisão do elemento P (por uma abordagem genética chamada: jump-out ou revertente). Uma exclusão pequena de 632 pares de base (bp) chamados F4 foi então obtida (Figura 1).

[0139] snoRNA:W28S-1153 foi identificado neste locus na posição 67331 (Figura 1) como parte da varredura sistemática feita por Huang et al. (2005) de todos os potenciais pequenos RNAs nucleolares (snoRNA) no genoma de Drosófila. O artigo correspondente, entretanto, não distingue qualquer snoRNA particular e não associa qualquer função com snoRNA:W28S-1153. No contexto da presente invenção, este snoRNA, faltando a exclusão de F4 pequeno, foi posicionada de forma precisa e caracterizado estrutural e funcionalmente. Este snoRNA é então feito de 148 pares de base (bp) e sua estrutura compreende uma caixa H/ACA.

2) CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DA EXCLUSÃO DE F4: REDUÇÃO DE TEMPO DE VIDA

[0140] Ao mesmo tempo em que o estudo é feito para a quantificação da atividade locomotora das moscas através da expressão de alvo de toxina do tétano em neurônios em forma de anel rotulada do filamento P[GAL4] 4C, o inventor observou que essas moscas tiveram um tempo de vida curto e decidiu quantificar de forma precisa o dito tempo de vida de moscas com toxina de tétano P[GAL4]4C/UAS, assim como das moscas F4 (com mutação em locus 4C). Dessa forma, as moscas F4 têm um tempo de vida curto (de cerca de 30% em relação a moscas de controle silvestre), sugerindo que a exclusão de snoRNA poderia afetar o tempo de vida (longevidade) (Figura 3). Os inventores também observaram que esse efeito é diferente de acordo com o sexo das moscas, sendo que o mesmo é muito mais pronunciado em fêmeas do que em machos.

3) GÊNESE DE UMA LINHA TRANSGÊNICA QUE CONTÉM A REGIÃO GENÔMICA DE SNORNA (JUVENTUDE) PARA PROPÓSITOS DE RESTAURAÇÃO DO FENÓTIPO SILVESTRE (“RESGATE”)

[0141] A fim de demonstrar que o fenótipo do Mutante F4 acontece na realidade devido à exclusão de snoRNA, uma linha de Drosófila transgênica que carrega uma Sequência de DNA genômica de 1723 bp da região (de 66377 a 68100), que compreende o snoRNA (Figura 1), e suas sequências reguladoras, foi gerada. Mais precisamente, um fragmento genômico a partir de região 1723-bp foi amplificado por PCR e inserido através do sítio de restrição de Xba1 no interior do vetor pCaSper-4 (este vetor não contém qualquer sequência promotora/reguladora). As moscas transgênicas foram então geradas de acordo com uma técnica padrão e linhas de moscas que expressam o mesmo transgene, mas inseridas em locais distintos do genoma, foram obtidas (inserções independentes: G4, G5).

[0142] A seguir, a fim de verificar que o transgene é funcional e pode resgatar a mutação F4 (isto é, restaurar o fenótipo silvestre, isto é restaurar um tempo de vida equivalente ao observado sem exclusão de F4), o inventor introduziu essas linhas transgênicas no contexto do mutante genético F4, por cruzamentos genéticos padrões (F4;G4 e F4;G5). Isso poderia ser demonstrado, dessa forma, que o transgene poderia resgatar o fenótipo devido à mutação responsável pela redução em tempo de vida (Figura 3) (consulte, por exemplo: F4 versus F4;G5). Ademais, este transgene disposto em um genoma silvestre (normal) (que corresponde a uma superexpressão deste snoRNA, já que existem 4 cópias de snoRNA em vez de duas cópias endógenas) (G5) aumenta o tempo de vida (até mesmo dobra o tempo de vida no caso de F4;G5 ou aumenta o mesmo em torno de 30% para G5) (Figura 3). Este experimento, portanto, mostra claramente que o tempo de vida do animal pode ser aumentado pela superexpressão deste snoRNA (ou através da modificação de seu nível de expressão). Em resumo, uma exclusão genômica pequena na região (pares de base 632, chamada de F4) (Figura 1), corresponde ou equivale à mutação deste gene, tempo de vida diminuída, enquanto a superexpressão (através de um transgene que contém DNA genômico deste snoRNA) por terapia genética não só resgata a mesma mutação mas estende de forma dramática (dobra) o tempo de vida do indivíduo tratado (Figura 3).

4) TESTES DE RESISTÊNCIA A ESTRESSE

[0143] Já é reconhecido em geral que os genes agem sobre a longevidade geralmente aumentando a resistência ao estresse. O inventor verificou e obteve a confirmação que a superexpressão deste snoRNA é efetivamente capaz de aumentar o tempo de vida do indivíduo referido sob condições de estresse, como jejum, choque térmico e estresse oxidativo (induzido por Paraquat) (Figura 4).

A) TESTE DE RESISTÊNCIA TÉRMICA (TESTE DE CHOQUE TÉRMICO)

[0144] Os machos e fêmeas são criados juntos em tubos padrões que contém alimento por 3 dias. Com 3 dias, os machos e fêmeas são distribuídos separadamente em grupos de 20 em um tubo padrão que contém alimento. Para submeter as moscas ao choque térmico, os tubos que contém as moscas são dispostos em uma incubadora a 36°C. O número de moscas mortas é contado a cada 6 horas. Para o choque térmico (36°C), na Figura 4A, perceba que as Moscas Mutantes F4 (fêmeas apenas) são mais resistentes que as moscas de controle. Entretanto, as moscas G5 (macho e fêmea) são mais resistentes que as de controle e a Mutante F4, enquanto como resultado da expressão do transgene G5 na Mutante F4 (moscas F4;G5) estas moscas também são muito mais resistentes do que as moscas de controle e as Moscas Mutantes F4.

B) TESTE DE JEJUM

[0145] Como o teste de resistência térmica, os machos e fêmeas são criados juntos em tubos padrões que contêm alimento por 3 dias. Com 3 dias de idade, os machos e fêmeas são distribuídos separadamente em grupos de 20 dentro de um tubo que contém um filtro de papel e 400 μL de água a fim de evitar a dessecação. As moscas são mantidas em uma sala úmida a 24°C, e a quantidade de moscas mortas é contada a cada 6 horas. Para o jejum, na Figura 4B, perceba que as Moscas Mutantes F4 (machos e fêmeas) são mais resistentes do que s moscas de controle. Ademais, as Moscas G5 (fêmea) ainda são mais resistentes, enquanto a expressão do transgene na Mutante F4 (F4;G5) restaura a sobrevivência normal (em fêmeas).

C) RESISTÊNCIA AO ESTRESSE OXIDATIVO (PARAQUAT)

[0146] O Paraquat (1,1'dicloreto- bipiridinio- 4,4’- dimetílico) reduz NADH, que gera os radicais de Paraquat estáveis, que reagem ao oxigênio para a geração de ROS (espécie reativa de oxigênio). Consequentemente, o ROS ocasiona dano à célula (Rzezniczak et al., 2011). Como para os testes anteriores, machos e fêmeas são criados juntos em tubos padrões que contêm alimento por 3 dias. Com 3 dias de idade, os machos e fêmeas são distribuídos separadamente em grupos de 20 dentro de um tubo padrão a fim de submetê-los a jejum por 6 horas. A seguir, as moscas são transferias para o interior de um tubo que contém a um filtro de papel e 450 μl de 20 mM de Paraquat diluído em 1% de sacarose a fim de promover a ingestão da dieta. As moscas são mantidas em um ambiente úmido a 24°C, e a quantidade de moscas mortas é contada a cada 6 horas.

[0147] Para o estresse oxidativo, na Figura 4C, perceba que as Moscas Mutantes F4 (fêmeas apenas, embora também haja uma forte tendência para os machos) são mais resistentes que as moscas de controle. De forma similar, as Moscas G5 fêmeas são mais resistentes que as de controle e similares às Mutantes F4, enquanto a expressão do transgene na Mutante F4 (F4;G5) restaura a sobrevivência das moscas (equivalente às moscas de controle).

[0148] Em resumo, as Moscas Mutantes F4 são mais resistentes que as moscas de controle, enquanto a superexpressão (G5) aumenta adicionalmente esta resistência (um efeito que é mais marcado e consistente em fêmeas que em machos). Ademais, em ambos os testes (jejum e estresse oxidativo) a expressão do transgene no Mutante F4 (F4;G5) restaura a sobrevivência da mosca, especificamente em fêmeas. Dessa forma, contrária à longevidade em que a mutação F4 reduz o tempo de vida, a mutação F4 aumenta a resistência ao estresse nos três testes feitos moscas novas com 3 dias de idade, e este efeito pode ser restaurado pelo transgene genômico de snoRNA (em dois testes). Em conclusão, a modulação da expressão (supressão, redução ou aumento) do snoRNA de “juventude” muda o tempo de vida dos indivíduos testados.

5) A DETERMINAÇÃO DO PERFIL DE EXPRESSÃO ESPAÇO- TEMPO DO SNORNA (HIBRIDIZAÇÃO IN SITU)

[0149] A fim de determinar em quais células e/ou tecidos o snoRNA de interesse é expresso e age, o perfil de expressão espaço-tempo deste snoRNA foi determinado no contexto da invenção, na mosca adulta, pela hibridização in situ (HIS), com o uso de um snoRNA antissenso. A Tiramida foi usada a fim de amplificar a rotulação. Tanto em machos quanto em fêmeas, o snoRNA de juventude é expresso na parede intestinal (epitélio) (Figura 5A), enquanto, conforme esperado, a mesma está ausente no Mutante F4 (Figura 5B).Mais especificamente, o uso de linhas de P[Gal4] específicas para diversos tipos de célula do intestino, combinadas com rotulação dupla, demonstrou que o snoRNA de juventude é expresso especificamente no nucléolo de enterócitos, a maioria e as principais células que formam o epitélio intestinal (Figura 6A), enquanto não é expresso em outros tipos de célula (Figura 6B, C, D, E). Adicionalmente, em fêmeas, o mesmo também é expresso em ovários, e mais particularmente em células nurse (Figuras 5C e 5D).

6) EXPRESSÃO DE ALVO DE SNORNA EM TIPOS DE CÉLULA QUE NÃO AS DE EPITÉLIO DE INTESTINO

[0150] A Expressão de alvo (ectópica) de snoRNA (UAS-8M) em tipos de células que não nas de epitélio de intestino através do uso de três outros linhas de direção Gal4 distintas foi feita: esg-Gal4 (esg-Gal4,F4/F4;UAS-8M/+) e Delta-Gal4 (Delta-Gal4,F4/F4;UAS-8M/+) células-tronco intestinais de direcionamento (ISCs), enquanto Su(H)-Gal4 (Su(H)-GBE-Gal4, F4/F4; UAS-8M/+) enteroblastos de direcionamento (Figura 7). Estes resultados demonstram: 1) que o snoRNA pode ser expresso ectopicamente em outros tipos de célula, 2) que esta expressão ectópica também aumenta a resistência a certos estresses (Figura 8). Em resumo, estes resultados mostram que o snoRNA pode também, conferir proteção quando o mês o é expresso em tipos de célula que não epitélio de intestino.

7) EXPRESSÃO DE ALVO (SELETIVA) DE SNORNA QUE LEVA AO RESGATE DA RESISTÊNCIA AO ESTRESSE

[0151] O inventor demonstrou, em duas abordagens diferentes, que uma expressão de alvo nas células do intestino é suficiente para a restauração do fenótipo de resistência ao estresse. Pode ser demonstrado, pela técnica de hibridização in situ, feito pelas linhas transgênicas genômicas (aquelas que aumentam a longevidade: G5, assim como com outra inserção independente (G4) que o snoRNA é expresso nas células intestinais e que, para regulação da longevidade, a expressão de snoRNA em células intestinais é suficiente.

[0152] A fim de confirmar este primeiro resultado, o snoRNA foi direcionado apenas nas células intestinais, com o uso do sistema de expressão binário P[Gal4]. Um vetor plasmídeo (p[UAS-snoRNA]) foi construído no qual o snoRNA de interesse (apenas148 bp) é disposto sob o controle de elementos reguladores (sequência de Ativação à Montante: SAM) de Gal4. As linhas de moscas transgênicas (UAS-snoRNA: 4M, 5M e 8M) foram então geradas. Para a expressão de alvo, as chamadas linhas de “direcionamento” de moscas transgênicas que contém um transgene (pChs-Gal4) (linhas de vetor de plasmídeo Myo1A-Gal4, esg-Gal4 (escargot- Gal4), Su(H)GBE-Gal4, e Dl-Gal4 (Delta-Gal4)), conhecidas por serem expressas em particular em células intestinais foram usadas (Jiang e Edgar, 2011; Takashima et al., 2011). A seguir, estes diversos transgenes foram dispostos no fundo genético de mutante F4, e foi demonstrado, por hibridização in situ, que o snoRNA é, na verdade, expresso nestes diversos tipos de células intestinais (Figuras 6 e 7) após sua expressão de alvo (esg-Gal4,F4/F4;UAS-snoRNA-8M) (Myo1A- Gal4,F4/F4;UAS-snoRNA-8M) (Su(H)-GBE-Gal4,F4/F4;UAS-snoRNA- 8M) (F4/F4; Delta-Gal4,/UAS-snoRNA-8M). Os resultados mostram que esta expressão de alvo (no Mutante F4) restaura substancialmente o fenótipo de resistência ao estresse (jejum e choque térmico) (Figura 8).

[0153] Estes experimentos mostram claramente que a manipulação destes snoRNAs em células intestinais, e mais particularmente em enterócitos, é necessária e suficiente para a restauração da resistência ao estresse. Estes experimentos, embora conduzidos em Drosófila, permitem sugerir que a reexpressão (restauração da expressão ou resgate) ou superexpressão de snoRNA em células epiteliais do intestino sejam capazes de levar a um aumento de tempo de vida em mamíferos e, em particular, em humanos.

8) IDENTIFICAÇÃO DE HOMÓLOGOS DA SEQUÊNCIA DE JUVENTUDE EM OUTRAS ESPÉCIES DE DROSÓFILA E EM MAMÍFEROS, QUE INCLUI CAMUNDONGOS E HUMANOS

[0154] A busca de homologia de sequência mostrou que este snoRNA também existe em outras 11 espécies diferentes de Drosófila cujos genomas estão disponíveis na (Figura 9A) (consulte ainda a estrutura de consenso de 12 espécies de Drosófila: Figura 9B).

[0155] Ademais, uma busca de homologia e especificamente através da estrutura de RNA (com o uso do software INFERNAL) permitiu a identificação de um homólogo em humanos, localizado no cromossomo 11, na posição: 1282272212822811 (Figura 10). Em camundongos, dois homólogos também foram identificados: no cromossomo 15, posição: 3033688930337017; e no cromossomo 18, posição: 6495012-6495091 (Figuras 11A e 11B).

[0156] Como na Drosófila, é muito provável que a superexpressão deste gene e/ou um análogo sintético (seja genético ou por administração oral, ou por injeção) irá estender o tempo de vida humana. Tal expressão também é capaz de proteger de efeitos deletérios de diversas doenças degenerativas.

9) PAPEL DO SNORNA EM NEURODEGENERAÇÃO E NEUROPROTEÇÃO

[0157] Já que as moscas F4 têm um tempo de vida muito curto, enquanto as moscas com superexpressão de snoRNA (G5) vivem mais, as moscas velhas (40 dias de vida) foram estudadas a fim de conferir a presença de quaisquer lesões neurodegenerativas (mais ou menos orifícios com tamanho maior ou menor presentes no cérebro). No geral, nas moscas de controle (Canton-S), há cerca de 60% das lesões presentes nas moscas (mas é perceptível que 50% das moscas CS já estão mortas com 40 dias) (Figura 12) [para mais detalhes: consulte a Figura 12d para uma análise semiquantitativa]. Nas Mutantes F4, todas as moscas (100%) têm lesões, e elas são geralmente mais severas que as de controle (tamanho e quantidade de orifícios), enquanto as Moscas G5 F4 tem significativamente menos orifícios (apenas cerca de 10% das moscas), sendo que estes orifícios também têm tamanho menor. Finalmente, nas moscas G5, em torno da mesma porcentagem de moscas como as de controle CS apresentam lesos (cerca de 40%) mas essas lesões são claramente menos graves (Figura 12d). Em resumo, o transgene genômico (F4;G5) resgata de forma parcial o fenótipo de neurodegeneração, enquanto a superexpressão de snoRNA (G5) protege contra a neurodegeneração.

10) PAPEL DO SNORNA NA PROTEÇÃO DOS PARÂMETROS SENSÓRIO-MOTOR

[0158] De forma similar, a fim de verificar se a neuroproteção fornecida pelo snoRNA tem efeitos sob parâmetros psicológicos, como parâmetros sensório-motor, a atividade locomotora das moscas com mais de 40 dias foi quantificada (com rastreamento por vídeo) (Martin, 2004) e comparada a de moscas mais novas, com 4 dias de idade (Figura 13). Primeiramente, uma grande diferença entre as moscas de 4dias de idade e as de 40 dias de idade é observada; as moscas com 40dias de idade percorreram um terço da distância percorrida pelas moscas com 4 dias de idade. Entretanto, nas moscas mais velhas com 40 dias de idade, as moscas que superexpressaram o snoRNA (G5) andam mais que as moscas de controle (Canton-S), Mutantes F4 e as que expressam o snoRNA no fundo mutante genético (F4;G5). Este efeito é mais marcado em machos do que em fêmeas. Em resumo, em moscas ânsias com 40dias de idade, é possível notar que as moscas com superexpressão de snoRNA têm melhor desempenho sensório-motor que as moscas de controle. Estes resultados demonstram a natureza de proteção do snoRNA em relação aos efeitos deletérios associados aos mecanismos de envelhecimento.

11) TESTANDO A FUNÇÃO DO SNORNA NOS OVÁRIOS: PAPEL NA FERTILIDADE (REPRODUÇÃO)

[0159] Em fêmeas, o snoRNA também é expresso nos ovários e mais precisamente em células nurse (Figuras 5C,D). Os inventores também mostraram que as moscas mutantes (F4) também têm mudanças na fertilidade (fenótipo reprodutor). As Mutantes F4 colocam um pouco mais de ovos do que as moscas de controle (CS) (Figura 14). As moscas que carregam o snoRNA no fundo genético mutante (F4;G4) colocam um pouco menos de ovos (fertilidade reduzida) enquanto as moscas com superexpressão de snoRNA (G4) colocam muito mais ovos do que as moscas de controle (Figura 14). Estes resultados inegavelmente demonstram o importante efeito exercido pelo snoRNA nos ovários e sua influência sobre a fertilidade em fêmeas.

12) TRATAMENTO COM O SNORNA (ADMINISTRAÇÃO POR VIA ORAL OU INJEÇÃO)

[0160] O snoRNA pode ser administrado tanto de forma oral (per os) ou por injeção. Outras vias de administração como, por exemplo, inalação e aplicação local/cutânea também podem ser usadas dependendo do tipo de vetor usado.

[0161] Como os experimentos conduzidos como parte da invenção mostram, a administração oral do snoRNA é possível dada sua estabilidade e resistência in vitro assim como sua habilidade de agir de forma local sobre as células da parede intestinal (enteroblastos, enterócitos, ISCs). Conforme explicado anteriormente, a administração do snoRNA de interesse é, portanto, capaz de permitir a expressão que estaria, de outra forma, ausente (ou, em outras palavras, resgatar uma mutação existente) ou, se necessário, permitir a superexpressão, a fim de proteger a parede intestinal do dano enquanto mantém um melhor equilíbrio hormonal e metabólico.

13) TRATAMENTO DE CÂNCER

[0162] Em ambos os mamíferos e Drosófila, foi mostrado que os genes delta/notch regulam a diferenciação das células progenitoras de intestino (tripa), enquanto a Via de sinalização Wnt participa em manutenção e proliferação de ISCs. De forma similar, as vias de sinalização de citocina (Upd/Jak/Stat) e a via de RFCE (Receptor de Fator de Crescimento Epidérmico) regulam a proliferação de ISCs (Figuras 15 e 16) (Jiang e Edgar, 2011; Takashima et al., 2011).

[0163] Nossos experimentos mostram que o snoRNA de interesse de acordo com a invenção é capaz de regular certos genes, como notch, delta, JNK, RFCE, etc. (Figura 15) cujas desregulações podem levar à hiperploriferação do epitélio intestinal e, portanto, ao câncer (Jiang e Edgar, 2011; Takashima et al., 2011). O SnoRNA de interesse da invenção é particularmente capaz de evitar ou tratar o câncer através da sua habilidade de regular a expressão de RFCE, a via de sinalização de RFCE a regulação da proliferação de ISCs no intestino de Drosófila e mamíferos sendo, na verdade, particularmente bem conservada (Figura 16) [diversas terapias estão atualmente sob testes clínicos para o tratamento de câncer de cólon, que inclui dois anticorpos monoclonais anti- RFCE (cetuximab e panitumumab) (Amado et al., 2008; Di Nicolantonio et al, 2008)].

14) ENVOLVIMENTO DO SNORNA DE INTERESSE (“JUVENTUDE”) NA SÍNDROME DE HUTCHINSON-GILFORD (HGPS), TAMBÉM CONHECIDA COMO PROGÉRIA, QUE CONSISTE NO ENVELHECIMENTO PRECOCE E ACELERADO EM HUMANOS

[0164] Foi demonstrado que o snoRNA de juventude regula o splicing (quantidade de RNA com splicing) do gene klarsicht (Figura 18A). Foi mostrado que este gene interage com a lâmina (Patterson et al., 2004), uma proteína localizada na membrana interior do núcleo e envolvida em progéria (doença que ocasiona o envelhecimento precoce e acelerado em humanos) (Figura 18B). A progéria é uma doença rara que afeta 1 em 8 milhões de indivíduos (Scaffidi e Misteli, 2006; Broers et al., 2006; Cohen et al., 2001; Cau et al., 2014; Coutinho et al., 2009). O snoRNA de juventude fornece, através de seu fenótipo (envolvimento na longevidade) e seu envolvimento na regulação do gene klarsicht, um prospecto novo para o tratamento de laminopatias como Síndrome de Hutchinson-Gilford ou progéria, displasia mandibuloacral (MAD), Distrofia muscular de Emery- Dreifuss, síndrome de Werner atípica, dermopatia restritiva, acinesia fetal letal, e LIRLLC (Lipoatrofia generalizada, diabetes insulino-resistente, pápulas leucomelanodermia, esteatose hepática e cardiomiopatia hipertrófica) (Hutchison, 2002; Broers et al, 2006), em particular Síndrome de Hutchinson-Gilford (progéria).

15) ENVOLVIMENTO DO SNORNA DE INTERESSE ( “JUVENTUDE”) NA REGULAÇÃO DO SPLICING DE GENE DE HIDROXILASE-2 DE ÁCIDOS GRAXOS (FA2H), E CONSEQUENTEMENTE COM AS DIVERSAS FORMAS DE NEURODEGENERAÇÃO ASSOCIADAS A ESTE GENE

[0165] Foi demonstrado que o snoRNA de juventude regula o splicing (quantidade de RNA com splicing) de gene CG30502 que codifica hidroxilase-2 de ácido graxo (fa2h) (Figura 18B). Este gene é envolvido no processo de biossíntese de ácido graxo e mais particularmente nos processos metabólicos de lipídios complexos como esfingolipídeos e ceramidas (Carvalho et al., 2010). Em humanos, este fa2h foi associado a diversas formas de neurodegeneração (desmielinização) como os associados ao acúmulo de ferro no cérebro, certas leucodistrofias, e finalmente paraplegia espástica hereditária (SPG35) (Kruer et al., 2010; Pierson et al., 2012; Schneider e Bhatia, 2010). Devido a esse fenótipo (envolvimento na longevidade e/ou hipertrofia de gordura corporal observada no Mutante F4) e seu envolvimento na regulação do gene, o snoRNA de juventude oferece uma nova perspectiva para o tratamento das neurodoenças degenerativas mencionadas acima.

16) ) RELAÇÃO METABÓLICA E NEUROENDÓCRINA ENTRE O INTESTINO E O CÉREBRO (EIXO CÉREBRO-INTESTINAL)

[0166] Conforme mencionado anteriormente, os mutantes de snoRNA (F4) apresentam hipertrofia de gordura corporal, visível tanto no abdômen quanto em torno do cérebro na cápsula da cabeça (Figura 21). Ademais, a quantidade de triglicerídeo confirmou esta hipertrofia (consequentemente o qualificador “obeso” das moscas). Este fenótipo sugere uma relação metabólica e/ou neuroendócrina entre a expressão do snoRNA no intestino, lesões neurodegenerativas e tempo de vida aumentado. Mais especificamente, esta interrupção metabólica sugere um envolvimento da via de sinalização da insulina, esta via é descrita muitas vezes como evolvida na longevidade da Drosófila (Tatar et al., 2001; Bai et al., 2012; Partridge et al., 2011; Fontana et al., 2010). Os marcadores imunohistoquímicos direcionados contra um 3- anticaspase ativado mostraram, na Drosófila adulta, que a gordura localizada em torno do perímetro do cérebro é altamente interrompida (isto é, hipertrofiada) em Mutantes F4, enquanto a mesma tem superexpressão do snoRNA (transgenes G5) assim como no resgate (restauração da expressão) (F4; G5) (Figura 21). Estes resultados demonstraram que o snoRNA protege o organismo que expressa o mesmo de mudanças na gordura corporal, e, portanto, por extensão, da obesidade. Ademais, os experimentos de interação genética (mutantes duplos) que envolvem mutações do receptor de insulina (InR) e o Mutante F4 mostram que a mutação do snoRNA pode ao menos resgatar parcialmente o fenótipo da mutação do receptor de insulina (consulte a Figura 21 e sua legenda). Estes resultados mostram a existência de ligações (sejam diretas ou indiretas) entre a via de sinalização de insulina, o snoRNA e a longevidade. Os resultados precedentes mostram que a mutação e/ou desregulamentação do snoRNA interrompe o metabolismo de carboidrato e lipídio.

[0167] O snoRNA de juventude oferece, portanto, uma nova perspectiva para o tratamento tanto de diabetes quanto de obesidade.

17) EXPRESSÃO DO SNORNA DE INTERESSE (“JUVENTUDE”) EM HUMANOS E CAMUNDONGOS

[0168] Através de uma abordagem RT-PCR, foi demonstrada a existência de sequências homólogas, mais precisamente sequências ortólogas, ao snoRNA de juventude (primeiro identificado na Drosófila) expresso de forma concreta em mamíferos (Figura 20). Em humanos, o snoRNA 159- bp (SEQ ID NO: 2) é expresso no intestino e cérebro e levemente nos ovários e rins. Em camundongos, o snoRNA-1 129- bp (SEQ ID NO: 3) é expresso apenas no cérebro e o snoRNA-2 122-bp (SEQ ID NO: 4) é expresso no intestino, cérebro e ovários, mas não nos rins. Estes dados apoiam a expressão, muito provavelmente funcional, destes snoRNAs tanto em humanos quanto em camundongos. REFERÊNCIAS - Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van Cutsem E, Siena S, Freeman DJ, Juan T, Sikorski R, Suggs S, Radinsky R, Patterson SD, Chang DD (2008). Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol, 26, 1626-1634. - Bai H, Kang P, Tatar M. (2012). Drosophila insulin-like peptide-6 (dilp6) expression from fat body extends lifespan and represses secretion of Drosophila insulin-like peptide-2 from the brain. Aging Cell., 11, 978- 985. - Brand AH, Perrimon N (1993) Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development 118, 401-415 - Broers JL, Ramaekers FC, Bonne G, Yaou RB, Hutchison CJ (2006). Nuclear lamins: laminopathies and their role in premature ageing. Physiol Rev., 86, 967-1008. - Carvalho M, Schwudke D, Sampaio JL, Palm W, Riezman I, Dey G, Gupta GD, Mayor S, Riezman H, Shevchenko A, Kurzchalia TV, Eaton S. (2010) Survival strategies of a sterol auxotroph. Development, 137, 3675-3685. - Cau P, Navarro C, Harhouri K, Roll P, Sigaudy S, Kaspi E, Perrin S, De Sandre-Giovannoli A, Lévy N. (2014). Nuclear matrix, nuclear envelope and premature aging syndromes in a translational research perspective. Semin Cell Dev Biol., 28, S1084-9521(14)00058-5. - Cohen M, Lee KK, Wilson KL, Gruenbaum Y. (2001). Transcriptional repression, apoptosis, human disease and the functional evolution of the nuclear lamina. Trends Biochem Sci., 26, 41-47. - Coutinho HD1, Falcão-Silva VS, Gonçalves GF, da Nóbrega RB (2009). Molecular ageing in progeroid syndromes: Hutchinson-Gilford progeria syndrome as a model. Immun Ageing, 20, 6:4. - Dick, K. J., Al-Mjeni, R., Baskir, W., Koul, R., Simpson, M. A., Patton, M. A., Raeburn, S., Crosby, A. H. (2008). A novel locus for an autosomal recessive hereditary spastic paraplegia (SPG35) maps to 16q21-q23. Neurology 71: 248-252. - Dick, K. J., Eckhardt, M., Paisan-Ruiz, C., Alshehhi, A. A., Proukakis, C., Sibtain, N. A., Maier, H., Sharifi, R., Patton, M. A., Bashir, W., Koul, R., Raeburn, S., Gieselmann, V., Houlden, H., Crosby, A. H. (2010). Mutation of FA2H underlies a complicated form of hereditary spastic paraplegia (SPG35). Hum. Mutat. 31: E1251-1260. - Di Nicolantonio F, Martini M, Molinari F, Sartore-Bianchi A, Arena S, Saletti P, De Dosso S, Mazzucchelli L, Frattini M, Siena S, Bardelli A (2008). Wildtype BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol, 26, 5705-5712. - Elliott DA, Brand AH. (2008) The GAL4 system: a versatile system for the expression of genes. Methods Mol Biol, 420, 79-95. - Fontana L, Partridge L, Longo VL (2010). Extending healthy life span - from yeast to humans. Science, 328, 321-326. - Huang ZP, Zhou H, He HL, Chen CL, Liang D, Qu LH. (2005) Genome-wide analyses of two families of snoRNA genes from Drosophila melanogaster, demonstrating the extensive utilization of introns for coding of snoRNAs. RNA, 11, 13031316. - Hutchison CJ. (2002). Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nat Rev Mol Cell Biol., 3, 848-858. - Jiang H, Edgar BA (2011). Intestinal stem cells in the adult Drosophila midgut. Exp Cell Res. 317, 2780-2788. - Kruer MC1, Paisán-Ruiz C, Boddaert N, Yoon MY, Hama H, Gregory A, Malandrini A, Woltjer RL, Munnich A, Gobin S, Polster BJ, Palmeri S, Edvardson S, Hardy J, Houlden H, Hayflick SJ. (2010). Defective FA2H leads to a novel form of neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA). Ann Neurol., 68, 611-618. - Martin, JR, Faure, P, Ernst, R (2002). The Power Law Distribution for Walking-Time Intervals Correlates with the Ellipsoid Body in Drosophila. J. Neurogenetics, 15, 1-15. - Martin, JR (2004). A portrait of locomotor behaviour in Drosophila determined by a video-tracking paradigm. Behav. Process., 67, 207-219. - Partridge L, Alic N, Bjedov I, Piper MD (2011). Ageing in Drosophila: the role of the insulin/Igf and TOR signalling network. Exp Gerontol., 46, 376-381. - Patterson K1, Molofsky AB, Robinson C, Acosta S, Cater C, Fischer JA. (2004) The functions of Klarsicht and nuclear lamin in developmentally regulated nuclear migrations of photoreceptor cells in the Drosophila eye. Mol Biol Cell., 15, 600-610. - Pierson TM1, Simeonov DR, Sincan M, Adams DA, Markello T, Golas G, Fuentes-Fajardo K, Hansen NF, Cherukuri PF, Cruz P, Mullikin JC, Blackstone C, Tifft C, Boerkoel CF, Gahl WA. (2012) Exome sequencing and SNP analysis detect novel compound heterozygosity in fatty acid hydroxylase- associated neurodegeneration. Eur J Hum Genet., 20, 476-479. - Rzezniczak TZ, Douglas LA, Watterson JH, Merritt TJ. (2011) Paraquat administration in Drosophila for use in metabolic studies of oxidative stress. Analytical Biochem., 419, 345-7. - Scaffidi P, Misteli T. (2006) Lamin A-dependent nuclear defects in human aging. Science, 312, 1059-1063. - Schneider SA, Bhatia KP. (2010) Three faces of the same gene: FA2H links neurodegeneration with brain iron accumulation, leukodystrophies, and hereditary spastic paraplegias. Ann Neurol., 68, 575-577. - Takashima S, Adams KL, Ortiz PA, Ying CT, Moridzadeh R, Younossi-Hartenstein A, Hartenstein V (2011). Development of the Drosophila entero-endocrine lineage and its specification by the Notch signaling pathway. Dev Biol, 353, 161-172. - Tatar M, Kopelman A, Epstein D, Tu MP, Yin CM, Garofalo RS (2001). A Mutant Drosophila Insulin Receptor Homolog That Extends Life-Span and Impairs Neuroendocrine Function. Science, 292, 107. - Uytterhoeven V, Kuenen S, Kasprowicz J, Miskiewicz K, Verstreken P (2011). Loss of skywalker reveals synaptic endosomes as sorting stations for synaptic vesicle proteins. Cell, 145, 117-132.

Claims

1. USO DE UMA SEQUÊNCIA DE RNA ISOLADA OU SINTÉTICA, compreendendo a sequência SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, caracterizado pela sequência de RNA ser para fabricação de um medicamento para prolongar a vida útil de um indivíduo, para aumentar a resistência ao estresse em um indivíduo, para combater os efeitos nocivos do envelhecimento em um indivíduo, para tratar a infertilidade ou estimular a fertilidade em um indivíduo, ou para prevenir ou tratar em um indivíduo uma doença degenerativa, em particular uma doença neurodegenerativa, uma laminopatia, diabetes, obesidade ou câncer.

2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela dita sequência ser um pequeno RNA nucleolar (snoARN).

3. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo câncer ser um câncer induzido por radicais livres.

4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo indivíduo ser um animal ou um inseto, tipicamente um mamífero, de preferência, um ser humano, sendo ainda mais preferencialmente, um indivíduo que não expressa a sequência de RNA, conforme definido nas reivindicações 1 ou 2, ou que expresse uma versão anormal da dita sequência de RNA, um indivíduo experimentando condições de estresse, tais como jejum, um choque térmico ou um estresse oxidativo, e/ou um indivíduo que sofre de uma doença degenerativa, de uma laminopatia, de diabetes, de obesidade, de câncer ou de problemas de fertilidade.

5. USO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo genoma do indivíduo não expressar a sequência de RNA, conforme definido nas reivindicações 1 ou 2, ou expressar uma versão anormal da dita sequência de RNA, que contém uma sequência de DNA que compreende uma mutação, sendo que a dita sequência é uma sequência do tipo selvagem selecionada a partir de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO:8; e a dita mutação sendo, de preferência, selecionada dentre uma deleção, uma substituição ou uma adição de um ou vários pares de bases.

6. VETOR QUE PERMITE A EXPRESSÃO DE UMA SEQUÊNCIA DE RNA para uso, conforme definido nas reivindicações 1 ou 2, caracterizado por ser selecionado a partir de um plasmídeo, um cosmídeo, um vetor viral e um fago, dito vetor compreendendo um promotor e/ou elementos reguladores que favorecem a expressão da dita sequência de RNA nas células intestinais ou ovarianas.

7. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender uma sequência de RNA, conforme definido nas reivindicações 1 ou 2, um vetor, conforme definido na reivindicação 6 e um suporte adequado do ponto de vista dietético ou farmacêutico.

8. USO DE UMA SEQUÊNCIA DE RNA, conforme definido nas reivindicações 1 ou 2, de um vetor, conforme definido na reivindicação 6 ou de uma composição, conforme definido na reivindicação 7, caracterizado por ser utilizado de modo contínuo ou sequencial, para restaurar ou modular a expressão da dita sequência de RNA in vitro ou ex vivo.