BR112018007173B1 - composição compreendendo àcidos nucléicos ou proteínas p53 de elefante e uso da composição para inibir câncer - Google Patents

Abstract

A presente divulgação é dirigida a métodos e composições para inibir uma célula cancerosa usando sequências de ácido nucleico que codificam p53 de elefante ou sequências de aminoácido de p53 de elefante

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AO(S) PEDIDO(S) RELACIONADO(S)

[001]Este reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório dos EUA No 62/239.103, depositado em 8 de outubro de 2015, e Pedido de Patente Provisório dos EUA No 62/379.179, depositado em 24 de agosto de 2016, os conteúdos inteiros de todos os quais são completamente incorporados aqui por referência.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DO MATERIAL SUBMETIDO ELETRONICAMENTE

[002]Incorporada por referência em sua totalidade aqui é uma listagem de sequências de nucleotídeo/aminoácido com suporte informático submetida concorrentemente com este e identificada como segue: Unidade 184.774 bytes ASCII (Text) arquivo denominado “026389-9173_ST25.txt,” criado em 6 de outubro de 2016.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003]Organismos multicelulares têm defesas intrínsecas para proteger contra o desenvolvimento de mutações e câncer. Um tal mecanismo de defesa são as vias de sinalização reguladas por proteína tumoral p53 (codificada pelo gene TP53), que é um supressor crítico do câncer. Referida como o “guardião do genoma,” p53 é capaz de parar a divisão celular quando dano ao DNA é detectado e iniciar a correção da mutação, ou ativar apoptose se o dano for irreparável (Blagosklonny. Int J Cancer, 98: 161 - 166(2002)). Seres humanos contêm uma cópia (dois alelos) de TP53, e ambos os alelos em funcionamento são cruciais para prevenir o desenvolvimento do câncer. A ausência de até um alelo funcional leva a Síndrome de Li-Fraumeni (LFS), uma predisposição ao câncer em que pacientes têm uma chance de 90 % de desenvolver câncer durante sua vida (McBride et al. Nat Rev Clin Oncol; 11(5): 260 - 271 (2014)). A inativação de p53 também pode levar a câncer (Lane, DP. Nature; 358(6381): 15 - 16 (2014); Hanahan et al. Cell; 144(5): 646 - 674 (2011)), e em seres humanos a função de p53 naturalmente diminui com a idade (Feng et al., PNAS; 104(42): 16633 - 16638 (2007)), deixando metade de todos os homens e um terço de todas as mulheres suscetíveis a desenvolver câncer durante sua vida (American Cancer Society; Cancer Facts & Figures (2015)). Mutações de p53 foram identificadas em numerosos canceres humanos (Hollstein et al., Science; 253(5015): 49 - 53 (1991)).

[004]Pesquisadores naturalmente focaram em combater o câncer utilizando- se as propriedades protetivas de p53. Por exemplo, terapias genéticas com TP53 mediadas por retrovírus e adenovírus foram desenvolvidas para liberar p53 humana a células cancerosas (Cai et al. Hum Gene Ther: 4: 617-624 (1993); Brandt et al. Am J Epidemiol; 90: 484-500 (1969)), e o acúmulo de p53 pode ser induzido interrompendo- se sua regulação negativa por minuto duplo camundongo 2 (MDM2) (Vassilev et al. Science; 3i03: 844-848 (2004)). Entretanto, estas terapias focaram principalmente em restaurar a atividade de p53 do tipo selvagem em seres humanos, ou eliminar as células cancerosas com p53 mutante.

[005]Dado que cada divisão celular pode induzir potencialmente uma nova mutação genética, foi originalmente suspeito que em organismos maiores (que naturalmente requerem um número maior de divisões celulares) haveria um aumento no número de células mutadas (Tomasetti et al., Science; 347(6217): 78 - 81 (2015)). Se todas as células mamíferas forem igualmente suscetíveis a mutações oncogênicas, então o risco de câncer deveria aumenta com o tamanho corporal (número de células) e expectativa de vida da espécie (número de divisões celulares). Entretanto esta teoria foi contestada há mais de 35 anos, visto que a incidência do câncer sobre os animais não parece aumentar para o tamanho corporal e expectativa de vida grandes (Caulin et al., Trends Ecol Evolut; 26(4): 175 - 182 (2011); Peto et al., Br J Cancer; 32(4): 411 - 426 (1975)). Os mecanismos celulares e moleculares desta resistência ao câncer em animais maiores não são claramente entendidos, entretanto um estudo recente mostrou que elefantes são especialmente resistentes a desenvolver câncer (Abegglen et al. JAMA; 314(17): 1850 - 60 (2015)). Também foi descoberto que elefantes portam cópias extras do gene TP53. Estudos de seguimento mostraram que p53 de elefante (EP53) é especialmente eficaz em matar células cancerosas, mesmo quando as células cancerosas já continham p53 humana.

[006]Permanece uma necessidade de composições e métodos para restaurar mais eficazmente a função de p53 a células cancerosas. A invenção fornece tais composições e métodos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007]A presente divulgação fornece um método de inibir câncer que compreende contatar uma célula cancerosa com (a) uma ou mais sequências de ácido nucleico todas codificando uma proteína p53 de elefante, ou (b) uma ou mais proteínas p53 de elefante, por meio do qual o câncer é inibido.

[008]A presente divulgação também fornece uma composição compreendendo um portador farmaceuticamente aceitável e (a) uma ou mais sequências de ácido nucleico todas codificando uma proteína p53 de elefante ou (b) uma ou mais proteínas p53 de elefante.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[009]A Figura 1 é um gráfico do log(massa x expectativa de vida) de 33 espécies mamíferas diferentes em relação à porcentagem de necropsias realizadas em cada espécie que exibiu tumores.

[010]A Figura 2 é uma árvore filogênica que mostra retrogenes de TP53 do grupo A e grupo B no elefante africano.

[011]A Figura 3A é uma imagem de um gel de eletroforese que mostra resultados de RT-PCR específica de TP53 realizada em PBMCs de elefantes africanos e asiáticos e fibroblastos de elefante africano. Duas faixas em 201bp e 185bp são mostradas, que correlacionam com o Grupo A e Grupo B dos retrogenes de p53 de elefante. A Figura 3B é uma imagem de resolução mais alta dos resultados de PCR representados na Figura 3A.

[012]A Figura 4A e 4B são imagens de western blots mostrando que células HEK293 transfectadas com retrogenes de EP53 aumentam a expressão das proteínas em resposta ao dano ao DNA induzido por MG132 ou doxorrubicina. A Figura 4C é uma imagem de um western blot mostrando que células HEK293 transfectadas com EP53r9são capazes de supra-regular a proteína, e aumentar a expressão da proteína fosforilada, em resposta ao dano ao DNA a partir de radiação ionizante.

[013]A Figura 5A é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de linfócitos do sangue periférico de elefante comparados a linfócitos do sangue periférico humano sofrendo apoptose tardia em resposta a radiação ionizante de 2 Gy e 6 Gy. A Figura 5B é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de linfócitos do sangue periférico de elefante comparados a linfócitos do sangue periférico humano sofrendo apoptose precoce em resposta à radiação ionizante de 2 Gy e 6 Gy.

[014]A Figura 6A é um gráfico de barras mostrando que linfócitos de um elefante africano exibem níveis maiores de apoptose tardia depois da exposição à doxorrubicina. A Figura 6B é um gráfico de barras mostrando que linfócitos de um elefante africano exibem níveis maiores de apoptose precoce depois da exposição à doxorrubicina.

[015]A Figura 7 é um gráfico de dispersão que mostra a porcentagem de linfócitos do sangue periférico sofrendo apoptose tardia a seguir da exposição à radiação ionizante de 2 Gy, de pacientes com Síndrome de Li-Fraumeni, 10 controles saudáveis, e 1 elefante africano.

[016]A Figura 8 é um gráfico de linhas mostrando que fibroblastos de elefante exibem maior clivagem de caspase 3/7 do que fibroblastos humanos a seguir da exposição à doxorrubicina.

[017]A Figura 9 é uma imagem de um western blot que mostra um aumento na expressão de proteína p53 e p21 5 horas e 24 horas depois da radiação ionizante de 2 Gy e 6 Gy.

[018]A Figura 10A é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de células apoptóticas em linfócitos de um ser humano e um elefante asiático, 18 horas depois do tratamento com radiação ionizante de 2 Gy. A Figura 10B é uma imagem de um western blot que mostra a expressão de proteína p21 em linfócitos de elefante asiático 5 horas depois da radiação ionizante de 2 Gy. A Figura 10C é um gráfico de barras que mostra a porcentagem de linfócitos apoptóticos em elefantes asiáticos, classificados por grupos de idade, 18 horas depois do tratamento com radiação ionizante.

[019]A Figura 11A é um gráfico de linhas que mostra um aumento da atividade de caspase em células NIH 3T3 transfectadas com EP53r5 a seguir do tratamento com doxorrubicina. A Figura 11B é um gráfico de linhas que mostra um aumento da atividade de caspase em células NIH 3T3 transfectadas com EP53r9 a seguir do tratamento com doxorrubicina.

[020]A Figura 12A é um gráfico de linhas que mostra um aumento na atividade de caspase em células U-2OS transfectadas com EP53r6 a seguir do tratamento com doxorrubicina. A Figura 12B é um gráfico de linhas que mostra um aumento na atividade de caspase em células U-2OS induzidas com EP53anc a seguir do tratamento com doxorrubicina. A Figura 12C é uma imagem de um western blot mostrando que células U-2OS induzidas com EP53anc e tratadas com doxorrubicina para induzir dano ao DNA exibem um aumento em genes alvos de p53, p21 e MDM2.

[021]A Figura 13 é um western blot mostrando que células U-2OS transfectadas com EP53r9 rotulada com GFP exibem um aumento em EP53r9 fosforilada, com uma diminuição concomitante na P53 humana fosforilada.

[022]A Figura 14A é um gráfico de pontos mostrando que células HCT 116 transfectadas com EP53r9 exibem um aumento na atividade de caspase a seguir do tratamento com doxorrubicina. A Figura 14B é um western blot mostrando que células HCT 116 transfectadas com EP53r9 exibem um aumento na expressão de EP53r9 que correlaciona com doses crescentes de doxiciclina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[023]A presente divulgação é prognosticada, pelo menos em parte, na descoberta de que elefantes africanos são mais resistentes ao câncer do que os seres humanos. A mortalidade por câncer ocorre em cerca de 11 % a 25 % de seres humanos, enquanto o câncer ocorre em cerca de 3 % a 6 % de elefantes. Esta resistência aumentada ao câncer pode ser parcialmente explicada pelo aumento em cópias genéticas do gene TP53 em elefantes, que codifica a proteína p53. Embora seres humanos tenham apenas uma cópia de TP53 (dois alelos), elefantes têm pelo menos 20 cópias (40 alelos) do gene de p53 de elefante (EP53). Em estudos de cultura celular, foi descoberto que linfócitos de elefante foram mais prováveis a executar apoptose em resposta ao dano ao DNA a partir da exposição à radiação ionizante, sugerindo um limiar mais baixo para dano ao DNA antes que a apoptose mediada por p53 de elefante seja provocada. p53 de elefante parece ser mais eficaz do que p53 humana em detectar dano ao DNA e remover células mutadas de um organismo. O uso de p53 de elefante não foi previamente explorado como um mecanismo para alvejar canceres humanos.

Sequências de p53 de Elefante

[024]A presente divulgação fornece um método de inibir câncer, que compreende contatar uma célula cancerosa com uma ou mais sequências de ácido nucleico todas codificando uma proteína p53 de elefante, ou uma ou mais proteínas p53 de elefante.

[025]Ácidos nucleicos podem ser de filamento único ou de filamento duplo, ou podem conter porções tanto de sequências de filamento duplo quanto de filamento único. O ácido nucleico pode ser DNA, e conter desoxirribonucleotídeos, ou RNA, e conter ribonucleotídeos. Ácidos nucleicos podem ser obtidos por métodos de síntese química ou por métodos recombinantes. Uma sequência de ácido nucleico particular pode abranger variantes conservativamente modificadas desta (por exemplo, substituições de códon), alelos, ortólogos, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), e sequências complementares assim como a sequência explicitamente indicada.

[026]Uma célula cancerosa pode ser contatada com qualquer sequência de ácido nucleico adequada que codifica uma proteína p53 de elefante em qualquer combinação adequada. Por exemplo, em algumas modalidades, a célula cancerosa pode ser contatada com uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína p53 de elefante. Em outras modalidades, a célula cancerosa é contatada com sequências de ácido nucleico múltiplas, todas codificando uma proteína p53 de elefante. Visto que elefantes compreendem pelo menos 20 cópias do gene TP53, a célula cancerosa pode ser contatada com 2 a 25 sequências de ácido nucleico (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 sequências de ácido nucleico) todas codificando uma proteína p53 de elefante. Em uma modalidade, a uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma proteína p53 de elefante é um retrogene. Como usado aqui, o termo “retrogene” refere- se a um RNA transcrito a partir de um gene de DNA copiado de volta no genoma por transcrição reversa. Um retrogene pode carecer de introns. A célula cancerosa pode ser contatada com sequências de ácido nucleico múltiplas cada uma das quais compreende o mesmo retrogene, retrogenes diferentes múltiplos, ou combinações destes. Além disso ou alternativamente, a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína p53 de elefante pode ser um gene ancestral. Como usado aqui, o termo “gene ancestral” refere-se a um gene comum a partir do qual uma família de genes descende. Um gene ancestral pode ser derivado a partir da ressureição do gene ancestral ou restauração do gene ancestral, em que a proteína ancestral é inferida por meio de métodos filogênicos, e uma molécula de DNA que codifica esta proteína é sintetizada (Chang et al., Integr Comp Biol; 43(4): 500 - 507 (2003)). A célula cancerosa pode ser contatada com sequências de ácido nucleico múltiplas cada uma das quais compreende o mesmo gene ancestral, genes ancestrais diferentes múltiplos, ou combinações destes. Em outras modalidades, a célula cancerosa pode ser contatada com uma combinação de um ou mais retrogenes que codificam p53 e um ou mais genes ancestrais que codificam p53.

[027]Exemplos de sequências de ácido nucleico de retrogenes que codificam proteínas p53 de elefante incluem, mas não são limitados a, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, e SEQ ID NO: 76. Um exemplo de uma sequência de ácido nucleico de um gene ancestral que codifica uma proteína p53 de elefante inclui, mas não é limitado a, SEQ ID NO: 2.

[028]Para liberação às células (por exemplo, células cancerosas), a uma ou mais sequências de ácido nucleico podem ser incorporadas em um vetor de transferência de gene. Um “vetor de transferência de gene” ou “vetor” é qualquer molécula ou composição que tem a capacidade de portar materiais genéticos (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico), em uma célula hospedeira adequada onde a síntese da proteína codificada ocorre. Vetores adequados incluem, mas não são limitados a, plasmídeos, vetores virais, lipossomas, lipídeos, polímeros, nanopartículas inorgânicas, ou vetores quiméricos compreendendo qualquer combinação do precedente (por exemplo, um complexo de plasmídeo-lipídeo ou um complexo de plasmídeo-polímero). Vetores virais adequados incluem, por exemplo, vetores retrovirais, vetores com base em vírus do herpes simples (HSV), vetores com base em parvovírus, vetores com base em vírus Sendai (SeV), vetores com base em vírus adeno-associado (AAV), vetores quiméricos AAV-adenovirais, e vetores com base em adenovírus, e podem ser preparados usando técnicas de DNA recombinante padrão descritas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 4a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.Y. (2016). Polímeros, lipídeos, e nanopartículas inorgânicas adequados são descritos em, por exemplo, Peer et al., Nature Nanotechnology, 2:751 - 760 (2007), e Boussif et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92: 7297 - 7301 (1995)).

[029]Em outras modalidades, a célula cancerosa pode ser contatada com uma ou mais proteínas p53 de elefante. Uma célula cancerosa pode ser contatada com qualquer proteína p53 de elefante adequada em qualquer combinação adequada. Como debatido acima, porque elefantes compreendem pelo menos 20 cópias do gene TP53, a célula cancerosa pode ser contatada com 2 a 25 proteínas p53 (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 proteínas). A uma ou mais proteínas p53 de elefante podem ser codificadas por um ou mais retrogenes, tais como aqueles descritos aqui. Por exemplo, a célula cancerosa pode ser contatada com proteínas múltiplas, cada uma das quais é codificada pelo mesmo retrogene, retrogenes múltiplos diferentes, ou combinações destes. Além disso ou alternativamente, a uma ou mais proteínas p53 de elefante podem ser codificadas por um gene ancestral, tais como aqueles descritos aqui. A célula cancerosa pode ser contatada com proteínas múltiplas p53, cada uma das quais é codificada pelo mesmo gene ancestral, genes ancestrais diferentes múltiplos, ou combinações destes. Em outras modalidades, a célula cancerosa pode ser contatada com uma combinação de uma ou mais proteínas p53 codificadas por retrogene e uma ou mais proteínas p53 codificadas por gene ancestral.

[030]Exemplos de sequências de aminoácido de p53 de elefante codificadapor retrogene, mas não são limitados a, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29,SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39,SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49,SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59,SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69,SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, e SEQ ID NO: 77. Um exemplo de uma sequência de aminoácido de p53 de elefante codificada por gene ancestral inclui, mas não é limitado à SEQ ID NO: 3.

Composições

[031]Em certas modalidades, a uma ou mais sequências de ácido nucleico deTP53 de elefante que codificam a uma ou mais proteínas p53 de elefante estão na forma de uma composição. Assim, a presente divulgação também fornece uma composição compreendendo um portador farmaceuticamente aceitável e (a) uma ou mais sequências de ácido nucleico todas codificando uma proteína p53 de elefante ou (b) uma ou mais proteínas p53 de elefante. Qualquer portador farmaceuticamente aceitável adequado pode ser usado no contexto da presente divulgação, e tais portadores são bem conhecidos na técnica. A escolha do portador será determinada, em parte, pelo sítio particular ao qual a composição deve ser administrada e pelo método particular usado para administrar a composição. Formulações exemplares para a composição incluem, mas não são limitadas a, formulações orais, injetáveis, e em aerossol.

[032]Formulações adequadas para administração oral podem compreender(a) soluções líquidas, tal como uma quantidade eficaz de a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou proteínas dissolvidas em diluentes, tais como água, solução salina, ou uma bebida, (b) cápsulas, sachês, ou tabletes, todos contendo uma quantidade predeterminada de a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou proteínas, como sólidos ou grânulos, (c) suspensões em um líquido apropriado, e (d) emulsões adequadas. Formas de tablete podem incluir um ou mais de lactose, manitol, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, acácia, gelatina, dióxido de silício coloidal, croscarmelose sódica, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico, e outros excipientes, corantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes umectantes, preservantes, agentes flavorizantes, e excipientes farmacologicamente compatíveis. Formas de pastilha expectorante podem compreender a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou proteínas em um flavor, usualmente sacarose e acácia ou tragacanto, assim como pastilhas compreendendo o ingrediente ativo em uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia, emulsões, géis, e semelhantes contendo, além de a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou proteínas, tais excipientes como são conhecidos na técnica.

[033]Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções para injeção estéreis isotônicas, aquosas e não aquosas, que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostáticos, e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor intencionado, e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizadores, agentes espessantes, estabilizadores, e preservantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou de doses múltiplas, tais como ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em uma condição seca por congelamento (liofilizada) que requer apenas a adição do excipiente líquido estéril, por exemplo, água, para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções para injeção e suspensões extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos, e tabletes do tipo previamente descrito.

[034]Formulações adequadas para administração por aerossol compreendendo a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou proteínas, sozinhas ou em combinação com outros componentes adequados, que podem ser fabricados em formulações em aerossol a serem administradas por intermédio de inalação. Estas formulações em aerossol podem ser colocadas em propelentes pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio, e semelhantes. Elas também podem ser formuladas como produtos farmacêuticos para preparações não pressurizadas, tais como em um nebulizador ou um atomizador.

[035]Formulações adequadas para administração tópica podem incluir cremes, loções, géis, unguentos, ou semelhantes. Outras formulações adequadas são possíveis, por exemplo, supositórios podem ser preparados pelo uso de uma variedade de bases tais como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. Formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas, ou formulas de pulverização contendo, além de a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou proteínas, tais portadores como são conhecidos na técnica como sendo apropriados.

[036]Em uma modalidade, formulações adequadas da composição podem compreender uma temperatura de transição de fase que é igual a ou mais baixa do que a estabilidade térmica da proteína. Por exemplo, uma proteína com uma estabilidade térmica de 25 °C pode ser formulada com um fosfolipídeo compreendendo uma temperatura de fusão de 23 °C (por exemplo, 1,2-Dimiristoil-sn- glicero-3-fosfocolina (DMPC)). Fosfolipídeos adequados são bem conhecidos na técnica.

[037]Em um aspecto do método acima, a composição compreende um lipossoma. O termo “lipossoma” como usado aqui refere-se a uma vesícula artificialmente preparada composta de uma bicamada de lipídeo. O termo “bicamada de lipídeo” como usado aqui refere-se a uma membrana fabricada de duas camadas de moléculas de lipídeo. A bicamada de lipídeo pode ter uma espessura similar àquela de uma bicamada naturalmente existente, tal como uma membrana celular, uma membrana nuclear, e um envelope viral. Por exemplo, a bicamada de lipídeo pode ter uma espessura de cerca de 10 nm ou menos, por exemplo, em uma faixa de cerca de 1 nm a cerca de 9 nm, cerca de 2 nm a cerca de 8 nm, cerca de 2 nm a cerca de 6 nm, cerca de 2 nm a cerca de 4 nm, ou cerca de 2,5 nm a cerca de 3,5 nm. A bicamada de lipídeo é uma barreira que retém ácidos nucleicos, proteínas, íons, e outras moléculas enquanto também impedindo-os de difundir em áreas indesejáveis.

[038]As “moléculas de lipídeo” que formam a bicamada de lipídeo podem compreender uma molécula incluindo uma cabeça hidrofílica e uma cauda hidrofóbica. A molécula de lipídeo pode compreender de cerca de 14 a cerca de 50 átomos de carbono. Exemplos das moléculas de lipídeo que podem formar uma bicamada de lipídeo incluem fosfolipídeos, lipídeos conjugados a polietilenoglicol (PEG), colesterol, ou qualquer combinação destes. Um lipossoma pode ser classificado como uma vesícula unilamelar ou uma vesícula multilamelar. Uma vesícula unilamelar, como definido aqui, é uma bicamada única de um lipídeo anfifílico ou uma mistura de tais lipídeos, contendo solução aquosa dentro da câmara. Uma vesícula multilamelar consiste em muitas bicamadas de lipídeo anfifílico concêntricas.

[039]Em um outro aspecto do método acima, o lipossoma pode ser uma micela, uma bicela, ou um nanodisco de lipídeo. Como usado aqui, “micela” refere-se a um agregado de moléculas de tensoativo compreendendo um interior hidrofóbico. Em algumas modalidades, a micela pode ser compreendida dentro do espaço interior hidrofílico de um lipossoma. Uma “bicela” é uma micela em forma de disco. Uma micela ou uma bicela podem compreender um ácido nucleico, proteína, íon hidrofóbicos, ou outra molécula. O termo “nanodisco,” como usado aqui, refere-se a pelo menos uma bicamada de fosfolipídeo, em que a margem hidrofóbica é estabilizada por pelo menos uma proteína anfipática.

[040]Em algumas modalidades, a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou uma ou mais sequências de aminoácido de p53 de elefante são encapsuladas dentro de um lipossoma.

[041]Em uma outra modalidade, a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou uma ou mais proteínas p53 de elefante podem ser encapsuladas dentro de uma nanopartícula. Uma “nanopartícula,” como definido aqui, é uma partícula tridimensional tendo pelo menos uma dimensão que é menos do que 100 nm. No contexto da presente divulgação, uma nanopartícula pode compreender um núcleo hidrofóbico e uma camada hidrofílica circundando o núcleo. Uma nanopartícula também pode compreender uma superfície externa decorada com uma ou mais porções. Como usado aqui, uma “porção” é uma parte ou grupo funcional de uma molécula. A uma ou mais porções podem ser embutidas no núcleo da nanopartícula, contidas dentro do núcleo, ligadas a uma molécula que forma pelo menos uma porção do núcleo, ligadas a uma molécula ligada ao núcleo, ou diretamente ligadas ao núcleo. Uma porção pode ser escolhida de modo a reduzir a interação da nanopartícula com o sistema reticuloendotelial. Tais porções incluem, por exemplo, polietilenoglicol (PEG).

[042]Em uma modalidade, a uma ou mais porções podem compreender uma porção de alvejamento. Como usado aqui, uma “porção de alvejamento” direciona uma nanopartícula a um tipo de célula específico, por exemplo, uma célula cancerosa. As porções de alvejamento preferivelmente estendem-se exteriormente do núcleo de modo que elas estejam disponíveis para interação com componentes celulares ou de modo que elas afetem as propriedades superficiais da nanopartícula. Em uma modalidade, as porções de alvejamento podem ser presas ao núcleo ou componentes que interagem com o núcleo. A porção de alvejamento pode compreender um portador de molécula pequena, tal como, um colesterol, um açúcar, ou insulina, para facilitar a captação metabólica da nanopartícula. A porção de alvejamento pode compreender adicionalmente um anticorpo ou um ligante que é específico para uma molécula, por exemplo, um receptor, no exterior da célula alvejada. A uma ou mais porções de alvejamento podem alvejar a nanopartícula a uma organela celular específica, tal que a nanopartícula acumula em uma organela celular específica, em relação a outras organelas ou citoplasma, em uma concentração maior do que uma nanopartícula não alvejada substancialmente similar. Uma nanopartícula não alvejada substancialmente similar inclui os mesmos componentes substancialmente na mesma concentração relativa (por exemplo, dentro de cerca de 5 %) como a nanopartícula alvejada, mas carece de uma porção de alvejamento. Organelas celulares que podem ser alvejadas pela nanopartícula incluem, por exemplo, a membrana celular, núcleo, nucléolo, mitocôndria, aparelho de golgi, vesícula de golgi, retículo endoplasmático áspero, retículo endoplasmático liso, lisossomo, peroxissoma, citoplasma, citosol, vacúolo, e vesículas secretórias.

[043]Em uma outra modalidade, a porção de alvejamento, por exemplo, um peptídeo de alvejamento, colesterol, açúcar, ou polietilenoglicol, pode ser conjugada a uma variante de uma proteína p53 de elefante para facilitar o alvejamento de um tipo de célula específico, e/ou para aumentar a meia-vida da proteína.

[044]A nanopartícula também pode compreender uma ou mais agentes terapêuticos (por exemplo, os ácidos nucleicos que codificam TP53 de elefante ou proteínas p53 descritos aqui). Em uma modalidade, o agente terapêutico pode compreender um segmento de peptídeo curto de uma proteína p53 de elefante, por exemplo, um peptídeo de 13-mer em comprimento. O agente terapêutico pode ser liberado em um tipo de célula específico a seguir da captação celular da nanopartícula, por exemplo, fusão da nanopartícula com um tipo de célula específico. Em uma outra modalidade, o agente terapêutico pode ser liberado no exterior de um tipo de célula específico, e ser absorvido por um mecanismo celular, tal como, macropinocitose. Os agentes terapêuticos podem ser contidos dentro do núcleo da nanopartícula e liberados do núcleo em uma taxa desejada. Em algumas modalidades, o núcleo pode ser biodegradável, liberando o uma ou mais agentes terapêuticos conforme o núcleo é degradado ou desgastado.

[045]A composição pode compreender ainda uma ou mais agentes ou aditivos adicionais que inibem câncer ou realçam a atividade dos ácidos nucleicos e proteínas de p53 de elefante descritos aqui. O agente pode opcionalmente melhorar a eficácia do agente terapêutico, e/ou impedir a inativação, desnaturação, ou degradação do agente terapêutico. Por exemplo, a composição pode compreender ainda um produto quimioterapêutico de molécula pequena, um anticorpo monoclonal, ou um agente de imagem (por exemplo, agente de contraste, um açúcar, um complexo de ferro, ou gadolínio (Gd)).

[046]A composição descrita acima, uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam p53 de elefante, ou uma ou mais proteínas p53 de elefante podem ser fornecidas em um kit, isto é, uma combinação empacotada de reagentes em quantidades predeterminadas com instruções para realizar um ensaio diagnóstico ou método terapêutico. O kit pode incluir aditivos, tais como estabilizadores, tampões, e semelhantes, assim como instruções para o uso do kit. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que substancialmente otimizam a sensibilidade do ensaio.

Método de Inibir Câncer

[047]A presente divulgação fornece um método de inibir câncer usando a uma ou mais sequências de ácido nucleico todas codificando uma proteína p53 de elefante descrita aqui, a uma ou mais proteínas p53 de elefante descritas aqui, ou composições compreendendo a uma ou mais sequências de ácido nucleico de proteínas de elefante descritas aqui. O termo “inibir câncer,” como usado aqui, refere-se a prevenir, suprimir, bloquear, ou retardar o crescimento, proliferação e/ou metástase de uma ou mais células cancerosas. Em algumas modalidades, por exemplo, o método descrito aqui pode promover a inibição da proliferação de célula cancerosa, inibição de vascularização de célula cancerosa, erradicação de células cancerosas, e/ou uma redução no tamanho de pelo menos um tumor canceroso, tal que um ser humano é tratado quanto ao câncer.

[048]O método descrito aqui pode ser usado para inibir o crescimento, proliferação, e/ou metástase de qualquer tipo de célula cancerosa conhecido na técnica, tal como, por exemplo, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer esofágico, câncer de vesícula biliar, câncer de cabeça e pescoço (por exemplo, câncer da cavidade oral, faringe, laringe, glândula salivar, e seios paranasais e cavidade nasal), leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, câncer ovariano, câncer pancreático, câncer de próstata, câncer de reto, carcinoma de células renais, câncer de estômago (gástrico), câncer de intestino delgado, e câncer da tireoide. A célula cancerosa pode se originar de um sujeito como definido aqui, que desejavelmente é um mamífero, e preferivelmente é um ser humano (por exemplo, um ser humano compreendendo um câncer). A célula cancerosa também pode se originar de animais não humanos, por exemplo, todos os vertebrados mamíferos e não mamíferos (tais como, mas não limitados a, primatas não humanos, ovelha, cães, gatos, cães, gado, porcos, cavalos, roedores, aves domésticas, anfíbios, e répteis).

[049]Em algumas modalidades, a célula cancerosa pode ser uma população de células cancerosas, tais como, por exemplo, um câncer ou tumor primário, um câncer ou tumor metastático, ou um crescimento renovado do tumor canceroso. Em uma modalidade, a célula cancerosa ou população de células cancerosas compreende um gene TP53 ou proteína defeituoso (por exemplo, mutante), tal como um gene TP53 compreendendo uma supressão, mutação pontual, inserção, substituição, ou reagrupamento genético de um gene TP53 que resulta na expressão de TP53 alterada (por exemplo, sobre- ou sob-expressão), expressão de uma proteína p53 com função anormal, ou anulação da expressão de proteína p53 inteiramente. O gene defeituoso ou gene suprimido pode estar presente em um alelo (heterozigoto alterado), ou dois alelos (homozigoto alterado). A célula cancerosa ou população de células cancerosas podem compreender um gene TP53 ou proteína normais, com outras alterações genômicas por todo o genoma da célula cancerosa.

[050]De acordo com os métodos descrito aqui, a célula cancerosa pode ser ex vivo, in vivo, ou in vitro. “Ex vivo” refere-se a métodos conduzidos dentro de ou sobre células ou tecido em um ambiente artificial fora de um organismo com alteração mínima de condições naturais. Ao contrário, o termo “in vivo” refere-se a um método que é conduzido dentro de organismos vivos em seu estado intacto, normal, enquanto um método “in vitro” é conduzido usando componentes de um organismo que foram isolados de seu contexto biológico usual.

[051]Em modalidades onde os métodos são conduzidos in vitro ou ex vivo, a célula cancerosa pode ser uma linhagem de célula tumoral ou cancerosa. Linhagens de célula tumoral e cancerosa podem ser obtidas comercialmente ou de fontes públicas. Exemplos de fontes comercial ou publicamente disponíveis das quais linhagens de célula tumoral ou cancerosa podem ser adquiridas incluem, mas não são limitados a, the American Type Culture Collection (ATCC), Manassus, Va.; Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH (DSMZ) Braunschweig, Germany; Cell Line Service (CLS), Alemanha; e European Collection of Celullar Cultures (ECACC), Salisbury, Grã-Bretanha.

[052]Em outras modalidades, os métodos descritos aqui são realizados in vivo, isto é, a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam TP53 de elefante, a uma ou mais proteínas p53 de elefante, ou composições destas são administradas diretamente a um animal em necessidade destes, desejavelmente um mamífero (tais como aqueles descritos aqui), e preferivelmente um ser humano sofrendo de câncer. Os métodos descritos aqui são bem adequados para administração in vivo a um mamífero, por exemplo, um ser humano, canino, etc. A uma ou mais sequências de ácido nucleico de elefante, proteínas, ou composição podem ser administradas a um mamífero (por exemplo, um ser humano, canino, etc.) usando técnicas de administração padrão, incluindo administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual, ou por supositório. A composição preferivelmente é adequada para administração parenteral. O termo “parenteral,” como usado aqui, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal, e intraperitoneal. Mais preferivelmente, a composição é administrada a um mamífero usando liberação sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal, ou subcutânea. Em certas modalidades, o efeito de liberação à célula cancerosa de a uma ou mais sequências de ácido nucleico de elefante, proteínas, ou composição descritas aqui é terapêutico, isto é, o efeito cura parcial ou completamente uma doença e/ou sintomas adversos atribuíveis à doença (por exemplo, câncer). Para esta finalidade, o método descrito aqui compreende administrar uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de a uma ou mais sequências de ácido nucleico de elefante, proteínas, ou composição descritas aqui. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter um resultado terapêutico desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade de a uma ou mais sequências de ácido nucleico de elefante, proteínas, ou composição de evocar uma resposta desejada em um indivíduo. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ácido nucleico ou proteína de TP53 de elefante pode ser uma quantidade que aumenta a bioatividade da proteína p53 em um ser humano e/ou realça as vias de sinalização de p53 contra um câncer. Desejavelmente, o efeito terapêutico resulta na morte da célula cancerosa.

[053]Alternativamente, o efeito farmacológico e/ou fisiológico pode ser profilático, isto é, o efeito previne completa ou parcialmente uma doença ou sintoma desta (por exemplo, câncer). Neste respeito, o método descrito aqui compreende administrar uma “quantidade profilaticamente eficaz” de a uma ou mais sequências de ácido nucleico de elefante, proteínas, ou composição descritas aqui. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter um resultado profilático desejado (por exemplo, prevenção do início da doença). Preferivelmente, os resultados profiláticos na prevenção do câncer.

Exemplos

[054]Os exemplos seguintes ilustram ainda mais a invenção mas, certamente, não devem ser interpretados como em qualquer modo limitando seu escopo.

EXEMPLO 1

[055]Este exemplo descreve as taxas de câncer em diferentes espécies de mamífero (incluindo elefantes) para determinar se a massa corporal correlaciona com a incidência do câncer.

[056]Dados de necropsia foram examinados a partir de animais de zoológico para determinar se a incidência do câncer aumenta com o tamanho corporal ou expectativa de vida. Quatorze anos de dados de necropsia coletados pelo San Diego Zoo (Feng et al., PNAS; 104(42): 16633 - 16638 (2007)) foram compilados e a incidência de tumor foi calculada para 36 espécies mamíferas, abrangendo até 6 ordens de magnitude em tamanho e expectativa de vida (American Cancer Society; Cancer Facts & Figures (2015)). Dados da Elephant Encyclopedia (Griner et al., Patolhogy of Zoo Animals; Zoological Society of San Diego (1983)) foram usados para analisar a causa de morte para elefantes africanos (Loxodonta africana) e asiáticos (Elephas maximus) cativos, e para estimar o risco de câncer em incidência por idade e vida global. Usando um modelo de transformação de câncer previamente estabelecido (de Magalhaes et al., J Evol Biol; 22(8): 1770 - 1774 (2009)), a porcentagem de diminuição na taxa de mutação celular foi calculada para responder por um aumento de 100* na massa celular (a diferença entre elefantes e seres humanos) sem desenvolvimento do câncer. Tabela 1

[057]As 36 espécies mamíferas analisadas abrangeram do camundongo listrado do campo (peso de 51 g, expectativa de vida máxima de 4,5 anos) ao elefante (peso de 4800 kg, expectativa de vida máxima de 65 anos). O risco de câncer não aumentou com o tamanho corporal e expectativa de vida máxima do mamífero entre as 36 espécies analisadas (por exemplo, para rato das pedras, 1 % [95 % de CI, 0 % a 5 %]; cão selvagem africano, 8 % [95 % de CI, 0 % a 16 %]; e leão, 2 % [95 % de CI, 0 % a 7 %]) (Figura 1). Nenhuma relação significante foi encontrada com quaisquer combinações de massa, expectativa de vida, e taxa metabólica basal e incidência do câncer. Entre as 644 mortes de elefante anotadas da base de dados da Elephant Encyclopedia, a incidência do câncer no tempo de vida foi descoberta ser 3,11 % (95 % de CI, 1,74 % a 4,47 %) (Tabela 1). Para obter uma estimativa mais conservativa, uma incidência do câncer inferida foi calculada para casos que careceram de detalhes adequados quanto à causa da morte, levando a uma taxa de mortalidade de elefante por câncer estimada de 4,81 % (95 % de CI, 3,14 % a 6,49 %). Com base em um modelo algébrico de carcinogênese (de Magalhaes et al., J Evol Biol; 22(8): 1770 - 1774 (2009)), uma diminuição de 2,17 vezes na taxa de mutação foi calculada como suficiente para proteger os elefantes de desenvolvimento de câncer dada sua massa celular aumentada em 100* comparado com seres humanos. Preferivelmente, a taxa de mortalidade por câncer para elefantes foi descoberta ser menor do que 5 % comparado com uma taxa de mortalidade por câncer para seres humanos de 11 % a 25 % (25).

[058]Os resultados deste exemplo demonstram que animais maiores com expectativas de vida mais longas, incluindo elefantes, podem desenvolver menos câncer, comparado a animais menores.

EXEMPLO 2

[059]Este exemplo descreve uma análise genômica de genes relacionados ao câncer em elefantes.

[060]A análise de sequência genômica foi realizada nas plataformas publicamente disponíveis do genoma de elefante africano na base de dados Ensembl (emissão 72) e na base de dados NCBI GenBank; especificamente, genes relacionados ao câncer (incluindo oncogenes e supressores tumorais) foram examinados. Alinhamentos de sequência de TP53 foram explorados em espécies relacionadas, e retrogenes de TP53 de elefante africano e asiático foram clonados e sequenciados novamente. Sequenciamento capilar foi realizado em elefantes únicos para evitar problemas de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) entre elefantes. Sequenciamento de genoma integral (ILLUMINA® HISEQ 2500® Sequencing System; Illumina Inc., San Diego, CA) foi realizado em DNA recentemente extraído de um elefante africano em 40* cobertura de sequência media, com mais do que 100* cobertura dentro de áreas do gene TP53.

[061]Uma filogenia de probabilidade máxima foi usada para agrupar os clones de retrogene de TP53 sequenciados e para confirmar o número de genes únicos descobertos no genoma do elefante africano. A filogenia levou em conta a visualização de similaridade de retrogene de TP53 entre si assim como sua relação à sequência de TP53 ancestral no elefante e hírax. Os clones de sequenciamento capilar deste estudo são mostrados como círculos e as sequências publicadas do GenBank são mostradas como quadrados. O genoma de esboço LoxAfr3 de elefante africano (L. africana) contém 19 cópias de TP53 (Figura 2). A análise filogênica revela pelo menos 18 agrupamentos distintos de cópias de TP53 processadas. Estes agrupamentos caem em 2 grupos, rotulados como Grupo A e Grupo B. O genoma haploide humano contém 1 cópia de TP53, enquanto Ensembl e GenBank anotam um grande número de parálogos de TP53 no genoma de elefante africano (12 e 20 cópias haploides, respectivamente). Alinhamentos de sequência de elefante revelaram que uma cópia de TP53 com uma estrutura de gene comparável a TP53 foi encontrada em outras espécies mamíferas (cópia ancestral).

[062]As outras 19 cópias careceram de introns verdadeiros, sugerindo que elas se originaram da retrotransposição (retrogenes). O sequenciamento de genoma integral com cobertura profunda confirmou uma cópia ancestral e 19 cópias de retrogene totais, similares às 20 cópias totais anotadas em GenBank para TP53. Onze dos 18 retrogenes do sequenciamento capilar foram similares, mas não idênticos, às anotações do Gen-Bank prévias e dados de sequenciamento de genoma integral locais. A variância alta em cobertura através de cópias de TP53 de referência indicou cópias de TP53 de elefante adicionais que podem não ter sido ainda montadas com êxito.

[063]Não houve nenhuma evidência para 8 das cópias de retrogene publicadas, possivelmente por causa da sub-amostragem de clones, desmontagem no genoma publicado, ou diferenças entre elefantes individuais. Um adicional de 7 sequências clonadas teve suporte de clones múltiplos mas não foi encontrado em nenhuma base de dados. Também é possível que cópias de TP53 no genoma possam ter sido não detectadas pelos iniciadores de reação em cadeia de polimerase (PCR). O DNA do elefante asiático também foi descoberto conter 15 a 20 cópias de retrogenes de TP53 do Grupo A e B.

[064]De modo a estabelecer se elefantes expressam retrogenes de TP53 (EP53r), análise molecular funcional de TP53 e seus retrogenes foi realizada em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de elefantes africanos e asiáticos, e fibroblastos de um elefante africano. O RNA foi isolado de PBMCs e fibroblastos que foram expostos à radiação ionizante de 2 Gy, e transcrição reversa- reação em cadeia de polimerase (RT-PCR) foi realizada. Os iniciadores de PCR foram designados a distinguir os retrogenes de TP53 da sequência ancestral (EP53anc) e variantes de junção. Os produtos e RT-PCR foram observados em 201bp e 185bp em um gel (Figura 3A), os tamanhos esperados para os retrogenes de EP53 do Grupo A e Grupo B, respectivamente, e o sequenciamento de Sanger confirmou duas identidades como retrogenes. Uma imagem de resolução mais alta é mostrada na Figura 3B.

[065]Os resultados deste exemplo sugerem que elefantes têm 19 retrogenes de TP53 (EP53r), que podem ser divididos em dois grupos (Grupo A e Grupo B), e um gene TP53 ancestral (EP53anc).

EXEMPLO 3

[066]Este exemplo demonstra se retrogenes de EP53 de elefante transfectados em linhagens de célula humana podem ser traduzidos em proteínas.

[067]Vetores de expressão de mamíferos foram clonados para produzir proteínas de retrogene de p53 de elefante (EP53r) fundidas a um epítopo a partir da proteína myc. O marcador myc foi usado para imunoprecipitar a proteína traduzida de lisatos celulares, e/ou para sondar quanto à proteína em um western blot. Construções foram desenvolvidas para cinco EP53rs diferentes: retrogene 1, retrogene 5, retrogene 7, retrogene 9, e retrogene 17. Estes retrogenes foram selecionados porque eles representam o espectro de diferentes genes de EP53. Todos os 5 EP53rs foram expressados como proteínas truncadas, comparado ao tamanho natural da proteína EP53, que funciona em torno de 53 kDa (similar a p53 humana).

[068]Células de rim embrionário humano (HEK293), fibroblastos de camundongo (NIH 3T3), e células de osteossarcoma humano (U-2OS) foram transfectadas com um dos plasmídeos de EP53rmarcados com myc (myc-EP53r). os dados das células HEK293 são mostrados, e são representativos dos experimentos realizados nos outros tipos de células. A transfecção com base em lipídeo foi realizada, e as células também foram transfectadas com vetor vazio como um controle negativo. 24 horas depois da transfecção, as células foram colocadas em meios contendo antibióticos para matar seletivamente as células que não expressaram o gene de interesse. Uma vez que a seleção foi completa, doxiciclina foi adicionada para induzir a expressão do gene, que foi confirmada por western blot.

[069]As linhagens de célula cancerosa U-2OS (osteossarcoma) e HCT116 (câncer de cólon) também foram infectadas com vetores lentivirais para gerar linhagens de célula estáveis que expressam proteínas EP53r de elefante. Os plasmídeos usados para fabricar lentivírus foram plasmídeos de expressão de gene induzível por tetraciclina, em que o gene de interesse é apenas expressado quando células são tratadas com doxiciclina. 24 horas depois da transdução viral, as células foram colocadas em meios contendo antibióticos para eliminar as células que não expressaram o gene de interesse. Uma vez que a seleção foi completa, a expressão do gene de interesse foi confirmada por western blot.

[070]P53 é supra-regulado em resposta ao dano ao DNA, de modo a confirmar que as células transfectadas ou transduzidas podem expressar os genes de interesse, as células foram tratadas com MG132 (um inibidor de protease) ou doxorrubicina (intercala com DNA para impedir a biossíntese macromolecular) para induzir dano ao DNA. Para células induzíveis por tetraciclina, as células foram tratadas com doxiciclina por 24 a 48 horas antes do tratamento com MG132 ou doxorrubicina. Depois da indução do dano ao DNA, as células foram colhidas e peletizadas. As pelotas celulares foram congeladas, e depois lisadas no tampão de lise celular contendo inibidores de fosfatase e protease. Os lisatos celulares foram conduzidos em géis proteicos SDS- PAGE, e depois transferidos para membranas de PVDF (western blots). As membranas foram bloqueadas, e depois sondadas com anticorpos primários para determinar os níveis de proteína p53. Os blots foram sondados com anticorpos secundários conjugados a HRP, e os níveis proteicos foram detectados usando um substrato e um quimioluminômetro. GAPDH foi usado como um controle de carga para cada western blot. Os blots também foram sondados para EP53r fosforilado no resíduo de serina-15 (fosfo-EP53r). O dano ao DNA induz a fosforilação de p53, que reduz a interação desta proteína com seu regulador negativo, minuto duplo camundongo 2 (MDM2) (Milczarek et al. Life Sci; 60: 1 - 11 (1997)).

[071]A seguir do tratamento das células transfectadas com 10 μM de MG132 ou 1 μM de doxorrubicina, um aumento na rotulagem de proteína foi observado para todas as cinco EP53rs em células HEK293, assim como um aumento na rotulagem para fosfo-EP53r (Figuras 4A e 4B). Isto sugeriu transferência bem sucedida dos genes às células, e que os genes de EP53rpodem ser traduzidos em proteínas. O aumento em fosfo-EP53r confirmou que MG132 estava impedindo a degradação proteassômica da proteína de elefante. Em seguida foi determinado se as EP53rs podem interagir com o regulador negativo, MDM2. Para determinar se as EP53rs podem se ligar a MDM2, células HEK293 foram transfectadas com EP53r9, e submetidas à radiação ionizante de 6 Gy para induzir dano ao DNA. A proteína EP53r9 expressada depois foi imunoprecipitada com um anticorpo ao marcador myc, e conduzida em um western blot. Immunoblots mostraram que a radiação ionizante de 6 Gy aumentou a expressão e fosforilação de EP53r9, indicativo de estabilização de proteína durante o dano ao DNA, e adicionalmente que MDM2 co-imunoprecipitou com myc-EP53r9, indicando que as duas proteínas interagem (Figura 4C).

[072]Os resultados deste exemplo demonstram que myc-EP53rs pode ser transfectada em células e gerar proteína em resposta ao dano ao DNA, e interagir com MDM2.

EXEMPLO 4

[073]Este exemplo descreve a resposta celular ao dano ao DNA em linfócitos do sangue periférico de elefantes e seres humanos.

[074]Experimentos foram realizados em linfócitos do sangue periférico (PBLs) de três grupos de sujeitos: Elefantes africanos e asiáticos, um coorte clínico representativo de pacientes com Síndrome de Li-Fraumeni (LFS) registrado no Cancer Genetics Study na University of Utah, e controles humanos em conformidade de idade sem um histórico familiar significante de câncer (também registrado no Cancer Genetics Study). Pacientes com LFS foram selecionados quanto à inclusão como uma amostra representativa com base em seu estado de mutação de TP53, histórico de câncer variado, e disponibilidade para retiradas de sangue. Experimentos laboratoriais de seguimento também foram realizados em fibroblastos de elefante africano, fibroblastos humanos, e células HEK293 para confirmar os resultados.

[075]Radiação ionizante (0,5, 2, 5, 6, 10, e 20 Gy) ou doxorrubicina (0,005 a 30 μM) foram usadas para induzir o dano ao DNA nos PBLs primários cultivados, que depois foram avaliados quanto a sinais de apoptose, eficiência do reparo do DNA, e parada do ciclo celular. Apoptose foi avaliada medindo-se o número de células que mancharam para Anexina V (AV) e iodeto de propídio (PI); células foram categorizados como estando em apoptose tardia se elas foram AV+ PI+, e em apoptose precoce se elas foram AV+ PI-. Apoptose foi também medida usando APO- TOX GLO™ (Promega, Madison, WI) ou Ensaio CASPASE-GLO® 3/7 (Promega) e CELLTITER-GLO® (Promega). Os resultados foram normalizados para viabilidade celular usando contagens do ensaio MULTI-TOX-FLUOR™ (Promega) incluído com APO-TOX GLO™, ou usando CELLTITER-GLO® quando a atividade da caspase foi medida. Diferenças estatisticamente significantes em apoptose foram calculadas em GRAPHPAD PRISMA®.

[076]A seguir da radiação ionizante de 2 Gy e 6 Gy, PBLs elefante africano exibiram apoptose em taxas significantemente elevadas, comparado com PBLs humanos, depois de 18 horas (apoptose tardia: 33,20 % comparado a 14,07 %, respectivamente; P < ,001 (Figura 5A); apoptose precoce: 21,07 % comparado a 11,73 %, respectivamente; P < ,001(Figura 5B)). Linfócitos de elefante africano também exibiram um aumento significante em apoptose tardia (Figura 6A) e precoce (Figura 6B) em 18 e 24 horas quando expostos a 5 μM de doxorrubicina.

[077]Linfócitos do sangue periférico de indivíduos com LFS (n = 10), controles saudáveis (n = 10), e 1 elefante africano, tratados com 2 Gy de radiação ionizante revelaram níveis diferentes de apoptose (apoptose calculada subtraindo-se a porcentagem de células AV+PI+ tratadas com radiação ionizante de 2 Gy, da porcentagem de células AV+PI+ cultivadas sem tratamento). Células de pacientes com LFS sofreram significantemente menos apoptose comparadas com PBLs humanos saudáveis (2,71 % em relação a 7,17 %; P < ,001) e PBLs de elefante (14,64 %; P < ,001) (Figura 7).

[078]Similar a linfócitos, uma taxa mais alta de apoptose (como uma métrica de clivagem de caspase aumentada 3/7) também foi observada em fibroblastos de elefante (Figura 8) submetidos a dano ao DNA por 10 μM e 30 μM de doxorrubicina (elefante: 9,1 vezes de aumento; ser humano: 2,24 vezes de aumento; P < ,001). As células de fibroblastos de elefante adicionalmente mostraram viabilidade reduzida compatível com a parada do ciclo celular depois de 0,5 Gy de radiação ionizante (elefante: 80,81 % comparado a ser humano: 95,87 %; P = ,01).

[079]P53 desempenha um papel crítico em indução de proteína p21 e MDM2 a seguir de dano ao DNA (Macleod et al, Genes Dev; 9(8): 935 - 944 (1995); Yoon et al. PNAS; 99(24): 15632 - 15637 (2002)), de modo que a expressão de p21 fosse avaliada em immunoblots para validar que a resposta do dano ao DNA em células de elefante à radiação foi dependente de P53. Tanto PBLs de elefante quanto humanos mostraram um aumento na expressão de proteína p53 e p21 a seguir da exposição à radiação ionizante (Figura 9). Mais expressão de proteína p21 foi observada em 5 horas em PBLs de elefante tratadas com 0,5 Gy de radiação ionizante comparado com PBLs humanos (20,1 vezes de aumento em relação a 3,5 vezes de aumento; P = ,004). Fibroblastos de elefante também mostraram expressão de proteína p21 aumentada a seguir de 2 Gy de radiação ionizante em 5 horas (1,9 vezes de aumento) comparado com nenhum aumento em fibroblastos humanos.

[080]Como uma análise post hoc, os mesmos experimentos foram repetidos em PBLs a partir de elefantes asiáticos múltiplos (n = 6) de diferentes idades (2, 12, 17, 38, 57, e 69 anos). Linfócitos de elefante asiático também demonstraram uma taxa aumentada de apoptose (50,63 % em relação a células humanas 23,67 %; P < ,001) quando expostos a 2 Gy de radiação ionizante (Figura 10A) e um aumento na expressão de p21 (Figura 10B). Adicionalmente, a resposta apoptótica em PBLs diminuiu com a idade de elefantes asiáticos quando testada tanto com uma regressão linear quanto com um teste de Jonckheere-Terpstra, que leva em consideração relações não lineares (Figura 10C) (elefante de 2 anos com 2 Gy de radiação em 18 horas, 52,53 % [95 % de CI, 35,86 % a 69,2 %] e elefante de 69 anos, 40,03 % [95 % de CI, 30,64 % a 49,43 %]; P = ,002 por regressão linear; P < ,001 por teste de Jonckheere-Terpstra).

[081]Células HEK293 expressam proteínas de adenovírus que naturalmente inibem a função de p53; entretanto a linhagem de célula de fibroblasto de camundongo, NIH3T3, expressa um gene funcional TP53. Portanto, estudos adicionais foram conduzidos em células NIH3T3 para testar o efeito sobre a sobrevivência celular da expressão de EP53r5e EP53r9em células que também expressam TP53 do tipo selvagem funcional. Células NIH3T3 foram transfectadas com EP53r 5 ou EP53r9e depois tratadas com doxorrubicina para induzir dano ao DNA. Como mostrado na Figura 11, um aumento significante na atividade de caspase das células NIH 3T3 transfectadas com EP53r 5 (Fig. 11A) e EP53r9(Fig. 11B) foi observado em relação a células de controle, sugerindo que a expressão de EP53r5 e EP53r9 aumenta a apoptose em células que já expressam TP53 funcional. Tabela 2

[082]A eficiência do reparo de DNA foi avaliada em seguida determinando-se o número de focos rotulados com fosfo-histona H2AX (pH2AX), um indicador de rupturas de filamento duplo no DNA. As células foram cultivadas por 1, 5, 10, 18, 24, e 72 horas depois da indução de dano ao DNA por radiação ionizante de 2 Gy, e depois avaliadas. Linfócitos sofrem apoptose dependente de p53 em resposta ao dano ao DNA (Heinrichs et al. Oncogene; 22(4): 555 - 571 (2003); Lowe et al. Cell; 74(6): 957 - 967 (1993)), enquanto fibroblastos sofrem tanto apoptose dependente de p53 quanto parada do ciclo celular (Antoccia et al. J Radiat Res; 50(5): 457 - 468 (2009); Kastan et al. Cell; 71(4): 587 - 597 (1992); Attardi et al. Oncogene; 23(4): 973 - 980 (2004)); ambos os tipos de células de elefante foram testados consequentemente.

[083]Radiação ionizante não causou uma diferença significante na porcentagem de células com focos de pH2AX rotulados em PBLs humanos e de elefante, indicando que a apoptose aumentada em elefantes não pode ser atribuída a mais dano ao DNA (Tabela 2). Células foram arquivadas pelo número de focos de pH2AX (0 a 5, 6 a 10, 11 a 15, 16 a 20+), e não demonstraram nenhuma diferença significante na taxa de reparo de dano ao DNA entre seres humanos e elefantes.

Tabela 3

[084]Para identificar mudanças na expressão do gene em células de elefante em resposta ao dano ao DNA, linfócitos do sangue periférico de elefante foram tratados com radiação ionizante de 2 Gy. Células irradiadas e não tratadas foram cultivadas a 37 °C por 5 horas. RNA foi extraído das células e tratados com DNase para remover o DNA genômico. Sequenciamento de RNA foi realizado, e os 20 genes mais supra-regulados de topo em células de elefante depois da exposição à radiação foram compilados. Na tabela 3, os genes destacados em cinza são alvos ou reguladores conhecidos de p53 em células humanas. Estes resultados sugerem que o dano ao DNA induz as vias de sinalização dependentes de p53 em células de elefante, similar às vias de sinalização de p53 induzidas por dano ao DNA em células humanas.

[085]Os resultados deste exemplo demonstram que as células de elefante executam níveis mais altos de apoptose em resposta ao dano ao DNA, e que quando proteínas EP53 são transduzidas em células humanas, estas células são capazes de executar níveis mais altos de apoptose em resposta ao dano ao DNA.

EXEMPLO 5

[086]Este exemplo avalia se a expressão de EP53 pode aumentar a apoptose da linhagem de câncer humano, U-2OS (osteossarcoma) transfectado com vários genes de EP53.

[087]Células U-2OS foram transfectadas com EP53r5ou EP53 ancestral (EP53anc), e depois tratadas com doxiciclina para induzir a expressão de EP53r. As células depois foram tratadas com doxorrubicina para danificar o DNA. Como mostrado na Figura 12A, um aumento significante na atividade da caspase foi observado na linhagem de célula trasduzida por EP53r5 comparado às células de controle com um vetor vazio, sugerindo que a expressão de EP53r5 aumenta a apoptose de células cancerosas que também expressam TP53 funcional.

[088]Células U-2OS também foram transduzidas com EP53anc. Estas células depois foram induzidas para expressar EP53anc, e tratadas com doxorrubicina para ativar o dano ao DNA. Como mostrado na Figura 12B, células induzidas para expressar EP53anc tiveram um aumento de 20 vezes na atividade da caspase, comparado a células transduzidas com um vetor vazio. Estas células exibiram mais fosfor-EP53anc, como foi um aumento nos genes alvos de p53, p21 e MDM2 (Figura 12C). Células que expressaram EP53anctambém expressaram menos p53 humana endógena. Mesmo na ausência de tratamento com doxorrubicina, células U-2OS que expressam EP53anc sofreram apoptose significante comparadas às células que foram transduzidas com vetor vazio.

[089]Experimentos adicionais foram conduzidos em que células U-2OS foram transfectadas com EP53r9 marcada com GFP (GFP-EP53r9). Depois de 24, 48, ou 72 horas pós-transfecção, as células foram colhidas e os lisatos celulares integrais foram processados para western blotting. Os blots foram sondados para fosfo-EP53r9, assim como fosfor-p53 humano endógeno. Foi descoberto que além da expressão aumentada de EP53R9, as células U-2OS exibiram restauração da resposta de p53 do tipo selvagem, que induziu apoptose destas células (Figura 13).

[090]Células U-2OS também foram transfectadas com EP53anc e TP53 humana, e a viabilidade celular depois da indução com doxiciclina foi observada depois de 72 horas. Foi descoberto que em células transfectadas com p53 de elefante, a viabilidade celular caiu para 35,6 % (SEM 1,85), ao passo que células transduzidas com p53 humana apenas caiu para 46,1 % (SEM 1,12) de viabilidade celular, sugerindo que p53 de elefante é capaz de matar mais células humanas cancerosas do que p53 humana sozinha. As células U-2OS transfectadas com EP53anctambém observaram um aumento na atividade de caspase (14,22 %, SEM 0,23) em relação a células transfectadas com p53 humana (10,89 %, SEM 0,12), compatível com um aumento na atividade apoptótica a seguir da indução de proteínas p53 de elefante.

[091]Para examinar o efeito da expressão de EP53r9 sobre a senescência celular de células de câncer de cólon humano, células cancerosas HCT116 foram transduzidas com um vetor induzível por tetraciclina que codifica EP53r9. A expressão de proteína depois foi induzida com doxiciclina, e células depois foram tratadas com doxorrubicina para danificar o DNA. Células HCT116-EP53r9 exibiram significantemente mais atividade de caspase comparadas às células de controle (Fig. 14A). Western blots foram realizados para confirmar a expressão de EP53r9 nestas células (Fig. 14B). Foi descoberto que células tratadas com concentrações crescentes de doxiciclina expressaram mais p53 fosforilada humana endógena (Ser15) comparadas às células que não expressaram EP53r9. As células foram transduzidas com EP53r9 marcada com marcador, e um anticorpo para marcador foi usado para verificar a expressão de EP53r9. Células foram tratadas com 5-FU para ativar a via de p53. Estes resultados sugerem que EP53r9 aumentou a apoptose aumentando-se a quantidade de p53 endógena ativada nestas células.

[092]Os resultados deste exemplo demonstram que a indução de EP53 em linhagens de célula cancerosa causa um aumento significante na apoptose.

[093]Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente, e patentes, citados aqui são por meio deste incorporados por referência do mesmo modo como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada como sendo incorporada por referência e fosse apresentada em sua totalidade aqui.

[094]O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “a” e “pelo menos um” e referentes similares no contexto de descrever a invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) deve ser interpretado como abrangendo tanto o singular quanto o plural, a menos que de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. O uso do termo “pelo menos um” seguido por uma lista de um ou mais itens (por exemplo, “pelo menos um de a e B”) deve ser interpretado para significar um item selecionado dos itens listados (A ou B) ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens listados (A e B), a menos que de outro modo indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “compreendendo,” “tendo,” “incluindo,” e “contendo” devem ser interpretados como termos ilimitados (isto é, significando “incluindo, mas não limitado a,”) a menos que de outro modo observado. O relato de faixas de valores aqui são meramente intencionadas a servir como um método estenográfico de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, a menos que de outro modo indicado aqui, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se ele fosse individualmente relatado aqui. Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “tal como”) fornecidos aqui, é intencionado meramente para esclarecer melhor a invenção e não apresenta uma limitação sobre o escopo da invenção a menos que de outro modo reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[095]Modalidades preferidas desta invenção são descritas aqui, incluindo o melhor modo conhecido aos inventores para realizar a invenção. Variações destas modalidades preferidas podem tornar-se evidentes àqueles de habilidade comum na técnica durante a leitura da descrição precedente. Os inventores esperam que técnicos habilitados utilizem tais variações conforme apropriado, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outro modo que não como especificamente descrito aqui. Consequentemente, esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto relatado nas reivindicações anexas a este como permitido por lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as variações possíveis destes é abrangida pela invenção a menos que de outro modo indicado aqui ou de outro modo claramente contradito pelo contexto.

Claims (45)

1. Uso de (a) uma ou mais sequências de ácido nucleico cada uma codificando uma proteína p53 de elefante selecionada a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, ou combinações das mesmas, ou (b) uma ou mais proteínas p53 de elefante tendo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, ou combinações das mesmas, o uso CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de uma composição para inibir câncer.

2. Uso, de acordo com a reinvindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o uso compreende colocar em contato uma célula cancerosa com uma ou mais das sequências de ácido nucleico que codifica uma proteína p53 de elefante.

3. Uso, de acordo com a reinvindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína p53 de elefante é codificada por um retrogene.

4. Uso, de acordo com a reinvindicação 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína p53 de elefante é um gene ancestral.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o uso compreende colocar em contato uma célula cancerosa com múltiplas sequências de ácido nucleico diferentes, cada uma codificando uma proteína p53 de elefante.

6. Uso, de acordo com a reinvindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas sequências de ácido nucleico diferentes compreendem múltiplos retrogenes diferentes.

7. Uso, de acordo com a reinvindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das múltiplas sequências de ácido nucleico é um gene ancestral.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais sequências de ácido nucleico compreende RNA ou DNA.

9. Uso, de acordo com a reinvindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o uso compreende colocar em contato uma célula cancerosa com uma ou mais proteínas p53 de elefante.

10. Uso, de acordo com a reinvindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o uso compreende colocar em contato uma célula cancerosa com uma proteína p53 de elefante.

11. Uso, de acordo com a reinvindicação 9 ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína p53 de elefante é codificada por um retrogene.

12. Uso, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 9 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína p53 de elefante é codificada por um gene ancestral.

13. Uso, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 9 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o uso compreende colocar em contato a célula cancerosa com múltiplas proteínas p53 de elefante diferentes.

14. Uso, de acordo com a reinvindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas proteínas p53 de elefante diferentes são codificadas por múltiplos retrogenes diferentes.

15. Uso, de acordo com a reinvindicação 13 ou 14, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das múltiplas proteínas p53 de elefante diferentes é uma proteína p53 ancestral.

16. Uso, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou a uma ou mais proteínas p53 de elefante estão na forma de uma composição que compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

17. Uso, de acordo com a reinvindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende um lipossoma.

18. Uso, de acordo com a reinvindicação 16 ou 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou uma ou mais proteínas p53 são encapsuladas dentro do lipossoma.

19. Uso, de acordo com a reinvindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende uma nanopartícula.

20. Uso, de acordo com a reinvindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a nanopartícula compreende uma ou mais cargas selecionadas a partir do grupo que consiste em uma substância orgânica, uma substância inorgânica, um lipídeo, um polímero, um metal e uma nanoestrutura de carbono.

21. Uso, de acordo com a reinvindicação 19 ou 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a nanopartícula compreende a proteína p53 de elefante ou ácido nucleico de TP53 de elefante encapsulado dentro de um lipossoma.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 19 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a nanopartícula compreende uma superfície externa decorada com uma porção para reduzir uma interação com o sistema reticuloendotelial.

23. Uso, de acordo com a reinvindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção compreende polietilenoglicol.

24. Uso, de acordo com a reinvindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção compreende uma porção de direcionamento.

25. Uso, de acordo com a reinvindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de direcionamento aumenta a afinidade da nanopartícula para a célula cancerosa.

26. Uso, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 16 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende ainda um ou mais quimioterapêuticos de molécula pequena, anticorpos monoclonais ou agentes de imagem.

27. Uso, de acordo com a reinvindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de imagem compreende um agente de contraste, um açúcar, um complexo de ferro, ou gadolínio (Gd).

28. Uso, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 1 a 27, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula cancerosa está in vitro ou in vivo.

29. Uso, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 1 a 28, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula cancerosa é derivada de um mamífero.

30. Uso, de acordo com a reinvindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um ser humano.

31. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende (a) uma ou mais sequências de ácido nucleico cada uma codificando uma proteína p53 de elefante selecionada a partir da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 20, ou combinações das mesmas, ou (b) uma ou mais proteínas p53 de elefante tendo uma sequência selecionada a partir da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 21, ou combinações das mesmas; e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis selecionados a partir de soluções isotônicas estéreis, antioxidantes, tampões, bacteriostáticos, conservantes, lactose, manitol, amido de milho, amido de batata, celulose microcristalina, acácia, gelatina, dióxido de silício coloidal, croscarmelose de sódio, talco, estearato de magnésio, ácido esteárico, corantes, diluentes, agentes tamponantes, agentes umectantes, agentes flavorizantes, propelentes pressurizados ou combinações dos mesmos.

32. Composição, de acordo com a reinvindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico cada uma codificando uma proteína p53 de elefante.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, CARACTERIZADA pelo fato de que a uma ou mais sequências de ácido nucleico compreende RNA ou DNA.

34. Composição, de acordo com a reinvindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende uma ou mais proteínas p53 de elefante.

35. Composição, de acordo com a reinvindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende ainda um lipossoma.

36. Composição, de acordo com a reinvindicação 35, CARACTERIZADA pelo fato de que a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou uma ou mais proteínas p53 são encapsuladas dentro do lipossoma.

37. Composição, de acordo com a reinvindicação 31, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende ainda uma nanopartícula.

38. Composição, de acordo com a reinvindicação 37, CARACTERIZADA pelo fato de que a nanopartícula compreende uma ou mais cargas selecionados a partir do grupo que consiste em uma substância orgânica, uma substância inorgânica, um lipídeo, um polímero, um metal e uma nanoestrutura de carbono.

39. Composição, de acordo com a reinvindicação 37 ou 38, CARACTERIZADA pelo fato de que a uma ou mais sequências de ácido nucleico ou uma ou mais proteínas p53 são encapsuladas dentro de um lipossoma.

40. Composição, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 37 a 39, CARACTERIZADA pelo fato de que a nanopartícula compreende uma superfície externa compreendendo uma porção para reduzir uma interação com o sistema reticuloendotelial.

41. Composição, de acordo com a reinvindicação 40, CARACTERIZADA pelo fato de que a porção compreende polietilenoglicol.

42. Composição, de acordo com a reinvindicação 41, CARACTERIZADA pelo fato de que a porção compreende uma porção de direcionamento.

43. Composição, de acordo com a reinvindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a porção de direcionamento aumenta a afinidade da nanopartícula para a célula cancerosa.

44. Composição, de acordo com qualquer uma das reinvindicações 31 a 43, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição compreende ainda um ou mais quimioterapêuticos de molécula pequena, anticorpos monoclonais e agentes de imagem.

45. Composição, de acordo com a reinvindicação 44, CARACTERIZADA pelo fato de que o agente de imagem compreende um agente de contraste, um açúcar, um complexo de ferro, ou gadolínio (Gd).

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