WO2017209577A1 - 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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WO2017209577A1
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corneal dystrophy
tgfbi
type
corneal
pharmaceutical composition
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PCT/KR2017/005823
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김응권
최승일
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연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dysfunction, and more particularly to a pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dysfunction in TGFBI gene.
  • Corneal dystrophy due to transforming growth factor ⁇ -induced (TGFBI) aberrant protein is commonly referred to as a disorder in which the cloud appears in the cornea due to abnormal TGFBI genes and is accompanied by vision loss due to cloudiness. Corneal dystrophy due to TGFBI abnormal protein is worsening with age, and the number of severe symptoms is increasing rapidly.
  • TGFBI transforming growth factor ⁇ -induced
  • type 2 granular corneal dystrophy (GCD2; Avellino corneal dystrophy) has a prevalence of 870 persons per Korean, and therefore, there is an urgent need for the development of a medicament capable of treating corneal dystrophy due to TGFBI abnormal protein.
  • TGFBI aberrant protein Corneal dystrophy due to TGFBI aberrant protein has not been treated properly except to transplant a normal cornea to date. However, even after transplantation, TGFBI abnormal proteins may accumulate in the cornea over time, causing symptoms to worsen. Difficulties include the cost of repeated corneal grafts and severe shortages of the cornea for transplantation. Thus, the development of fundamental therapies is required.
  • the inventors of the present invention have revealed mechanisms related to expression, aggregation, and fusion of TGFBI protein using corneal cells of patients with corneal dystrophy due to TGFBI aberrant protein, and prevented the formation and deposition of aberrant proteins that cause diseases.
  • TGFBI protein a protein that causes corneal dystrophy due to TGFBI aberrant protein, causes ER stress and induces apoptosis, and this ER stress may exacerbate TGFBI gene mutations.
  • the role of the pharmaceutical composition for the treatment of corneal dystrophy according to an embodiment of the present invention is to inhibit TGFBI protein expression and to remove TGFBI protein.
  • TGFBI The study of the function of TGFBI can be divided into the part related to cancer and the part related to the corneal dystrophy, but the function of the TGFBI is more revealed in the cancer related study compared to the function of TGFBI related to the corneal dystrophy.
  • TGFBI expression is closely related to phenomena such as cell adhesion, cell migration, and cancer metastasis by regulating downstream signaling systems through various integrin-like receptors located on the cell membrane.
  • the clear intracellular function of TGFBI is not yet known.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of corneal dystrophy, in particular TGFBI gene mutation keratosis.
  • Another object of the present invention is to reduce the endoplasmic reticulum (ER) stress, reduce the activity of the unfolded protein response (UPR), and to reduce the TGFBI abnormal protein through the ER-associated degradation (ERAD) pathway It provides a therapeutic agent for corneal dystrophy that can be used to treat corneal dystrophy caused by TGFBI abnormal protein.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy containing 4-phenylbutyric acid (4-PBA) as an active ingredient.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays corneal dystrophy symptoms by administering the prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention to a subject.
  • treatment refers to any action to improve or benefit from corneal dystrophy by administering the prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention to a subject.
  • the inventors of the present invention have found that 4-phenylbutyric acid inhibits mutant transforming growth factor ⁇ -induced (TGFBI) proteins.
  • keratopathy refers to a disease in which abnormalities appear on the cornea and the symptoms are aggravated, and all symptoms are accompanied by deterioration of vision. It means any condition that needs to be prevented.
  • turbidity such as white spots, appears on the surface of the cornea, which increases with age, and the diagnosis is based on the findings of the physical examination and corresponding genetic abnormalities.
  • turbidity appearing on the corneal surface may be due to condensation and accumulation of abnormal proteins, which are the causative agents, and degradation of decomposition.
  • the maintenance of transparency is essential for the function of the cornea, and the extracellular matrix and irregular collagen increased during wound healing not only inhibit the transparency of the cornea but also TGFBI, which is known to be produced in this process. Protein has been shown to be a critical cause of clinical exacerbation of corneal dystrophy due to TGFBI aberrant protein.
  • the term "keratopathy caused by abnormal TGFBI protein” indicates a disease in which corneal abnormalities appear on the cornea due to an abnormal TGFBI gene, a symptom is intensified, and is accompanied by a decrease in visual acuity. Corneal dystrophy If corneal dystrophy is a corneal dystrophy due to a TGFBI gene mutation, the specific type or symptom of the symptom is not particularly limited.
  • the corneal dystrophy due to the TGFBI aberrant protein of the present invention is a type 1 granular corneal dystrophy (ranular corneal dystrophy type 1), type 2 granular corneal dystrophy (Avellino corneal dystrophy), type 1 lattice corneal dystrophy (lattice corneal dystrophy type 1), lattice corneal dystrophy type 3; Reis-Buchler corneal dystrophy (RCD), and Thiel-Behnke corneal dystrophy (TBCD), all of which are autosomal dominant and are caused by genetic mutations of the 5q31 chromosome TGFBI protein.
  • the corneal dystrophy may be a type 2 granular corneal dystrophy.
  • Variation of Type 2 Granular Keratopathy TGFBI protein or TGFBI aberrant protein is expressed from the TGFBI gene with a point mutation in R124H of the TGFBI gene.
  • compositions herein have been found to have a particularly good effect in improving the symptoms of type 2 granular corneal dystrophy.
  • Inhibition of the entire TGFBI gene using siRNA or anti-TGFBI protein antibodies can modulate TGFBI expression in the cornea, but it will cause serious side effects when considering the range of action of the TGFBI gene in the center of numerous biomechanisms. It was predicted.
  • ER endoplasmic reticulum
  • Physiological or pathological conditions can interfere with endoplasmic reticulum homeostasis, which can lead to the accumulation of unfolded or misfolded proteins. This accumulation is also known as ER stress.
  • ER stress activates the unfolded protein response (UPR) to reduce this stress and restore homeostasis.
  • UPR unfolded protein response
  • This adaptive response leads to reduced transcription and elimination of misfolded proteins through ER-associated degradation and ER chaperone transcription upregulation to aid protein folding.
  • ERAD is very closely linked to ER stress and removes folds of proteins from endoplasmic reticulum.
  • the target protein of ERAD is selected by the quality control system in the ER lumen and degraded by the cytoplasmic ubiquitin-proteasome system.
  • the corneal dystrophy of the present invention will be described by way of example for type 2 granular corneal dystrophy (GCD2), but is not limited in connection with the corneal dystrophy associated with TGFBI protein. That is, the corneal dysfunction in the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy of the present invention includes all of the corneal dysplasias associated with TGFBI protein or mutations or abnormalities of different or different positions of the point mutations in GCD2.
  • GCD2 type 2 granular corneal dystrophy
  • GCD2 is an autosomal dominant disease caused by substitution of histidine with arginine at the 124 codon (R124H) in the gene of TGFBI protein.
  • GCD2 is characterized by a decrease in corneal clarity following accumulation of mutant-TGFBI proteins in corneal epithelium and stroma. Oxidative stress, altered mitochondrial function, defective autophagy and TGFBI protein accumulation, and delayed TGFBI protein secretion are known to be associated with the development of GCD2.
  • the inventors of the present invention noted the role of GCD2 in eliminating ER stress and mutant mutant TGFBI protein as a mechanism of development of GCD2. And it was found that 4-phenylbutyric acid can reduce ER stress and cell death by reversing the false folding of proteins associated with disease in the endoplasmic reticulum of the cornea.
  • UPR may be a major adaptive response to restore ER homeostasis, and GCD2 corneal fibroblasts activate the UPR pathway in response to ER stress. Sustained UPR increases XBP1 and CHOP in GCD2 corneal fibroblasts and induces apoptosis.
  • 4-phenylbutyric acid is a low molecular weight fatty acid and has a saffron-like activity. 4-phenylbutyric acid reduces ER stress and decreases UPR activation. In addition, 4-phenylbutyric acid reduces the level of TGFBI abnormal protein in GCD2 corneal fibroblasts. 4-phenylbutyric acid induces TGFBI proteolysis via mechanisms associated with TGFBI proteolysis, such as the ERAD pathway, and reduces TGFBI protein levels. Furthermore, 4-phenylbutyric acid prevents GCD2 cell death due to ER stress. 4-phenylbutyric acid is stable and exhibits high permeability in the eye.
  • An effective amount of the 4-phenylbutyric acid of the present invention is not particularly limited, and may be included in 0.00001 to 10% by weight or as a total content based on the total weight of the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy according to one embodiment of the present invention may further include appropriate carriers, excipients, and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions. .
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy according to an embodiment of the present invention, respectively, in the form of eye drops, ointments, or powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. according to a conventional method.
  • compositions include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol Starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate And mineral oils, but are not limited thereto. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a humectant, a disintegrant, and a surfactant that is commonly used may be prepared. .
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy according to an embodiment of the present invention may be prepared preferably by eye drops or eye ointments.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy according to an embodiment of the present invention may be an eye drop using a colloidal dosage form.
  • the advantage of the colloidal formulation is that it can control drug release at the target site upon drug delivery to the eye and can also overcome the permeation barrier associated with epithelial barrier and outflow. Colloidal formulations can also contribute to the stabilization of unstable drugs.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy according to an embodiment of the present invention may be used as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the preparation for parenteral administration includes a sterile aqueous solution, a non-aqueous solvent, a suspension, an emulsion, and lyophilization. Formulations, external preparations, and the like may be included.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • Pharmaceutically effective amount, effective dosage of the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy may be varied by the method of formulating the pharmaceutical composition, mode of administration, administration time and / or route of administration, and the like.
  • the type and extent of the reaction to be achieved by the administration of the pharmaceutical composition, the type of subject to be administered, the age, weight, general state of health, the condition or extent of the disease, sex, diet, excretion, simultaneous or It can be varied according to various factors and similar factors well known in the medical field, including the components of the drug and other compositions used together in this case, and those skilled in the art can facilitate the effective dosage for the desired treatment. You can decide and prescribe.
  • Administration of the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy in accordance with an embodiment of the present invention may be administered once a day, may be divided into several times. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • the route of administration and mode of administration of the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy according to one embodiment of the present invention may be independent of each other, and the method is not particularly limited, and the pharmaceutical composition reaches the desired site. As far as possible, any route of administration and mode of administration may be followed.
  • the pharmaceutical composition may be administered by oral or parenteral administration, and preferably by parenteral administration.
  • the parenteral administration method includes, but is not limited to, for example, a method of directly administering to the eye.
  • mutant TGFBI protein inhibitor means a substance that acts to inhibit the accumulation of variant TGFBI protein in the cornea. 4-phenylbutyric acid of the present invention was found to reduce the level of mutant TGFBI protein.
  • mammals means all animals, including mammals, including rats, domestic animals, humans, and the like.
  • a method for improving corneal dystrophy comprises administering the pharmaceutical composition to an individual except a human.
  • the present invention provides a composition containing 4-phenylbutyric acid as an active ingredient, and exhibits the effect of preventing or treating corneal dystrophy, particularly TGFBI gene mutation keratosis.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating corneal dystrophy exhibits an effect of reducing ER stress, decreasing the activity of UPR, and reducing TGFBI abnormal protein through the ERAD pathway. It can be used to treat corneal dysfunction by.
  • Figure 3 is an experimental result showing a decrease in TGFBI protein with time when the composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is an experimental result showing that there is no effect on the level of TGFBI mRNA when treating the composition according to an embodiment of the present invention.
  • 6A is an experimental result for confirming cell death induced by ER stress when treating a composition according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6b is an experimental result showing that when treating the composition according to an embodiment of the present invention, to prevent cell death induced by ER stress.
  • Figure 7 is an experimental result showing that there is no cytotoxicity in the fibroblasts of the cornea when the composition according to an embodiment of the present invention.
  • the corneal dysfunction of the present invention will be described by way of example, but not limited to type 2 granular corneal dystrophy (GCD2), the improvement of corneal dysfunction according to various embodiments of the present invention by reducing the TGFBI abnormal protein As long as corneal dystrophy is improved, it can be applied to various corneal dystrophy.
  • GCD2 type 2 granular corneal dystrophy
  • the following experiments used human corneal fibroblasts of wildtype (WT) and primary GCD2 homozygous variants (homozygous: HO).
  • Primary corneal fibroblasts and cell lines were treated with 10% fetal bovine serum (Gibco, Gaithersburg, MD, USA), 100 IU / ml penning and 100 ⁇ g / in 37 ° C 5% CO 2 incubator.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's media; Corning, Cambridge, MA, USA
  • ml streptomycin was maintained.
  • RIPA radioimmunoprecipitation assay
  • RIPA protease inhibitory tablet
  • RIPA 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4
  • From primary corneal fibroblasts Western blots were performed and the intensity and optical density of the scanned immunoreactive protein bands were quantified using ImageJ version 1.37 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), normalized to the ⁇ -actin band and background removed was corrected.
  • Adaptive UPR improves cell survival, but chronic UPR activation triggers cell death, particularly in GCD2 corneal fibroblasts.
  • Cell death pathway activation can be caused by ER stress.
  • GCD2 corneal fibroblasts were stimulated by tunicamycin and induced ER stress, cell death in GCD2 increased about 20-fold compared to wild-type cells.
  • Inositol-requiring enzyme 1 ⁇ (IRE1 ⁇ ) is a major ER stress kinase
  • XBP1 X box-binding protein 1
  • BiP, IRE1 ⁇ , and XBP1 are persistent and major upregulated by tunicamycin (FIG. 1A). This induction is greater in HO cells than in WT cells.
  • 4-PBA treatment greatly reduces BiP induction by tunicamycin ((a) and (b) of FIG. 1).
  • IRE1 ⁇ and XBP1 of HO cells are also greatly reduced when treated with 10 mM 4-PBA ((a), (c) and (d) of FIG. 1). Furthermore, tunicamycin-mediated IRE1 ⁇ and XBP1 regulation is markedly inhibited by 4-PBA treatment in HO cells ((a), (c) and (d) of FIG. 1).
  • TGFBI protein levels analyzed by Western blot were significantly reduced in both WT and HO cells by treatment with 5, 10, or 20 mM 4-PBA for 24 hours (FIGS. 2A and 2B).
  • 20 mM 4-PBA treated cells decreased TGFBI protein about 40% after 4 hours and continued to decrease until 24 hours ( Figure 3).
  • experiments were also conducted to confirm the association with autophagy, a TGFBI proteolytic system, but no significant differences were shown (FIGS. 2A and 2B).
  • 4-PBA did not appear to affect TGFBI transcription regulation (FIG. 4) or TGFBI protein secretion (FIG. 2 (d)).
  • TGFBI mRNA levels were analyzed by real-time qRT-PCR.
  • ERAD is induced to activate misfolded proteolysis in the endoplasmic reticulum via the ubiquitin-proteasome system. This indicates that TGFBI protein may be degraded by the ERAD system.
  • an experiment was performed to check the level of TGFBI protein under ER stress. WT and HO cells were incubated with or without 10 ⁇ M of tunicamycin and 20 mM 4-PBA, 0.1 mM Baf A1, or 1 mM MG132 for 18 hours.
  • Western blot analysis shows that TGFBI aberrant protein levels (Mutant-TGFBI protein) are reduced by ER stress inducers (FIGS. 5A and 5B).
  • TGFBI aberrant protein levels were markedly inhibited by 4-PBA (lanes 3, 4, 6 and 7 of FIGS. 5A and 5B). This means that TGFBI aberrant proteins can be degraded by ERAD and 4-PBA can activate the ERAD system.
  • FIG. 6A is a phase contrast micrograph 320X of corneal fibroblasts treated with the described material for 24 hours.
  • FIG. 6B is a phase contrast micrograph 320X of corneal fibroblasts treated with the described material for 24 hours.
  • 4-PBA has an inhibitory effect on cell death induced by ER stress.
  • 4-PBA is stable and has high ocular permeability in the aqueous solution (10 ⁇ M) and the free solution (5 ⁇ M) treated in the mouse eye. Given that the aqueous solution is located just behind the cornea, 4-PBA can reduce TGFBI protein levels by about 60% without concern for toxicity in GCD2 cells, for example, at acceptable therapeutic dose levels of 10 ⁇ M or less. (FIG. 7).
  • 6B and 7 show flow cytometry for WT and GCD2 corneal fibroblasts at various 4-PBA concentrations.
  • Cells were labeled with FITC (annexin V-fluorescein isothiocyanate).
  • FITC annexin V-fluorescein isothiocyanate
  • Cells shown are PI staining (lower left quadrant) and double-negative for annexin.
  • Early death phase cells are low-PI staining (lower quadrant) and are represented by high-annexin, and later death phase cells are PI staining (upper quadrant) and double-positive for annexin. to be.
  • Necrotic cells are PI stained (upper left quadrant) and are represented by low-annexin.

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Abstract

4-페닐부티르 산(4-phenylbutyric acid)을 유효성분으로 함유하는 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 ER 스트레스를 감소시키고 UPR의 활성을 감소시키며, ERAD 경로를 통해 TGFBI 이상단백질을 감소시키는 효능을 나타내며 이에 의해 TGFBI 이상단백질에 의한 각막이상증을 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 05.07.2017]　각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
TGFBI(transforming growth factor β-induced) 이상단백질로 인한 각막이상증은 TGFBI 유전자 이상으로 인하여 각막에 혼탁이 나타나는 질환을 통칭하며 혼탁으로 시력저하를 동반한다. TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증은 연령이 증가함에 따라 증상이 심화되며, 증상이 심한 환자가 빠르게 증가하고 있있다.
특히, 제2형 과립형 각막이상증(GCD2; Avellino corneal dystrophy)은 한국인에서의 유병률이 인구 870명당 1명이므로, TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증을 치료할 수 있는 의약품의 개발이 절실히 요구되고 있다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증은 현재까지 정상 각막을 이식하는 방법 외에 적절한 치료법이 없는 상태이다. 하지만 각막이식을 받아도 시간이 경과하면서 TGFBI 이상단백질이 다시 각막에 축적되어, 증상이 악화될 수 있다. 증상의 약화에 의해 반복되는 각막이식에 들어가는 비용과 이식용 각막의 극심한 부족 등의 어려움이 있다. 따라서, 근본적인 치료법 개발이 요구된다.
특히, TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증 환자가 라식, 라섹과 같은 첨단 시력회복 수술 후 증상이 악화되어 실명하였다고 국내외에서 보고되고 있다. 이는 앞으로도 잠재적 TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증 환자들이 시력회복 수술 후 증상의 악화 및 실명할 수 있는 위험에 처할 수 있다는 점을 나타낸다.
이에, 본 발명의 발명자들은 TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증 환자의 각막세포를 이용하여 TGFBI 단백질의 발현과 응집, 융해와 관련된 메커니즘을 밝혀내고, 질병의 원인이 되는 이상단백질의 생성과 침착을 막아 치료에 적용할 수 있는 치료용 약학 조성물을 발명하였다.
본 발명의 발명자들은 TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증의 원인이 되는 단백질인 TGFBI 단백질이 ER 스트레스를 일으키고 세포사멸을 유도하고 이 ER 스트레스는 TGFBI 유전자 변이각막이상을 악화시킬 수 있음 규명하였다.
TGFBI 이상단백질에 의한 각막질환의 진행 과정에서 본 발명의 일 실시예에 따른 각막이상증 치료용 약학 조성물이 가진 TGFBI 단백질 발현의 억제 및 TGFBI 단백질의 제거에서의 역할을 확인하였다.
TGFBI의 기능에 관한 연구는 크게 암과 관련한 부분과 각막이상증과 관련된 부분으로 나누어 볼 수 있으나 각막이상증과 관련된 TGFBI의 기능과 비교하여 암 관련 연구에서 그 기능이 더 많이 밝혀져 있다. TGFBI의 발현이 세포막에 위치한 다양한 인테그린(integrin)과 같은 수용체를 통하여 하류의 신호전달 체계를 조절하여 세포부착, 세포이동, 암전이(cancer metastasis)와 같은 현상에 밀접한 관련이 있다는 결과가 최근에 보고되었지만 TGFBI의 명확한 세포내 기능은 아직 밝혀지지 않았다.
한편, TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증에서 TGFBI 돌연변이 단백질의 침착이 원인이라고 보고되었으나, TGFBI의 돌연변이 단백질이 어떠한 기전을 통해서 각막의 세포외 기질에 축적되는지에 대한 명확한 발병 메카니즘은 알려져 있지 않다. 즉, TGFBI 단백질의 침착의 억제 또는 단백질 분해 등과 같은 조절 기전에 대해서는 규명되지 않았다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 각막이상증, 특히 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 해결하고자 하는 다른 과제는, 소포체(endoplasmic reticulum: ER) 스트레스를 감소시키고 UPR(unfolded protein response)의 활성을 감소시키며, ERAD(ER-associated degradation) 경로를 통해 TGFBI 이상단백질을 감소시키는 효능을 나타내며 이에 의해 TGFBI 이상단백질에 의한 각막이상증을 치료하는데 사용될 수 있는 각막이상증 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 4-페닐부티르 산(4-phenylbutyric acid: 4-PBA)을 유효성분으로 함유하는 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "예방"은 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하여 각막이상증 증상을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명의 일실시예에 따른 상기 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하여 각막이상증 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 발명자들은 4-페닐부티르 산이 변이 TGFBI(transforming growth factor β-induced) 단백질을 억제하는 것을 밝혀내었다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "각막이상증”은 각막에 이상소견이 나타나며 증상이 심화되는 질환을 통칭하며 시력저하를 동반하는 모든 증상을 의미하며, 시력이 저하된 상태뿐 아니라 저하될 가능성이 있거나 이를 예방할 필요가 있는 모든 상태를 의미한다.
각막이상증 환자에서는 각막표면에 흰점과 같은 혼탁이 나타나는데 이것은 나이가 들면서 증가하고, 진단은 이학적인 검사에서 나타나는 소견과 이에 해당되는 유전자이상으로 이루어진다. 이때 각막표면에 나타나는 혼탁은 원인 물질이 되는 이상단백질의 응축 및 축적, 분해 저하 등에 의한 것일 수 있다.
각막의 조직학적 특성상 투명성의 유지는 각막 고유의 기능을 수행하는데 반드시 필요한데 창상치유과정에서 증가한 세포외기질과 불규칙한 콜라겐의 배열은 각막의 투명성을 저해시킬 뿐만 아니라 특히 이 과정에서 많이 생성되는 것으로 알려진 TGFBI 단백질은 TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증의 임상적 악화에 결정적인 원인임이 밝혀졌다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "TGFBI 이상단백질로 인한 각막이상증”은 TGFBI 유전자의 이상으로 인하여 각막에 이상소견이 나타나며 증상이 심화되는 질환을 나타내며 시력저하를 동반하는 질환을 의미한다. 본 명세서의 상기 각막이상증은 각막이상증은 TGFBI 유전자 변이로 인한 각막이상증이라면, 그 구체적인 증상의 종류나 증상의 정도가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 TGFBI 이상단백질로 인한 상기 각막이상증은 제1형 과립형 각막이상증(ranular corneal dystrophy type 1), 제2형 과립형 각막이상증(Avellino corneal dystrophy), 제1형 격자형 각막이상증(lattice corneal dystrophy type 1), 제3형 격자형 각막이상증(lattice corneal dystrophy type 3); RBCD(Reis-Buchler corneal dystrophy), 및 TBCD(Thiel-Behnke corneal dystrophy)을 포함하며, 모두 상염색체 우성유전을 하며 5q31염색체의 TGFBI 단백질의 유전자 돌연변이가 원인이다.
바람직하게, 각막이상증은 제2형 과립형 각막이상증일 수 있다. 제2형 과립형 각막이상증의 변이 TGFBI 단백질 또는 TGFBI 이상단백질은 TGFBI 유전자(TGF-β induced gene)의 R124H에서의 점 돌연변이가 발생한 TGFBI 유전자로부터 발현된다.
본 명세서에서의 조성물은 특히 제2형과립형각막이상증의 증상을 개선하는 데에 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
한편, siRNA 또는 anti-TGFBI 단백질 항체를 사용하여 TGFBI 유전자 전체를 억제하면 각막에서의 TGFBI 발현을 조절할 수 있으나, 이는, 수많은 생체기전의 중심에 있는 TGFBI 유전자의 작용 범위를 고려할 때 심각한 부작용을 일으킬 것이라 예측되었다.
소포체(endoplasmic reticulum: ER)의 주요 기능은 새롭게 합성된 단백질의 품질 관리이다. 생리적이거나 병리학적 조건들이 소포체 항상성을 방해할 수 있으며, 이는 폴딩되지 않거나 잘못 폴딩된 단백질의 축적을 야기할 수 있다. 이러한 축적을 ER 스트레스라고도 한다. ER 스트레스는 UPR(unfolded protein response)을 활성화하여 이러한 스트레스를 감소시키며 항상성을 회복시킬 수 있다. 이러한 적응반응은 ERAD(ER-associated degradation)을 통해 전사 감소와 잘못 폴딩된 단백질의 제거를 야기하며, 단백질 폴딩에 도움을 주는 ER 샤페론 전사 상향조절을 야기한다. 이러한 ERAD 등은 초기에는 유익할 수 있으나 오래 지속되는 UPR은 결국 세포 사멸로 이어진다.
ERAD는 ER 스트레스와 매우 밀접하게 연결되며, 소포체에서 잘못 폴딩된 단백질을 제거한다. ERAD의 타겟 단백질은 ER 루멘 내의 품질관리 시스템에 의해 선택되며, 세포질 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 분해된다.
이하에서는, 본 발명의 각막이상증을 제2형과립형각막이상증(GCD2)을 예시적으로 하여 설명하나 TGFBI 단백질과 연관된 각막이상증과 관련하여 제한되지 않는다. 즉, 본 발명의 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물에서의 각막이상증은 GCD2에서와 점 돌연변이의 위치가 상이하거나 상이한 변이의 변이 또는 이상 TGFBI 단백질과 연관된 각막이상증을 모두 포함한다.
GCD2는 TGFBI 단백질의 유전자에서 124 코돈(R124H)에서 아르기닌이 히스티딘으로의 치환에 의해 야기되는 상염색체우성 질환이다. GCD2는 각막 상피와 기질에서 변이 TGFBI 단백질(mutant-TGFBI protein)의 축적에 이은 각막 투명도 감소를 증상으로 한다. 산화 스트레스, 변화된 미토콘드리아 기능, 결함있는 자식작용(autophagy) 및 TGFBI 단백질 축적, 지연된 TGFBI 단백질 분비 등이 GCD2 발병과 연관된 것으로 알려졌다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 GCD2의 발병 매커니즘으로서 ER 스트레스와 ERAD의 변이 TGFBI 단백질의 제거 역할에 주목하였다. 그리고, 4-페닐부티르 산이 각막의 소포체에서의 질병과 연관된 단백질들의 잘못된 폴딩을 리버스(reverse)함으로써 ER 스트레스와 세포 사멸을 감소시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다.
변이 TGFBI 단백질은 각막 섬유아세포에서 ER 스트레스를 야기할 수 있다. UPR은 ER 항상성을 회복하기 위한 주요 적응 응답일 수 있으며, GCD2 각막 섬유아세포는 ER 스트레스에 대응하여 UPR 경로를 활성화한다. 지속된 UPR은 이는 GCD2 각막 섬유아세포에서 XBP1와 CHOP를 증가시키며, 세포사멸을 유도한다.
4-페닐부티르 산은 저분자량 지방산이며 샤프론 유사 활성을 갖는다. 4-페닐부티르 산은 ER 스트레스를 감소시키고 UPR 활성화를 감소시킨다. 또한, 4-페닐부티르 산은 GCD2 각막 섬유아세포에서 TGFBI 이상단백질의 레벨을 감소시킨다. 4-페닐부티르 산은 ERAD 경로와 같은 TGFBI 단백질 분해와 연관된 기전을 통해 TGFBI 단백질 분해를 유도하고, TGFBI 단백질 레벨을 감소시킨다. 나아가, 4-페닐부티르 산은 ER 스트레스로 인한 GCD2 세포사를 방지한다. 4-페닐부티르 산은 안정적이며 눈에서의 높은 투과성을 나타낸다.
본 발명의 상기 4-페닐부티르 산의 유효 함량은 특별히 제한되지 않으며, 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 10 중량％로 포함되거나 전체 함량으로도 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 4-페닐부티르 산에 더하여, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 점안제, 안연고의 형태로, 또는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 멸균 주사 용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 바람직하게는 점안제 또는 안연고로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 바람직하게 콜로이달 제형(Colloidal Dosage Form)을 이용한 점안액일 수 있다. 콜로이달 제형의 장점은 눈으로의 약물 전달 시 타겟 부위에서의 약물 방출을 조절할 수 있으며 상피 장벽 및 유출량과 연관된 투과 장벽도 극복할 수 있다. 또한 콜로이달 제형은 불안정한 의약품의 안정화에도 기여할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 개별 치료제로 사용되거나 다른 치료제와 병용하여 사용될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물이 비경구 투여를 위한 제제로 제조되는 경우, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등이 포함될 수 있다. 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학적 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 이시에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여는 하루에 1 회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학적 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 눈에 직접 투여하는 방법을 포함하나 이들에 제한되지 아니한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 4-페닐부티르 산을 함유하는 변이 TGFBI 단백질 억제제가 제공된다.
본 발명에서 사용되는 용어, "변이 TGFBI 단백질 억제제"는 각막에서의 변이 TGFBI 단백질의 축적을 억제하는 작용을 하는 물질을 의미한다. 본 발명의 4-페닐부티르 산은 변이 TGFBI 단백질의 레벨을 감소시키는 것으로 확인되었다.
본 명세서에서 "개체"는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유 동물을 비롯한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 각막이상증을 개선시키는 방법은 상기 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 것을 포함한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은 4-페닐부티르 산을 유효 성분으로 함유하는 조성물을 제공하고, 이를 이용하여 각막이상증, 특히 TGFBI 유전자 변이 각막이상증의 예방 또는 치료하는 효과를 나타낸다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 ER 스트레스를 감소시키고 UPR의 활성을 감소시키며, ERAD 경로를 통해 TGFBI 이상단백질을 감소시키는 효능을 나타내며 이에 의해 TGFBI 이상단백질에 의한 각막이상증을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 처리하였을 때, BIP, IRE1α 및 XBP1s의 레벨을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 처리하였을 때, TGFBI 단백질의 레벨을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 처리하였을 때, 시간에 따른 TGFBI 단백질의 감소를 나타낸 실험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 처리하였을 때, TGFBI mRNA의 레벨에는 영향이 없음을 나타낸 실험 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 처리하였을 때, TGFBI 단백질의 레벨을 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 처리하였을 때, ER 스트레스에 의해 유도된 세포사를 확인하기 위한 실험 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 처리하였을 때, ER 스트레스에 의해 유도된 세포사를 방지하는 것을 나타내는 실험 결과이다.
도 7는 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 처리하였을 때, 각막의 섬유아세포에서 세포독성이 없음을 나타내는 실험 결과이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
이하에서는, 본 발명의 각막이상증을 제2형과립형각막이상증(GCD2)을 예시적으로 하여 설명하나 이에 제한되지 않고, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 각막이상증 이상의 개선은 TGFBI 이상단백질의 감소함으로써 각막이상증이 개선되는 한 다양한 각막이상증에 적용될 수 있다.
이하의 실험들에서는 와일드타입(WT) 및 1차 GCD2 동형접합성 변이의 (homozygous: HO) 인체 각막 섬유아세포를 사용하였다. 1차 각막 섬유아세포들과 세포 라인들은 37°C 5% CO2 인큐베이터에서 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; Gibco, Gaithersburg, MD, USA), 100 IU/ml 페니실린(Corning) 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(Corning)이 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's media; Corning, Cambridge, MA, USA)를 사용하여 유지되었다.
세포 추출은 프로테아제 억제 타블렛을 함유하는 RIPA (radioimmunoprecipitation assay) 버퍼 (RIPA; 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4) 에서의 1차 각막 섬유아세포로부터 수행되었다. 웨스턴 블랏이 수행되고, 스캐닝된 면역 반응성 단백질 밴드의 강도와 광학 밀도는 ImageJ version 1.37 (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 정량화되었으며, β-actin 밴드에 대한 정규화와 배경 제거 방식으로 수정되었다.
적응적 UPR은 세포의 생존을 향상시키지만 만성적인 UPR 활성화는 특히 GCD2 각막 섬유아세포에서 세포 사멸을 트리거한다. 세포 사멸 경로 활성화는 ER 스트레스로 야기될 수 있다. GCD2 각막 섬유아세포가 튜니카마이신(tunicamycin)에 의해 자극되어 ER 스트레스가 유도된 경우, 와일드타입 세포들과 비교하여 GCD2에서의 세포사가 약 20배정도 증가하였다.
실시예 1 - 4-PBA로 인한 ER 스트레스 감소
4-PBA로 처리되거나 처리되지 않은 세포들은 ER 스트레스 유도체로 처리되었다. IRE1α(inositol-requiring enzyme 1α)는 주요한 ER 스트레스 키니아제이며, XBP1(X box-binding protein 1)은 UPR의 활성화와 연관된 타겟이다. BiP, IRE1α, 및 XBP1는 튜니카마이신에 의해 지속적이고 주요하게 상향조절된다(도 1의 (a)). 이러한 유도는 WT 세포들에서보다 HO 세포들에서 보다 크게 나타난다. 한편, 4-PBA 처리는 튜니카마이신에 의한 BiP 유도를 크게 저감시킨다(도 1의 (a) 및 (b)). 나아가, HO 세포들의 IRE1α 및 XBP1도 10 mM 4-PBA로 처리되는 경우 크게 감소한다(도 1의 (a), (c) 및 (d)). 나아가, 튜니카마이신-매개된 IRE1α 및 XBP1 조절은 HO 세포들에서 4-PBA 처리에 의해 현저하게 억제된다(도 1의 (a), (c) 및 (d)).
실시예 2 - 4-PBA로 인한 TGFBI 단백질 레벨 감소
TGFBI 단백질의 분비 또는 발현에 대한 4-PBA의 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 웨스턴 블랏에 의해 분석된 TGFBI 단백질 레벨은 24시간동안의 5, 10, 또는 20 mM 4-PBA 처리에 의해 WT 및 HO 세포들에서 모두 크게 감소되었다(도 2의 (a) 및 (b)). 또한, 20 mM 4-PBA 처리된 세포들은 4시간후 TGFBI 단백질이 약 40% 감소되었으며 24시간이 될 때까지 지속적으로 감소되었다(도 3). 또한, TGFBI 단백질 분해 시스템인 자식 작용(autophagy)과의 연관성을 확인하기 위한 실험도 수행하였으나, 유의미한 차이는 나타나지 않았다(도 2의 (a) 및 (b)). 또한, 4-PBA는 TGFBI 전사 조절(도 4) 또는 TGFBI 단백질 분비(secretion)(도 2의 (d))에도 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. TGFBI mRNA 레벨은 real-time qRT-PCR로 분석되었다.
실시예 3 - ER 스트레스하에서 TGFBI 단백질의 ERAD를 통한 분해 및 4-PBA의 ERAD 활성화 유도
ERAD가 유도되어 유비퀴틴-프로테아좀 시스템을 통해 소포체 내에서 잘못 폴딩된 단백질 분해가 활성화된다. 이는 TGFBI 단백질이 ERAD 시스템에 의해 분해될 수도 있다는 것을 나타낸다. 이를 확인하기 위해 ER 스트레스 하에서 TGFBI 단백질의 레벨을 확인하는 실험을 수행하였다. WT 및 HO 세포들은 18시간동안 10 μM의 튜니카마이신 그리고 20 mM 4-PBA, 0.1 mM Baf A1, 또는 1 mM MG132을 포함하거나 포함하지 않고 배양되었다. 웨스턴블랏 분석은 TGFBI 이상단백질 레벨(Mutant-TGFBI 단백질)이 ER 스트레스 유도물질에 의해 감소되는 것을 나타낸다(도 5의 (a) 및 (b)). 나아가, 이러한 감소는 ERAD 억제제인 MG132(ubiquitin proteasome inhibitor)와 자식 작용 억제제인 bafA1(bafilomycin A1)에 의해 현저하게 억제되었다(도 5의 (a) 및 (b)). ERAD를 통한 4-PBA이 TGFBI 단백질 레벨을 조절하는지를 판단하기 위해, 4-PBA, MG132, 또는 bafA1을 포함하거나 포함하지 않고 TGFBI 이상단백질의 레벨을 측정하였다(도 5의 (a) 및 (b)). 튜니카마이신은 지속적으로 이상TGFBI 단백질의 레벨을 감소시켰으나(도 5의 (a) 및 (b)의 lane 1, 2), MG132 또는 bafA1과 함께 처리되는 경우, ER 스트레스 하에서 TGFBI 이상단백질 레벨이 현저하게 상향 조절되었다(도 5의 (a) 및 (b)의 lane 3, 4). 이러한 높아진 TGFBI 이상단백질 레벨은 4-PBA에 의해 현저하게 억제되었다(도 5의 (a) 및 (b)의 lane 3, 4, 6 및 7). 이는 TGFBI 이상단백질이 ERAD에 의해 분해될 수 있으며, 4-PBA가 ERAD 시스템을 활성화시킬 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 4 - 4-PBA처리에 의한 GCD2 세포사 감소
ER 스트레스-매개된 GCD2 세포사가 4-PBA 처리에 의해 방지되는 것을 확인하였다(도 6a 및 도 6b). 도 6a는 기재된 물질로 24시간동안 처리된 각막 섬유아세포의 위상차 현미경 사진(320X)이다. 이러한 결과는 ER 스트레스에 의해 유도된 세포사에서 4-PBA가 억제 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 또한, 마우스의 눈에 처리된 수양액(10 μM) 및 유리액(5 μM)에서 4-PBA는 안정적이며 높은 안구 투과성을 갖는다. 수양액이 각막 바로 뒤에 위치된다는 점을 고려할 때, 4-PBA는 예를 들어 10 μM 이하의 허용가능한 치료 도즈 레벨에서 GCD2 세포들에서 독성에 대한 우려 없이 TGFBI 단백질 레벨을 약 60%까지 감소시킬 수 있다(도 7). 도 6b 및 도 7은 다양한 4-PBA 농도하에서 WT와 GCD2 각막 섬유아세포에 대한 유세포 분석을 나타낸다. 세포들은 FITC(annexin V-fluorescein isothiocyanate)로 라벨링되었다. 보여지는 세포들은 PI 염색(좌하부 사분면)이고, 아넥신에 대해서 이중-음성(double-negative)이다. 초기의 사멸 단계 세포는 낮은-PI 염색(우하부 사분면)이며 높은-아넥신으로 나타내어지고, 후기의 사멸 단계 세포는 PI 염색(우상부 사분면)이고 아넥신에 대해 이중-양성(double-positive)이다. 괴사성(necrotic) 세포들은 PI 염색(좌상부 사분면)이고 낮은-아넥신으로 나타내어진다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 4-페닐부티르 산(4-phenylbutyric acid)을 유효성분으로 함유하는, 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 각막이상증은 TGFBI(transforming growth factor β-induced) 유전자 변이 각막이상증인, 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 제1형과립형각막이상증(ranular corneal dystrophy type 1), 제2형과립형각막이상증(Avellino corneal dystrophy), 제1형격자형각막이상증(lattice corneal dystrophy type 1), 제3형격자형각막이상증(lattice corneal dystrophy type 3); RBCD(Reis-Buchler corneal dystrophy), 및 TBCD(Thiel-Behnke corneal dystrophy) 중 하나인, 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 제2형과립형각막이상증인, 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 4-페닐부티르 산(4-phenylbutyric acid)을 유효성분으로 함유하는, 각막이상증 치료제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 각막이상증은 TGFBI 유전자 변이 각막이상증인, 각막이상증 치료제.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 제1형과립형각막이상증(ranular corneal dystrophy type 1), 제2형과립형각막이상증(Avellino corneal dystrophy), 제1형격자형각막이상증(lattice corneal dystrophy type 1), 제3형격자형각막이상증(lattice corneal dystrophy type 3); RBCD(Reis-Buchler corneal dystrophy), 및 TBCD(Thiel-Behnke corneal dystrophy) 중 하나인, 각막이상증 치료제.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 TGFBI 유전자 변이 각막이상증은 제2형과립형각막이상증인, 각막이상증 치료제.
  9. 제5항 내지 제8항 중 한 항에 있어서,
    점안제 또는 안연고의 제형인, 각막이상증 치료제.
  10. 4-페닐부티르 산을 함유하는 변이 TGFBI 억제제.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 변이 TGFBI는 TGFBI 유전자의 R124H에서의 점 돌연변이가 발생한 TGFBI인 변이 TGFBI 억제제.
PCT/KR2017/005823 2016-06-03 2017-06-02 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물 WO2017209577A1 (ko)

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