WO2017200325A1 - 케라틴 8 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법 - Google Patents

케라틴 8 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2017200325A1
WO2017200325A1 PCT/KR2017/005189 KR2017005189W WO2017200325A1 WO 2017200325 A1 WO2017200325 A1 WO 2017200325A1 KR 2017005189 W KR2017005189 W KR 2017005189W WO 2017200325 A1 WO2017200325 A1 WO 2017200325A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
macular degeneration
keratin
phosphorylation
pharmaceutical composition
treatment
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/005189
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김동은
백아름
Original Assignee
건국대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 건국대학교 산학협력단 filed Critical 건국대학교 산학협력단
Priority to EP17799682.4A priority Critical patent/EP3459548A4/en
Priority to AU2017267166A priority patent/AU2017267166B2/en
Priority to CN201780028704.1A priority patent/CN109152782A/zh
Priority to US16/302,934 priority patent/US10857154B2/en
Priority to JP2018556969A priority patent/JP2019518007A/ja
Publication of WO2017200325A1 publication Critical patent/WO2017200325A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4184—1,3-Diazoles condensed with carbocyclic rings, e.g. benzimidazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration comprising a keratin 8 phosphorylation inhibitor and a screening method for treating macular degeneration, and more particularly for preventing or treating dry macular degeneration, including trametinib or gefitinib.
  • Korean Patent Registration No. 10-1415221 (2014.06.27.) Discloses a pharmaceutical composition for preventing and treating angiogenesis-related diseases containing inorganic nanoparticles selected from silica or titanium oxide as an active ingredient.
  • the angiogenesis-related diseases include macular degeneration.
  • trametinib or zefitinib is useful for the prevention or treatment of macular degeneration by inhibiting the phosphorylation of keratin 8.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration, including trametinib or gefitinib, and a screening method for treating macular degeneration.
  • one selected from the group consisting of trametinib, zefitinib, carnitinib, lapatinib, erlotinib, afatinib, neratinib, selumetinib, repametinib, and PD98059 Provided is a pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration comprising the keratin 8 phosphorylation inhibitor described above.
  • the keratin 8 phosphorylation inhibitor may be trametinib or gefitinib.
  • the macular degeneration may be dry macular degeneration, dry macular degeneration by mesenchymal cell epithelial cells.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • a method for screening a macular degeneration agent comprising a step of selecting a candidate having an inhibitory effect on keratin 8 phosphorylation is provided.
  • the step of selecting a candidate comprises a) treating the candidate with retinal pigment epithelial cells phosphorylated with keratin 8 by oxidative stress; b) determining whether to inhibit keratin 8 phosphorylation after treatment with the candidate substance; And c) when keratin 8 phosphorylation is suppressed compared to the group not treated with the candidate material, the candidate material may be determined to have a macular degeneration treatment effect.
  • step b) may be a step of determining that phosphorylation of keratin 8 is inhibited when the expression level of P-ERK1 / 2 or P-K8 decreases after treatment with the candidate.
  • step b) may be a step of determining that phosphorylation of keratin 8 is inhibited when the expression level of E-cadherin increases after treatment with a candidate.
  • step b) may be a step of determining that phosphorylation of keratin 8 is inhibited when the expression amount of non-mentin is reduced after treatment with the candidate.
  • trametinib or zefitinib inhibits phosphorylation and peri nuclear rearrangement of keratin 8, increases the expression of E-cadherin, and decreases the expression of bimentin. Therefore, the trametinib or zefitinib of the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of macular degeneration.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing degeneration of retinal epithelial cells by oxidative stress.
  • Figure 2 shows the results of Western blot showing the inhibitory effect of ERK and K8 phosphorylation by oxidative stress using (A and B) PD98059, and (C) cell staining whether or not around the nuclear rearrangement inhibitory effect (reference) Chair length: 5 ⁇ m).
  • Figure 3 shows the inhibition of mesenchymal cell regeneration of retinal epithelial cells by (A) PD98059 (base length: 10 ⁇ m) and (B) cell mobility inhibitory effect (base length: 0.5 mm) and (C) mouse model.
  • FIG. 5 shows the results of (A) phosphorylation of ERK and K8 of retinal epithelial cells by oxidative stress using zephytinib, an EGFR inhibitory anticancer agent, and (B) inhibition of nuclear rearrangement around K8 through Western blot and cell staining. (Standard length: 5 ⁇ m) and (C) Cell staining results (standard length: 10 ⁇ m) confirming the mesenchymal cell inhibition effect.
  • Figure 6 is a schematic diagram showing the signaling effect of epidermal growth factor receptor and EGFR phosphorylation inhibitory effect of zephytinib.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating macular degeneration comprising at least one keratin 8 (K8) phosphorylation inhibitor selected from the group consisting of nip (neratinib), selumetinib, refametinib, and PD98059 Is provided.
  • the invention also provides the use of a keratin 8 phosphorylation inhibitor or a pharmaceutical composition comprising the same for use in the prevention or treatment of macular degeneration.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating macular degeneration comprising administering to a patient a therapeutically effective amount of a keratin 8 phosphorylation inhibitor.
  • the keratin 8 phosphorylation inhibitor may be trametinib or gefitinib.
  • the macular degeneration may be dry macular degeneration, dry macular degeneration by mesenchymal cell epithelial cells.
  • the pharmaceutical composition may further comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers or additives. That is, the pharmaceutical compositions of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, suppositories, eye drops and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method. Can be.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like. Also included are diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, and the like.
  • Oral solid preparations include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose ( lactose), gelatin, and the like, and may include lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, syrups, and the like, and may include water, diluents such as liquid paraffin, wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, and the like.
  • Parenteral preparations include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, and vegetable oils such as olive oil and ethyl. Injectable esters such as oleate and the like.
  • aqueous solvents such as propylene glycol, polyethylene glycol, and vegetable oils such as olive oil and ethyl.
  • injectable esters such as oleate and the like.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like may be used.
  • the dosage of the keratin 8 phosphorylation inhibitor contained in the pharmaceutical composition of the present invention depends on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the keratin 8 phosphorylation inhibitor may be administered at a dose of 0.0001 to 1000 mg / kg, preferably 0.01 to 1000 mg / kg, and the administration may be administered once or several times a day. have.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise 0.001 to 90% by weight of the keratin 8 phosphorylation inhibitor relative to the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in various routes in mammals such as rats, mice, livestock, humans, or the like, for example, by oral, intraperitoneal, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection. May be administered.
  • a method for screening a macular degeneration agent comprising a step of selecting a candidate having an inhibitory effect on keratin 8 phosphorylation is provided.
  • the step of selecting a candidate comprises a) treating the candidate with retinal pigment epithelial cells phosphorylated with keratin 8 by oxidative stress; b) determining whether to inhibit keratin 8 phosphorylation after treatment with the candidate substance; And c) when keratin 8 phosphorylation is suppressed compared to the group not treated with the candidate material, the candidate material may be determined to have a macular degeneration treatment effect.
  • step b) may be a step of determining that phosphorylation of keratin 8 is inhibited when the expression level of P-ERK1 / 2 (phosphorylated ERK) or P-K8 (phosphorylated K8) decreases after treatment with a candidate substance.
  • Measurement of the expression level can be carried out via Western blot.
  • step b) may be a step of determining that phosphorylation of keratin 8 is inhibited when the expression level of E-cadherin increases after treatment with a candidate.
  • the expression level may be measured by immunofluorescence staining.
  • step b) may be a step of determining that phosphorylation of keratin 8 is inhibited when the expression amount of vimentin is decreased after treatment with the candidate.
  • the expression level may be measured by immunofluorescence staining.
  • epithelial-mesenchymal transition may proceed as K8 phosphorylates, decreasing E-cadherin and increasing non-mentin.
  • Mesenchymal cellization refers to a process in which a cell loses adhesion between cells as an epithelial cell phenotype and switches to a highly mobile state as a mesenchymal cell phenotype (FIG. 1).
  • APRE-19 cells (retinal pigment epithelial cells, American Type Culture Collection; CRL-2302), which are derived from human retinal tissue, were selectively treated with 400 ⁇ M of paraquat for 24 hours, followed by 10 ⁇ M of JNK inhibitor SP600125 or ERK inhibitor. 20 ⁇ M of PD98059 was treated for 24 hours. Bar graphs according to Western blot showed expression levels of P-K8 (FIG. 2A). As a result, it was confirmed that PD98059 was superior to the effect of inhibiting phosphorylation of K8 due to oxidative stress compared to the use of SP600125.
  • APRE-19 cells were treated with paraquat 400 ⁇ M for 24 hours followed by selective treatment of PD98059 20 ⁇ M for 24 hours.
  • Bar graphs according to Western blot showed expression levels of ERK 2, P-ERK1 / 2 (phosphorylated ERK), K8, P-K8 and LC3 I / II.
  • the expression level of P-ERK and P-K8 was confirmed in the bar graph analyzed Western blot image (Fig. 2B).
  • Fig. 2B Western blot image
  • ARPE-19 cells and human tissue-derived RPE cells were selectively treated with Paraquat 400 ⁇ M and PD98059 20 ⁇ M for 36 hours.
  • ARPE-19 cells are genetically engineered cell lines capable of infinite growth for experimental use.
  • human tissue-derived RPE cells were obtained by culturing RPE tissue removed from human eye, and thus were used for experiments under conditions similar to those of human RPE because they did not undergo any genetic manipulation.
  • P-K8 green fluorescence of the cells was then stained by immunochemistry (Abcam; ab32579). Nuclei were stained (Invitrogen; T3605) using topro-3 (TOPRO-3, blue fluorescence) (FIG. 2C). As a result, it was confirmed that under the oxidative stress conditions of paraquat-induced retinal epithelial cells, PD98059 suppressed the peripheral nuclear rearrangement of K8 indicated in green.
  • E-cadherin green fluorescence
  • vimentin red fluorescence
  • PD98059 restores the loss of E-cadherin, which is characteristic of mesenchymal cell formation, and suppresses the increase of non-mentin filaments that are specific to mesenchymal cells. This was confirmed. Thus, PD98059 reduced mesenchymal cell formation.
  • APRE-19 cells were selectively treated with 400 ⁇ M of paraquat and 50 nM of trametinib for 24 hours.
  • Bar graphs according to Western blot showed expression levels of ERK 2, P-ERK1 / 2 (phosphorylated ERK), K8, P-K8 and LC3 I / II.
  • the expression level of P-ERK and P-K8 was confirmed in the bar graph analyzed Western blot image (Fig. 4A). As a result, it was confirmed that trametinib inhibits phosphorylation of K8 due to oxidative stress.
  • APRE-19 cells were optionally treated with 400 ⁇ M of paraquat and 50 nM of trametinib for 36 hours.
  • P-K8 (green fluorescence) of cells was stained by immunochemistry (FIG. 4B). As a result, it was confirmed that under the oxidative stress conditions of paraquat-induced retinal epithelial cells, trametinib inhibits the peripheral nuclear rearrangement of K8 indicated in green.
  • APRE-19 cells and human tissue-derived RPE cells were selectively treated with 400 ⁇ M of paraquat and 50 nM of trametinib for 48 hours.
  • E-cadherin (green fluorescence) and bimentin (red fluorescence) were stained by immunochemistry in the cells.
  • Nuclei were visualized with topro-3 (blue fluorescence) (FIG. 4C).
  • trametinib recovers the loss of E-cadherin and inhibits the increase of non-mentin filament.
  • trametinib reduces mesenchymal cellization.
  • EGFR EGFR
  • ligands such as epidermal growth factor (EGF) bind to each other, auto-phosphorylation results in the promotion of various signals in cells. It is known. Since ERK is one of the sub-factors of EGFR, zephytinib also inhibits the degeneration of retinal epithelial cells due to oxidative stress, so that it can be seen as a possibility of use as a therapeutic agent for macular degeneration (FIG. 6).

Abstract

본 발명은 트라메티닙 또는 제피티닙을 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은, 산화 스트레스 조건하의 망막색소상피세포에서 케라틴 8의 인산화 및 핵 주변 재배열을 억제하고, E-카데린의 발현을 증가시키며, 비멘틴의 발현을 감소시키므로, 황반변성의 예방 또는 치료 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

케라틴 8 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법
본 발명은 케라틴 8 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 트라메티닙 또는 제피티닙을 포함하는 건성 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 케라틴 8의 인산화를 억제하는 건성 황반변성 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
노화가 진행됨에 따라 망막에 존재하는 황반부에 변성이 일어나게 되면서 시야 중심부가 흐려지거나 왜곡되는 황반변성은 세포 대사 찌꺼기인 드루젠이 망막층과 그 아래 존재하는 기저막 사이에 축적되어 나타나는 건성 황반변성과 비정상적인 혈관이 자라나 혈액이 누수되어 나타나는 습성 황반변성으로 나뉘어진다. 습성 황반변성의 경우 혈관내피세포 성장인자(vacular endothelial growth factor; VEGF)와 같은 성장인자에 의해 신생혈관 생성이 촉진되어 나타나며 직접적인 원인이 규명되어 있어 이를 타겟으로 하는 여러 약물(Avastin, Lucentis, Eylea)이 개발되어 있으나, 환자의 약 90 % 비율을 차지하는 건성 황반변성의 경우 연구가 많이 진행되어 있지 않아 약물 개발도 되어있지 않은 실정이다. 건성 황반변성은 크게 시력에 영향을 주지 않는다고 알려져 있지만 건성 황반변성이 계속 진행되면 습성 황반변성으로 변하기 때문에 건성 황반변성의 치료제 개발이 시급한 실정이다.
최근 연구에 의하면 황반변성의 주된 원인인 산화 스트레스에 의해 세포외신호조절인산화효소(extracellular signal-regulated kinase; ERK)가 활성화되면 세포 내 골격 역할을 담당하는 케라틴 8(keratin 8; K8)이 인산화되며, 정상적인 세포에서 세포질 전반부에 넓게 분포하고 있는 K8이 산화 스트레스에 노출된 세포에서는 ERK에 의해 인산화되어 세포의 핵 주변으로 재배열된다는 것을 확인하였다. 인산화된 K8의 핵 주변 재배열은 세포의 이동성을 증가시키는데 이러한 과정을 거친 세포는 상피세포의 성질을 잃어버리고 간엽세포화(epithelial-mesenchymal transition; EMT)된다.
망막상피세포가 그 성질을 잃어버리고, 세포 이동성이 높은 간엽세포의 성질을 얻으면 치밀한 구조를 이루고 있던 망막층이 흐트러진다. 이러한 현상은 건성 황반변성의 후기 형태인 망막색소상피위축(geographic atrophy; GA)의 원인이 된다. GA 환자는 맥락막신생혈관(choroidal neovascularization; CNV)이 생길 위험도가 매우 높으며 생성된 CNV가 스트레스 및 작은 충격에 의해 터지게 되면 혈액이 누수되어 습성 황반변성으로 발전하게 된다. 따라서 건성 황반변성의 진행과 습성 황반변성으로의 전환을 억제하기 위해서는 망막상피세포의 EMT를 막는 것이 무엇보다도 중요하다.
관련 종래기술로서 한국등록특허 제10-1415221호(2014.06.27.)는 실리카 또는 산화티탄에서 선택되는 무기나노입자를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 개시한 바 있으며, 상기 혈관신생 관련질환으로서 황반변성을 포함하고 있다.
본 발명자들은 황반변성의 치료에 대하여 연구하던 중, 트라메티닙 또는 제피티닙이 케라틴 8의 인산화를 억제시킴으로써 황반변성의 예방 또는 치료에 유용하다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 트라메티닙 또는 제피티닙을 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 트라메티닙, 제피티닙, 카너티닙, 라파티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 네라티닙, 셀루메티닙, 레파메티닙 및 PD98059로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 케라틴 8 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 케라틴 8 인산화 억제제는 트라메티닙 또는 제피티닙일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 황반변성은 건성 황반변성일 수 있으며, 상피세포의 간엽세포화에 의한 건성 황반변성일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따라, 케라틴 8 인산화 억제 효과를 나타내는 후보물질 선별 단계를 포함하는 황반변성 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 후보물질 선별 단계는 a) 산화 스트레스에 의해 케라틴 8이 인산화된 망막색소상피세포에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질 처리 이후 케라틴 8 인산화 억제 여부를 판단하는 단계; 및 c) 후보물질을 처리한 군에서 처리하지 않은 군에 비해 케라틴 8 인산화가 억제되는 경우, 상기 후보물질이 황반변성 치료 효과가 있다고 판단하는 단계일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 b) 단계는 후보물질 처리 이후 P-ERK1/2 또는 P-K8의 발현량이 감소하면 케라틴 8의 인산화가 억제되는 것으로 판단하는 단계일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 b) 단계는 후보물질 처리 이후 E-카데린의 발현량이 증가하면 케라틴 8의 인산화가 억제되는 것으로 판단하는 단계일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 b) 단계는 후보물질 처리 이후 비멘틴의 발현량이 감소하면 케라틴 8의 인산화가 억제되는 것으로 판단하는 단계일 수 있다.
본 발명에 의해, 트라메티닙 또는 제피티닙이 케라틴 8의 인산화 및 핵 주변 재배열을 억제하고, E-카데린의 발현을 증가시키며, 비멘틴의 발현을 감소시키는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 트라메티닙 또는 제피티닙은 황반변성의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 산화 스트레스에 의한 망막상피세포의 변성을 나타낸 모식도이다.
도 2는 (A 및 B) PD98059를 이용하여 산화 스트레스에 의한 ERK 및 K8의 인산화 억제 효과를 나타낸 웨스턴 블랏 결과 및 (C) K8 단백질의 핵 주변 재배열 억제 효과 여부를 세포 염색으로 나타낸 것이다(기준자 길이 : 5 ㎛).
도 3은 (A) PD98059에 의한 망막상피세포의 간엽세포화 억제(기준자 길이 : 10 ㎛) 및 (B) 세포 이동성 억제 효과(기준자 길이 : 0.5 mm) 및 (C) 마우스 모델에서의 망막층 변성억제에 따른 세포보호 효과(기준자 길이 : 50 ㎛)를 세포염색으로 확인한 것이다.
도 4는 (A) ERK 인산화 억제 항암제인 트라메티닙을 이용하여 산화 스트레스에 의한 망막상피세포의 ERK 및 K8의 인산화, (B) K8의 핵 주변 재배열 억제 효과를 웨스턴 블랏과 세포염색을 통해 나타낸 결과(기준자 길이 : 5 ㎛) 및 (C) 간엽세포화 억제 효과를 확인한 세포염색 결과(기준자 길이 : 10 ㎛)이다.
도 5는 (A) EGFR 억제 항암제 제피티닙을 이용하여 산화 스트레스에 의한 망막상피세포의 ERK 및 K8의 인산화, (B) K8의 핵 주변 재배열 억제 효과를 웨스턴 블랏과 세포염색을 통해 나타낸 결과(기준자 길이 : 5 ㎛) 및 (C) 간엽세포화 억제 효과를 확인한 세포염색 결과(기준자 길이 : 10 ㎛)이다.
도 6은 상피세포성장인자 수용체의 신호전달 모식도와 제피티닙의 EGFR 인산화 억제 효과를 나타낸 모식도이다.
본 발명의 일 태양에 따라, 트라메티닙(trametinib), 제피티닙(gefitinib), 카너티닙(canertinib), 라파티닙(lapatinib), 에를로티닙(erlotinib), 아파티닙(afatinib), 네라티닙(neratinib), 셀루메티닙(selumetinib), 레파메티닙(refametinib) 및 PD98059로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 케라틴 8(Keratin 8; K8) 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명은 황반변성의 예방 또는 치료에 사용하는 케라틴 8 인산화 억제제 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 환자에게 치료학적으로 유효한 양의 케라틴 8 인산화 억제제를 투여하는 것을 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 상기 케라틴 8 인산화 억제제는 트라메티닙 또는 제피티닙일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 황반변성은 건성 황반변성일 수 있으며, 상피세포의 간엽세포화에 의한 건성 황반변성일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 점안제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한다. 또한, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 포함한다. 경구용 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 포함할 수 있으며, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제 등을 포함할 수 있다. 경구용 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하며, 물, 리퀴드 파라핀 등의 희석제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구용 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함하며, 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르류 등을 포함한다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 함유되는 케라틴 8 인산화 억제제의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 케라틴 8 인산화 억제제는 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 1000 mg/kg의 용량으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 케라틴 8 인산화 억제제를 0.001 내지 90 % 중량백분율로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구, 복강, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따라, 케라틴 8 인산화 억제 효과를 나타내는 후보물질 선별 단계를 포함하는 황반변성 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 후보물질 선별 단계는 a) 산화 스트레스에 의해 케라틴 8이 인산화된 망막색소상피세포에 후보물질을 처리하는 단계; b) 후보물질 처리 이후 케라틴 8 인산화 억제 여부를 판단하는 단계; 및 c) 후보물질을 처리한 군에서 처리하지 않은 군에 비해 케라틴 8 인산화가 억제되는 경우, 상기 후보물질이 황반변성 치료 효과가 있다고 판단하는 단계일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 b) 단계는 후보물질 처리 이후 P-ERK1/2(phosphorylated ERK) 또는 P-K8(phosphorylated K8)의 발현량이 감소하면 케라틴 8의 인산화가 억제되는 것으로 판단하는 단계일 수 있다. 상기 발현량의 측정은 웨스턴 블랏을 통해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 b) 단계는 후보물질 처리 이후 E-카데린(E-cadherin)의 발현량이 증가하면 케라틴 8의 인산화가 억제되는 것으로 판단하는 단계일 수 있다. 상기 발현량의 측정은 면역형광염색법을 통해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 b) 단계는 후보물질 처리 이후 비멘틴(vimentin)의 발현량이 감소하면 케라틴 8의 인산화가 억제되는 것으로 판단하는 단계일 수 있다. 상기 발현량의 측정은 면역형광염색법을 통해 수행될 수 있다.
산화 스트레스가 유도된 망막색소상피세포에서는 K8이 인산화되면서 E-카데린이 감소하고 비멘틴이 증가함으로써 간엽세포화(epithelial-mesenchymal transition; EMT)가 진행될 수 있다. 간엽세포화라 함은, 세포가 상피세포 표현형으로서의 세포 간의 부착성을 상실하고, 간엽세포 표현형으로서 이동성이 높은 상태로 전환하는 과정을 의미한다(도 1).
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예>
1. PD98059의 K8 인산화 및 핵 주변 재배열 억제 효과 확인
인간망막조직 유래 세포인 APRE-19 세포(망막색소상피세포, American Type Culture Collection; CRL-2302)에 파라콰트(paraquat) 400 μM을 24시간 동안 선택적으로 처리한 후 JNK 억제제인 SP600125 10 μM 또는 ERK 억제제인 PD98059 20 μM을 24시간 동안 처리하였다. 웨스턴 블랏에 따른 막대 그래프로 P-K8의 발현 수준을 나타내었다(도 2A). 상기 결과로서 산화 스트레스로 인한 K8의 인산화를 억제하는 효과는 SP600125를 사용할 때에 비하여 PD98059가 더 뛰어난 것을 확인하였다.
APRE-19 세포에 파라콰트 400 μM을 24시간 동안 처리한 후 PD98059 20 μM을 24시간 동안 선택적으로 처리하였다. 웨스턴 블랏에 따른 막대 그래프로 ERK 2, P-ERK1/2(phosphorylated ERK), K8, P-K8 및 LC3 I/II의 발현 수준을 나타내었다. 웨스턴 블랏 이미지를 분석한 막대 그래프에서 P-ERK 및 P-K8의 발현 수준을 확인할 수 있었다(도 2B). 상기 결과로서 산화 스트레스로 인한 K8의 인산화를 PD98059가 억제하는 것을 확인할 수 있으며, 자가포식(autophagy) 마커인 LC3 I/II의 발현에는 PD98059가 관여하지 않음을 알 수 있었다.
APRE-19 세포 및 인간 조직 유래 RPE 세포(LONZA;194987)에 파라콰트 400 μM와 PD98059 20 μM을 36시간 동안 선택적으로 처리하였다. ARPE-19 세포는 실험적으로 이용하기 위하여 무한증식이 가능토록 유전자조작을 거친 세포주이다. 그러나, 인간 조직 유래 RPE 세포는 사람 안구에서 떼어낸 RPE 조직을 배양하여 얻어낸 것으로 어떠한 유전자 조작을 거치지 않았으므로 인체 내 RPE와 유사한 조건으로 실험하기 위해 이용하였다.
이후 세포의 P-K8(녹색 형광)을 면역화학법으로 염색(Abcam; ab32579)하였다. 핵은 토프로-3(TOPRO-3, 청색 형광)을 이용하여 염색(Invitrogen; T3605)하였다(도 2C). 상기 결과로서 파라콰트에 의해 유도된 망막상피세포의 산화 스트레스 조건하에서, PD98059가 녹색으로 표시되는 K8의 핵 주변 재배열을 억제함을 확인할 수 있었다.
2. PD98059의 간엽세포화, 세포 이동성 및 망막세포 변성 억제 효과 확인
APRE-19 세포 및 인간 조직 유래 RPE 세포에 파라콰트 400 μM과 PD98059 20 μM을 48시간 동안 선택적으로 처리하였다. 세포에서 E-카데린(E-cadherin, 녹색 형광) 및 비멘틴(vimentin, 적색 형광)을 면역화학법으로 염색(Cell signaling; 7832s)하였다. 핵은 토프로-3(청색 형광)을 이용하여 염색하였다(도 3A). 상기 결과로서 파라콰트에 의해 유도된 망막상피세포의 산화 스트레스 조건하에서, PD98059가 간엽세포화의 특징인 E-카데린의 소실을 회복하고 간엽계 세포에서 특이적으로 나타나는 비멘틴 필라멘트의 증가를 억제함이 확인되었다. 따라서 PD98059가 간엽세포화를 감소시킴을 알 수 있다.
또한 파라콰트 400 μM과 PD98059 20 μM을 36시간 동안 선택적으로 처리한 ARPE-19 세포의 세포 이동성을 트랜스웰(transwell)을 이용하여 분석하였다. 이동한 세포의 존재여부는 메틸렌 블루로 염색되었으므로 이미지를 통해 확인하였다(도 3B). 상기 결과로서 파라콰트에 의해 유도된 망막상피세포의 산화 스트레스 조건하에서, PD98059가 증가한 세포 이동성을 감소시킴을 알 수 있다.
7 ~ 9주령 마우스 망막세포에서 밀착연접(tight junction) 마커인 ZO-1(녹색 형광)에 대하여 면역조직화학적 분석(Abcam; ab59720)을 수행하였다. 식염수 처리 그룹은 0.9 % NaCl을 정맥 투여하여 대조군으로 설정하였다. 20 mg/kg의 NaIO3을 정맥에 투여한 마우스 그룹에는 10 mg/kg의 PD98059를 선택적으로 처리하였다. 동물 그룹은 정맥 투여 2주 후 희생시켰다. 형광 이미지는 공초점 현미경(confocal microscope)을 통해 수득하였다(도 3C). 상기 결과로서 NaIO3에 의해 유도된 망막세포의 변성을 PD98059가 복원하는 것을 확인할 수 있었다.
3. 트라메티닙을 이용한 간엽세포화 억제 효과 확인
APRE-19 세포에 파라콰트 400 μM과 트라메티닙 50 nM을 24시간 동안 선택적으로 처리하였다. 웨스턴 블랏에 따른 막대 그래프로 ERK 2, P-ERK1/2(phosphorylated ERK), K8, P-K8 및 LC3 I/II의 발현 수준을 나타내었다. 웨스턴 블랏 이미지를 분석한 막대 그래프에서 P-ERK 및 P-K8의 발현 수준을 확인할 수 있었다(도 4A). 상기 결과로서 산화 스트레스로 인한 K8의 인산화를 트라메티닙이 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
APRE-19 세포에 파라콰트 400 μM과 트라메티닙 50 nM을 36시간 동안 선택적으로 처리하였다. 세포의 P-K8(녹색 형광)을 면역화학법으로 염색하였다(도 4B). 상기 결과로서 파라콰트에 의해 유도된 망막상피세포의 산화 스트레스 조건하에서, 트라메티닙이 녹색으로 표시되는 K8의 핵 주변 재배열을 억제함을 확인할 수 있었다.
APRE-19 세포 및 인간 조직 유래 RPE 세포에 파라콰트 400 μM과 트라메티닙 50 nM을 48시간 동안 선택적으로 처리하였다. 세포에서 E-카데린(녹색 형광) 및 비멘틴(적색 형광)을 면역화학법으로 염색하였다. 핵은 토프로-3(청색 형광)으로 시각화하였다(도 4C). 상기 결과로서 파라콰트에 의해 유도된 망막상피세포의 산화 스트레스 조건하에서, 트라메티닙이 E-카데린의 소실을 회복하고 비멘틴 필라멘트의 증가를 억제함이 확인되었다. 따라서 트라메티닙이 간엽세포화를 감소시킴을 알 수 있다.
4. 제피티닙을 이용한 간엽세포화 억제 효과 확인
실시예 3과 동일하게 수행하되, 트라메티닙 50 nM 대신 제피티닙 10 μM을 사용하였다.
웨스턴 블랏 이미지를 분석한 막대 그래프로 P-ERK 및 P-K8의 발현 수준을 확인할 수 있었다. 도 5A에 따르면 산화 스트레스로 인한 K8의 인산화를 제피티닙이 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
도 5B에 따르면 상기 결과로서 파라콰트에 의해 유도된 망막상피세포의 산화 스트레스 조건하에서, 제피티닙이 녹색으로 표시되는 K8의 핵 주변 재배열을 억제함을 확인할 수 있었다.
도 5C에 따르면 상기 결과로서 파라콰트에 의해 유도된 망막상피세포의 산화 스트레스 조건하에서, 제피티닙이 E-카데린의 소실을 회복하고 비멘틴 필라멘트의 증가를 억제함이 확인되었다. 따라서 제피티닙이 간엽세포화를 감소시킴을 알 수 있다.
EGFR(epidermal growth factor receptor; EGFR)은 세포막에 존재하는 수용체로서 상피세포성장인자(epidermal growth factor; EGF)와 같은 리간드들이 결합하면 자기인산화(auto-phosphorylation)되어 세포 내 여러 신호전달을 촉진하게 되는 것으로 알려져 있다. ERK는 EGFR의 하위 인자 중 하나이므로 제피티닙 또한 산화 스트레스에 의한 망막상피세포의 변성을 억제하여 황반변성 치료제로써의 이용 가능성이 충분히 있는 것으로 볼 수 있다(도 6).

Claims (10)

  1. 트라메티닙(trametinib), 제피티닙(gefitinib), 카너티닙(canertinib), 라파티닙(lapatinib), 에를로티닙(erlotinib), 아파티닙(afatinib), 네라티닙 (neratinib), 셀루메티닙(selumetinib), 레파메티닙(refametinib) 및 PD98059로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 케라틴 8(Keratin 8; K8) 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 케라틴 8 인산화 억제제가 트라메티닙 또는 제피티닙인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 황반변성이 건성 황반변성인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 황반변성이 상피세포의 간엽세포화에 의한 건성 황반변성인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 약학 조성물이 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  6. 케라틴 8(Keratin 8; K8) 인산화 억제 효과를 나타내는 후보물질 선별 단계를 포함하는 황반변성 치료제의 스크리닝 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 후보물질 선별 단계가
    a) 산화 스트레스에 의해 케라틴 8이 인산화된 망막색소상피세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    b) 후보물질 처리 이후 케라틴 8 인산화 억제 여부를 판단하는 단계; 및
    c) 후보물질을 처리한 군에서 처리하지 않은 군에 비해 케라틴 8 인산화가 억제되는 경우, 상기 후보물질이 황반변성 치료 효과가 있다고 판단하는 단계
    를 포함하는 스크리닝 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 b) 단계가
    후보물질 처리 이후 P-ERK1/2(phosphorylated ERK) 또는 P-K8(phosphorylated K8)의 발현량이 감소하면 케라틴 8의 인산화가 억제되는 것으로 판단하는 단계인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 b) 단계가
    후보물질 처리 이후 케라틴 8의 인산화가 억제되면 E-카데린(E-cadherin)의 발현량이 증가하는 것으로 판단하는 단계인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 b) 단계가
    후보물질 처리 이후 케라틴 8의 인산화가 억제되면 비멘틴(vimentin)의 발현량이 감소하는 것으로 판단하는 단계인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
PCT/KR2017/005189 2016-05-19 2017-05-18 케라틴 8 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법 WO2017200325A1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17799682.4A EP3459548A4 (en) 2016-05-19 2017-05-18 PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING KERATIN 8 PHOSPHORYLATION INHIBITOR FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF MACULAR DEGENERATION, AND METHOD OF SCREENING A MEDICAMENT AGAINST MACULAR DEGENERATION
AU2017267166A AU2017267166B2 (en) 2016-05-19 2017-05-18 Pharmaceutical composition containing keratin 8 phosphorylation inhibitor for preventing or treating macular degeneration, and method for screening macular degeneration medicine
CN201780028704.1A CN109152782A (zh) 2016-05-19 2017-05-18 包含角蛋白8磷酸化抑制剂的黄斑变性预防或治疗用药学组合物以及黄斑变性治疗剂的筛选方法
US16/302,934 US10857154B2 (en) 2016-05-19 2017-05-18 Pharmaceutical composition containing keratin 8 phosphorylation inhibitor for preventing or treating macular degeneration, and method for screening macular degeneration medicine
JP2018556969A JP2019518007A (ja) 2016-05-19 2017-05-18 ケラチン８リン酸化抑制剤を含む黄斑変性予防または治療用医薬組成物、および黄斑変性治療剤のスクリーニング方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160061259A KR101796684B1 (ko) 2016-05-19 2016-05-19 케라틴 8 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법
KR10-2016-0061259 2016-05-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017200325A1 true WO2017200325A1 (ko) 2017-11-23

Family

ID=60325962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2017/005189 WO2017200325A1 (ko) 2016-05-19 2017-05-18 케라틴 8 인산화 억제제를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 황반변성 치료제의 스크리닝 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US10857154B2 (ko)
EP (1) EP3459548A4 (ko)
JP (3) JP2019518007A (ko)
KR (1) KR101796684B1 (ko)
CN (1) CN109152782A (ko)
AU (1) AU2017267166B2 (ko)
WO (1) WO2017200325A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102020109157A1 (de) 2020-04-02 2021-10-07 Lts Lohmann Therapie-Systeme Ag Trägerelement für Mikronadeln sowie Mikronadelarray-Einrichtung
CN115869317A (zh) * 2022-12-19 2023-03-31 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） 厄洛替尼在制备预防/治疗视网膜脱离后视网膜下膜产生的药物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090094815A (ko) * 2006-11-09 2009-09-08 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 티로신 키나아제 억제제의 경구 투여를 위한 약제 투여형
WO2010048446A2 (en) * 2008-10-22 2010-04-29 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
KR20140128159A (ko) * 2013-04-26 2014-11-05 건국대학교 산학협력단 노년황반변성의 진단, 치료 및 예방용 조성물 및 노년황반변성에 대한 진단 방법
WO2015036512A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Pharmaceutical compositions containing refametinib

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9508538D0 (en) * 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
US20040136975A1 (en) 2002-03-22 2004-07-15 Duesbery Nicholas S Anthrax lethal factor inhibits tumor growth and angiogenesis
KR100511720B1 (ko) 2002-08-09 2005-09-02 재단법인서울대학교산학협력재단 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 의약 조성물
US7378423B2 (en) * 2004-06-11 2008-05-27 Japan Tobacco Inc. Pyrimidine compound and medical use thereof
US7750018B2 (en) 2006-12-06 2010-07-06 Tactical Therapeutics, Inc Use of carboxiamidotriazole (CAI) orotate in macular degeneration
KR20100004466A (ko) 2008-07-04 2010-01-13 인하대학교 산학협력단 신생혈관형성 억제 활성을 갖는 약학적 조성물
KR101244711B1 (ko) 2010-09-30 2013-03-18 강원대학교산학협력단 콩나물 추출물을 포함하는 황반변성 치료 및 예방용 조성물
CA2820709C (en) 2011-02-28 2016-02-16 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Substituted quinoline compounds and methods of use
DK2797957T3 (da) 2011-11-23 2019-09-23 Medimmune Llc Bindingsmolekyler specifikke for her3 og anvendelser deraf
KR101388635B1 (ko) 2012-07-25 2014-04-25 서울대학교산학협력단 다프난 다이터페노이드（Ｄａｐｈｎａｎｅ ｄｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄ）계 물질의 상피세포 성장인자 수용체（ＥＧＦＲ） 저해제인 제피티닙（Ｇｅｆｉｔｎｉｂ） 내성 인간 폐암 세포에 유용한 항암제
KR101415221B1 (ko) 2012-08-07 2014-07-09 한국표준과학연구원 무기 나노입자를 유효성분으로 함유하는 혈관 신생 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR101483581B1 (ko) 2013-05-23 2015-01-16 대한민국 눈큰흑찰(흑찰거대배아미) 현미 또는 이의 추출물을 포함하는 황반변성의 예방 또는 치료용 조성물
CA2929181A1 (en) * 2013-11-13 2015-05-21 Novartis Ag Mtor inhibitors for enhancing the immune response
GB201320729D0 (en) * 2013-11-25 2014-01-08 Cancer Rec Tech Ltd Therapeutic compounds and their use
US9750761B2 (en) * 2014-05-21 2017-09-05 University Of Rochester LDH inhibitors as treatment for fibrosis and fibrotic-related disorders
KR101627409B1 (ko) 2014-05-23 2016-06-03 이화여자대학교 산학협력단 메트포르민을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090094815A (ko) * 2006-11-09 2009-09-08 애보트 게엠베하 운트 콤파니 카게 티로신 키나아제 억제제의 경구 투여를 위한 약제 투여형
WO2010048446A2 (en) * 2008-10-22 2010-04-29 Genentech, Inc. Modulation of axon degeneration
KR20140128159A (ko) * 2013-04-26 2014-11-05 건국대학교 산학협력단 노년황반변성의 진단, 치료 및 예방용 조성물 및 노년황반변성에 대한 진단 방법
WO2015036512A1 (en) * 2013-09-13 2015-03-19 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Pharmaceutical compositions containing refametinib

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DRIDI, S. ET AL.: "ERK1/2 Activation is a Therapeutic Target in Age-related Macular Degeneration", PNAS, vol. 109, no. 34, 2012, pages 13781 - 13786, XP055362258 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020196734A (ja) 2020-12-10
EP3459548A4 (en) 2019-05-22
EP3459548A1 (en) 2019-03-27
JP2019518007A (ja) 2019-06-27
AU2017267166B2 (en) 2019-08-22
AU2017267166A1 (en) 2018-12-06
CN109152782A (zh) 2019-01-04
US20190275044A1 (en) 2019-09-12
US10857154B2 (en) 2020-12-08
KR101796684B1 (ko) 2017-11-10
JP2022160502A (ja) 2022-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Johnson et al. Neuroprotective effects of intravitreal mesenchymal stem cell transplantation in experimental glaucoma
CN108135737B (zh) 用于治疗翼状胬肉的组合物和方法
JP2022160502A (ja) ケラチン８リン酸化抑制剤を含む黄斑変性予防または治療用医薬組成物、および黄斑変性治療剤のスクリーニング方法
JP2013545792A (ja) 眼疾患の処置および防止方法
Namavari et al. Cyclosporine immunomodulation retards regeneration of surgically transected corneal nerves
WO2014038866A1 (ko) 연골세포 유래 세포외 기질막을 이용한 신생혈관질환 치료용 조성물 및 각막 또는 결막 이식재
TOPP et al. Herpes virus infection of RPE and MDCK cells: polarity of infection
WO2013191401A1 (ko) 이매티닙 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 혈관 투과성 질환의 치료 또는 예방용 조성물
KR101951787B1 (ko) mTOR 저해제를 함유하는 황반변성 치료용 의약조성물
JP2023035974A (ja) ナノ低分子ペプチドｆｇ及びその眼底血管疾患の治療や予防用薬物の調製への応用
KR20040014600A (ko) 알파1 수용체 차단약을 유효 성분으로 하는 시신경 보호제
WO2018048046A2 (ko) mTOR 저해제를 함유하는 황반변성 치료용 의약조성물
WO2017209577A1 (ko) 각막이상증 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2023163562A1 (ko) 핵산 복합체를 포함하는 알츠하이머병의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023163563A1 (ko) 핵산 복합체를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 조성물
Bourcier et al. Expression of neurotensin receptors in human corneal keratocytes
WO2022086039A1 (ko) Fas 신호전달 억제용 펩타이드를 포함하는 황반변성 예방 또는 치료용 조성물
Zhu et al. Inhibition of TGF-β2–Induced Trabecular Meshwork Fibrosis by Pirfenidone
WO2023132673A1 (ko) 핵산 복합체를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2014193061A1 (ko) Ｅｂｖ 감염 인간각막상피세포를 이용한 혈관신생 질환용 세포 모델
KR102259058B1 (ko) Herpud1 억제제를 유효성분으로 포함하는 결핵의 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2022154267A9 (ko) ACE2에 결합하는 SARS-CoV2에 대한 항 바이러스 항체 및 이의 용도
US20150284393A1 (en) Methods for treating eye disorders
WO2015088094A1 (ko) 녹내장 여과수술 후 흉터 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2012115439A9 (en) Composition comprising expression or activity regulators of akap12 for treating central nerve system diseases

Legal Events

Date Code Title Description
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018556969

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17799682

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017267166

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20170518

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017799682

Country of ref document: EP

Effective date: 20181219