JP2013545792A

JP2013545792A - 眼疾患の処置および防止方法

Info

Publication number: JP2013545792A
Application number: JP2013543824A
Authority: JP
Inventors: ピーター、アダムソン; ダニエル、リー
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2013-12-26
Also published as: WO2012080497A3; EP2651403B1; ES2847883T3; EP2651403A2; WO2012080497A2; US20130267544A1

Abstract

本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ２の阻害により眼疾患を処置および防止するのに有用な組成物および方法を提供する。該組成物および方法は、限定されるものではないが、黄斑浮腫、ぶどう膜炎、および糖尿病性網膜症等の疾患および障害を処置および防止するのに有用である。

Description

本発明は、広義には、眼疾患を処置および／または防止する方法に関し、より具体的には、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の発現および／または活性を阻害する薬剤を用いた眼疾患の処置および／または防止に関する。

糖尿病性網膜症で起こる血管変性プロセスは完全には理解されていないが、状態の重症度は高血糖の程度および期間に直接的な関係がある。糖尿病性網膜症の後期では視力障害が通常起こる。黄斑浮腫発症の直接の原因は内側血液網膜関門（ｉＢＲＢ）破綻であり、一方、疾患の血管新生期（増殖性糖尿病性網膜症；ＰＤＲ）には新規血管の異常な成長があり、これは視覚を脅かす硝子体出血および牽引性網膜剥離を生じさせる。

黄斑浮腫は、内側網膜虚血および低酸素症により駆動されるサイトカインおよび成長因子（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）が最もよく知られている）の分泌増加の結果起こる。黄斑浮腫は、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、炎症、手術後、牽引等の結果として起こり得る。糖尿病により起こり得る黄斑浮腫は、糖尿病患者の視力喪失の主な原因である。更に、黄斑浮腫は、糖尿病性網膜症の全ての段階で起こり得、疾患が臨床的に出現する前にも起こり得る（Antonetti et al., 2006；Curtis et al., 2008）。

病状発現前の黄斑浮腫を有する無症候性の多くの患者は、ある程度の視力喪失が既に起こるまで処置を求めることができない。視覚を脅かす糖尿病性網膜症はレーザー光凝固、コルチコステロイド、ＶＥＧＦ阻害剤、および硝子体網膜手術によりある程度処置または抑制することができるが、これらの治療介入は主に最終段階の疾患に焦点があり、視覚を脅かす大きな副作用があり、初期および可逆的であり得る血管変性病態に取り組むものではない（Chung et al., 2008）。持続的な網膜虚血又は黄斑浮腫の正味の影響は、視力喪失につながる神経網膜層の神経変性である。したがって、より負担の少ない処置選択肢によって理想的には優れた結果（視力等）が得られる、黄斑浮腫を処置するための満たされていないニーズが存在する。

ｉＢＲＢの破綻は、糖尿病性網膜症および他の虚血性または炎症性の網膜疾患（例えば網膜中心静脈閉塞症およびぶどう膜炎）の初期段階の最も重要な病態生理学的変化の１つである。糖尿病患者およびストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病モデル動物の両方で、血管透過性および明白なｉＢＲＢ機能障害が観察されている。ｉＢＲＢ破綻の正確な機構はほとんど明らかになっていないが、機構の一部が、密着結合の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の消失および細胞喪失を含む内皮機能障害につながるＶＥＧＦ（および他のサイトカイン）レベルに関係することが知られている。眼の網膜血管は神経網膜にあり、これは中枢神経系の延長部分であるので、これらは、脳のＣＮＳ血管と解剖学的に同じＣＮＳ型の血管である。したがって、内側網膜（血管）関門は、前側（ａｎｔｅｒｉｏｒ）血液網膜関門と呼ばれ、脳内のそれらの血管は血液脳関門と呼ばれる。前側血液網膜関門および血液脳関門はどちらも、ＣＮＳ関門の関門特性がかなり高められている点で、他の全ての血管床と比べて独特である。この重要な解剖学的特徴は、透過性が非常に低いイオン的に堅固な関門を提供する内皮密着結合の発達によって実現されている。この信じられないほど低い透過性はＣＮＳ恒常性にとって重要であり、この透過性の乱れは、ＣＮＳ浮腫および糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）等の深刻な事象につながり得る。

酸化ストレスが大きな関心を集めており、これは主に、公衆衛生に大きく影響する慢性的病状（例えば、糖尿病およびアテローム性動脈硬化症）および通常の老化の主要な原因としての役割が受け入れられているためである。したがって、酸化ストレスの増加は、糖尿病性循環器疾患（Pennathur et al., 2007）ならびにおそらく糖尿病性血管疾患、例えば糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、および糖尿病性腎症といったその他の合併症の重要な寄与因子であると考えられる。実際、真性糖尿病および高コレステロール血症の両方に罹患している個体は大血管のアテローム硬化合併症のリスクが高い（Moreno et al., 2000）。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）オキシダーゼの活性化が、高グルコースおよび終末糖化産物（ＡＧＥ）に応答した血管系における主要な活性酸素種（ＲＯＳ）生成源として関係付けられている（Dave et al., 2007）。ＡＧＥは、糖尿病性網膜症に強く関係付けられており、実際、ＡＧＥは糖尿病でダメージを受けた種々の臓器内に蓄積し、これらのＡＧＥの蓄積率は高血糖により促進される。ＡＧＥは、腎臓、網膜、およびアテローム斑を含む糖尿病合併症のほとんどの部位に蓄積する（Hammes et al., 1999；Bucala et al., 1995；Makita et al., 1994）。ＡＧＥは、２型糖尿病患者では網膜血管に局在し、網膜症の程度に相関することが見出されている（Murata et al., 1997；Stitt 2001）。非糖尿病動物に、予め形成したＡＧＥアルブミンを注入すると、この付加体は周皮細胞の周辺および内部に蓄積し、ＡＧＥ受容体と共局在し、基底膜の肥厚を誘導し、内側血液網膜関門の破綻の原因となる（Stitt et al., 1997；Stitt et al., 2000）。更に、ＡＧＥに曝された網膜血管内皮細胞は異常な内皮型一酸化窒素合成酵素発現を示し（Chakravarthy et al., 1998）、これにより、糖尿病の網膜微小循環で見られる血管調節異常の一部が説明されると考えられる。更に、インビトロ実験でＡＧＥ曝露後に網膜細胞中でＶＥＧＦがアップレギュレートされることが示されており（Lu et al., 1998）、このアップレギュレーションは、網膜血管新生を促進し得、タンパク質に対する網膜関門の透過性を上昇させ得る。

タンパク質、脂質、およびＤＮＡ上でのＡＧＥ形成は、高分子機能に大きな影響を与えることがあり（Paget et al., 1998；Giardino ert al；1994；Addel-Wahab et al., 1996）、生理的条件下で一定に形成されている。組織からの老化した糖化修飾分子の除去および／または存在するＡＧＥ架橋結合の分解によってそれらの有害な影響を抑えるするように複雑な受容体系が進化した。そのような受容体は、ＡＧＥ関連生物学および糖尿病に関連する病態学において重要な役割を果たす（Vlassara et al., 2001；Schmidt et al., 2000；Sano et al., 1999）。複数のＡＧＥ結合分子が報告されており、後期糖化生成物により生じる有害作用の多くはＡＧＥ受容体に仲介されると考えられている。終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ）（Schmitd et al., 1994）がこれらの受容体の中で最もよく特徴が解析されている。しかし、一部または全てのＡＧＥ受容体が、ＡＧＥに仲介される細胞および組織の機能障害を促進または制限する働きをするのかどうかは議論の余地がある。ＡＧＥ受容体の調節的役割およびシグナル伝達経路の解明は、鋭意研究中の領域であり、最近の証拠から、ＡＧＥ受容体結合が、タンパク質キナーゼＣの活性化（Mene et al., 1999；Scivittaro et al., 2000）、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）／シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）のチロシンリン酸化（Huang et al., 1999）、ホスフォチジルイノシトール３’キナーゼのＲａｓへの動員（Deora et al., 1998）、転写活性化（Lander et al., 1997）、ならびにＮＦκＢおよびＡＰ−１に関連する酸化ストレスカスケードの誘導（Bierhaus et al., 2007）、に関連する重要なシグナル伝達経路を開始させることができることが示唆されている。

酸化ストレスが増大すると、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）内に含まれるリン脂質等の脂質が酸化される。リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ_２（Ｌｐ−ＰＬＡ_２）は、以前には当該技術分野で血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦアセチルヒドロラーゼ）としても知られ、リポタンパク脂質またはリン脂質の加水分解に関与するホスホリパーゼＡ_２酵素のスーパーファミリーのメンバーである。Ｌｐ−ＰＬＡ_２は、マクロファージ、単球、リンパ球、Ｔリンパ球、および肥満細胞を含む傷害に対する全身性炎症反応において主要な役割を果たす複数の細胞によって分泌され、ヒト循環中でＬＤＬに主に結合することが分かっている（Wilensky et al., 2009）。

Ｌｐ−ＰＬＡ２は独特であり、酸化リン脂質は切断するが非修飾リン脂質は切断せず、かなりの量の非エステル型遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）およびリゾホスファチジルコリン（リゾＰＣ）を生成することが示されており、これらはどちらも炎症促進性の脂質である。リゾＰＣは、例えば、白血球活性化、アポトーシス誘導、および内皮機能障害の仲介に関連付けられている（Wilensky et al., 2009；Lavi et al., 2007）。興味深いことに、左主幹冠動脈および冠状静脈洞から同時に血漿サンプルを採取した場合、リゾＰＣの局所的純生産量が冠状動脈内皮機能障害と有意に相関することが示されている。この臨床的観察は、リゾＰＣが内皮型一酸化窒素合成酵素発現のダウンレギュレーション、内皮ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性化、および内皮細胞遊走の阻害を引き起こすことを示すインビトロ実験と一致していた。したがって、Ｌｐ−ＰＬＡ２は、血管炎症およびＲＯＳ生成増加の連続サイクルを増強し得るリゾＰＣを産生することにより、糖尿病に関連する組織損傷の一因となり得る。

Ｌｐ−ＰＬＡ２がＬＤＬと循環し（Wilensky et al., 2009）、酸化リポタンパク質脂質に対するその酵素活性の結果、炎症促進性脂質の生成に特異的に影響を与えることを考えると、ヒトにおいてＬＤＬを低下させるが抗炎症薬としても作用することが示されているロバスタチン（ＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤、スタチン）によるｄｂ／ｄｂマウスの処置が、網膜血管漏出の低減および網膜炎症の点においても有効であることは注目に値する（Li et al., 2009）。ロバスタチン処置は、血清コレステロールレベルを有意に低下させ、それが網膜におけるロバスタチンの有益な効果に寄与したのかも知れない。ｄｂ／ｄｂマウスは、高脂血症でもある２型糖尿病の詳細に明らかにされている遺伝的モデルである。同様な知見は、Ｂ１０ＲＩＩＩマウスにおけるぶどう膜炎誘発血液網膜関門破綻においても指摘されている（Gegg et al., 2005）。

局所的な炎症プロセスが糖尿病性網膜症の発症において役割を果たすという考えが確立されつつあり、白血球停滞（網膜血管の管腔面への白血球の接着）および血管透過性増大を引き起こす多くの炎症性メディエーターに糖尿病性眼疾患が関連するという知見を含む、この仮説を裏付ける証拠が急速に蓄積されつつある。この新しい仮説は、糖尿病性網膜症の病理発生への新たな洞察を与え、眼の疾患を阻害するための新規な標的を提供する。

本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ２の阻害、例えばＬｐ−ＰＬＡ２タンパク質の発現および／または活性の阻害により眼の疾患および障害を処置および／または防止するための方法に関する。特定の態様では、本発明の方法により処置および／または防止される眼疾患は内側血液網膜関門（ｉＢＲＢ）の破綻に関連する。具体的には、そのような疾患には、例えば、限定されるものではないが、あらゆる原因による、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等が含まれる。

別の態様では、全身性炎症疾患、例えば若年性関節リウマチ、炎症性腸疾患、川崎病、多発性硬化症、サルコイドーシス、多発性動脈炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、全身性エリテマトーデス、フォークト・小柳・原田症候群、ライム病、ベーチェット病、強直性脊椎炎、慢性肉芽腫性疾患、付着部炎が、網膜に影響するぶどう膜炎の原因であり得、これは黄斑浮腫を生じ得る。本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ２の阻害、例えばＬｐ−ＰＬＡ２タンパク質の発現および／または活性の阻害によりぶどう膜炎を処置および／または防止する方法に関する。

本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ２の阻害、例えばＬｐ−ＰＬＡ２タンパク質の発現および／または活性の阻害により眼の疾患および障害を処置および／または防止する方法に関する。具体的な態様では、本発明の方法により処置および／または防止される眼疾患としては、限定されるものではないが、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症、アーヴァイン−ガス症候群（白内障後および手術後）、色素性網膜炎、扁平部炎、バードショット脈絡網膜炎、網膜上膜、脈絡膜腫瘍、嚢胞性黄斑浮腫、傍中心窩毛細血管拡張症（ｐａｒａｆｏｖｅａｌｔｅｌｅｎｇｉｅｃｔａｓｉｓ）、牽引性黄斑症、硝子体黄斑牽引症候群、網膜剥離、視神経網膜炎、特発性黄斑浮腫等が含まれる。

一態様では、本明細書に開示の方法は、眼疾患の処置および／または防止が必要な対象に、Ｌｐ−ＰＬＡ２を阻害する薬剤、例えばＬｐ−ＰＬＡ_２の発現および／またはＬｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の活性を阻害する薬剤、を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる。本発明は疾患の如何なる特定の段階（例えば、初期または後期）にも限定されることは意図されない。

いくつかの態様では、本明細書中に開示されるように、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害により、例えばＬｐ−ＰＬＡ_２の発現阻害および／またはＬｐ−ＰＬＡ_２のタンパク質活性阻害によりｉＢＲＢ漏出を防止する方法が提供される。したがって、いくつかの態様は、酵素活性をブロックすることによりＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する方法を提供し、いくつかの態様は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２ＲＮＡの発現を低減および／またはダウンレギュレートすることによりＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する方法を提供する。いくつかの態様では、ｉＢＲＢ漏出またはｉＢＲＢ透過性の防止および／または低減により、糖尿病性眼疾患に関連する症状が防止および／または軽減される。

別の態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の活性または発現を阻害する薬剤を投与される対象はヒトである。

別の態様では、本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の活性および／または発現を阻害する薬剤を含んでなる医薬組成物を対象に投与することを含んでなる、黄斑浮腫に罹患しているまたは黄斑浮腫のリスクがある対象を処置および／または防止する方法であって、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の阻害により黄斑浮腫の症状が軽減または停止する、方法を提供する。いくつかの態様では、黄斑浮腫は糖尿病性眼疾患に関連するが、糖尿病性網膜症に関連しない。別の態様では、黄斑浮腫は糖尿病性網膜症に関連する。別の態様では、黄斑浮腫はぶどう膜炎に関連する。更に別の態様では、黄斑浮腫は任意の他の原因、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等によるものであり得る。

別の態様では、本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の発現および／または活性を阻害する薬剤を含んでなる医薬組成物を対象に投与することを含んでなる、それを必要とする対象において内側血液網膜関門の破綻に関連する疾患または障害を処置および／または防止する方法を提供する。

いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の発現を阻害することができ、例えばＬｐ−ＰＬＡ_２ＲＮＡが翻訳されてＬｐ−ＰＬＡ_２タンパク質が産生されるのを阻害することができる。別の態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤はＬｐ−ＰＬＡ_２タンパク質活性を阻害することができる。あらゆる薬剤が本明細書に開示の方法における使用に包含される。いくつかの態様では、薬剤は、小分子、核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、またはその変異体もしくは断片であり得る。いくつかの態様では、薬剤は核酸薬剤、例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはリボザイム、またはその変異体である。

いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２のタンパク質活性を阻害する薬剤は、小分子、例えば、限定されるものではないが、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の可逆的または不可逆的な小分子阻害剤である。いくつかの態様では、そのような小分子はピリミジオン系化合物である。いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の小分子阻害剤は、例えば、限定されるものではないが、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−［［（４−フルオロフェニル）メチル］チオ］−４，５，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１Ｈ−シクロペンタピリミジン−１−アセトアミド（別名ＤａｒａｐｌａｄｉｂまたはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８４８）またはその塩である（米国特許第６，６４９，６１９号参照）。

いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の小分子阻害剤は、例えば、限定されるものではないが、２−［［（２，３−ジフルオロフェニル）メチル］チオ］−Ｎ−［１−（２−メトキシエチル）−４−ピペリジニル］−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１（４Ｈ）−キノリンアセトアミド（別名Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド）（別名ＲｉｌａｐｌａｄｉｂまたはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’０３２）またはその塩である（米国特許第７，２３５，５６６号参照）。

いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の小分子阻害剤は、例えば、限定されるものではないが、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２−［［（４−フルオロフェニル）メチル］チオ］−５−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル］−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１（４Ｈ）−ピリミジンアセトアミド（別名Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５）またはその塩である（米国特許第６，９５３，８０３号参照）。

いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の小分子阻害剤は、例えば、限定されるものではないが、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−｛２−［２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル］−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジン−１−イル｝−Ｎ−｛［４’−（トリフルオロメチル）−４−ビフェニリル］メチル｝アセトアミド酒石酸水素塩（あるいは、Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４Ｈ−クニナゾリン−１−イル）−Ｎ−（４’−クロロ−ビフェニル−４−イルメチル）−アセトアミド酒石酸水素塩）（別名Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９）またはその塩である。

Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害剤を含んでなる医薬組成物を対象に投与するいくつかの態様では、方法は、更なる治療剤、例えば、限定されるものではないが、あらゆる原因による、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；ＡＭＤ；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等を含む眼疾患の処置に使用される治療剤を対象に投与することを更に含んでなってよい。眼疾患を処置するための治療剤の投与には、特定の手法の応用が含まれ得ると理解され、そのような手法としては、例えば、限定されるものではないが、網膜焦点レーザー光凝固、汎網膜光凝固、トリアムシノロン等のステロイドの硝子体内投与、フルオシノロンアセトニドを含む硝子体内ステロイドインプラント、ならびにルセンティス（商標）、アバスチン（商標）、およびアフリベルセプト（商標）等の抗ＶＥＧＦ治療薬の硝子体内投与が挙げられる。

いくつかの態様では、本明細書に記載の黄斑浮腫、糖尿病性眼疾患、糖尿病性網膜症、およびその他の眼の疾患または障害を処置および／または防止するための本明細書に開示の方法は、対象、例えば哺乳動物対象に適用可能である。いくつかの態様では、対象はヒトである。

糖尿病／高コレステロール血症（ＤＭＨＣ）が血液脳関門（ＢＢＢ）破綻を引き起こし、脳組織への血漿の流入およびＩｇＧのニューロンへの結合を生じさせることの証拠を示す図である。ＤＭＨＣブタの種々の脳領域全体で、ＩｇＧ免疫陽性の微小血管漏出が共通して観察される。観察された漏出の数および脳実質への血漿流入の程度または規模は大きく異なり、これらの漏出が生じる場所という点で、これらの漏出の散発的または予測不可能な性質を裏付けている。赤色の輪郭は、小さな血管周囲血漿漏出クラウド（ｃｌｏｕｄ）がある孤立した小さな細動脈を囲んでいる。ニューロン（暗い茶色の点）が、漏出領域で強くＩｇＧ陽性である。

Ｄａｒａｐｌａｄｉｂが皮質中の細動脈からの漏出密度を低減することを示す図である。（上側パネル）：皮質中の細動脈漏出密度（平方ｍｍ当たりの漏出細動脈の数）はＤＭＨＣ、Ｄａｒａｐｌａｄｉｂ処置ＤＭＨＣ（１０ｍｇ／ｋｇ／日で２４週間）、および非処置対照ブタの間で異なっていた。細動脈が血管性漏出の検出可能な主な部位である。薬物処置群では細動脈漏出密度が他の群と比べて幾分低下していた。

Ｄａｒａｐｌａｄｉｂが細動脈から脳に漏出する物質の量を低減することを示す図である。同様に、細動脈漏出の程度（すなわち、細動脈から漏れる物質の量）も、Ｄａｒａｐｌａｄｉｂ（１０ｍｇ／ｋｇ／日で２４週間）で処置されたＤＭＨＣブタ脳の大脳皮質で幾分低下していた。

ブタ大脳皮質中のニューロン内Ａβ４２を示す図である。これらの実験中で一貫している知見は、優性な神経細胞型（錐体ニューロン）がブタ脳中でＡβ４２を含む唯一の神経細胞型であることである。

脳全体におけるＡβ４２含有ニューロンの相対密度を示す図である。Ｄａｒａｐｌａｄｉｂ（１０ｍｇ／ｋｇ／日で２４週間）は、ＤＭＨＣブタの脳全体でブタ大脳皮質中のＡβ４２陽性ニューロンの密度を対照に匹敵するレベルまで低下させた。

脳全体におけるＡβ４２を含むニューロンの密度を示す図であり、大脳皮質層２〜３（Ｌ２）と層４〜６（Ｌ６）を比較している。（下側パネル）：Ａβ４２陽性ニューロンの密度はＤＭＨＣ群の皮質層２〜３でわずかに大きいが、これはこの層の錐体ニューロンの大きさが一般的に小さいことから予想されるものである。

脳全体のＡβ４２の総量（Ａβ４２負荷量）を示す図である。Ｄａｒａｐｌａｄｉｂ（１０ｍｇ／ｋｇ／日で２４週間）はＤＭＨＣブタの大脳皮質中のＡβ４２の総量を減少させた。

脳全体でのＡβ４２含有ニューロン当たりのＡβ４２の量を示す図である。この減少は明らかに、ニューロン１個当たりのＡβ４２の量の減少によるものではなく、Ａβ４２が負荷されたニューロンの数の減少によるものである（上の図４でも示されている）。

アルツハイマーモデルウサギにおける１０週間のＬｐ−ＰＬＡ２レベルを示す図である。５群に分けて毎日皮下注射を受けた、コレステロールを添加した食餌および硫酸銅で置き換えた飲料水で処置したウサギ４０頭のＬｐ−ＰＬＡ２。Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９を受けた２つの群でＬｐ−ＰＬＡ２活性レベルが有意に低かった。データは平均値±ＳＥＭで表されている。

Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤化合物の賦形剤で処置したウサギにおけるナトリウム蛍光の蓄積を示す図である。図５に示したものと同じデータであり、通常の餌を与えた動物およびＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９処置（１０ｍｇ／ｋｇ／日）ありまたはなしの高コレステロールＣｕＳＯ_４添加食を与えた動物動物におけるＮａＦ蓄積。データは、通常の餌を与えられた動物のＢＢＢ透過性をゼロに設定して標準化されている。個々のウサギの個々のデータポイントを示す。線は群の平均値を示す。

ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処置後のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットにおける高血糖症の誘発を示す図である。データは平均値±ＳＥＭで表されている。

ＳＴＺによる高血糖症誘発後のＳＤラットにおける血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の上昇およびその後のＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ）投薬による抑制を示す図である。データは平均値±ＳＥＭである。

図１０Ａ〜Ｂは、賦形剤またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤化合物で処置した糖尿病ラットにおける血漿から網膜へのエバンスブルー−アルブミンの血管外漏出を示す図である。３１日間の高血糖および２８日間のＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／日）での動物処置の、ＳＤラットにおけるエバンスブルー色素の網膜実質への血管外漏出に対する影響。（Ａ）は個々の動物の値を示し、線は平均値を示す。（Ｂ）は平均値±ＳＥＭを示す。

図１１Ａ〜Ｂは、光干渉断層法（ＯＣＴ）で評価した糖尿病ラットにおける網膜下液蓄積の発生率を示す図である。（Ａ）正常血糖、高血糖、ならびに１４日目（実験１）および１７日目（実験ＩＩ）にＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で処置された高血糖ＳＤラットにおいてＯＣＴイメージングで評価した網膜液蓄積率（試験した全動物の百分率）。（Ｂ）ＳＴＺ処置ＳＤラットにおける１７日目の網膜液蓄積を示す最初の実験。

図１２Ａ〜Ｃは、賦形剤またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤化合物で処置した糖尿病ラットにおいて光干渉断層法（ＯＣＴ）で評価した神経網膜厚の減少を示す図である。（Ａ）は、ＳＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐ．で３日間）で糖尿病を誘発し、その後、０日目から賦形剤で、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐ、４日目から）で、またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐ、８日目から）で処置した動物において経時的にＯＣＴで評価した神経網膜層の厚さを示す図である。糖尿病誘発（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐ．、３日間）後、０日目から賦形剤で、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐ、４日目から）で、またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐ、８日目から）で処置した、糖尿病誘発１０日後（Ａ）および１８日後（Ｂ）の神経網膜層の厚さを示す。ＳＴＺで処置しなかった動物を用いてベースラインを０に設定した。*ｐ＜０．０５、賦形剤のみで処置した動物との比較。データは平均値±ＳＥＭで表されている。

図１３Ａ〜Ｂは、賦形剤またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤化合物で処置した糖尿病ラットの光干渉断層法で評価した神経網膜厚の減少を示す図である。（Ａ）は、非処置動物またはＳＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐ．、３日間）で糖尿病を誘発した動物（処置動物はその後Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）または賦形剤で４日目からｉ．ｐ．で処置した）のＯＣＴで評価した経時的な神経網膜層の厚さを示す。***ｐ＜０．００１、ＳＴＺ処置および賦形剤処置動物対ＳＴＺ処置およびＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５動物。###ｐ＜０．００１、非ＳＴＺ処置動物対ＳＴＺ処置動物、二元配置反復ＡＮＯＶＡ。データは平均値±ＳＥＭで表されている。（Ｂ）は、賦形剤処置対Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）処置糖尿病動物の１３日目および２８日目の網膜厚を比較を示している。***Ｐ＜０．００１；**Ｐ＜０．０１、ＳＴＺ対ＳＴＺ＋Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５、Ｔｕｋｅｙの事後検定。

図１４Ａ〜Ｂは、リゾＰＣ添加後のインビトロ血液脳（網膜）関門モデルを介する経内皮電気抵抗およびルシファーイエローの輸送を示す図である。（Ａ）は、内皮単分子層へのリゾＰＣ添加に応答した、培養ラット脳アストロサイト（底部のウェル）存在下で、トランスウェル・インサートのアピカル側で培養したラット脳微小血管内皮細胞一次培養を横切るルシファーイエロートレーサーの輸送を示す。*ｐ＜０．００１、賦形剤処置との比較。（Ｂ）は、内皮細胞単分子層へのリゾＰＣ添加の前および後の両方における経内皮電気抵抗を示す。*ｐ＜０．００１、リゾＰＣ添加前のＴＥＥＲとの比較。データは平均値±ＳＥＭで表されている。有意差の決定はｔ検定による）。

ＢｒｏｗｎＮｏｒｗａｙラットの網膜実質へのエバンスブルー色素血管外漏出に対する、３１日間の高血糖および１４日間のＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＱＤ）による動物処置の影響を示す図である。パネルは個々の動物の値を示しており、線は平均値および値±ＳＥＭを示す。ＮＤＢＣＯＮ：非糖尿病；ＤＢ＋プラセボ：賦形剤で処置した糖尿病対照；ＤＢ＋薬物：糖尿病対照プラス１０ｍｇ／ｋｇのＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（薬物）（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．ＱＤ）。４週間の実験で、糖尿病賦形剤処置動物対糖尿病Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５処置動物は統計的に異なっていた。ｐ＜０．０４、ｔ検定。

高血糖ＢｒｏｗｎＮｏｒｗａｙラットの網膜血管からのアルブミン漏出に対する２０ｍｇ／ｋｇのＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（ＱＤ、ｉ．ｐ．）の処置効果を示す、網膜組織像を示す図である（２週間のデータ）。凍結切片：網膜血管をＩＢ４染色（赤色）およびラットアルブミン（緑色）で同定した。糖尿病性網膜では、両方の標識の強い共局在があり、アルブミンが網膜血管系から漏出していることを示しているが、薬物処置動物では、アルブミンは血管内に限定されており、網膜血管と共局在している。

高血糖ＢｒｏｗｎＮｏｒｗａｙラットの網膜血管からのアルブミン漏出に対する１０ｍｇ／ｋｇＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（ＱＤ、ｉ．ｐ．）の処置効果を示す網膜組織像（４週間）を示す図である。凍結切片：網膜血管をＩＢ４染色（赤色）およびラットアルブミン（緑色）で同定した。非糖尿病動物では、アルブミンが網膜血管と共局在しているが、糖尿病網膜では、標識はほとんど共局在しておらず、このことは網膜血管系からアルブミンが漏出していることを示している。薬物処置動物は、アルブミンが血管内に限定されており、網膜血管と共局在している非糖尿病対照と類似している。

発明の具体的説明

本発明者らは、眼疾患、特に、あらゆる原因による、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；ＡＭＤ；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等、並びに内側血液網膜関門の破綻に関連する障害の処置および／または防止にＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤を用いることができることを見出した。

定義
利便性のために、本願全体（明細書、実施例、および特許請求の範囲を含む）で使用される特定の用語をここにまとめる。特に断りのない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

「疾患」または「障害」という用語は本明細書中で交換可能に使用されており、機能のパフォーマンスを妨げるもしくは妨害する且つ／または罹患している人または人に接触した人に不快感、機能不全、苦痛（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）、更には死等の症状を生じさせる、体の状態または臓器の一部の状態のあらゆる変化を意味する。疾患または障害は、異常（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ）、慢性的な病的状態（ａｉｌｉｎｇ）、軽い病気（ａｉｌｍｅｎｔ）、疾病（ｍａｌａｄｙ）、障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、病（ｓｉｃｋｎｅｓｓ）、病気（ｉｌｌｎｅｓｓ）、病気の訴え（ｃｏｍｐｌａｉｎ）、または詐病（ａｆｆｅｃｔａｔｉｏｎ）にも関し得る。

「血液脳関門（ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒ）」または「ＢＢＢ」という用語は本明細書中において交換可能に使用されており、脳組織中を移動する際に血液と脳組織の間で交換されるものを厳密に制限し且つしっかりと制御する、血管中に存在する透過性の関門を指して使用される。血液脳関門の構成要素には、全血管の最内側の裏層（ｌｉｎｉｎｇ）を形成する内皮細胞、ＢＢＢに構造的関連のある隣接内皮細胞間の密着結合、内皮細胞の基底膜、および血管の露出した外側表面のほぼ全てをカバーする近傍のアストロサイトから延びた足突起が含まれる。ＢＢＢは、Ｉｇ、抗体、補体、アルブミン、薬物等のほとんどの巨大分子および小分子を含む血液中のほとんどの物質が脳組織に入るのを防ぐ。

「内側血液網膜関門（ｉｎｎｅｒｂｌｏｏｄ−ｒｅｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒ）」または「ｉＢＲＢ」という用語は本明細書中において交換可能に使用されており、網膜組織中を移動する際に血液と網膜組織の間で交換されるものを厳密に制限し且つしっかりと制御する、血管中に存在する透過性関門を指して使用される。血液網膜関門の構成要素には、全血管の最内側の裏層を形成する内皮細胞、ｉＢＲＢに構造的関連のある隣接内皮細胞間の密着結合、内皮細胞の基底膜、ならびに血管の露出した外側表面のほぼ全てをカバーする、近傍のアストロサイト細胞および周皮細胞（グリア細胞を含む）から延びた足突起が含まれる。ｉＢＲＢは、Ｉｇ、抗体、補体、アルブミン、薬物等のほとんどの巨大分子および小分子を含む血液中のほとんどの物質が網膜組織に入るのを防ぐ。

「異常ＢＢＢ」という用語は、例えば、機能的ＢＢＢを通常は通過する分子（例えば栄養素およびグルコース等の糖）をＢＢＢが通過させない、機能障害性ＢＢＢを指して使用される。異常ＢＢＢは、正常に機能するＢＢＢに通常は排除される分子に対してＢＢＢが透過性である場合を指すこともあり、これを本明細書中では通常「ＢＢＢ透過性」と呼ぶ。

異常「内側ＢＲＢ」という用語は、例えば機能的ｉＢＲＢを通常は通過する分子（例えば栄養素およびグルコース等の糖）をｉＢＲＢが通過させない、機能障害性ｉＢＲＢを指して使用される。異常ｉＢＲＢは、正常に機能するｉＢＲＢに通常は排除される分子に対してｉＢＲＢが透過性である場合を指すこともあり、これを本明細書中では通常「ｉＢＲＢ透過性」と呼ぶ。

「ＢＢＢ透過性」または「透過性ＢＢＢ」という用語は一般的に当業者に「漏出性ＢＢＢ」と呼ばれる。これらの用語は、損傷を受けたＢＢＢの完全性および増大した血管透過性を指して本明細書中で交換可能に使用されている。例えば、透過性ＢＢＢは、無傷のＢＢＢであれば通常脳組織から排除する分子、例えばＩｇ分子、補体タンパク質、血清アルブミン、および他の多くのタンパク質がＢＢＢを通過するのを許す。透過性ＢＢＢの有無を決定するアッセイは、例えば、ＢＢＢが正常に機能している場合（すなわちＢＢＢが透過性でない場合）には通常血管の内腔に限定されているＩｇが、脳組織中の血管外に存在するかどうかを評価することであり得る。

「ｉＢＲＢ透過性」または「透過性ｉＢＲＢ」という用語は一般的に当業者に「漏出性ｉＢＲＢ」と呼ばれる。これらの用語は、損傷を受けたｉＢＲＢの完全性および増大した血管透過性を指して本明細書中で交換可能に使用されている。例えば、透過性ｉＢＲＢは、無傷のｉＢＲＢであれば通常網膜組織から排除する分子、例えばＩｇ分子、補体タンパク質、血清アルブミン、および他の多くのタンパク質がｉＢＲＢを通過するのを許す。透過性ｉＢＲＢの有無を決定するアッセイは、例えば、ｉＢＲＢが正常に機能している場合（すなわちＢＲＢが透過性でない場合）には通常血管の内腔に限定されるＩｇが、網膜組織中の血管外に存在するかどうかを評価することであり得る。

「薬剤」または「剤」（ａｇｅｎｔ）という用語は、通常細胞中に存在しないまたは投与されるレベルで存在しない、任意の実体（ｅｎｔｉｔｙ）を意味する。薬剤は、以下を含んでなる群から選択することができる：化学物質；小分子；核酸配列；核酸アナログ；タンパク質；ペプチド；アプタマー；抗体；またはその断片。核酸配列はＲＮＡまたはＤＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得、以下を含んでなる群から選択することができる：目的のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸アナログ、例えばペプチド−核酸（ＰＮＡ）、偽相補的ＰＮＡ（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙＰＮＡ：ｐｃ−ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）等。そのような核酸配列としては、例えば、限定されるものではないが、例えば転写リプレッサーとして働くタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、小さな抑制性核酸配列、例えば、限定されるものではないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等が含まれる。タンパク質および／またはペプチドまたはその断片は、細胞中に通常存在しないまたは低レベルで発現される任意の目的のタンパク質、例えば、限定されるものではないが、変異タンパク質、治療用タンパク質、および切断型タンパク質であり得る。タンパク質は、以下を含んでなる群からも選択することができる：変異タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミディボディ（ｍｉｄｉｂｏｄｙ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質、およびその断片。あるいは、薬剤は、核酸配列を細胞に導入し、その転写によりＬｐ−ＰＬＡ_２の核酸および／またはタンパク質阻害剤が細胞内で産生された結果として、細胞内にあってよい。いくつかの態様では、薬剤は、任意の化学的な実体または部分、例えば、限定されるものではないが、合成および天然の非タンパク質性実体である。特定の態様では、薬剤は、化学的部分を有する小分子である。例えば、化学的部分には、マクロライド、レプトマイシン、および関連天然産物またはそのアナログを含む、非置換または置換アルキル、芳香族、またはヘテロシクリル部分を含む。薬剤は、所望の活性および／または特性を有することが知られていてよく、多様な化合物のライブラリーから選択することができる。

本発明において、「阻害する」という用語は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質またはその変異体もしくは相同体の発現または活性を、所望の効果を得るのに十分な程度および／または期間低減し、例えばＬｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の阻害が黄斑浮腫、ぶどう膜炎、糖尿病性網膜症等の症状を低減または停止させることを意味する。活性の低下は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の触媒活性を低下させることを含むＬｐ−ＰＬＡ_２の１または複数の特徴への影響によるものまたはＬｐ−ＰＬＡ_２の補因子を阻害することによるものまたはＬｐ−ＰＬＡ２への結合によるものであり得、その活性の程度は、あらゆる原因の、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等が処置または防止されるような程度である。特に、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２阻害のアッセイ、例えば、限定されるものではないが、本明細書に開示のＬｐ−ＰＬＡ_２タンパク質のバイオアッセイを用いて測定することができる。

本発明において、「Ｌｐ−ＰＬＡ_２」という用語は、本明細書に開示の方法により阻害されるタンパク質標的を指す。Ｌｐ−ＰＬＡ_２は、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ_２と交換可能に使用されており、以前から当該技術分野で血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦアセチルヒドロラーゼ）として知られている。ヒトＬｐ−ＰＬＡ_２は、アクセッション番号：Ｕ２０１５７（配列番号１）またはＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００５０８４（配列番号２）に相当する核酸にコードされておりまたはおよびヒトＬｐ−ＰＬＡ_２はアクセッション番号：ＮＰ＿００５０７５（配列番号３）に相当するタンパク質配列に相当し、これらは、参照によりその全体を具体的に本明細書に援用する米国特許第５，９８１，２５２号に開示されている。

「患者」、「対象」、および「個体」という用語は本明細書中において交換可能に使用されており、予防処置を含む処置が施される動物、特にヒトを意味する。本発明において、「対象」という用語はヒトおよび非ヒト動物を意味する。「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」という用語は本明細書中において交換可能に使用されており、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、齧歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、および非哺乳動物、例えばニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。一態様では、対象はヒトである。別の態様では、対象は、疾患モデルとしての実験動物または代替動物である。

本発明において、「処置する」という用語は、本明細書に記載の眼の疾患および障害に関連する状態、疾患、または障害の少なくとも１つの有害作用または症状を低減、軽減、または防止することを含む。処置の陽性の結果を測定する方法としては、限定されるものではないが、ＯＣＴで測定される網膜下浮腫の軽減または維持、最高矯正視力で評価される視力低下の低減、視力の維持、または視力向上が含まれる。

本発明において、「有効量」という用語は、本明細書に開示の眼の疾患または障害の少なくとも１つの症状を低減、停止、軽減、または防止する、医薬組成物の治療剤の量を意味する。例えば、本明細書に開示の方法を用いる有効量は、疾患または障害の症状を低減または防止するのに十分な量、例えばＯＣＴによって測定される黄斑浮腫の完全もしくは部分的な回復および／もしくは維持または最高矯正視力の５文字を超える向上および／もしくは維持（ＥＤＴＲＳ視力検査表により評価）に十分な量と考えられる。糖尿病性黄斑浮腫を処置する有効量は、網膜内毛細血管からの漏出によって生じる黄斑浮腫の量を減少させることによって通常達成される視力改善に十分な量を含む。浮腫の量は、ＯＣＴ等の非侵襲的技術によりおよび／またはフルオレセイン血管造影で検出される漏出により検出される網膜厚の量によって推測することができる。本発明における有効量には、黄斑浮腫および関連する視力喪失の発生を防止するまたは遅らせるのに十分な量も含まれる。本発明における有効量には、疾患の症状の発現を防止するもしくは遅らせる、疾患の症状の過程を変える（例えば、限定されるものではないが、疾患の症状の進行を遅らせる）、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量も含まれる。

本発明において、「投与する」および「導入する」という用語は交換可能に使用されており、所望の部位に薬剤を少なくとも部分的に局在させる方法または経路で、本明細書に開示のＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤を対象中に配置することを意味する。本発明の化合物は、対象の有効な処置が実現される任意の適切な経路で投与することができる。

単数形は１または２以上（すなわち、少なくとも１つ）の対象物を指している。例えば、「要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

Ｌｐ−ＰＬＡ _２：一般情報
Ｌｐ−ＰＬＡ_２は、当該技術分野でＬｐ−ＰＬＡ_２、ＬＤＬ−ＰＬＡ_２、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ_２、ＰＬＡ２Ｇ７、ホスホリパーゼＡ２（ＶＩＩ群）、または血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦアセチルヒドロラーゼまたはＰＡＦＡＨ）といった別名でも呼ばれる。ヒトＬｐ−ＰＬＡ_２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ２０１５７（配列番号１）またはＲｅｆＳｅｑＩＤ：ＮＭ＿００５０８４（配列番号２）に相当する核酸にコードされ、ヒトＬｐ−ＰＬＡ_２は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００５０７５（配列番号３）に相当するタンパク質配列に相当し、これらはその全体を参照により本明細書に具体的に援用する米国特許第５，９８１，２５２号に開示されている。

ホスホリパーゼＡ_２酵素リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ_２（Ｌｐ−ＰＬＡ_２）、その配列、単離、精製、酵素をコードする単離された核酸、および酵素をコードするＤＮＡで形質転換された組換え宿主細胞が、その全体を参照により本明細書に具体的に援用する国際公開第９５／００６４９号（スミスクライン・ビーチャム社（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍｐｌｃ））に開示されている。同じグループのその後の論文で更にこの酵素が説明されており（Tew D et al., Arterioscler Thromb Vas Biol 1996:16; 591-9）、この酵素は論文中でＬＤＬＰＬＡ_２と呼ばれており、その後の特許出願（国際公開第９５／０９９２１号、アイコス社（ＩｃｏｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））およびＮａｔｕｒｅの関連論文（Tjoelker et al., vol. 374, 6 April 1995, 549）は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２と本質的に同じ配列を有する酵素ＰＡＦ−ＡＨを記載している。

Ｌｐ−ＰＬＡ_２は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）が酸化型に変換されている間の、ホスファチジルコリンからリゾホスファチジルコリンへの変換を担うことが示されている。この酵素は、酸化ホスファチジルコリンのｓｎ−２エステルを加水分解してリゾホスファチジルコリンおよび酸化修飾された脂肪酸を生成することが知られている。Ｌｐ−ＰＬＡ_２作用の両生成物は生物学的に活性であり、リゾホスファチジルコリンは特に、どちらも動脈壁内における単球由来マクロファージ蓄積を促進する単球走化性および内皮機能障害誘導を含むそれに起因する複数のアテローム生成促進活性を有する。

Ｌｐ−ＰＬＡ _２を阻害する薬剤
いくつかの態様では、本発明は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害に関する。いくつかの態様では、阻害は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２をコードする核酸転写産物の阻害、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の阻害である。別の態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の遺伝子産物、例えばＬｐ−ＰＬＡ_２のポリペプチドまたはタンパク質、またはそのアイソフォームの発現の阻害および／または活性の阻害である。本発明において、「遺伝子産物」という用語は、遺伝子から転写されたＲＮＡ、または遺伝子にコードされたもしくはＲＮＡから翻訳されたポリペプチドを意味する。

いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害は薬剤によるものである。任意の薬剤、例えば、限定されるものではないが、核酸、核酸アナログ、ペプチド、ファージ、ファージミド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、リボソーム、アプタマー、抗体、小さいまたは大きい有機または無機分子、またはその任意の組合せを使用することができる。いくつかの態様では、本発明の方法に有用な薬剤として、Ｌｐ−ＰＬＡ発現の阻害剤として機能する薬剤、例えばＬｐ−ＰＬＡをコードするｍＲＮＡの阻害剤が含まれる。

本明細書に開示の方法に有用な他の薬剤は、その全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２００８／０２７９８４６号に対応する国際公開第２００８／１４０４４９号に見出すことができる。

あるいは、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害剤として本明細書に開示の方法に有用な薬剤は、化学物質、小分子、大分子、または実体もしくは部分、例えば、限定されるものではないが、合成および天然の非タンパク質性実体であり得る。特定の態様では、薬剤は、本明細書に開示の化学的部分を有する小分子である。

小分子
いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤は小分子である。Ｌｐ−ＰＬＡ_２の不可逆的または可逆的な阻害剤を本発明の方法に用いることができる。

Ｌｐ−ＰＬＡ_２の不可逆的阻害剤は、その全体を参照により本明細書に具体的に援用する国際公開第９６／１３４８４号、同第９６／１９４５１号、同第９７／０２２４２号、同第９７／１２９６３号、同第９７／２１６７５号、同第９７／２１６７６号、同第９７／４１０９８号、および同第９７／４１０９９号（スミスクライン・ビーチャム社に開示されており、とりわけ、酵素Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害剤である様々な一連の４−チオニル／スルフィニル／スルホニルアゼチジノン化合物が開示されている。これらは不可逆的なアシル化阻害剤である（Tew et al., Biochemistry, 37, 10087, 1998）。

ヒトで有効なＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤は一般に当業者に公知であり、評価中、例えば前臨床および第ＩＩ相臨床試験を含む臨床評価中のものが含まれる。スミスクライン・ビーチャム社およびその後継であるグラクソ・スミスクライン社によりその複数の出願例が提出および公開されている。同会社に帰属する関連公開出願の一覧は、全体を参照により本明細書に具体的に援用する国際公開第９９／２４４２０号、同第００／１０９８０号、同第００／６６５６６号、同第００／６６５６７号、同第００／６８２０８号、同第０１／６０８０５号、同第０２／３０９０４号、同第０２／３０９１１号、同第０３／０１５７８６号、同第０３／０１６２８７号、同第０３／０４１７１２号、同第０３／０４２１７９号、同第０３／０４２２０６号、同第０３／０４２２１８号、同第０３／０８６４００号、同第０３／０８７０８８号、同第０５／００３１１８号、同第０５／０２１００２号、同第０８／０４８８６６号、同第０８／１４０４４９号、同第０８／１４１１７６号、同第０８／０４８８６７号、米国特許出願公開第２００８／０２８０８２９号、同第２００８／０１０３１５６号、同第２００８／００９０８５１号、同第２００８／００９０８５２号、および国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／０７７１５４に対応する代理人整理番号ＰＣ６４３３３である。

化合物Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−［［（４−フルオロフェニル）メチル］チオ］−４，５，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１Ｈ−シクロペンタピリミジン−１−アセトアミド（本明細書中でＤａｒａｐｌａｄｉｂという用語および別の命名法による１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８４８とも交換可能に使用される）が特に有効なＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤であり、本発明において特に有用である。

化合物２−［［（２，３−ジフルオロフェニル）メチル］チオ］−Ｎ−［１−（２−メトキシエチル）−４−ピペリジニル］−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１（４ｈ）−キノリンアセトアミド（本明細書中でＲｉｌａｐｌａｄｉｂという用語；またはＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’０３２および別の命名法によるＮ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド）とも交換可能に使用される）が特に有効なＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤であり、本発明において特に有用である。

本明細書に開示の方法において有用な他のＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤は、公開されている特許出願、例えば、その全体を参照により本明細書に具体的に援用する国際公開第２００６０６３７９１（Ａ１）号、同第２００６０６３８１１（Ａ１）号、同第２００６０６３８１２（Ａ１）号、同第２００６０６３８１３（Ａ１）号（全てバイエル・ヘルスケア社の名による）；およびKorea Res. Inst. Bioscience & Biotechnologyに帰属する米国特許出願公開第２００６１０６０１７（Ａ１）号に記載されている。Ｌｐ−ＰＬＡ_２阻害剤には公知の薬剤も含まれ、例えば、限定されるものではないが、スタチンとナイアシン（www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=6724568参照）およびフェノフィブラート（www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=14817756&taxid=19参照）の使用が含まれる。

上記段落に記載した出願の全てを参照により本明細書に援用する。これらの文献に開示されている全ての化合物が、任意の原因の、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；ＡＭＤ；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等の予防または処置に有用であると考えられる。実施例に例示されているような本明細書に記載のモデルを用いて、当業者は、開示化合物またはその他のＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤（例えば抗体またはＲＮＡｉ）のどれが、本発明で請求されている、任意の原因による、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等の処置または防止に有効であるかを決定することができる。

特定の態様では、その全体を参照により本明細書に具体的に援用する米国特許第６，６４９，６１９号および同第７，１５３，８６１号（および国際公開第０１／６０８０５号）およびその全体を参照により本明細書に援用する米国特許第７，１６９，９２４号（および国際公開第０２／３０９１１号）に開示のＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤が、任意の原因による、例えば網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、糖尿病、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、ぶどう膜炎、ならびに糖尿病性の眼の疾患および障害、例えば糖尿病性網膜症等を予防または処置するための本明細書に開示の方法に有用である。いくつかの態様では、その全体を参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００５／００３３０５２（Ａ１）号ならびに国際公開第０２／３０９０４号、同第０３／０４２２１８号、同第０３／０４２２０６号、同第０３／０４２１７９号、同第０３／０４１７１２号、同第０３／０８６４００号、および同第０３／８７０８８号に開示のＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤が可逆的Ｌｐ−ＰＬＡ_２阻害剤である。

式（Ｉ）
その全体を参照により本明細書に援用する米国特許第６，６４９，６１９号および同第７，１５３，８６１号の派生元である国際公開第０１／６０８０５号に開示されている一群の可逆的Ｌｐ−ＰＬＡ_２阻害剤を使用することができ、これらの開示全体を本明細書中に記載された場合と同じように本明細書に援用する。より狭い群の目的の化合物は、国際公開第０１／６０８０５号に記載のならびに米国特許第６，６４９，６１９号および同第７，１５３，８６１号で特許請求されている式（Ｉ）の化合物、すなわち

（式中、

Ｒ^ａおよびＲ^ｂは、それらが結合しているピリミジン環炭素原子と一緒に、縮合５員炭素環を形成し；

Ｒ^２は、１〜３個のフッ素原子で置換されたフェニルであり；

Ｒ^３は、メチルまたはＮＲ^８Ｒ^９で置換されたＣ_{（１−３）}アルキルであるか；

Ｒ^３は、ＨｅｔＣ_{（０−２）}アルキル（式中、Ｈｅｔは、Ｎを有する５〜７員のヘテロシクリル環であり、Ｎは、非置換であるか、Ｃ_{（１−６）}アルキルで置換されている）であり；

Ｒ^４およびＲ^５は一緒に４−（４−トリフルオロメチルフェニル）フェニル部分を形成し；

Ｒ^８およびＲ^９は、同じであっても異なっていてもよく、水素、またはＣ_{（１−６）}アルキル）からなる群から選択され；

Ｘは、Ｓである）
またはその薬学的に許容可能な塩である。

更により興味深いのは以下の化合物であり、全て式（Ｉ）の範囲に含まれ、前述の出願および特許中に開示されている：

１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン（本明細書に記載のブタ実験で使用）；

１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（２，３−ジフルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノ−カルボニルメチル）−２−（３，４−ジフルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノ−カルボニルメチル）−２−（２，３，４−トリフルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノ−カルボニルメチル）−２−（２−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−メチル−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（２−（１−ピペリジノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノ−カルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノ−カルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（２−エチルアミノ−２−メチルプロピル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

Ｎ−（２−ｔｅｒｔ−ブチルアミノエチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノ−カルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；

１−（Ｎ−（２−（エチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン；またはこれらの化合物の薬学的に許容可能な塩。

これらの化合物の製造方法は前述の文献に開示されている。

１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）−アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オンの第２の製造プロセスが全体を参照により本明細書に援用する国際公開第０３／０１６２８７号（米国特許第７，２３２，９０２号）に記載されている。

式（ＩＩ）

本発明の方法の実施に有用であり得る更なる群の化合物が国際公開第０２／３０９１１号およびこの国際出願に対応する米国特許第７，１６９，９２４号に開示されている。これら両方の全体を本明細書に援用する。その場合の一般式（本明細書では式（ＩＩ）として表される）は以下の通りである：

式中、

Ｒ^１は、アリール基であり、Ｃ_{（１−６）}アルキル、Ｃ_{（１−６）}アルコキシ、Ｃ_{（１−６）}アルキルチオ、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、およびモノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキルから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよく；

Ｒ^２は、ハロゲン、Ｃ_{（１−３）}アルキル、Ｃ_{（１−３）}アルコキシ、ヒドロキシＣ_{（１−３）}アルキル、Ｃ_{（１−３）}アルキルチオ、Ｃ_{（１−３）}アルキルスルフィニル、アミノＣ_{（１−３）}アルキル、モノ−またはジ−Ｃ_{（１−３）}アルキルアミノＣ_{（１−３）}アルキル、Ｃ_{（１−３）}アルキルカルボニルアミノＣ_{（１−３）}アルキル、Ｃ_{（１−３）}アルコキシＣ_{（１−３）}アルキルカルボニルアミノＣ_{（１−３）}アルキル、Ｃ_{（１−３）}アルキルスルホニルアミノＣ_{（１−３）}アルキル、Ｃ_{（１−３）}アルキルカルボキシ、Ｃ_{（１−３）}アルキルカルボキシＣ_{（１−３）}アルキルであり、且つ

Ｒ^３は、水素、ハロゲン、Ｃ_{（１−３）}アルキル、またはヒドロキシＣ_{（１−３）}アルキルであるか；

Ｒ^２およびＲ^３は、それらが結合しているピリミドン環炭素原子と一緒に、縮合５または６員炭素環を形成するか；

Ｒ^２およびＲ^３は、それらが結合しているピリミドン環炭素原子と一緒に、縮合したベンゾまたはヘテロアリール環を形成し、環は、ハロゲン、Ｃ_{（１−４）}アルキル、シアノ、Ｃ_{（１−６）}アルコキシ、Ｃ_{（１−６）}アルキルチオ、またはモノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキルから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよく；

Ｒ^４は、水素；非置換であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ^７、ＣＯＲ^７、カルボキシ、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^７ＣＯＲ^８、モノ−またはジ−（ヒドロキシＣ_{（１−６）}アルキル）アミノ、およびＮ−ヒドロキシＣ_{（１−６）}アルキル−Ｎ−Ｃ_{（１−６）}アルキルアミノから選択される１、２、または３個の置換基で置換されていてもよいＣ_{（１−６）}アルキルであるか；

Ｒ^４は、Ｈｅｔ−Ｃ_{（０−４）}アルキル（式中、Ｈｅｔは、Ｎおよび場合によってＯまたはＳを含んでなる５〜７員ヘテロシクリル環であり、Ｎは、ＣＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０で置換されていてよい）であるか、ヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ^７、ＣＯＲ^７、カルボキシ、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０、またはＮＲ^９Ｒ^１０から選択される１、２、または３個の置換基で置換されていてよいＣ_{（１−６）}アルキル（例えば、ピペリジン−４−イル、ピロリジン−３−イル）であり；

Ｒ^５は、Ｃ_{（１−６）}アルキル、Ｃ_{（１−６）}アルコキシ、Ｃ_{（１−６）}アルキルチオ、アリールＣ_{（１−６）}アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^７、カルボキシ、ＣＯＯＲ^７、ＮＲ^７ＣＯＲ^８、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０、ＳＯ_２ＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^７ＳＯ_２Ｒ^８、ＮＲ^９Ｒ^１０、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキル、およびモノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルコキシから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよいアリールまたはヘテロアリール環であり；

Ｒ^６は、Ｃ_{（１−１８）}アルキル、Ｃ_{（１−１８）}アルコキシ、Ｃ_{（１−６）}アルキルチオ、Ｃ_{（１−６）}アルキルスルホニル、アリールＣ_{（１−６）}アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^７、カルボキシ、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^７ＣＯＲ^８、ＳＯ_２ＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^７ＳＯ_２Ｒ^８、ＮＲ^９Ｒ^１０、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキル、およびモノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルコキシ、またはＣ_{（５−１０）}アルキルから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で更に置換されていてよいアリールまたはヘテロアリール環であり；

Ｒ^７は、水素またはＣ_{（１−１２）}アルキル、例えばＣ_{（１−４）}アルキル（例えばメチルまたはエチル）であり；

Ｒ^８は、水素、ＯＣ_{（１−６）}アルキル、またはＣ_{（１−１２）}アルキル、例えばＣ_{（１−４）}アルキル（例えばメチルまたはエチル）であり；

Ｒ^９およびＲ^１０は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ、水素またはＣ_{（１−１２）}アルキルから選択されるか、あるいは、Ｒ^９およびＲ^１０は、それらが結合している窒素と一緒に、酸素、窒素、および硫黄から選択される１または複数の更なる異種原子を含んでいてよく、且つヒドロキシ、オキソ、Ｃ_{（１−４）}アルキル、Ｃ_{（１−４）}アルキルカルボキシ、アリール（例えばフェニル）、またはアラルキル（例えばベンジル）から選択される１または２個の置換基で置換されていてよい、５〜７員環（例えばモルホリンまたはピペラジン）を形成し；

Ｘは、メチルおよびエチルから選択される１、２、または３個の置換基で置換されていてよいＣ_{（２−４）}アルキレンまたはＣＨ＝ＣＨである。

式（ＩＩ）の全ての塩も、本発明の処置方法に用いることができる。

特に興味深いのには、国際公開第０２／３０９１１号で式（Ｉ）について記載されているように、Ｒ^１が、ハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、トリフルオロメチル、またはＣ_１−Ｃ_６アルコキシから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよいフェニル基であり得る、本明細書の式（ＩＩ）で表される化合物である。より具体的には、フェニルは、非置換であるか、１、２、３、または４個のハロゲン置換基、具体的には１〜３個のフルオロ基、最も具体的には２，３−ジフルオロ、２，４−ジフルオロ、または４−フルオロで置換されている。

本明細書の式（ＩＩ）の更なる態様では、Ｘは−ＣＨ_２ＣＨ_２−である。

更に、興味深いのは、Ｒ^２が、デフォルトの水素であるか、ハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、モノ〜パーフルオロＣ_１−Ｃ４_６アルコキシ、またはＣ_１−Ｃ_６アルコキシ；特にモノ〜パーフルオロ−Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、またはＣ_１−Ｃ_６アルコキシである、式（ＩＩ）の化合物である。特に興味深いのは、Ｒ^２が水素以外であり、（Ｒ^２）_n中のｎが１、２、または３であり、置換パターンがメタおよび／またはパラ、特にパラ、すなわち４位置換基である、式（ＩＩ）の化合物である。Ｒ^２が４−トリフルオロメチルまたは４−トリフルオロメトキシである化合物も参照されたい。

Ｒ^３およびＲ^４は、同じであっても異なっていてもよく、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはｎ−ブチルである。特に興味深いのは、Ｒ^３およびＲ^４が同じであり、メチルまたはエチルであり、特に興味深くはメチルである、本明細書の式（ＩＩ）の化合物である。

Ｒ^５は、水素、直鎖または分岐鎖の−Ｃ_{（１−６）}アルキルであり得る。特に興味深いのはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、またはｎ−ヘキシルである。

本明細書の式（ＩＩ）の化合物は、

Ｒ^１が、２，３−ジフルオロで置換されたフェニルであり；

Ｒ^２およびＲ^３が、それらが結合しているピリミジン環炭素原子と一緒に、縮合５員シクロペンテニル環を形成し；

Ｒ^４が、２−（ジエチルアミノ）エチルであり；

Ｒ^５が、フェニルであり；

Ｒ^６が、４位でトリフルオロメチルで置換されたフェニルまたは５位でトリフルオロメチルで置換されたチエン−２−イルであり；

Ｘが、−（ＣＨ_２）_２である、
更なるサブグループの化合物を包含すると理解される。

特に興味深いのは、国際公開第０２／３０９１１号で式（Ｉ）について記載されているように、Ｒ^１が、ハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、トリフルオロメチル、またはＣ_１−Ｃ_６アルコキシから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよいフェニル基であり得る、本明細書の式（ＩＩ）の化合物である。より具体的には、フェニルは、非置換であるか、１、２、３、または４個のハロゲン置換基、具体的には１〜３個のフルオロ基、最も具体的には２，３−ジフルオロ、２，４−ジフルオロ、または４−フルオロで置換されている。

本明細書の式（ＩＩ）の更なる態様では、Ｘが、−ＣＨ_２ＣＨ_２−であり；Ｒ^２およびＲ^３が、それらが結合しているピリミジン環炭素原子と一緒に、縮合５員ベンゾ環を形成し；Ｒ^４が、Ｈｅｔ−Ｃ_{（０−４）}アルキル（式中、Ｈｅｔは、Ｎを含んでなる５〜７員ヘテロシクリル環であり、Ｎは、Ｃ_{（１−６）}アルキルで置換されていてよい）、例えば、ピペリジン−４−イル、ピロリジン−３−イルであり；Ｒ^５が、アリール環であり；Ｒ^６が、Ｃ_{（１−１８）}アルキル、ハロゲン、特に、４−クロロから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で更に置換されていてよいアリール環である。

興味のある本明細書の式（ＩＩ）の具体的な化合物を以下に挙げる。

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４Ｈ−クニナゾリン−１−イル）−Ｎ−（４’−クロロ−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩（ｂｉｔａｒｔｒａｔｅ）；

Ｎ−（１−エチル−ピペリジン−４−イル）−２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−エチルアミノ−２−メチル−プロピル）−２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ｔ−ブチルアミノエチル）−２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチル−ピペリジン−４−イル）−２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（４−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）フェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）−アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（４−フルオロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）−アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

（＋／−）−Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２フェニル−プロピル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（２，４−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（２，５−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（３，４−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（２−フルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（３−フルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（３−クロロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（４−クロロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（４−メチルフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（４−メトキシフェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−（２−（２−（４−（トリフルオロメトキシ）フェニル）−エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

または酒石酸水素塩のいずれかの遊離塩基または別の薬学的に許容可能な塩。

これらの化合物の製造方法は記載の文献に開示されている。

式（ＩＩＩ）

更に、興味深いのは、国際公開第０２／３０９０４号に開示されている式（ＩＩＩ）

［式中、

Ｒ^１は、Ｃ_{（１−６）}アルキル、Ｃ_{（１−６）}アルコキシ、Ｃ_{（１−６）}アルキルチオ、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキル、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルコキシアリール、およびアリールＣ_{（１−４）}アルキルから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよいアリール基であり；

Ｒ^２およびＲ^３は、それらが結合しているピリドン環炭素原子と一緒に、縮合５または６員炭素環を形成しているか；

Ｒ^２およびＲ^３は、それらが結合しているピリドン環炭素原子と一緒に、ハロゲン、Ｃ_{（１−４）}アルキル、シアノ、Ｃ_{（１−３）}アルコキシＣ_{（１−３）}アルキル、Ｃ_{（１−４）}アルコキシまたはＣ_{（１−４）}アルキルチオ、またはモノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキルから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよい縮合ベンゾまたはヘテロアリール環を形成し；

Ｒ^４は、Ｈｅｔ−Ｃ_{（０−４）}アルキル（式中、Ｈｅｔは、Ｎと場合によってＯまたはＳとを含んでなる５〜７員ヘテロシクリル環であり、Ｎは、ＣＯＲ^７、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０で置換されていてよい）；またはヒドロキシ、ハロゲン、ＯＲ^７、ＣＯＲ^７、カルボキシ、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０、もしくはＮＲ^９Ｒ^１０から選択される１、２、もしくは３個の置換基で置換されていてよいＣ_{（１−６）}アルキル、例えば、ピペリジン−４−イル、ピロリジン−３−イルであり；

Ｒ^５は、Ｃ_{（１−６）}アルキル、Ｃ_{（１−６）}アルコキシ、Ｃ_{（１−６）}アルキルチオ、アリールＣ_{（１−６）}アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^７、カルボキシ、ＣＯＯＲ^７、ＮＲ^７ＣＯＲ^８、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０、ＳＯ_２ＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^７ＳＯ_２Ｒ^８、ＮＲ^９Ｒ^１０、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキル、およびモノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルコキシから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換基されていてよいアリールまたはヘテロアリール環であり；

Ｒ^６は、Ｃ_{（１−６）}アルキル、Ｃ_{（１−６）}アルコキシ、Ｃ_{（１−６）}アルキルチオ、Ｃ_{（１−６）}アルキルスルホニル、アリールＣ_{（１−６）}アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、ＣＮ、ＣＯＲ^７、カルボキシ、ＣＯＯＲ^７、ＣＯＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^７ＣＯＲ^８、ＳＯ_２ＮＲ^９Ｒ^１０、ＮＲ^７ＳＯ_２Ｒ^８、ＮＲ^９Ｒ^１０、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキル、およびモノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルコキシから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で更に置換されていてよいアリールまたはヘテロアリール環；またはＣ_{（５−１０）}アルキルであり；

Ｒ^７およびＲ^８は、独立して、水素またはＣ_{（１−１２）}アルキル、例えばＣ_{（１−４）}アルキル（例えばメチルまたはエチル）であり；

Ｒ^９およびＲ^１０は、同じであっても異なっていてもよく、それぞれ、水素またはＣ_{（１−１２）}アルキルから選択され、あるいは、Ｒ^９およびＲ^１０は、それらが結合している窒素と一緒に、酸素、窒素、および硫黄から選択される１または複数の更なる異種原子を含んでいてよく且つヒドロキシ、オキソ、Ｃ_{（１−４）}アルキル、Ｃ_{（１−４）}アルキルカルボキシ、アリール（例えばフェニル）、またはアラルキル（例えばベンジル）から選択される１または２個の置換基で置換されていてよい、５〜７員環（例えばモルホリンまたはピペラジン）を形成し；

Ｘは、Ｃ_{（２−４）}アルキレン基（メチルおよびエチルから選択される１、２、または３個の置換基で置換されていてよい）、ＣＨ＝ＣＨ、（ＣＨ_２）_ｎＳ、または（ＣＨ_２）_ｎＯ（式中、ｎは１、２、または３である）である］

の化合物またはその薬学的に許容可能な塩である。

特に興味深いのは、Ｒ^２およびＲ^３が、それらが結合しているピリドン環炭素原子と一緒に、ハロゲン、Ｃ_{（１−４）}アルキル、シアノ、Ｃ_{（１−４）}アルコキシまたはＣ_{（１−４）}アルキルチオ、またはモノ〜パーフルオロ−Ｃ_{（１−４）}アルキルから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよい縮合ベンゾまたはヘテロアリール環を形成している、式（ＩＩＩ）の化合物である。好ましくは、Ｒ^１は、ハロゲン、Ｃ_{（１−６）}アルキル、トリフルオロメチル、Ｃ_{（１−６）}アルコキシで、好ましくは１〜３個のフルオロで、より好ましくは２，３−ジフルオロで置換されていてよい、フェニルである。Ｒ^４の代表例としては、１位でメチル、イソプロピル、１−（２−メトキシエチル）、１−（２−ヒドロキシエチル）、ｔ−ブトキシカルボニル、またはエトキシカルボニルメチルにより置換されているピペリジン−４−イル；アミノエチルにより２位で置換されているエチル；１−エチルピペリジニルメチル；ピペリジン−４−イル；３−ジエチルアミノプロピル；４−ピロリジン−１−イルブチル；および１−エチルピロリジン−３−イルが含まれる。好ましくは、Ｒ^４は、１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル、１−メチルピペリジン−４−イル、または１−エチルピロリジン−３−イルである。Ｒ^５の代表例としてはフェニルおよびピリジルが含まれる。好ましくは、Ｒ^５はフェニルである。Ｒ^６の代表例としては、ハロゲン、またはトリフルオロメチル（好ましくは４位において）、およびヘキシルで置換されていてよいフェニルが含まれる。好ましくは、Ｒ^６は、４位においてトリフルオロメチルで置換されているフェニルである。Ｒ^６の更なる代表例としては、１または複数のＣ_{（１−３）}アルキルで置換されたフェニルが含まれる。好ましくは、Ｒ^６は４位においてエチルで置換されたフェニルである。好ましくは、Ｒ^５およびＲ^６は一緒に、４−（フェニル）フェニルまたは２−（フェニル）ピリジニル置換基を形成しており、離れたフェニル環が、好ましくは４位において、ハロゲンまたはトリフルオロメチルで置換されていてよい。好ましくは、ＸはＣ_{（２−４）}アルキレン、より好ましくはＣ_{（２−３）}アルキレン、最も好ましくは（ＣＨ_２）_２、またはＣＨ_２Ｓである。

式（ＩＩＩ）を構成する化合物の群は、

Ｒ^２およびＲ^３が、それらが結合しているピリドン環炭素原子と一緒に、縮合ベンゾまたはピリド環を形成し；

Ｒ^４が、１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イルであり；

Ｒ^５およびＲ^６が一緒に、４−（フェニル）フェニル置換基を形成し、離れたフェニル環が、好ましくは４位で、トリフルオロメチルで置換されており；

Ｘが、ＣＨ_２Ｓまたは（ＣＨ_２）_２である、
化合物のサブグループを包含すると理解される。

以下の式（ＩＩＩ）の化合物が興味深い。

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−５，６−トリメチレンピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−エチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［５−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−メチル−７−オキソ−７Ｈ−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−４−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

（±）Ｎ−（１−エチルピロリジン−３−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

（±）Ｎ−（１−エチルピロリジン−３−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミドジヒドロクロリド；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミドモノパラトルエンスルホネート；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミドモノヒドロクロリド；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミドジヒドロクロリド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（４−フルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（４−フルオロベンジルチオ）−４−オキソ−５，６−トリメチレンピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−５，６−トリメチレンピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（４−フルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（３，４−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２−フルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（３−クロロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル）］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル）］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ピロリジン−１−イルエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ピペリジン−１−イルエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）７−フルオロ−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−５−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−メチル−７−オキソ−７Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピリジン−４−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−５，６−ジメチル−４−オキソ−４Ｈ−ピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−５−エチル−４−オキソ−４Ｈ−ピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］ピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ピロリジン−１−イルエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［６−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−メチル−４−オキソ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イルメチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（４−ピロリジン−１−イルブチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（３−ジエチルアミノプロピル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（４−ピロリジン−１−イルブチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［５−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−７−オキソ−７Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピリジン−４−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［５−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−メチル−７−オキソ−７Ｈ−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−４−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−エチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−エチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−イソプロピルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−イソプロピルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−メチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−メチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エトキシカルボニルメチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（３’，４’−ジメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（ｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（３’，４’−ジフルオロビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［６−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３，４−トリフルオロフェニルエチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［６−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−２−メチル−４−オキソ−２，４−ジヒドロ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［６−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−エチル−４−オキソ−２，４−ジヒドロピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［６−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−イソプロピル−４−オキソ−２，４−ジヒドロピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−エチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−［５−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−メチル−７−オキソ−７Ｈ−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−４−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［５−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−メチル−７−オキソ−７Ｈ−チアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−４−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−５，６−トリメチレン−ピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−５，６−トリメチレン−ピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−５，６−トリメチレンピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−５，６−トリメチレンピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［５−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−メチル−７−オキソ−２，７−ジヒドロピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−４−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［５−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−１−メチル−７−オキソ−１，７−ジヒドロピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジン−４−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−７−メチル−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−７−メチル−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−７−メチル−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−７−メチル−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−７−メチル−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−５，６−トリメチレン−ピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−５，６−トリメチレンピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−５，６−トリメチレン−ピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−５，６−トリメチレンピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−５，６−テトラメチレン−ピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−クロロビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−メチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−クロロビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−クロロビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−クロロビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−クロロビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［６−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−メチル−４−オキソ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（１−（ｔ−ブトキシカルボニル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−［６−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−２−（２−メトキシエチル）−４−オキソ−４Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン−７−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［４−オキソ−２−（２−（２，３，４−トリフルオロフェニル）エチル）−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，４−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（３−フルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロ−メチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−５，６−トリメチレンピリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；

Ｎ−（ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−［１，８］ナフチリジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミドトリフルオロアセテート；

Ｎ−（２−エチルアミノエチル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（２−エチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド；

Ｎ−（１−（２−ヒドロキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩；またはその遊離塩基、または別の薬学的に許容可能な塩。

これらの化合物の製造方法は記載した文献に開示されている。

式（ＩＶ）

式（ＩＶ）：

（式中、

Ｒ^１は、非置換であるか、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルチオ、アリールＣ_１−Ｃ_６アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ＣＮ、ＣＯＲ^６、ＣＯＯＲ^６、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＣＯＮＲ^８Ｒ^９、ＳＯ_２ＮＲ^８Ｒ^９、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＮＲ^８Ｒ^９、ハロＣ_１−Ｃ_４アルキル、およびハロＣ_１−Ｃ_４アルコキシからなる群から選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されている、アリール基であり；

ＷはＣＨであり且つＸはＮであるか、ＷはＮであり且つＸはＣＨであるか、ＷおよびＸはどちらもＣＨであるか、ＷおよびＸはＮであり；

Ｙは、Ｃ_２−Ｃ_４アルキルであり、

Ｒ^２は、水素、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルチオ、アリールＣ_１−Ｃ_６アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ＣＮ、ＣＯＲ^６、カルボキシ、ＣＯＯＲ^６、ＮＲ^６ＣＯＲ^７、ＣＯＮＲ^８Ｒ^９、ＳＯ_２ＮＲ^８Ｒ^９、ＮＲ^６ＳＯ_２Ｒ^７、ＮＲ^８Ｒ^９、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、またはモノ〜パーフルオロ−Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシであり；

ｎは、０〜５であり；

Ｒ^３は、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルであり；

Ｒ^４は、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルであり；

Ｒ^５は、水素、Ｃ_１−Ｃ_１０アルキル、Ｃ_２−Ｃ_１０アルケニル、Ｃ_２−Ｃ_１０アルキニル、ハロＣ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキル、Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキル、Ｃ_３−Ｃ_８シクロアルキルＣ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_５−Ｃ_８シクロアルケニル、Ｃ_５−Ｃ_８シクロアルケニルＣ_１−Ｃ_４アルキル、３〜８員ヘテロシクロアルキル、３〜８員ヘテロシクロアルキルＣ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_６−Ｃ_１４アリール、Ｃ_６−Ｃ_１４アリールＣ_１−Ｃ_１０アルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールＣ_１−Ｃ_１０アルキルであり；各基は、Ｃ_１−Ｃ_６アルコキシ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキルチオ、アリールＣ_１−Ｃ_６アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、ＣＮ、ＮＲ^８Ｒ^９、またはハロＣ_１−Ｃ_４アルコキシである同じおよび／または異なる基で１または複数回置換されていてよく；

Ｒ^６およびＲ^７は、独立して、水素またはＣ_１−Ｃ_１０アルキルであり；

Ｒ^８およびＲ^９は、同じか異なり、水素またはＣ_１−Ｃ_１０アルキルであるか、あるいはＲ^９およびＲ^１０は、それらが結合している窒素と一緒に、酸素、窒素、および硫黄から選択される１または複数の更なる異種原子を含んでいてよく且つヒドロキシ、オキソ、Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、Ｃ_１−Ｃ_４アルキルカルボキシ、アリール、およびアリールＣ_１−Ｃ_４アルキルからなる群から選択される１または２個の置換基で置換されていてよい、５〜７員環を形成している）
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩も興味深い。

定義した置換基および／または列挙したそれらのラジカルを式（ＩＶ）の範囲から除外するものではないが、以下のＲ基および関連ラジカルが特に興味深い。

Ｒ^１に関して、これは、ハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、トリフルオロメチル、またはＣ_１−Ｃ_６アルコキシから選択される同じであっても異なっていてもよい１、２、３、または４個の置換基で置換されていてよいフェニル基であり得る。より具体的には、フェニルは、非置換であるか、１、２、３、または４個のハロゲン置換基、具体的には１〜３個のフルオロ基、最も具体的には２，３−ジフルオロ、２，４−ジフルオロ、または４−フルオロで置換されている。

式（Ｉ）の更なる態様では、Ｙは−ＣＨ_２ＣＨ_２−である。

本発明は更に、Ｒ^２が、デフォルトの水素であるか、ハロ、Ｃ_１−Ｃ_６アルキル、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、モノ〜パーフルオロＣ_１−Ｃ４_６アルコキシ、またはＣ_１−Ｃ_６アルコキシ；特にモノ〜パーフルオロ−Ｃ_１−Ｃ_４アルキル、モノ〜パーフルオロ−Ｃ_１−Ｃ_４アルコキシ、またはＣ_１−Ｃ_６アルコキシである、式（Ｉ）の化合物を提供する。特に興味深いのは、Ｒ^２が水素以外であり、（Ｒ^２）_ｎ中のｎが１、２、または３であり、置換パターンがメタおよび／またはパラ、特にパラ、すなわち４位置換基である化合物である。例示化合物としては、Ｒ^２が４−トリフルオロメチルまたは４−トリフルオロメトキシであるものが含まれる。

Ｒ^３およびＲ^４は、同じであっても異なっていてもよく、メチル、エチル、ｎ−プロピル、またはｎ−ブチルである。特に興味深いのは、Ｒ^３およびＲ^４が同じであり且つメチルまたはエチル（メチルが特に興味深い）である式（Ｉ）の化合物である。

Ｒ^５は、水素または直鎖もしくは分岐鎖であるＣ_{（１−６）}アルキルであり得る。特に興味深いのは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、またはｎ−ヘキシルである。

前述した本明細書に記載の化合物はいずれも、結晶形態または非結晶形態で製造することができ、結晶性の場合、例えば水和物として、溶媒和されていてよい。化学量論的溶媒和物（例えば水和物）が本発明の範囲に含まれる。

本明細書に記載の化合物のいくつかは、１または複数のキラル原子を含み得、あるいは、２つのエナンチオマーとして存在でき得る。本明細書に記載の方法に有用な化合物としては、エナンチオマーの混合物および精製されたエナンチオマーまたは鏡像異性的に濃縮された混合物が含まれる。式（Ｉ）〜（ＩＶ）で表される化合物の個々の異性体およびあらゆる全体的または部分的に平衡化されたその混合物も本発明の範囲に含まれる。本発明は更に、１または複数のキラル中心が反転したその異性体との混合物としての、特許請求される化合物の個々の異性体を包含する。また、特許請求される化合物の全ての互変異性体および互変異性体の混合物が式（Ｉ）〜（ＩＶ）の化合物の範囲に含まれると理解される。種々の異性体形態は、従来の方法によって互いに分離または分割することができ、あるいは、従来の合成方法または立体特異的もしくは不斉合成により任意の所定の異性体を得ることができる。

式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、および（ＩＶ）の化合物の合成

式（Ｉ）、（ＩＩ）、および（ＩＩＩ）の化合物の製造方法は特許文献に公開されている。例えば、式（Ｉ）の製造方法は、国際公開第０１／６０８０５号および同第０３／０１６２８７号に記載されている。式（ＩＩ）の化合物の製造方法は、国際公開第０２／３０９１１号に記載されている。式（ＩＩＩ）の化合物の製造方法は、国際公開第０２／３０９０４号に記載されている。式（ＩＶ）の化合物の製造方法は、国際公開第０８／０４８８６６号および同第０８／０４８８６７号に記載されている。

いくつかの合成例を以下に示す。本明細書の例中の化合物の複数の一般的グループを区別するために、式（Ｉ）に関連する物質は「合成アプローチ例（Ｉ）−１」（以下同様）、式（ＩＩ）については、「合成アプローチ例（ＩＩ）−１」（以下同様）、式（ＩＩＩ）については、「合成アプローチ例（ＩＩＩ）−１」（以下同様）、式（Ｉ）については「合成アプローチ例（ＩＶ）−１」（以下同様）と表示する。

式（Ｉ）の合成

式（Ｉ）の化合物は、国際公開第０１／６０８０５号に開示されているように、スキームＩのプロセスによって製造することができる。

スキームＩ

ここで、
Ｌ^３は、Ｃ（１〜６）アルキル基、例えばメチルであり；

Ｒ^１５は、Ｃ_{（１−６）}アルキル基、例えばエチルまたはｔ−ブチルであり；

Ｌ^１、Ｌ^２、Ｒ^ａ、Ｒ^ｂ、Ｒ^ｃ、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、ｎ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、国際公開第０１／６０８０５号に定義される通りである。

興味のある式（Ｉ）の化合物を製造するための例示的反応は当該技術分野で、例えば国際公開第０１／６０８０５号に記述されており、以下に説明されている。

合成アプローチ例（Ｉ）−１（ａ）
１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノカルボニル−メチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン

国際公開第０１／６０８０５号に開示されているように、国際公開第０１／６０８０５号の中間体Ｂ６９（８７．１ｇ、０．２６ｍｏｌ．）を、ジクロロメタン（２．９リットル）に懸濁した。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（３５．２ｇ、０．２６ｍｏｌ．）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（９９．７ｇ、０．５２ｍｏｌ．）を加え、懸濁液を４５分撹拌した時点で完全な溶液が得られた。国際公開第０１／６０８０５号の中間体Ａ３０（９１．２ｇ、０．２６ｍｏｌ．）をジクロロメタン（１００ｍｌ）溶液として５分間かけて加え、溶液を４時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム溶液：水混合物（１：１、１リットル）を加え、溶液を１０分間撹拌した。有機相を分離し、飽和塩化アンモニウム：水混合物（１：１、１リットル）で抽出し、抽出物はｐＨ６であった。有機相を分離し、酢酸（１０ｍｌ）を含む水（１リットル）で抽出し、抽出物はｐＨ５であった。ジクロロメタン層を分離し、飽和炭酸ナトリウム溶液：水：飽和食塩水混合物（１：３：０．２、１リットル、ｐＨ１０．５）で、次いで飽和食塩水：水混合物（１：１、１リットル）で抽出した。褐色溶液を、脱色木炭（３５ｇ）の存在下、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、溶媒を減圧下で除去して、暗褐色の泡状物を得た。泡状物を酢酸イソプロピル（１００ｍｌ）に溶解し、溶媒を減圧下で除去した。暗褐色のゴム状残渣を、沸騰した酢酸イソプロピル（５００ｍｌ）に溶解し、室温に冷却し、種晶を入れ、一晩撹拌した。生成した淡いクリーム色の固体をろ別し、酢酸イソプロピル（１００ｍｌ）で洗浄した。固体をシンター（ｓｉｎｔｅｒ）中で１時間吸引乾燥した後、酢酸イソプロピル（４００ｍｌ）から再結晶した。一晩撹拌した後、形成された固体をろ別し、酢酸イソプロピル（８０ｍｌ）で洗浄し、減圧乾燥して、表題化合物を得た（１１０ｇ、収率６３．５％）。1H NMR (CDCl₃, 約1.9:1の回転異性体混合物) δ 0.99 (6H, t), 2.10 (2H, m), 2.50 (4H, q), 2.58/2.62 (2H, 2 x t), 2.70/2.82 (2H, 2 x t), 2.86 (2H, t), 3.28/3.58 (2H, 2 x t), 4.45/4.52 (2H, 2 x s), 4.68/4.70 (2H, 2 x s), 4.93 (2H, s), 6.95 (2H, m), 7.31 (2H, d), 7.31/7.37 (2H, 2 x m), 7.48/7.52 (2H, d), 7.65 (2H, m), 7.72 (2H, m); MS (APCI) (M+H)⁺ 667; mp 125℃ (DSCによる−非対称吸熱)．

合成アプローチ例（Ｉ）−１（ｂ）
国際公開第０１／６０８０５号に開示されている１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノカルボニルメチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン酒石酸水素塩

国際公開第０１／６０８０５号の実施例１の方法で、国際公開第０１／６０８０５号の中間体Ａ３０およびＢ６９から製造した。¹H-NMR (d₆-DMSO, 約１：１の回転異性体混合物) δ 0.92/0.99 (6H,2x t), 1.99 (2H,m), 2.54 (6H,m), 2.68/2.74 (4H,m), 3.36 (2H,m), 4.21 (2H,s), 4.37/4.44 (2H,2x s), 4,63/4.74 (2H,2x s), 4,89/5.13 (2H,2x s), 7.08/7.14 (2H,2x m), 7.36-7.50 (4H, m), 7.64/7.70 (2H,2x d), 7.83 (4H,m); MS (APCI+) 測定値 (M+1) = 667; C₃₆H₃₈F₄N₄O₂Sの理論値は666.
合成アプローチ例（Ｉ）−１（ｃ）

１−（Ｎ−（２−（ジエチルアミノ）エチル）−Ｎ−（４−（４−トリフルオロメチルフェニル）ベンジル）アミノカルボニル−メチル）−２−（４−フルオロベンジル）チオ−５，６−トリメチレンピリミジン−４−オン塩酸塩

国際公開第０１／６０８０５号に開示されているように、実施例（Ｉ）−１（ａ）由来の遊離塩基（３．００ｇ、０．００４５ｍｏｌ）をイソプロパノール（３０ｍｌ）に撹拌しながら懸濁し４５℃に温めて、透明な溶液を得た。次いで、溶液を周囲温度に冷却し、濃塩酸（０．４０ｍｌ、０．０４５ｍｏｌ）を加えた。次いで、得られたスラリーを周囲温度で３５分間撹拌し、その後、０℃に３５分間冷却した。その後、スラリーをろ過し、イソプロパノール（１０ｍｌ）で、次いでヘプタン（３０ｍｌ）で洗浄した後、減圧下で乾燥して、表題化合物を白色固体として得た（３．００ｇ、９５％）。¹H NMR (CDCl₃) δ .38 (6H, t), 2.08 (2H, m), 2.82 (2H, t), 2.99 (2H, t), 3.19 (4H, m), 3.35 (2H, m), 3.97 (2H, s), 4.42 (2H, s), 4.81 (2H, s), 4.99 (2H, s), 6.87 (2H, t), 7.26 (2H, t), 7.33 (2H, d), 7.41 (2H, d), 7.53 (2H, d), 7.71 (2H, d), 11.91 (1H, s)。

式（ＩＩ）の合成

式（ＩＩ）の化合物ならびに上記に挙げた化合物の中間体および最終生成物の例の製造方法は、参照により本明細書に援用する国際公開第０２／３０９１１号に記載されている。本発明において有用な化合物を製造するための最終段階の方法は実施例（ＩＩ）−１である。
合成アプローチ例（ＩＩ）−１

Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）−２−［２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル）−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩

国際公開第０２／３０９１１号に開示されているように、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’−（４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−イルメチル）−エタン−１，２−ジアミン（国際公開第０２／３０９１１号の中間体Ｄ４）（０．５０ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）と、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（０．５６ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）と、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（０．１２ｇ）と、２−（２−［２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル］−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−シクロペンタピリミジン−１−イル）−酢酸（国際公開第０２／３０９１１号の中間体Ｃ１）（０．４８ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）とのジクロロメタン（１０ｍｌ）溶液を周囲温度で一晩撹拌した後、ジクロロメタン（３０ｍｌ）で希釈し、重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、蒸発させた。残渣をクロマトグラフィー（１０ｇシリカカートリッジ、酢酸エチル−アセトン）で精製して、表題化合物を黄色泡状物として得た（遊離塩基）（０．５０ｇ、５２％）。¹H-NMR (DMSO, 回転異性体混合物) δ 0.83-0.89 (6H, m), 1.98 (2H, m), 2.40 (4H, m), 2.45-2.82 (10H, m), 3.02 (2H, m), 4.64/4.75 (2H,2x s), 4.96/5.19 (2H,2x s), 7.11-7.40 (5H, m), 7.65 (2H, m), 7.84 (4H, m); MS (APCI+) 測定値(M+1) = 667; ₃₇H₃₉F₅N₄O₂の理論値は666.

国際公開第０２／３０９１１に開示されているように、ｄ−酒石酸（０．０９ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を遊離塩基（０．４０ｇ、０．６０ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍｌ）溶液に撹拌しながら加えた。得られた溶液を蒸発させて塩を得た（０．４９ｇ）。¹H-NMR (DMSO, 回転異性体混合物) 0.85-0.97 (6H, m), 1.91-2.00 (2H, m), 2.40-2.49 (4H, m), 2.54-2.82 (10H, m), 3.02-3.46 (2H, m), 4.20 (2H, s), 4.64/4.75 (2H, 2x s), 4.97/5.18 (2H, 2x s), 7.11-7.40 (5H, m), 7.65 (2H, m), 7.84 (4H, m); MS (APCI+) 測定値 (M+1) = 667; C₃₇H₃₉F₅N₄O₂の理論値は666.

このプロセス、あるいは国際公開第０２／３０９１１に記載の別のプロセスに従い、式（ＩＩ）の構造を有する前述したその他の化合物を製造することができる。

国際公開第０２／３０９１１号；米国特許第７，１６９，９２４号の開示に従い、中間体Ｃ４３を中間体Ｄ８２と反応させることにより、国際公開第０２／３０９１１号に開示されているようにＮ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４Ｈ−クニナゾリン−１−イル）−Ｎ−（４’−クロロ−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩（実施例１３５）を製造した。

中間体Ｃ４３：

中間体Ｃ４３：２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−１−イル）−酢酸：
国際公開第０２／３０９１１号に開示されているように、２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４Ｈ−キナゾリン−１−イル）−酢酸エチルエステル（Ｂ６５）（６．８ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）のメタノール（３０ｍｌ）溶液および２Ｍ水酸化ナトリウム溶液（１８．０ｍｌ、３６ｍｍｏｌ）を周囲温度で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を水（１０ｍｌ）に溶解した。２Ｍ塩酸でｐＨ１に酸性化して固体を得、これをろ過し、水洗し、減圧乾燥して、所望の生成物（５．９ｇ、９４％）を白色固体として得た。¹H-NMR (DMSO) δ 3.11-3.30 (4H, m), 5.31 (2H, s), 7.16-7.33 (3H, m), 7.61 (1H, t), 7.68 (1H, d), 7.89 (1H, t), 8.18 (1H, d); MS (APCI+) (M+1) = 345（測定値）; C₁₈H₁₄F₂N₂O₃の理論値は344.

中間体Ｄ８２：

中間体Ｄ８２：Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−４−（クロロフェニル）−ベンジルアミン：
国際公開第０２／３０９１１号；米国特許第７，１６９，９２４号に開示されているように、中間体Ｄ８の方法により、中間体Ｄ８２を製造した。ピペリドン前駆体は、市販されていたか、文献の方法またはその軽微な改変例により市販の材料から容易に製造された。

式（ＩＩＩ）の合成

式（ＩＩＩ）の化合物の合成全体を、国際公開第０２／３０９０４号に示されるように、以下のスキームＩＩＩに示す。

スキームＩＩＩ

このスキームを参照して、塩基、例えばＢｕＬｉを含むＴＨＦまたは水素化ナトリウムを含むＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）の存在下で、（ＶＩ）（式中、Ｒ^１１は本明細書中で既に定義した通りである）（例えば、（ＶＩ）は、ｔ−ブチルブロモアセタートまたはブロモ酢酸エチルである）を用いて（Ｖ）をＮ−１アルキル化することより、エステル（ＩＶ）を製造することができる（ステップｃ）。

ＸがＣＨ_２Ｓである場合、主要中間体（ＩＶ）の合成は、低温でトリメチルスルホキソニウムヨージドを水素化ナトリウムで処理して生成したジメチルオキソスルホニウムメチリドと（ＸＸ）を反応させて硫黄イリド（ＸＸＩＩ）を得（ステップｑ）、その後、ジイソプロピルアミン存在下にて二硫化炭素で（ＸＸＩＩ）を処理し、次いでＲ^１ＣＨ_２−Ｌ^４（式中、Ｌ^４は脱離基である）で処理して、中間体（ＩＶ）を生成する（ステップｒ）ことにより行うことができる。

あるいは、ＸがＣＨ_２Ｓである場合、Ｒ^１Ｘ置換基の導入は、ピリジン（ＶＩＩＩ）上またはピリジンＮ−オキシド（ＸＩＶ）上の脱離基Ｌ^２（例えばＣｌ）の置換（ステップｅ）により２置換ピリジン（ＶＩＩ）および（ＸＶ）を得ることにより行うことができる。（ＶＩＩ）または（ＸＶ）から４−ピリドン（Ｖ）への変換は、４−酸素を脱保護し（例えば、Ｒ^１２＝アリルで、エタノール水溶液中にある場合、（Ｐｈ_３Ｐ）_３ＲｈＣｌを使用）（ステップｄ）、次いで、（ＸＶＩ）の場合、Ｐｄ／Ｃを含む酢酸の存在下で水素を用いてＮ−オキシド置換基を除去する（ステップｋ）ことにより、達成される。ピリジン（ＶＩＩＩ）またはピリジンＮ−オキシド（ＸＩＶ）は、ステップ（ｉ）、（ｈ）、（ｇ）、（ｆ）、および（ｊ）によって製造することができる：

（ｊ）ｍ−クロロ過安息香酸のジクロロメタン溶液による（ＶＩＩＩ）の処理；

（ｆ）Ｒ^１２ＯＨ（Ｘ）（式中、Ｒ^１２はアリルである）および水素化ナトリウムのＤＭＦ溶液による（ＩＸ）の処理；

（ｇ）オキシ塩化リンによる（ＸＩ）の処理；

（ｈ）加熱しながらＨＣｌ水溶液で（ＸＩＩ）を処理；

（ｉ）マロン酸ジ低級アルキルおよびナトリウムアルコキシドのアルコール溶液による（ＸＩＩＩ）の処理（式中、Ｒ^１３は、Ｃ_{（１−６）}アルキルであり、典型的にはＲ^１３＝Ｅｔ）。

Ｒ^１−ＣＨ_２ＳＨ（ＸＩＸ）は、典型的にはチオアセタートから製造され、対応するアルキルブロミドＲ^１−ＣＨ_２Ｂｒから形成される。

あるいは、ＸがＣＨ_２Ｓであり、Ｒ^２およびＲ^３が、それらが結合しているピリドン環炭素原子と一緒に縮合ベンゾ環を形成し得る場合、中間体（ＩＶ）は、公知の出発材料からステップ（ｓ）、（ｃ）、および（ｖ）により合成することができる：

（ｓ）低温で水素化ナトリウムによるメルドラム酸（ＸＸＩＩＩ）の処理、次いで、フェニルイソチオシアナートとの反応、その後、Ｒ^１ＣＨ_２−Ｌ^４で処理；

（ｃ）前述の通り；

（ｖ）トリフルオロ酢酸による（ＸＸＶ）の処理。

Ｘがアルキレンである場合、ステップ（ｍ）および（ｈ）（中間体（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ））またはステップ（ｎ）および（ｐ）（中間体（ＸＩＸ）、（ＸＸ）、（ＸＸＩ））を用いることが好ましい。：

（ｈ）例えばａｑＨＣｌおよびジオキサンを用いた（ＸＶＩＩ）Ｒ^１４＝Ｃｌの処理によるまたは例えばステップ（ｄ）の条件を用いたＲ^１４＝ＯＲ^１２の脱保護による、４置換ピリジンから４−ピリドンへの変換；

（ｍ）例えばＸ＝ＹＣＨ_２ＣＨ_２の場合、Ｒ^１−Ｙ−ＣＨ_２−Ｌ^４（ＸＶＩ）（式中、Ｌ^４は脱離基である）およびＢｕＬｉ等の強塩基のＴＨＦ溶液を用いて２−メチルピリジン（ＸＶＩＩＩ）を処理することによる、２−アルキルピリジンの鎖延長。

別の経路では、Ｒ^１５＝ｔＢｕの場合、ジフェニルエーテル中で加熱することにより中間体（ＸＩＸ）Ｒ^１５＝Ｃ_{（１−６）}アルキルから３−エステル基が除去され（ステップｎ）；中間体（ＸＩＸ）は、ＮａＨを含むＤＭＦまたは１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンを含むジクロロメタン等の塩基で処理することにより、２，６−ジオキソ−１，３−オキサジン（ＸＸ）およびエステル（ＸＸＩ）から形成される。

公知の出発材料からの（ＸＸ）の合成は、ステップ（ｗ）および（ｃ）またはステップ（ｙ）および（ｃ）により達成することができる。：

（ｗ）アジドトリメチルシランのＴＨＦ溶液による（ＸＸＶＩＩ）の処理；

（ｙ）ホスゲンによる（ＸＸＶＩ）の処理；

（ｃ）前述の通り。

式（ＩＩＩ）の化合物の製造方法の更なる詳細および解説については、参照により本明細書に援用する国際公開第０２／３０９０４号を参照されたい。

合成アプローチ例（ＩＩＩ）−１
Ｎ−（１−（２−メトキシエチル）ピペリジン−４−イル）−２−［２−（２，３−ジフルオロベンジルチオ）−４−オキソ−４Ｈ−キノリン−１−イル］−Ｎ−（４’−トリフルオロメチルビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド

ジクロロメタンの代わりにＤＭＦを溶媒として用いたこと以外は、国際公開第０２／３０９０４号に開示されているように、実施例１の方法で中間体Ｅ１および中間体Ａ４２から遊離塩基を製造した。この材料１．９７ｇを酢酸ｎブチル（１０ｍｌ）から結晶化させて表題化合物を得た（１．３５ｇ）。¹H-NMR (CD₃OD) δ 1.7-2.05 (4H, m), 2.05-2.3 (2H, 2xt), 2.5-2.65 (2H, m), 2.95-3.1 (2H, m), 3.3 (3H, s), 3.45-3.55 (2H, m), 3.9-4.05 + 4.4-4.5 (1H, 2xm), 4.37 + 4.48 (2H, 2xs), 4.71 + 4.87 (2H, 2xbr s), 5.31 + 5.68 (2H, 2xs), 6.44 + 6.52 (1H, 2xs), 6.95-7.3 (3H, m), 7.35-7.85 (11H, m), 8.2-8.35 (1H, m); MS (APCI+) 測定値 (M+1) 736; C₄₀H₃₈F₅N₃O₃Sの理論値は735.

式（ＩＶ）の合成

以下のフローチャートは本発明の化合物の製造プロセスを示している。

更に、このフローチャートに記載の中間体の一部の製造に有用であり得る化学については、公開されたＰＣＴ出願の国際公開第０３／０１６２８７号を参照されたい。それらの化学を、それらが本ケースにおいて有用な範囲で、本明細書中に完全に記載したのと同様なように参照により本明細書に援用する。更に、公開されたＰＣＴ出願の国際公開第０１／６０８０５号、同第０２／３０９１１号、同第０２／３０９０４号、同第０３／０４２２１８号、同第０３／０４２２０６号、同第０３／０４１７１２号、同第０３／０８６４００号、および同第０３／８７０８８号、米国特許出願公開２００８／００９０８５１号、同第２００８／００９０８５２号、同第２００８／００９０８５３号、および同第２００８／０１０３１５６号に記載の合成を参照する。先の頁の経路中のもの以外の中間体、試薬、溶媒、時間、温度等を用いて式（ＩＶ）の化合物を製造したい場合、これらの公開物は有用な手引となり得る。こららの出願中の化学が本化合物の製造に関連する範囲で、それらの材料を参照により本明細書に援用する。

Ｌｐ−ＰＬＡ _２阻害剤を同定するためのバイオアッセイ：
Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質阻害についてのスクリーニング

いくつかの態様では、本発明の方法は、任意の原因の、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等を含む眼疾患を処置するためのＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤の使用に関する。必要であれば、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質を阻害する薬剤を、バイオアッセイで、例えば参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許第５，９８１，２５２号に開示されているように、評価する。

本明細書に開示されている化合物、例えば合成例という題名のセクションに開示されている化合物を試験し、０．１〜１０ｎＭのＩＣ_５０値を有することが見出された。

本明細書に提示する例は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の阻害による、任意の原因の、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等を含む眼の疾患を防止および／または処置するための方法および組成物に関する。本願全体で種々の公開物を参照する。本発明が関する分野の水準をより完全に記述するために、公開物およびそれらの公開物中で引用されている参照文献の全ての開示の全体を参照により本願に援用する。以下の実施例は発明の請求範囲を限定することを意図しておらず、特定の態様の例であることが意図される。当業者に考えられる例示されている方法のあらゆるバリエーションが本発明の範囲に含まれることが意図される。

いくつかの態様では、ＣＮＳ血管透過性を低減させる効果について、本明細書に開示のモデル動物においてＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤が評価され得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示のモデル動物、例えばＳＴＺ誘発糖尿病ラットにおいて、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤が評価され得る。

いくつかの態様では、糖尿病および高コレステロール血症の組合せで誘発された血液／網膜関門透過性増大を示すモデル動物において、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤が評価され得る。

実施例１

ＣＮＳ血管透過性の低減におけるＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤の効果

糖尿病（ＤＭ）／高コレステロール血症（ＨＣ）ブタ中でのＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤

方法：

ブタにおける糖尿病の誘発

ヨークシャー飼育農場ブタ（約２５〜３５ｋｇ；アーチャー・ファームズ社（ＡｒｃｈｅｒＦａｒｍｓ）製）で、１２５ｍｇ／ｋｇストレプトゾトシンの単回静脈内注射により糖尿病を誘発した（Mohler et al., 2008）。血中のグルコースおよびコレステロールを詳細にモニタリングした。糖尿病誘発の３日後、高脂質食を用いて、血清コレステロール濃度が４００〜８００ｍｇ／ｄｌに固定された高コレステロール血症を実現した。ブタは高コレステロール食に対して変わりやすい血清コレステロール応答を示すので、コレステロール濃度を２ヶ月毎にチェックした。ＤＭＨＣ誘発の１ヶ月後、１０ｍｇ／ｋｇ／ｄの選択的Ｌｐ−ＰＬＡ_２阻害剤Ｄａｒａｐｌａｄｉｂ（グラクソ・スミスクライン社製）を経口投与された処置群または対照群に動物を無作為に割り当てた。誘発の２８週間後（すなわち、処置開始の２４週間後）にブタを屠殺した。実験終了時点では、対照群のブタ３頭を持続的にコレステロールレベルが上昇していたので分析から除外したため、対照群はブタ１７頭、Ｄａｒａｐｌａｄｉｂ処置群は２０頭であった。３頭のブタを、ＤＭ−ＨＣを誘発せずに、年齢が一致した対照として用いた。具体的な実験が公開されている（Wilensky et al., 2008）が、この論文中では血管漏出データは示されていない。

形態学的および定量的な免疫組織化学的解析のためのブタ脳組織の調製

非処置対照３頭、ＤＭＨＣ１３頭、Ｄａｒａｐｌａｄｉｂで処置したＤＭＨＣ１３頭（Ｒｘ）を含むブタ２９頭の脳の標本をパラフィンワックスで包埋した。各脳標本の連続切片を作製し、各サンプルを代表する第１の切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）で染色し、染色の差に基づいて皮質領域を非皮質領域と区別して決定できるようにした。本実験全体で、解析する組織の量を最大にしてその後の定量化を有利にするために、全（大）面組織ブロックを用いた。コンピューター支援画像解析およびＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓソフトウェアを用いて、Ｈ＋Ｅ染色切片中で、各切片中の皮質および非皮質脳組織の総面積（平方ｍｍ）を測定した。

ＢＢＢの完全性および透過性の示標としての脳血管からの免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の漏出の免疫組織化学的検出

脳の間質腔中にあるまたはニューロンもしくはアストロサイトに関連する全ての非血管性ＩｇＧの位置を特定するために、ブタ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な抗体で各標本ブロックを代表する切片を免疫染色した。ＢＢＢが無傷（ｉｎｔａｃｔ）と考えられる正常な脳では、ＢＢＢの完全性により、脳実質（特に大脳皮質）からＩｇＧが効率的に排除される。これに基づき、間質ＩｇＧ、ＩｇＧを含む血管周囲クラウド、ならびにニューロンおよび／またはアストロサイトに関連するＩｇＧの存在を、局所的血漿漏出およびＢＢＢの透過性増大または破綻の証拠と解釈した。パラフィン包埋組織の免疫組織化学を以前に報告されているように行った（D’Andrea et al., 2001；Nagele et al., 2002）。簡潔に述べると、脳組織切片をキシレンで脱パラフィンし、濃度を段階的に下げたエタノール系列で再水和した。クエン酸バッファー中で切片にマイクロ波を照射することによりタンパク質の抗原性を高めた。０．３％Ｈ_２Ｏ_２で切片を３０分間処理することにより内因性ペルオキシダーゼをクエンチした。切片を、最初にブロッキング血清中でインキュベートし、次いで、適切に希釈した一次抗体（抗ブタＩｇ）を用いて室温で１時間処理した。ＰＢＳ中で十分にすすいだ後、ビオチン標識二次抗体を３０分間アプライした。切片をアビジン−ペルオキシダーゼ標識ビオチン複合体（ＡＢＣ、ベクター・ラボ社（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｓ）製、フォスターシティー、カリフォルニア州）で処理し、３−３−ジアミノベンジジン−４−ＨＣＬ（ＤＡＢ）／Ｈ_２Ｏ_２（バイオメディア社（Ｂｉｏｍｅｄａ）製、フォスターシティー、カリフォルニア州）で処理することにより可視化した。次いで、切片をヘマトキシリンで軽く対比染色し、漸増濃度のエタノールで脱水し、キシレン中でクリアリングし、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ中にマウントした。対照は、非免疫血清、すなわち一次抗体を含まない血清で処理した脳切片からなる。標本を調べ、ニコン社製ＦＸＡ顕微鏡で写真を撮り、ニコン社製ＤＸＭ１２００Ｆデジタルカメラを用いてデジタル画像を記録し、ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ（フェーズ３イメージング社（Ｐｈａｓｅ３Ｉｍａｇｉｎｇ）製、グレンミルズ、ペンシルベニア州）画像ソフトウェアで処理した。

ＩｇＧ漏出を示す血管の密度の定量分析

血管（ＢＢＢ）漏出の密度（＝脳組織切片中の単位面積当たりの漏出の数）を以下のように計算した。コンピューター支援画像解析およびＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓソフトウェアを用いた各Ｈ＋Ｅ染色切片の皮質および非皮質脳組織の総面積（平方ｍｍ）。Ｈ＋Ｅ染色手法を少し改変して、色の差に基づいて皮質と非皮質を容易に識別できるようにした。この染色手法の、非皮質と皮質を区別して示す能力を、詳細な顕微鏡検査で確認した。各切片の面積決定後、次の連続的組織切片を、脳組織中の全てのＩｇＧの存在を検出するために、抗ブタＩｇＧ抗体で前述したように免疫染色した。各切片中の内部陽性対照は、当然、血管内ＩｇＧを含む血管から得た。皮質および非皮質中に見える血管で血管周囲漏クラウドを示した血管の輪郭の総数を数えることにより、各免疫染色切片を評価した。原因となる血管が切片の面の上または下にある多くの他の漏出クラウドも観察されたが、血管輪郭を含む漏出クラウドだけをカウントに含めた。各漏出クラウドに関連する血管を、細動脈、細静脈、または毛細血管として記録し、皮質または非皮質のいずれかとした。皮質または非皮質の単位面積（平方ｍｍ）当たりの漏出の数として漏出の密度を計算した。

血管（ＢＢＢ）漏出の程度の定量分析

脳切片中に見られた個々の漏出クラウドを、漏出の程度、脳の具体的な領域、血管の種類（細動脈、細静脈、または毛細血管）、およびその皮質または非皮質的位置についてスコア化した。ここで、血管周囲漏出クラウドは、原因の血管が中心または中心付近にある円として現れるが、これらのクラウドは実際には３次元において円柱状であることに留意されたい。これらは円柱状であるので、切片中で見られる漏出クラウドの直径が２倍であれば、実際には、漏出クラウドの体積（量）はおよそ４倍になる。したがって、ここで使用および記載される値は、本当の「３Ｄ」の値より過小評価されたものである。最後に、漏出クラウドの相対的サイズを「漏出量」または漏出の程度の尺度として用いた。

ＤＭＨＣブタ脳の大脳皮質全体にわたるアミロイドベータ１−４２（Ａβ４２）ペプチドの量および分布の定量分析

定量的免疫組織化学およびＡβ４２ペプチドに特異的な抗体を用いて、ブタ脳大脳皮質の組織切片中でＡβ４２を検出および定量化した。各標本ブロックを代表する切片を、Ａβ４２に特異的な抗体で免疫染色して調べ、ニコン社製ＦＸＡ顕微鏡で写真を撮り、ニコン社製ＤＸＭ１２００Ｆデジタルカメラで画像を記録し、ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ（フェーズ３イメージング社製、グレンミルズ、ペンシルベニア州）画像ソフトウェアを用いて解析した。組織内の無作為に選択された５つの皮質部位のそれぞれで、２０倍画像を、最も近い皮質層２〜３領域で２枚、対応する皮質層４〜６領域で２枚の４枚撮影した。このやり方で、各スライドから最大２０枚の２０倍画像を得た。画像解析には、ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ画像解析プログラム内で作動する自動サブプログラムを用いた。Ａβ４２免疫応答をほとんどまたは全く示さない対照画像を、同一の光強度、光フィルター、集光レンズおよび絞りの設定、ならびにデジタルカメラによる光増幅の条件下における基準閾値の設定に用いた。各２０倍組織切片中に存在する全Ａβ４２を自動で測定し、データをエクセルのスプレッドシートにダウンロードし、解析した。

観察結果

糖尿病（ＤＭ）／高コレステロール血症（ＨＣ）ブタにおける血管漏出に対するＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８４８の効果

Ｌｐ−ＰＬＡ_２の薬理学的阻害剤でブタを処置した結果、ＤＭ／ＨＣ対照動物（嗜眠性、一般に反応がにぶい）と比べて、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＤａｒａｐｌａｄｉｂを投薬された動物で全般的な健康促進効果（活動および注意力の増加）が示された。死体解剖後、ＳＢ４８０８４８処置ＤＭ／ＨＣ動物、対照ＤＭ／ＨＣ動物、および非糖尿病／非高コレステロール血症動物の脳を調べた。血液脳関門（ＢＢＢ）が無傷である正常な脳では、ＢＢＢの完全性により、脳実質（特に大脳皮質中）からＩｇＧが効率的に排除される。したがって、間質ＩｇＧ、ＩｇＧを含む血管周囲漏出クラウド、ならびにニューロンおよび／またはアストロサイトに関連するＩｇＧの存在は、局所的血漿漏出およびＢＢＢの透過性増大または破綻の証拠であると解釈した。対照ＤＭ／ＨＣ動物は、脳の全種類の血管からの著しい血管漏出の証拠を示し、これは顕著な行動的特徴の説明となり得る。これは、血管内ＩｇＧを含む血管領域中の脳実質中における強力な組織化学的ＩｇＧ免疫応答性により証明された。Ｄａｒａｐｌａｄｉｂは、脳微小血管系内の全種類の血管において漏出の程度を低減するのに有効であった（図１および２参照）。

血液は、Ａβ４２ペプチドの主要供給源であり、Ａβ４２ペプチドは血清中では脳脊髄液の１０倍濃縮されており、ＢＢＢ透過性増大期間中に脳内に漏出することが分かっている。脳に入った後、Ａβ４２ペプチドは特定の種類の神経細胞内に蓄積し得る（Clifford et al., 2007）。ＤＭ／ＨＣブタは、対照動物と比べて、大脳皮質（および調べた脳の全ての領域）の錐体ニューロン中で選択的にアミロイド蓄積の増加を示した。Ｄａｒａｐｌａｄｉｂは、非処置ＤＭ／ＨＣブタと比べた時、皮質の全ての層で、ＤＭ／ＨＣブタの脳中でのアミロイド蓄積を低減した。効果は、特定のニューロンに関連するＡβ４２ペプチドの量の減少（これは中程度であった）によるものではなく、Ａβ４２ペプチド陽性ニューロンの数（密度）の減少によるものであることが決定された（図３、４、および５参照）。

総合すると、ＤＭ／ＨＣブタの脳内におけるＩｇＧ染色およびＡβ４２ペプチド局在は、脳血管からの管腔物質が脳血管系から正常組織実質に逃げていることおよびそのような血管漏出が高コレステロール血症および糖尿病により誘発された代謝ストレスに起因することを示した。Ｄａｒａｐｌａｄｉｂによる処置は、代謝ストレスを受けた動物における行動変化を誘導すると考えられるだけでなく、代謝ストレスにより誘導されたＢＢＢ透過性の低減に高い有効性を示すようである。

実施例２

銅を与えた高コレステロール血症ウサギにおけるＬｐ−ＰＬＡ _２阻害剤の効果

方法：

ウサギにおける高コレステロール血症の誘発

３〜４ヶ月の雄のＳＰＦニュージーランドホワイト系マウスをコーヴァンス社（Ｃｏｖａｎｃｅ；デンバー、ペンシルベニア州）から購入し、個々に収容し、１２／１２時間の光暗サイクルで、ウサギ用の固形飼料および水を自由に摂取させた。実験は３週間空けて到着した動物で２回繰り返した。ウサギを、１群当たり８頭のサンプルサイズで５つの処置群に無作為に割り当てた。３２頭のウサギをコレステロール／銅食で飼育し、８頭のウサギには通常の固形飼料を与えた。コレステロール／銅食は、２％コレステロールを添加したまたは添加していない、１日当たり１６０ｇの市販食（ＰｕｒｉｎａＭｉｌｌｓＨｉｇｈＦｉｂｒｅＤｉｅｔ）からなる。コレステロール添加食を割り当てたウサギの飲料水には硫酸銅（０．１２ｍｇ／ｌ）を加えた。

動物への投薬

動物の体重を量り、首のひだへの皮下注射により、薬物または賦形剤を３ｍｌ／ｋｇで投与して１０ｍｇ／ｋｇの投与量になるようにした。

処置群

８頭の動物からなる６群の動物を以下の処置群に割り当てた。第１〜５群は、コレステロール添加食および硫酸銅を含む飲料水で飼育した。Ｎ−（１−エチルピペリジン−４−イル）−２−（２−（２−（２，３−ジフルオロフェニル）−エチル）−４−オキソ−４Ｈ−クニナゾリン−１−イル）−Ｎ−（４’−クロロ−ビフェニル−４−イルメチル）アセトアミド酒石酸水素塩がＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤化合物、すなわち、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９である。

第１群：２９〜７２日目まで賦形剤で毎日処置

第２群：２９から７２日目までＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９（１０ｍｇ／ｋｇ）で毎日処置

第３群：１〜７２日目まで賦形剤で毎日処置

第４群：１〜７２日目までＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９（１０ｍｇ／ｋｇ）で毎日処置

第５群：通常食で飼った処置なしの動物

ウサギ血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定

１、２９、３２、および７２日目に採取した血漿サンプル中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を、所有のＧＳＫ技術を用いて測定した。

ウサギ血液脳関門の透過性

５つの処置群それぞれのウサギ３頭、合計ウサギ１５頭に、血液脳関門透過性を評価するためのトレーサーを注射した。蛍光トレーサーのフルオレセインナトリウム（ＮａＦ）を用いてＢＢＢ透過性の変化を評価した。行った方法は、以前に報告されている方法（Lenzser et al., 2005；Phares et al., 2007；Morrey et al., 2008）を改変したものである。動物にイソフルランで麻酔し、２％ＮａＦを含むＰＢＳ５ｍｌを静脈内（ｉ．ｖ．）注射して３０分間循環させた。次いで、動物を、無色の灌流液が観察されるまでＰＢＳで５分間経心灌流（４５ｍｌ／ｍｉｎ）した。灌流後、動物を断頭し、脳を取り出し、左半球および右半球を単離した。左半球の重さを量り、１０倍体積の５０ｗ／ｖ％トリクロロ酢酸に入れ、ホモジナイズし、１３，０００ｇで１０分間遠心し、上清を５Ｍ水酸化ナトリウムで中和した。４４／５２５ｎｍ励起／発光波長でＮａＦ量を決定した。１０〜２００ｎｇ／ｍｌの基準を参照して蛍光色素含量を算出した。

観察結果

血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２へのＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９によるウサギの処置

反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）により４つの時点でＬｐ−ＰＬＡ２活性を分析した。効果群は有効であった（ｐ＜０．０００１）。有意効果群の事後分析から、高脂肪食の開始時からＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９で処置されたウサギは７２日のタイムコース全体で有意に低いレベルのＬｐ−ＰＬＡ２活性を示し、２９日目から処置を受けた動物は７２日目にＬｐ−ＰＬＡ２活性の低下を示すことが示された（図６参照）。

血液脳関門の透過性

通常食で飼育したウサギではＢＢＢ透過性がより低かったが、コレステロールおよび硫酸銅を添加した食餌で飼育したウサギはＢＢＢ透過性の大きな増大を示した。６つの群の透過性を比較した１元配置分散分析は統計的に有意であった（Ｆ（５，１６）＝１５．３１、ｐ＜０．０００１）。ダネットの事後検定は、通常食動物と高コレステロール／ＣｕＳＯ_４食で飼育した動物の透過性の間における有意な差を示した。高コレステロール／ＣｕＳＯ_４を与えた動物において、賦形剤処置群と比べて、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９処置動物における透過性の数的低下が観察された。これは、２９〜７２日目および１〜２７日目に薬物を投与した時に顕著であった（図７参照）。しかし、サンプルサイズが小さ過ぎたため、これらの差は統計的に有意ではなかった。動物１頭を灌流がうまくいかなかったので分析から除いた。

実施例３

ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病ラットにおけるＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤

ＳＴＺ誘発糖尿病は一般的に使用されている１型糖尿病モデルであり、ＳＴＺ糖尿病ラットは、血管拡張、基底膜肥厚、ニューロンおよびグリアの機能障害、ならびにｉＢＲＢ破綻を含むヒトで見られる背景糖尿病性網膜症の病理学的特徴のほとんどをその網膜が示すので、前臨床モデルとして最も頻繁に使用されている動物種である。この糖尿病性網膜症モデルは薬物の有効性を評価するために広く使用されてきた。

方法

動物、糖尿病誘発、および薬物投与

６週齡、体重１８０〜２００ｇの雄のＳＤラットを本実験に用いた。ラットは食料および水を自由に摂取でき、１２時間の明暗サイクルで環境制御されたケージ中で飼育された。ストレプトゾトシン（プロトコールの最初の３日間のそれぞれで、５０ｍｇ／ｋｇ／日を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与）を含む１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．６）を動物に投与して糖尿病を誘発した。Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２−［［（４−フルオロフェニル）メチル］チオ］−５−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル］−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１（４Ｈ）−ピリミジンアセトアミド（Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５）を１０％ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンまたはＤＭＳＯ：１％メチルセルロース（１：９９）に可溶化し、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９をＤＭＳＯ：１％メチルセルロース（１：９９）に可溶化し、それぞれ、４〜３１日目および４〜１８日目に１０ｍｇ／ｋｇ／日でｉ．ｐ．注射により投薬した。９ｍＭを超える上昇した血糖値を維持した動物を糖尿病と見なした。

ＳＤラットにおける血糖の測定

一晩絶食後、尾静脈から２５〜４０μｌの血液を取り、ジョンソン社（ライフスキャン事業部）製ＯｎｅＴｏｕｃｈＵｌｔｒａＥａｓｙＢｌｏｏｄＧｌｕｃｏｓｅＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇＳｙｓｔｅｍを用いて、メーカーの説明書に従い操作して血糖値を測定した。ストレプトゾトシン投与の前と後の両方で血糖値を測定した。

ＳＤラットの血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定

市販のＬｐ−ＰＬＡ２アッセイキットのＡＺＷｅｌｌＡｕｔｏＰＡＦ−ＡＨアッセイ（コスモ・バイオ株式会社製、日本、www.cosmobio.co.jp）をメーカーの説明書に従って用いて、血清サンプル中のＬｐ−ＰＬＡ２活性を測定した。

実験的光干渉断層法（ＯＣＴシステム）

市販のフーリエドメインＯＣＴ（ＲＴＶｕｅ−１００；バージョン２．１；オプトビュー社（Ｏｐｔｏｖｕｅ，Ｉｎｃ．）製、カリフォルニア州、米国）で網膜画像をスキャンした。中心波長が８４０ｎｍ、全帯域幅が５０ｎｍのスーパールミネセントダイオード光源をＯＣＴに適応させた。手動で調整したＲＴＶｕｅスキャナーの自動ソフトウェアで網膜厚を評価した。網膜色素上皮から網膜神経節細胞層（ＧＣＬ）までの層から網膜厚を定義した。

光干渉断層法（ＯＣＴ）イメージングならびに網膜厚および網膜液滲出の測定の方法

２つの別個の実験を行った。第２の実験では、実験の４、１０、１３、１７、２２、２８、および３１日目に、第１の実験では、実験の０、４、７、１０、１４および、１８日目に網膜画像を撮った。５％イソフロウランの吸入により動物に麻酔をかけ、１％トロピカミドおよび１％フェニルエフリンで瞳孔を拡張させた。ＯＣＴ分析の前に、動物をサポートフレームに固定し、画像化する眼を、眼底に垂直なスキャンビームの中心と整列するように配置した。スキャン長さが２ｍｍのラインスキャンパターン（１０２４軸方向スキャン）を用いて画像を得た。画像化後、動物を回復させ、ケージに戻した。６つの時点のＯＣＴ測定から得られた網膜厚を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて反復測定分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析した。ＡＮＯＶＡが有意な主効果を示した場合、更にスチューデントｔ検定を用いて化合物処置群と賦形剤対照との間の差を明らかにした。全てのデータは平均値±ＳＥＭで表される。

エバンスブルーを用いた網膜血管透過性の決定

この方法は、実験動物の網膜中に存在するエバンスブルーの測定にＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いたこと以外は以前に公開されている方法（Xu at el., 2001）に従って行った。動物を３０ｍｇ／ｋｇのアベルチンで麻酔し、腹部の皮膚および筋肉を切開し、腸骨の動脈および静脈を注意深く露出させ、それぞれ内径０．２８ｍｍおよび０．５８ｍｍのポリエチレンチューブでカニューレ処置し、ヘパリン添加食塩水で満たした。エバンスブルー（食塩水中３０ｍｇ／ｍｌ）を４５ｍｇ／ｋｇの用量で１０秒かけて腸骨静脈から注射した。エバンスブルー注射の２分後、腸骨動脈から５０μｌの血液を抜き取り、初期エバンスブルー血漿濃度を得た。その後、注射後２時間まで３０分間隔で腸骨動脈から５０μｌの血液を抜き取り、時間平均エバンスブルー血漿濃度を得た。注入から正確に２時間後に、５０μｌの血液を左心室から抜き取り、最終エバンスブルー血漿濃度を得た。結果を血漿１マイクロリットル当たりのエバンスブルーのマイクログラム数で表す。灌流の直後、両眼の眼球を摘出し、赤道で二分した。次いで、手術用顕微鏡下で網膜を注意深く解剖して分離した。解剖後、網膜サンプルをｓｐｅｅｄ−ｖａｃで乾燥させ、次いで、重さを量った後、メタノール（２０μｌ／ｍｇ組織）を添加した。その後、組織をホモジナイズし、１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心によりタンパク質を沈殿させた。上清３０μｌを、３０μｌのＨ_２Ｏおよび６μｌの内部標準液（２，３−ジヒドロ−５−メチル−ｎ−［６−［（２−メチル−３−ピリジニル）オキシ］−３−ピリジニル］−６−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキサミド、国際公開第９７／４８６９９号に開示、Ｈ_２Ｏ中２０ｎｇ／ｍｌ）で希釈した。更にボルテックスし、４０００ｒｍｐで５分間遠心した後、上清１０μｌをＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入して、網膜サンプル中のエバンスブルー濃度を測定した。ＬＣ法の移動相は（Ａ）１ｍＭＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４−ＣＨ_３ＣＮ（９／１、ｖ／ｖ）および（Ｂ）ＣＨ_３ＣＮ−ＣＨ_３ＯＨ（４／１、ｖ／ｖ）とした。グラジエントを表１に定義されるように流した。

表２：網膜組織中のエバンスブルーのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定のＭＳパラメーターを表２Ａおよび２Ｂに示す。

網膜の乾燥重量および網膜中へのエバンスブルー色素漏出をアッセイした。

以下の式を用いて血液網膜関門破綻を計算した。

ラット脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の単離

３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを頸椎脱臼により屠殺した。白質、髄膜、および肉眼で見える軟膜血管を除去した後、氷冷したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＣ）で灰白質を十分にトリチュレートした。次いで、コラゲナーゼＩＩ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮａｓｅＩ（３９Ｕ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ（５つのラット脳に７ｍｌ）中、振盪速度１３０ｒｐｍ、３７℃で１時間、組織を消化した。消化した組織を同じ体積のＤＭＥＭで希釈し、１０００ｇ、４℃で８分間遠心した。細胞ペレットを２０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）−ＤＭＥＭ溶液に再懸濁し、１０００ｇ、４℃で２０分間遠心した。ペレット中に得られた微小血管を、コラゲナーゼ−ディスパーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）およびＤＮａｓｅＩ（３９Ｕ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ（５つのラット脳に３ｍｌ）を用いて３７℃で０．５時間更に消化した。消化した微小血管溶液を同じ体積のＤＭＥＭで希釈し、７００ｇ、４℃で６分間遠心した。ペレットを再懸濁し、３３％連続パーコールグラジエント上に層にし、１０００ｇ、４℃で１０分間遠心した。微小血管層を回収し、同じ体積のＤＭＥＭで２回洗浄した。得られた微小血管断片を、６×１０^５細胞／ｃｍ^２の密度で、ＥＣＭ−コラーゲンコートＴｒａｎｓｗｅｌｌインサート（０．３３ｃｍ^２）中の補足内皮基本培地（ヒドロコルチゾン、ｈＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ｈＦＧＦ−Ｂ、Ｒ３−ＩＧＦ−１、アスコルビン酸、ゲンタマイシン／アムホテリシンＢ、および５％ＦＢＳを含むＥＢＭ（商標）−２、（ロンザ社（Ｌｏｎｚａ）製））にプレーティングした。ＢＭＥＣを付着させ、２４時間遊走させた後、培地を、４μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む補足ＥＢＭ（商標）−２に変えた。ピューロマイシン処置の２日後、培養培地を補足ＥＢＭ（商標）−２に交換して更に２日間維持した後、共培養モデル構築のためのそれらの準備が整った。

ラットアストロサイトの単離および培養

新生仔ＳＤラットからラット大脳アストロサイトを得た。髄膜を含まない脳皮質を刻んで、０．１２５％トリプシン−ＥＤＴＡで１０分間（３ｍＬ／ラット脳）で消化した。同じ体積の１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭを添加することによりトリプシンの活性を停止させた。懸濁液を分散させ、１０００ｇで５分間遠心した。細胞ペレットを１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ溶液で再懸濁し、その後、１００μｍおよび４０μｍのフィルターに通した。ろ液を遠心し、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに再懸濁した後、ポリＬリジンコートされたフラスコに密度１×１０^５細胞／ｃｍ^２でプレーティングした。培地は３日に１回交換した。培養９日後、混入しているミクログリアを除去するために、３７℃、９５％相対湿度、および５％ＣＯ_２の雰囲気でフラスコを一晩振盪した。得られたアストロサイトを更に継代するか−８０℃で冷凍保存した。

共培養したインビトロＢＢＢモデルの構築および経内皮電気抵抗の測定

１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭに懸濁したアストロサイトを継代１〜４代目に密度１．５×１０^４／ｃｍ^２でポリＬリジンコート２４ウェル培養プレートに播種した。２４時間後、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上で５日間培養したＢＭＥＣを、アストロサイトを含む２４ウェル培養プレートに移した。管腔側および反管腔側コンパートメントの培地を、５５０ｎＭヒドロコルチゾンを含む無血清補足ＥＢＭ（商標）−２に２日間交換した。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ（ミリポア社製、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を用いて毎日、単分子層の経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定し、ＴＥＥＲ＞１５０Ω・ｃｍ^２の場合、単分子層は輸送実験への準備が整っているとした。リゾホスファチジルコリン（リゾ−ＰＣ）でＢＭＥＣ単分子層を処理した後、同一のＴＥＥＲ測定を行った。対応のないスチューデントの両側ｔ検定により統計解析を行った。

ＢＭＥＣ−アストロサイト共培養中でのルシファーイエローの透過性

０．３、１、３、６、および１０μｇ／ｍＬのリゾＰＣをＴｒａｎｓｗｅｌｌシステム共培養プレートのアピカル側に加えてＢＭＥＣ単分子層を処理し（各濃度につきｎ＝４）、次いで、２μＬのルシファーイエローを同様にアピカル側に加えてルシファーイエローの終濃度が１００μＭになるようにした。吸い込みと分注を複数回行うことで各ウェルのアピカル側の組織培養液を十分に混合した。投与されたＢＭＥＣ単分子層を、１３０ｒｐｍのオービタルシェーカー上で混合しながら、３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ^２の加湿したチャンバー中で９０分間インキュベートした。９０分間インキュベートした後、５０μＬのドナー培地（アピカル）および１００μＬのレシーバー（バソラテラル）培地を吸引した。蛍光検出（励起波長４８５ｎｍ、発光波長５３０ｎｍ）を用いて、ドナーおよびレシーバーコンパートメント中のルシファーイエロー濃度を測定した。以下の式を用いてルシファーイエローの透過性を決定した。

式中、Ｖ_ＤおよびＶ_Ｒはそれぞれ、ｍＬで表したドナーおよびレシーバーの培地体積である。

Ａは、ｃｍ^２で表した膜表面積であり、ｔは秒で表した輸送時間である。

Ｃ_Ｒ（ｔ）は、時間ｔ（９０分）におけるレシーバーコンパートメントのルシファーイエローの測定濃度である。

Ｃ_Ｄ（ｔ）は、時間ｔ（９０分）におけるドナーコンパートメントのルシファーイエローの測定濃度である。

対応のないスチューデントの両側ｔ検定により統計解析を行った。

観察結果

ＳＴＺで３日間のＳＤラットにおける糖尿病の誘発により、空腹時血糖が上昇し、これは実験期間中維持された。予想された通り、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／日）での処置は、ＳＴＺで誘発された高血糖を変化させなかった。ＳＴＺで処置しなかった動物は、実験期間全体を通して、およそ５ｍＭの正常な血糖値を維持した（図８参照）。ＳＴＺによるＳＤラット処置は、血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２活性も上昇させ、これはその後、投薬後３時間および投薬後２４時間で観察されるように、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ）の単回投与により抑制された。この効果は、１０ｍｇ／ｋｇＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５の連日投薬の２回目の２４時間後に更により顕著であり、血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２活性は、ＳＴＺで処置した動物では更に上昇していたが、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５では上昇していなかった（図９参照）。これらのデータは、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５が血漿Ｌｐ−ＰＬＡ２活性を阻害するインビボ活性の直接的証拠を提供する。

ＳＤラットにおける高血糖の誘発は、網膜中でアルブミンに会合したエバンスブルー色素の血管外漏出を増加させた。このことは、そのような高血糖が血液網膜関門の透過性を増大させることができることの直接的証拠を提供する。網膜実質へのエバンスブルー透過性および血管外漏出は、高血糖等の刺激に応答したインビボ血液網膜関門透過性を示すための、数多く利用されており且つ確立された技術である（Xu et al., 2001）。３１日間の高血糖の誘発は、非糖尿病動物と比べて動物の大部分で血液網膜関門の透過性を増大させた。網膜透過性の増大は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ）で毎日動物を処置することにより弱まったが、これは非糖尿病対照が示すレベルまでは弱められず、非処置糖尿病動物と統計的に有意な差はなかったが、効果の傾向は明確であった（図１０、Ａ、Ｂ参照）。

インビボで網膜透過性を評価するための更なる方法は、光干渉断層法（ＯＣＴ）で網膜を直接画像化することであり、これにより、生きた動物中で網膜の個々の層を区別することができ、網膜層の構造中の乱れを評価することができる。網膜内の網膜下液の存在を識別することも可能であり、そのような計測手段は、糖尿病性眼疾患の診断および処置のモニタリングに臨床的に使用されている。この技術を用いて、正常血糖動物、高血糖動物、およびＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で２８日間処置した高血糖動物における液の網膜下滲出を評価した。正常血糖動物はいずれも１４日目までに網膜下液蓄積の証拠を示さなかったが、高血糖動物は動物の４０％が網膜液蓄積の徴候を示してスクリーニングされた。しかし、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した高血糖動物は、ＯＣＴによれば、明確な網膜液蓄積を有する動物を示さなかった（図１１参照）。このデータは、ＳＤラットにおいて急性高血糖に続く網膜透過性を緩和するこのクラスの化合物の効果を示している点でエバンスブルー透過性データを裏付けている。

血液網膜関門透過性が増大すると、網膜の恒常性が失われ、神経網膜が変性する。この特徴は前臨床モデルおよびヒト糖尿病黄斑浮腫患者の両方で観察される（Bursell et al., 1996；Ahlers et al., 2009）。前臨床モデルでは、これは、（網膜の層中で組織化されている）神経細胞数の減少、その後、網膜神経節細胞層（ＲＧＣ）と網膜色素上皮（ＲＰＥ）の間の層として定義される神経網膜層全体の菲薄化として現れる。ＯＣＴを用いて、網膜層の厚さを決定した。２つの個々の実験を行い、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐのＳＴＺで３日間動物を処置すると、網膜厚が時間依存的に劇的に減少した。第１の実験では、１０ｍｇ／ｋｇ／日のＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５での処置により、８日目の処置開始後、ＳＴＺ誘発網膜菲薄化が部分的ではあるが有意に阻害され、１０日目および１８日目に統計的差を評価した。（図１２、Ａ、Ｂ、Ｃ参照、両方の時点でｐ＜０．０５）。Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９での処置（４日目に開始）も、網膜厚の減少を示したが、この効果は賦形剤のみで処置した動物と統計的に有意な差ではなかった（図１２、Ａ、Ｂ、およびＣ）。但し、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９は、ラットＬｐ−ＰＬＡ２酵素に対してＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５よりも有意に弱い阻害剤であることに注意されたい。

独立した第２の実験では、ＳＴＺ（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄ、ｉ．ｐ．）で３日間処置した動物で、網膜厚が時間依存的に劇的に減少し、これは糖尿病誘発処置されていない動物と比べて有意な差であった（ｐ＜０．００１、ｔ検定）。後からＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５ＳＴＺで処置したＳＴＺ処置動物は、賦形剤で処置した糖尿病ラットと比べて網膜菲薄化の発現が有意に減弱された（ｐ＜０．００１、ｔ検定）（図１３参照）。

酸化リン脂質に対するＬｐ−ＰＬＡ２の作用は、リゾ−ホスファチジルコリンの生成を仲介し、リゾ−ホスファチジルコリンは強力な炎症性脂質であると提唱されており、白血球動員および炎症を誘導することが知られている（Tan et al., 2009）。血液ＣＮＳ関門（脳または網膜）のインビトロモデルにリゾＰＣを加えると、この薬剤は、そのようなインビトロ培養物を通常は透過できず、インビボ実験ではＣＮＳから完全に排除される、ルシファーイエロー等の物質の輸送増大を仲介することができる（Sarker et al., 2000）。密着した内皮単分子層を誘導するためにラット脳アストロサイトと共培養したラット脳微小血管内皮細胞を用いた実験により、内皮単分子層のアピカル面にリゾＰＣを添加するとルシファーイエローの輸送が用量依存的に減少することが実証された（図１４Ａ参照）。ルシファーイエローの輸送増大は、細胞単分子層の密着結合の完全性の示標である経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定値の低下とも関連していた（図１４Ｂ参照）。透過性増大の仲介におけるリゾＰＣの作用はヒト冠状動脈内皮細胞でも観察されており、単分子層の透過性を増大させ、密着結合に関連するタンパク質および接着結合に関連するタンパク質の両方の発現を低下させることが示されている（Yan et al., 2005）。リゾＰＣの作用は更に、これらの実験においてかなりのスーパーオキシドを発生させ、抗酸化剤処置により、リゾＰＣで刺激された単分子層の透過性は有意に阻害された（Yan et al., 2005）。Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の生成物、すなわちリゾＰＣの、内皮単分子層透過性制御における作用は、網膜血管系におけるＬｐ−ＰＬＡ２活性が糖尿病黄斑浮腫で起こる血管透過性増大の原因の一部であるという考えを更に裏付けている。リゾＰＣが発生すると、当然その後、血清酵素リゾホスホリパーゼＤの作用を介してリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が発生し（Umezu-Goto et al., 2002）、これは血管系および白血球の両方に対して種々の薬理学的活性を有する。

実施例４

ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発糖尿病Ｂｒｏｗｎ−ＮｏｒｗａｙラットにおけるＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤

ＳＴＺ誘発糖尿病は一般的に使用されている１型糖尿病モデルであり、ＳＴＺ糖尿病ＢＮラットは、血管拡張、基底膜肥厚、ニューロンおよびグリアの機能障害、ならびにｉＢＲＢ破綻を含むヒトで見られる背景糖尿病性網膜症の病理学的特徴のほとんどをその網膜が示すので、前臨床モデルとして最も多く使用されている動物種である。この糖尿病性網膜症モデルは薬物の有効性評価に広く使用されている。

方法

動物、糖尿病の誘発、および薬物投与

６週齡、体重１８０〜２００ｇのＢｒｏｗｎＮｏｒｗａｙ（ＢＮ）ラットを本実験に用いた。ラットは食料および水に自由に摂取でき、１２時間の明暗サイクルで環境制御されたケージ中で飼育された。ストレプトゾトシン（プロトコールの最初の３日間のそれぞれに６５ｍｇ／ｋｇ／日を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与）を含む１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．６）を動物に投与して糖尿病を誘発した。Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５を１０％ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンまたはＤＭＳＯ：１％メチルセルロース（１：９９）に可溶化し、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８５９をＤＭＳＯ：１％メチルセルロース（１：９９）に可溶化し、それぞれ、４〜３１日目および４〜１８日目に１０ｍｇ／ｋｇ／日でｉ．ｐ．注射により投薬した。９ｍＭを超える上昇した血糖値を維持した動物を糖尿病と見なした。

ＢＮラットにおけるエバンスブルーを用いた網膜血管透過性の決定

この方法は、ＥＤを分光測定で決定したこと以外は、ＳＤラットについて以前に報告されている、以前に公開されている方法（Xu at el., 2001）に従って行った。

血液網膜関門の完全性および透過性の示標としての網膜血管からのラット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の漏出の免疫組織化学的検出

眼球を摘出し、鋸状縁に沿って半分に分割し、硝子体液を除去した。眼杯を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中で３０分間浸漬固定し、ＰＢＳで洗浄し、網膜を剥離した。固定網膜を凍結保護し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で瞬間凍結した（ｓｎａｐｆｒｏｚｅｎ）Ｔｉｓｓｕｅ−ＴｅｋＯＣＴｃｏｍｐｏｕｎｄに包埋し、１２μｍの凍結切片を作製した。非血管性のＩｇＧおよびイソレクチンＢ４の位置を特定して網膜切片中の網膜血管の位置を決定するために、ラット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に特異的な抗体で切片を免疫染色し、共焦点顕微鏡で観察した。ニコン社製ＴＥ−２０００Ｃ１共焦点システム（ニコン社製、キングストン・アポン・テムズ、英国）を用いて蛍光を可視化した。いくつかのケースでは、ヨウ化プロプリジウム染色で網膜血管を強調した。

観察結果

エバンスブルーによる網膜血管透過性の評価（アルブミン測定）
２週間の実験で、実験中の通常の血糖モニタリングおよびＨｂＡ１ｃの測定により、ストレプトゾトシン処置群における持続的な高血糖が示された。持続的高血糖は、網膜におけるアルブミンの漏出を少し増大させた。しかし、このモデル固有のばらつきおよび一般的に高血糖により誘発されるＥＢ漏出の程度が低いことにより、この漏出は統計的に有意ではなかった。Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＱＤ）での処置はこの漏出を正常血糖群が示すレベルまで低減させたが、やはり、ばらつきが大きいため、このデータは統計的に堅固（ｒｏｂｕｓｔ）でなかった（図３、上および中央のパネル）。しかし、糖尿病誘発後にＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（ｉ．ｐ．、ＱＤ）で４週間処置したＢＮラットは、高血糖後に続くアルブミンの血管透過性増大の抑制におけるＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＱＤ）の統計的に有意な効果を示した（ｐ＜０．０４、糖尿病賦形剤処置動物に対して、図１５）。ＢＮラットへの投薬（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＱＤ）は、高血糖ラットにおいてトラフＬｐ−ＰＬＡ_２阻害レベル８９．７％（２週間実験）および９３．２％（４週間実験）を示し、これは、クリニックで１２週間後に８８％のＬｐ−ＰＬＡ２活性阻害を示した１６０ｍｇ投与量のＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’８４８（実験ＬＰＬ１０４８８４）と比べて遜色がない。これらの観察結果は、免疫組織化学による決定で網膜中へのアルブミンの血管外漏出が容易に観察可能であった同一動物におけるＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤’４９５の効果と一致する。

免疫組織学的検出による網膜血管透過性の評価

エバンスブルー用の処理を行わなかった動物に由来する網膜を用いて免疫組織化学的アルブミン検出を行った。凍結切片内の網膜血管をヨウ化プロピヅイム（ＰＩ）染色またはイソレクチンＢ４染色（ＩＢ４）のいずれかで強調した。抗アルブミンｍＡｂを用いてラットアルブミンを強調した。非糖尿病網膜では、両方の標識が強く共局在しており、アルブミンが血管内に制限されていることが示されている。表層（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ：ＳＰ）および深部神経叢（ｄｅｅｐｐｌｅｘｕｓ：ＤＰ）の血管を認識することができる。このことは、ｉＢＲＢが正常に機能していることを示している。糖尿病ラット（ＳＴＺ処置後３１日目）では、特に血管層（矢印）に隣接する領域付近の血管コンパートメントおよび神経網にアルブミンが局在しており、これは、サイズが約４０ｋＤａのタンパク質に対するｉＢＲＢの破綻、したがって、網膜中への血清の漏出を示している。ＳＢ４３５４９５で処置した糖尿病動物は、賦形剤のみで処置した高血糖動物と比べて、漏出が少なく、アルブミンと網膜血管の広範囲な共局在を示している。これらの知見は、２および４週間実験の動物に由来する切片中に明白である。脈絡膜は元々漏出性の血管床であるので、（予想された通り）脈絡膜に大量のアルブミンがある（図１６および１７参照）。これらの実験は、ＳＢ４３５４９５の１０ｍｇ／ｋｇ（図１７）および２０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ、ＱＤ）（図１６）投与が、アルブミン（タンパク質）の血管外漏出によって示される高血糖で誘発される血管透過性の増大を抑制できることを明確に示しているが、ＣＮＳ血管における血管透過性の増大は、種々のサイズの分子に対する血管透過性の制御の変化を特に伴い得る。

総合すると、糖尿病および高コレステロール血症の組合せにより誘導した血液網膜関門透過性の増大が薬理学的に活性なＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤を用いた処置に応答性であることを示すウサギおよびラットのデータは、疾患進行の主な原因要素がＣＮＳ血管系関門の破綻である疾患（例えば糖尿病性黄斑浮腫）においてそのような薬理学的阻害剤による介入が有益であることを実証している。ブタ脳データは、この網膜データと一致する。ＣＮＳ血液関門破綻の結果、しばしば虚血および浮腫が起こり、これは究極的に、患部組織の神経変性および血管変性の両方を生じ、細胞死／細胞喪失を招く。神経変性はしばしば、網膜厚の減少として現れ且つ容易に測定される。ＳＴＺ処置ラットにおいて糖尿病を誘発すると網膜厚が減少し、これが、開示されているＬｐ−ＰＬＡ２の薬理学的阻害剤を用いた処置により部分的に逆転したことは注目に値する。これらの薬剤の透過性に対する効果および網膜厚の維持により評価される網膜保護は、糖尿病の眼への影響に苦しむ糖尿病患者で進行中の血管変性プロセスから網膜を保護するのにこれらの化合物が有益であることを示唆する説得力のある事例を提供している。種々の活性Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤の有意な薬理学的効果は、高血糖または高血糖および高コレステロール血症で疾患が開始される様々な種（ｓｐｅｃｉｅｓ）に治療上有益な効果を示した。例示した実験におけるＬｐ−ＰＬＡ２化合物の効果に加えて、Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の産物が高度に炎症性の脂質であり、これが低血糖症および高脂血症に続くこれらのヒト疾患に関連する血管透過性効果および炎症効果の仲介を担っていると考えられる詳細な証拠がある。

いくつかの態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤の最適用量は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の活性および／または発現を低減する用量、例えば、Ｌｐ−ＰＬＡ_２遺伝子にコードされるｍＲＮＡ等の核酸の発現を低減したまたはＬｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の発現もしくは活性を低減した用量である。別の態様では、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤の最適用量は、例えば、限定されるものではないが、あらゆる原因による、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；ＡＭＤ；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等を含む眼の疾患もしくは障害の処置もしくは防止またはそのような眼の疾患もしくは障害の症状の軽減において最大の保護効果を生じる用量である。

いくつかの態様では、処置対象の患者集団は、中心部に影響する成人ＤＭＥ患者である。

別の態様では、患者集団は真性糖尿病（１型または２型）に罹患している。

一態様では、ＤＭＥの確認はフルオレセイン血管造影を用いてなされる。

一態様では、中心窩を含む網膜の肥厚（ＤＭＥ）は、ＳＤ−ＯＣＴの中央亜領域の厚さがＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇＳｐｅｃｔｒａｌｉｓでは３３０ミクロン超、ＺｅｉｓｓＣｉｒｒｕｓでは３１０超であることにより決定される。

いくつかの態様では、投薬は硝子体内注射による。

いくつかの態様では、投薬は経口送達による。具体的な有効量は、１６０ｍｇを超えない最大１日経口投与量である。好ましくは、有効量は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤の、腸溶性コーティングされたマイクロ化遊離塩基錠剤として製剤化される。より具体的な有効量は、Ｄａｒａｐｌａｄｉｂの、腸溶性コーティングされたマイクロ化遊離塩基錠剤１６０ｍｇを超えない最大１日経口投与量である。

いくつかの態様では、特にＤＭＥに対する処置前のベースラインと比較した、最高矯正視力（ＢＣＶＡ）および網膜厚を、本明細書に開示のＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤を用いた処置の有効性の示標とする。

いくつかの態様では、投薬は、処置効果が認識される前に、一定期間行われる。特定の態様では、処置は、３０日間が推奨される、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤を含む医薬組成物の連日経口投与である。別の態様では、処置は、６０日間が推奨される、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤を含む医薬組成物の連日経口投与である。更に別の態様では、処置は、９０日間が推奨される、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤を含む医薬組成物の連日経口投与である。

一態様では、中心部に及ぶＤＭＥに罹患した対象におけるＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤の投与の有効性を決定するために、ＢＣＶＡで測定を行った。別の態様では、中心部に及ぶＤＭＥに罹患した対象におけるＬｐ−ＰＬＡ２阻害剤の投与の有効性を決定するために、眼の中心亜領域についてスペクトラルドメインＯＣＴ（ＳＤ−ＯＣＴイメージング）を用いて分析を行った。

別の態様では、眼のフルオレセイン血管造影（漏出領域）、眼底写真（網膜肥厚領域）、およびＳＤ−ＯＣＴ（黄斑体積、網膜下液、網膜内嚢胞）の１または複数によって評価される網膜の解剖学的形態の変化を用いて処置の有効性を決定した。

いくつかの態様では、処置の有効性を評価するために、対象は１または複数の以下の追加的な眼の疾患または障害を有さない。例えば、白内障、緑内障、虚血性視神経障害、色素性網膜炎、糖尿病性網膜症、虚血性黄斑症、脈絡膜血管新生、眼内手術。

組成物の処方

化合物、例えば、本明細書に開示のＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤は、医薬として用いることができ、あるいは、本明細書に開示の有用性の１または複数を備えた医薬組成物を製剤化するために用いることができる。これらは、インビトロで培養中の細胞に、インビボで体内の細胞に、または後で同じもしくは異なる個体の体に戻すことができる個体の外側の細胞にエクスビボで投与することができる。そのような細胞は、脱凝集されていてもよく、固形組織として提供されてもよい。

化合物、例えば、本明細書に開示のＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤は、医薬または他の医薬組成物を製造するために用いることができる。薬学的に許容可能な担体を更に含んでなるＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤および個体への組成物の送達に有用な構成要素を更に含んでなる組成物の使用は当該技術分野で公知である。そのような担体および他の構成要素を本明細書に開示の薬剤に添加することは当業者の技術水準に十分含まれる。

いくつかの態様では、組成物は、全身送達用に適合された製剤として投与され得る。いくつかの態様では、組成物は、特定の臓器、例えば、限定されるものではないが、肝臓、骨髄への送達または全身送達用に適合された製剤として投与され得る。

あるいは、医薬組成物は、エクスビボで細胞の培養培地に添加することができる。活性化合物に加えて、そのような組成物は、薬学的に許容可能な担体と、投与を容易にするおよび／または取り込みを促進することが知られている他の成分（例えば、食塩水、ジメチルスルホキシド、脂質、ポリマー、親和性に基づく細胞特異的標的システム）を含み得る。組成物は、（例えば、ペレットまたはディスクとして形成された）ゲル、スポンジ、または他の浸透性マトリックス中に組み込まれて局所的持続放出のために内皮の近くに配置されてよい。組成物は、単回投与で投与されてもよく、異なる時点で投与される複数回投与で投与されてもよい。

医薬組成物は任意の公知の経路で投与することができる。例えば、組成物は、粘膜、肺、経口、局所等の局所経路または全身経路（例えば、経腸および非経口）により投与することができる。本発明において、「非経口投与」および「非経口投与された」という語句は、経腸および局所投与以外の、通常は注射による投与形態を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内の注射、注入、および他の注射または注入技術を含み、これらに限定されない。本発明において、「全身投与」、「全身投与された」、「末梢投与」、および「末梢投与された」という語句は、本明細書に開示の薬剤が動物の全身に入り、したがって、代謝および同様のプロセスを受けるような、本明細書に開示の薬剤の投与、例えば皮下投与を意味する。

本発明において「薬学的に許容可能な」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー応答等の問題または合併症がなく、妥当なベネフィット／リスク比と釣り合っており、ヒトおよび動物の組織に接触させての使用に適した、化合物、材料、組成物、および／または製剤を指して使用される。

本発明において「薬学的に許容可能な担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙａｃｃｅｐｔａｂｌｅｃａｒｒｉｅｒ）」という語句は、１つの臓器または体の一部から別の臓器または体の一部への目的薬剤の運搬または輸送に関わる、薬学的に許容可能な材料、組成物、または賦形剤、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、補形剤、溶媒、または封入材料を意味する。各担体は、製剤のその他の成分と共存可能であるいう意味で「許容される」必要があり、例えば、担体は処置への薬剤の影響を低下させない。換言すると、担体は薬剤的に不活性である。

投薬の量およびタイミング、製剤、ならびに投与経路の好適な選択は、糖尿病性眼疾患に罹患しているまたはそのリスクがある対象において好ましい反応を実現し（すなわち有効性）、対象への過度な毒性またはその他の害を回避する（すなわち安全性）という目標が達成されるようになされ得る。したがって、「有効な」（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）とは、所望の効果を実現するための条件の日常的な操作を含む選択を意味する。

１日１回短時間で個体に投与される製剤のボーラスは便利な投与スケジュールである。あるいは、有効な一日量を、投与のために複数回投与量、例えば１日２〜１２回投与量に分割することができる。医薬組成物中の活性成分の用量レベルも、個体中において化合物またはその誘導体の一過的または持続的な濃度が実現されるようにおよび所望の治療的反応または保護が得られるように、変更することができる。しかし、所望の治療効果を達成するのに要求されるよりも少ないレベルで投薬を開始して所望の効果が得られるまで用量を徐々に増やすことも当該技術分野の技術に含まれる。

投与されるＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤の量は、化合物の生理活性およびバイオアベイラビリティ（例えば、体内での半減期、安定性、および代謝）；化合物の化学的特性（例えば、分子量、疎水性、および溶解度）；投与の経路およびスケジューリング等の当業者に公知の因子によって異なる。任意の特定の個体用に達成される特定の投与量レベルが年齢、性別、健康、病歴、体重、１または複数の他の薬物との組合せ、および疾患の重症度を含む種々の因子に依存し得ることも理解される。

眼疾患の処置に関連する「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、とりわけ、疾患の進行を防止することまたは疾患の経過を変化させること（例えば、限定されるものではないが、疾患の進行を遅くする）、疾患の症状を逆転させること、対象における１もしくは複数の症状および／または１もしくは複数の生化学マーカーを軽減すること、１もしくは複数の症状の悪化もしくは進行を防止すること、回復を促進するもしくは予後を改善すること、ならびに／またはそれらのない対象において疾患を防止すること、ならびに既に存在する疾患の進行を遅くするもしくは軽減することを意味する。所定の対象について、症状の改善、その悪化、後退、または進行は、客観的または主観的尺度により決定することができる。

予防的方法（例えば、再発の防止または軽減）も処置とみなされる。

いくつかの態様では、処置は更に、他の既存の処置形態、例えば、眼疾患を処置するための既存の薬剤、例えば抗ＶＥＧＦ治療薬、例えばルセンティス（商標）、アバスチン（商標）、およびアフリベルセプト（商標）、ならびにステロイド、例えば、トリアムシノロン、およびフルオシノロンアセトニドを含むステロイドインプラントとの組合せも含み得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示のＬｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤は、他の薬剤、例えば神経変性疾患を防止および／または処置する治療剤と組み合わせることができる。そのような薬剤は、神経変性性の疾患または障害の処置および／または防止のために現在使用されているまたは開発されている、予防的および／または治療的効果を有し得且つ／または眼の障害または疾患の症状を軽減し得る任意の薬剤であり得る。

したがって、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する１または複数の薬剤と１または複数の他の医学的手法を更に併用した処置が実施され得る。

更に、処置は、Ｌｐ−ＰＬＡ_２の発現または活性を阻害する複数の薬剤を含んでなってもよい。

対象に投与される量は、好ましくは、その投与により得られる利点を超える毒作用を誘導しない量である。更なる目的は、認められているケアの標準と比較して、個体において、疾患の症状による数値を下げること、重症度を下げること、および／またはその他の点で苦痛を軽減することである。

現在の規制に従う化合物の製造は、政府機関（例えば米国食品医薬品局）により優良試験所基準（ＧＬＰ）および優良製造規範（ＧＭＰ）で規制されている。これは、正確且つ完全な記録の保持およびＱＡ／ＱＣの監視を要求する。インフォームド・コンセントが得られていること；製品の安全性、生理活性、適切な用量、および有効性がフェーズ中に研究されていること；結果が統計的に有意であること；および倫理指針に従っていることを確実にするための、機関または機関委員会による患者プロトコールの監督も想定される。モデル動物を用いたプロトコールならびに毒性化学物質の使用および規制の遵守の同様な監督も要求される。

Ｌｐ−ＰＬＡ_２の発現および／または活性を阻害することを目的とした、用量、製剤、用量体積、投与計画、および結果の分析方法は異なり得る。したがって、最小および最大の有効量は投与方法に応じて変わる。眼疾患に関連した臨床的および組織学的変化の抑制が特定の用量範囲内で起こり得るが、この用量範囲は、投薬を受ける生物、投与経路、Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤が他の共刺激分子と組み合わせて投与されるのかどうか、およびＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤投与の具体的投与計画によって異なる。例えば、一般的に、経鼻投与で必要な用量は、経口、経腸、直腸、または膣内投与よりも少ない。

本発明と使用するための経口または経腸製剤では、当該技術分野で周知の固形担体を用いて定法に従って錠剤が製剤化され得る。本発明の方法と使用する経口製剤のために使用されるカプセル剤は、ゼラチンまたはセルロース誘導体等の任意の薬学的に許容可能な材料から製造することができる。経口投与製剤用の徐放性経口送達システムおよび／または腸溶性コーティング、例えば、１９８７年１１月３日付けで付与された米国特許第４，７０４，２９５号「Enteric Film-Coating Compositions」、１９８５年１２月３日付けで付与された米国特許第４、５５６，５５２号「Enteric Film-Coating Compositions」、１９８２年１月５日付けで付与された米国特許第４，３０９，４０４号「Sustained Release Pharmaceutical Compositions」、および１９８２年１月５日付けで付与された米国特許第４，３０９，４０６号「Sustained Release Pharmaceutical Compositions」に記載されているものも予期される。

本明細書中の使用のための具体的な有効量は、Ｌｐ−ＰＬＡ２阻害剤の、１６０ｍｇの腸溶性コーティングされたマイクロ化遊離塩基錠剤である。より具体的な有効量は、Ｄａｒａｐｌａｄｉｂの、１６０ｍｇの腸溶性コーティングされたマイクロ化遊離塩基錠剤である。

固形担体の例としては、デンプン、糖、ベントナイト、シリカ、および他の一般的に使用される担体が含まれる。本発明の製剤中で使用することができる担体および希釈剤の更なる非限定的な例としては、食塩水、シロップ、デキストロース、および水が含まれる。

腸溶性コーティングされた製剤

本明細書に開示されている式（Ｉ）〜（ＩＶ）のようなＬｐ−ＰＬＡ_２阻害剤の小さな化学的実体を投与するための製剤に関して、特に有用な態様の１つは、腸溶性ポリマー剤皮を備えたＬｐ−ＰＬＡ阻害剤を含んでなる錠剤である。そのような製剤の例は国際公開第２００５／０２１００２号に見出すことができる。コア中の活性材料は、マイクロ化または可溶化された形態で存在し得る。活性材料に加えて、コアは、圧縮錠剤の分野で慣習的な添加剤を含み得る。そのような錠剤中の適切な添加剤は、希釈剤、例えば無水ラクトース、ラクトース一水和物、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはこれらの混合物；結合剤、例えば微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピル−セルロース、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、またはアラビアゴム、またはこれらの混合物；崩壊剤、例えば微結晶性セルロース（結合剤および崩壊剤の両方の機能を果たす）架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、またはこれらの混合物；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、滑剤または流動補助剤（ｆｌｏｗａｉｄ）、例えばコロイダルシリカ、タルク、またはデンプン、および安定化剤、例えば乾燥非晶質シリカ、着色剤、香味剤等を含んでなり得る。好ましくは、錠剤は、ラクトースを希釈剤として含んでなる。結合剤が存在する場合、結合剤は好ましくはヒドロキシプロピルメチルセルロースである。好ましくは、錠剤はステアリン酸マグネシウムを滑沢剤として含んでなる。好ましくは、錠剤は、クロスカルメロースナトリウムを崩壊剤として含んでなる。好ましくは、錠剤は微結晶性セルロースを含んでなる。

希釈剤はコアの１０〜８０重量％の範囲で存在し得る。滑沢剤はコアの０．２５〜２重量％の範囲で存在し得る。崩壊剤はコアの１〜１０重量％の範囲で存在し得る。微結晶性セルロースは、存在する場合、コアの１０〜８０重量％の範囲で存在し得る。

活性成分は、好ましくは、コアの重量の１０〜５０％、より好ましくはコアの重量の１５〜３５％を構成する（遊離塩基相当物として計算）。コアは、任意の治療上好適な用量レベルの活性成分を含み得るが、好ましくは最大１５０ｍｇを活性成分の遊離塩基として含む。特に好ましくは、コアは、２０、３０、４０、５０、６０、８０、または１００ｍｇを活性成分の遊離塩基として含む。活性成分は、遊離塩基としてまたは任意の薬学的に許容可能な塩として存在し得る。活性成分が塩として存在する場合、塩の遊離塩基として計算して、錠剤が所望の量の活性成分を含むように重量を調整する。

コアは、その構成要素を小型化した混合物から作製され得る。構成要素は、直接圧縮してもよく、造粒してから圧縮してもよい。そのような顆粒は、当該技術分野で公知の従来の造粒プロセスにより形成することができる。別の態様では、顆粒は、腸溶性剤皮（ｅｎｔｅｒｉｃｃａｓｉｎｇ）で個々にコーティングされた後、標準的なカプセル剤皮に封入されてよい。

コアは、腸溶性ポリマーを含んでなる剤皮で覆われている。腸溶性ポリマーの例としては、酢酸フタル酸セルロース、セルロースアセタートスクシナート、フタル酸メチルセルロース、エチルヒドロキシセルロースフタラート、ポリビニルアセタートフタラート、ポリビニルブチラートアセタート、酢酸ビニル−無水マレイン酸コポリマー、スチレン−マレイン酸モノエステルコポリマー、メチルアクリラート−メタクリル酸コポリマー、またはメタクリラート−メタクリル酸−オクチルアクリラートコポリマーが挙げられる。これらは、単独または組み合せて用いてよく、あるいは上記以外のポリマーと一緒に用いてもよい。剤皮は、生きた体の中で分解も可溶化もしない不溶性物質、例えばアルキルセルロース誘導体、例えばエチルセルロース、架橋ポリマー、例えばスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー、ヒドロキシルを有する多糖、例えばデキストラン、二官能性架橋剤、例えばエピクロロヒドリン、ジクロロヒドリン、または１、２−、３、４−ジエポキシブタンで処理されたセルロース誘導体を含んでもよい。剤皮はデンプンおよび／またはデキストリンを含んでもよい。

好適な腸溶性コーティング材料は、単独でまたは可塑剤と共に使用される、市販のオイドラギット腸溶性ポリマー、例えば、オイドラギットＬ、オイドラギットＳ、およびオイドラギットＮＥである。そのようなコーティングは通常、液体媒体を用いて適用され、可塑剤の性質は、媒体が水系であるか非水系であるかによって異なる。水系溶媒と用いる可塑剤としては、プロピレングリコール、クエン酸トリエチル、クエン酸アセチルトリエチル、またはＣｉｔｒｏｆｌｅｘもしくはＣｉｔｒｏｆｌｅｘＡ２が含まれる。非水系可塑剤としては、これらならびにフタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、およびセバシン酸ジブチルが含まれる。好適な可塑剤はクエン酸トリエチルである。含められる可塑剤の量は当業者に明らかである。

剤皮は、粘着防止剤、例えばタルク、シリカ、またはモノステアリン酸グリセリンも含んでよい。好ましくは、粘着防止剤はモノステアリン酸グリセリンである。典型的には、剤皮は、約５〜２５ｗｔ％の可塑剤および最大約５０ｗｔ％の粘着防止剤、好ましくは１〜１０ｗｔ％の粘着防止剤を含み得る。

所望であれば、ポリマーの水性懸濁液形成を促進するために界面活性剤を含めてよい。可能な界面活性剤の多くの例が当業者に公知である。界面活性剤の好適な例は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、またはラウリル硫酸ナトリウムである。存在する場合、界面活性剤は、剤皮の０．１〜１０％、好ましくは０．２〜５％、特に好ましくは０．５〜２％を形成し得る。

一態様では、コアと腸溶性コーティングとの間にシールコートが含まれる。シールコートとは、コア中のあらゆるアルカリ性成分により起こり得る化学的攻撃から腸溶性剤皮を保護するために用いることができるコーティング材料である。シールコートは更に、表面をより滑らかにすることにより、腸溶性剤皮の付着をより容易にする。好適なコーティングは当業者に公知である。好ましくはシールコートは、Ｏｐａｄｒｙコーティングで作られており、特に好ましくはＯｐａｄｒｙＷｈｉｔｅＯＹ−Ｓ−２８８７６である。

あらゆる原因による、例えばＲＶＯ、炎症、手術後、牽引等による黄斑浮腫；ＡＭＤ；ぶどう膜炎；糖尿病性の眼の疾患および障害；糖尿病性網膜症等の、ＬｐＰＬＡ２による処置は、局所的に、局所的点眼薬、眼周囲注射（例えばテノン嚢下）として、または硝子体内注射により投与されてもよい。固体インプラント（生分解性であってもなくてもよい）または生分解性ポリマーマトリックス（例えばマイクロ粒子）等の技術を用いることにより薬物の持続放出を実現してもよい。これらは眼周囲または硝子体内のいずれかで投与されてよい。

参照文献
本明細書中および本願中で引用した参照文献を参照により本明細書に援用する。

Claims

対象における眼の障害または疾患を処置および／または防止する方法であって、眼の疾患または障害を有する対象を同定すること、ならびにＬｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の活性および／または発現を阻害する薬剤を含んでなる医薬組成物をそれを必要とする前記対象に投与することを含んでなる、方法。
前記眼の疾患または障害が黄斑浮腫である、請求項１に記載の方法。
前記眼の疾患または障害が糖尿病性網膜症である、請求項１に記載の方法。
対象における黄斑浮腫を処置および／または防止する方法であって、黄斑浮腫を有する対象を同定すること、ならびにＬｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の活性および／または発現を阻害する薬剤を含んでなる医薬組成物をそれを必要とする前記対象に投与することを含んでなる、方法。
前記黄斑浮腫が、糖尿病性の眼の疾患または障害に関連する、請求項３に記載の方法。
前記黄斑浮腫が、網膜静脈閉塞症、炎症、手術後、牽引、またはぶどう膜炎に関連する、請求項３に記載の方法。
対象における異常な内側血液網膜関門に関連する疾患または障害を処置および／または防止する方法であって、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の発現および／または活性を阻害する薬剤を含んでなる医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含んでなる、方法。
前記異常なｉＢＲＢが、透過性血液網膜関門である、請求項７に記載の方法。
前記疾患または障害が、糖尿病性の眼の疾患または障害である、請求項７に記載の方法。
前記疾患または障害が糖尿病性網膜症である、請求項７に記載の方法。
前記疾患または障害が黄斑浮腫である、請求項７に記載の方法。
前記黄斑浮腫がぶどう膜炎に関連する、請求項４に記載の方法。
前記黄斑浮腫が網膜静脈閉塞症に関連する、請求項４に記載の方法。
前記疾患または障害が嚢胞性黄斑浮腫である、請求項４に記載の方法。
前記薬剤が、小分子、核酸、核酸アナログ、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、またはその変異体もしくは断片である、請求項１、４、または７に記載の方法。
前記核酸薬剤がＲＮＡｉ剤である、請求項１５に記載の方法。
前記ＲＮＡｉ剤が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはリボザイム、またはその変異体である、請求項１５に記載の方法。
前記小分子が、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−［［（４−フルオロフェニル）メチル］チオ］−４，５，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１Ｈ−シクロペンタピリミジン−１−アセトアミド、またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１５に記載の方法。
前記小分子が、Ｎ−［２−（ジエチルアミノ）エチル］−２−｛２−［２−（２，３−ジフルオロフェニル）エチル］−４−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジン−１−イル｝−Ｎ−｛［４’−（トリフルオロメチル）−４−ビフェニリル］メチル｝アセトアミド酒石酸水素塩またはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１５に記載の方法。
前記小分子が、２−［［（２，３−ジフルオロフェニル）メチル］チオ］−Ｎ−［１−（２−メトキシエチル）−４−ピペリジニル］−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１（４Ｈ）−キノリンアセトアミドまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１５に記載の方法。
前記小分子が、Ｎ−［２−（ジメチルアミノ）エチル］−２−［［（４−フルオロフェニル）メチル］チオ］−５−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル］−４−オキソ−Ｎ−［［４’−（トリフルオロメチル）［１，１’−ビフェニル］−４−イル］メチル］−１（４Ｈ）−ピリミジンアセトアミドまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１５に記載の方法。
Ｌｐ−ＰＬＡ_２を阻害する薬剤を含んでなる前記医薬組成物の投与後に前記対象の視力を測定することにより処置をモニタリングすることを更に含んでなる、請求項１、４、７、または１５に記載の方法。
網膜厚または内側血液網膜関門機能を評価することにより処置をモニタリングすることを更に含んでなる、請求項１、４、７、または１５に記載の方法。
前記対象に少なくとも１つの追加の治療剤を投与することを更に含んでなる、請求項１、４、７、または１５に記載の方法。
前期対象が哺乳動物である、請求項１、４、７、または１５に記載の方法。
眼の疾患または障害を処置および／または防止するための医薬の製造における、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の発現および／または活性を阻害する薬剤の使用。
黄斑浮腫を処置および／または防止するための医薬の製造における、Ｌｐ−ＰＬＡ_２タンパク質の発現および／または活性を阻害する薬剤の使用。