ES2847883T3

ES2847883T3 - Uso de inhibidores de LP-PLA2 en el tratamiento y prevención de enfermedades oculares

Info

Publication number: ES2847883T3
Application number: ES11802907T
Authority: ES
Inventors: Peter Adamson; Daniel Lee
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2010-12-17
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2021-08-04
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: US20130267544A1; JP2013545792A; EP2651403A2; WO2012080497A3; WO2012080497A2; EP2651403B1

Abstract

Un compuesto seleccionado de: N-[2-(dietilamino)etil]-2-[[(4-fluorofenil)metil]tio]-4,5,6,7-tetrahidro-4-oxo-N-[[4'-(trifluorometil)[1,1'-bifenil]-4-il]metil]-1Hciclopentapirimidin- 1-acetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y bitartrato de N-[2-(dietilamino)etil]-2-{2-[2-(2,3-difluorofenil)etil]-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-1Hciclopenta[d]pirimidin-1-il}- N-{[4'-(trifluorometil)-4-bifenilil]metil} acetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y 2-[[(2,3-difluorofenil)metil]tio]-N-[1-(2-metoxietil)-4-piperidinil]-4-oxo-N-[[4'-(trifluorometil)[1,1'-bifenil]-4-il]metil]-1(4H)- quinolinacetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y N-[2-(dimetilamino)etil]-2-[[(4-fluorofenil)metil]tio]-5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)metil]-4-oxo-N-[[4'-(trifluorometil)[1,1'- bifenil]-4-il]metil]-1(4H)-pirimidinacetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en el tratamiento y/o prevención del edema macular en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de inhibidores de LP-PLA2 en el tratamiento y prevención de enfermedades oculares

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades oculares, y más particularmente al tratamiento y/o prevención de enfermedades oculares utilizando agentes que inhiben la expresión y/o actividad de proteína Lp-PLA².

Antecedentes de la invención

El proceso de deterioro de los vasos sanguíneos que ocurre en la retinopatía diabética no se comprende completamente; sin embargo, la gravedad de la afección está directamente relacionada con el grado y la duración de la hiperglucemia. La discapacidad visual normalmente ocurre en las últimas etapas de la retinopatía diabética. El desarrollo de edema de mácula es una consecuencia directa de la ruptura de la barrera hemato-retiniana interna (iBRB), mientras que en la fase neovascular de la enfermedad (retinopatía diabética proliferativa; PDR) hay un crecimiento anormal de nuevos vasos sanguíneos que dan lugar a hemorragia vítrea que amenza la vista y desprendimiento de retina por tracción.

El edema macular se produce como resultado del aumento de la isquemia retiniana interna y la secreción de citocinas y factores de crecimiento impulsada por hipoxia, siendo el más conocido el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El edema macular puede ocurrir como resultado de la oclusión de la vena retiniana (RVO), inflamación, posquirúrgica, tracción y similares. El edema macular, que puede ser el resultado de la diabetes, es una de las principales causas de pérdida de visión en los pacientes diabéticos. Además, el edema macular puede ocurrir en cualquier etapa de la retinopatía diabética, incluso antes de la aparición clínica de la enfermedad (Antonetti et al., 2006; Curtis et al., 2008).

Un gran número de pacientes asintomáticos con edema macular preclínico no buscan tratamiento hasta que ya se ha producido algún grado de pérdida de visión. Si bien la retinopatía diabética que amenaza la vista se puede tratar o contener hasta cierto punto mediante fotocoagulación con láser, corticosteroides, inhibidores de VEGF y cirugía vitreorretiniana, estas intervenciones se centran principalmente en la enfermedad en etapa terminal, tienen efectos secundarios significativos que amenazan la vista y no abordan los problemas iniciales y patología vasodegenerativa potencialmente reversible (Chung et al., 2008). El efecto neto de la isquemia retiniana sostenida o el edema macular es la neurodegeneración de la capa neurorretiniana que conduce a la pérdida de la visión. Por lo tanto, persiste una necesidad insatisfecha de tratar el edema de mácula cuando las opciones de tratamiento menos onerosas idealmente proporcionarían resultados superiores, tal como la agudeza visual.

La ruptura de la iBRB es uno de los cambios fisiopatológicos más importantes en las primeras etapas de la retinopatía diabética, así como de otras enfermedades retinianas isquémicas o inflamatorias, tal como la oclusión de la vena central de la retina y la uveítis. Se ha observado vasopermeabilidad y disfunción manifiesta de iBRB tanto en pacientes con diabetes como en modelos animales diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los mecanismos exactos que subyacen a la degradación de iBRB no están muy claros, pero se sabe que parte del mecanismo está relacionado con los niveles de VEGF (y otras citocinas) que conducen a una disfunción endotelial, incluida la pérdida de la integridad de la unión estrecha y la pérdida de células. Los vasos retinianos del ojo residen en la retina neural, que es una extensión del sistema nervioso central y, en consecuencia, estos son vasos del tipo del CNS que son anatómicamente idénticos a los vasos del CNS en el cerebro. Por tanto, la barrera interna de la retina (vascular) se denomina barrera hemato-retiniana anterior, mientras que los vasos del cerebro se denominan barrera hematoencefálica. Tanto la barrera hemato-retiniana anterior como la hematoencefálica son únicas cuando se comparan con todos los demás lechos vasculares en que las propiedades de barrera de las barreras del CNS mejoran significativamente. Esta importante característica anatómica se logra mediante el desarrollo de uniones endoteliales estrechas que proporcionan una barrera iónicamente hermética con una permeabilidad muy baja. Esta permeabilidad increíblemente baja es importante para la homeostasis del CNS y las perturbaciones de esta permeabilidad pueden provocar eventos graves tales como edema del CNS y edema macular diabético (EMD).

El estrés oxidativo ha generado mucho interés principalmente debido a su papel aceptado como un importante contribuyente a la etiología de patologías normales, senescentes y crónicas con graves implicaciones para la salud pública tales como la diabetes y la aterosclerosis. Por lo tanto, se deduce que ese aumento del estrés oxidativo parece ser un factor importante para la enfermedad cardiovascular diabética (Pennathur et al., 2007) y probablemente otras complicaciones de la enfermedad vascular diabética tal como la retinopatía diabética, el edema macular diabético y la nefropatía diabética. De hecho, las personas con diabetes mellitus e hipercolesterolemia tienen un mayor riesgo de complicaciones ateroscleróticas macrovasculares (Moreno et al., 2000). La activación de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa se ha implicado como la principal fuente de generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) en la vasculatura en respuesta a la glucosa alta y los productos finales de glicación avanzada (AGE) (Dave et al., 2007). Los AGE están fuertemente implicados en la retinopatía diabética y, de hecho, los AGE se acumulan dentro de los diversos órganos que resultan dañados en la diabetes, con la tasa de acumulación de estos AGE acelerada por la hiperglucemia. Los AGE se acumulan en la mayoría de los sitios de complicaciones de la diabetes, incluidos los riñones, la retina y las placas ateroscleróticas (Hammes et al., 1999; Bucala et al., 1995; Makita et al., 1994). Los AGE se han localizado en los vasos sanguíneos de la retina en pacientes con diabetes tipo 2 y se ha encontrado que se correlacionan con el grado de retinopatía (Murata et al., 1997; Stitt 2001). Cuando se infunde albúmina AGE preformada en animales no diabéticos, los aductos se acumulan alrededor y dentro de los pericitos, se localizan conjuntamente con los receptores AGE, inducen el engrosamiento de la membrana basal y contribuyen a la ruptura de la barrera hemato-retiniana interna (Stitt et al., 1997; Stitt et al., 2000). Además, las células endoteliales vasculares retinianas expuestas a los AGE muestran una expresión anormal de óxido nítrico sintasa endotelial (Chakravarthy et al., 1998), lo que puede explicar algunas de las anomalías vasorreguladoras observadas en la microcirculación retiniana en la diabetes. Los estudios in vitro también han demostrado la sobrerregulación de VEGF en las células de la retina después de la exposición a AGE (Lu et al., 1998), lo que potencialmente promueve la neovascularización retiniana y aumenta la permeabilidad a las proteínas a través de la barrera retiniana.

La formación de AGE en proteínas, lípidos y ADN puede tener graves consecuencias para la función macromolecular (Paget et al., 1998; Giardino et al; 1994; Addel-Wahab et al., 1996) y se forman constantemente en condiciones fisiológicas. Se han desarrollado sistemas receptores complejos para eliminar moléculas senescentes modificadas por glicación y/o degradar los enlaces cruzados de AGE existentes de los tejidos, lo que limita sus efectos deletéreos. Tales receptores juegan un papel crítico en la biología relacionada con los AGE y la patología asociada con la diabetes (Vlassara et al., 2001; Schmidt et al., 2000, Sano et al., 1999). Se han descrito varias moléculas de unión a AGE y se cree que muchos de los efectos adversos causados por los productos de glicación avanzada están mediados por los receptores de AGE. Receptor for Advanced Glycation Endproducts (RAGE) (Schmitd et al., 1994) es el mejor caracterizado de estos receptores. No obstante, sigue siendo controvertido si algunos o todos los receptores AGE sirven para promover o limitar la disfunción celular y tisular mediada por AGE. La elucidación de las funciones moduladoras del receptor AGE y las vías de transducción de señales son áreas de intensa investigación y la evidencia reciente sugiere que la unión del receptor AGE puede iniciar importantes vías de señalización que implican la activación de la proteína quinasa C (Mene et al., 1999; Scivittaro et al. 2000), fosforilación de tirosina de Janus quinasa (JAK)/transductores de señal y activadores de transcripción (STAT) (Huang et al., 1999) reclutamiento de fosfotidilinositol 3' quinasa a Ras (Deora et al., 1998) activación transcripcional (Lander et al., 1997), y la inducción de cascadas de estrés oxidativo que involucran NFkB y AP-1 (Bierhaus et al., 2007).

Una consecuencia del aumento del estrés oxidativo es la oxidación de lípidos, incluidos los fosfolípidos contenidos en las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Fosfolipasa A²asociada a lipoproteínas (Lp-PLA²), también conocido previamente en la técnica como factor activador plaquetario acetil hidrolasa (PAF acetil hidrolasa) es un miembro de la superfamilia de enzimas de fosfolipasa A²que participan en la hidrólisis de lípidos o fosfolípidos de lipoproteínas. Es secretado por varias células que desempeñan un papel importante en la respuesta inflamatoria sistémica a una lesión, incluidos macrófagos, monocitos, linfocitos, linfocitos T y mastocitos y se encuentra predominantemente asociado con LDL en la circulación humana (Wilensky et al., 2009). La enzima también se ha relacionado con enfermedades neurodegenerativas y se propusieron inhibidores para reducir los signos y síntomas de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (w O 2008/140449 A1).

Lp-PLA2 escinde de forma única los fosfolípidos oxidados, pero no sin modificar, y se ha demostrado que genera cantidades significativas de ácidos grasos libres no esterificados (NEFA) y lisofosfatidilcolina (lisoPC), ambos lípidos proinflamatorios. LisoPC, por ejemplo, ha sido implicado en la activación de leucocitos, inducción de apoptosis y mediación de disfunción endotelial (Wilensky et al., 2009; Lavi et al., 2007). Curiosamente, cuando se recolectaron muestras de plasma simultáneamente de la arteria coronaria principal izquierda y del seno coronario, se demostró que la producción neta local de lisoPC se correlacionó significativamente con la disfunción endotelial coronaria. Esta observación clínica fue consistente con estudios in vitro que muestran que la lisoPC provoca una regulación negativa de la expresión de la sintasa de óxido nítrico endotelial, la activación de la oxidasa NADPH endotelial y la inhibición de la migración de las células endoteliales. Por lo tanto, Lp-PLA2 podría contribuir al daño tisular asociado con la diabetes al producir lisoPC que podría aumentar un ciclo continuo de inflamación vascular y una mayor producción de ROS.

Dado que Lp-PLA2 circula con LDL (Wilensky et al., 2009) e impacta específicamente en la generación de lípidos proinflamatorios luego de su actividad enzimática sobre los lípidos de lipoproteínas oxidadas, es notable que el tratamiento de ratones db/db con lovastatina (un inhibidor de la HMGCoA reductasa, estatina), que se ha demostrado que reduce el LDL en humanos, pero también actúa como antiinflamatorio, también es eficaz para reducir la fuga vascular retiniana y los aspectos de la inflamación retiniana (Li et al., 2009). El tratamiento con lovastatina redujo significativamente los niveles de colesterol sérico y, como tal, puede haber contribuido a los efectos beneficiosos de la lovastatina en la retina. El ratón db/db es un modelo genético bien definido de diabetes tipo 2 que también es hiperlipidémica. También se observa un hallazgo similar en la ruptura de la barrera hemato-retiniana inducida por uveítis en ratones B10RMI (Gegg et al., 2005).

Se está estableciendo el concepto de que los procesos inflamatorios localizados desempeñan un papel en el desarrollo de la retinopatía diabética, y la evidencia que respalda la hipótesis se está acumulando rápidamente, incluidos los hallazgos de que la enfermedad ocular diabética se asocia con numerosos mediadores inflamatorios que resultan en leucostasis (adherencia de los leucocitos a la superficie luminal de los vasos retinianos) y aumento de la permeabilidad vascular. Esta nueva hipótesis ofrece nuevos conocimientos sobre la patogenia de la retinopatía diabética y ofrece nuevos objetivos para inhibir la enfermedad ocular.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades y trastornos oculares por inhibición de Lp-PLA2, por ejemplo, inhibición de la expresión y/o actividad de la proteína Lp-PLA2. En realizaciones particulares, las enfermedades oculares susceptibles de tratamiento y/o prevención mediante los métodos de la presente invención están asociadas con la ruptura de la barrera hemato-retiniana interna (iBRB). De acuerdo con la presente invención, la enfermedad o trastorno ocular es edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgico, tracción y similares; degeneración macular relacionada con la edad (AMD); uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares.

En realizaciones adicionales, enfermedades inflamatorias sistémicas tales como artritis reumatoide juvenil, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Kawasaki, esclerosis múltiple, sarcoidosis, poliarteritis, artritis psoriásica, artritis reactiva, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada, enfermedad de Lyme, enfermedad de Bechet, esponilitis anquilosante, enfermedad granulomatosa crónica, entesitis, pueden ser la causa subyacente de la uveítis que afecta a la retina y que puede resultar en edema de mácula. La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento y/o la prevención de la uveítis mediante la inhibición de Lp-PLA2, por ejemplo la inhibición de la expresión y/o la actividad de la proteína Lp-PLA2.

La presente invención se refiere a métodos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades y trastornos oculares por inhibición de Lp-PLA2, por ejemplo, inhibición de la expresión y/o actividad de la proteína Lp-PLA2. En realizaciones particulares, las enfermedades oculares susceptibles de tratamiento y/o prevención mediante los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, oclusión de la vena retiniana central, oclusión de la vena retiniana ramificada, síndrome de Irvine-Gass (post catarata y postquirúrgico), retinitis pigmentosa, pars planitis, retinocoroidopatía en perdigones, membrana epirretiniana, tumores coroideos, edema macular quístico, telengiectasia parafoveal, maculopatías por tracción, síndromes de tracción vitreomacular, desprendimiento de retina, neurorretinitis, edema macular idiopático y similares.

En una realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden administrar a un sujeto que necesita tratamiento y/o prevención de una enfermedad ocular, una composición farmacéutica que comprende un agente que inhibe Lp-PLA2, por ejemplo, un agente que inhibe la expresión de Lp-PLA2 y/o la actividad de Lp-PLA2 proteína. No se pretende que la presente invención se limite a ninguna etapa particular de la enfermedad (por ejemplo, temprana o avanzada).

En algunas realizaciones, como se describe en este documento, los métodos para prevenir la fuga de iBRB se proporcionan mediante la inhibición de Lp-PLA2, por ejemplo, inhibición de la expresión de Lp-PLA2 y/o inhibición de la actividad proteica de Lp-PLA2. En consecuencia, algunas realizaciones proporcionan métodos para inhibir Lp-PLA2 bloqueando la actividad enzimática y algunas realizaciones proporcionan métodos para inhibir Lp-PLA2 reduciendo y/o regulando negativamente la expresión de Lp-PLA2 ARN. En algunas realizaciones, la prevención y/o reducción de la fuga de iBRB o la permeabilidad de iBRB conduce a la prevención y/o reducción de síntomas asociados con enfermedades oculares diabéticas.

En una realización adicional, el sujeto al que se le administra un agente que inhibe la actividad o expresión de la Lp-PLA2 la proteína es un ser humano.

En otra realización, la presente invención proporciona métodos para tratar y/o prevenir un sujeto con o en riesgo de edema macular que comprenden administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un agente que inhibe la actividad y/o expresión de proteína Lp-PLA2, en donde la inhibición de la proteína Lp-PLA2 reduce o detiene un síntoma de edema macular. En algunas realizaciones, el edema macular está asociado con la enfermedad ocular diabética, pero no con la retinopatía diabética. En otra realización, el edema macular está asociado con la retinopatía diabética. En otras realizaciones, el edema macular está asociado con uveítis. En otra realización más, el edema macular puede deberse a cualquier otra causa, p. ej., debido a RVO, inflamación, posquirúrgica, tracción y similares.

En otra realización, la presente invención proporciona métodos para tratar y/o prevenir una enfermedad o trastorno asociado con la ruptura de la barrera hemato-retiniana interna en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende un agente que inhibe la expresión y/o actividad de la proteína Lp-PLA².

En algunas realizaciones, el agente que inhibe Lp-PLA2 puede inhibir la expresión de Lp-PLA2, por ejemplo, inhibir la traducción de Lp-PLA2 ARN para producir la proteína Lp-PLA2. En realizaciones alternativas, el agente que inhibe Lp-PLA2 puede inhibir actividad de la proteína Lp-PLA2. Se incluye cualquier agente para su uso en los métodos descritos en el presente documento.

El agente que inhibe la actividad proteica de Lp-PLA2 es una molécula pequeña, como se define a continuación. Según la invención, un inhibidor de molécula pequeña de Lp-PLA2 es, N-[2-(dietilamino)etil]-2-[[(4-fluorofenil)metil]tio]-4,5,6,7-tetrahidro-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1'-bifenil]-4-il]metil]-1 H-ciclopentapirimidin-1 -acetamida (también conocido como Darapladib o inhibidor de Lp-PLA2 '848) o una sal del mismo. Véase U.S. 6,649,619.

Según la invención, un inhibidor adicional de molécula pequeña de Lp-PLA2 es, 2-[[(2,3-difluorofenil)metil]tio]-N-[1 -(2 metoxietil)-4-piperidinil]-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1 ’-bifenil]-4-il]metil]-1 (4H)-quinolinacetamida (denominada alternativamente N-(1-(2-Metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida) (también conocido como Rilapladib o inhibidor de Lp-PLA2 '032) o una sal del mismo. Véase U.S. 7,235,566.

Un inhibidor adicional de molécula pequeña de Lp-PLA²es según la invención N-[2-(dimetilamino)etil]-2-[[(4-fluorofenil)metil]tio]-5-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)metil]-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1'-bifenil]-4-il]metil]-1 (4H)-pirimidinacetamida (también conocido como inhibidor de Lp-PLA2 '495) o una sal del mismo. Véase U.S. 6,953,803.

Un último inhibidor de molécula pequeña de Lp-PLA²es, según la invención, Bitartrato de N-[2-(dietilamino)etil]-2-{2-[2-(2,3-difluorofenil)etil]-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-1 H-ciclopenta[d]pirimidin-1-il}-N-{[4’-(trifluorometil)-4-bifenilil]metil}acetamida (alternativamente, bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4H-quninazolin-1-il)-N-(4'-cloro-bifenil-4-ilmetil)-acetamida) (también conocido como Inhibidor de Lp-PLA2 '859) o una sal del mismo.

En algunas realizaciones en las que se administra a un sujeto una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de Lp-PLA², los métodos pueden comprender además administrar al sujeto agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, pero sin limitarse a, agentes terapéuticos utilizados en el tratamiento de enfermedades oculares, incluido el edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgico, tracción, y similares; AMD; uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares. Se entenderá que la administración de agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades oculares puede implicar la aplicación de ciertos procedimientos, por ejemplo, pero no limitado a, fotocoagulación con láser focal retiniana, fotocoagulación panretiniana, esteroides administrados intravítreos, tales como triamcinolona, esteroides intravítreos Implantes que contienen acetónido de fluocinolona y terapias anti-VEGF administradas por vía intravítrea tal como Lucentis®, Avastin® y Aflibercept®.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en este documento para el tratamiento y/o prevención del edema macular, enfermedades oculares diabéticas, retinopatía diabética y otras enfermedades o trastornos oculares como se describen en este documento, son aplicables a sujetos, por ejemplo, mamíferos. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Además, el objeto de la presente invención se define como en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra evidencia de que la diabetes/hipercolesterolemia (DMHC) causa la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB), lo que conduce al influjo de plasma en el tejido cerebral y la unión de IgG a las neuronas. Las fugas microvasculares inmunopositivas para IgG se observan comúnmente en las diferentes regiones del cerebro de los cerdos con DMHC. El número de fugas observadas y la extensión o magnitud del influjo de plasma en el parénquima cerebral variaron enormemente, lo que respalda la naturaleza esporádica o impredecible de estas fugas en términos de dónde surgen. El contorno rojo encierra una pequeña arteriola aislada con una pequeña nube de fuga de plasma perivascular. Las neuronas (manchas de color marrón oscuro) son intensamente positivas para IgG en las regiones de fuga.

La Figura 2B muestra que Darapladib reduce la densidad de las fugas de las arteriolas en la corteza. (Panel superior): La densidad de las fugas arteriolares en la corteza (número de arteriolas con fugas por mm2) fue diferente entre el DMHC, el DMHC tratado con Darapladib (10 mg/kg/día durante 24 semanas) y el cerdo de control no tratado. Las arteriolas son los principales sitios de fugas vasculares detectables. La densidad de fuga arteriolar en el grupo tratado con fármaco se redujo algo en comparación con los otros grupos.

La Figura 2A muestra que Darapladib reduce la cantidad de material que se filtra de las arteriolas al cerebro. De manera similar, la extensión de las fugas arteriolares (es decir, la cantidad de material que se escapa de las arteriolas) también se redujo algo en la corteza cerebral de los cerebros de cerdo con DMHC tratados con Darapladib (10 mg/kg/día durante 24 semanas).

La Figura 3 muestra Abeta42 intraneuronal en la corteza cerebral del cerdo. Un hallazgo constante en estos estudios es que el tipo de célula neuronal dominante, la neurona piramidal, es el único tipo de célula neuronal que contiene Abeta42 en el cerebro del cerdo.

La Figura 4A muestra la densidad relativa de todo el cerebro de las neuronas que contienen Abeta42. Darapladib (10 mg/kg/día durante 24 semanas) redujo la densidad de neuronas positivas para Abeta42 en la corteza cerebral de cerdo DMHC en todo el cerebro de cerdo a niveles comparables a los de los controles.

La Figura 4B muestra la densidad de neuronas que contienen la comparación del cerebro completo Abeta42 de las capas 2-3 de la corteza cerebral (L2) con las capas 4-6 (L6). (Panel inferior): Aunque la densidad de neuronas positivas para Abeta42 fue ligeramente mayor en las capas corticales 2-3 del grupo DMHC, esto es de esperar en vista del tamaño de neurona piramidal generalmente más pequeño en esta capa.

La Figura 5A muestra la cantidad total de Abeta42 (Carga de Abeta42) en todo el cerebro. Darapladib (10 mg/kg/día durante 24 semanas) redujo la cantidad total de Abeta42 en la corteza cerebral en cerdos con DMHC.

La Figura 5B muestra la cantidad de Abeta42 por neurona que contiene Abeta42 en todo el cerebro. Esta reducción aparentemente no fue el resultado de la reducción de la cantidad de Abeta42 por neurona, sino de la reducción del número de neuronas que cargan Abeta42 (como también se muestra arriba en la Figura 4).

La Figura 6 muestra los niveles de Lp-PLA2 en conejos modelo de Alzheimer durante 10 semanas. Lp-PLA2 en 40 conejos tratados con dieta suplementada con colesterol y agua potable suplantada con sulfato de cobre en 5 grupos de animales que recibieron diariamente inyecciones s.c. Los dos grupos que recibieron el inhibidor de Lp-PLA2 '859 tuvieron niveles significativamente más bajos de actividad de Lp-PLA2. Los datos se expresan como media /- SEM.

La Figura 7 muestra la acumulación de fluorescencia de sodio en conejos tratados con vehículo de compuestos inhibidores de Lp-PLA2. Datos idénticos a los que se muestran en la Figura 5, acumulación de NaF en animales alimentados normalmente y animales alimentados con colesterol alto, dieta complementada con CuSO4 con o sin tratamiento con inhibidor de Lp-PLA2 '859 (10 mg/kg/día). Los datos se normalizan con la permeabilidad BBB de los animales alimentados normales ajustada a cero. Se muestran puntos de datos individuales para conejos individuales. Las líneas designan valores medios de grupo.

La Figura 8 muestra la inducción de hiperglucemia en ratas Sprague-Dawley (SD) después del tratamiento con estreptozotocina (STZ). Los datos se expresan como media /- SEM.

La Figura 9 muestra un aumento en la actividad plasmática de Lp-PLA2 en ratas SD después de la inducción de hiperglucemia con STZ y supresión después de la dosificación del inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg). Los datos son la media /- SEM.

La Figura 10A-B muestra la extravasación de albúmina azul de Evans del plasma a la retina en ratas diabéticas tratadas con vehículo o un compuesto inhibidor de Lp-PLA2. El efecto de la hiperglucemia durante 31 días y tratamiento de animales con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg/día) durante 28 días sobre la extravasación del colorante azul de Evans en el parénquima retiniano en ratas SD. (A) muestra valores para animales individuales con líneas que designan medias. (B) muestra valores medios /- SEM.

La Figura 11A-B muestra la incidencia de acumulación de líquido subretiniano en ratas diabéticas según lo evaluado por tomografía de coherencia óptica (OCT). (A) Incidencia de acumulación de líquido retiniano (porcentaje de todos los animales analizados) según la evaluación de imágenes de OCT en ratas SD normoglucémicas, hiperglucémicas e hiperglucémicas tratadas con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg/día) el día 14 (estudio 1) y día 17 (estudio II). (B) Estudio inicial que muestra la acumulación de líquido retiniano el día 17 en ratas SD tratadas con STZ.

La Figura 12A-C muestra una reducción del grosor neurorretiniano evaluado mediante tomografía de coherencia óptica (OCT) en ratas diabéticas tratadas con vehículo o compuestos inhibidores de Lp-PLA2. (A) Muestra el grosor de la capa neurorretiniana evaluado por OCT a lo largo del tiempo en animales inducidos por diabetes con STZ (50 mg/kg/d ip durante 3 días) y posteriormente tratados con vehículo desde el día 0, inhibidor de Lp-PLA2 '859 (10 mg/kg/d ip desde el día 4) o con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg/d ip desde el día 8). Muestra el grosor de la capa neurorretiniana en (A) 10 días después de la inducción de la diabetes y (B) 18 días después de la inducción de la diabetes (50 mg/kg/d ip durante 3 días) y posteriormente tratada con vehículo desde el día 0, inhibidor de Lp-PLA2 '859 (10 mg/kg/d ip desde el día 4) o con inhibidor de Lp-PLA2' 495 (10 mg/kg/d ip desde el día 8). Los animales que no fueron tratados con STZ se utilizan para establecer la línea de base en 0. * p <0.05 en comparación con los animales tratados con vehículo solamente. Los datos se expresan en media /- SEM.

La Figura 13A-B muestra una reducción del grosor neurorretiniano evaluado mediante tomografía de coherencia óptica en ratas diabéticas tratadas con vehículo o un compuesto inhibidor de Lp-PLA2. (A) Muestra el grosor de la capa neurorretiniana según lo evaluado por OCT a lo largo del tiempo en animales no tratados o animales inducidos por diabetes con STZ (50 mg/kg/d ip durante 3 días). Los animales tratados fueron tratados posteriormente con inhibidor de Lp-PLA2. 495 (10 mg/kg/d) o vehículo ip desde el día 4. *** p <0.001 animales tratados con STZ y tratados con vehículo frente a animales tratados con STZ y con inhibidor de Lp-PLA2 '495. ### p <0.001 animales no tratados con STZ frente a animales tratados con STZ mediante ANOVA repetido bidireccional. Los datos se expresan con una media /- SEM (B) que muestra la comparación del grosor de la retina en animales diabéticos tratados con vehículo frente al inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg/d) a los 13 y 28 días. *** P <0.001; ** P <0.01 STZ frente a STZ inhibidor de Lp-PLA2 '495 según la prueba post-hoc de Tukey

La Figura 14A-B muestra resistencia eléctrica transendotelial y transporte de Lucifer Yellow a través de un modelo de barrera hematoencefálica (retiniana) in vitro después de la adición de lisoPC. (A) Muestra el transporte del marcador Lucifer Yellow a través de cultivos primarios de células endoteliales microvasculares de cerebro de rata, cultivados en el lado apical de insertos transwell en presencia de astrocitos de cerebro de rata cultivados (en el pozo inferior) en respuesta a la adición de lisoPC al monocapa endotelial. * p <0.001 en comparación con el vehículo tratado (B) Muestra resistencia eléctrica transendotelial tanto antes como después de la adición de lisoPC a monocapas de células endoteliales. * p <0.001 en comparación con TEER antes de la adición de lisoPC. Los datos se expresan como media /- SEM. Las diferencias significativas se determinan mediante pruebas t).

La Figura 15 muestra el efecto de la hiperglucemia durante 31 días y el tratamiento de animales con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg i.p. QD) durante 14 días sobre la extravasación del colorante azul de Evans en el parénquima retiniano en ratas Brown Norway. Los paneles muestran valores para animales individuales con líneas que designan medias y valores /- SEM. No diabético (NDB CON); DB PLACEBO Control diabético tratado con vehículo; DB FÁRMACO Control diabético más 10 mg/kg de inhibidor de Lp-PLA2 '495 (FÁRMACO) (10 mg/kg i.p. QD). En el estudio de 4 semanas, los animales tratados con vehículo diabético frente a los animales tratados con inhibidor de Lp-PLA2 diabético 495 fueron estadísticamente diferentes p <0.04, prueba t.

La Figura 16 muestra imágenes histológicas de la retina que demuestran un efecto de tratamiento de 20 mg/kg de inhibidor de Lp-PLA2 '495 QD i.p. sobre la fuga de albúmina de los vasos retinianos en ratas Brown Norway hiperglucémicas (datos de 2 semanas). Criosecciones: los vasos sanguíneos de la retina se identificaron mediante tinción con IB4 (rojo) y albúmina de rata (verde). En las retinas diabéticas hay una fuerte colocalización de ambas marcas que muestra que la albúmina se está escapando de la vasculatura retiniana, mientras que en los animales tratados con fármaco la albúmina está contenida intravascularmente y colocalizada con los vasos retinianos.

La Figura 17 muestra imágenes de histología retiniana que demuestran un efecto de tratamiento de 10 mg/kg de inhibidor de Lp-PLA2 '495 QD i.p. sobre la fuga de albúmina de los vasos retinianos en ratas Brown Norway hiperglucémicas (4 semanas). Crioecciones: los vasos sanguíneos de la retina se identificaron mediante tinción con IB4 (rojo) y albúmina de rata (verde). En los animales no diabéticos, la albúmina se localiza conjuntamente en los vasos retinianos, mientras que en las retinas diabéticas hay una mala localización de las etiquetas que muestran que la albúmina se está escapando de la vasculatura retiniana Los animales tratados con fármacos son similares a los controles no diabéticos en los que la albúmina está contenida por vía intravascular y co-localizado con los vasos retinianos.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han descubierto que los inhibidores de Lp-PLA²pueden usarse en el tratamiento y/o prevención de enfermedades oculares, a saber, edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgica, tracción y similares; AMD; uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares, y trastornos asociados con la ruptura de la barrera sanguínea retiniana interna.

Definiciones

Por conveniencia, aquí se recopilan ciertos términos empleados en toda la solicitud (incluida la especificación, los ejemplos y las reivindicaciones adjuntas). A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

El término "enfermedad" o "trastorno" se usa indistintamente en este documento, y se refiere a cualquier alteración en el estado del cuerpo o de algunos de los órganos, que interrumpen o perturban el desempeño de las funciones y/o provocan síntomas tales como malestar, disfunción, angustia, o incluso la muerte de la persona afligida o de quienes estén en contacto con una persona. Una enfermedad o trastorno también puede relacionarse con una destemplanza, aquejamiento, indisposición, padecimiento, dolencia, mal, afección o afectación.

Los términos "barrera hematoencefálica" o "BBB" se usan indistintamente en este documento y se usan para referirse a la barrera de permeabilidad que existe en los vasos sanguíneos a medida que viajan a través del tejido cerebral que restringe severamente y regula de cerca lo que se intercambia entre la sangre y el tejido cerebral. Los componentes de la barrera hematoencefálica incluyen las células endoteliales que forman el revestimiento más interno de todos los vasos sanguíneos, las uniones estrechas entre las células endoteliales adyacentes que son el correlato estructural de la BBB, la membrana basal de las células endoteliales y los procesos expandidos del pie de los astrocitos cercanos que cubre casi toda la superficie exterior expuesta del vaso sanguíneo. La BBB evita que la mayoría de las sustancias de la sangre entren en el tejido cerebral, incluidas la mayoría de las moléculas grandes tales como Ig, anticuerpos, complemento, albúmina y fármacos y moléculas pequeñas.

Los términos "barrera hemato-retiniana interna" o "iBRB" se usan indistintamente en este documento y se usan para referirse a la barrera de permeabilidad que existe en los vasos sanguíneos a medida que se desplazan a través del tejido retiniano que restringe severamente y regula de cerca lo que se intercambia entre la sangre y el tejido retiniano. Los componentes de la barrera hemato-retiniana incluyen las células endoteliales que forman el revestimiento más interno de todos los vasos sanguíneos, las uniones estrechas entre las células endoteliales adyacentes que son el correlato estructural de la iBRB, la membrana basal de las células endoteliales y los procesos expandidos del pie de las células astrocíticas cercanas. y pericitos, incluidas las células gliales, que cubren casi toda la superficie exterior expuesta del vaso sanguíneo. La iBRB evita que la mayoría de las sustancias de la sangre entren en el tejido retiniano, incluidas la mayoría de moléculas grandes tales como Ig, anticuerpos, complemento, albúmina y fármacos y moléculas pequeñas.

El término "BBB anormal" se utiliza para referirse a una BBB disfuncional, por ejemplo, donde la BBB no permite el tránsito de moléculas que normalmente transitan por una BBB funcional, por ejemplo, nutrientes y azúcares tales como la glucosa. Una BBB anormal también puede referirse a cuando la BBB es permeable a moléculas que típicamente excluiría una BBB que funciona normalmente, lo que típicamente se denomina "permeabilidad de BBB" en el presente documento.

El término "BRB interno anormal" se usa para referirse a una iBRB disfuncional, por ejemplo, donde el iBRB no permite el tránsito de moléculas que normalmente transitan por un iBRB funcional, por ejemplo, nutrientes y azúcares tales como la glucosa. Una iBRB anormal también puede referirse a cuando el iBRB es permeable a moléculas que típicamente excluiría un iBRB que funciona normalmente, lo que típicamente se denomina "permeabilidad de iBRB" en el presente documento.

Los términos "permeabilidad de BBB" o "BBB permeable" son comúnmente referidos por personas en la técnica como "BBB con fugas". Los términos se usan indistintamente en el presente documento para referirse a la integridad de BBB deteriorada y la permeabilidad vascular aumentada. Por ejemplo, una BBB permeable permite el tránsito de moléculas a través de la BBB que una BBB intacta normalmente excluiría del tejido cerebral, por ejemplo, moléculas de Ig, proteínas del complemento, albúmina sérica y muchas otras proteínas. Un ensayo para determinar la presencia de una BBB permeable puede ser, por ejemplo, para evaluar la presencia de Ig extravascular en el tejido cerebral que normalmente está restringido al lumen de los vasos sanguíneos cuando la BBB funciona normalmente (es decir, cuando la BBB es no permeable).

Los términos "permeabilidad de iBRB" o "iBRB permeable" son comúnmente denominados por personas en la técnica como "iBRB con fugas". Los términos se usan indistintamente en este documento para referirse a la integridad de iBRB deteriorada y la permeabilidad vascular aumentada. Por ejemplo, una iBRB permeable permite el tránsito de moléculas a través de la iBRB que una iBRB intacta normalmente excluiría del tejido retiniano, por ejemplo, moléculas de Ig, proteínas del complemento, albúmina sérica y muchas otras proteínas. Un ensayo para determinar la presencia de una iBRB permeable puede ser, por ejemplo, para evaluar la presencia de Ig extravascular en el tejido retiniano que normalmente está restringido al lumen de los vasos sanguíneos cuando la iBRB funciona normalmente (es decir, cuando la BRB no es permeable).

El término "agente" o "compuesto" como se define en las reivindicaciones, se refiere a las moléculas pequeñas como se describe anteriormente.

El término "inhibir" como se usa en este documento significa que la expresión o actividad de la proteína Lp-PLA²o variantes u homólogos de la misma se reduce hasta un grado, y/o durante un tiempo, suficiente para producir el efecto deseado, por ejemplo, en el que la inhibición de la proteína Lp-PLA²reduce o detiene un síntoma de edema macular, uveítis, retinopatía diabética, etc. La reducción en la actividad puede deberse a la afectación de una o más características de Lp-PLA², incluida la disminución de su actividad catalítica o inhibiendo un cofactor de Lp-PLA²o uniéndose a Lp-PLA²con un grado de actividad de tal manera que el resultado es el de tratar o prevenir el edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a OVR, inflamación, posquirúrgico, tracción y similares; degeneración macular relacionada con la edad (AMD); uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares. En particular, la inhibición de Lp-PLA²se puede determinar usando un ensayo para la inhibición de Lp-PLA², por ejemplo, pero sin limitarse a usar el bioensayo para la proteína Lp-PLA²como se divulga en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "Lp-PLA²" se refiere a la proteína diana inhibida por los métodos divulgados en el presente documento. Lp-PLA²se usa indistintamente con la fosfolipasa A²asociada a lipoproteínas, también conocida previamente en la técnica como Acetilhidrolasa del Factor Activador de Plaquetas (PAF acetilhidrolasa). La Lp-PLA²humana está codificada por el ácido nucleico correspondiente al número de acceso: U20157 (SEQ ID NO: 1) o Ref Seq ID: NM_005084 (SeQ ID NO: 2) o y la Lp-PLA²humana corresponde a la secuencia de proteína correspondiente al número de acceso: NP_005075 (SEQ ID NO: 3), que se divulgan en la Patente U.S.

5,981,252, que se incorpora aquí específicamente en su totalidad como referencia.

Los términos "paciente", "sujeto" e "individuo" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un animal, en particular a un ser humano, al que se le proporciona un tratamiento que incluye un tratamiento profiláxico. El término "sujeto", como se usa en este documento, se refiere a animales humanos y no humanos. El término "animales no humanos" y "mamíferos no humanos" se usan indistintamente en el presente documento e incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos, tales como primates no humanos (en particular primates superiores), ovejas, perros, roedores (por ejemplo, ratón o rata), cobaya, cabra, cerdo, gato, conejos, vacas y no mamíferos tales como pollos, anfibios, reptiles, etc. En una realización, el sujeto es un ser humano. En otra realización, el sujeto es un animal de experimentación o un sustituto de animal como modelo de enfermedad.

Como se usa en este documento, el término "tratar" incluye reducir, aliviar o prevenir al menos un efecto o síntoma adverso de una condición, enfermedad o trastorno asociado con las enfermedades y trastornos oculares descritos en este documento. Los métodos para medir los resultados positivos del tratamiento incluyen, pero no se limitan a, la reducción o el mantenimiento del edema subretiniano, medido por OCT, la reducción de la pérdida o el mantenimiento de la visión o la ganancia de la visión según la evaluación de la agudeza visual mejor corregida.

El término "cantidad eficaz", como se usa en este documento, se refiere a la cantidad de agente terapéutico de composición farmacéutica para reducir, detener, aliviar o prevenir al menos un síntoma de las enfermedades o trastornos oculares descritos en este documento. Por ejemplo, una cantidad eficaz utilizando los métodos divulgados en este documento se consideraría como la cantidad suficiente para reducir o prevenir un síntoma de la enfermedad o trastorno, por ejemplo, una resolución completa o parcial y/o mantenimiento del edema de mácula medido por OCT o un aumento y/o mantenimiento en la agudeza visual mejor corregida superior a 5 letras (según la evaluación de la tabla optométrica EDTRS). Una cantidad eficaz para tratar el edema macular diabético incluiría una cantidad suficiente para mejorar la visión, usualmente conseguida reduciendo la cantidad de edema macular provocado por la fuga de los capilares intrarretinianos. La cantidad de edema se puede estimar por la cantidad de engrosamiento retiniano detectado por una técnica no invasiva tal como OCT y/o por la fuga detectada en la angiografía con fluoresceína. Una cantidad eficaz como se usa en este documento también incluiría una cantidad suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo del edema de la mácula y la pérdida de visión asociada. Una cantidad eficaz como se usa en este documento también incluiría una cantidad suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de un síntoma de la enfermedad (por ejemplo, pero sin limitarse a, retardar la progresión de un síntoma de la enfermedad), o revertir un síntoma de la enfermedad.

Como se usa en este documento, los términos "administrar" e "introducir" se usan indistintamente y se refieren a la colocación de los agentes que inhiben Lp-PLA²como se divulga en este documento en un sujeto mediante un método o ruta que da como resultado la localización al menos parcial de los agentes en un sitio deseado. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por cualquier ruta apropiada que dé como resultado un tratamiento eficaz en el sujeto.

Los artículos "un" y "una, uno" se utilizan aquí para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Lp-PLA²: Información General

Lp-PLA²también se denomina en la técnica como Lp-PLA²aliasas, LDL-PLA², fosfolipasa A²asociada a lipoproteínas, PLA2G7, fosfolipasa A2 (grupo VII) o acetilhidrolasa del Factor Activador de Plaquetas (PAF acetilhidrolasa o PAFAH). La Lp-PLA²humana está codificada por 20 ácidos nucleicos correspondientes al GenBank Accession No: U20157 (SEQ ID NO: 1) o Ref Seq ID: NM_005084 (SEQ ID NO: 2) y la Lp-PLA²humana corresponde a la secuencia de proteínas correspondiente a GenBank Accession No: NP 005075 (SEQ ID NO: 3), que se divulgan en la patente U.S. 5,981,252.

La lipoproteína de enzima fosfolipasa A²se asoció a la fosfolipasa A²(Lp-PLA²), la secuencia, aislamiento y purificación de los mismos, ácidos nucleicos aislados que codifican la enzima y células huésped recombinantes transformadas con ADN que codifica la enzima se describen en el documento WO 95/00649 (SmithKline Beecham plc). Una publicación posterior del mismo grupo describe además esta enzima (Tew D et al., Arterioscler Thromb Vas Biol 1996:16; 591 -9) en donde se conoce como LDL-PLA²y posterior solicitud de patente (Wo 95/09921, Icos Corporation) y una publicación relacionada en Nature (Tjoelker et al., Vol. 374, 6 de abril de 1995, 549) describen la enzima PAFAH que tiene esencialmente la misma secuencia que Lp-PLA².

Se ha demostrado que Lp-PLA²es responsable de la conversión de fosfatidilcolina en lisofosfatidilcolina, durante la conversión de lipoproteínas de baja densidad (LDL) a su forma oxidada. Se sabe que la enzima hidroliza el éster sn-2 de la fosfatidilcolina oxidada para dar lisofosfatidilcolina y un ácido graso modificado oxidativamente. Ambos productos de la acción de Lp-PLA²son biológicamente activos con la lisofosfatidilcolina, en particular, tiene varias actividades proaterogénicas que se le atribuyen, incluida la quimiotaxis de monocitos y la inducción de disfunción endotelial, las cuales facilitan la acumulación de macrófagos derivados de monocitos dentro de la pared arterial.

Agentes que inhiben Lp-PLA²

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a la inhibición de Lp-PLA². En algunas realizaciones, la inhibición es la inhibición de las transcripciones de ácidos nucleicos que codifican Lp-PLA.², por ejemplo, inhibición del ARN mensajero (ARNm). En realizaciones alternativas, la inhibición de Lp-PLA²es la inhibición de la expresión y/o la inhibición de la actividad del producto génico de Lp-PLA², por ejemplo, el polipéptido o proteína de Lp-PLA², o isoformas de los mismos. Como se usa en este documento, el término "producto génico" se refiere a ARN transcrito de un gen, o un polipéptido codificado por un gen o traducido a partir de ARN.

La inhibición de Lp-PLA²es mediante un agente o compuesto. Estos agentes/compuestos son como se definen en este documento y de acuerdo con las reivindicaciones.

Otros agentes inhibidores de Lp-PLA²han sido descritos n WO 2008/140449; correspondiente a USSN 2008/0279846.

Se sabe que los inhibidores de Lp-PLA²pueden ser una sustancia química, molécula pequeña, molécula grande o entidad o fracción, incluyendo, sin limitación, entidades no proteicas sintéticas y de origen natural.

Moléculas pequeñas

Agentes o compuestos según la presente invención que inhiben Lp-PLA²son moléculas pequeñas como se describe en este documento. Son conocidos los inhibidores irreversibles o reversibles de Lp-PLA².

Los inhibidores irreversibles de Lp-PLA²se divulgan en las solicitudes de patente WO 96/13484, WO96/19451, WO 97/02242, WO97/12963, WO97/21675, WO97/21676, WO 97/41098 y WO97/41099 (SmithKline Beecham plc) y divulgan entre otras diversas series de compuestos de 4-tionil/sulfinil/sulfonil azetidinona que son inhibidores de la enzima Lp-PLA². Estos son inhibidores acilantes irreversibles (Tew et al., Biochemistry, 37, 10087, 1998).

Los inhibidores de Lp-PLA2 eficaces en seres humanos son comúnmente conocidos por los expertos en la técnica e incluyen aquellos que se someten a evaluación, por ejemplo, que se someten a evaluación preclínica y clínica que incluye ensayos clínicos de fase II. SmithKline Beecham y su sucesor GlaxoSmithKline han presentado y publicado varias solicitudes. Una lista de solicitudes publicadas relevantes asignadas a la misma es: WO99/24420, WO00/10980, WO00/66566, WO00/66567, WO00/68208, WO01/60805, WO02/30904, WO02/30911, WO03/015786, WO03/016287, WO03/041712, WO03/042179, WO03/042206, WO03/042218, WO03/086400, WO03/087088, WO05/003118, WO05/021002, WO08/048866, WO08/140449, WO08/141176, WO08/048867, US 2008/0280829, US 2008/0103156, US 2008/0090851, US 2008/0090852 y número de expediente de abogado PC64333 correspondiente a PCT/CN2010/0771 54.

El compuesto N-[2-(dietilamino)etil]-2-[[(4-fluorofenil)metil]tio]-4,5,6,7-tetrahidro-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1 '-bifenil]-4-il]metil]-1H-ciclopentapirimidin-1-acetamida (también se usa aquí de manera intercambiable con el término Darapladib y la nomenclatura alternativa de 1-(N-(2-(dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona; o el inhibidor de Lp-PLA2 '848) es un inhibidor de Lp-PLA2 particularmente eficaz y está de acuerdo con esta invención.

El compuesto 2-[[(2,3-difluorofenil)metil]tio]-N-[1 -(2-metoxietil)-4-piperidinil]-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1’-bifenil]-4-il]metil]-1 (4h)-quinolinacetamida (también se usa aquí indistintamente con el término Rilapladib; o inhibidor de Lp-PLA2 '032 y la nomenclatura alternativa de W-(1-(2-Metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-W-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida) es un inhibidor de Lp-PLA2 particularmente eficaz y está de acuerdo con esta invención.

Otros inhibidores de Lp-PLA2 se describen en solicitudes de patente publicadas, por ejemplo, WO2006063791-A1, WO2006063811 -A1, WO2006063812-A1, WO2006063813-A1, todo a nombre de Bayer Healthcare; y US2006106017-A1 asignado a Korea Res. Inst. Bioscience & Biotechnology. Los inhibidores de Lp-PLA2 también incluyen agentes conocidos, por ejemplo, por ejemplo, pero no se limitan a incluir el uso de estatinas con Niacina (véase www.genengnews.com/news/bnitem.aspx?name=6724568) y fenofibrato (véase www.genengnews.com/news/bnitem.aspx? name = 14817756&taxid=19).

Se cree que los compuestos descritos para el propósito de la presente invención y definidos en las reivindicaciones adjuntas, son útiles para la profilaxis o el tratamiento del edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgico, tracción, y similares; AMD; uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares. Los modelos descritos en el presente documento como se ejemplifican en los Ejemplos pueden ser utilizados por un experto en la técnica para determinar cuál de los compuestos descritos u otros inhibidores de Lp-PLA2, por ejemplo, los anticuerpos, o ARNi son eficaces para el tratamiento o la prevención del edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgico, tracción y similares; degeneración macular relacionada con la edad (AMD); uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares, como se reivindica en el presente documento.

Los inhibidores de Lp-PLA2 se describen en la patente U.S. 6,649,619 y 7,153,861, (y la solicitud internacional WO 01/60805) y la patente U.S. 7,169,924 (y solicitud de patente internacional WO 02/30911), y en la publicación U.S. No.

2005/0033052A1 y solicitudes de patentes internacionales WO 02/30904, WO 03/042218, WO 03/042206, WO03/042179, WO 03/041712, WO 03/086400 y WO 03/87088 son inhibidores de Lp-PLA2 reversibles.

Fórmula (I) Un grupo de inhibidores de Lp-PLA2 reversibles se describen en la solicitud internacional. WO 01/60805, de la cual surgieron las patentes U.S. 6,649,619 y 7,153,861. Un grupo más reducido de compuestos son de fórmula (I) descritos en el documento WO 01/60805 y reivindicado en las patentes U.S. 6,649,619 y 7,153,861, a saber:

en la que:

Ra y Rb junto con los átomos de carbono del anillo de pirimidina a los que están unidos forman un anillo carbocíclico fusionado de 5 miembros;

R2 es fenilo, sustituido por uno a tres átomos de flúor;

R3 es metilo o alquilo C(1-3) sustituido por NR8R9; o

R3 es Het-C(⁰-²)alquilo en el que Het es un anillo heterociclilo de 5 a 7 miembros que tiene N y en el que N no está sustituido o está sustituido con alquilo C(¹-⁶);

R4 y R5 juntos forman una fracción de 4-(4-trifluorometilfenil)fenilo;

R8 y R9 que pueden ser iguales o diferentes se seleccionan del grupo que consiste en hidrógeno, o C(¹-⁶)alquilo); X es S, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

De aún más interés son los siguientes compuestos, todos dentro del alcance de la fórmula (I) y descritos en la solicitud y las patentes mencionadas anteriormente:

1-(N-(2-(dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona, utilizado en el estudio porcino descrito en este documento;

1-(N-(2-(dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(2,3-difluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-(2-(dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonilmetil)-2-(3,4-difluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-(2-(dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonilmetil)-2-(2,3,4-trifluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-(2-(dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonilmetil)-2-(2-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-metil-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona; 1-(N-(2-(1-piperidino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-(1-etilpiperidin-4-il)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-(2-etilamino-2-metilpropil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

N-(2-tert-butilaminoetil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-(1-metilpiperidin-4-il)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-(1-isopropilpiperidin-4-il)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona;

1-(N-(1-(2-metoxietil)piperidin-4-il)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin- 4-ona;

1-(N-(2-(etilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona; o una sal farmacéuticamente aceptable de estos compuestos.

Los métodos para preparar estos compuestos se describen en los documentos indicados.

Un segundo proceso para preparar 1 -(N-(2-(dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)-aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona se puede encontrar en la solicitud WO 03/016287 (U.S. 7,232,902). Fórmula (II)

Otros compuestos se describen en el documento WO 02/30911; la patente US 7,169,924 corresponde a esta solicitud internacional. La fórmula genérica en ese caso, representada aquí como fórmula (II), es la siguiente:

en el cual:

R¹es un grupo arilo, opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de C(1-6)alquilo, C(1-6)alcoxi, C(1-6)alquiltio, hidroxi, halógeno, CN y mono a perfluoro-C(¹-⁴)alquilo;

R²es halógeno, C(¹-³)alquilo, C(¹-³)alcoxi, hidroxiC(¹-³)alquilo, C(¹-³)alquiltio, C(¹-³)alquilsulfinilo, aminoC(¹-³)alquilo, mono o di-C(¹-³)alquilaminoC(¹-³)alquilo, C(¹-³)alquilcarbonilaminoC(¹-³)alquilo, C(¹-³)alcoxiC(¹-³)alquilcarbonilaminoC(¹-³)alquilo, C(¹-³)alquilsulfonilaminoC(¹-³)alquilo, C(1-3)alquilcarboxi, C(¹-³)alquilcarboxiC(¹-³)alquilo, y

R³es hidrógeno, halógeno, C(¹-³)alquilo o hidroxiC(¹-³)alquilo; o

R²y R³junto con los átomos de carbono del anillo de pirimidona a los que están unidos forman un anillo carbocíclico fusionado de 5 o 6 miembros; o

R²y R³junto con los átomos de carbono del anillo de pirimidona a los que están unidos forman un anillo de anillo de benzo o heteroarilo fusionado opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de halógeno, C(¹-⁴)alquilo, ciano, C(1-6)alcoxi, C(1-6)alquiltio o mono a perfluoro-C(¹-⁴)alquilo; R⁴es hidrógeno, C(1-6)alquilo que puede estar sin sustituir o sustituido con 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados entre ^{hidroxi, halógeno,}Or7, Cor7, ^{carboxi, COOR7 , CONR9R10, NR9R10, NR7COR8 , mono- o di-(hidroxiC(1-6)alquil) amino}y N-hidroxiC(1-6)alquil-N-C(1-6)alquilamino; o

R⁴es Het-C(⁰-⁴)alquilo en el que Het es un anillo heterociclilo de 5 a 7 miembros que comprende N y opcionalmente O o S, y en el que N puede estar sustituido con COR⁷, COOR⁷, CONR⁹R¹⁰, o C(1-6)alquilo opcionalmente sustituido con 1 ,2 o 3 sustituyentes seleccionados entre hidroxi, halógeno, OR⁷, COR⁷, carboxi, COOR⁷, CONR⁹R¹⁰o NR⁹R¹⁰, por ejemplo, piperidin-4-ilo, pirrolidin-3-ilo;

R⁵es un anillo arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de C(1-6)alquilo, C(1-6)alcoxi, C(1-6)alquiltio, arilC(1-6)alcoxi, hidroxi, halógeno, CN, COR⁷, carboxi, COOR⁷, NR⁷COR⁸, CONR⁹R¹⁰, SO2NR⁹R¹⁰, NR⁷SO2R⁸, NR⁹R¹⁰, mono a perfluoro-C(¹-⁴)alquilo y mono a perfluoro-C(¹-⁴)alcoxi;

R⁶es un anillo arilo o heteroarilo que además está opcionalmente sustituido con 1,2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de C(1-18)alquilo, C(1-18)alcoxi, C(1-6)alquiltio, C(1-6)alquilsulfonilo, arilC(1-6)alcoxi, hidroxi, halógeno, CN, COR⁷, carboxi, COOR⁷, CONR⁹R¹⁰, NR⁷COR⁸, SO2NR⁹R¹⁰, NR⁷SO2R⁸, NR⁹R¹⁰, mono a perfluoro-C(¹-⁴)alquilo y mono a perfluoro-C(¹-⁴)alcoxi, o C(⁵-¹⁰)alquilo;

R⁷es hidrógeno o C(1-12)alquilo, por ejemplo C(¹-⁴)alquilo (por ejemplo, metilo o etilo);

R⁸es hidrógeno, OC(1-6)alquilo, o C(1-12)alquilo, por ejemplo C(¹-⁴)alquilo (por ejemplo, metilo o etilo);

R⁹y R¹⁰que pueden ser iguales o diferentes se selecciona cada uno de hidrógeno, o C(1-12)alquilo, o R⁹y R¹⁰junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados entre oxígeno, nitrógeno y azufre, y opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, oxo, C(¹-⁴)alquilo, C(¹-⁴)alquilcarboxi, arilo, por ejeplo fenilo o aralquilo, por ejemplo bencilo, por ejemplo morfolina o piperazina; y

X es C(²-⁴)alquileno, opcionalmente sustituido con 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados entre metilo y etilo, o CH=CH. Todas las sales de fórmula (II), también, pueden usarse en el presente método de tratamiento.

De particular interés son los compuestos de fórmula (II) aquí, donde, como se indica en el documento WO 02/30911 para la fórmula (I) allí, R¹puede ser un grupo fenilo opcionalmente sustituido con 1,2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de halo, C1-C6 alquilo, trifluorometilo o C1-C6 alcoxi. Más específicamente, el fenilo no está sustituido o está sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes halógeno, particularmente, de 1 a 3 grupos fluoro, y más particularmente, 2,3-difluoro, 2,4-difluoro o 4-fluoro.

Una realización adicional de la fórmula (II) aquí es donde X es -CH2CH2-.

Además, son de interés los compuestos de fórmula (II) donde R²es hidrógeno, por defecto, o es halo, C1-C6 alquilo, mono a perfluoro- C1-C4 alquilo, mono a perfluoro C¹-C4⁶alcoxi, o C1-C6 alcoxi; particularmente mono a perfluoro-C1-C4 alquilo, mono a perfluoro- C1-C4 alcoxi, o C1-C6 alcoxi. De particular interés son los compuestos de fórmula (II) donde R²es distinto del hidrógeno, n en (R²)n es 1,2 o 3, y el patrón de sustitución es meta y/o para, particularmente para, es decir, un sustituyente en la posición 4. Véanse también aquellos compuestos donde R²es 4-trifluorometilo o 4-trifluorometoxi.

R³y R⁴pueden ser iguales o diferentes y son metilo, etilo, n-propilo o n-butilo. De particular interés son aquellos compuestos de fórmula (II) en el presente documento en los que R³y R⁴son iguales y son metilo o etilo; el metilo es de particular interés.

R⁵puede ser hidrógeno, -C(1-6) alquilo que es de cadena lineal o ramificada. De particular interés son metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, /'so-butilo, f-butilo, n-pentilo o n-hexilo.

Se apreciará que dentro de los compuestos de fórmula (II) en el presente documento hay un subgrupo adicional de compuestos en los que:

R¹es fenilo sustituido con 2,3-difluoro;

R²y R³, junto con los átomos de carbono del anillo de pirimidina a los que están unidos, forman un anillo de ciclopentenilo fusionado de 5 miembros;

R⁴es 2-(dietilamino)etilo;

R⁵es fenilo;

R⁶es fenilo sustituido con trifluorometilo en la posición 4, o tien-2-ilo sustituido con trifluorometilo en la posición 5; y X es -(CH2)2.

Una realización adicional de la fórmula (II) aquí es donde X es -CH2CH2-; R²y R³, junto con los átomos de carbono del anillo de pirimidina a los que están unidos, forman un anillo benzo de 5 miembros fusionado; R⁴es Het-C(⁰-⁴)alquilo en el que Het es un anillo heterociclilo de 5 a 7 miembros que comprende N, y en el que N puede estar sustituido con C(1-6)alquilo, por ejemplo, piperidin-4-ilo, pirrolidin-3-ilo; R⁵es un anillo de arilo; R⁶es un anillo de arilo que además está opcionalmente sustituido con 1,2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de C(1-18)alquilo, halógeno, en particular 4-cloro.

Los compuestos particulares de fórmula (II) aquí de interés son:

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4H-quninazolin-1 -il)-N-(4'-cloro-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etil-piperidin-4-il)-2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4H-quinazolin-1-il)-N-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il]-N-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-etilamino-2-metil-propil)-2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-N-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-f-butilaminoetil)-2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-N-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etil-piperidin-4-il)-2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-N-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(4-fluoro-2-(trifluorometil)fenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidrociclopentapirimidin-1 -ilo)-N- bitartrato de (4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)-acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(4-fluoro-3-(trifluorometil)fenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro ciclopentapirimidin-1-ilo)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)-acetamida;

bitartrato de W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(3-cloro-4-fluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de (+/-)-W-(2-dietilaminoetil)-2-(2fenil-propil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(2,4-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(2,5-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(3,4-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(2-fluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(3-fluorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(3-clorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(4-clorofenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(4-metilfenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(4-(trifluorometil)fenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(4-metoxifenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de W-(2-dietilaminoetil)-2-(2-(2-(4-(trifluorometoxi)fenil)-etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-W-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

o la base libre de cualquiera de las sales de bitartrato, u otra sal farmacéuticamente aceptable.

Fórmula (III)

Además, estos compuestos de fórmula (III), descritos en el documento WO 02/30904:

en la cual:

R¹es un grupo arilo, opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de C(1-6)alquilo, C(1-6)alcoxi, C(1-6)alquiltio, hidroxi, halógeno, CN, mono a perfluoro-C(¹-⁴)alquilo, mono a perfluoro-C(¹-⁴)alcoxiarilo y arilC(¹-⁴)alquilo;

R²es halógeno, C(¹-³)alquilo, C(¹-³)alcoxi, hidroxiC(¹-³)alquilo, C(¹-³)alquiltio, C(¹-³)alquilsulfinilo, aminoC(¹-³)alquilo, mono o di-C(¹-³)alquilaminoC(¹-³)alquilo, C(¹-³)alquilcarbonilaminoC(¹-³)alquilo, C(^1-3) alcoxiC(¹-³)alquilcarbonilaminoC(¹-³)alquilo, C(¹-³)alquilsulfonilaminoC(¹-³)alquilo, C(1-3)alquilcarboxi, C(¹-³)alquilcarboxiC(¹-³)alquilo, y

R³es hidrógeno, halógeno, C(i-³)alquilo o hidroxiC(i-³)alquilo; o

R²y R³junto con los átomos de carbono del anillo de piridona a los que están unidos forman un anillo carbocíclico fusionado de 5 o 6 miembros; o

R²y R³junto con los átomos de carbono del anillo de piridona a los que están unidos forman un anillo de benzo o heteroarilo fusionado opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de halógeno, C(¹-⁴)alquilo, ciano, C(¹-³)alcoxiC(¹-³)alquilo, C(¹-⁴)alcoxi o C(¹-⁴)alquiltio o mono a perfluoro-C(1-4)alquilo;

R⁴es hidrógeno, C(1-6)alquilo que puede estar sin sustituir o sustituido con 1,2 o 3 sustituyentes seleccionados entre hidroxi, halógeno, O⁷, c Or7, carboxi, COOR⁷, CONR⁹R¹⁰, NR⁹R¹⁰, NR⁷COR⁸, mono- o di-(hidroxiC(1-6)alquil) amino y N-hidroxiC(1-6)alquil-N-C(1-6)alquilamino; o

R⁴es Het-C(⁰-⁴)alquilo en el que Het es un anillo heterociclilo de 5 a 7 miembros que comprende N y opcionalmente O o S, y en el que N puede estar sustituido con COR⁷, COOR⁷, CONR⁹R¹⁰, o C<1-6>alquilo opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 sustituyentes seleccionados entre hidroxi, halógeno, OR⁷, COR⁷, carboxi, COOR⁷, CONR⁹R¹⁰o NR⁹R¹⁰, por ejemplo, piperidin-4-ilo, pirrolidin-3-ilo;

R⁶es un anillo arilo o heteroarilo que además está opcionalmente sustituido con 1,2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de C(1-6)alquilo, C(1-6)alcoxi, C(1-6)alquiltio, C(1-6)alquilsulfonilo, arilC(1-6)alcoxi, hidroxi, halógeno, CN, COR⁷, carboxi, COOR⁷, CONR⁹R¹⁰, NR⁷COR⁸, SO2NR⁹R¹⁰, NR⁷SO2R⁸, NR⁹R¹⁰, mono a perfluoro-C(¹-⁴)alquilo y mono a perfluoro-C(¹-⁴)alcoxi, o C(⁵-¹⁰)alquilo;

R⁷y R⁸son independientemente hidrógeno o C(1-12)alquilo, por ejemplo C(¹-⁴)alquilo (por ejemplo, metilo o etilo);

R⁹y R¹⁰que pueden ser iguales o diferentes, se selecciona cada uno de hidrógeno, o C(1-12)alquilo, o R⁹y R¹⁰junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados entre oxígeno, nitrógeno y azufre, y opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados entre hidroxi, oxo, C(¹-⁴)alquilo, C(¹-⁴)alquilcarboxi, arilo, p. ej. fenilo o aralquilo, por ejemplo, bencilo, por ejemplo, morfolina o piperazina; y

X es un grupo C(²-⁴)alquileno (opcionalmente sustituido con 1, 2 o 3 sustituyentes seleccionados entre metilo y etilo), CH = CH, (CH2)nS o (CH2)nO donde n es 1,2 o 3;

0 una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Son de particular interés aquellos compuestos de fórmula (III) donde R²y R³junto con los átomos de carbono del anillo de piridona a los que están unidos forman un anillo de benzo o heteroarilo fusionado opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de halógeno, C(¹-⁴)alquilo, ciano, C(¹-⁴)alcoxi o C(1-4)alquiltio o mono a perfluoro-C(¹-⁴)alquilo. De manera adecuada, R¹es fenilo opcionalmente sustituido con halógeno, C(1-⁶)alquilo, trifluorometilo, C(1-6)alcoxi, de manera adecuada, de 1 a 3 fluoro, más de manera adecuada, 2,3-difluoro. Ejemplos representativos de R⁴incluyen piperidin-4-ilo sustituido en la posición 1 con metilo, isopropilo, 1 -(2-metoxietilo), 1 -(2-hidroxietilo), t-butoxicarbonilo o etoxicarbonilmetilo; etilo sustituido en la posición 2 con aminoetilo; 1-etilpiperidinilmetilo; piperidin-4-ilo; 3-dietilaminopropilo; 4-pirrolidin-1 -ilbutilo y 1 -etilpirrolidin-3-ilo. De manera adecuada R⁴es 1-(2-metoxietil)piperidin-4-ilo, 1 -metilpiperidin-4-ilo o 1 -etilpirrolidin-3-ilo. Ejemplos representativos de R⁵incluyen fenilo y piridilo. De manera adecuada, R⁵es fenilo. Ejemplos representativos de R⁶incluyen fenilo opcionalmente sustituido con halógeno o trifluorometilo, convenientemente en la posición 4 y hexilo. De manera adecuada, R⁶es fenilo sustituido con trifluorometilo en la posición 4. Ejemplos representativos adicionales de R⁶incluyen fenilo sustituido con 1 o más C(¹-³)alquilo. De manera adecuada, R⁶es fenilo sustituido con etilo en la posición 4. De manera adecuada, R⁵y R⁶juntos forman un sustituyente 4-(fenil)fenilo o 2-(fenil) piridinilo en el que el anillo de fenilo remoto puede estar opcionalmente sustituido con halógeno o trifluorometilo, de manera adecuada en la posición 4. Preferiblemente X es C(2-⁴)alquileno, más preferiblemente C(²-³)alquileno, más preferiblemente, (CH2)2, o CH2S.

Se apreciará que dentro del grupo de compuestos que comprenden la fórmula (III) hay un subgrupo de compuestos en los que:

R¹es fenilo sustituido con 2,3-difluoro;

R²y R³, junto con los átomos de carbono del anillo de piridona a los que están unidos, forman un anillo de benzo o pirido fusionado;

R⁴es 1-(2-metoxietil)piperidin-4-ilo;

R5 y R6 juntos forman un sustituyente de 4-(fenil)fenilo en el que el anillo de fenilo remoto está sustituido con trifluorometilo, preferiblemente en la posición 4; y

X es CH²S o (CH²)².

Los siguientes compuestos de fórmula (III) son de interés:

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida; bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-5,6-trimetilenpiridin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(1-(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(1-(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-etilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[5-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-metil-7-oxo-7H-tiazolo [4,5-b] piridin-4-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

(±)N-(1 -etilpirrolidin-3-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N- bitartrato de (4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

(±)N-(1-etilpirrolidin-3-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'bitartrato de -trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

diclorhidrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

monoparatoluenosulfonato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N- monohidrocloruro de (4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

diclorhidrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(4-fluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(4-fluorobenciltio)-4-oxo-5,6-trimetilenpiridin-1-il]-N-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-5,6-trimetilenpiridin-1-il]-N-(4'-trifluorometil-bifenil-4 ilmetil)acetamida;

N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(4-fluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida; bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(3,4-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2-fluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(3-clorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1-il)]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1-il)]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-pirrolidin-1-iletil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-isopropilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-piperidin-1-iletil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio) 7-fluoro-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-5-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-metil-7-oxo-7H-tieno [3,2-b] piridin-4-il]-N- (4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-5,6-dimetil-4-oxo-4H-piridin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-5-etil-4-oxo-4H-piridin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-tieno [3,4-b] piridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-pirrolidin-1 -iletil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[6-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-metil-4-oxo-4H-pirazolo [3,4-b] piridin-7-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-isopropilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4’-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-ilmetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(3-dietilaminopropil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(4-pirrolidin-1-ilbutil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(3-dietilaminopropil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(4-pirrolidin-1 -ilbutil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[5-(2,3-difluorobenciltio)-7-oxo-7H-tieno [3,2-b] piridin-4-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[5-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-metil-7-oxo-7H-tiazolo [4,5-b] piridin-4-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-etilbifenil-4-ilmetil)acetamida; bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4’-etilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-isopropilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4’-isopropilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-[1,8] naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-[1,8] naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4’-metilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-metilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etoxicarbonilmetilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -isopropilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(3',4'-dimetilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(t-butoxicarbonil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(3',4'-difluorobifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[6-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-tieno [2,3-b] piridin-7-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(1 -metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-[1,8] naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil- bitartrato de 4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3,4-trifluorofeniletil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[6-(2,3-difluorobenciltio)-2-metil-4-oxo-2,4-dihidro-pirazolo [3,4-b] piridin-7-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[6-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-etil-4-oxo-2,4-dihidropirazolo [3,4-b] piridina -7-yl]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[6-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-isopropil-4-oxo-2,4-dihidropirazolo [3,4-b] piridina -7-yl]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4’-etilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -isopropilpiperidin-4-il)-2-[5-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-metil-7-oxo-7H-tiazolo [4,5-b] piridin-4-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[5-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-metil-7-oxo-7H-tiazolo [4,5-b] piridin-4-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-5,6-trimetilen-piridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-5,6-trimetilen-piridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-5,6-trimetilenpiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -isopropilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-5,6-trimetilenpiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[5-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-metil-7-oxo-2,7-dihidropirazolo [4,3-b] piridina -4-yl]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[5-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-1 -metil-7-oxo-1,7-dihidropirazolo [4,3-b] piridina -4-yl]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-7-metil-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-7-metil-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-7-metil-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -isopropilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-7-metil-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-7-metil-4-oxo-4H-[1,8] naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-5,6-trimetilen-piridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-5,6-trimetilenpiridin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -isopropilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-5,6-trimetilen-piridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-5,6-trimetilenpiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-5,6-tetrametilen-piridin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-clorobifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -metilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-clorobifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4’-clorobifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1-(2-metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-clorobifenil-4 ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -isopropilpiperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-clorobifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[6-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-metil-4-oxo-4H-pirazolo [3,4-b] piridin-7-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(1-(f-butoxicarbonil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-[1,8]naftiridin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-[6-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-2-(2-metoxietil)-4-oxo-4H-pirazolo [3,4-b] piridin-7-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[4-oxo-2-(2-(2,3,4-trifluorofenil)etil)-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,4-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4’-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(2-dietilaminoetil)-2-[2-(2-(3-fluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-5,6-trimetilenpiridin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

bitartrato de N-(piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-[1,8] naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

trifluoroacetato de N-(piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-[1,8] naftiridin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida;

N-(2-etilaminoetil)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida; N-(2-etilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1-il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida; bitartrato de N-(1 -(2-hidroxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4H-quinolin-1 -il]-N-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida; o la base libre del mismo, u otra sal farmacéuticamente aceptable.

Fórmula (IV)

También se conocen compuestos de fórmula (IV)

en la que:

R1 es un grupo arilo, no sustituido o sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados del grupo que consiste en C¹-C⁶alquilo, C¹-C⁶alcoxi, C¹-C⁶alquiltio, arilo C¹-C⁶alcoxi, hidroxi, halo, CN, COR⁶, COOR⁶, NR⁶COR⁷, CONR⁸R⁹, SÜ2NR⁸R⁹, NR⁶SÜ2R⁷, NR⁸R⁹, halo C1-C4 alquilo y halo C1-C4 alcoxi; W es CH y X es N, o W es N y X es CH, W y X son ambos CH, o W y X son N;

Y es C²-C⁴alquilo,

R²es hidrógeno, C1-C6 alquilo, C1-C6 alcoxi, C1-C6 alquiltio, arilo C1-C6 alcoxi, hidroxi, halo, CN, COR⁶, carboxi, COOR⁶, NR⁶COR⁷, CONR⁸R⁹, SO2NR⁸R⁹, NR⁶SO2R⁷, NR⁸R⁹, mono a perfluoro- C1-C6 alquilo, o mono a perfluoro-C1-C6 alcoxi;

n es 0-5;

R³es C1-C4 alquilo;

R⁴es C1-C4 alquilo;

R⁵es hidrógeno, C1-C10 alquilo, C2-C10 alquenilo, C2-C10 alquinilo, halo C1-C4 alquilo, C3-C8 cicloalquilo, C3-C8 cicloalquilo, C3-C8 cicloalquilo C1-C4 alquilo, Cs-C⁸cicloalquenilo, C⁵-C⁸cicloalquenilo C1-C4 alquilo, heterocicloalquilo de 3-8 miembros, heterocicloalquilo C de 3-8 miembros¹-C⁴alquilo, C6-C14 arilo, C6-C14 arilo C1-C10 alquilo, heteroarilo o heteroarilo C1-C10alquilo; en donde cada grupo es opcionalmente una o más veces por el mismo y/o un grupo diferente que es C1-C6 alcoxi, C1-C6 alquiltio, arilo C1-C6 alcoxi, hidroxi, halo, CN, NR⁸R⁹o halo C1-C4 alcoxi R⁶y R⁷son independientemente hidrógeno o C1-C10 alquilo;

R⁸y R⁹son iguales o diferentes y son hidrógeno o C1-C10 alquilo, o R⁹y R¹⁰junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo de 5 a 7 miembros que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados entre oxígeno, nitrógeno y azufre, y opcionalmente sustituidos con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en hidroxi, oxo, C1-C4 alquilo, C1-C4 alquilcarboxi, arilo y arilo C1-C4 alquilo; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Sin pretender excluir ningún sustituyente definido y/o sus radicales citados del alcance de la fórmula (IV), los siguientes grupos R y los radicales asociados son de particular interés:

En cuanto a R¹, puede ser un grupo fenilo opcionalmente sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes que pueden ser iguales o diferentes seleccionados de halo, C1-C6 alquilo, trifluorometilo o C1-C6 alcoxi. Más específicamente, el fenilo no está sustituido o está sustituido con 1, 2, 3 o 4 sustituyentes halógeno, particularmente, de 1 a 3 grupos fluoro, y más particularmente, 2,3-difluoro, 2,4-difluoro o 4-fluoro.

Una realización adicional de la fórmula (I) es donde Y es -CH2CH2-.

La invención también proporciona un compuesto de fórmula (I) en el que R²es hidrógeno, por defecto, o es halo, C1-C⁶alquilo, mono a perfluoro- C1-C4 alquilo, mono a perfluoro C¹-C4⁶alcoxi, o C1-C6 alcoxi; particularmente mono a perfluoro-C¹-C⁴alquilo, mono a perfluoro- C1-C4 alcoxi, o C1-C6 alcoxi. De particular interés son los compuestos donde R²es distinto del hidrógeno, n en (R²)n es 1, 2 o 3, y el patrón de sustitución es meta y/o para, particularmente para, es decir, un sustituyente de 4 posiciones. Los compuestos ejemplificados incluyen aquellos en los que R²es 4-trifluorometilo o 4-trifluorometoxi.

R³y R⁴pueden ser iguales o diferentes y son metilo, etilo, n-propilo, o n-butilo. De particular interés son aquellos compuestos de fórmula (I) donde R³y R⁴son iguales y son metilo o etilo; el metilo es de particular interés.

R⁵puede ser hidrógeno, C(1-6) alquilo que es de cadena lineal o ramificada. De particular interés son metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, /'so-butilo, f-butilo, n-pentilo o n-hexilo.

Cualquiera de los compuestos descritos en el presente documento anteriormente se puede preparar en forma cristalina o no cristalina y, si es cristalino, se puede solvatar, p. como el hidrato. Esta invención incluye dentro de su alcance solvatos estequiométricos (por ejemplo, hidratos).

Algunos de los compuestos descritos en este documento pueden contener uno o más átomos quirales, o pueden ser capaces de existir de otro modo como dos enantiómeros. Los compuestos de acuerdo con la invención y útiles en los métodos descritos en este documento incluyen mezclas de enantiómeros así como enantiómeros purificados o mezclas enriquecidas enantioméricamente. También se incluyen dentro del alcance de la invención los isómeros individuales de estos compuestos. Las diferentes formas isoméricas pueden separarse o resolverse una de la otra mediante métodos convencionales, o cualquier isómero dado puede obtenerse mediante métodos sintéticos convencionales o mediante síntesis estereoespecífica o asimétrica.

Síntesis de los compuestos de fórmula (I), (II), (III) y (IV)

En la bibliografía de patentes se han publicado métodos para preparar compuestos de fórmula (I), (II) y (III). Por ejemplo, los métodos para hacer la fórmula (I) se pueden encontrar en el documento WO 01/60805 y WO03/016287. ^{Los métodos para preparar compuestos de fórmula (II) se han establecido en el documento}wO ^{02/30911. Los}métodos para preparar compuestos de fórmula (III) se pueden encontrar en el documento WO 02/30904. Los métodos para preparar compuestos de fórmula (IV) se pueden encontrar en el documento WO08/048866 y WO08/048867. A continuación se proporcionan algunos ejemplos de síntesis. Para diferenciar entre los varios grupos genéricos de compuestos en los ejemplos de este documento, los materiales relacionados con la fórmula (I) se etiquetarán como "Ejemplo de enfoque de síntesis (I)-1" y siguientes, para la fórmula (II) "Ejemplo de enfoque de síntesis (II)-1"y siguientes, para la fórmula (III)," Ejemplo de enfoque de síntesis (III)-1y siguientes, y para la fórmula (I), "Ejemplo de enfoque de síntesis (IV)-1, y siguientes.

Síntesis de la fórmula (I)

Los compuestos de fórmulas (I) se pueden preparar mediante el esquema de procesos I, como se describe en el documento WO 01/60805:

Esquema 1

en el cual:

L³es un grupo C(1-6)alquilo, por ejemplo metilo;

R^{15 *20}es un grupo C(1-6)alquilo, por ejemplo etilo o t-butilo y

L¹, L², Ra, Rb, RC, R², R³, R⁴, R⁵, n, X, Y y Z son como se definen en el documento WO 01/60805.

Se ha descrito en la técnica una reacción de ejemplo para preparar un compuesto de fórmula (I) de interés, por ejemplo, WO 01/60805, y se establece a continuación.

Ejemplo de enfoque de síntesis (I)-l(a)

1-(N-(2-(Dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonil-metil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona

Como se divulga en el documento WO 01/60805, el intermedio B69 de WO 01/60805 (87.1g, 0.26 mol) se suspendió en diclorometano (2.9 litros). Se añadieron hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (35.2 g, 0.26 mol) y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (99.7 g, 0.52 mol) y la suspensión se agitó durante 45 minutos, momento en el que se había obtenido la solución completa. El intermedio A30 de WO 01/60805 (91.2g, 0.26 mol) se añadió como una solución en diclorometano (100 ml) durante 5 minutos y la solución se agitó durante 4 horas. Se añadió una mezcla de solución saturada de cloruro de amonio:agua (1:1, 1 litro) y la solución se agitó durante 10 minutos. La fase orgánica se separó y se extrajo con una mezcla saturada de cloruro de amonio:agua (1:1, 1 litro), los extractos fueron pH 6. La fase orgánica se separó y se extrajo con agua (1 litro) que contenía ácido acético (10 ml), extracto pH 5. La capa de diclorometano se separó y se extrajo con mezcla de solución saturada de carbonato de sodio: agua:salmuera saturada (1: 3: 0,2, 1 litro), pH 10,5, luego con una mezcla de salmuera saturada:agua (1: 1, 1 litro). La solución de color marrón se secó sobre sulfato de sodio anhidro en presencia de carbón decolorante (35 g), se filtró y se eliminó el disolvente. In vacuo para dar una espuma de color marrón oscuro. La espuma se disolvió en acetato de iso-propilo (100 ml) y el disolvente eliminado in vacuo. El residuo gomoso de color marrón oscuro se disolvió en acetato de iso-propilo en ebullición (500 ml), enfriado hasta temperatura ambiente, sembrado y agitado durante la noche. El sólido de color crema pálido producido se filtró y se lavó con acetato de isopropilo (100 ml). El sólido se secó por aspiración en el sinter durante 1 hora y luego se recristalizó en acetato de iso-propilo (400 ml). Después de agitar durante la noche, el sólido formado se filtró, se lavó con acetato de isopropilo (80 ml) y se secó in vacuo para dar el compuesto del título, 110 g, rendimiento del 63.5 %. RMN 1H (CDCh, ca 1.9: 1 mezcla de rotámero) 50.99 (6H, t), 2.10 (2H, m), 2.50 (4H, q), 2.58/2.62 (2H, 2 xt), 2.70/2.82 (2H, 2 xt), 2.86 (2H, t), 3.28/3.58 (2H, 2 xt), 4.45/4.52 (2H, 2 xs), 4.68/4.70 (2H, 2 xs), 4.93 (2H, s), 6.95 (2H, m), 7.31 (2H, d), 7.31/7.37 (2H, 2 x m), 7.48/7.52 (2H, d), 7.65 (2H, m), 7.72 (2H, m); MS (APCI) (M H)+ 667; pf 125=iC (por DSC - endotermia asimétrica).

Ejemplo de enfoque de síntesis (I)-1 (b)

Como se divulga en el documento WO 01/60805, bitartrato de 1-(N-(2-(Dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonilmetil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona

Preparado a partir de los intermedios A30 y B69 en el documento WO 01/60805 por el método del Ejemplo 1 en el documento WO 01/60805. ¹H-RMN (d⁶-DMSO, ca 1:1 mezcla de rotámero) 50.92/0.99 (6H, 2x t), 1.99 (2H, m), 2.54 (6H, m), 2.68/2.74 (4H, m), 3.36 (2H, m), 4.21 (2H, s), 4.37/4.44 (2H, 2x s), 4.63/4.74 (2H, 2x s), 4.89/5.13 (2H, 2x s), 7.08/7.14 (2H, 2x m), 7.36-7,50 (4H, m), 7.64/7.70 (2H, 2x d), 7.83 (4H, m); MS (APCI+) encontrado (M+1) = 667; C36H38F4N4O2S requiere 666.

Ejemplo de enfoque de síntesis (I)-1 (c)

Clorhidrato de 1-(N-(2-(dietilamino)etil)-N-(4-(4-trifluorometilfenil)bencil)aminocarbonil-metil)-2-(4-fluorobencil)tio-5,6-trimetilenpirimidin-4-ona

Como se divulga en el documento WO 01/60805, la base libre del Ejemplo (I)-1 (a) (3.00 g, 0.0045 mol) se suspendió con agitación en isopropanol (30 ml) y se calentó hasta 45 °C para dar una solución transparente. Después, la solución se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió ácido clorhídrico concentrado (0.40 ml, 0.045 mol). La suspensión resultante se agitó luego a temperatura ambiente durante 35 minutos, antes de enfriarse hasta 0 °C durante 35 minutos. Después, la suspensión se filtró y se lavó con isopropanol (10 ml), seguido de heptano (30 ml), antes de secarse bajo vacío para dar el compuesto del título como un sólido blanco (3.00 g, 95 %). ¹RMN H (CDCh) 5.38 (6H, t), 2.08 (2H, m), 2.82 (2H, t), 2.99 (2H, t), 3.19 (4H, m), 3.35 (2H, m), 3.97 (2H, s), 4.42 (2 H, s), 4.81 (2 H, s), 4.99 (2 H, s), 6.87 (2 H, t), 7.26 (2 H, t), 7.33 (2 H, d), 7.41 (2 H, d), 7.53 (2 H, d), 7.71 (2 H, d), 11.91 (1 H, s).

Síntesis de la fórmula (II)

En la solicitud internacional publicada WO 02/3091 1 se puede encontrar una descripción de cómo preparar los compuestos de fórmula (II) y ejemplos de productos intermedios y finales de los compuestos mencionados anteriormente. Un método de último paso para hacer un compuesto útil en esta invención es el Ejemplo (II)-1.

Ejemplo de enfoque de síntesis (II)-1

bitartrato de N-(2-Dietilaminoetil)-2-[2-(2-(2,3-difluorofenil)etil)-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-cidopentapinmidin-1-il]-W-(4'-tnfluorometil-bifenil-4-ilmetil)acetamida

Como se divulga en el documento WO 02/30911, una solución de N,N-dietil-N'-(4'-trifluorometil-bifenil-4-ilmetil)-etano-1,2-diamina (Int D4 en el documento WO 02/30911) (0.50 g, 1.44 mmol), 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (0.56 g, 1.45 mmol), 1-hidroxibenzotriazol hidrato (0.12 g) y ácido 2-(2-[2-(2,3-difluorofenil)-etil]-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-ciclopentapirimidin-1-il)-acético (Int C1 en el documento WO 02/30911) (0.48 g, 1.44 mmol) en diclorometano (10 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche y después se diluyó con diclorometano (30 ml), se lavó con bicarbonato de sodio acuoso y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía (cartucho de sílica de 10 g, acetato de etilo-acetona) para dar el compuesto del título como una espuma de color amarillo (base libre) (0.50 g, 52 %). ¹H-RMN (DMSO, mezcla de rotámero) 50.83-0,89 (6H, m), 1.98 (2H, m), 2.40 (4H, m), 2.45-2,82 (10H, m), 3.02 (2H, m), 4.64 /4.75 (2H, 2x s), 4.96/5.19 (2H, 2x s), 7.11-7,40 (5H, m), 7.65 (2H, m), 7.84 (4H, m); MS (APCI+) encontrado (M+1) = 667; 37H39F5N4O2 requiere 666.

Como se divulga en el documento WO 02/30911, se añadió ácido d-tartárico (0.09 g, 0.60 mmol) a una solución de la base libre (0.40 g, 0.60 mmol) en metanol (10 ml) con agitación. La solución resultante se evaporó para producir la sal (0.49 g). ¹H-RMN (DMSO, mezcla de rotámero) ^ 0.85-0,97 (6H, m), 1.91-2,00 (2H, m), 2.40-2,49 (4H, m), 2.54-2,82 (10H, m), 3.02-3,46 (2H, m), 4.20 (2H, s), 4.64/4.75 (2H, 2x s), 4.97/5.18 (2H, 2x s), 7.11-7.40 (5H, m), 7.65 (2H, m), 7.84 (4 H, m); MS (APCI+) encontrado (M+1) = 667; C37H39F5N4O2 requiere 666.

Siguiendo este proceso, o alternativamente otros procesos descritos en el documento WO 02/30911, se pueden preparar los otros compuestos mencionados anteriormente que tienen la estructura de fórmula (II).

Como se divulga en el documento WO 02/30911, se preparó bitartrato de N-(1 -etilpiperidin-4-il)-2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4H-quninazolin-1-il)-N-(4'-cloro-bifenil-4-ilmetil)acetamida (Ejemplo 135) haciendo reaccionar el Intermedio C43 con el Intermedio D82, de acuerdo con la divulgación en el documento WO 02/30911; la patente US 7.169.924:

Intermedio C43:

Intermedio C43: ácido 2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4H-quinazolin-1-il)acético: Como se divulga en el documento WO 02/30911, una solución de éster etílico del ácido 2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4H-quinazolin-1 -il)-acético (B65) (6.8 g, 18.3 mmol) en metanol (30 ml) y solución de hidróxido de sodio 2 M (18.0 ml, 36 mmol) a temperatura ambiente durante la noche. Se eliminó el solvente in vacuo y el residuo se disolvió en agua (10 ml). La acidificación a pH 1 con ácido clorhídrico 2 M dio un sólido que se filtró, se lavó con agua y se secó in vacuo para dar el producto deseado (5.9 g, 94 %) como un sólido blanco. ¹H-RMN (DMSO) ⁵3.11-3,30 (4H, m), 5.31 (2H, s), 7.16-7,33 (3H, m), 7.61 (1H, t), 7.68 (1H, d), 7.89 (1H, t), 8.18 (1 H, d); MS (APCI+) encontrado (M+1) = 345; C18H14F2N2O3 requiere 344.

Intermedio D82:

Intermedio D82: N-(1-etilpiperidin-4-il)-4-(clorofenil)-bencilamina: El Intermedio D82 se preparó mediante el método del Intermedio D8 como se divulga en el documento WO 02/30911; patente US 7.169.924: Los precursores de piperidona estaban bien sea disponibles comercialmente, o se preparaban fácilmente a partir de materiales disponibles comercialmente mediante métodos de la bibliografía o modificaciones menores de los mismos.

Síntesis de la fórmula (III)

La síntesis general de compuestos de fórmula (III) se ilustra en el siguiente esquema III, como se presenta en el documento WO02/30904:

Esquema III:

Con referencia a este esquema, el éster (IV) se puede preparar mediante alquilación N-1de (V) usando (VI), en el que R11 es como se define aquí anteriormente, por ejemplo (VI) es bromoacetato de t-butilo o bromoacetato de etilo, en presencia de una base, por ejemplo, BuLi en THF o hidruro de sodio en N-metil pirrolidinona (NMP) (etapa c).

Cuando X es CH²S, el intermedio clave (IV) se puede sintetizar haciendo reaccionar (XX) con metiluro de dimetiloxosulfonio, generado mediante el tratamiento de yoduro de trimetilsulfoxonio con hidruro de sodio a baja temperatura, para producir un ilido de azufre (XXII) (etapa q). El tratamiento posterior de (XXII) con disulfuro de carbono en presencia de diisopropilamina, seguido de R1CH²-L4, donde L4 es un grupo saliente, produce el intermedio (IV) (etapa r).

Alternativamente, cuando X es CH²S, el sustituyente de R1X se puede introducir mediante el desplazamiento de un grupo saliente L2 (por ejemplo, Cl) (etapa e) bien sea sobre una piridina (VIII) o N-óxido de piridina (XIV), para dar piridinas sustituidas en 2 (VII) y (XV). La transformación de (VII) o (XV) en la 4-piridona (V) se logra mediante la desprotección del 4-oxígeno (por ejemplo, usando (Ph3P)3RhCl cuando en etanol acuoso cuando R12 = alilo) (etapa d), seguido, para (XVI), por la eliminación del sustituyente N-óxido, usando hidrógeno en presencia de Pd/C en ácido acético (etapa k). La piridina (VIII) o N-óxido de piridina (XIV) se puede preparar mediante las etapas (i), (h), (g), (f) y (j), en las que:

(j) tratamiento de (VIII) con ácido m-cloroperbenzoico en diclorometano;

(f) tratamiento de (IX) con R¹²OH (X), en el que R¹²es alilo e hidruro de sodio en DMF;

(g) tratamiento de (XI) con oxicloruro de fósforo;

(h) tratamiento de (XII) con HCl acuoso con calentamiento;

(i) tratamiento de (XIII) con malonato de di-alquilo inferior y alcóxido de sodio en alcohol (en el que R¹³es C(1-6)alquilo, típicamente R¹³= Et); y

R¹- CH2SH (XIX) se prepara típicamente a partir del tioacetato, que se forma a partir del correspondiente bromuro de alquilo R¹-CH2Br.

Alternativamente, cuando X es CH2S y R²y R³, junto con los átomos de carbono del anillo de piridona a los que están unidos, pueden formar un anillo benzo fusionado, el intermedio (IV) se puede sintetizar a partir de materiales de partida conocidos mediante las etapas (s), (c) y (v) en las que:

(s) tratamiento del ácido de Meldrum (XXIII) con hidruro de sodio a baja temperatura, seguido de reacción con fenilisotiocianato y posterior tratamiento con R¹CH2-L4;

(c) como se discutió anteriormente;

(v) tratamiento de (XXV) con ácido trifluoroacético.

Cuando X es alquileno, es preferible utilizar las etapas (m) y (h) (intermedios (XVII), (XVIII)) o las etapas (n) y (p) (intermedios (XIX), (XX), (XXI)) en las que:

(h) transformación de una piridina 4-sustituida en una 4-piridona, por ejemplo, por tratamiento de (XVII) R¹⁴= Cl con HCl acuoso y dioxano, o desprotección de R¹⁴= O¹², por ejemplo usando las condiciones de la etapa (d).

(m) extensión de la cadena de una 2-alquil piridina, por ejemplo donde X = YCH2CH2 por tratamiento de una 2-metilpiridina (XVIII) con R¹-Y-CH2-L⁴(XVI) en el que L⁴es un grupo saliente y una base fuerte, tal como BuLi, en THF. En la ruta alternativa, el grupo 3-éster se elimina del intermedio (XIX) R¹⁵= C(1-6)alquilo por calentamiento en difenil éter donde R¹⁵= tBu (etapa n); el intermedio (XIX) se forma a partir de la 2,6-dioxo-1,3-oxazina (XX) y el éster (XXI) por tratamiento con una base tal como NaH en DMF o 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec- 7-eno en diclorometano.

La síntesis de (XX) a partir de materiales de partida conocidos se puede lograr mediante las etapas (w) y (c) o las etapas (y) y (c) en las que:

(w) tratamiento de (XXVII) con azidotrimetilsilano en THF;

(y) tratamiento de (XXVI) con fosgeno;

(c) como se describió anteriormente.

Véase el documento WO02/30904, para obtener detalles adicionales y una exposición de cómo hacer compuestos de fórmula (III).

Ejemplo de enfoque de síntesis (III)-1

W-(1-(2-Metoxietil)piperidin-4-il)-2-[2-(2,3-difluorobenciltio)-4-oxo-4W-quinolin-1-il]-W-(4'-trifluorometilbifenil-4-ilmetil)acetamida

Como se divulga en el documento WO02/30904, la base libre se preparó a partir de Int. E1 e Int. A42 mediante el método del Ejemplo 1, excepto que se usa DMF como disolvente en lugar de diclorometano. Se cristalizaron 1.97 g de este material en acetato de n.butilo (10 ml) para dar el compuesto del título (1.35 g). 1H-RMN (CD3OD) 51,7-2,05 (4H, m), 2.05-2,3 (2H, 2xt), 2,5-2,65 (2H, m), 2.95-3,1 (2H, m), 3.3 (3H, s), 3.45-3,55 (2H, m), 3.9-4.05 4.4-4.5 (1H, 2xm), 4.37 4.48 (2H, 2xs), 4.71 4.87 (2H, 2xbr s), 5.31 5.68 (2H, 2xs), 6.44 6.52 (1H, 2xs), 6.95-7,3 (3H, m), 7.35-7,85 (11H, m), 8,2-8,35 (1H, m); MS (APCI+) encontrado (M+1) 736; C40H38F5N3O3S requiere 735.

Síntesis de la fórmula (IV)

El siguiente diagrama de flujo ilustra un proceso para preparar los compuestos de esta invención.

Además, se remite al lector a la solicitud PCT publicada WO 03/016287 para las químicas que pueden ser útiles para preparar algunos de los intermedios establecidos en este diagrama de flujo. Esas químicas, en la medida en que sean útiles en este caso, se incorporan aquí como referencia como si se establecieran completamente en este documento. Además, se hace referencia a las síntesis expuestas en las solicitudes PCT publicadas WO 01/60805, WO 02/30911, WO 02/30904, WO 03/042218, WO 03/042206, WO 03/041712, WO 03/086400 y WO 03/87088, US 2008/0090851, US 2008/0090852, solicitudes US 2008/0090853 y US 2008/0103156. En la medida en que el lector desee preparar los compuestos de fórmula (IV) utilizando intermedios, reactivos, disolventes, tiempos, temperaturas, etc., distintos de los de la ruta de la página anterior, estas publicaciones pueden proporcionar una guía útil.

Bioensayo para identificar inhibidores de LP-PLA²:

Cribado para inhibición de la proteína Lp-PLA²

En algunas realizaciones, los métodos de la presente invención se refieren al uso de inhibidores de Lp-PLA^.2para el tratamiento de enfermedades oculares, es decir, edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgico, tracción y similares; degeneración macular relacionada con la edad (AMD); uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares. Cuando sea necesario, agentes que inhiben Lp-PLA²se evalúan mediante un bioensayo, por ejemplo, como, se describe en la patente U.S. 5,981,252

Los compuestos que se divulgan en este documento, por ejemplo, como se divulga en las secciones tituladas Ejemplos de síntesis, se probaron y se encontró que tenían valores IC⁵⁰en el rango de 0.1 a 10 nM.

Ejemplos

Los ejemplos aquí presentados se refieren a los métodos y composiciones para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades oculares, siendo el edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgico, tracción y similares; degeneración macular relacionada con la edad (AMD); uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares, por inhibición de Lp-PLA2.

En algunas realizaciones, los agentes que inhiben Lp-PLA2 puede evaluarse en modelos animales descritos en este documento para determinar su efecto en la reducción de la permeabilidad vascular del CNS.

En algunas realizaciones, los agentes que inhiben Lp-PLA2 puede evaluarse en modelos animales, por ejemplo, ratas diabéticas inducidas por STZ, divulgadas en el presente documento.

En algunas realizaciones, los agentes que inhiben Lp-PLA2 puede evaluarse en modelos animales que muestran un aumento de la permeabilidad de la barrera sanguínea/retiniana inducida por una combinación de diabetes e hipercolesterolemia.

Ejemplo 1

Efecto de los inhibidores de Lp-PLA²para reducir la permeabilidad vascular del CNS

Inhibidores de Lp-PLA2 en cerdos diabéticos (DM)/hipercolesterolémicos (HC)

Métodos:

Inducción de diabetes en cerdos

Se indujo diabetes a cerdos domésticos de granja de Yorkshire (-25-35 kg; Archer Farms) con una única inyección intravenosa de estreptozotocina 125 mg/kg (Mohler et al., 2008). Se monitorizaron de cerca la glucosa y el colesterol en sangre. Tres días después de la inducción de la diabetes, se utilizó una dieta hiperlipidémica para lograr la hipercolesterolemia con concentraciones de colesterol sérico fijadas entre 400 y 800 mg/dl. Debido a que los cerdos tienen una respuesta variable del colesterol sérico a una dieta alta en colesterol, las concentraciones de colesterol se revisaron cada dos meses. Un mes después de la inducción de DMHC, los cerdos fueron asignados aleatoriamente a un grupo de control o un grupo de tratamiento que recibieron 10 mg/kg/día por vía oral del inhibidor de Lp-PLA2 selectivo Darapladib (GlaxoSmithKline). Los cerdos se sacrificaron 28 semanas después de la inducción (es decir, 24 semanas después del inicio del tratamiento). En el momento de la finalización del estudio, había 17 cerdos en el grupo de control y 20 en el grupo tratado con Darapladib, ya que tres cerdos del grupo de control fueron excluidos del análisis debido a niveles de colesterol elevados persistentemente. Tres cerdos no se sometieron a la inducción de DM-HC y actuaron como controles de la misma edad. Se publicó el experimento específico (Wilensky et al., 2008), pero en esa publicación no se presentaron datos de fugas vasculares.

Preparación de tejidos de cerebro de cerdo para análisis inm unohistoquím icos m orfológicos y cuantitativos.

Las muestras de los cerebros de 29 cerdos, incluyeron 3 controles sin tratar; 13 DMHC y 13 DMHC tratados con Darapladib (Rx) se embebieron en cera de parafina. Cada muestra de cerebro se seccionó en serie y la primera sección que representa cada muestra se tiñó con hematoxilina y eosina (H+E), lo que permitió determinar las regiones corticales de las no corticales basándose en la tinción diferencial. Se utilizaron bloques de tejido facial completos (grandes) a lo largo de este estudio en un esfuerzo por maximizar la cantidad de tejido analizado para favorecer la cuantificación posterior. Las áreas totales (en mm cuadrados) de tejido cerebral cortical y no cortical en cada sección se midieron en secciones teñidas con H+E utilizando análisis de imágenes asistido por ordenador y el software Image Pro Plus.

Detección inmunohistoquím ica de la fuga de inmunoglobulina G (IgG) de los vasos sanguíneos del cerebro como indicador de la integridad y permeabilidad de la BBB.

Las secciones que representan cada bloque de muestras se sometieron a inmunotinción con anticuerpos específicos para inmunoglobulina G (IgG) de cerdo para localizar cualquier IgG no vascular en el espacio intersticial del cerebro o asociada con neuronas o astrocitos. En cerebros normales con una BBB supuestamente intacta, la IgG se excluye eficazmente del parénquima cerebral (especialmente en la corteza cerebral) en virtud de la integridad de la BBB. Con base en esto, la presencia de IgG intersticial, nubes de fuga perivascular que contienen IgG e IgG asociadas con neuronas y/o astrocitos se interpretaron como evidencia de una fuga de plasma local y una mayor permeabilidad o degradación de la BBB. La inmunohistoquímica para tejidos embebidos en parafina se llevó a cabo como se describió anteriormente (D'Andrea et al., 2001; Nagele et al., 2002). En resumen, las secciones de tejido cerebral se desparafinaron usando xileno, rehidratadas a través de una serie graduada de concentraciones decrecientes de etanol. La antigenicidad de la proteína se potenció calentando secciones en microondas en regulador de citrato. La peroxidasa endógena se inactivó tratando secciones con 0.3 % de H2O2 durante 30 min. Las secciones se incubaron primero en suero bloqueante y luego se trataron con anticuerpo primario (anti-Ig porcina) a diluciones apropiadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un enjuague completo en PBS, se aplicó el anticuerpo secundario marcado con biotina durante 30 min. Las secciones se trataron con el complejo de biotina marcado con avidina-peroxidasa (ABC, Vector Labs, Foster City, CA) y se visualizaron mediante el tratamiento con 3-3-diaminobenzidina-4-HCL (DAB)/H2O2 (Biomeda, Foster City, CA). A continuación, las secciones se contratiñeron ligeramente con hematoxilina, se deshidrataron mediante concentraciones crecientes de etanol, se aclararon en xileno y se montaron en Permount. Los controles consistieron en secciones de cerebro tratadas con suero no inmune u omisión del anticuerpo primario. Las muestras se examinaron y fotografiaron con un microscopio Nikon FXA, y las imágenes digitales se registraron usando una cámara digital Nikon DXM1200F y se procesaron usando el software de imagen Image Pro Plus (Phase 3 Imaging, Glen Mills, PA).

Análisis cuantitativos de la densidad de los vasos sanguíneos que muestran una fuga de IgG

La densidad de las fugas vasculares (BBB) (= el número de fugas por unidad de área en secciones de tejido cerebral) se calculó de la siguiente manera: las áreas totales (en mm cuadrados) de tejido cerebral cortical y no cortical en cada sección teñida con H+E usando análisis de imágenes asistido por ordenador y el software Image Pro Plus. El procedimiento de tinción H+E se modificó ligeramente para permitir distinguir fácilmente la corteza de la no corteza con base en las diferencias de color. La capacidad de este procedimiento de tinción para delimitar la corteza de la no corteza se confirmó mediante un examen microscópico detallado. Después de que se completaron las determinaciones de área para cada sección, la siguiente sección histológica consecutiva se sometió a inmunotinción como se describió anteriormente con anticuerpos anti-IgG porcina con el fin de detectar la presencia de cualquier IgG en el tejido cerebral. Los vasos sanguíneos proporcionaron un control positivo interno en cada sección que, por supuesto, contienen IgG intravascular. Cada sección inmunoteñida se evaluó contando el número total de perfiles de vasos sanguíneos que aparecen en la corteza y en la no corteza que también presentaban nubes de fuga perivascular. En el recuento solo se incluyeron las nubes de fuga que contenían perfiles de vasos sanguíneos, a pesar de que también se observaron muchas otras nubes de fuga en las que el vaso fuente estaba bien sea por encima o por debajo del plano de sección. Los vasos sanguíneos asociados con cada nube de fuga se registraron como arteriolas, vénulas o capilares y se designaron como corticales o no corticales. La densidad de fugas se calculó como el número de fugas por unidad de área (mm cuadrado) de corteza o no corteza.

Análisis cuantitativo del alcance de las fugas vasculares (BBB)

Las nubes de fuga individuales que aparecen en las secciones del cerebro se puntuaron según la extensión de la fuga, la región específica del cerebro, el tipo de vaso (arteriola, vénula o capilar) y su ubicación cortical o no cortical. Cabe señalar aquí que, aunque las nubes de fuga perivascular aparecen como círculos con el vaso sanguíneo de origen en o cerca del centro, estas nubes son en realidad cilíndricas en tres dimensiones. Debido a que son cilíndricas, una duplicación del diámetro de la nube de fuga como se ve en las secciones en realidad se traduce en un aumento de aproximadamente cuatro veces en el volumen (cantidad) de la nube de fuga. Por lo tanto, los valores utilizados y presentados aquí son subestimaciones de los valores reales "3D". Por último, el tamaño relativo de la nube de fugas se ha utilizado como una medida de la "cantidad de la fuga" o la extensión de la fuga.

Análisis cuantitativo de la cantidad y distribución del péptido amiloide beta1-42 (Abeta42) a lo largo de la corteza cerebral del cerebro de cerdo DMHC.

Abeta42 se detectó y cuantificó en secciones histológicas de la corteza cerebral del cerebro de cerdo utilizando inmunohistoquímica cuantitativa y anticuerpos específicos para este péptido. Las secciones que representan cada bloque de muestras se sometieron a inmunotinción con anticuerpos específicos para Abeta42 y se examinaron y fotografiaron con un microscopio Nikon FXA, y las imágenes se registraron con una cámara digital Nikon DXM1200F y se analizaron con el software de imagen Image Pro Plus (Phase 3 Imaging, Glen Mills, PA).

En cada una de las cinco ubicaciones corticales seleccionadas al azar dentro del tejido, se tomaron cuatro imágenes de 20 x; dos de las 2-3 regiones de capas corticales más cercanas y dos en las correspondientes 4-6 regiones de capas corticales. De esta forma, se obtuvieron un máximo de veinte imágenes de 20x de cada diapositiva. Para el análisis de imágenes, se utilizó un subprograma automatizado que opera dentro del programa de análisis de imágenes Image Pro Plus. Se utilizaron imágenes de control que mostraban poca o ninguna inmunorreactividad de Abeta42 para establecer el umbral de la línea de base bajo condiciones de intensidad de luz idéntica, filtros de luz, condensador y ajustes de apertura y fotoamplificación por la cámara digital. El Abeta42 total presente en cada sección histológica de 20x se midió automáticamente y los datos se descargaron en una hoja de cálculo de Excel y se analizaron.

Observaciones

Efecto del inhibidor de Lp-PLA2 '848 sobre la fuga vascular en cerdos diabéticos (DM)/hipercolesterolémicos (HC).

Los cerdos tratados con inhibidores farmacológicos de Lp-PLA2 mostraron que los animales a los que se les administró 10 mg/kg/día de Darapladib experimentaron un efecto de bienestar general (mayor actividad y estado de alerta) en comparación con los animales de control DM/HC (letárgicos, generalmente sin respuesta). Tras la necropsia, se examinaron los cerebros de animales DM/HC tratados con SB480848, animales DM/HC de control y animales no diabéticos/no hipercolesterolémicos. En cerebros normales con una barrera hematoencefálica (BBB) intacta, la IgG se excluye eficazmente del parénquima cerebral (especialmente en la corteza cerebral) en virtud de la integridad de la BBB. Por tanto, la presencia de IgG intersticial, nubes de fuga perivascular que contienen IgG e IgG asociadas con neuronas y/o astrocitos se ha interpretado como evidencia de una fuga de plasma local y un aumento de la permeabilidad o degradación de la BBB. Los animales de control con DM/HC mostraron evidencia de una fuga vascular significativa de todos los tipos de vasos sanguíneos en el cerebro, lo que puede explicar los aspectos de comportamiento notables. Esto se puso de manifiesto por una fuerte inmunorreactividad histoquímica de IgG en el parénquima cerebral en la región de los vasos sanguíneos que contienen IgG intravascular. Darapladib fue eficaz para reducir la extensión de las fugas en todos los tipos de vasos dentro de la microvasculatura del cerebro (véanse Figuras 1 y 2).

La sangre es la principal fuente de péptido Abeta42 que está 10 veces más concentrado en el suero que el líquido cefalorraquídeo y se encuentra que se filtra al cerebro durante los períodos de mayor permeabilidad de la BBB. Una vez en el cerebro, el péptido Abeta42 puede acumularse dentro de tipos de células neuronales específicos (Clifford et al., 2007). Los cerdos DM/HC mostraron un aumento de la deposición de amiloide de forma selectiva en las neuronas piramidales de la corteza cerebral (y en todas las regiones del cerebro analizadas) en comparación con los animales de control. Darapladib redujo la deposición de amiloide en los cerebros de cerdo DM/HC en todas las capas de la corteza en comparación con los cerdos DM/HC no tratados. Se determinó que el efecto se debía a una reducción en el número (densidad) de neuronas positivas al péptido Abeta42 en lugar de a la cantidad de péptido Abeta42 asociado con neuronas específicas que eran modestas (véanse Figuras 3, 4 y 5).

En conjunto, la tinción de IgG y la localización del péptido Abeta42 en el cerebro de cerdos con DM/HC demuestran que el material luminal de los vasos cerebrales se escapa de la vasculatura cerebral al parénquima tisular normal y que tal fuga vascular es atribuible al estrés metabólico inducido por la hipercolesterolemia y diabetes. El tratamiento con Darapladib parece no solo inducir cambios de comportamiento en animales con estrés metabólico, sino que también parece tener un efecto muy eficaz en la reducción de la permeabilidad de la BBB inducida por el estrés metabólico.

Ejemplo 2

Efecto de inhibidores de Lp-PLA²en conejos hipercolesterolémicos alimentados con cobre

Métodos:

Inducción de hipercolesterolemia en conejos

Se compraron conejos blancos de Nueva Zelanda macho SPF de 3-4 meses de Covance (Denver, PA), se alojaron individualmente y tuvieron acceso ad libitum a comida para conejos y agua en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h. Los experimentos se repitieron dos veces con animales que llegaron con 3 semanas de diferencia. Los conejos se asignaron al azar a cinco grupos de tratamiento con un tamaño de muestra de 8 animales por grupo. Se colocaron 32 conejos con dieta de colesterol/cobre y 8 conejos se alimentaron con pienso normal. La dieta de colesterol/cobre consistió en 160 g por día de dieta producida comercialmente (Purina Mills High Fiber Diet) suplementada o no con un 2 % de colesterol. Se añadió sulfato de cobre (0.12 mg/l) al agua de bebida de los conejos asignados a la dieta suplementada con colesterol.

Dosificación animal

Se pesaron los animales y se suministró el fármaco o vehículo a 3 ml/kg para afectar a una dosis de 10 mg/kg mediante inyección subcutánea en el pliegue del cuello.

Grupos de tratamiento

Se asignaron seis grupos de animales que consistían en 8 animales a los siguientes grupos de tratamiento. Los grupos 1 -5 se mantuvieron con una dieta suplementada con colesterol con sulfato de cobre en el agua de bebida. El bitartrato de W-(1-etilpiperidin-4-il)-2-(2-(2-(2,3-difluorofenil)-etil)-4-oxo-4H-quninazolin-1-il)-W-(4'-cloro-bifenil-4-ilmetil)acetamida es un compuesto inhibidor de Lp-PLA2, es decir, inhibidor de Lp-PLA2 '859.

Grupo 1: tratado diariamente con vehículo desde el día 29-72

Grupo2: tratado con inhibidor de Lp-PLA2 '859 (10 mg/kg) diariamente desde el día 29-72

Grupo 3: tratado diariamente con vehículo desde el día 1-72

Grupo 4: tratado con inhibidor de Lp-PLA2 '859 (10 mg/kg) diariamente desde el día 1-72

Grupo 5: Animales con dieta normal sin tratamiento.

Medición de la actividad de Lp-PLA2 en plasma de conejo

La actividad de Lp-PLA2 se midió en muestras de plasma recolectadas los días 1, 29, 32 y 72 usando técnicas patentadas de GSK.

Permeabilidad de la barrera hematoencefálica de conejo

A tres conejos de cada uno de los cinco grupos de tratamiento para un total de 15 conejos se les inyectó un marcador para la evaluación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica. Los cambios en la permeabilidad de BBB se evaluaron utilizando el marcador fluorescente fluoresceína sódica (NaF). El procedimiento realizado fue una modificación de los métodos descritos anteriormente (Lenzser et al., 2005; Phares et al., 2007; Morrey et al., 2008). Los animales se anestesiaron con isoflurano y se inyectaron i.v. con 5 ml de NaF al 2 % en PBS que se dejó circular durante 30 min. A continuación, los animales se perfundieron transcardialmente (45 ml/min) con PBS durante 5 min hasta que se observó perfundido incoloro. Después de la perfusión, los animales fueron decapitados, se extrajeron los cerebros y se aislaron los hemisferios izquierdo y derecho. Se pesó el hemisferio izquierdo y se colocó en 10 volúmenes de ácido tricloroacético al 50 % p/v, se homogeneizó, se centrifugó a 13.000 g durante 10 min y se neutralizó el sobrenadante con hidróxido de sodio 5M. La cuantificación de NaF se determinó a longitudes de onda de excitación/emisión de 44/525 nm. El contenido de colorante fluorescente se calculó por referencia a estándares con un rango de 10-200 ng/ml.

Observaciones

Tratamiento de conejos con inhibidor de Lp-PLA2 '859 en Lp-PLA2 en plasma.

La actividad de Lp-PLA2 se analizó en 4 puntos de tiempo mediante análisis de varianza de medidas repetidas (ANOVA). El grupo de efecto fue significativo (p <0.0001). El análisis post hoc del efecto de grupo significativo indicó que los conejos tratados con el inhibidor de Lp-PLA2 '859 desde el inicio de la dieta alta en grasas tenían niveles significativamente más bajos de actividad de Lp-PLA2 durante el transcurso de 72 días mientras que los animales que habían recibido el tratamiento desde el día 29 mostró una reducción en la actividad de Lp-PLA2 el día 72 (véase Figura 6)

Permeabilidad de la barrera hematoencefálica

Hubo una menor permeabilidad de BBB en los conejos mantenidos con una dieta normal mientras que los conejos con una dieta suplementada con colesterol y sulfato de cobre mostraron un profundo aumento en la permeabilidad de BBB. Un análisis de varianza de una vía comparando la permeabilidad en los 6 grupos fue estadísticamente significativo F (5.16) = 15.31, p <0.0001. Las pruebas post-hoc de Dunnetts indicaron una diferencia significativa entre la permeabilidad en los animales de dieta normal y los animales con dieta de colesterol alto/CuSO4. Se observó una disminución numérica en la permeabilidad en los animales tratados con inhibidor de Lp-PLA2 '859 en comparación con los grupos tratados con vehículo en los grupos de animales alimentados con colesterol alto/CuSO4-. Esto fue evidente cuando se dosificó el fármaco entre los días 29-72 y los días 1 -27 (véase Figura 7). Sin embargo, los tamaños de la muestra eran demasiado pequeños para que estas diferencias fueran estadísticamente significativas. Un animal se omitió del análisis debido a una mala perfusión.

Ejemplo 3

Inhibidores de Lp-PLA2 en ratas diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ)

La diabetes inducida por STZ es un modelo comúnmente utilizado de diabetes tipo 1 y las ratas diabéticas STZ son las especies animales más utilizadas como modelos preclínicos, ya que sus retinas exhiben la mayoría de las características patológicas de la retinopatía diabética de fondo observada en humanos, incluida la dilatación de los vasos sanguíneos., engrosamiento de la membrana basal, disfunción neuronal y glial y degradación de iBRB. Este modelo de retinopatía diabética se ha utilizado ampliamente para evaluar la eficacia de los fármacos.

Métodos

Animales, inducción de diabetes y dosificación de fármacos.

En este estudio se utilizaron ratas SD macho, de 6 semanas de edad y con un peso de 180-200 g; las ratas tenían libre acceso a comida y agua y se mantuvieron en jaulas en una habitación con control ambiental con un ciclo de luzoscuridad de 12 horas. La diabetes se indujo siguiendo la dosificación de los animales con estreptozotocina (50 mg/kg/día administrados i.p. para cada uno de los primeros 3 días del protocolo) en regulador de citrato de sodio 10 mM pH 4.6. La N-[2-(dimetilamino)etil]-2-[[(4-fluorofenil)metil]tio]-5-(1-metil-1H-pirazol-4-il)metil]-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1 '-bifenil]-4-il]metil]-1 (4H)-pirimidinacetamida (inhibidor de Lp-PLA2 '495) se solubilizó en 10 % de hidroxipropil-beta-ciclodextrina o Dm So : 1 % de metilcelulosa (1:99) e inhibidor de Lp-PLA2 '859 en DMSO: 1 % de metilcelulosa (1:99) y dosificado por inyección i.p. a 10 mg/kg/día desde el día 4 hasta el día 31 y desde el día 4 hasta el día 18 respectivamente. Los animales que mantuvieron un nivel elevado de glucosa en sangre de más de 9 mM se consideraron diabéticos.

Determinación de glucosa en sangre en ratas SD

Se extrajeron entre 25 y 40 ul de sangre de la vena de la cola después de ayunar durante la noche y se determinó el nivel de glucosa en sangre usando un sistema de monitorización de glucosa en sangre OneTouch UltraEasy de Johnson (Lifescan) y se hizo funcionar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los niveles de glucosa en sangre se determinaron tanto antes como después de la administración de estreptozotocina.

Determinación de la actividad plasmática de Lp-PLA2 en ratas SD

La actividad de Lp-PLA2 se determinó en muestras de suero utilizando el kit de ensayo comercial de Lp-PLA2 ensayo AZWell auto-PAF-AH (Cosmo Bio Co Ltd, Japón, www.cosmobio.co.jp) y procedimientos realizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Tomografía de coherencia óptica experimental (sistema OCT)

Las imágenes de la retina se escanearon mediante un OCT de dominio de Fourier disponible comercialmente (RTVue-100; versión 2.1; Optovue, Inc., California, EE. UU.). Se adaptó al OCT una fuente de luz de diodo superluminiscente con una longitud de onda central de 840 nm y un ancho de banda completo de 50 nm. Se accedió al grosor de la retina mediante el software automático del escáner RTVue con ajuste manual. El grosor de la retina se definió desde la capa capa de epitelio pigmentario de la retina (RPE) hasta la capa de células ganglionares de la retina (GCL).

Procedimiento de generación de imágenes por tomografía de coherencia óptica (OCT) y determinación del grosor de la retina y la exudación de líquido retiniano

Se realizaron dos estudios separados. Se tomaron imágenes de la retina en los días experimentales 4, 10, 13, 17, 22, 28 y 31 para el segundo estudio y los días 0, 4, 7, 10, 14 y 18 para el primer estudio. Los animales se anestesiaron mediante inhalación de isoflourano al 5 % y las pupilas se diluyeron con tropicamida al 1 % y fenilefrina al 1 %. Antes del análisis de OCT, los animales se fijaron en un marco de soporte y el ojo que se va a tomar la imagen se colocó para alinearse con el centro del haz de exploración perpendicular al fondo de ojo. Para generar las imágenes se utilizó un patrón de escaneo de líneas (1024 escaneos axiales) con una longitud de escaneo de 2 mm. Después de la generación de imágenes, los animales se recuperaron y se devolvieron a las jaulas. El espesor de la retina de seis puntos de tiempo de medición de OCT se analizó mediante análisis de varianza de mediciones repetidas (ANOVA) utilizando el software Prism. Cuando ANOVA mostró un efecto principal significativo, se utilizó además la prueba t de Student para revelar diferencias entre los grupos de tratamiento con compuestos con controles de vehículo. Todos los datos se expresaron como valor medio ± SEM.

Determinación de la permeabilidad vascular retiniana con azul de Evans

Esta metodología se realizó de acuerdo con métodos previamente publicados (Xu et al., 2001) con la excepción de que se usó LC-MS/MS para determinar el azul de Evans presente en las retinas de animales experimentales. Los animales se anestesiaron con 30 mg/kg de avertina, se hicieron incisiones en la piel y el músculo del abdomen, se expusieron cuidadosamente la arteria y la vena ilíacas y se canularon con tubos de polietileno de 0.28 y 0.58 mm de diámetro interno, respectivamente, y se llenaron con solución salina heparinizada. Se inyectó azul de Evans (30 mg/ml en solución salina) a través de la vena ilíaca durante 10 segundos a una dosis de 45 mg/kg. Dos minutos después de la inyección de azul de Evans, se extrajeron 50 ul de sangre de la arteria ilíaca para obtener la concentración plasmática inicial de azul de Evans. Posteriormente, a intervalos de 30 minutos, se extrajeron 50 ul de sangre de la arteria ilíaca hasta 2 horas después de la inyección para obtener la concentración plasmática de azul de Evans promediada en el tiempo. Exactamente 2 horas después de la infusión, se extrajeron 50 ul de sangre del ventrículo izquierdo para obtener la concentración plasmática final de azul de Evans. Los resultados se expresan en microgramos de azul de Evans por microlitro de plasma. Inmediatamente después de la perfusión, ambos ojos fueron enucleados y bisecados en el ecuador. A continuación, las retinas se disecaron cuidadosamente bajo un microscopio quirúrgico. Una vez disecadas, las muestras de retina se secaron en un speed-vac y luego se pesaron antes de la adición de metanol (20 pl/mg de tejido). Posteriormente, el tejido se homogeneizó y la proteína se precipitó mediante centrifugación a 12000 rpm durante 10 min. Se diluyeron 30 pl de sobrenadante con 30 pl de H2O y 6 pl de solución estándar interna (2,3-Dihidro-5-metil-n-[6-[(2-metil-3-piridinil) oxi]-3-piridinil]-6-(trifluorometil)-1 H- indol-1 -carboxamida, divulgada en el documento WO 97/48699, 20 ng/ml en H2O). Después de sometimiento a vórtex adicional y centrifugación a 4000 rpm durante 5 min, se inyectaron 10 pl de sobrenadante en el sistema LC-MS/MS para determinar la concentración de azul de Evans en muestras de retina. La fase móvil del método LC fue (A) CH3COONH4-CH3CN 1 mM (9/1, v/v) y (B) CH3CN-CH3OH (4/1, v/v). El gradiente se ejecutó como se define en la Tabla 1.

Tabla 1: Parámetros de LC para la determinación de azul de Evans en tejidos retinianos

Tabla 2: Los parámetros de MS para la determinación por CL-EM/EM de azul de Evans en tejidos retinianos se muestran en las Tablas 2A y 2B.

Tabla 2A

Tabla 2B

Se ensayó el peso seco de las retinas y la fuga del tinte azul de Evans en las retinas.

La ruptura de la barrera hemato-retiniana se calculó utilizando la siguiente ecuación:

Evans blue (ug)/retina dry weight (g)

Time averaged Evans blue concentration (ug)/plasma (ul) X circulation time (h)

Aislamiento de células endoteliales microvasculares de cerebro de rata (BMEC)

Se sacrificaron ratas Sprague-Dawley (SD) de tres semanas mediante dislocación cervical. Después de eliminar la sustancia blanca, las meninges y los vasos piales macroscópicos, la sustancia gris se trituró completamente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enfriado con hielo. A continuación, el tejido se digirió en DMEM (7 ml para 5 cerebros de rata) que contenía colagenasa II (1 mg/ml) y DNasa I (39 U/ml) a 37 °C durante 1 h con una velocidad de agitación de 130 rpm. El tejido digerido se diluyó con el mismo volumen de DMEM y se centrifugó a 1000 g durante 8 min a 4 °C. las pellas celulares se resuspendieron en una solución de albúmina de suero bovino al 20 % (BSA)-DMEM y se centrifugó a 1000 g durante 20 min a 4 °C. Los microvasos obtenidos en las pellas se digirieron adicionalmente con colagenasa-dispasa (1 mg/ml) y DNasa I (39 U/ml) en DMEM (3 ml para 5 cerebros de rata) durante 0.5 h a 37 °C. La solución de microvasos digerida se diluyó con el mismo volumen de DMEM y se centrifugó a 700 g durante 6 min a 4 °C. Las pellas se resuspendieron y se colocaron en capas sobre un gradiente de Percoll continuo al 33 % y se centrifugaron a 1000 g durante 10 min a 4 ° C. La capa de microvasos se recolectó y se lavó dos veces con el mismo volumen de DMEM. Los fragmentos de microvasos resultantes se colocaron en placas a una densidad de 6 x 10⁵células/cm²sobre insertos Transwell recubiertos de colágeno ECM (0.33 cm²) en medio basal endotelial suplementado (EBM®-2 que contiene hidrocortisona, hEGF, VEGF, hFGF-B, R3-IGF-1, ácido ascórbico, gentamicina/anfotericina-B y FBS al 5 %, (Lonza)). Se permitió que las BMEC se unieran y migraran durante 24 h antes de cambiar el medio a EBM®-2 suplementado que contenía 4 pg/ml de puromicina. Después de 2 días de tratamiento con puromicina, el medio de cultivo se reemplazó con EBM®-2 suplementado durante otros 2 días de mantenimiento antes de que estuvieran listos para la construcción del modelo cocultivado.

Aislamiento y cultivo de astrocitos de rata.

Se obtuvieron astrocitos cerebrales de rata de ratas SD neonatales. La corteza cerebral libre de meninges se trituró y se digirió en tripsina-EDTA al 0.125 % durante 10 min (3 ml/cerebro de rata). La actividad de la tripsina se terminó añadiendo el mismo volumen de FBS-DMEM al 10 %. La suspensión se dispersó y se centrifugó a 1000 g durante 5 min. Las pellas celulares se resuspendieron con una solución de FBS-DMEM al 10 % y se forzaron posteriormente a través de un filtro de 100 pm y 40 pm. El filtrado se centrifugó y se resuspendió en FBS-DMEM al 10 % y luego se sembró en placas en un matraz recubierto de poli-L-lisina a una densidad de 1 x 10⁵células/cm². El medio se cambió cada 3 días. Después de 9 días de cultivo, los matraces se agitaron durante la noche en una atmósfera de 37 ° C, 95 % de humedad relativa y 5 % de CO2 para eliminar la microglía contaminante. Los astrocitos resultantes se sometieron a pases adicionales o se crioconservaron a -80 ° C.

Construcción de un modelo de BBB cocultivado in vitro y determinación de la resistencia eléctrica transendotelial

Los astrocitos suspendidos en FBS-DMEM al 10 % se sembraron en una placa de cultivo de 24 pocillos recubierta con Poly-L-lisina en un paso entre 1 y 4 a una densidad de 1.5 x 10⁴/cm². Después de veinticuatro horas, las BMEC cultivadas en un Transwell durante 5 días se transfirieron a las placas de cultivo de 24 pocillos que contenían astrocitos.

El medio en el compartimento luminal y abluminal se reemplazó con EBM®-2 suplementado sin suero que contenía hidrocortisona 550 nM durante 2 días. La resistencia eléctrica transendotelial (TEER) de las monocapas se determinó todos los días utilizando Millicell-ERS (Millipore, Bedford, MA) y cuando el TEER> 150 Q cm2, la monocapa estaba lista para el experimento de transporte. Se tomaron nediciones idénticas de TEER después del tratamiento en monocapas de BMEC con lisofospatidilcolina (liso-PC). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student no apareada de dos colas.

Permeabilidad del Amarillo Lucifer en cocultivos BMEC-astrocitos

Las monocapas de BMEC se trataron con 0,3, 1, 3, 6 y 10 pg/ml de lisoPC añadido al lado apical de la placa de cocultivo del sistema Transwell (n = 4 para cada concentración) seguido de la adición de 2 pl de amarillo lucifer colocado de forma similar hacia el lado apical dando como resultado una concentración final de Amarillo Lucifer de 100 pM. El fluido de cultivo de tejidos en el lado apical de cada pocillo se mezcló a fondo varias veces de extracción y dispensación. Las monocapas de BMEC dosificadas se incubaron durante 90 min en una cámara humidificada a 37 °C, 95 % de humedad relativa y 5 % de CO2 mientras se mezcla en un agitador orbital a 130 rpm. Después de la incubación de 90 min, se aspiraron 50 pl de medio donante (apical) y 100 pl de medio receptor (basolateral). La concentración de amarillo lucifer en el compartimento donante y receptor se midió mediante detección de fluorescencia (longitud de onda de excitación de 485 nm y longitud de onda de emisión de 530 nm). La permeabilidad del amarillo lucifer se determinó usando la siguiente ecuación.

donde V^dy V^rson los volúmenes del medio del donante y del receptor en ml, respectivamente

A es el área de la superficie de la membrana en cm2, t es el tiempo de transporte en segundos

CR(t) es la concentración medida de amarillo lucifer en el compartimento receptor en el tiempo t (90 minutos) CD(t) es la concentración medida de amarillo lucifer en el compartimento donante en el tiempo t (90 minutos) El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student no apareada de dos colas.

Observaciones

La inducción de diabetes en ratas SD con STZ durante tres días condujo a un aumento de la glucosa en sangre en ayunas que se mantuvo durante el transcurso del estudio. Como era de esperar, el tratamiento con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg/día) no alteró la hiperglucemia inducida por STZ. Los animales que no fueron tratados con STZ mantuvieron un nivel de glucosa en sangre normal de alrededor de 5 mM durante el transcurso del estudio (véase Figura 8). El tratamiento de ratas SD con STZ también dio como resultado un aumento de la actividad plasmática de Lp-PLA2 que se suprimió posteriormente tras una dosis única de inhibidor de Lp-PLA2495 (10 mg/kg) observable 3 horas después de la dosis y 24 horas después de la dosis. El efecto fue incluso más pronunciado 24 horas después de la segunda dosis diaria de 10 mg/kg de inhibidor de Lp-PLA2 '495 ya que la actividad plasmática de Lp-PLA2 ha aumentado adicionalmente en animales que fueron tratados con STZ pero no con el inhibidor de Lp-PLA2' 495 (véase Figura 9). Estos datos proporcionan evidencia directa de la actividad in vivo del inhibidor de Lp-PLA2 '495 en la inhibición de la actividad plasmática de Lp-PLA2.

La inducción de hiperglucemia en ratas SD condujo a un aumento en la extravasación de colorante azul de Evans asociado a albúmina en la retina, lo que proporciona una evidencia directa de que tal hiperglucemia puede resultar en un aumento de la permeabilidad de la barrera hemato-retiniana. La permeabilidad y extravasación del azul de Evans en el parénquima retiniano se ha utilizado muchas veces y es una técnica establecida para mostrar la permeabilidad de la barrera hemato-retiniana in vivo en respuesta a la hiperglucemia y otros estímulos (Xu et al., 2001). La inducción de hiperglucemia durante 31 días aumentó la permeabilidad de la barrera hemato-retiniana en la mayoría de los animales en comparación con la de los animales no diabéticos. El aumento de la permeabilidad retiniana se atenuó mediante el tratamiento diario de los animales con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg). Sin embargo, esto no fue al nivel exhibido por los controles no diabéticos y aunque no fue estadísticamente significativamente diferente de los animales diabéticos no tratados, hubo una clara tendencia de efecto (véase Figura 10, A, B).

Una metodología adicional para evaluar la permeabilidad retiniana in vivo consiste en obtener imágenes directamente de la retina mediante tomografía de coherencia óptica (OCT) lo que permite distinguir capas individuales de la retina en animales vivos y evaluar cualquier perturbación en la estructura de las capas retinianas. También es posible discernir la presencia de líquido subretiniano dentro de la retina y dicha instrumentación se usa clínicamente para diagnosticar y monitorizar el tratamiento de la enfermedad ocular diabética. Esta técnica se utilizó para evaluar la exudación subrretiniana de líquido en animales normoglucémicos, hiperglucémicos e hiperglucémicos tratados con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg/día) durante 28 días. Se observó que ningún animal normoglucémico mostró evidencia de acumulación de líquido subrretiniano el día 14, mientras que en los animales hiperglucémicos el 40 % de los animales examinados mostraban signos de acumulación de líquido retiniano. Sin embargo, los animales hiperglucémicos que se trataron con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg/día) no mostraron que ningún animal tuviera una acumulación manifiesta de líquido retiniano como lo demuestra la OCT (véase la Figura 11). Estos datos apoyan los datos de permeabilidad del azul de Evans al demostrar un efecto de esta clase de compuesto en la moderación de la permeabilidad retiniana secundaria a la hiperglucemia aguda en ratas SD.

Una consecuencia del aumento de la permeabilidad de la barrera hemato-retiniana es una pérdida de homeostasis en la retina lo que conduce a la degeneración de la retina neural, una característica observada tanto en modelos preclínicos como en pacientes con edema macular diabético humano (Bursell et al., 1996; Ahlers et al., 2009). En modelos preclínicos esto se manifiesta como una reducción en el número de células neuronales (que están organizadas en capas en la retina) y consecuentemente un adelgazamiento de toda la capa neurorretiniana, definida como las capas entre la capa de células ganglionares retinianas (RGC) y el epitelio pigmentario de la retina (EPR). Se utilizó OCT para determinar el grosor de las capas retinianas. Se realizaron dos estudios individuales en los que el tratamiento de animales con 50 mg/kg/d i.p STZ durante 3 días condujo a una reducción dramática dependiente del tiempo en el grosor de la retina. En el primer estudio, el adelgazamiento de la retina inducido por STZ fue parcial pero significativamente inhibido por el tratamiento con 10 mg/kg/día de inhibidor de Lp-PLA2 '495 después de que se inició el tratamiento a los 8 días y se evaluaron las diferencias estadísticas a los 10 y 18 días (véase Figura 12, A, B, C, p <0.05 en ambos puntos de tiempo). El tratamiento con el inhibidor de Lp-PLA2 '859 (iniciado en el día 4) también mostró una reducción en el grosor de la retina, pero este efecto no fue estadísticamente significativamente diferente de los animales tratados solo con vehículo (Figura 12, A, B y C), aunque debe tenerse en cuenta que el inhibidor de Lp-PLA2 '859 es un inhibidor significativamente menos potente que el inhibidor de Lp-PLA2' 495 en la enzima Lp-PLA2 de rata.

En un segundo estudio independiente, los animales que fueron tratados con STZ (50 mg/kg/d ip) durante 3 días llevaron a una reducción dramática dependiente del tiempo en el grosor de la retina, lo que fue significativamente diferente de los animales que no fueron tratados para inducir diabetes (p < 0.001 prueba t). Los animales tratados con STZ que fueron tratados posteriormente con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 STZ mostraron una atenuación significativa en el desarrollo de adelgazamiento de la retina en comparación con ratas diabéticas tratadas con vehículo (p <0.001 prueba t) (véase Figura 13).

La acción de Lp-PLA2 sobre fosfolípidos oxidados media la generación de lisofosfatidilcolina, que se ha propuesto como un lípido inflamatorio poderoso y se sabe que induce el reclutamiento e inflamación de leucocitos (Tan et al., 2009). Cuando se agrega lisoPC a un modelo in vitro de la barrera sangre-CNS (cerebro o retina), este agente es capaz de mediar en el aumento del transporte de sustancias tales como el Amarillo Lucifer, que normalmente no es permeable a través de tales cultivos in vitro y está completamente excluido el CNS en estudios in vivo (Sarker et al., 2000). Los estudios que utilizaron células endoteliales microvasculares de cerebro de rata cocultivadas con astrocitos de cerebro de rata para inducir una monocapa endotelial apretada demostraron que la adición de lisoPC a la superficie apical de la monocapa endotelial resultó en una reducción dependiente de la dosis en el transporte del Amarillo Lucifer (véase Figura 14 A). El aumento en el transporte de Amarillo Lucifer también se asoció con una reducción en las mediciones de resistencia eléctrica transendotelial (TEER) que son una indicación de la integridad de la unión estrecha de la monocapa celular (véase Figura 14B). También se ha observado la acción de la lisoPC en la mediación del aumento de la permeabilidad en las células endoteliales de la arteria coronaria humana, donde se ha demostrado que aumenta la permeabilidad de la monocapa y reduce la expresión de proteínas asociadas tanto a la unión estrecha como a la unión adherente (Yan et al., 2005). La acción de lisoPC también dio como resultado una generación significativa de superóxido en estos estudios y el tratamiento con un antioxidante dio como resultado una inhibición significativa de la permeabilidad de la monocapa estimulada por lisoPC (Yan et al., 2005). La acción del producto de la actividad de Lp-PLA2, a saber, lisoPC, en la regulación de la permeabilidad de la monocapa endotelial respalda además la idea de que la actividad de Lp-PLA2 en la vasculatura retiniana es en parte responsable del aumento de la permeabilidad vascular que se produce en el edema de mácula diabético. Por supuesto, la generación de lisoPC puede conducir posteriormente a la generación de ácido lisofosfatídico (LPA) a través de la acción de la enzima sérica lisofosfolipasa D (Umezu-Goto et al., 2002) que tiene una amplia gama de actividades farmacológicas tanto en la vasculatura como en leucocitos.

Ejemplo 4

Inhibidores de Lp-PLA2 en ratas Brown-Norway diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ)

La diabetes inducida por STZ es un modelo comúnmente utilizado de diabetes tipo 1 y las ratas BN STZ-diabéticas son una especie animal que se usa con mayor frecuencia como modelos preclínicos, ya que sus retinas exhiben la mayoría de las características patológicas de la retinopatía diabética de fondo observada en humanos, incluida la dilatación de los vasos sanguíneos, el engrosamiento de la membrana basal, la disfunción neuronal y glial y la degradación de iBRB. Este modelo de retinopatía diabética se ha utilizado ampliamente para evaluar la eficacia de los fármacos.

Métodos

Animales, inducción de diabetes y dosificación de fármacos

En este estudio se utilizaron ratas Brown Norway (BN), de 6 semanas de edad y con un peso de 180-200 g; las ratas tenían libre acceso a comida y agua y se mantuvieron en jaulas en una habitación con control ambiental con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. La diabetes se indujo siguiendo la dosificación de los animales con estreptozotocina (65 mg/kg/día dosificados i.p. para cada uno de los primeros 3 días del protocolo) en regulador de citrato de sodio 10 mM pH 4.6. El inhibidor de Lp-PLA2 '495 se solubilizó en 10 % de hidroxipropil-beta-ciclodextrina o DMSO: 1 % de metilcelulosa (1:99) y el inhibidor de Lp-PLA2 '859 en DMSO: 1 % de metilcelulosa (1:99) y se dosificó por inyección i.p. a 10 mg/kg/día desde el día 4 hasta el día 31 y desde el día 4 hasta el día 18 respectivamente. Los animales que mantuvieron un nivel elevado de glucosa en sangre de más de 9 mM se consideraron diabéticos.

Determinación de la permeabilidad vascular retiniana usando azul de Evans en ratas BN

Esta metodología se realizó de acuerdo con métodos previamente publicados (Xu et al., 2001) como se ha descrito previamente para ratas SD con la excepción de que la ED se determinó espectrofotométricamente.

Detección inmunohistoquímica de la fuga de inmunoglobulina G (IgG) de rata de los vasos sanguíneos de la retina como indicador de la integridad y permeabilidad de la barrera hemato-retiniana.

Los ojos fueron enucleados, hemiseccionados a lo largo de la ora serrata y eliminado el humor vítreo. Los oculares se fijaron por inmersión en paraformaldehído al 4 % (p/v) durante 30 min, se lavaron en PBS y se desprendieron las retinas. Se crioprotegieron las retinas fijadas, se embebieron en el compuesto Tissue-Tek OCT, se congelaron instantáneamente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, y se prepararon criosecciones de 12 gm. Las secciones se sometieron a inmunotinción con anticuerpos específicos para inmunoglobulina G (IgG) de rata con el fin de localizar cualquier IgG no vascular e isolectina B4 para determinar la ubicación de los vasos sanguíneos retinianos en las secciones retinianas y se observaron en un microscopio confocal. La fluorescencia se visualizó utilizando un sistema confocal Nikon TE-2000 C1 (Nikon Ltd, Kingston upon Thames, Reino Unido). En algunos casos, los vasos sanguíneos de la retina se resaltaron mediante tinción con yoduro de propidio.

Observaciones

Evaluación de la permeabilidad vascular retiniana por azul de Evans (determinación de albúmina)

En el estudio de 2 semanas, la hiperglucemia sostenida en el grupo tratado con estreptozotocina se puso de manifiesto mediante la monitorización regular de la glucosa en sangre durante todo el estudio y las determinaciones de HbA1c. La hiperglucemia sostenida dio como resultado un pequeño aumento de la fuga de albúmina en las retinas. Sin embargo, debido a la variabilidad inherente de este modelo, y la extensión generalmente pequeña del aumento inducido por la hiperglucemia en la fuga de EB, este aumento no fue estadísticamente significativo. El tratamiento con el inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg i.p. QD) redujo esta fuga a los niveles exhibidos por el grupo normoglucémico, pero nuevamente debido a la gran variabilidad, estos datos no fueron estadísticamente robustos (Figura 3, paneles superior e intermedio). Sin embargo, el tratamiento de ratas BN con inhibidor de Lp-PLA2 '495 i.p. QD durante 4 semanas después de la inducción de la diabetes mostró un efecto estadísticamente significativo del inhibidor de Lp-PLA2 '495 (10 mg/kg ip QD) en la restricción del aumento de la permeabilidad vascular secundaria a la hiperglucemia a la albúmina (p <0.04 versus animales tratados con vehículo diabético, Figura 15). La dosificación de 10 mg/kg i.p. QD en ratas BN produjo a través de Lp-PLA²niveles de inhibición del 89.7 % (estudio de 2 semanas) y 93.2 % (estudio de 4 semanas) en ratas hiperglucémicas que se compara favorablemente con la dosis de 160 mg del inhibidor de Lp-PLA2 '848 que produjo una inhibición del 88 % de la actividad de Lp-PLA²después de 12 semanas en la clínica (estudio LPL104884). Estas observaciones son consistentes con el efecto del inhibidor de Lp-PLA2 '495 en animales idénticos en los que la extravasación de albúmina en la retina determinada por inmunohistoquímica fue fácilmente observable.

Evaluación de la permeabilidad vascular retiniana por detección inmunológica

Se utilizaron retinas de animales que no se procesaron para azul de Evans para la detección de albúmina inmunohistoquímica. Los vasos sanguíneos de la retina dentro de las criosecciones se destacaron bien sea mediante tinción con yoduro de propriduim (PI) o tinción con isolectina B4 (IB4). La albúmina de rata se resalta usando un mAb anti-albúmina. En las retinas no diabéticas hay una fuerte colocalización de ambas marcas que muestra que la albúmina está contenida intravascularmente. Se pueden reconocer los vasos del plexo superficial (SP) y profundo (DP). Esto demuestra un funcionamiento normal de iBRB. En ratas diabéticas (31 días después del tratamiento con STZ) hay una localización de albúmina en el compartimento vascular y la neuropila, especialmente alrededor de las regiones adyacentes a las capas vasculares (flechas), lo que indica la descomposición del iBRB en proteínas de ~40 KDa de tamaño y, por lo tanto, la fuga de suero al retinae. Los animales diabéticos tratados con SB435495 muestran menos fugas y una extensa colocalización de albúmina con los vasos sanguíneos de la retina en comparación con los animales hiperglucémicos tratados únicamente con vehículo. Estos hallazgos son evidentes en secciones derivadas de animales en el estudio de 2 y 4 semanas. Hay una gran cantidad de albúmina en la coroides (como se esperaba) ya que se trata de un lecho vascular con fugas naturales (véanse Figuras 16 y 17) Estos experimentos demuestran claramente una capacidad de dosis de 10 mg/kg (Figura 17) y 20 mg/kg ip QD (Figura 16) de SB435495 para limitar el aumento de la permeabilidad vascular inducido por la hiperglucemia, como lo demuestra la extravasación de albúmina (proteína); sin embargo, los aumentos de la permeabilidad vascular en los vasos del CNS pueden asociarse específicamente con cambios en la regulación de la permeabilidad vascular a las moléculas o diferente tamaño.

En conjunto, los datos en conejos y ratas que muestran un aumento de la permeabilidad de la barrera hemato-retiniana inducida por una combinación de diabetes e hipercolesterolemia responden al tratamiento con inhibidores de Lp-PLA2 farmacológicamente activos demuestran que la intervención con tales inhibidores farmacológicos en enfermedades en las que un factor contribuyente importante en la progresión de la enfermedad es la ruptura de la barrera vascular del CNS, tal como el edema de la mácula diabética, será beneficioso. Los datos del cerebro del cerdo son consistentes con estos datos retinianos. Las consecuencias de la ruptura de la barrera sanguínea del CNS son a menudo tanto la isquemia como el edema, que en última instancia da como resultado tanto neurodegeneración como vasodegeneración del tejido afectado, lo que conduce a la muerte/pérdida celular. La neurodegeneración a menudo se manifiesta y se mide fácilmente como una disminución del grosor de la retina. Es notable que la inducción de diabetes en la rata tratada con STZ condujo a una reducción del grosor de la retina y esto se revirtió parcialmente mediante el tratamiento con los inhibidores farmacológicos de Lp-PLA2 divulgados. Los efectos de estos agentes sobre la permeabilidad y la protección de la retina, evaluados manteniendo el grosor de la retina, proporcionan un caso convincente para sugerir que estos compuestos serán beneficiosos para proteger la retina de los procesos vasodegenerativos que están en curso en pacientes con diabetes que padecen las consecuencias oculares de esta enfermedad. Los efectos farmacológicos significativos de un rango de inhibidores activos de Lp-PLA2 han mostrado efectos terapéuticamente beneficiosos en un rango de especies en los que la enfermedad se inició con hiperglucemia o hiperglucemia e hipercolesterolemia. Además de los efectos de los compuestos de Lp-PLA2 en estudios ilustrativos, existe una amplia evidencia de que el producto de la actividad de Lp-PLA2 es un lípido altamente inflamatorio que probablemente sea responsable de mediar los efectos de la permeabilidad vascular y los efectos inflamatorios asociados con estas enfermedades humanas que son secundarios a hipoglucemia e hiperlipidemia.

En algunas realizaciones, la dosificación óptima de agentes que inhiben Lp-PLA²es uno que reduce la actividad y/o expresión de Lp-PLA², por ejemplo, expresión reducida de ácido nucleico, por ejemplo, ARNm codificado por el gen de Lp-PLA²o expresión o actividad reducida de la proteína Lp-PLA². En otras realizaciones, la dosificación óptima de agentes que inhiben Lp-PLA²es uno que genera el máximo efecto protector en el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno ocular que incluye, por ejemplo, pero sin limitarse a, edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgico, tracción y similares; AMD; uveítis; enfermedades y trastornos oculares diabéticos; retinopatía diabética y similares; o reducir un síntoma de tal enfermedad o trastorno ocular.

En algunas realizaciones, la población de pacientes a tratar son pacientes adultos con DME con participación del centro.

En otra realización, la población de pacientes tiene diabetes mellitus (tipo 1 o tipo 2).

En una realización, la confirmación de DME se realiza utilizando angiografía con fluoresceína.

En una realización, el engrosamiento de la retina (DME) que implica el centro de la fóvea se determina mediante un espesor del subcampo central SD-OCT >330 micrómetros para Heidelberg Spectralis y >310 para Zeiss Cirrus.

En algunas realizaciones, la dosificación se realiza mediante inyección intravítrea.

En algunas realizaciones, la dosificación se realiza por vía oral. Una dosificación particularmente eficaz es una dosis diaria oral máxima que no exceda los 160 mg. De forma adecuada, la dosificación eficaz se formula como una formulación de tableta de base libre micronizada con recubrimiento entérico, del inhibidor de Lp-PLA2. Una dosificación más particularmente eficaz es una dosis diaria oral máxima que no debe exceder los 160 mg de formulación de tableta de base libre micronizada con recubrimiento entérico, de Darapladib.

En algunas realizaciones, la agudeza visual mejor corregida (BCVA) y el grosor de la retina, especialmente en comparación con la línea de base antes del tratamiento para DME, son los indicadores de eficacia del tratamiento con los inhibidores de Lp-PLA2 divulgados en este documento.

En algunas realizaciones, la dosificación se producirá durante un período de tiempo, antes de que se realicen los efectos del tratamiento. En una realización particular, el tratamiento es una dosis oral diaria de una composición farmacéutica que contiene un inhibidor de Lp-PLA2, recomendada durante 30 días. En otra realización, el tratamiento es una dosis oral diaria de una composición farmacéutica que contiene un inhibidor de Lp-PLA2, recomendada durante 60 días. En aún otra realización, el tratamiento es una dosis oral diaria de una composición farmacéutica que contiene un inhibidor de Lp-PLA2, recomendada durante 90 días.

En una realización, para determinar la eficacia de la administración de un inhibidor de Lp-PLA2 en sujetos con DME implicado en el centro, se toman mediciones en la BCVA. En otra realización, para determinar la eficacia de la administración de un inhibidor de Lp-PLA2 en sujetos con DME implicado en el centro, el análisis se realiza utilizando el subcampo central del ojo OCT de dominio espectral (formación de imágenes SD-OCT).

En otra realización, los cambios en la anatomía de la retina evaluados por una o más angiografía con fluoresceína (área de fuga), fotografía del fondo de ojo (área de engrosamiento de la retina) y SD-OCT (volumen macular, líquido subretiniano, quistes intrarretinianos) del ojo, se utilizan para determinar la eficacia del tratamiento.

En algunas realizaciones, con el fin de evaluar la eficacia del tratamiento, un sujeto no tendría una o más de las siguientes enfermedades o trastornos oculares adicionales. Incluyendo cataratas, glaucoma, neuropatía óptica isquémica, retinitis pigmentosa, retinopatía diabética, maculopatía isquémica, neovascularización coroidea, cirugía intraocular.

Formulaciones de composiciones

Los compuestos, es decir, agentes inhibidores de Lp-PLA²como se describe en el presente documento, puede usarse como un medicamento o usarse para formular una composición farmacéutica con una o más de las utilidades divulgadas en el presente documento. Se pueden administrar in vitro a células en cultivo, in vivo a células en el cuerpo o ex vivo a células fuera de un individuo que luego se pueden devolver al cuerpo del mismo individuo u otro. Tales células pueden desagregarse o proporcionarse como tejido sólido.

Los compuestos, es decir, agentes que inhiben Lp-PLA²como se divulga en el presente documento se puede usar para producir un medicamento u otras composiciones farmacéuticas. Se conoce en la técnica el uso de agentes inhibidores de Lp-PLA²que además comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y composiciones que además comprenden componentes útiles para administrar la composición a un individuo. La adición de tales vehículos y otros componentes a los agentes divulgados en este documento está dentro del nivel de experiencia en esta técnica.

En algunas realizaciones, las composiciones se pueden administrar como una formulación adaptada para la administración sistémica. En algunas realizaciones, las composiciones se pueden administrar como una formulación adaptada para la administración a órganos específicos, por ejemplo, pero sin limitarse al hígado, médula ósea o administración sistémica.

Alternativamente, se pueden añadir composiciones farmacéuticas al medio de cultivo de células ex vivo. Además del compuesto activo, tales composiciones pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes conocidos por facilitar la administración y/o mejorar la absorción (por ejemplo, solución salina, dimetilsulfóxido, lípidos, polímeros, sistemas de direccionamiento específicos de células basados en afinidad). La composición puede incorporarse en un gel, esponja u otra matriz permeable (por ejemplo, formada como pellas o un disco) y colocarse cerca del endotelio para una liberación local sostenida. La composición se puede administrar en una sola dosis o en múltiples dosis que se administran en diferentes momentos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier vía conocida. A modo de ejemplo, la composición puede administrarse por vía mucosa, pulmonar, oral, tópica u otra vía localizada o sistémica (por ejemplo, enteral y parenteral). Las expresiones "administración parenteral" y "administrada por vía parenteral" como se usan en este documento significan modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e intraesternal, infusión y otras técnicas de inyección o infusión, sin limitación. Las expresiones "administración sistémica", "administrada sistémicamente", "administración periférica" y "administrada periféricamente" como se usan en el presente documento significan la administración de los agentes como se describe en el presente documento de tal manera que ingrese al sistema del animal y, por lo tanto, esté sujeto al metabolismo y a otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se emplea en este documento para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, están dentro del alcance del buen juicio médico, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" como se usa en este documento significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un relleno, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante líquido o sólido, involucrado en llevar o trasnportar los agentes en cuestión desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano o porción del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación, por ejemplo, el vehículo no disminuye el impacto del agente en el tratamiento. En otras palabras, un vehículo es farmacéuticamente inerte.

Se pueden hacer selecciones adecuadas en las cantidades y el momento de las dosis, la formulación y las vías de administración con el objetivo de lograr una respuesta favorable en el sujeto con enfermedades oculares diabéticas o un riesgo de las mismas (es decir, eficacia) y evitar la toxicidad indebida u otros daños al mismo (es decir, seguridad). Por lo tanto, "eficaz" se refiere a tales selecciones que implican la manipulación rutinaria de las condiciones para lograr un efecto deseado.

[503] Un bolo de la formulación administrado a un individuo durante un período corto una vez al día es un programa de dosificación conveniente. Alternativamente, la dosis diaria eficaz se puede dividir en múltiples dosis con fines de administración, por ejemplo, de dos a doce dosis por día. Los niveles de dosificación de los ingredientes activos en una composición farmacéutica también se pueden variar para lograr una concentración transitoria o sostenida del compuesto o derivado del mismo en un individuo y dar como resultado la respuesta o protección terapéutica deseada. Pero también está dentro de la experiencia de la técnica comenzar con dosis a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta lograr el efecto deseado.

La cantidad de agentes que inhiben Lp-PLA²administrado depende de factores conocidos por un experto en la técnica tales como bioactividad y biodisponibilidad del compuesto (por ejemplo, vida media en el cuerpo, estabilidad y metabolismo); propiedades químicas del compuesto (por ejemplo, peso molecular, hidrofobicidad y solubilidad); ruta y programación de la administración, y similares. También se entenderá que el nivel de dosis específico a alcanzar para cualquier individuo particular puede depender de una variedad de factores, que incluyen edad, género, salud, historial médico, peso, combinación con uno o más de otros fármacos y gravedad de la enfermedad.

El término "tratamiento", con respecto al tratamiento de enfermedades oculares, se refiere, entre otras cosas, a prevenir el desarrollo de la enfermedad o alterar el curso de la enfermedad (por ejemplo, pero no limitado a, ralentizar la progresión de la enfermedad), o revertir un síntoma de la enfermedad o reducir uno o más síntomas y/o uno o más marcadores bioquímicos en un sujeto, prevenir que uno o más síntomas empeoren o progresen, promover la recuperación o mejorar el pronóstico y/o prevenir la enfermedad en un sujeto que está libre de enfermedades existentes, así como ralentizar o reducir la progresión de la enfermedad existente. Para un sujeto dado, la mejoría de un síntoma, su empeoramiento, regresión o progresión pueden determinarse mediante una medición objetiva o subjetiva.

Los métodos profilácticos (por ejemplo, prevenir o reducir la incidencia de recaídas) también se consideran tratamientos.

En algunas realizaciones, el tratamiento también puede implicar la combinación con otros modos de tratamiento existentes, por ejemplo, agentes existentes para el tratamiento de enfermedades oculares, tales como terapias anti-VEGF, por ejemplo, Lucentis®, Avastin® y Aflibercept® y esteroides, por ejemplo, triamcinolona, e implantes de esteroides que contienen acetónido de fluocinolona.

En algunas realizaciones, los agentes que inhiben Lp-PLA²como se divulga en el presente documento se puede combinar con otro agente, por ejemplo, un agente terapéutico para prevenir y/o tratar enfermedades neurodegenerativas. Tales agentes pueden ser cualquier agente actualmente en uso o que está en desarrollo para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno neurodegenerativo, donde el agente puede tener un efecto profiláctico y/o curativo y/o reducir un síntoma de un trastorno o enfermedad ocular.

Por lo tanto, se puede practicar el tratamiento combinado con uno o más agentes que inhiben Lp-PLA²con uno o más de otros procedimientos médicos.

Además, el tratamiento también puede comprender múltiples agentes para inhibir la expresión o actividad de Lp-PLA².

La cantidad que se administra a un sujeto es preferiblemente una cantidad que no induce efectos tóxicos que superen las ventajas que resultan de su administración. Objetivos adicionales son reducir el número, disminuir la gravedad y/o aliviar el sufrimiento de los síntomas de la enfermedad en el individuo en comparación con los estándares de atención reconocidos.

La producción de compuestos de acuerdo con las regulaciones actuales será regulada por las buenas prácticas de laboratorio (GLP) y las buenas prácticas de fabricación (GMP) por agencias gubernamentales (por ejemplo, la U.S. Food and Drug Administration). Esto requiere un mantenimiento de registros preciso y completo, así como una monitorización de QA/QC. También se prevé la supervisión de los protocolos de los pacientes por parte de agencias y paneles institucionales para garantizar que se obtenga el consentimiento informado; se estudian en fases la seguridad, la bioactividad, la dosificación apropiada y la eficacia de los productos; los resultados son estadísticamente significativos; y se siguen las pautas éticas. Se requiere una supervisión similar de los protocolos que utilizan modelos animales, así como el uso de productos químicos tóxicos y el cumplimiento de las regulaciones.

Pueden variar las dosificaciones, formulaciones, volúmenes de dosificación, regímenes y métodos para analizar resultados destinados a inhibir la expresión y/o la actividad de Lp-PLA². Por lo tanto, las dosificaciones efectivas mínima y máxima varían dependiendo del método de administración. La supresión de los cambios clínicos e histológicos asociados con las enfermedades oculares puede ocurrir dentro de un rango de dosificación específico, que, sin embargo, varía dependiendo del organismo que recibe la dosificación, la vía de administración, si los agentes que inhiben Lp-PLA²se administran junto con otras moléculas coestimuladoras y el régimen específico del inhibidor de la administración de Lp-PLA². Por ejemplo, en general, la administración nasal requiere una dosificación menor que la administración oral, enteral, rectal o vaginal.

Para formulaciones orales o enterales para su uso con la presente invención, las tabletas pueden formularse de acuerdo con procedimientos convencionales que emplean vehículos sólidos bien conocidos en la técnica. Las cápsulas empleadas para formulaciones orales que se utilizarán con los métodos de la presente invención pueden prepararse a partir de cualquier material farmacéuticamente aceptable, tales como gelatina o derivados de celulosa. También se contemplan sistemas de administración oral de liberación sostenida y/o recubrimientos entéricos para formas de dosificación administradas por vía oral, tales como los descritos en la patente U.S. No. 4,704,295, "Enteric Film-Coating Compositions", concedida el 3 de noviembre de 1987; patente U.S. No. 4, 556,552, "Enteric Film-Coating Compositions", concedida el 3 de diciembre de 1985; patente U.S.No. 4,309,404, "Sustained Release Pharmaceutical Compositions", concedida el 5 de enero de 1982; y patente U.S. No. 4,309,406, "Sustained Release Pharmaceutical Compositions", concedida el 5 de enero de 1982.

Una dosificación particularmente eficaz para uso en la presente invención es la formulación de tableta de base libre micronizada de recubrimiento entérico de 160 mg del inhibidor de Lp-PLA2. Una dosificación más particularmente eficaz es la formulación de tableta de base libre micronizada de recubrimiento entérico de 160 mg de Darapladib.

Ejemplos de vehículos sólidos incluyen almidón, azúcar, bentonita, sílica y otros vehículos de uso común. Ejemplos no limitantes adicionales de vehículos y diluyentes que se pueden usar en las formulaciones de la presente invención incluyen solución salina, jarabe, dextrosa y agua.

Formulación con recubrimiento entérico

En cuanto a las formulaciones para la administración de pequeñas entidades químicas para inhibidores de Lp-PLA²de fórmulas similares a las de las fórmulas (I)--(IV) como se divulga en este documento, una realización particularmente útil es una formulación de tableta que comprende el inhibidor de Lp-PLA con una cubierta de polímero entérico. Un ejemplo de tal preparación se puede encontrar en el documento WO2005/021002. El material activo en el núcleo puede estar presente en forma micronizada o solubilizada. Además de los materiales activos, el núcleo puede contener aditivos convencionales en la técnica de tabletas comprimidas. Los aditivos apropiados en tal tableta pueden comprender diluyentes tales como lactosa anhidra, lactosa monohidrato, carbonato de calcio, carbonato de magnesio, fosfato dicálcico o mezclas de los mismos; aglutinantes tales como celulosa microcristalina, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, almidón pregelatinizado o goma arábiga o mezclas de los mismos; disgregantes tales como celulosa microcristalina (que cumple funciones tanto aglutinantes como desintegrantes) polivinilpirrolidona entrecruzada, glicolato de almidón de sodio, croscarmelosa de sodio o mezclas de los mismos; lubricantes, tales como estearato de magnesio o ácido esteárico, deslizantes o coadyuvantes de flujo, tales como sílica coloidal, talco o almidón, y estabilizadores tales como sílica amorfa desecante, agentes colorantes, sabores, etc. De manera adecuada, la tableta comprende lactosa como diluyente. Cuando está presente un aglutinante, es convenientemente hidroxipropilmetilcelulosa. De forma adecuada, la tableta comprende estearato de magnesio como lubricante. De forma adecuada, la tableta comprende croscarmelosa sódica como desintegrante. De forma adecuada, la tableta comprende celulosa microcristalina.

El diluyente puede estar presente en un rango del 10 al 80 % en peso del núcleo. El lubricante puede estar presente en un rango de 0.25 a 2 % en peso del núcleo. El desintegrante puede estar presente en un rango del 1 al 10 % en peso del núcleo. La celulosa microcristalina, si está presente, puede estar presente en un rango del 10 al 80 % en peso del núcleo.

El ingrediente activo comprende de manera adecuada entre el 10 y el 50 % del peso del núcleo, más de manera adecuada entre el 15 y el 35 % del peso del núcleo (calculado como equivalente de base libre). El núcleo puede contener cualquier nivel de dosificación terapéuticamente adecuado del ingrediente activo, pero de manera adecuada contiene hasta 150 mg como base libre del ingrediente activo. De forma particularmente adecuada, el núcleo contiene 20, 30, 40, 50, 60, 80 o 100 mg como base libre del ingrediente activo. El ingrediente activo puede estar presente como base libre o como cualquier sal farmacéuticamente aceptable. Si el ingrediente activo está presente como una sal, el peso se ajusta de tal manera que la tableta contenga la cantidad deseada de ingrediente activo, calculada como base libre de la sal.

El núcleo se puede fabricar a partir de una mezcla compactada de sus componentes. Los componentes pueden comprimirse directamente o granularse antes de la compresión. Tales gránulos pueden formarse mediante un proceso de granulación convencional como se conoce en la técnica. En una realización alternativa, los gránulos pueden recubrirse individualmente con una cubierta entérica y luego encerrarse en una cubierta de cápsula estándar.

El núcleo está rodeado por una cubierta que comprende un polímero entérico. Ejemplos de polímeros entéricos son acetato ftalato de celulosa, acetato succinato de celulosa, ftalato de metilcelulosa, ftalato de etilhidroxicelulosa, ftalato de polivinilacetato, acetato de polivinilbutirato, copolímero de acetato de vinilo-anhídrido maleico, copolímero de estireno-monoéster maleico, copolímero de acrilato de metilo- ácido metacrílico, o copolímero de metacrilato-ácido metacrílico-acrilato de octilo. Estos se pueden usar solos o en combinación, o junto con otros polímeros distintos de los mencionados anteriormente. La cubierta también puede incluir sustancias insolubles que no se descomponen ni solubilizan en cuerpos vivos, tales como derivados de alquilcelulosa tales como etilcelulosa, polímeros entrecruzados tales como copolímero de estireno-divinilbenceno, polisacáridos que tienen grupos hidroxilo tales como dextrano, derivados de celulosa que se tratan con agnetes de entrecruzamiento bifuncional tales como epiclorhidrina, diclorhidrina o 1, 2-, 3, 4-diepoxibutano. La cubierta también puede incluir almidón y/o dextrina.

Los materiales de recubrimiento entérico adecuados son los polímeros entéricos de Eudragit disponibles comercialmente tales como Eudragit L, Eudragit S y Eudragit NE usados solos o con un plastificante. Tales recubrimientos se aplican normalmente usando un medio líquido y la naturaleza del plastificante depende de si el medio es acuoso o no acuoso. Los plastificantes para uso con medio acuoso incluyen propilenglicol, citrato de trietilo, citrato de acetiltrietilo o Citroflex o Citroflex A2. Los plastificantes no acuosos incluyen estos, y también ftalato de dietilo y dibutilo y sebacato de dibutilo. Un plastificante adecuado es el citrato de trietilo. La cantidad de plastificante incluida será evidente para los expertos en la técnica.

La cubierta también puede incluir un agente anti-pegajosidad tal como talco, sílica o monoestearato de glicerilo. De forma adecuada, el agente anti-pegajosidad es monoestearato de glicerilo. Típicamente, la cubierta puede incluir alrededor del 5 - 25 % en peso de plastificante y hasta alrededor del 50 % en peso de agente anti-pegajosidad, de manera adecuada 1-10 % en peso de agente anti-pegajosidad.

Si se desea, se puede incluir un tensioactivo para ayudar a formar una suspensión acuosa del polímero. El experto en la técnica conoce muchos ejemplos de posibles tensioactivos. Ejemplos adecuados de tensioactivos son polisorbato 80, polisorbato 20 o lauril sulfato de sodio. Si está presente, un tensioactivo puede formar 0.1 - 10 % de la cubierta, de manera adecuada 0.2 - 5 % y particularmente de manera adecuada 0.5 - 2 %

En una realización, se incluye una capa de sellado entre el núcleo y el recubrimiento entérica. Una capa de sellado es un material de recubrimiento que se puede usar para proteger la cubierta entérica de un posible ataque químico de cualquier ingrediente alcalino en el núcleo. La capa de sellado también puede proporcionar una superficie más lisa, lo que permite una fijación más fácil de la cubierta entérica. Una persona experta en la técnica conocerá los recubrimientos adecuados. De manera adecuada, la capa de sellado está hecha de un recubrimiento Opadry, y de manera particularmente adecuada es Opadry White OY-S-28876.

El tratamiento del edema macular de cualquier causa, por ejemplo, debido a RVO, inflamación, posquirúrgico, tracción y similares; AMD; uveítis; con inhibidores de LpPLA2 como se describe en las reivindicaciones adjuntas, también se puede administrar localmente, como un colirio tópico, una inyección periocular (por ejemplo, sub-espiga) o mediante inyección intravítrea. La liberación sostenida del fármaco también se puede lograr mediante el uso de tecnologías tales como implantes sólidos (que pueden o no ser biodegradables) o matrices poliméricas biodegradables (por ejemplo, micropartículas). Estos pueden administrarse por vía periocular o intravítrea.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto seleccionado de:

N-[2-(dietilamino)etil]-2-[[(4-fluorofenil)metil]tio]-4,5,6,7-tetrahidro-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1'-bifenil]-4-il]metil]-1 H-ciclopentapirimidin-1-acetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

bitartrato de N-[2-(dietilamino)etil]-2-{2-[2-(2,3-difluorofenil)etil]-4-oxo-4,5,6,7-tetrahidro-1 Hciclopenta[d]pirimidin-1 -il}-N-{[4’-(trifluorometil)-4-bifenilil]metil} acetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

2-[[(2,3-difluorofenil)metil]tio]-N-[1-(2-metoxietil)-4-piperidinil]-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1'-bifenil]-4-il]metil]-1 (4H)-quinolinacetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y

N-[2-(dimetilamino)etil]-2-[[(4-fluorofenil)metil]tio]-5-(1-metil-1 H-pirazol-4-il)metil]-4-oxo-N-[[4’-(trifluorometil)[1,1'-bifenil]-4-il]metil]-1 (4H)-pirimidinacetamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

para uso en el tratamiento y/o prevención del edema macular en un sujeto.

2. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto seleccionado de:

para uso en el tratamiento y/o prevención del edema macular en un sujeto.

3. El compuesto para uso de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 2, en el que el edema macular está asociado con una enfermedad o trastorno del ojo diabético, o el edema macular está asociado con oclusión, inflamación, posquirúrgico, tracción, o uveítis de la vena retiniana.

4. El compuesto para uso o composición farmacéutica para uso de la reivindicación 3, en el que el edema macular es edema macular quístico.