KR20220152549A - 약제로서 유용한 적어도 하나의 카복시기, 설포기 또는 아미도기를 갖는 2,5- 또는 2,6-이치환된 하이드로퀴논 유도체 - Google Patents

약제로서 유용한 적어도 하나의 카복시기, 설포기 또는 아미도기를 갖는 2,5- 또는 2,6-이치환된 하이드로퀴논 유도체 Download PDF

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자크스 바우어
올리비어 마틴
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옴 파르마 에스아
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Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 신규한 하이드로퀴논 유도체, 이의 제조 공정, 및 예컨대 자가면역, 면역학적, 류마티스성, 혈관 장애, 안과학적 장애, 섬유성 장애, 대사 및 위장 장애, 신경염증성 및 신경퇴행성 질환, 신생물 및 암 관련 장애, 호르몬 관련 질환 및 바이러스 및 박테리아 감염 질환 및 이들의 합병증으로부터 야기되는 면역학적 장애를 치료 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물 및 방법을 제공한다.
Figure pct00332

상기 식에서 R1은 COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H 또는 CONH-R10이고; R2 및 R3 중 하나는 H이고 다른 하나는 R5이다.

Description

약제로서 유용한 적어도 하나의 카복시기, 설포기 또는 아미도기를 갖는 2,5- 또는 2,6-이치환된 하이드로퀴논 유도체
본 발명은 일반적으로 신규한 하이드로퀴논 유도체, 이의 제제 및 이를 필요로 하는 온혈 동물에 이러한 화합물을 투여하여 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 자가면역, 면역학적, 류마티스성, 혈관 장애, 안과학적 장애, 섬유성 장애, 대사 및 위장 장애, 신경염증성 및 신경퇴행성 질환, 신생물 및 암 관련 장애, 호르몬 관련 질환 및 바이러스 및 박테리아 감염으로 인한 면역학적 장애, 및 이들의 합병증의 예방 및/또는 치료에 유용한 화합물에 관한 것이다.
일부 하이드로퀴논-기반 유도체 예컨대, 2,5-디히드록시벤젠설폰산 유도체 및 특히 칼슘 도베실레이트(calcium dobesilate), 에탐실레이트(ethamsylate) 및 퍼실레이트(persilate)는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여, 남성 성기능 장애 및 내피 기원의 기타 혈관 장애의 치료를 위한 활성제로 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 미국특허 제6,147,112호는 2,5-디히드록시벤젠설폰산 유도체, 바람직하게는 칼슘 도베실레이트, 에탐실레이트 및 퍼실레이트의 사용 방법이 기술되어 있다. 2,5-디히드록시벤젠설폰산 칼슘 염이라는 화학 명칭을 갖는, 칼슘 도베실레이트 또는 하이드로퀴논 칼슘 설포네이트는 Dexium(Delalande) 및 Doxium(Carrion)으로 판매되고 있으며, 이의 제조 공정이 미국특허 제3,509,207호에 기술되어 있다.
페놀 또는 카테콜기를 함유하는 약물은 경구 투여 후 흡수되는 동안 히드록시기에서 조기 대사를 일으키는 약물이 많이 있다. 히드록시기를 보호하려는 이전의 노력은 사용된 보호기가 너무 불안정하거나(O=COR 또는 O=CR) 너무 안정하여(CH3) 일반적으로 성공적이지 못하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 신규한 하이드로퀴논의 유도체, 이의 약학적으로 허용되는 염 및 제형을 제공하는 것이다. 이러한 신규한 하이드로퀴논 유도체는 특히 강력한 항-섬유성, 항-염증성 및 항-신생혈관 특성을 갖는다.
국제공개 WO2018160618A1호는 신흥 기술, 예컨대 매개된 연료 전지 또는 유기-매개체 유동 배터리에서 산화환원 매개체로서 사용하기 위한 특정한 치환된 하이드로퀴논, 1,4-퀴논, 카테콜, 1,2-퀴논, 안트라퀴논, 및 안트라하이드로퀴논을 개시한다.
문헌[Richter et al, in Synthesis, 1976, 1976(3), 192-194]은 비스-N-아릴카바메이트 및 2,5-디히드록시-3,6-비스[N-아릴카복사미도]-1,4-벤조퀴논과 2,5-디히드록시-1,4-벤조퀴논 및 아릴 이소시아네이트로부터의 이의 제조를 개시한다.
일본 특허 공개 JP 51026839A호는 항결핵(antitubercular), 진통(analgesic), 항-염증성, 및 요산-배설(uric acid-excreting) 활성을 갖는 벤자닐리드 I(Benzanilide I)을 개시한다:
Figure pct00001
벤자닐리드 I.
미국 등록 특허 US 3,973,038호는 또한 다음의 일반식을 갖는 벤조일아닐린 화합물을 개시한다:
Figure pct00002
.
상기 식에서(R1 = OH, 아실옥시; R2 = H, OH, 저급 알킬, 할로, 아실옥시; R3 = Cl, Br, 저급 알킬; R4 = OH, NH2, 저급 알콕시, 아실옥시; R5 = H, 할로, CO2H, 저급 알킬, 아실옥시) 생체 내 효소 억제 특성, 특히, 히스타민 디아세틸라제 및 잔틴 옥시다제를 갖는다.
그러나 선행 기술 문서에는 자가면역, 면역학적, 류마티스성, 혈관 장애, 안과학적 장애, 섬유성 장애, 대사 및 위장 장애, 신경염증성 및 신경퇴행성 질환, 신생물 및 암 관련 장애, 호르몬 관련 질환 및 바이러스 및 박테리아 감염 질환으로 인한 면역학적 장애, 및 이들의 합병증을 비롯하여 다양한 질병의 예방 및/또는 치료에 특히 유용한, 본 발명의 하이드로퀴논 유도체 화합물의 신규 부류가 개시되어 있지 않다.
본 발명은 또한 대사성 장애, 예컨대 당뇨병 및 비만의 치료, 예방, 및 감소에 관한 것이다. 식후 혈당 수치가 상승함에 따라, 인슐린이 분비되어 말초 조직(골격근 및 지방)의 세포가 에너지원으로서 혈액으로부터 글루코스를 능동적으로 흡수하도록 자극한다. 잘못된 인슐린 분비 또는 작용 결과로 인한 글루코스 항상성의 손실은 전형적으로 대사성 장애 예컨대 당뇨병을 초래하며, 이는 비만에 의해 공동-유발되거나 더욱 악화될 수 있다. 이러한 상태는 종종 치명적이기 때문에, 혈류에서 적절한 글루코스 제거를 회복하기 위한 전략이 필요하다. 대사성 장애, 특히 글루코스 및 지질 조절 장애는 산업화된 국가의 인구가 고령화되고 좌식 생활 방식이 보편화됨에 따라 점점 더 널리 퍼지고 있다. 이러한 장애는 종종 상호연관되어 있으며 종종 서로의 예측인자 또는 결과이다.
예를 들어, 당뇨병은 인슐린 저항성과 췌장-β 세포에 의한 인슐린 분비 장애의 조합으로 인해 발생한다. 인슐린 저항성이 있는 개인은 종종 복부 비만, 이상지질혈증, 고혈압, 글루코스 불내성(glucose intolerance) 및 혈전형성(prothrombitic) 상태(대사 증후군)를 갖는다. 이에 따라, 비만인 개인은 전체적으로 인슐린 저항성이 생길 위험이 더 높다. 따라서 대사 경로의 붕괴는 무수한 장애 예컨대 고지혈증, 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 글루코스 불내성, 고혈당증,　대사 증후군 및 고혈압을 유발할 수 있으며, 이는 차례로 추가 대사 기능장애를 유발하여 전신 문제를 야기하고 개인을 추가 합병증 및 조기 이환의 위험에 빠뜨릴 수 있다. 글루코스 및 지질 수준은 글루코스, 단백질 및 지질을 합성, 저장, 분비, 변형 및 분해하는 역할을 하는 간에서 부분적으로 조절된다. 질병이나 외상성 손상은 이러한 정상적인 활동을 수행하는 간의 능력을 크게 감소시킬 수 있다. 따라서, 간 기능장애의 임상 증상의 대부분은 세포 손상과 정상적인 간 기능 손상에서 비롯된다. 간 기능장애는 유전적 상태, 염증성 장애, 약물 및 알코올과 같은 독소, 면역학적 장애, 혈관 장애 또는 대사 상태로 인해 발생할 수 있다. 원인에 관계없이, 간 손상은 대사 과정의 기능과 혈당 및 혈청 지질 수준의 조절에 전신적 영향을 미쳐 만성 질환 상태를 악화시키고 추가 질병 및 병태의 위험을 증가시킬 수 있다. 혈당 수치의 상승 및 감소 둘 모두는 글루코스 항상성을 회복하도록 설계된 호르몬 반응을 유발한다. 저혈당은 췌장 a-세포에서 글루카곤의 방출을 유발한다. 고혈당은 췌장 b-세포에서 인슐린 방출을 유발한다. 뇌하수체에서 분비되는 ACTH와 성장호르몬은 간 외 조직에 의한 흡수를 억제하여 혈당을 높이는 작용을 한다. 글루코코르티코이드는 또한 글루코스 흡수를 억제하여 혈당 수치를 높이는 작용을 한다. 부신 피질에서 분비되는 주요 글루코코르티코이드인 코르티솔은 순환 ACTH의 증가에 대한 반응으로 분비된다. 부신 수질 호르몬인 에피네프린은 스트레스 자극에 반응하여 글리코겐 분해를 활성화하여 글루코스 생성을 자극한다. 글루코스 및 지질 대사에 영향을 미치는 대사성 질환 예컨대 고지혈증, 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 고혈당증, 글루코스 불내성,　대사 증후군 및 고혈압은 심혈관 질환 및 조기 병태를 비롯한 만성 질환으로 이어지는 장기적인 건강상 결과를 가져온다. 이러한 대사 및 심혈관 장애는 상호 연관되거나, 악화되거나, 서로를 촉발하고 중단하기 어려운 피드백 기작을 생성할 수 있다. 대사 및 심혈관 장애에 대한 현재의 약물 치료는 지질-저하제, 혈당강하제, 항고혈압제, 식이요법 및 운동의 조합을 포함한다. 그러나, 복잡한 치료 요법은 부작용 증가, 약물 간 상호 작용, 순응도 실패, 및 약물 오류 증가와 같은 다약제(polypharmacy) 문제를 일으킬 수 있다. 따라서 대사성 장애 및 심혈관 장애 및 대사성 장애와 관련된 상태를 안전하고 효과적으로 치료하기 위한 신규 화합물, 제형, 및 방법을 확인하기 위한 당업계에 충족되지 않은 강력한 요구가 존재한다.
대사성 상태의 예는 비제한적으로 통증, 상처 치유, 발열, 신경염증성 및 신경퇴행성 상태, 염증, 열 생성, 항온, 트리글리세리드 분해, 당 분해, 크렙스 주기(Krebs cycle), 발효, 광합성,　대사율(metabolic　rate), 생물학적 및 비생물학적 스트레스, 분비물, 산화 스트레스, 스트레스,　신생물 성장, 피부 상태, 심혈관 상태, 신경염증성 및 신경퇴행성 상태, 정신 및 행동장애를 포함한다. 이러한 과정 또는 상태는 세포, 세포 군, 또는 전체 유기체에서 발생할 수 있다.
최근 분자 의학의 발전으로 신생물성 질환의 진단 및 치료가 어느 정도 개선되었다. 이러한 부분적인 성공에도 불구하고, 이러한 병리는 여전히 상당한 도전 과제로 남아 있다. 특정 유형의 암의 경우, 현재 치료법이 몇 가지 이유로 실패하는 경우가 있다. 한편으로, 이는 종양 세포의 고유한 내성, 지속적인 돌연변이 및 치료 회피 능력이며, 다른 한편으로는 종양 환경의 이질성이기도 하다. 동일한 유형의 종양이 소위 "개인" 요법의 필요성을 나타내는 게놈 프로파일의 관점에서 개별 대상체 마다 크게 다른 것으로 나타났다. 더 큰 문제는 최근 신장 종양에 대해 밝혀진 바와 같이 동일한 종양에서 돌연변이의 이질성이며, 이러한 상황은 다른 유형의 종양에서도 예상될 수 있다. 이러한 이유로, 종양의 모든 또는 대부분의 악성 세포에 공통적이고 바람직하게는 암세포의 필수 기능에 영향을 미치는 불변 개입 지점 및 새로운 접근법을 찾는 것이 필요하다. 그러한 개입 지점은 대사 수준, 예를 들어 세포의 모든 생리학적 및 병태생리학적 과정에 필요한 에너지 생성에 필수적인 세포 소기관인 미토콘드리아에 있을 수 있는 것으로 보인다. 종양 세포는 에너지 생성을 위해 소위 호기성 당 분해라고 하는 주요 부분을 사용하지만, 미토콘드리아 호흡(즉, ATP 형성과 관련된 산소 소비)은 대부분의(전부는 아니지만) 유형의 종양에 내재되어 있다. 따라서, 이러한 신생물 장애를 안전하고 효과적으로 치료하기 위한 새로운 화합물, 제형, 및 방법을 확인하기 위한 당업계에 충족되지 않은 강력한 요구가 존재한다.
본 발명은 신규한 하이드로퀴논 유도체, 신규한 제조 공정, 및 신규한 주요 중간체를 제공한다. 본 발명은 또한 치료 유효량의 이러한 하이드로퀴논 유도체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 이들이 항-섬유성, 항-염증성 및 항-신생혈관 효과를 가짐에 따라, 혈관신생(혈관), 염증성 및/또는 섬유성 병리생물학을 치료 및/또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 따라서 본 발명은 최종적으로 치료 유효 용량의 상기된 바와 같은 본 발명의 화합물 및/또는 약학 조성물을 이를 필요로하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 면역학적/류마티스성/혈관 장애, 안과학적 장애, 섬유성 장애, 대사성 & 위장관 장애, 신생물 및 암 관련 장애를 비롯한 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 질환 또는 장애 자가면역, 면역학적, 류마티스성, 혈관 장애, 안과학적 장애, 섬유성 장애, 대사 및 위장 장애, 신경염증성 및 신경퇴행성 질환, 신생물 및 암 관련 장애, 호르몬 관련 질환 및 바이러스 및 박테리아 감염 질환 및 이들의 합병증으로부터 야기되는 면역학적 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
도 1: (a) 각 실험군의 대표적인 마우스에서 망막 홀 마운트(whole mount)에서의 에반스 블루(Evans blue) 염료 누출에 의해 평가된 혈관 투과성의 공초점 면역형광 이미지. 화살표는 혈관외유출(extravasation) 위치를 나타낸다. 스케일 바, 30 μm. (b) 필드(0.44 mm2) 당 혈관외유출 수 평가에 의한 혈관 누출의 정량화. Ic-007a 점안액의 효과는 비-당뇨 대조군에서 발생하는 것과 동일한 수준으로 혈관 누출을 유의미하게 감소시켰다. 다른 군과 비교하여 *p < 0.01.
도 2: (a) 슈미트 점수(Schmidt score)는 4가지 매개변수에 대한 다음 점수(괄호 안의 숫자)에 기초한 췌장 손상을 설명하는 4가지 조직병리학 평가 기준에 따른 화합물의 효능 평가이다. (a) (0) 없음 (1) 소엽 간(Interlobular) (2) 소엽(Lobule) 관련 (3) 샘꽈리 세포(acinar cell)와 같은 단리된 섬 점수가 있는 부종 간질성 부종. (b) 염증 침윤 = (0) 없음, (1) < 20%, (2) 20% 내지 50%, (3) > 50%의 점수가 있는 백혈구 침윤. (c) 실질(Parenchymal) 괴사 = (0) 없음, (1) < 5%, (2) 5% 내지 20%, (3) > 20%의 점수가 있는 샘꽈리 세포 괴사. (d) (0) 없음, (1) 1 내지 2개 지점, (2) 3 내지 5개 지점, (3) > 5개 지점의 점수가 있는 출혈(Haemorrhage). 슈미트 최고 점수 = 10은 세룰레인(caerulein) 유도 + 비히클 처리이고 최저 점수 = 0은 비-유도된 동물이다. 슈미트 점수는 a+b+c+d 점수의 합계이며 ****은 도 2에 제시된 바와 같이 세룰레인 유도군과 통계학적으로 유의한 차이를 의미한다. 모든 생성물은 세룰레인 대조군 동물에 비해 개선된 슈미트 점수를 나타낸다.
도 3a 내지 d: 도 3a 내지 b는 선택된 질환과 관련된 주요 사이토카인이 있는 질환 목록을 나타내며(문헌[Akdis M. et al, J Allergy Clin Immunol 2016;138:984-1010]) 도 3c는 https://www.targetvalidation.org/에서 검색한 후 "당뇨병성 망막증"의 예로서 제공된 선택된 질환과 관련될 가능성이 있는 사이토카인 및 유전자를 점수 별로 분류한 검색 결과의 일부를 나타낸다. 도 3d에서, VEGFA가 언급된 질환 목록을 찾기 위해 사이토카인으로써 VEGFA를 사용하여 검색을 수행하였다. VEGFA가 관련된 질환의 일부만이 도 3d에 표시된다. 참조: 문헌[Open Targets Platform: new developments and updates two years on. Denise Carvalho et al (Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, D1056-D1065, https://doi.org/10.1093/nar/gky1133)].
도 4(a 내지 d): 실시예 1.1 내지 1.4에 기술된 바와 같은 유형 Ia 내지 Id의 화합물의 조건 및 수율을 열거하는 표를 나타낸다. 출발 물질 2,5-디히드록시테레프탈산으로부터 계산된 전체 수율.
도 5(a 내지 c): 실시예 1.5 내지 1.7에 기술된 바와 같은 유형 IIa 내지 IIc의 화합물의 조건 및 수율을 열거하는 표를 나타낸다.
도 6: 실시예 1.8 및 1.9에 기술된 바와 같은 유형 IIIa 및 IIIb의 화합물의 조건 및 수율을 열거하는 표를 나타낸다.
도 7: 실시예 1.10에 기술된 바와 같은 유형 IIIc의 화합물의 조건 및 수율을 열거하는 표를 나타낸다.
도 8: 화합물 유형 V와 관련된 실시예 1.12에 기술된 탈보호(deprotection) 과정을 열거하는 표.
도 9: 투여 전 0일차 후, 및 이후 7일 및 14일 동안 매일 정맥 내 또는 경구(per os) 경로로 투여한 후 샘플링된 모든 동물의 각 군에서 STZ-유도된 당뇨병 모델의 비-공복 혈당 수준(모든 동물의 평균 ± 표준편차)을 나타낸다.
도 10: 정맥 내 또는 경구 경로에 의해 매일 투여 후 7일차에 샘플링된 군 당 3마리의 동물의 STZ-유도된 당뇨병 모델에서 상처 치유를 가속화하는 것을 나타낸다.
도 11: 도 11a는 치료 21일차에 폐 섬유증의 대표적인 이미지를 나타낸다; (a1) 비-유도(건강함); a2, 비히클 처리로 유도된 블레오마이신(bleomycine); a3, 피르페니돈(pirfenidone) 100 mg/kg 처리로 유도된 블레오마이신; a4, IVc-059a 처리로 유도된 블레오마이신. 도 11b는 비-처리 대 피르페니돈 대 IVc-059a로 유도된 건강한, 블레오마이신의 애쉬크로프트 점수(Ashcroft score)를 나타낸다.
질환, 장애, 또는 기능장애를 앓고 있는 대상체의 치료에 유용한 신규한 화합물이 본원에 개시된다. 이러한 질환, 장애, 또는 기능장애의 예는 제한 없이 자가면역,　대사성, 염증성, 퇴행성 및　신생물성　장애, 특히 염증성 병리, 혈관신생 질환 및/또는 섬유성 장애 예컨대 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증(diabetic nephropathy), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 만성 췌장염, 간 섬유증, 신장 섬유증, 및 췌장 기능장애에 의해 야기된 대사 질환을 포함한다.
이하, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 개시된 신규한 화합물을 이용하여 치료될 수 있는 질환, 장애, 또는 기능장애의 집합은 집합적으로 "의학적 상태"로 지칭된다.
본원에서 사용된 용어 "대상체"는 임의의 모든 유기체를 포함하고 용어 "환자"를 포함한다. 본원에 기술된 방법에 따라 치료될 대상체는 의학적 상태를 앓고 있는 것으로 의료 종사자에 의해 진단된 대상체일 수 있다. 진단은 임의의 적절한 수단에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 본 개시내용에 따라 치료될 대상체가 의학적 상태를 진단하기 위해 표준 시험을 받았을 수 있음을 이해할 것이다. 통상의 기술자에게 알려진 바와 같이, 본원에 개시된 유형의 의학적 상태의 임상적 특징은 병리기전에 따라 변한다.
본원에서 "치료하기(treating)"는 치료 목적을 위해 개시된 화합물을 이용하는 것을 지칭한다. 치료적 치료(Therapeutic　treatment)는 예를 들어 대상체의 상태를 개선하거나 안정화하기 위해 의학적 상태를 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 청구범위 및 실시형태에서, 치료하기는 치료 목적으로 본원에 개시된 방법론을 대상체가 겪고있는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 전구약물은 임의의 광범위한 전구약물 전략을 지칭한다. 예를 들어, 전구약물 전략은 1958년 Adrian Albert에 의해 공식적으로 인정되었지만(문헌[Albert, A. Chemical aspects of selective toxicity. Nature, 1958, 182, 421-422]) 메테나민(methenamine), 페나세틴(phenacetin), 및 프론토실(prontosil)로 예시된 바와 같이 이전 세기 초반에 시작되었다. 전구약물은 일반적으로 약리학적 활성이 거의 또는 전혀 없는 분자이지만 우연히든 의도적으로든 생체 내에서 활성 약물로 생물전환을 가능하게 하는 내재된 구조적 불안정성을 가지고 있다. 전환은 화학적 또는 효소적 과정 또는 이 둘의 조합을 통해 발생할 수 있다. 활성 분자는 종종 적절한 생물학적 표적으로의 전달에 상당한 문제를 일으키는 바람직하지 않은 물리화학적 특성과 연관되어 있다. 전구약물은 일반적으로 간 대사에 기인하는 대사 불안정성을 개선할 수 있다. 유사하게, 약물의 원치 않는 장 대사는 선택적 전구약물 전략에 의해 극복될 수 있다. 이러한 불안정성은 전신 순환 및 그 표적에 도달하는 약물의 총량을 크게 감소시킬 수 있다. 전구약물은 빠른 대사를 피하기 위해 페놀과 같이 대사적으로 불안정하지만 약리학적으로 필수적인 작용기를 마스킹함으로써 활성 약물을 이러한 초회 통과 효과로부터 보호하는 데 사용될 수 있다.
약물의 구조적 변형을 통해 수득된 전구약물은 분자의 고유한 물리화학적 특성에 영향을 주어 전달이 가능하도록 설계된다. 이러한 개발이 발견 단계에서 새로운 분자의 설계에 항상 통합되는 것은 아니다. 종종 유사체(analogue) 최적화가 선호되는 경로이다. 초기 전구약물 전략을 실행하면 보다 신속한 임상 개발과, 궁극적으로 의약품의 상업화가 가능하다.
많은 전구약물 전략을 적용하여 모 약물(parent drug)의 친유성에 영향을 줄 수 있다. 약물의 친유성은 짧은-사슬 탄화수소 프로모이어티(promoieties)에 의해 극성 및 이온화된 기능을 마스킹함으로써 개선되었다. 친수성 히드록실, 카복실, 포스페이트 또는 아민, 및 기타 음전하 또는 양전하를 띤 기는 유비쿼터스 에스테라제 또는 펩티다제에 의해 체내에서 모 약물로 다시 빠르게 가수분해되는 보다 친유성인 알킬 또는 아릴 에스터 또는 N-아실 유도체로 성공적으로 전환되었다.
따라서 본 발명은 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure pct00003
화학식 (I)
상기 식에서:
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
R2 및 R3은 H 또는 R5이고, 단 R2 및 R3 중 하나는 R5인 경우, 다른 하나는 H이고 R2 및 R3 중 하나가 H인 경우, 다른 하나는 R5이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R5 = R6, R7 또는 R8이고;
R6 = CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, 또는 CONHCH(COOR4)(CH2)kR9, 헤테로아릴-R9이고 여기서 k = 0 내지 4이고;
R7 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 벤조헤테로아릴이고;
R8 = (CH2)mX(CH2)pR9이고;
X = O, S, SO2, NH, NAc, 또는 N(CH2)qR9이고;
R9 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린, C=O, NHCO-R10으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
R10 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
여기서 R9 및 R10의 아릴은 페닐, 나프틸, 바이페닐기로부터 선택되는, 6 내지 14개 탄소 원자를 함유하는 방향족기이고; 헤테로아릴 R9 및 R10은 1 내지 14개 탄소 원자 및 하나 이상의 질소를 함유하는 방향족기이고; n, m, p 및 q는 독립적으로 1 내지 4이다.
본 발명은 추가로 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure pct00004
(I)
상기 식에서:
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
R2 및 R3은 H 또는 R5이고, 단 R2 및 R3 중 하나는 R5인 경우, 다른 하나는 H이고 R2 및 R3 중 하나가 H인 경우, 다른 하나는 R5이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R5 = R6, 또는 R7이고,
R6 = CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, 또는 CONHCH(COOR4)(CH2)kR9이고; 여기서 k = 0 내지 4이고;
R7 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 벤조헤테로아릴이고;
R9 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린, C=O, 또는 NHCO-R10으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 헤테로아릴이고;
R10 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 헤테로아릴이고; 여기서 R9 및 R10의 아릴은 페닐, 나프틸, 바이페닐 중에서 선택되는, 6 내지 14개 탄소 원자를 함유하는 방향족기이고; R9 및 R10의 헤테로아릴은 1 내지 14개 탄소 원자 및 하나 이상의 질소를 함유하는 방향족기이고; n은 독립적으로 1 내지 4이다.
본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물을 제공한다:
Figure pct00005
(I)
상기 식에서:
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
R2 및 R3은 H 또는 R5이고, 단 R2 및 R3 중 하나는 R5인 경우, 다른 하나는 H이고 R2 및 R3 중 하나가 H인 경우, 다른 하나는 R5이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R5 = R8이고
R8 = (CH2)mX(CH2)pR9이고;
X = O, S, SO2, NH, NAc, 또는 N(CH2)qR9이고;
R9 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린, C=O, 또는 NHCO-R10으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 헤테로아릴이고;
R10 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 헤테로아릴이고;
여기서 R9 및 R10의 아릴은 페닐, 나프틸, 바이페닐기 중에서 선택되는, 6 내지 14개 탄소 원자를 함유하는 방향족기이고; 헤테로아릴 R9 및 R10은 1 내지 14개 탄소 원자 및 하나 이상의 질소를 함유하는 방향족기이고; n, m, p 및 q는 독립적으로 1 내지 4이다.
용어 "알킬"은 1 내지 20개 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 12개 탄소 원자, 특히 1 내지 6개(예컨대, 1, 2, 3 또는 4개) 탄소 원자를 함유하는 포화된, 직쇄 또는 분지형 탄화수소기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, iso-프로필, n-부틸, iso-부틸, sec-부틸 또는 tert-부틸을 지칭한다. 또한, 용어 알킬은 예를 들어, 2,2,2-트리클로로에틸 또는 트리플루오로메틸기와 같이, 하나 이상의 수소 원자가 할로겐 원자(바람직하게는 F 또는 Cl)로 치환된 기를 지칭한다.
용어 "아실"은 (알킬)-C(O)-, (아릴)-C(O)-, (헤테로아릴)-C(O)-, (헤테로알킬)-C(O)-, 및 (헤테로사이클로알킬)-C(O)- 기를 지칭하며, 여기서 상기 기는 카보닐 기능화를 통해 모 구조(parent structure)에 부착된다. 일부 실시형태에서, 이는 아실옥시기의 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클로알킬 부분의 사슬 또는 고리와 아실의 카보닐 탄소의 총 수, 즉, 3개의 다른 고리 또는 사슬 원자와 카보닐의 총 수를 지칭하는 C1-C4　아실 라디칼이다.
용어 "아릴"은 6 내지 14개 고리 탄소 원자, 바람직하게는 6 내지 10개(특히 6개) 고리 탄소 원자를 함유하는 하나 이상의 고리를 함유하는 방향족기를 지칭한다.
용어 "아르알킬" 또는 "아릴C1-4알킬"은 상기 정의에 따라 아릴과 또한 알킬, 알케닐, 알키닐 및/또는 사이클로알킬기 둘 모두를 함유하는 기, 비제한적으로 벤질, 2-페닐에틸, 3-페닐프로필, 및 2-나프-2-일에틸을 지칭한다. 아르알킬기는 바람직하게는 6 내지 10개 탄소 원자를 함유하는 1 또는 2개의 방향족 고리 시스템(1 또는 2개 고리) 및 1 또는 2 내지 6개 탄소 원자를 함유하는 1 또는 2개의 알킬, 알케닐 및/또는 알키닐기 및/또는 5 또는 6개 고리 탄소 원자를 함유하는 사이클로알킬기를 함유한다.
용어 "헤테로아릴"은 5 내지 14개 고리 원자, 바람직하게는 5 내지 10개(특히 5 또는 6 또는 9 또는 10개) 고리 원자를 함유하는 하나 이상의 고리를 함유하고, 하나 이상의(바람직하게는 1, 2, 3 또는 4개) 산소, 질소, 인 또는 황 고리 원자(바람직하게는 O, S 또는 N)를 함유하는 방향족기를 지칭한다. 예는 피리딜(예컨대, 4-피리딜), 이미다졸릴(예컨대, 2-이미다졸릴), 페닐피롤릴(예컨대, 3-페닐피롤릴), 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 테트라졸릴, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 이속사졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈이속사졸릴, 벤즈티아졸릴, 피리다지닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 피롤릴, 퓨리닐, 카바졸릴, 아크리디닐, 피리미딜, 2,3-바이퓨릴, 피라졸릴(예컨대 3-피라졸릴) 및 이소퀴놀리닐기이다.
용어 "벤조헤테로아릴" 또는 "벤조헤테로방향족"은 일환 헤테로방향족 고리에 융합된 페닐 고리를 포함하는 이환 고리를 지칭한다. 벤조헤테로아릴의 예는 벤즈이속사졸릴, 벤족사졸릴, 벤즈이소티아졸릴, 벤조티아졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조퓨릴, 벤조티에닐(S-옥시드 및 디옥시드 포함), 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 인다졸릴, 인돌릴, 등을 포함한다.
용어 "아졸"은 질소 고리 원자와 N, O 또는 S로부터 선택되는 0 내지 3개의 추가 고리 헤테로원자를 가진 5원 헤테로아릴기를 지칭한다. 이미다졸, 옥사졸, 티아졸 및 테트라졸은 대표적인 아졸기이다.
용어 "사이클로알킬"은 하나 이상의 고리(바람직하게는 1 또는 2개)를 함유하고, 3 내지 14개 고리 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 10개(특히 3, 4, 5, 6 또는 7개) 고리 탄소 원자를 함유하는 포화된 또는 부분적으로 불포화된(예를 들어, 사이클로알케닐기) 환형 기를 지칭한다. 사이클로알킬기의 특정 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 기이다.
용어 "선택적으로 치환된"은 적어도 하나의 또는 선택적으로 2, 3 또는 그 이상의 수소 원자가 플루오린, 클로린, 브로민, 요오딘 원자로, 또는 OH, =O, SH, =S, NH2, =NOH, N3　또는 NO2기로 치환될 수 있는 기를 지칭한다. 이러한 용어는 추가로 적어도 1, 2, 3 또는 그 이상의 비치환된 C1-C10　알킬, C2-C10　알케닐, C2-C10　알키닐, 헤테로알킬, C3-C18　사이클로알킬, C2-C17　헤테로사이클로알킬, C4-C20　알킬사이클로알킬, C2-C19 헤테로알킬사이클로알킬, C6-C18　아릴, C1-C17　헤테로아릴, C7-C20　아르알킬 또는 C2-C19 헤테로아르알킬기로 치환될 수 있는 기를 지칭한다. 이러한 용어는 또한 특히 1, 2, 3 또는 그 이상의 비치환된 C1-C6　알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6　알키닐, C1-C6　헤테로알킬, C3-C10　사이클로알킬, C2-C9　헤테로사이클로알킬, C7-C12　알킬사이클로알킬, C2-C11　헤테로알킬사이클로알킬, C6-C10　아릴, C1-C9　헤테로아릴, C7-C12　아르알킬, 또는 C2-C11　헤테로아르알킬기로 치환될 수 있는 기를 지칭한다.
바람직한 실시형태에 따르면, 본원에 기술된 모든 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 알킬사이클로알킬, 헤테로알킬사이클로알킬, 아르알킬 및 헤테로아르알킬기는 선택적으로 치환될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며; 여기서:
(A)
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고,
R1 = COOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H; R3 = R5이고;
R5 = R6 = CONH-R9이다;
또는
(B)
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고,
R1 = COOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R3 = H이고; R2 = R5이고;
R5 = R6 = CONH-R9이다.
제1 실시형태에서, 따라서 본 발명은 표 1에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00006

R3 = R5 = CONHR9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 Ra Rb R4 R9
Ia-001a
4-(2-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 2-카복시페닐
Ia-001a-Tz 4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐-아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
Ia-001c 2,5-디히드록시-4-(2-설포페닐아미노카보닐)벤조산 H H H 2-설포페닐
Ia-002a 4-(3-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 3-카복시페닐
Ia-002a-Tz 4-(3-(1H-테트라졸-5-일)페닐-아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 3-(1H-테트라졸-5-일)페닐
Ia-002c 2,5-디히드록시-4-(3-설포페닐아미노카보닐)벤조산 H H H 3-설포페닐
Ia-003a 4-(4-카복시페닐-아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-카복시페닐
Ia-003a-Tz 4-(4-(1H-테트라졸-5-일)페닐-아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-(1H-테트라졸-5-일)페닐
Ia-003c 2,5-디히드록시-4-(4-설포페닐아미노카보닐)벤조산 H H H 4-설포페닐
Ia-004a 4-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 3-카복시-4-히드록시페닐
Ia-005a 4-(4-카복시-3-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-카복시-3-히드록시페닐
Ia-056a
 4-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
Ia-006a 4-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 2-카복시-4-히드록시페닐
Ib-010a 3,5-비스(2,5-디히드록시-4-카복시벤조일아미노)벤조산 H H H
Figure pct00007
Ia-011a 3-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산; H H H 2,3-디카복시페닐
Ia-012a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산 H H H 2,5-디카복시페닐
Ia-013a 화합물 36: 2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산 H H H 2,6-디카복시페닐
Ia-014a 화합물 38: 4-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산 H H H 3.4-디카복시페닐
Ia-015a 5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산 H H H 3.5-디카복시페닐
Ia-016a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 H H H 3-카복시피리딘-2-일
Ia-017a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산 H H H 4-카복시피리딘-2-일
Ia-018a 6-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 H H H 5-카복시피리딘-2-일
Ia-019a 6-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 H H H 6-카복시피리딘-2-일
Ia-020a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산 H H H 3-카복시-5-플루오로피리딘-2-일
Ia-021a 6-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산 H H H 3,6-디카복시피리딘-2-일
Ia-022a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산 H H H 3,5-디카복시피리딘-2-일
Ia-023a 3-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산 H H H 4-카복시피리딘-3-일
Ia-024a 5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 H H H 5-카복시피리딘-3-일
Ia-025a 5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 H H H 6-카복시피리딘-3-일
Ia-026a 3-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 H H H 2-카복시피리딘-3-일
Ia-027a 5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산 H H H 4-카복시-6-플루오로피리딘-3-일
Ia-028a 4-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 H H H 3-카복시피리딘-4-일
Ia-029a 4-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 H H H 2-카복시피리딘-3-일
Ia-032a 4-(4-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-(카복시메틸)페닐
Ia-033a 4-(3-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 3-(카복시메틸)페닐
Ia-033a-HyP 2,5-디히드록시-4-(3-(1-히드록시-1H-피라졸-4-일)페닐아미노카보닐)벤조산 H H H 3-(1-히드록시-1H-피라졸-4-일) 페닐
Ia-034a 4-(2-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 2-(카복시메틸)페닐
Ia-001a-E2-A2 에틸 4-(2-(에톡시카보닐)페닐아미노카보닐)-2,5-디아세톡시벤조에이트 Ac Ac Et 2-(에톡시카보닐)페닐
Ia-001a-E2 에틸 4-(2-(에톡시카보닐)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트 H H Et 2-(에톡시카보닐)페닐
Ia-001a-Tz-E1-A2 에틸 4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디아세톡시벤조에이트 Ac Ac Et 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
Ia-001a-Tz-E1 에틸 4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트 H H Et 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
Ia-004a-E2 에틸 2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐아미노카보닐)벤조에이트 H H Et 4-히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐
Ib-010a-E3-A4 에틸 3,5-비스(2,5-디아세톡시-4-에톡시카보닐벤조일아미노)벤조에이트 Ac Ac Et
Figure pct00008
Ib-010a- E3 에틸 3,5-비스(2,5-디히드록시-4-에톡시카보닐벤조일아미노)벤조에이트 H H Et
Figure pct00009
Ia-023a-E2 에틸 3-(4-(에톡시카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코티네이트 H H Et 4-에톡시카보닐피리딘-3-일
Ia-056a-E2 화합물 390: 에틸 4-(4-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트 H H Et 4-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐
B.
Figure pct00010

R2 = R5 = CONHR9
IIa-001a 3-(2-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 2-카복시페닐
IIa-001a-Tz 3-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
IIa-001c 2,5-디히드록시-3-(2-설포페닐아미노카보닐)벤조산 H H H 2-설포페닐
IIa-002a 3-(3-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 3-카복시페닐
IIa-002a-Tz 3-(3-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 3-(1H-테트라졸-5-일)페닐
IIa-002c 2,5-디히드록시-3-(3-설포페닐아미노카보닐)벤조산 H H H 3-설포페닐
IIa-003a 3-(4-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-카복시페닐
IIa-003a-Tz 3-(4-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-(1H-테트라졸-5-일)페닐
IIa-003c 2,5-디히드록시-3-(4-설포페닐아미노카보닐)벤조산 H H H 4-설포페닐
IIa-004a 3-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 3-카복시-4-히드록시페닐
IIa-005a 3-(4-카복시-3-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-카복시-3-히드록시페닐
IIa-006a 3-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 2-카복시-4-히드록시페닐
IIb-010a 3,5-비스(2,5-디히드록시-3-카복시벤조일아미노)벤조산 H H H
Figure pct00011
IIa-011a 3-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산 H H H 2,3-디카복시페닐
IIa-012a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산 H H H 2,5-디카복시페닐
IIa-013a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산 H H H 2.6-디카복시페닐
IIa-014a 4-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산 H H H 3.4-디카복시페닐
IIa-015a 5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산 H H H 3,5-디카복실산
IIa-016a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 H H H 3-카복시피리딘-2-일
IIa-017a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산 H H H 4-카복시피리딘-2-일
IIa-018a 6-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 H H H 5-카복시피리딘-2-일
IIa-019a 6-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 H H H 6-카복시피리딘-2-일
IIa-020a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산 H H H 3-카복시-5-플루오로피리딘-2-일
IIa-021a 6-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산 H H H 3,6-디카복시피리딘-2-일
IIa-022a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산 H H H 3,5-디카복시피리딘-2-일
IIa-023a 3-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산 H H H 4-카복시피리딘-3-일
IIa-024a 5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 H H H 5-카복시피리딘-3-일
IIa-025a 5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 H H H 6-카복시피리딘-3-일
IIa-026a 3-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 H H H 2-카복시피리딘-3-일
IIa-027a 5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산 H H H 4-카복시-6-플루오로피리딘-3-일
IIa-028a 4-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 H H H 3-카복시피리딘-4-일
IIa-029a 화합물 172: 4-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산; H H H 2-카복시피리딘-3-일
IIa-032a 3-(4-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 4-(카복시메틸)페닐
IIa-033a 3-(3-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 3-(카복시메틸)페닐
IIa-033a-Hyp 2,5-디히드록시-3-(3-(1-히드록시-1H-피라졸-4-일)페닐아미노카보닐)벤조산 H H H 3-(1-히드록시-1H-피라졸-4-일)페닐
IIa-034a 3-(2-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 H H H 2-(카복시메틸)페닐
IIa-001aTz-E1 에틸 3-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트 H H Et 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
IIa-034a-E2 에틸 3-(2-(에톡시카보닐메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트 H H Et 2-(2-에톡시카보닐메틸)페닐
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 화합물을 제공하며, 여기서:
(A)
Ra, Rb = H이고;
R1 = SO3H이고;
R2 = H; R3 = R5이고;
R5 = R6 = CONH-R9이다;
또는
(B)
Ra, Rb = H이고;
R1 = SO3H이고;
R3 = H; R2 = R5이고;
R5 = R6 = CONH-R9이다.
제2 실시형태에서, 본 발명은 표 2에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00012

R3 = R5 = CONHR9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 Ra Rb R9
Ia-001b 2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산 H H 2-카복시페닐
Ia-001d 2,5-디히드록시-4-(2-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산 H H 2-설포페닐
Ia-002b 3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산 H H 3-카복시페닐
Ia-002d 2,5-디히드록시-4-(3-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산 H H 3-설포페닐
Ia-003b 4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산 H H 4-카복시페닐
Ia-003d 2,5-디히드록시-4-(4-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산 H H 4-설포페닐
Ia-004b 5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 H H 3-카복시-4-히드록시페닐
Ia-005b 4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 H H 4-카복시-3-히드록시페닐
Ia-006b 2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-5-히드록시벤조산 H H 2-카복시-4-히드록시페닐
Ib-010b 3,5-비스(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산 H H
Figure pct00013
Ia-011b 3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)프탈산 H H 2,3-디카복시페닐
Ia-012b 2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)테레프탈산 H H 2,5-디카복시페닐
Ia-013b 2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)이소프탈산 H H 2,6-디카복시페닐
Ia-014b 4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)프탈산 H H 3.4-디카복시페닐
Ia-015b 5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)이소프탈산 H H 3.5-디카복시페닐
Ia-016b 2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)니코틴산 H H 3-카복시피리딘-2-일
Ia-017b 2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)이소니코틴산 H H 4-카복시피리딘-2-일
Ia-018b 6-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)니코틴산 H H 5-카복시피리딘-2-일
Ia-019b 6-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피콜린산 H H 6-카복시피리딘-2-일
Ia-020b 2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산 H H 3-카복시-5-플루오로피리딘-2-일
Ia-021b 6-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산 H H 3,6-디카복시피리딘-2-일
Ia-022b 2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산 H H 3,5-디카복시피리딘-2-일
Ia-023b 3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)이소니코틴산 H H 4-카복시피리딘-3-일
Ia-024b 5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)니코틴산 H H 5-카복시피리딘-3-일
Ia-025b 5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피콜린산 H H 6-카복시피리딘-3-일
Ia-026a 3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피콜린산 H H 2-카복시피리딘-3-일
Ia-027b 5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산 H H 4-카복시-6-플루오로피리딘-3-일
Ia-028b 4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)니코틴산 H H 3-카복시피리딘-4-일
Ia-029b 4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피콜린산 H H 2-카복시피리딘-3-일
Ia-032b (4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)페닐)아세트산 H H 4-(카복시메틸)페닐
Ia-033b (3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)페닐)아세트산 H H 3-(카복시메틸)페닐
Ia-034b (2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)페닐)아세트산 H H 2-(카복시메틸)페닐
B.
Figure pct00014

R2 = R5 = CONHR9
IIa-001b 2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)벤조산 H H 2-카복시페닐
IIa-001d 2,5-디히드록시-3-(2-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산 H H 2-설포페닐
IIa-002b 3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)벤조산 H H 3-카복시페닐
IIa-002d 2,5-디히드록시-3-(3-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산 H H 3-설포페닐
IIa-003b 4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)벤조산 H H 4-카복시페닐
IIa-003d 2,5-디히드록시-3-(4-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산 H H 4-설포페닐
IIa-004b 5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 H H 3-카복시-4-히드록시페닐
IIa-005b 4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-2-히드록시벤조산; H H 4-카복시-3-히드록시페닐
IIa-006b 2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-5-히드록시벤조산 H H 2-카복시-4-히드록시페닐
IIb-010b 3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산 H H
Figure pct00015
IIa-011b 3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)프탈산; H H 2,3-디카복시페닐
IIa-012b 2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)테레프탈산 H H 2,5-디카복시페닐
IIa-013b 2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)이소프탈산 H H 2,6-디카복시페닐
IIa-014b 4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)프탈산 H H 3.4-디카복시페닐
IIa-015b 5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)이소프탈산 H H 3.5-디카복시페닐
IIa-016b 2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)니코틴산 H H 3-카복시피리딘-2-일
IIa-017b 2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)이소니코틴산 H H 4-카복시피리딘-2-일
IIa-018b 6-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)니코틴산 H H 5-카복시피리딘-2-일
IIa-019b 6-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피콜린산 H H 6-카복시피리딘-2-일
IIa-020b 2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산 H H 3-카복시-5-플루오로피리딘-2-일
IIa-021b 6-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산; H H 3,6-디카복시피리딘-2-일
IIa-022b 2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산 H H 3,5-디카복시피리딘-2-일
IIa-023b 3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)이소니코틴산 H H 4-카복시피리딘-3-일
IIa-024b 5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)니코틴산 H H 5-카복시피리딘-3-일
IIa-025b 5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피콜린산 H H 6-카복시피리딘-3-일
IIa-026b 3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피콜린산 H H 2-카복시피리딘-3-일
IIa-027b 5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산 H H 4-카복시-6-플루오로피리딘-3-일
IIa-028b 4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)니코틴산 H H 3-카복시피리딘-4-일
IIa-029b 화합물 173: 4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피콜린산 H H 2-카복시피리딘-3-일
IIa-032b (4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)페닐)아세트산 H H 4-(카복시메틸)페닐
IIa-033b (3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)페닐)아세트산 H H 3-(카복시메틸)페닐
IIa-034b (2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)페닐)아세트산 H H 2-(카복시메틸)페닐
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며, 여기서:
(A)
Ra, Rb = H이고;
R1 = (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H; R3 = R5이고;
R5 = R6 = CONH-R9이거나;
또는
(B)
Ra, Rb = H이고;
R1 = (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸;
R3 = H; R2 = R5이고;
R5 = R6 = CONH-R9이다.
제3 실시형태에서, 본 발명은 표 3에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00016

R3 = R5 = R6 = CONH-R9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 R1 Ra Rb R9
IIIa-001a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산 CH2COOH H H 2-카복시페닐
IIIa-001a-Tz (2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 CH2COOH H H 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
IIIa-001c (2,5-디히드록시-4-(2-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산 CH2COOH H H 2-설포페닐
IIIa-002a 3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산; CH2COOH H H 3-카복시페닐
IIIa-002c (2,5-디히드록시-4-(3-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산; CH2COOH H H 3-설포페닐
IIIa-003a 4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산; CH2COOH H H 4-카복시페닐
IIIa-003c 2-(2,5-디히드록시-4-(4-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산; CH2COOH H H 4-설포페닐
IIIa-004a 화합물 216: 5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 CH2COOH H H 3-카복시-4-히드록시페닐
IIIa-005a 4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 CH2COOH H H 4-카복시-3-히드록시페닐
IIIa-006a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-히드록시벤조산 CH2COOH H H 2-카복시-4-히드록시페닐
IIIb-010a 3,5-비스(2,5-디히드록시-4-카복시메틸벤조일아미노)벤조산 CH2COOH H H
Figure pct00017
IIIa-011a 3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산 CH2COOH H H 2,3-디카복시페닐
IIIa-012a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산 CH2COOH H H 2,5-디카복시페닐
IIIa-013a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산 CH2COOH H H 2,6-디카복시페닐
IIIa-014a 4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산 CH2COOH H H 3.4-디카복시페닐
IIIa-015a 5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산 CH2COOH H H 3.5-디카복시페닐
IIIa-016a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 CH2COOH H H 3-카복시피리딘-2-일
IIIa-017a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산 CH2COOH H H 4-카복시피리딘-2-일
IIIa-018a 6-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 CH2COOH H H 5-카복시피리딘-2-일
IIIa-019a 6-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 CH2COOH H H 6-카복시피리딘-2-일
IIIa-020a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산 CH2COOH H H 3-카복시-5-플루오로피리딘-2-일
IIIa-021a 6-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산 CH2COOH H H 3,6-디카복시피리딘-2-일
IIIa-022a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산 CH2COOH H H 3,5-디카복시피리딘-2-일
IIIa-023a 3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산; CH2COOH H H 4-카복시피리딘-3-일
IIIa-024a 5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 CH2COOH H H 5-카복시피리딘-3-일
IIIa-025a 5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 CH2COOH H H 6-카복시피리딘-3-일
IIIa-026a 3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 CH2COOH H H 2-카복시피리딘-3-일
IIIa-027a 5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산 CH2COOH H H 4-카복시-6-플루오로피리딘-3-일
IIIa-028a 4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산; CH2COOH H H 3-카복시피리딘-4-일
IIIa-029a 4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산; CH2COOH H H 2-카복시피리딘-3-일
IIIa-032a (4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산 CH2COOH H H 4-(카복시메틸)페닐
IIIa-033a (3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산 CH2COOH H H 3-(카복시메틸)페닐
IIIa-034a (2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산 CH2COOH H H 2-(카복시메틸)페닐
IIIa-001a-E2 메틸 2-(4-(에톡시카보닐메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조에이트 CH2COOEt H H 2-(메톡시카보닐)페닐
IIIa-001aTz-E1 화합물 383: 에틸 (4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세테이트; CH2COOEt H H 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
IIIa-015a-E3 디에틸 5-(4-( 에톡시카보닐메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈레이트 CH2COOEt H H 3,5-디에톡시카보닐페닐
IIIb-010a-E3 메틸 3,5-비스(4-(에톡시카보닐메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조에이트 CH2COOEt H H
Figure pct00018
B.
Figure pct00019

R2 = R5 = R6 = CONHR9
IVa-001a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산 CH2COOH H H 2-카복시페닐
IVa-001c (2,5-디히드록시-3-(2-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산 CH2COOH H H 2-설포페닐
IVa-002a 3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산 CH2COOH H H 3-카복시페닐
IVa-002c (2,5-디히드록시-3-(3-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산 CH2COOH H H 3-설포페닐
IVa-003a 4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산 CH2COOH H H 4-카복시페닐
IVa-003c (2,5-디히드록시-3-(4-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산 CH2COOH H H 4-설포페닐
IVa-004a 5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 CH2COOH H H 3-카복시-4-히드록시페닐
IVa-005a 4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 CH2COOH H H 4-카복시-3-히드록시페닐
IVa-006a 화합물 295: 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-히드록시벤조산; CH2COOH H H 2-카복시-4-히드록시페닐
IVb-010a 3,5-비스(2,5-디히드록시-3-카복시메틸벤조일아미노)벤조산 CH2COOH H H
Figure pct00020
IVa-011a 3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산 CH2COOH H H 2,3-디카복시페닐
IVa-012a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산 CH2COOH H H 2,5-디카복시페닐
IVa-013a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산 CH2COOH H H 2,6-디카복시페닐
IVa-014a 4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산 CH2COOH H H 3.4-디카복시페닐
IVa-015a 5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산 CH2COOH H H 3.5-디카복시페닐
IVa-016a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 CH2COOH H H 3-카복시피리딘-2-일
IVa-017a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산 CH2COOH H H 4-카복시피리딘-2-일
IVa-018a 6-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 CH2COOH H H 5-카복시피리딘-2-일
IVa-019a 6-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 CH2COOH H H 6-카복시피리딘-2-일
IVa-020a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산 CH2COOH H H 3-카복시-5-플루오로피리딘-2-일
IVa-021a 6-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산 CH2COOH H H 3,6-디카복시피리딘-2-일
IVa-022a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산 CH2COOH H H 3,5-디카복시피리딘-2-일
IVa-023a 3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산 CH2COOH H H 4-카복시피리딘-3-일
IVa-024a 5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 CH2COOH H H 5-카복시피리딘-3-일
IVa-025a 5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 CH2COOH H H 6-카복시피리딘-3-일
IVa-026a 3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 CH2COOH H H 2-카복시피리딘-3-일
IVa-027a 5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산 CH2COOH H H 4-카복시-6-플루오로피리딘-3-일
IVa-028a 4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산 CH2COOH H H 3-카복시피리딘-4-일
IVa-029a 4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산 CH2COOH H H 2-카복시피리딘-3-일
IVa-032a (4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산 CH2COOH H H 4-(카복시메틸)페닐
IVa-033a (3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산 CH2COOH H H 3-(카복시메틸)페닐
IVa-034a (2 -(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산 CH2COOH H H 2-(카복시메틸)페닐
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며; 여기서:
(A)
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
R1 = CONH-R10이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H이고; R3 = R5이고;
R5 = R6 = CONH-R9이거나;
또는
(B)
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
R1 = CONH-R10이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R3 = H이고; R2 = R5이고;
R5 = R6 = CONH-R9이다.
제4 실시형태에서, 본 발명은 표 4에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00021

R3 = R5 = R6 = CONH-R 9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 Ra Rb R10 R9
Ic-001a-Tz/1-004a 5-(4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시 벤조산 H H 3-카복시-4-히드록시페닐 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
Ic-001a-Tz(2) N1,N4-비스(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐)-2,5-디히드록시테레프탈아미드 H H 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
Ic-007a 5-(4-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시 벤조산; H H 3-카복시-4-히드록시페닐 3-카복시-4-히드록시페닐
Ic-007b 5-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-3-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시 벤젠설폰산 H H 4-히드록시-3-설포닐페닐 4-히드록시-3-설포닐페닐
Ic-008a 4-(4-(4-카복시-3-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시 벤조산 H H 4-카복시-3-히드록시페닐 4-카복시-3-히드록시페닐
Ic-008b 4-(2,5-디히드록시-4-(3-히드록시-4-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시 벤젠설폰산 H H 3-히드록시-4-설포닐페닐 3-히드록시-4-설포닐페닐
Ic-009a 2-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-2-카복시페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-5-히드록시 벤조산 H H 2-카복시-4-히드록시페닐 2-카복시-4-히드록시페닐
Ic-009b 2-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-2-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-5-히드록시 벤젠설폰산 H H 4-히드록시-2-설포페닐 4-히드록시-2-설포페닐
Ib-001a-Tz/1-004a-E1 메틸 5-(4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조에이트; H H 4-히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐- 2-(1H-테트라졸-5-일)페닐
Ic-007a-E2-A4 메틸 5-(2,5-디아세톡시-4-(4-아세톡시-3-(메톡시카보닐)페닐아미노카보닐) 벤즈아미도)-2-아세톡시벤조에이트; Ac Ac 4-아세톡시-3-(메톡시카보닐)페닐 4-아세톡시-3-(메톡시카보닐)페닐
Ic-007a-E2 메틸 5-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐아미노카보닐) 벤즈아미도)-2-히드록시벤조에이트; H H 4-히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐 4-히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐
Ic-007a-pive2 1-(2,2-디메틸프로파노일옥시)에틸 5-[[4-[[3-[1-(2,2-디메틸프로파노일옥시)에톡시카보닐]-4-히드록시-페닐]카바모일]-2,5-디히드록시-벤조일]아미노]-2-히드록시벤조에이트 H H 3-[1-(2,2-디메틸프로파노일옥시)에톡시카보닐]-4-히드록시페닐 3-[1-(2,2-디메틸프로파노일옥시)에톡시카보닐]-4-히드록시-페닐
Ic-009a-E2 : 메틸 2-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-2-(메톡시카보닐)페닐아미노카보닐) 벤즈아미도)-5-히드록시벤조에이트 H H 4-히드록시-2-(메톡시카보닐)페닐 4-히드록시-2-(메톡시카보닐)페닐
B.
Figure pct00022

R2 = R5 = R6 = CONH-R9
IIc-007a 5-(3-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시 벤조산 H H 3-카복시-4-히드록시페닐 3-카복시-4-히드록시페닐
IIc-007b 5-(2,5-디히드록시-3-(4-히드록시-3-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시 벤젠설폰산 H H 4-히드록시-3-설포페닐 4-히드록시-3-설포페닐
IIc-008a 4-(3-(3-히드록시-4-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시 벤조산 H H 3-히드록시-4-카복시페닐 3-히드록시-4-카복시페닐
IIc-008b 4-(2,5-디히드록시-3-(3-히드록시-4-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시 벤젠설폰산 H H 3-히드록시-4-설포페닐 3-히드록시-4-설포페닐
IIc-009a 2-(3-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-히드록실 벤조산 H H 2-카복시-4-히드록시페닐 2-카복시-4-히드록시페닐
IIc-009b 2-(2,5-디히드록시-3-(4-히드록시-2-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-5-히드록시 벤젠설폰산 H H 4-히드록시-2-설포페닐 4-히드록시-2-설포페닐
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며, 여기서:
(A)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H이고; R3 = R5이고;
R5 = R6 = CONHCOR9이거나;
또는
(B)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R3 = H이고; R2 = R5이고;
R5 = R6 = CONHCOR9이다.
제5 실시형태에서, 본 발명은 표 5에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00023

R3 = R5 = R6 = CONHCOR 9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 R1 R9
Ia-040a N-(1,3,4,5-테트라히드록시사이클로헥실카보닐) 4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드 COOH
Figure pct00024
Ia-041a N-(4-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 4-카복시-2,5-디히드록시-벤즈아미드 COOH 2,5-디히드록시-4-카복시페닐
Ia-042a N-(3-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 4-카복시-2,5-디히드록시-벤즈아미드 COOH 2,5-디히드록시-3-카복시페닐
Ia-043a N-(3,4-디히드록시벤조일) 4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드 COOH 3,4-디히드록시페닐
Ia-044a N-(3,5-디히드록시벤조일) 4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드 COOH 3,5-디히드록시페닐
IIIa-040a N-(1,3,4,5-테트라히드록시사이클로헥실카보닐) 3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드 CH2COOH
Figure pct00025
IIIa-041a N-(4-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 3-카복시-2,5-디히드록시-벤즈아미드 CH2COOH 2,5-디히드록시-4-카복시페닐
IIIa-042a N-(3-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 3-카복시-2,5-디히드록시-벤즈아미드 CH2COOH 2,5-디히드록시-3-카복시페닐
IIIa-043a N-(3,4-디히드록시벤조일) 3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드 CH2COOH 3,4-디히드록시페닐
IIIa-044a N-(3,5-디히드록시벤조일) 3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드 CH2COOH 3,5-디히드록시페닐
B.
Figure pct00026

R2 = R5 = R6 = CONHCOR9
IIa-040a N-(1,3,4,5-테트라히드록시사이클로헥실카보닐) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드 COOH
Figure pct00027
IIa-041a N-(4-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시-벤즈아미드 COOH 2,5-디히드록시-4-카복시페닐
IIa-042a N-(3-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시-벤즈아미드 COOH 2,5-디히드록시-3-카복시페닐
IIa-043a N-(3,4-디히드록시벤조일) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드 COOH 3,4-디히드록시페닐
IIa-044a N-(3,5-디히드록시벤조일) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드 COOH 3,5-디히드록시페닐
IVa-040a N-(1,3,4,5-테트라히드록시사이클로헥실카보닐) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드 CH2COOH
Figure pct00028
IVa-041a N-(4-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시-벤즈아미드 CH2COOH 2,5-디히드록시-4-카복시페닐
IVa-042a N-(3-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시-벤즈아미드 CH2COOH 2,5-디히드록시-3-카복시페닐
IVa-043a N-(3,4-디히드록시벤조일) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드 CH2COOH 3,4-디히드록시페닐
IVa-044a N-(3,5-디히드록시벤조일) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드 CH2COOH 3,5-디히드록시페닐
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며; 여기서
(A)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H이고; R3 = R5이고;
R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9이거나;
또는
(B)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R3 = H이고; R2 = R5이고;
R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9이다.
제6 실시형태에서, 본 발명은 표 6에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00029

R3 = R5 = R6 = CONH(CH 2 ) n -R 9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 R1 n R9
Ia-035a 4-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산; COOH 1 3,4-디히드록시페닐
Ia-035a-2 4-(2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산; COOH 2 3,4-디히드록시페닐
Ia-037a 4-(3,5-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산; COOH 1 3,5-디히드록시페닐
Ia-038a 4-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산; COOH 1 4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)
Ia-039a 2,5-디히드록시-4-((3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)메틸아미노카보닐)벤조산 COOH 1 3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)
Ia-053a 4-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 COOH 1 2-카복시페닐
Ia-054a 4-(3-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 COOH 1 3-카복시페닐
Ia-055a 4-(4-카복시페닐메틸아미노카보닐) 2,5-디히드록시벤조산 COOH 1 4-카복시페닐
IIIa-035a 3-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 CH2COOH 1 3,4-디히드록시페닐
IIIa-037a 3-(2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 CH2COOH 1 3,5-디히드록시페닐
IIIa-038a 3-(3,5-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 CH2COOH 1 4-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)
IIIa-039a 3-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 CH2COOH 1 3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)
IIIa-053a 2,5-디히드록시-3-((3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)메틸아미노카보닐)벤조산 CH2COOH 1 2-카복시페닐
IIIa-054a 3-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 CH2COOH 1 3-카복시페닐
IIIa-055a 3-(3-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 CH2COOH 1 4-카복시페닐
B.
Figure pct00030

R2 = R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9
IIa-035a 3-(4-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 COOH 1 3,4-디히드록시페닐
IIa-035a-2 (4-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 COOH 2 3,4-디히드록시페닐
IIa-037a (4-(3,5-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 COOH 1 3,5-디히드록시페닐
IIa-038a (4-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐) 아세트산 COOH 1 4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)
IIa-039a 화합물 191: (2,5-디히드록시-4-((3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)메틸아미노카보닐)페닐)아세트산 COOH 1 3,4,5-트리히드록시사이클로헥실
IIa-053a (4-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 COOH 1 2-카복시페닐
IIa-054a (4-(3-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 COOH 1 3-카복시페닐
IIa-055a (4-(4-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 COOH 1 4-카복시페닐
IVa-035a (3-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 CH2COOH 1 3,4-디히드록시페닐
IVa-037a (3-(3,5-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 CH2COOH 1 3,5-디히드록시페닐
IVa-038a (3-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐) 아세트산 CH2COOH 1 4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)
IVa-039a (2,5-디히드록시-3-((3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)메틸카보닐아미노)페닐)아세트산 CH2COOH 1 3,4,5-트리히드록시사이클로헥실
IVa-053a (3-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 CH2COOH 1 2-카복시페닐
IVa-054a (3-(3-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 CH2COOH 1 3-카복시페닐
IVa-055a (3-(4-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 CH2COOH 1 4-카복시페닐
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며, 여기서:
Ra, Rb = H이고;
R1 = SO3H이고;
R2 = H이고; R3 = R5이고;
R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9이다.
제7 실시형태에 따르면, 본 발명은 하기 표 7에 따른 화합물을 포함한다:
Figure pct00031

R3 = R5 = CONH(CH 2 ) n -R 9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 n R9
Ia-053b 2-((2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)메틸)벤조산 1 2-카복시페닐
Ia-054b 3-((2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)메틸)벤조산 1 3-카복시페닐
Ia-055b 4-((2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)메틸)벤조산 1 4-카복시페닐
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물에 관한 것으로서 여기서:
(A)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H이고; R3 = R5이고;
R5 = R6 = CONHCH(COOR4)(CH2)k-R9이거나;
또는
(B)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R3 = H이고; R2 = R5이고;
R5 = R6 = CONHCH(COOR4)(CH2)k-R9이다.
제8 실시형태에서, 본 발명은 하기 표 8에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00032

R 3 = R 5 = R 6 = CONHCH(COOR 4 )(CH 2 ) k R 9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 R1 R4 k R9
Ia-035a-3 4-(1-카복시-2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H 1 3,4-디히드록시페닐
Ia-036a 4-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H 0 3,4-디히드록시페닐
IIIa-036a 3-(1-카복시-2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 CH2COOH H 0 3,4-디히드록시페닐
B.
Figure pct00033

R 2 = R 5 = R 6 = CONHCH(COOR 4 )(CH 2 ) k R 9
IIa-035a-3 3-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H 1 3,4-디히드록시페닐
IIa-036a (4-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 COOH H 0 3,4-디히드록시페닐
IVa-036a (3-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산 CH2COOH H 0 3,4-디히드록시페닐
특정 실시형태에서, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며, 여기서
(A)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H이고; R3 = R5이고;
R5 = R6 = 헤테로아릴-R9이거나;
또는
(B)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐 (구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R3 = H이고; R2 = R5이고;
R5 = R6 = 헤테로아릴-R9이다.
제9 실시형태에 따르면, 본 발명은 표 9에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00034

R3 = R5 = R6 = 헤테로아릴-R9
화합물 No. 화합물 화학 명칭 R1 헤테로아릴-R9
Ia-045a 4,6-비스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 COOH
Figure pct00035
Ia-046a 4-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-6-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 COOH
Figure pct00036
Ia-047a 4-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-6-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 COOH
Figure pct00037
Ia-048a 4-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-6-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 COOH
Figure pct00038
Ia-049a 4,6-비스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 COOH
Figure pct00039
Ia-050a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 COOH
Figure pct00040
Ia-051a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 COOH
Figure pct00041
Ia-052a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 COOH
Figure pct00042
IIa-046a 4,6-비스(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 COOH
Figure pct00043
IIa-050a 4-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-6-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 COOH
Figure pct00044
IIIa-045a 4-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-6-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 CH2COOH
Figure pct00045
IIIa-046a 4-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-6-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 CH2COOH
Figure pct00046
IIIa-047a 4,6-비스(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00047
IIIa-048a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00048
IIIa-049a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00049
IIIa-050a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00050
IIIa-051a 2-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00051
IIIa-052a 2-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00052
B.
Figure pct00053

R2 = R5 = R6 = 헤테로아릴-R9
IIa-045a 4-(4-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-6-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 COOH
Figure pct00054
IIa-047a 4-(4-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-6-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 COOH
Figure pct00055
IIa-048a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(4-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 COOH
Figure pct00056
IIa-049a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(4-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 COOH
Figure pct00057
IIa-051a 2-(4-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 COOH
Figure pct00058
IIa-052a 2-(4-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 COOH
Figure pct00059
IVa-045a 4-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-6-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 CH2COOH
Figure pct00060
IVa-046a 4-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-6-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 CH2COOH
Figure pct00061
IVa-047a 4-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-6-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 CH2COOH
Figure pct00062
IVa-048a 4-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-6-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진-2-온 CH2COOH
Figure pct00063
IVa-049a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00064
IVa-050a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-4-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00065
IVa-051a 2-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,4-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00066
IVa-052a 2-(3-카복시메틸-2,5-디히드록시페닐)-4-(3,5-디히드록시페닐)-1,3,5-트리아진 CH2COOH
Figure pct00067
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며, 여기서:
(A)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H이고; R3 = R5이고;
R5 = R7 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 벤조헤테로아릴이거나;
또는
(B)
Ra, Rb = H이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R3 = H이고; R2 = R5이고;
R5 = R7 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 벤조헤테로아릴이다.
제10 실시형태에 따르면, 본 발명은 표 10에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00068

R3 = R5 = R7
화합물 No. 화합물 화학 명칭 R1 R3
Id-030a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산 COOH
Figure pct00069
Id-030a-E2 메틸 2-(4-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실레이트 COOEt
Figure pct00070
Id-030b 2-(2,5-디히드록시-4-설포페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산 SO3H
Figure pct00071
Id-031a 2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산 COOH
Figure pct00072
Id-031b 2-(2,5-디히드록시-4-설포페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산 SO3H
Figure pct00073
IIId-030a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산 CH2COOH
Figure pct00074
IIId-031a 2-(2,5-디히드록시-3-설포페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산 CH2COOH
Figure pct00075
B.
Figure pct00076

R2 = R5 = R7
IId-030a 2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산 COOH
Figure pct00077
IId-030b 2-(2,5-디히드록시-3-설포페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산 SO3H
Figure pct00078
IId-031a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산 COOH
Figure pct00079
IId-030a 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산 SO3H
Figure pct00080
IVd-030a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산 CH2COOH
Figure pct00081
IVd-031a 2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산 CH2COOH
Figure pct00082
바람직하게는, 본 발명은 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물을 제공하며, 여기서:
(A)
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R2 = H이고; R3 = R5이고;
R5 = R8 = (CH2)mX(CH2)pR9이고;
여기서 X = O, S, SO2, NH, NAc, 또는 N(CH2)qR9이거나;
또는
(B)
Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4; SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐 (구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
R3 = H이고; R2 = R5이고;
R5 = R8 = (CH2)mX(CH2)pR9이고;
여기서 X = O, S, SO2, NH, NAc, 또는 N(CH2)qR9이다.
제11 실시형태에 따르면, 본 발명은 표 11에 따른 화합물을 포함한다:
A.
Figure pct00083

R3 = (CH 2 ) m X(CH 2 ) p R 9
No. 화합물 화학 명칭 R1 Ra Rb m X p R9

IIIc-056a
 비스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민 COOH H H 1 NH 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-056b
4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸아미노)메틸)-2,5-디히드록시벤조산 SO3H H H 1 NH 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-056c
 화합물 267: 4-((2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸아미노)메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 NH 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IIIc-056d
비스(2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸)아민 SO3H H H 1 NH 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IIIc-057a N,N-비스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세타미드 COOH H H 1 NH(COCH3) 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-057b N-(2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸) N-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸) 아세타미드 SO3H H H 1 NH(COCH3) 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-057c N-(2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸) N-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸) 아세타미드 COOH H H 1 NH(COCH3) 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IIIc-057d N,N-비스(2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸)아세타미드 SO3H H H 1 NH(COCH3) 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IIIc-058a 4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 S 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-058b 4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산 SO3H H H 1 S 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-058c 4-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 S 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IIIc-058d
4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산; SO3H H H 1 S 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IIIc-059a 4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산; COOH H H 1 SO2 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-059b
4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산; SO3H H H 1 SO2 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-059c 4-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 SO2 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IIIc-059d 4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산 SO3H H H 1 SO2 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IIIc-060a 4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 O 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-060b 4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산; SO3H H H 1 O 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-060c 4-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 O 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IIIc-060d
4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산 SO3H H H 1 O 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IIIc-061a 트리스 (4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민 COOH H H 1 N(CH2)qR9
q = 1:
R9 =
4-카복시-2,5-디히드록시페닐		 1 4-카복시-2,5-디히드록시페닐
IIIc-061a-E3 트리스 (4-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐메틸)아민 COOEt H H (CH2)qR9q = 1:
R9 =
4-에톡시카복시-2,5-디히드록시페닐		 1 4-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐
B.
Figure pct00084

R2 = (CH 2 ) m X(CH 2 ) p R 9

IVc-056a
비스(3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민 COOH H H 1 NH 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-056b
3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸아미노)메틸)-2,5-디히드록시벤조산 SO3H H H 1 NH 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-056c
 3-((2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸아미노)메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 NH 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IVc-056d 비스(2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸)아민 SO3H H H 1 NH 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IVc-057a N,N-비스(3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세타미드 COOH H H 1 NH(COCH3) 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-057b N-(2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸) N-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸) 아세타미드 SO3H H H 1 NH(COCH3) 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-057c N-(2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸) N-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸) 아세타미드 COOH H H 1 NH(COCH3) 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IVc-057d N,N-비스(2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸)아세타미드 SO3H H H 1 NH(COCH3) 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IVc-058a 3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 S 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-058b 3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산 SO3H H H 1 S 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-058c 3-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 S 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IVc-058d 3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산 SO3H H H 1 S 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IVc-059a 3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 SO2 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-059b 3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산 SO3H H H 1 SO2 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-059c 3-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 SO2 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IVc-059d 3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산 SO3H H H 1 SO2 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IVc-060a 3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 O 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-060b 3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산 SO3H H H 1 O 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-060c 3-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산 COOH H H 1 O 1 2,5-디히드록시-3-설포페닐
IVc-060d
 3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산 SO3H H H 1 O 1 2,5-디히드록시-4-설포페닐
IVc-061a 트리스 (3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민 COOH H H 1 N(CH2)qR9
q = 1:
R9 =
3-카복시-2,5-디히드록시페닐		 1 3-카복시-2,5-디히드록시페닐
IVc-059a-E2-A4 메틸 3-((2,5-디아세톡시-3-메톡시카보닐페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디아세톡시벤조에이트 COOMe Ac Ac 1 SO2 1 2,5-디아세톡시-3-(메톡시카보닐)페닐
IVc-059a-E2 메틸 3-((2,5-디히드록시-3-메톡시카보닐페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-히드록시벤조에이트 COOMe H H 1 SO2 1 2,5-디히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐
IVc-059a-mpe2 2-모폴리노에틸 3-((2,5-디히드록시-3-(2-모폴리노에톡시카보닐)페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-히드록시벤조에이트 COORR=2-모폴리노에틸 H H 1 SO2 1 2,5-디히드록시-3-(2-모폴리노에톡시카보닐)페닐
IVc-061a-E3 트리스 (3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민 COOEt H H 1 N(CH2)qR9
q = 1:
R9 =
3-에톡시카보닐-2,5-디히드록시-페닐		 1 3-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐
또 다른 실시형태에 따르면, 본 발명은 표 12에 따른 화합물을 포함한다:
화합물 No. 화합물 화학 명칭 구조
V-001a 4-(3-(2,5-디히드록시-4-카복시페닐카바모일)-5-히드록시벤즈아미도)-2,5-디히드록시 벤조산
Figure pct00085
V-001a 디에틸 에스터 4-(3-(4-(에톡시카보닐)-2,5-디히드록시페닐카바모일)-5-히드록시벤즈아미도)-2,5-디히드록시벤조산 에틸 에스터
Figure pct00086
V-002a 2-히드록시-5-(3-히드록시-5-(4-히드록시-3-카복시페닐카바모일)벤즈아미도)벤조산
Figure pct00087
V-002a 디에틸 에스터 5-(3-(3-(에톡시카보닐)-4-히드록시페닐카바모일)-5-히드록시벤즈아미도)-2-히드록시 벤조산 에틸 에스터
Figure pct00088
V-003a 4,4'-카보닐비스(아잔디일)비스(2,5-디히드록시벤조산)
Figure pct00089
V-003a 디에틸 에스터 디에틸 4,4'-카보닐비스(아잔디일)비스(2,5-디히드록시벤조에이트)
Figure pct00090
본 발명은 또한 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물의 제조 공정에 관한 것으로서, 이는 다음을 포함한다
단계 (a): NMI의 존재 하에 상응하는 아실 클로라이드에 의해 또는 아미드 커플링제 예컨대 TCFH를 사용하여 페놀성 작용기로 보호된 하이드로퀴논-유래 카복실산을 다양한 작용기가 있는 아닐린과 커플링;
단계 (b): 전형적으로 비누화 반응에 의한 에스터 작용기의 탈보호; 및
단계 (c): 전형적으로 촉매적 수소화에 의한 페놀성 작용기의 탈보호.
또는, 대안적으로,
단계 (d): 페놀성 작용기로 보호된, 하이드로퀴논-유래 카복실산을 환원시켜 벤질 알코올 생산
(e) 벤질 알코올 작용기의 활성화 및 다양한 작용기를 갖는 벤질 친핵체(nucleophile)(알코올, 티올, 1차 또는 2차 아민)로 치환;
(f) 전형적으로 비누화 반응에 의한 에스터 작용기의 탈보호; 및
(g) 전형적으로 촉매적 수소화에 의한 페놀성 작용기의 탈보호.
상기 공정은 개략적으로 하기와 같이 표시된다:
Figure pct00091
본 발명의 하이드로퀴논 유도체 화합물은 광학적으로 활성인 형태(입체이성질체), E/Z 이성질체,　거울상 이성질체, 라세미체, 이의 부분입체이성질체, 및 이의 수화물 및 용매화물로서 존재할 수 있다. 화합물의 용매화물은 화합물의 분자와 사용된 불활성 용매 사이의 상호 인력 때문이다. 용매화물, 예컨대, 일수화물, 이수화물, 또는 알코올산염.
본 발명의 하이드로퀴논 유도체는 또한 약학적으로 허용되는 염으로서 존재할 수 있으며, 여기서 모(parent) 하이드로퀴논 유도체는 이의 산성 또는 염기성 염을 제조함으로써 변형된다.
약학적으로 허용되는 염의 예는 특히 염기성 잔기의 무기 또는 유기산 염, 예컨대 아민; 및 산성 잔기의 알칼리성 또는 유기산 염, 예컨대 카복실산 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 비-독성 유기 또는 무기산으로부터의 화합물의 모든 투여 경로에 적합한 통상적인 비-독성 염 또는 4차 암모늄 염을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 통상적인 비-독성 염은 무기 염, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산(sulfamic acid), 인산, 질산 등으로부터 유도된 것들; 및 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타타르산, 시트르산, 아스코르브산, 파모산, 말레산, 히드록실산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시-벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄디설폰산, 옥살산, 이세티온산, 트리플루오로아세트산 등으로부터 제조된 염을 포함한다.
약학적으로 허용되는 염은 양이온 및 음이온에 대해 문헌["Pharmaceutical salts: A summary on doses of salt formers from the Orange Book. Saal C, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 49, 614-623]에 기술되어 있다. 양이온의 예시로서, 알루미늄, 아르기닌, 벤자틴, 칼슘, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, 리신, 마그네슘, 히스티딘, 리튬, 메글루민, 포타슘, 프로카인, 소듐, 트리에틸아민, 아연을 들 수 있다. 음이온의 예로서, 아세테이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 베실레이트, 바이카보네이트, 바이타르트레이트, 브로마이드, 캄실레이트, 카보네이트, 클로라이드, 시트레이트, 데카노에이트, 에데테이트, 에실레이트, 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜레이트, 헥사노에이트, 히드록시나프토에이트, 요오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토바이오네이트, 말레이트, 말리에이트, 만델레이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 뮤케이트, 나프실레이트, 니트레이트, 옥타노에이트, 올리에이트, 파모에이트, 판토테네이트, 포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 아세테이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 테오클레이트, 토실레이트를 들 수 있다. 대안적으로, 양쪽이온(zwiterion)은 양이온 반대이온으로서 유리 아미노산 아르기닌 또는 리신과 음이온 반대이온으로서 글루타메이트 또는 아스파테이트와 같은 염으로서 사용될 수 있다. 아르기닌 또는 리신의 반복 단위로서 짧은 펩타이드(2 내지 20개 아미노산) 및 다른 중성 아미노산과의 이들의 조합. 이러한 양이온 세포 투과성 펩티드(CPP: cell penetrating peptide)는 약물이 세포 내로 침투하기 위한 증강제로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 유용한 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 통상적인 화학적 절차에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물(parent compound)로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 상기 염은 유리산 또는 이들 화합물의 염기성 형태를 물 또는 유기 용매, 또는 이 둘의 혼합물에서 화학양론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조될 수 있으며; 일반적으로, 비-수성 매질 예컨대 에터, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세토니트릴이 바람직하다. 그 개시내용이 본원에 인용되어 포함된, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418]에서, 적합한 염의 목록이 제시되어 있다.
본 발명에 따르고 다양한 실시형태에서 본원에 기술된 적합한 투여량은 대상체의 상태, 연령 및 종에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 수의학적 및 인간 약제 둘 모두에서 사용되는 총 일일 투여량은 적합하게는 0.01 내지 2000 mg/kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 1000 mg/kg 체중, 바람직하게는 1 내지 100 mg/kg의 범위일 것이며, 이들은 단일 또는 분할 용량으로 투여될 수 있으며, 또한 상한선이 표시된 경우에도 또한 초과될 수 있다. 이러한 투여량은 투여되는 특정 화합물, 투여 경로, 치료되는 상태, 및 치료되는 환자를 포함하여 각각의 경우에 개별 요구사항에 맞게 조정될 수 있다. 그러나, 화합물은 또한 매주, 매월 또는 더 긴 간격으로 데포(depot) 제제(이식물, 서방성 제형 등)로서 투여될 수 있다. 이러한 경우 투여량은 1일 투여량보다 훨씬 높을 수 있으며 투여 형태, 체중 및 구체적인 적응증에 따라 조정될 수 있다. 적절한 투여량은 통상적인 모델 시험, 바람직하게는 동물 모델 시험을 수행함으로써 결정될 수 있다. 일반적으로, 체중이 약 70 kg인 성인에게 경구 또는 비경구 투여하는 경우, 1일 투여량은 약 10 mg 내지 약 10.000 mg, 바람직하게는 약 200 mg 내지 약 1000 mg이 적절해야 하지만, 지시되는 경우 상한은 초과될 수 있다. 상기 치료적 유효 투여량은 단일 투여의 결과일 필요는 없고 일반적으로 복수의 단위 용량의 투여의 결과인 것으로 이해되어야 한다. 이러한 단위 용량은 이제 1일 또는 매주 투여량의 일부를 포함할 수 있으며, 따라서, 치료 유효 용량은 치료(접촉) 기간에 걸쳐 결정된다. 예를 들어, 경구 투여의 경우, 1일 용량은 체중의 약 0.04 내지 약 1.0 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.04 내지 약 0.20 mg/kg/일, 보다 더 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.15 mg/kg/일, 가장 바람직하게는 약 0.1 mg/kg 체중일 수 있다. 일반적으로, 투여되는 활성 물질의 양은 원하는 혈장 농도를 달성하고, 바람직하게는 유지하기 위해 비교적 넓은 범위에 걸쳐 변할 수 있다. 활성 성분의 단위 투여 형태는 이의 약 0.1 밀리그램 내지 약 15 밀리그램을 함유할 수 있다. 바람직한 단위 투여 형태는 약 0.1 내지 약 1 밀리그램의 제제를 함유하고 하루에 2 내지 5회 투여될 수 있다. 그러나, 전술한 혈장 농도를 유지하도록 설계된 속도로 연속 주입과 같은 다른 대안적 경로도 또한 고려된다는 점에 유의해야 한다. 특정 치료의 지속기간은 또한 질병의 중증도, 치료가 급성 징후를 위한 것인지 또는 예방 목적을 위한 것인지 여부 등의 고려사항에 따라 달라질 수 있다. 전형적인 투여는 약 5 내지 약 14일의 기간 동안 지속되며, 7일의 시간 과정 일반적이다.
투여 과정(주기)은 또한 매월 간격으로 반복될 수 있거나, 비경구 단위 투여량은 매주 간격으로 전달될 수 있다. 경구 단위 투여량은 결정된 치료 유효 용량을 제공하기 위해 1일 내지 수 일 간격으로 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 적절한 투여량은 치료될 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 제제가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 환자의 병력, 및 화합물에 대한 반응, 및 담당 의사의 기준에 따라 달라질 것이다. 적절한 용량 또는 투여 경로의 결정은 분명히 현재 의사의 능력 범위 내에 있다. 동물 실험은 인간 요법의 유효 용량을 결정하기 위한 신뢰할 수 있는 지침을 제공한다. 유효량의 종 간(inter-species) 스케일링은 문헌[Mordenti, J. and Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics", in Toxicokinetics] 및 문헌[New Drug Development, editors Yacobi　et al., Pergamon Press, New York, 1989, pp. 42-96]에 의해 확립된 원칙에 따라 수행될 수 있다.
본 발명은 추가로 (i) 치료 유효량의 화학식 (I)의 하이드로퀴논 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 전구약물, 또는 입체이성질체, 및 (ii) 약학적으로 허용되는 부형제 또는 부형제들을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학 부형제는 통상적인 부형제, 예컨대 비제한적으로 가용화제, 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, pH 조절제, 투과 증진제, 방출 조절제, 보존제, 코팅제, 담체, 맛 은폐제(Taste masking agents) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 약학 성분과 함께 본 발명의 화합물의 약학 조성물은 액상 의약품, 고체 또는 반-고체 의약품, 및/또는 기체 의약품으로서 상기 부헝제와 함께 제형화될 수 있다.
고체 제형으로 존재할 때, 이들은 임의의 제한 없이 과립, 펠렛, 정제, 캡슐, 분말, 필름, 로젠지, 분쇄성 정제, 용해성 정제, 붕해성 정제, 분산성 정제, 필름 코팅 정제 및 제어, 지속, 연장, 또는 임의의 위에서 언급한 고체 형식의 변형된 방출을 포함할 수 있다. 이러한 제형은 또한 즉시 방출, 지연 방출, 또는 변형 방출의 형태일 수 있다. 또한, 즉시 방출 조성물은 통상적인, 분산성, 씹을 수 있는, 구강 용해성, 또는 플래시 용융 제제, 및 매트릭스 또는 저장조 또는 매트릭스와 저장조 시스템의 조합을 형성하기 위해 친수성 또는 소수성, 또는 친수성과 소수성의 조합의 방출 속도 제어 물질을 포함할 수 있는 변형된 방출 조성물일 수 있다.
조성물은 직접 블렌딩, 건식 과립화, 습식 과립화, 균질화, 밀링, 미분화, 압출 및 구형화와 같은 기술 중 임의의 하나 이상을 사용하여 제조될 수 있다. 조성물은 비코팅, 필름 코팅, 당 코팅, 분말 코팅, 장용 코팅 및 변형된 방출 코팅으로서 제공될 수 있다. 액체 제형으로 존재할 때, 이들은 용액, 현탁액, 나노현탁액, 분산액, 콜로이드, 에멀젼, 로션, 크림, 연고, 팅크제(tincture) 및 동결-건조 조성물과 같은 임의의 액체 형태를 제한 없이 포함할 수 있다. 이들이 기체 제형으로 존재할 때 이들은 밀링 분말 또는 블렌드, 미분화 분말, 또는 블렌드, 나노현탁액, 에어로졸, 스프레이, 액적, 미스트, 분무 용액 또는 현탁액, 및/또는 원자화된 증기를 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 원하는 경우 비히클, 결합제, 향수, 향미제, 감미료, 착색제, 방부제, 항산화제, 안정화제, 및 계면활성제와 같은 임의의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물 및 화합물은 경구 경로와 같은 경장 경로; 정맥내, 피하, 안구 내, 근육 내 또는 복강 내 주사와 같은 주사를 통한 비경구 경로; 안구 경로, 설하/협측 경로를 포함하는 점막 및 경점막 경로와 같은 국소 경로; 및 폐, 비강, 비강 내, 기관지 내, 폐 내 경로를 통한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 안구 투여 경로는 국소 안구 투여, 안구 내, 유리체 내(intravitreal), 또는 구후(retrobulbar) 투여를 포함한다.
본 발명에 따른 화합물의 바람직한 제형은 액체 경구 제형, 안구 제형, 및 정맥 내 및 복강 내 제형을 포함한다.
액체 경구 제형은 경구 약물 투여를 위한 용액 및 현탁액 형태가 일반적이고, 편리하며, 안전한 것으로 간주된다. 이는 비교적 많은 양의 약물을 전달하는 데 사용될 수 있으며 소아 인구와 정제 또는 캡슐을 삼키는 데 어려움을 겪는 사람들에게 자주 사용된다. 위장관을 통한 도입은 빠른 용해와 약물 흡수를 제공하지만, 내약성과 위장관의 다른 물질과의 상호작용이 고려되어야 한다. 활성 약학 성분(API: active pharmaceutical ingredient)의 특성은 단순한 수성 기반 경구 용액으로 제형화될 수 있지만 API가 잘 녹지 않는 경우, 제형은 용해도 및 생체이용률을 향상시키기 위해 분자를 중심으로 설계되어야 한다. 계면활성제, 용매, 완충액 및 오일의 도입은 용해도를 증가시키고 위액과의 상호작용에 따른 침전 및/또는 분해를 감소시킨다. 현탁액이 필요한 경우, 입자 크기는 종종 약물 용해도, 투과 및 궁극적으로 약물 흡수를 향상시키기 위해 감소되고 제어된다. 제형 개발이 진행됨에 따라, 보존제와 향미제가 도입되어 환자에게 적합하게 하고 유통 기한이 적절하게 되도록 한다.
안과용 제형은 눈에 직접 전달되는 안과용 제형이며 용액 또는 현탁액 형식의 액체인 경우가 많다. 눈에 투여하면 위장관에 의한 대사를 방지하고 경구 투여 시 잘 흡수되지 않는 약물에 대해 사용될 수 있다. 점안액은 눈 자극을 피하기 위해 4 내지 8의 공칭 pH를 가진 멸균 및 등장액이다. 가용화제, 킬레이트제, 중합체, 계면활성제, 투과 증진제 및 사이클로덱스트린을 비롯한 부형제가 제형에 첨가되어 안정성을 개선하고, 점도를 수정하거나, 용해도, 투과성, 및 난용성 약물의 생체이용률을 증가시킨다.
정맥 내 제형은 즉각적인 반응을 위해 환자 시스템에 도달하는 전체 용량의 비경구 약물 전달 후 빠른 흡수를 가능케 한다. 이러한 도입 방식은 위장관에 의한 대사를 회피하고 경구 투여 시 잘 흡수되지 않는 약물에 사용될 수 있다. 주사제는 전형적으로 멸균된 등장성 수성 용액이며 투여 시 통증을 유발하지 않도록 설계된다. 난용성 약물의 경우, 유기 공용매, 계면활성제, 및 완충제로 제형을 변형하여 용해도를 증가시키고 나노 현탁액 제형도 가능케 한다. 용액에서 불안정한 분자의 경우, 제형은 사용 지점에서 희석을 위해 동결건조될 수 있다.
본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 하나 이상의 화합물 또는 이의 제형을 포함하는 조성물 및 상기 조성물 또는 제형의 투여를 위한 전달 장치를 포함하고 사용 설명서를 포함하는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는, 키트를 제공한다.
본 약학 조성물을 제조하기 위해, 본 발명에 따른 활성 성분은 통상적인 약제학적 배합 기술에 따라 약학적으로 허용되는 담체, 보조제 및/또는 부형제와 혼합될 수 있다. 본 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체는 임의의 표준 약학 담체, 예컨대 인산염 완충 염수 용액, 물, 및 에멀젼, 예컨대 유/수(oil/water) 또는 수/유(water/oil) 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제를 포함한다. 조성물은 추가로 고형 약학 부형제 예컨대 전분, 셀룰로스, 활석, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 소듐 클로라이드, 건조 탈지유 등을 함유할 수 있다. 액체 및 반고체 부형제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 물, 에탄올, 및 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 비롯한 다양한 오일로부터 선택될 수 있다. 특히 주사용 용액을 위한 액체 담체에는 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 및 글리콜을 포함한다. 담체, 안정화제, 및 보조제의 예는, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, edited by E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990)]을 참조한다.
조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 용매의 예는 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients (Ninth Edition, Pharmaceutical Press, London and American Pharmacists Association, Washington, 2020)], [Aulton's Pharmaceutics, The Design and Manufacture of Medicines. (Fifth edition, Editors: Kevin Taylor and Michael Aulton, Elsevier, 2017)],["　Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed." (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker)] 및 ["　Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems" (ANSEL et al., 1994 et 2011, WILLIAMS & WILKINS)]과 같은 참고서에서 확인할 수 있다. 본 조성물에 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 용매의 비-제한적인 예는, 비제한적으로 프로필렌 글리콜(1,2-디히드록시프로판, 2-히드록시프로판올, 메틸 에틸렌 글리콜, 메틸 글리콜 또는 프로판-1,2-디올로도 공지됨), 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 글리콜, 크레모포어(cremophor) EL 또는 임의의 형태의 폴리에톡실화된 캐스터유, 디프로필렌 글리콜, 디 이소솔비드, 프로필렌 카보네이트, N-메틸피롤리돈, 글리코푸롤, 테트라에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 지방산 에스터, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 따른 화합물은 항-섬유성, 항-염증성 및 항혈관신생 효과를 입증하였다. 이하 본원에 열거된 몇 가지 질환은 오직 하나뿐만 아니라 2개 또는 심지어는 3개의 표적을 포함한다. 질환 카테고리는 전-우세한(pre-dominant) 혈관신생(혈관), 염증성 및/또는 섬유성 병리생물학을 나타낸다.
일부 실시형태에서 본 발명은 본 발명에 따른 화합물의 전구-약물에 관한 것이다. 이러한 전구약물의 이점은 예컨대 예를 들어, 비경구 전달 또는 경구 전달을 위한 더 나은 수 용해도를 생성할 적합한 절단 가능한 작용기를 첨가함으로써, 당업자에게 공지된 방법에 의해 수득된다.
매우 극성이고 하전된 특성을 나타내는 본 발명의 분자용 전구약물은 이러한 작용기가 생물학적 막을 통한 수동 투과성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 극성 및 하전된 약물의 주요 장애물은 낮은 막 투과성으로 인해 종종 낮고 가변적인 경구 흡수 및 낮은 경구 생체이용률로 이어진다. 또한, 극성 및 하전된 약물의 경구 흡수는 종종 종간 상당한 변동성과 관련이 있다. 투과성이 낮은 약물은 또한 국소 투여 후에도 특정 표적 기관에서 낮은 노출 수준을 보인다. 막 투과성 개선은 현재까지 전구약물 연구에서 가장 유익한 분야 중 하나였다.
눈에 대한 국소 경로 장벽, 구강 점막 장벽, 전달체 효과 또는 기타 국소 용도를 극복하기 위해 본 발명에 따른 약물에 대해 상이한 전구약물 전략이 개발되었다.
전구약물 전략은 1958년(문헌[Albert, A. Chemical aspects of selective toxicity. Nature, 1958, 182, 421-422])에 Adrian Albert에 의해 공식적으로 인정되었지만 메테나민, 페나세틴 및 프론토실에 의해 예시된 바와 같이, 이전 세기 초반에 시작되었다. 전구약물은 약리학적 활성이 거의 또는 전혀 없는 분자이지만 우연히든 의도적으로든 생체 내에서 활성 약물로 생물전환을 허용하는 내재된 구조적 불안정성을 가지고 있다. 전환은 화학적 또는 효소적 과정 또는 이 둘의 조합을 통해 발생할 수 있다. 활성 분자는 종종 적절한 생물학적 표적으로의 전달에 상당한 문제를 일으키는 바람직하지 않은 물리화학적 특성과 연관된다.
약물의 구조적 변형을 통해 수득된 전구약물은 분자의 고유한 물리화학적 특성에 영향을 주어 전달이 가능하도록 설계되었다. 이러한 개발이 발견 단계에서 새로운 분자의 설계에 항상 통합되는 것은 아니다. 종종 아날로그 최적화가 선호되는 경로이다. 초기 전구약물 전략을 실행하면 보다 신속한 임상 개발과, 궁극적으로 의약품의 상업화가 가능할 수 있다.
모 약물의 가장 일반적인 작용기에 대한 전구약물 전략은 문헌[Rautio J, 2018 (Jarkko Rautio et al, Nature Reviews Drug Discovery, 2018, 17, 559-587)]에 기술되어 있다. 이러한 검토는 현대 약물 설계 및 개발에서 전구약물의 역할이 확대되는 것과 모 약물에서 가장 일반적인 작용기에 대한 전구약물 전략에 대해 설명한다.
전구약물의 이점은 예를 들어 비경구 전달 또는 경구 전달을 위한 더 나은 수 용해도를 생성할 적절한 절단 가능한 작용기를 추가함으로써 수득된다. 반면에 극성이 매우 높고 하전된 분자의 경우, 이러한 작용기는 생물학적 막을 통한 수동 투과성에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 극성 및 하전된 약물의 주요 장애물은 낮은 막 투과성으로 인해 종종 낮고 가변적인 경구 흡수 및 낮은 경구 생체이용률로 이어진다.
또한, 극성 및 하전된 약물의 경구 흡수는 종종 종간 상당한 변동성과 관련이 있다. 투과성이 낮은 약물은 국소 투여 후에도 특정 표적 기관에서 낮은 노출 수준을 보인다. 막 투과성 개선은 현재까지 전구약물 연구에서 가장 유익한 분야 중 하나였다. 많은 전구약물 전략을 적용하여 모약물의 친유성에 영향을 줄 수 있다. 약물의 친유성은 단쇄 탄화수소 프로모이어티(promoietiy)에 의해 극성 및 이온화된 기능을 마스킹함으로써 개선되었다. 친수성 히드록실, 카복실, 포스페이트 또는 아민 및 기타 음전하 또는 양전하를 띤 기는 유비쿼터스 에스테라제 또는 펩티다제에 의해 체내에서 모 약물로 빠르게 다시 가수분해되는, 보다 친유성인 알킬 또는 아릴 에스터 또는 N-아실 유도체로 성공적으로 전환되었다.
대부분의 친유성 전구약물은 막 투과성과 경구 흡수를 개선하기 위해 개발되었다. 피부나 눈을 통해 흡수되는 모약물의 국소 투여를 개선하기 위해 동일한 전구약물 전략이 적용될 수 있다. 눈에 국소 투여하는 동안, 전구약물은 점적 후 각막에 쉽게 침투하여 안구 카복실에스테라제에 의해 주로 가수분해된다.
전구약물은 또한 담체-매개 수송을 이용할 수 있다. 이러한 수송체는 중요한 극성 내인성 영양소의 섭취와 혈관외유출을 조절하는데 중요한 역할을 하는 막 단백질이다. 이들의 특이성은 내인성 기질에 국한되지 않으며, 내인성 기질과 구조적으로 매우 유사한 약물은 또한 수송체에 의해 세포막을 가로질러 운반될 수 있다. 담체-매개 수송은 극성 및 하전된 약물이 생물학적 막을 가로질러 무시할 수 있는 수동 확산을 가지기 때문에 특히 중요하다. 담체-매개 수송 기작을 이용할 수 있는 전구약물은 약물 설계에서 흥미로운 표적을 제공한다. 유사하게, 전구약물은 개선된 대사 안정성을 가져올 수 있다.
전구약물은 전형적으로 간 대사에 기인하는 대사 불안정성을 개선할 수 있다. 유사하게, 약물의 원치 않는 장 대사는 선택적인 전구약물 전략에 의해 극복될 수 있다. 이러한 불안정성은 전신 순환 및 그 표적에 도달하는 약물의 총량을 크게 감소시킬 수 있다. 전구약물은 빠른 대사를 피하기 위해 페놀과 같이 대사적으로 불안정하지만 약리학적으로 필수적인 작용기를 마스킹함으로써 활성 약물을 이러한 초회 통과(first-pass) 효과로부터 보호하는 데 사용될 수 있다.
불충분한 혈장 수준의 문제를 해결하고 작용 지속 시간을 연장하기 위해, 약물은 일반적으로 약물 방출을 제어하고 최대 효과를 피하고 작용을 연장하는 현탁액 및 중합체 매트릭스와 같은 제형에 의해 제어된다. 전구약물은 활성 약물의 방출 속도, 흡수 속도 또는 이의 조직 분포에 영향을 미치는 방식으로 활성 약물의 수 용해도 및 용해 특성을 수정함으로써 활성 약물의 제어 방출을 달성하는데 사용될 수 있다.
전구약물은 몇 주에서 몇 개월 동안 모 약물의 치료 혈장 수준을 유지하는, 여러 피하 또는 근육 내 서방성 데포 주사의 개발에 특히 유용하였다. 이들 전구약물은 전형적으로 지방산 에스터, 예를 들어 데카노에이트, 팔미테이트, 에난테이트, 사이피오네이트 또는 발레레이트이며, 이는 오일-기재 비히클에 제형화되어, 전구약물의 느린 방출을 초래하고, 따라서 모 약물의 처리를 조절한다. 이들 전구약물의 높은 친유성은 또한 혈액 및 조직 단백질에 결합하여, 효소 전환을 늦추고 결과적으로 전신 순환에서 활성 약물의 출현을 느리게 한다.
더 나은 표적화 및 더 낮은 부작용은 종종 산 불안정 전구약물을 갖는 엔도솜 또는 리소좀에서, 종양 조직의 산성 환경에서 절단된 전구약물 표적화로 달성된다. 또한 부위-특이적 효소를 사용하여 유사한 접근법을 달성할 수 있으며 전구약물은 효소가 가장 높은 농도에 있는 원하는 기관 또는 조직에서 주로 절단된다. 하전된 약물의 경우, 세포 내 절단은 표적 세포에 갇혀 있는 음전하 또는 양전하 약물의 높은 세포 농도를 유도한다.
눈에 대한 국소 경로 장벽, 구강 점막 장벽, 수송체 효과 또는 기타 국소 용도를 극복하기 위해 본 발명에 따른 약물에 대해 상이한 전구약물 전략이 개발되었다.
본 발명에 따른 약물은 하전된 극성기를 보유한다. 해결해야 할 문제는 투여 경로와 약물 작용의 장기 또는 단기 지속기간의 필요성에 따라 달라진다. 마우스뿐만 아니라 인간 조직 및 혈액 에스테라제에 의해 절단되는 전구약물의 예가 성공적으로 합성되었다.
본 발명의 화합물은 카복실산 작용기와 페놀기를 보유하고 있다. 이러한 기능에서 유도된 다양한 전구약물이 고려될 수 있다: 예를 들어, 카복실산은 가장 빈번하게 에스터로 전환되었다: 단순 알킬 에스터(메틸, 에틸, 이소프로필 및 더 긴사슬), 기능화된 알킬 에스터 예컨대 모폴리노알킬 에스터, 피롤리디노알킬 에스터, N-메틸피페라지노-알킬 에스터, 또한 아릴 에스터 예컨대 구아이아콜 유래 에스터; 혼합된 아세탈 에스터 예컨대 아실옥시메틸(또는 1-에틸) 또는 알콕시카보닐옥시메틸(또는 1-에틸) 에스터 및 (옥소디옥솔릴)메틸 에스터는 또한 카복실산에 대해 효율적인 전구약물 작용기이다. 다양한 에스터 및 기능화된 에터가 페놀 기반 전구약물로서 사용되었다: 단순 지방족 에스터, 방향족 에스터, 디카복실산의 반에스터, 아미노산 에스터, 카바메이트 에스터, 포스페이트 모노에스터, 포스포노옥시메틸 에터, 아실옥시메틸(또는 1-에틸) 에터, 알콕시카보닐옥시메틸(또는 1-에틸) 에터, 아미노아실옥시메틸 에터, 등.
따라서, 본 발명은 질환 또는 장애 자가면역, 면역학적, 류마티스성, 혈관 장애, 안과학적 장애, 섬유성 장애, 대사 및 위장 장애, 신경염증성 및 신경퇴행성 질환, 신생물 및 암 관련 장애, 호르몬 관련 질환 및 바이러스 및 박테리아 감염 질환으로 인한 면역학적 장애 및 이들의 합병증의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하며, 이는 치료 유효량의 상기된 바와 같은 본 발명의 화합물 및/또는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 약학 조성물 및 방법은 특히 인간 또는 비-인간 대상체인 대상체에 적합하다.
본 발명에 따른 화합물은 여러 화합물에 대해 제공된 바이오데이터에 기술된 바와 같이 개별 사이토카인 프로파일에 기초하여 질환을 표적화할 수 있다(도 3a 내지 d 참조). 다음의 웹 사이트 Open Targets Platform(URL: https://www.targetvalidation.org/, Denise Carvalho et al, Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue D1, 08 January 2019, D1056-D1065, https://doi.org/10.1093/nar/gky1133)은 현재 서지 정보를 기반으로 완전한 그림을 제공하며 질환 또는 사이토카인으로 검색될 수 있다.
두 가지 전형적인 예: (a) 당뇨병성 망막병증에 대한 질환 특이적 검색은 질환과 높은 상관관계를 나타내는 다음과 같은 사이토카인을 유발한다(도 3c). 세 가지 상위 사이토카인은 당뇨병성 망막병증 검색의 예로서 VEGFA 점수 = 1(혈관 내피 성장 인자 A), HFE 점수 = 1(항상성 철 조절 인자) 및 TNF 점수 = 0.86(종양 괴사 인자) 및 (b) VEGFA에 대한 검색은: 신경계 질환, 혈관 질환, 안과 질환, 망막병증 및 도 3d에 표시된 기타 여러 질병을 유발한다.
소그룹의 염증성 사이토카인에 대한 화합물의 효능을 설명하기 위해, 화합물의 효과를 인간 전혈(실시예 3.6) 및 LPS 유도 염증의 억제에 대한 IC50 값에 대해 평가하였다(표 13, μM 단위).
화합물 GM-CSF IFNγ IL-1b IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-9 IL-10 IL-12p70 IL-13 IL-17A IL-17F IL-18 IL-21 IL-33 TGF베타 TNFα TNFβ
Ia-001a 100 30.5 34.4 94.3 100 100 1.24 5.63 100 1.5 26.4 0.1 14.7 100 100 19.3 100 0.02 13.20
Ia-001a-Tz 100 100 100 7.99 100 100 0.75 8.63 26.1 32.4 32.1 0.11 46.5 100 100 23.6 100 0.63 53.00
Ia-001a-Tz/004a 3.4 0.61 100 4.91 100 100 3.04 8.48 19.5 12.2 1.5 0.02 2.4 46.6 0.3 1.67 100 0.002 3.02
Ic-001a-Tz2 100 1.38 100 9.45 100 100 0.52 9.13 100 29.1 0.12 0.31 0.15 33.9 32 0.23 100 0.1 0.41
Ia-001c 100 0.44 100 12.8 100 100 0.95 46.9 1.9 0.44 86.1 0.09 89.7 100 100 100 100 0.05 29.70
Ia-003a-Tz 100 2.95 100 43 100 100 1.41 3.62 6.94 1.26 89.6 0.07 83.9 100 1.49 72.2 100 0.18 55.00
Ic-007a 100 1.44 100 100 100 100 0.09 27.1 12.5 0.49 30.1 0.04 22.9 100 1.9 18.4 100 0.27 6.52
Ib-010a 100 2.22 33.3 2.74 100 100 1.02 11.58 100 0.27 100 0.42 100 100 67.8 31.3 100 0.31 49.30
Ib-010a-E3 100 2.79 100 36.2 100 100 0.24 26.8 100 0.84 33 0.52 34.2 100 100 20 100 0.98 38.20
Ia-015a 2.76 100 100 7.08 100 100 0.77 1.47 5.27 0.12 0.15 0.05 0.15 100 57.2 0.24 100 0.17 0.30
IIc-007a 26 0.11 100 12.8 100 100 0.05 2.14 17.9 3.37 0.25 0.01 0.26 100 9.41 0.18 100 0.03 0.29
IIc-009a 100 0.54 100 19.6 100 100 0.27 18.9 11.31 100 0.13 0.001 0.13 2.95 8.01 0.29 100 0.11 6.94
IIa-053a 100 1.04 100 1.67 100 100 2.2 1.41 100 0.27 29.9 100 28.8 100 100 12.1 100 0.02 91.50
IIIa-001aTz 100 18.9 100 100 100 100 1.98 3.01 7.78 0.48 0.15 0.17 0.16 27.7 3 0.14 100 0.31 0.23
IIIa-013a 27.8 0.15 100 57.1 100 100 3.55 11.9 37.3 0.5 0.37 0.15 0.41 100 1.63 1.11 100 0.51 0.89
IIIc-057a 100 0.9 16.2 24.2 100 100 0.19 11.1 100 0.73 4.73 1.32 5.06 100 1.56 2.93 100 0.15 1.58
IIIc-061a 31.2 2.48 100 100 100 100 0.18 8.85 17.9 37.2 0.31 0.04 0.32 32.4 6.38 0.31 100 0.03 0.81
IVc-058a 100 10.6 27.5 3.82 100 100 0.21 31.1 16.4 4.23 55.9 0.1 86.8 100 3.2 33.9 100 0.18 59.30
IVc-059a 100 4.34 38.6 21.2 100 100 0.11 0.4 1.31 42 100 0.16 100 100 1.87 27.5 100 0.16 0.33
IVc-059a-E2-A4 1.83 3.5 14.1 10.4 100 100 0.99 2.9 16.8 51.4 18.7 0.02 25.8 100 100 23.2 100 0.3 19.40
면역학/류마티스성/혈관 장애는 예를 들어 복막염(peritonitis), 가와사키병(KD: Kawasaki disease), 다카야수 동맥염(TA: Takayasu arteritis), 현미경적 다발혈관염(MP: microscopic polyangiitis), 거대 세포 동맥염(GCA: giant cell arteritis), 항인지질 증후군(APS: antiphospholipid syndrome), 베체트병(BD: Behcet's Disease), 다발혈관염을 동반한 육아종증(GPA: granulomatosis with polyangiitis) 또는 베게너 육아종증(WG: Wegener's granulomatosis), 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis), 처그-스트라우스 증후군(EGPA: Churg-Strauss syndrome), 및 주사비(RO: rosacea)를 포함할 수 있다.
류마티스성 질환은 특히 관절의 힘줄, 인대 및 뼈에 영향을 미쳐 통증, 운동 상실, 및 염증을 동반한다. 이는 다양한 유형의 관절염 예컨대 골관절염(OA: osteoarthritis), 류마티스 관절염(RA: rheumatoid arthritis), 루푸스(lupus), 척추관절증(spondyloarthropathies): 강직성 척추염(AS: ankylosing spondylitis) 및 건성성 관절염(PsA: psoriatic arthritis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 통풍(Gout), 경피증(scleroderma), 감염성 관절염(Infectious arthritis), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica)을 포함한다.
복막염은 일반적으로 세균이나 진균 감염으로 인한 복막의 염증이다. 복막염에는 두 가지 유형이 있다. 첫 번째 유형은 간경변이나 신장 질환과 같은 간 질환의 합병증으로 발전할 수 있는 자발(spontaneous) 복막염이다. 2차(Secondary) 복막염은 복부 천공이나 다른 의학적 상태의 합병증으로 인해 발생할 수 있다. 복막염을 치료하지 않고 방치하면 심각하고, 잠재적으로 생명을 위협하는 감염으로 이어질 수 있다.
가와사키병은 몸 전체의 중간 크기의 동맥 벽에 염증을 일으킨다. 이는 주로 어린이에게 영향을 미친다. 염증은 심장 근육에 혈액을 공급하는 관상 동맥에 영향을 미치는 경향이 있다. 가와사키병은 감염 시 부어오르는 림프절, 피부, 및 입, 코, 및 목구멍 내부의 점막에도 영향을 미치기 때문에 종종 피부 점막 림프절 증후군이라고도 지칭된다.
다카야수 동맥염은 혈관 염증을 일으키는 질환군인 드문 유형의 혈관염이다. 다카야수 동맥염에서, 염증은 대동맥과 그 주요 가지를 손상시킨다. 이러한 질환은 동맥이 좁아지거나 막히거나 동맥류를 유발할 수 있다. 다카야수 동맥염은 또한 팔이나 가슴의 통증, 고혈압, 그리고 결국에는 심부전이나 뇌졸중을 유발할 수 있다. 동맥의 염증을 조절하고 합병증을 예방하려면 약물이 필요하다.
다발혈관염을 동반한 육아종증은 코, 부비동, 목구멍, 폐 및 신장의 혈관 염증을 유발하는 드문 질환이다. 이전에 베게너 육아종증이라고 불렸던, 이러한 상태는 혈관염이라고 하는 혈관 장애 군 중 하나이다. 이는 일부 기관으로 가는 혈류를 느리게 한다. 영향을 받은 조직은 육아종이라고 하는 염증 부위를 발달시킬 수 있으며, 이는 이러한 기관이 작동하는 방식에 영향을 미칠 수 있다. 치료하지 않으면, 상태가 치명적일 수 있다.
거대 세포성 동맥염은 동맥 내막의 염증이다. 대부분, 머리의 동맥, 특히 관자놀이에 영향을 미친다. 이러한 이유로, 거대 세포성 동맥염은 때때로 측두 동맥염이라고 지칭된다. 거대 세포성 동맥염은 종종 두통, 두피 압통, 턱 통증 및 시력 문제를 유발한다. 치료하지 않으면, 실명으로 이어질 수 있다.
항인지질 증후군은 면역 체계가 실수로 항체를 생성하여 혈액이 응고될 가능성을 훨씬 높일 때 발생한다. 이는 다리, 신장, 폐 및 뇌에 위험한 혈전을 유발할 수 있다. 임산부의 경우, 항인지질 증후군은 또한 유산과 사산을 유발할 수 있다. 항인지질 증후군에 대한 치료법은 없다. 사용 가능한 약물만이 혈전 위험을 줄일 수 있다.
베체트 증후군이라고도 불리는 베체트병은 혈관 염증을 일으키는 희귀 질환이다. 이 질환은 처음에는 관련이 없어 보일 수 있는 수많은 징후와 증상을 유발할 수 있다. 이는 구강 궤양, 눈 염증, 피부 발진 및 병변, 생식기 염증을 포함할 수 있다. 현재 치료는 베체트병의 증상을 줄이고 실명과 같은 심각한 합병증을 예방하는 데 도움이 될 수 있다.
처그-스트라우스 증후군은 혈관 염증이 특징인 장애이다. 이 염증은 장기와 조직으로 가는 혈류를 제한할 수 있으며, 때로는 영구적으로 혈류에 손상을 줄 수 있다. 이러한 상태는 다발혈관염을 동반한 호산구성 육아종증(EGPA)으로도 알려져 있다. 천식은 처그-스트라우스 증후군의 가장 흔한 징후이다. 이러한 장애는 고초열(hay fever), 발진(rash), 장출혈(gastrointestinal bleeding), 및 손과 발의 통증 및 마비와 같은 다른 문제를 일으킬 수 있다. 처그-스트라우스 증후군은 치료법이 없다. 현재 약물은 스테로이드 및 기타 강력한 면역억제제를 포함하여 증상을 조절하는데 도움이 된다.
주사비(rosacea)는 얼굴에 발적과 눈에 띄는 혈관을 유발하는 일반적인 피부 상태이다. 이는 또한 작고 붉고 고름이 가득한 혹(bump)을 생성할 수 있다. 이러한 징후와 증상은 몇 주에서 몇 달 동안 급격히 악화되었다가 잠시 동안 사라질 수 있다. 주사비는 여드름, 기타 피부 문제 또는 자연적인 홍반으로 오인될 수 있다. 주사비에 대한 치료법은 없지만, 치료를 통해 징후와 증상을 조절하고 줄일 수 있다. 골관절염은 전 세계적으로 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 가장 흔한 형태의 관절염이다. 이는 시간이 지남에 따라 보호 연골이 닳아 발생한다. 골관절염은 임의의 관절을 손상시킬 수 있지만, 이러한 장애는 가장 일반적으로 손, 무릎, 엉덩이 및 척추의 관절에 영향을 미친다. 관절 손상은 되돌릴 수 없지만, 골관절염 증상은 일반적으로 관리될 수 있다.
루푸스는 자가면역 질환이다. 이는 면역 체계가 신장을 포함한 자신의 조직과 기관을 공격하는 자가항체라는 단백질을 생성하도록 한다. 루푸스 신염은 전신홍반성 낭창(Systemic lupus erythematosus)(일반적으로 루푸스로 알려짐)이 있는 사람들의 빈번한 합병증이다. 루푸스 신염은 루푸스 자가항체가 신장 구조에 영향을 미칠 때 발생한다. 이는 신장 염증을 일으키고 소변의 혈액, 소변의 단백질, 고혈압, 신장 기능 손상 또는 신부전으로 이어질 수 있다.
경피증은 피부와 결합 조직이 경화되고 조여지는 것을 수반하는 희귀 질환군이다. 경피증의 다양한 유형이 존재한다. 일부 사람들에게는, 경피증이 피부에만 영향을 미친다. 그러나 많은 사람들에게, 경피증은 또한 혈관, 내부 장기 및 소화관(전신 경피증)과 같은 피부 이외의 구조에도 해를 끼친다. 경피증에 대한 치료법은 없다.
쇼그렌 증후군은 가장 흔한 두 가지 증상인 안구 건조와 구강 건조로 확인되는 면역 체계 장애이다. 이러한 상태는 종종 류마티스성 관절염 및 루푸스와 같은 다른 면역 체계 장애를 동반한다. 쇼그렌 증후군에서, 일반적으로 눈과 입의 점막과 수분-분비선이 먼저 영향을 받아 눈물과 타액이 감소된다.
감염성 또는 패혈성 관절염은 신체의 다른 부분에서 혈류를 통해 이동하는 세균으로 인해 발생할 수 있는 관절의 고통스러운 감염이다. 패혈성 관절염은 또한 동물에 물린 상처나 외상과 같은 관통 부상이 세균을 관절에 직접 전달할 때에도 발생할 수 있다. 인공 관절이 있는 사람도 패혈성 관절염의 위험이 있다. 무릎이 가장 일반적으로 영향을 받지만, 패혈성 관절염은 또한 엉덩이, 어깨 및 기타 관절에 영향을 미칠 수 있다. 감염은 관절 내 연골과 뼈를 빠르고 심각하게 손상시킬 수 있으므로, 신속한 치료가 중요하다.
이전에 소아 류마티스성 관절염으로 알려졌던 소아 특발성 관절염은 16세 미만 어린이에게 가장 흔한 관절염 유형이다. 소아 특발성 관절염은 지속적인 관절 통증, 부기 및 강직을 유발할 수 있다. 일부 어린이는 몇 개월 동안만 증상을 경험할 수 있지만, 다른 어린이는 수년 동안 증상을 경험할 수 있다. 일부 유형의 소아 특발성 관절염은 성장 문제, 관절 손상 및 눈 염증과 같은 심각한 합병증을 유발할 수 있다.
류마티스성 다발근통은 특히 어깨와 엉덩이에서 근육통과 강직을 유발하는 염증성 장애이다. 류마티스성 다발근통의 징후와 증상은 일반적으로 빠르게 시작되며 아침에 더 심해진다. 류마티스성 다발근통이 발병하는 대부분의 사람들은 65세 이상이다. 이러한 상태는 거대 세포성 동맥염이라는 또 다른 염증성 상태와 관련이 있다.
안과학적 장애는 예를 들어 제한 없이 연령 황반 변성(AMD:age macular degeneration 또는 ARMD, 건식 및 습식 형태), 익상편(PTE: pterygium), 당뇨병성 망막증(DR: diabetic retinopathy), 당뇨병성 황반 부종(DME: diabetic macular edema), 스타가르트병(SD: Stargardt disease), 증식성 유리체망막병증(PVR: proliferative vitreoretinopathy), 안구 건조 증후군(DYS: dry eye syndrome), 안구내염(endophthalmitis), 중심 장액 맥락망막병증(CSC: central serous chorioretinopathy), 색소성 망막염(RP: retinitis pigmentosa), 녹내장 및 녹내장 관련 합병증, 및 포도막염(UVE: uveitis)을 포함할 수 있다.
습식 황반 변성(Wet macular degeneration)은 시야가 흐려지거나 시야에 사각 지대를 유발하는 만성 안구 장애이다. 이는 일반적으로 황반으로 체액이나 혈액이 누출되는 비정상적인 혈관으로 인해 발생한다. 황반은 중심 시력을 담당하는 망막 부분에 있다. 습식 황반 변성은 두 가지 유형의 연령-관련 황반 변성 중 하나이다. 습식 유형은 항상 건식 유형으로 시작한다. 건식 황반 변성은 더 흔하고 덜 심각하다. 이는 또한 황반의 얇아짐으로 인해 중심 시력이 흐려지거나 감소한다. 건식 황반 변성은 먼저 한쪽 또는 양쪽 눈에서 발생하고 그 다음에는 양쪽 눈에 영향을 미칠 수 있다. 시력 상실은 전형적으로 중심 시력이지만 주변 시력에 유지된다.
당뇨병성 망막증은 눈에 영향을 미치는 당뇨병 합병증이다. 이는 망막의 혈관이 손상되어 발생한다. 처음에, 당뇨병성 망막증은 증상이 없거나 경미한 시력 문제를 일으킬 수 있다. 결국, 이는 실명을 유발할 수 있다. 이러한 상태는 1형 또는 2형 당뇨병이 있는 모든 사람에게서 발생할 수 있다. DME는 미세동맥류가 혈관벽에서 돌출되어 액체와 혈액이 망막으로 누출되거나 스며들어 황반에 부종을 일으키는 심각한 눈 합병증이다.
스타가르트병은 어린이와 젊은 성인에서 시력 상실을 일으키는 안과 질환이다. 이는 유전병이므로 부모로부터 자녀에게 유전된다. 스타가르트병은 황반 변성의 한 형태로 종종 청소년 황반 변성으로 불린다.
PVR은 열공 망막 박리(rhegmatogenous retinal detachment)의 합병증으로서 발전하는 질환이다. PVR은 1차 망막 박리 수술을 받는 환자의 약 8 내지 10%에서 발생하며 열공 망막 박리의 성공적인 외과적 수복을 방해한다. PVR은 박리된 망막을 다시 부착하는 수술로 치료될 수 있지만 수술의 시각적 결과는 매우 좋지 않다.
안구 건조 질환은 눈물이 눈에 적절한 윤활을 제공할 수 없을 때 발생하는 일반적인 상태이다. 눈물은 여러 가지 이유로 부적절하고 불안정할 수 있다. 예를 들어, 눈물을 충분히 생산하지 않거나 품질이 좋지 않은 눈물을 생산하는 경우 안구건조증이 발생할 수 있다. 이러한 눈물의 불안정성은 눈 표면의 염증과 손상을 유발한다.
안구내염은 안구 주사 또는 수술 후 발생할 수 있는 눈 내부의 염증이다. 징후는 전형적으로 흐릿한 시력 또는 시력의 기타 변화, 눈의 통증, 눈의 충혈, 빛에 대한 눈의 민감성 또는 눈물이다.
색소성 망막염(RP)은 눈 뒤쪽을 감싸고 있는 빛에 민감한 조직인, 망막에서 세포의 파괴 및 손실을 수반하는 희귀 유전 장애의 군이다. 일반적인 증상은 야간에 보기 어려움과 측면(주변) 시력 상실을 포함한다.
녹내장은 시신경을 손상시키는 안구 질환의 군으로서, 시신경의 건강은 좋은 시력에 매우 중요하다. 이러한 손상은 종종 비정상적으로 높은 안압으로 인해 발생한다. 녹내장은 60세 이상의 사람들에게 실명의 주요 원인 중 하나이다. 이는 모든 연령에서 발생할 수 있지만 노인에게 더 흔하다. 많은 형태의 녹내장에는 경고 징후가 없다. 그 영향은 상태가 진행 단계에 도달할 때까지 시력의 변화 없이 매우 점진적이다.
포도막염은 안구 염증의 한 형태이다. 이는 안구 벽 또는 포도막 조직의 중간 층에 영향을 미친다. 포도막염 경고 징후는 종종 갑자기 나타나며 빠르게 악화된다. 이는 눈의 충혈, 통증, 및 흐린 시력을 포함한다. 포도막염의 가능한 원인은 감염, 부상, 자가면역 또는 염증성 질환이다. 포도막염은 심각하여, 영구적인 시력 상실로 이어질 수 있다.
본 발명에 따른 화합물 및 약학 조성물은 또한 당뇨병성 망막증, 연령-관련 황반 변성, 녹내장, 및 색소성 망막염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 신경퇴행성 질환의 치료 및/또는 예방 방법에 사용될 수 있다.
망막 신경퇴행성 질환은 진행성 신경 손실을 특징으로 하는 망막 상태를 지칭한다. 당뇨병성 망막증, 연령-관련 황반변성, 녹내장, 및 색소성 망막염은 신경변성이 중요한 역할을 하는 망막질환으로 여겨진다.
이러한 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 화합물은, 망막 신경 퇴행성 질환의 국소 안구 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한, 치료될 상태의 치료 효능을 향상시키기 위해 특히 디펩티딜 펩티다제-4 억제제(DPPIV) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 함께 다른 활성제와 조합될 수 있다. DPPIV 억제제는 시타글립틴(sitagliptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 빌다글립틴(vildagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 아나글립틴(anagliptin), 테넬리글립틴(teneligliptin), 알로글립틴(alogliptin), 트렐라글립틴(trelagliptin), 게미글립틴(gemigliptin), 오마리글립틴(omarigliptin), 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물은 또한 환자가 필요로 하는 안구 내 항-VEGF 항체 주사 횟수를 감소시키기 위해 항-VEGF 치료와 유리하게 조합될 수 있다. 예를 들어 당뇨병성 망막증, 연령 관련 황반 변성과 같은 망막 신경퇴행성 질환이 있는 환자에 대한 투여는 이러한 질환의 진행을 늦추고 환자에게 필요한 항-VEGF 약물 요법을 감소시킨다.
섬유성 장애는 예를 들어 임의의 제한 없이, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 복막 후 섬유증(retroperitoneal fibrosis), 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 복합성 폐 섬유증 & 폐기종(CPFE: combined pulmonary fibrosis & emphysema), 호산구성 혈관심성 섬유증(eosinophilic angiocentric fibrosis), 장 섬유증(intestinal fibrosis), 난소 섬유증(ovarian fibrosis), 신장성 전신 섬유증(nephrotenic systemic fibrosis), 구강 점막 하 섬유증(OSMF: oral submucous fibrosis) 및 간 섬유증(liver fibrosis)을 포함할 수 있다.
낭포성 섬유증(CF)은 폐, 소화기 계통 및 기타 신체 기관에 심각한 손상을 일으키는 유전 장애이다. 이는 점액, 땀 및 소화액을 생성하는 세포에 영향을 미친다. 분비물은 윤활제 역할을 하는 대신 특히 폐와 췌장에서 관, 덕트 및 통로를 막는다.
폐 섬유증은 폐 조직이 손상되고 흉터가 생길 때 발생하는 폐 질환이다. 이러한 두꺼워지고 뻣뻣한 조직은 폐가 제대로 작동하는 것을 더 어렵게 만든다. 폐 섬유증과 관련된 흉터는 다양한 요인에 의해 유발될 수 있다. 폐 섬유증으로 인한 폐 손상은 복구될 수 없지만, 약물과 치료법은 때때로 증상을 완화하고 삶의 질을 개선하는 데 도움이 될 수 있다.
폐기종은 숨가쁨을 유발하는 폐 상태이다. 폐포가 손상되고, 시간이 지남에 따라, 폐포의 내벽이 약해지고 파열되어, 많은 작은 공기 공간 대신 더 큰 공기 공간이 생성된다. 이는 폐의 표면적을 감소시키고, 이어서, 혈류에 도달하는 산소의 양을 감소시킨다. 손상된 폐포가 제대로 작동하지 않아, 오래된 공기가 갇히고 신선한 산소가 풍부한 공기가 들어갈 공간이 없게 된다.
대사성 & 위장관 장애는 예를 들어 임의의 제한 없이 당뇨병 유발 합병증: 당뇨병성 신증(DN: diabetic nephropathy), 당뇨병성 망막증(DR: diabetic retinopathy), 당뇨병성 심근병증(DCDM: diabetic cardiomyopathy), 또는 당뇨병성 족부 궤양(DFU: diabetic foot ulcer)을 포함할 수 있다. 간 질환은 비알코올성 지방간 질환(NAFLD: Nonalcoholic fatty liver disease), 비알코올성 지방간증(NASH: Non alcoholic steatic hepatosis), 원발성 담즙성 담관염(PBC: primary biliary cholangitis), 간 섬유증(hepatic fibrosis) 또는 간경변(HF: hepatic fibrosis or cirrhosis), 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease): 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 장 섬유증(intestinal fibrosis)을 포함할 수 있다. 당뇨병성 신증 외에, 다른 신장 질환은 다낭성 신장 질환(PKD: polycystic kidney disease), 만성 신장 질환(CKD: chronic kidney disease), 신인성 전신 섬유증(NSF: nephrogenic systemic fibrosis) 및 췌장염(급성 및 만성)을 포함할 수 있다.
당뇨병성 신증은 제1 형 당뇨병과 제2 형 당뇨병의 심각한 신장-관련 합병증이다. 이는 당뇨병성 신장 질환이라고도 한다. 당뇨병 환자의 약 25%가 결국 신장 질환에 걸린다. 당뇨병성 신증은 신체에서 노폐물과 여분의 체액을 제거하는 일상적인 작업을 수행하는 신장의 능력에 영향을 미친다. 수 년에 걸쳐, 이 상태는 신장의 섬세한 여과 시스템을 천천히 손상시키고, 말기 신장 질환이라고도 하는 신부전으로 진행될 수 있다. 신부전은 생명을 위협하는 상태이다.
비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 알코올을 거의 또는 전혀 마시지 않는 사람들에게 영향을 미치는 다양한 간 상태에 대한 포괄적인 용어이다. 이름에서 알 수 있듯이, NAFLD의 주요 특징은 간 세포에 너무 많은 지방이 저장되어 있다는 것이다. 만성 간 질환의 가장 흔한 형태. NAFLD가 있는 일부 개인들은 간 염증으로 표시되고 진행성 반흔(간경변) 및 간부전으로 진행될 수 있는 공격적인 형태의 지방간 질환인 비알코올성 지방간염(NASH)이 발생할 수 있다. 이러한 손상은 과도한 알코올 사용으로 인한 손상과 유사하다.
원발성 담즙성 담관염은 간에 있는 담관이 천천히 파괴되는 만성 자가면역 질환이다. 담관이 손상되면, 담즙이 간에 역류하여 때때로 돌이킬 수 없는 간경변증을 유발할 수 있다. 유전적 요인과 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 이러한 질환을 유발한다.
IBD는 소화관의 만성 염증과 관련된 장애를 설명한다. IBD의 유형은 결장 및 직장의 표면 내벽을 따라 궤양을 수반하는 궤양성 대장염과, 종종 소화관의 더 깊은 층을 침범할 수 있는 소화관 내막의 염증을 특징으로 하는 크론병을 포함한다. 궤양성 대장염과 크론병 둘 모두는 일반적으로 설사, 직장 출혈, 복통, 피로, 체중 감소를 특징으로 하며 때로는 생명을 위협하는 합병증을 유발한다.
신생물 및 암 관련 장애는 예를 들어 임의의 제한 없이 췌장암: 대부분 섬유성, 신세포 암종, 방사선 유도 섬유증, 원발성 골수섬유증, 섬유형성증, 섬유육종, 간세포 암종, 망막모세포종, 안내 림프종, 및 흑색종(섬유조직형성, 결막, 포도막)을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 바이러스 단백질 헤파란 설페이트 결합 부위에 대한 결합을 통한 바이러스 감염의 치료, 예방 및 감소에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 성장 인자(FGF, VEGF 및 기타 성장 인자) 및 성장 인자 수용체(FGFR, VEGFR 및 기타)의 헤파란 설페이트 결합 영역과 상호작용한다. 많은 바이러스가 세포막에 결합된 헤파란 설페이트 모이어티에 대한 친화성을 사용하여 포유동물 세포와 상호작용하는 것으로 알려져 있다. 표면 단백질에 헤파란 설페이트(HS) 결합 도메인을 보유하고 있는 바이러스는 이러한 HS 친화성을 세포에 접근 및 감염시키고 세포에 부착된 헤파란 설페이트에 결합하는 주요 입구 문 중 하나로 사용한다. HS 바이러스에 부착되면 각 바이러스에 특이적인 다양한 침입 기작을 사용하여 세포를 감염시킬 수 있다. 단백질 및 특히 바이러스 단백질의 헤파란 결합 도메인과 본 발명에 따른 화합물의 강력한 상호작용은 혈액 세포, 혈관 및 기관을 둘러싸고 있는 내피 세포 뿐만 아니라 입, 비점막, 및 폐 및 또한 위장관에 존재하는 표면 상피 세포의 바이러스 감염을 예방한다. 몇몇 바이러스 종은 비제한적으로 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 인간 메타뉴모바이러스(human metapneumovirus), 인플루엔자(H1N1 등), 인간 리노바이러스(HRV: human rhinovirus), 호흡기세포융합 바이러스(RV: rhinosyncitial virus), 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus), 코로나바이러스 예컨대 CoV, SARS-CoV, MERS-Cov, COVID-19(SARS-CoV-2 및 이의 변이체)와 같이 헤파란 설페이트에 대해 높은 친화도를 갖는 것으로 알려져 있다. HS는 SARS-CoV-2 감염에 필요한 보조-인자이다. HS는 ACE2에 인접한 SARSCoV-2 스파이크 당단백질의 수용체-결합 도메인과 상호작용하여, 스파이크 구조를 개방형 구조로 이동시켜 ACE2 결합을 촉진한다. 바이러스성 및 박테리아 감염 질환은 또한 패혈성 쇼크, 수술이나 감염으로 인한 안구내염과 같은 눈의 염증을 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: 화합물 및 중간체의 합성
실시예 1.1: 유형 Ia의 분자: 모노아미드, 25개 실시예
Figure pct00092
합성 절차
반응식 1.
중간체 KI-1 및 KI-6의 합성
Figure pct00093
절차 :
KI-1 및 KI-6 의 합성(단계 [1],[2])
디에틸 2,5-비스(벤질옥시)테레프탈레이트 (KI-0)(단계 [1]) . 포타슘 카보네이트-325 메시(326.1 g, 2.4 mol)를 주위 온도에서 15분 동안 DMF(800.0 mL) 중의 디에틸 2,5-디히드록시테레프탈레이트(200.0 g, 0.79 mol)의 교반된 용액에 조금씩 첨가하였다. 이어서 벤질 브로마이드(280.0 mL, 2.4 mol)를 반응 플라스크에 적가 방식으로 30분에 걸쳐 첨가하고, 생성된 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 가열한 결과, 진한 크림색 침전물이 생성되었다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각하고 포화 수성 암모늄 클로라이드(2 L) 용액으로 처리하였다. 생성된 현탁액을 30분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 고체 물질을 포화 수성 암모늄 클로라이드(2 Х 200 mL) 용액으로 세척하였다. 이어서 고체를 에탄올(400 mL)에 현탁하고, 진공 오븐에서 여과 건조하여 백색 고체로서 원하는 생성물을 수득하였다(341.0 g, 0.785 mol, 99.8%)
UPLC-MS(산성 방법, 2분): rt = 1.36분, 이온화가 관찰되지 않음, 피크 영역 >95%
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.51-7.44 (m, 6H), 7.44-7.36 (m, 4H), 7.36-7.28 (m, 2H), 5.17 (s, 4H), 4.29 (q, J = 7.1 Hz, 4H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 6H).
2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조산( KI-1 ) 및 2,5-비스(벤질옥시)테레프탈산( KI-6 ) (단계 [2])
물(200.0 mL) 중의 포타슘 히드록시드(14.2 g, 0.25 mol) 용액을 1,4-디옥산(1 L) 중의 디에틸 2,5-비스(벤질옥시)테레프탈레이트(100 g, 0.23 mol) 용액에 신속하게 첨가하고, 생성된 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공에서 제거한 결과, 백색 슬러리가 형성되었다. 조(crude)를 EtOH(500 mL)에 현탁하고 여과하고 수집된 고체를 진공 오븐에서 건조하여 순수한 디에틸 2,5-비스(벤질옥시)테레프탈레이트(23.0 g, 0.053 mol, 23%)를 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.36분, 이온화가 관찰되지 않음, 피크 영역 98%
에탄올 여과액을 농축하여 오익을 수득하였다. 에틸 아세테이트(500 mL)를 첨가하여 침전물을 형성하고 이를 여과하고 에틸 아세테이트(200 mL)로 세척하여 백색 고체로서 2,5-비스(벤질옥시)테레프탈산(KI-6)을 수득하였다(18.9 g, 0.042 mol, 18%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.22분, m/z 377.1 [M-H]-, 피크 영역 95%
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.52-7.45 (m, 4H), 7.41-7.33 (m, 4H), 7.33-7.26 (m, 4H), 5.13 (s, 4H).
여과액을 소듐 카보네이트의 포화 수용액(200 mL), 수성 1 M 염산(500 mL) 및 염수(500 mL)로 세척한 다음, 건조하고(Na2SO4), 여과 및 농축 건조하여 백색 고체로서 2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조산(KI-1)을 수득하였다(53 g, 0.130 mol, 57.0%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.22분, m/z 405.3 [M-H]-, 피크 영역 96%
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.52-7.27 (m, 13H), 5.17 (s, 4H), 4.28 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
KI-1 합성을 위한 대규모 프로토콜
10 L 재킷 용기에 디에틸 2,5-비스(벤질옥시)테레프탈레이트(500.00 g, 1.15 mol), 1,4-디옥산(2.5 L), 포타슘 히드록시드(71.00 g, 1.26 mol) 및 물(500 mL)을 채웠다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. LCMS 분석에 따르면 반응이 절반 정도 완료되었으며 부산물(이-산(di-acid))과 출발 물질(디-에스터)의 비율이 (디에스터:일(mono)-산:이산(diacid) = 28:58:14)임을 나타냈다. (이산: 4.44 rt, 일산: 5.08 rt, 디에스터: 5.68 rt). 이 단계에서 용매를 진공에서 제거하였다. 조 생성물을 10 L 재킷 용기에서 에탄올:물(3L)의 2:1 혼합물에 넣고 밤새 교반하고 여과하여 다음을 수득하였다:
고체: (디에스터:일-산:이산 = 86:12:2, 110.00 g, 무색 고체)
여과액: (디에스터:일-산:이산 3:63:34)
여과액을 진공에서 농축하여 오일을 수득하였다. 이러한 오일을 에틸 아세테이트(2.5 L)에 녹이고, 10 L 재킷 용기에서 밤새 교반하고 여과하여 백색 고체를 수득하였다(150.00 g).
고체: (디에스터:일-산:이산 = 미량:40:60).
여과액을 수집하고, 소듐 바이카보네이트(100 mL)의 포화 수용액, 1 N 염산 용액(200 mL) 및 염수(200 mL)로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조하고 여과하였다. 용매를 감압 하에 제거하여 원하는 생성물인 2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조산(KI-1)을 백색 고체로서 수득하였으며, 이를 50℃의 진공 오븐에서 48시간 동안 건조하였다(225.00 g, 49% 수율)(수율은 49 내지 65% 사이로 다양함).
반응식 2: 중간체 KI-1Bn 합성
Figure pct00094
절차:
KI-1Bn 의 합성 :
2,5-비스(벤질옥시)-4-(벤질옥시카보닐)벤조산 (KI-1Bn) . 교반 하에 0℃에서 DMF(20 mL) 중의 2,5-디히드록시테레-프탈산(1.97 g, 10 mmol) 용액에 소듐 하이드라이드(2.0 g, 50 mmol)를 첨가한 다음, 5분에 걸쳐 벤질 브로마이드(5.95 mL, 50 mmol, 5 eq)를 적하 방식으로 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 유지하였다. 이어서 혼합물을 60℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 MeOH(5 mL)로 조심스럽게 처리하였다. 혼합물을 감압 하에 농축하고, 잔류 물질을 헵탄(3x)으로 동시-증발시켰다. 잔류물을 DCM(30 mL)에 녹이고, 유기상을 1 M HCl(25 mL)로 세척하고, 분리된 수성 층을 DCM(3x30 mL)으로 추출하고 합친 유기 상을 건조하고(MgSO4) 농축하였다. 조 고체를 EtOH(약 30 mL)에서 재결정화하여 순수한 KI-0Bn(2.286 g, 41%)을 수득하였다. KI-0Bn(282 mg, 0.5 mmol) 샘플을 1,4-디옥산(10 mL)과 리튬 히드록시드 히드레이트(22 mg, 0.52 mmol) 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 80℃로 3일 동안 가열하였다. 혼합물을 실온으로 냉각하고, AcOEt(30 mL)에 녹여 용액을 1 M HCl(2 mL)로 세척하였다. 유기상을 건조 및 농축하고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 약 16%의 디에스터 KI-0Bn으로 오염된 모노에스터 KI-1Bn을 수득하였다.
KI-0Bn: 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.51 (s, 2H), 7.36-7.30 (m, 20H), 5.34 (s, 4H), 5.11 (s, 4H).
KI-1Bn: 1H NMR (250 MHz, CDCl3): δ 7.86 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.41-7.30 (m, 20H), 5.36 (s, 2H), 5.26 (s, 2H), 5.16 (s, 2H).
모노아민의 합성
반응식 3. 모노아미드 Ia의 합성
Figure pct00095
아미드 커플링 [3A]에 대한 일반적인 절차
▷ KI-1 또는 KI-6으로부터, 아실 클로라이드를 통한 커플링
모델 반응(Ia-013a)
디메틸 2-(2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조일아미노)이소프탈레이트. 2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조산(KI-1, 1.1 g, 2.8 mmol)을 티오닐 클로라이드(6 mL) 중에 용해하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반하였다. DMF 몇 방울을 첨가하고, 생성된 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 과잉의 티오닐 클로라이드를 진공에서 제거하고 잔류물을 톨루엔(3 × 20 mL)으로 동시-증류하여 아실 클로라이드를 수득하였다. DCM(10 mL) 중의 아실 클로라이드 용액을 주위 온도에서 DCM(10 mL) 중의 아민 (디메틸 2-아미노이소프탈레이트, 210 mg, 3.1 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.53 mL, 3.045 mmol) 용액에 신속하게 첨가하고 반응물을 18시간 동안 교반하였다. 잔류물을 DCM(70 mL)으로 희석하고 1 M 수성 염산(100 mL), 물(100 mL)로 세척하고, 건조하고(Na2SO4), 여과하고 농축하여 조 생성물을 수득하였으며, 이를 이소-헥산 중의 에틸 아세테이트(0 내지 25%)의 구배로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 원하는 생성물을 수득하였다(1.24 g, 2.075 mmol, 75%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.37분; m/z = 598.2 [M+H]+, 피크 영역 >95%
1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6 ) δ 11.60 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.69 (s, 1H), 7.59 - 7.23 (m, 12H), 5.49 (s, 2H), 5.19 (s, 2H), 4.28 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.71 (s, 6H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
아미드 커플링 [3B]에 대한 일반적인 절차 B
▷ KI-1 또는 KI-6으로부터, 축합제를 사용한 커플링
모델 반응(Ia-001a)
메틸 2-(2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조일아미노)벤조에이트. 1-메틸이미다졸(13.0 mL, 163 mmol)을 주위 온도에서 MeCN(150 mL) 중의 2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조산(KI-1, 12.95 g, 32 mmol)과 메틸 안트라닐레이트(5.729 g, 38 mmol, 1.190 eq) 혼합물에 첨가하였다. 클로로-N,N,N',N''-테트라메틸포름아미디늄 헥사플루오로포스페이트(TCFH)(10.728 g, 0.038 mol)를 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 생성된 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 1 M 수성 염산(700 mL)으로 처리하였다. 생성된 현탁액을 10분 동안 교반한 다음, 여과하였다. 고체 물질을 물(2 Х 200 mL)로 세척하였다. 이어서 고체를 에탄올(200 mL)에 현탁하고, 여과하고, 에터(100 mL)로 세척하고 진공 오븐에서 건조하여 백색 고체로서 원하는 생성물을 수득하였다(14.7 g, 27 mmol, 86%)
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.43분; m/z = 540.2 [M+H]+, 피크 영역 >99%
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 11.87 (s, 1H), 8.65 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.98 (dd, J = 8.0, 1.7 Hz, 1H), 7.81 - 7.61 (m, 2H), 7.59 - 7.12 (m, 12H), 5.41 (s, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.28 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 1.27 (t, J = 7.1 Hz, 3H).0
일반적인 탈보호 절차 [4], [5]
비누화
모델 반응(Ia-013a)
2-(2,5-비스(벤질옥시)-4-카복시벤조일아미노)이소프탈산. 물(4 mL) 중의 리튬 히드록시드(42 mg, 1 mmol) 용액을 THF(6 mL) 중의 디메틸 2-(2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조일아미노)이소프탈레이트(100 mg, 0.167 mmol) 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 물(4 mL) 중의 추가의 LiOH(6 eq)를 반응 혼합물에 첨가하고 이를 추가 23시간 동안 교반하였다. 완료 후, 물(50 mL)을 반응에 첨가하고 혼합물을 에틸 아세테이트(50 mL)로 세척하였다. 수성 층을 1 M 수성 염산으로 산성화하여 pH=2로 만들고 에틸 아세테이트(2X 50 mL)로 추출하였다. 유기 층을 수집하고, 건조하고(Na2SO4), 여과하고 농축하여 백색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다(82 mg, 0.151 mmol, 91%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.02분; m/z = 542.1 [M+H]+, 피크 영역 >95%
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 13.18 (s, 2H), 11.74 (s, 1H), 8.00 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.71 (s, 1H), 7.58 - 7.43 (m, 5H), 7.40 - 7.24 (m, 7H), 5.47 (s, 2H), 5.14 (s, 2H).
탈벤질화
모델 반응(Ia-013a)
2-(2,5-디히드록시-4-카복시벤조일아미노)이소프탈산( Ia-013a) . Pd/C(94 mg, 10%)를 EtOH와 DCM의 10:30 혼합물 중의 2-(2,5-비스(벤질옥시)-4-카복시벤조일아미노)이소프탈산(0.94 g, 1.74 mmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 주위 온도 및 대기압에서 수소 하에 두고 18시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 셀라이트(Celite)를 통해 여과하고, 이를 DCM 및 MeOH로 세척하였다. 여과액 및 세척물을 합치고 감압 하에 농축하여 황색 고체로서 원하는 생성물 Ia-013a를 수득하였다(644 mg, 1.69 mmol, 98%).
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.91분; m/z =362.0 [M+H]+, 피크 영역 >98%
1H NMR (DMSO-d 6 ) δ: 13.11 (s, 2H), 11.70 (s, 1H), 11.13 (s, 1H), 7.97 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.41 (s, 1H), 7.38 (t, J = 7.7 Hz, 1H)
반응식 4a. KI-1Bn으로부터 모노아미드 Ia의 합성
Figure pct00096
KI-1Bn으로부터의 일반적인 절차
▷ 아실 클로라이드를 통한 커플링
모델 반응: Ia-032a의 합성
벤질 4-(2,5-비스(벤질옥시)-4-(벤질옥시카보닐)벤조일아미노)페닐아세테이트. DCM(10 mL) 중의 KI-1Bn(233 mg, 84% 순도) 용액에 SOCl2(1.8 mL, 60 eq)을 첨가하고 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 가열하였다. 용매를 증발시키고 톨루엔(3 × 10 mL)으로 동시-증발시켜서, 조 아실 클로라이드(237 mg, 99%)를 수득하였다. 이러한 물질을 DCM(3 mL) 중에 용해하고, 디이소프로필에틸아민(0.08 mL, 1.15 eq)을 첨가하고, 이어서 DCM(3 mL) 중의 벤질 4-아미노페닐아세테이트(92 mg, 0.95 eq) 용액을 첨가하였다. 최종 반응 부피는 10 mL이었다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 혼합물을 DCM(15 mL)으로 희석하고, 포화 수성 암모늄 클로라이드(12 mL)로 세척하였다. 분리된 수성 상을 DCM(2 × 2 mL)으로 추출하고, 유기상을 합치고, 건조하고(MgSO4), 농축하였다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피(Pet. Et./DCM 1:1 이어서 100% DCM에 대한 구배)에 적용하여 순수한 KI-0Bn의 제1 분획, 및 순수한 원하는 생성물(237 mg, 86%, KI-1Bn의 순도에 대해 보정됨)을 함유하는 제2 분획을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 10.10 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.53-7.30 (m, 20H), 7.22-7.13 (br AB, 4H), 5.39, 5.22, 5.21, 5.12 (4s, 4x 2H), 3.61 (s, 2H).
4-(4-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산 (Ia-032a). DCM(20 mL) 중의 상기 제조된 전구체(225 mg, 0.33 mmol) 용액에 탄(charcoal)(72 mg) 중의 5% Pd를 첨가하고, 이어서 EtOH(20 mL)를 첨가하였다. 플라스크를 Ar(3x)로 플러싱한 다음 수소(대기압)로 채우고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 촉매를 밀리포어 필터 상에서 여과하여 제거하고, 여과액을 증발시키고, 잔류물을 건조하여 연한 황색 고체로서 생성물 Ia-032a를 수득하였다(107 mg, 99%).
1H NMR (250 MHz, DMSO-d 6 ): δ 12.28 (br, 1H), 10.92 (s, 1H), 10.44 (s, 1H), 7.65 (br d, 2H), 7.41 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.25 (br d, 2H), 3.55 (s, 2H).
예를 들어:
Figure pct00097
조건 및 수율에 대해: 도 4a 내지 d를 참조한다
1) 4-(2-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-001a
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 0.95분, m/z = 316 [M-H]-, 피크 영역 > 97%
Figure pct00098
Figure pct00099
디에틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.39분, m/z = 372.2 [M-H]-, 피크 영역 > 98%
Figure pct00100
Figure pct00101
2) 4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-001aTz:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.17분; m/z =342.0 [M+H]+, 피크 영역 >96%
Figure pct00102
Figure pct00103
에틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.08분, m/z = 370.1 [M+H]+, 피크 영역 > 97%
Figure pct00104
Figure pct00105
에틸 에스터 디아세테이트:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): r.t = 1.57분, m/z = 454.1 [M+H]+, 피크 영역 > 97%
Figure pct00106
3) 2,5-디히드록시-4-(2-설포페닐아미노카보닐)벤조산, 화합물 Ia-001c:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.73분; m/z =352.0 [M-H]-, 피크 영역 >99%
Figure pct00107
4) 4-(3-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-002a:
Figure pct00108
5) 4-(3-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-002aTz:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.13분; m/z =342.0 [M+H]+, 피크 영역 >99%
Figure pct00109
6) 2,5-디히드록시-4-(3-설포페닐아미노카보닐)벤조산, 화합물 Ia-002c:
Figure pct00110
7) 4-(4-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-003a:
Figure pct00111
8) 4-(4-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-003aTz:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.79분; m/z =342.0 [M+H]+, 피크 영역 >97%
Figure pct00112
9) 2,5-디히드록시-4-(4-설포페닐아미노카보닐)벤조산, 화합물 Ia-003c:
Figure pct00113
10) 4-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-004a:
UPLC-MS (산성 방법, 6.5분): rt = 1.40분; m/z =332.0 [M-H]-, 피크 영역 >96%
Figure pct00114
에틸 메틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.16분, m/z = 376.1 [M+H]+, 피크 영역 > 95%
Figure pct00115
11) 4-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-006a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.81분; m/z =334.0 [M+H]+, 피크 영역 >96%
Figure pct00116
12) 3-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산, 화합물 Ia-011a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.69분; m/z = 360.1 [M-H]-, 피크 영역 >89%
Figure pct00117
13) 2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산, 화합물 Ia-012a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.12분; m/z = 362.1 [M+H]+, 피크 영역 >96%
Figure pct00118
14) 2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산, 화합물 Ia-013a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.91분; m/z = 362.0 [M+H]+, 피크 영역 >98%
Figure pct00119
Figure pct00120
15) 4-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산, 화합물 Ia-014a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.98분; m/z = 362.1 [M+H]+, 피크 영역 >94%
Figure pct00121
16) 5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산, 화합물 Ia-015a:
Figure pct00122
17) 3-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산, 화합물 Ia-023a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.63분; m/z = 319.1 [M+H]+, 피크 영역 >93%
Figure pct00123
Figure pct00124
디에틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): r.t = 1.87분, m/z = 375.1 [M+H]+, 피크 영역 > 98%
Figure pct00125
18) 4-(4-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-032a:
Figure pct00126
19) 4-(3-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-033a:
UPLC-MS (산성 방법, 6.5분): rt = 1.71분; m/z = 332.1 [M+H]+, 피크 영역 >99%
Figure pct00127
20) 4-(2-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-034a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.82분; m/z = 332.1 [M+H]+, 피크 영역 >98%
Figure pct00128
21) 4-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-035a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.02분; m/z = 320.1 [M+H]+, 피크 영역 >91%
Figure pct00129
22) 4-(2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-035a-2:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.77분; m/z = 332.0 [M-H]-, 피크 영역 >99%
Figure pct00130
23) 4-(1-카복시-2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-035a-3:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.70분; m/z = 376.0 [M-H]-, 피크 영역 >99%
Figure pct00131
24) 4-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-036a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.62분; m/z = 362.1 [M-H]-, 피크 영역 >92%
Figure pct00132
25) 4-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-053a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.08분; m/z = 332.0 [M+H]+, 피크 영역 >97%
Figure pct00133
Figure pct00134
반응식 4b. 에틸 4-아미노-2,5-디벤질옥시벤조에이트 (아닐린 A)의 합성
Figure pct00135
프로토콜: 아닐린 A 합성
에틸 4-아미노-2,5-디벤질옥시벤조에이트(아닐린 A). 불활성 대기(N2) 하의 THF(25 mL) 중의 2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조산(KI-1)(2.0 g, 4.9 mmol) 및 Et3N(1.6 mL, 11.3 mmol)의 냉각된 용액(얼음조(ice bath))에 DPPA(1.1 mL, 5.2 mmol)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 천천히 가온하고 상기 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서 물(8 mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 70℃로 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 소듐 히드로겐카보네이트(250 mL)의 포화 용액에 붓고 5분 동안 교반하고 EtOAc(3 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 무색 오일을 수득하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(이소-헥산/EtOAc 1:0 이어서 30% EtOAc에 대한 구배)로 정제하여 회백색 고체로서 표제 화합물 아닐린 A(1.0 g, 53%)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.26분; m/z = 378.2 [M+H]+, 피크 영역 94%
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ 7.54 - 7.46 (m, 4H), 7.44 - 7.36 (m, 4H), 7.35 - 7.25 (m, 3H), 6.46 (s, 1H), 5.65 (s, NH2), 5.06 (s, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.16 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.22 (t, J = 7.1 Hz, 3H).
26) 4-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 Ia-056a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.90분; m/z = 348.0 [M-H]-, 피크 영역 97%
Figure pct00136
디에틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.86분; m/z = 404.2 [M-H]-, 피크 영역 92%
Figure pct00137
실시예 1.2 - 유형 Ib의 분자: 디아민으로부터의 디아미드, 1개 실시예
Figure pct00138
반응식 5. 유형 Ib의 디아미드 합성
Figure pct00139
합성 절차: 일반적인 절차 단계 [3], [4], [5] 참조
실시예:
Figure pct00140
조건 및 수율에 대해: 도 4a 내지 d를 참조한다
27) 3,5-비스(2,5-디히드록시-4-카복시벤조일아미노)벤조산, 화합물 Ib-010a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.98분; m/z = 511.0 [M-H]-, 피크 영역 >93%
Figure pct00141
트리에틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.29분, m/z = 597.1 [M+H]+, 피크 영역 > 96%
Figure pct00142
트리에틸 에스터 테트라아세테이트:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.19분, m/z = 782.1 [M+NH4]+, 피크 영역 91%
Figure pct00143
실시예 1.3. - 유형 Ic의 분자: 이산으로부터의 디아미드, 4개 실시예
Figure pct00144
반응식 6. R = R'인 유형 Ic의 아미드 합성
Figure pct00145
절차: KI-6 [3], [4], [5]로부터의 일반적인 절차 참조
실시예:
Figure pct00146
조건 및 수율에 대해: 도 4a 내지 d를 참조한다
28) N 1 ,N 4- 비스(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐)-2,5-디히드록시테레프탈아미드, 화합물 Ic-001aTz2:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.97분; m/z = 485.1 [M+H]+, 피크 영역 >97%
Figure pct00147
29) 5-(4-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산, 화합물 Ic-007a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.80분; m/z = 469.1 [M+H]+, 피크 영역 >91%
Figure pct00148
Figure pct00149
디메틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.13분, m/z = 497.0 [M+H]+, 피크 영역 > 95%
Figure pct00150
Ic-007a의 대안적인, 대규모 합성
a) 5-(4-(3-메톡시카보닐-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디벤질옥시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 메틸 에스터
5 L 플랜지 플라스크에 2,5-비스(벤질옥시)테레프탈산(KI-6, 141.00 g, 0.373 mol), 벤질트리에틸암모늄 클로라이드(850 mg, 3.73 mmol, 0.01 eq) 및 클로로폼(2.5 L)을 채웠다. 이어서 여기에 질소 유입구, 온도계, 압력-균등 적하 깔때기, 빈 Dreschel 병으로의 배출구 및 소듐 히드록시드 기포발생기를 장착하였다. 교반된 용액을 55℃로 가온하고, 티오닐 클로라이드(59 mL, 0.802 mol, 2.15 eq)를 적하 방식으로 40분에 걸쳐 첨가하였다. 용액을 55℃에서 6시간 동안 유지하고, 실온으로 밤새 냉각되도록 하였다. 분취량을 에탄올 중에서 5분 동안 초음파처리하고, LCMS 분석으로 분석하였으며, 이는 오직 디에틸에스터만 나타냈다. 혼합물을 2개의 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 휘발성 물질을 진공에서 제거하였다; 산성 클로라이드를 톨루엔(각각의 플라스크 중의 800 mL)과 공비 혼합하였다. 10 L 재킷 용기에 메틸 5-아미노-2-히드록시벤조에이트(137.00 g, 0.819 mol, 2.2 eq), 및 디클로로메탄(2.5 L, 18 vol)을 채웠다; 용액을 15℃로 냉각시켰다. 산성 클로라이드를 디클로로메탄(2.5 L, 18 vol)에 녹여 교반된 반응에 첨가하였다. 반응은 즉시 다량의 고체를 형성하였고 교반이 어려워졌다; 또한 반응은 30℃까지 발열하였다. 그러나, 장기간 교반하면 혼합물이 분홍색/보라색 미세 현탁액이 된다. 혼합물을 25℃에서 72시간 동안 교반하였다. 현탁액을 여과하고, 디클로로메탄(2 L, 14 vol)으로 세척하고 생성된 고체를 진공 오븐에서 건조하여 240.00 g의 생성물(94% 수율)을 수득하였다.
b) 5-(4-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시 벤조산, Ic-007a
비누화: 5L 3-목 둥근 바닥 플라스크에 신선하게 분쇄된 5-(4-(3-메톡시카보닐-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디벤질옥시벤즈아미도)-2-히드록시-벤조산 메틸 에스터(150.00 g, 0.22 mol) 및 이소프로판올(1.5 L, 10 vol)을 채웠다. 혼합물을 50℃로 가온하고 테트라부틸암모늄 히드록시드(444 mL, 0.67 mol, 3 eq) 및 물(1.1 L, 7 vol)을 첨가하였다. 1시간 동안 일부 고체가 남아서, 추가 60 mL의 테트라부틸암모늄 히드록시드 용액을 물(120 mL)과 함께 첨가하고, 혼합물을 50℃에서 6시간 동안 교반하고, 실온으로 밤새 냉각되도록 하였다. 추가의 테트라부틸암모늄 히드록시드(80 mL)를 첨가하고 고체가 남지 않을 때까지 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 추가로 교반하였다.
수소화분해: 반응을 탈기하고(N2로 3회 주기), 이어서 촉매(30.00 g, C 상의 10%)를 물(100 mL) 중의 슬러리로서 첨가하였다. 반응을 추가로 탈기하고(N2로 3회 주기, H2로 2회) 50℃에서 밤새 H2 하에 두었다(풍선 압력). 반응을 수소로 재충전하고 50℃에서 추가 4시간 동안 유지하고 이후 LCMS 분석은 완전한 반응을 나타냈다. 반응 혼합물을 탈기하고(N2로 3회 주기), 셀라이트 패드를 통해 여과하고 따듯한 물/이소프로판올(1 L, 1:1, 60℃)로 세척하였다. 진공에서 부피를 약 1.2 L로 감소시켰다. 혼합물을 물(약 3 L)이 있는 5 L 플랜지 플라스크로 옮겼다. 플라스크에 오버헤드 교반기(큰 앵커-유형)를 장착하고 염산(35%)으로 산성화하였다. 첨가 동안 무거운 침전물이 형성되었다. 혼합물을 55℃에서 6시간 동안 가열하고, 실온에서 72시간에 걸쳐 냉각되도록 하였다. 혼합물을 여과하고 1M aq HCl(3L) 중의 고체 슬러리를 50℃로 3시간 동안 가열하고, 실온에서 밤새 냉각되도록 하였다. 혼합물을 여과하고, 1 M aq HCl(2 L), 물(1.5 L) 및 아세톤(1 L)으로 세척하였다. 고체를 진공 오븐에서 건조하여 100.00 g의 생성물을 수득하였으며 여전히 약 5 mol%의 테트라부틸암모늄 염으로 오염되어 있었다(NMR). 이러한 고체를 1M aq 염산(3 L)에서 70℃에서 8시간 동안 교반하고, 이어서 실온으로 밤새 냉각되도록 하였다. 고체를 여과하고, 물로 세척하고, 진공 오븐에서 건조하였다. 테트라부틸암모늄 양을 약 0.62 mol%로 감소시켰다. (85.90 g, 82% 수율) (갈색 분말).
30) 2-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-2-카복시페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-5-히드록시벤조산, 화합물 Ic-009a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.85분; m/z = 469.0 [M+H]+, 피크 영역 >98%
Figure pct00151
디메틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.03분, m/z = 497.1 [M+H]+, 피크 영역 > 92%
Figure pct00152
반응식 7. R ≠ R인 유형 Ic의 아미드 합성
Figure pct00153
합성 절차: KI-1로부터의 일반적인 절차를 참조한다.
실시예:
Figure pct00154
조건 및 수율에 대해: 도 4a 내지 d를 참조한다
31) 5-(4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산, 화합물 Ic-001aTz/004a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.40분; m/z = 477.2 [M-H]-, 피크 영역 >99%
Figure pct00155
메틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.06분, m/z = 491.1 [M+H]+, 피크 영역 > 89%
Figure pct00156
Figure pct00157
실시예 1.4. 유형 Id의 분자: 벤즈이미다졸-연결, 1개 실시예
Figure pct00158
반응식 8. 유형 Id의 화합물 합성
Figure pct00159
합성 절차: KI-1 [3], [4], [5]로부터의 일반적인 절차를 참조한다
환형화 단계: 도 4a 내지 d를 참조한다.
실시예:
Figure pct00160
32) 2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산, 화합물 Id-030a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.99분; m/z = 313.1 [M-H]-, 피크 영역 >97%
Figure pct00161
에틸 메틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): r.t = 2.09분, m/z = 357.1 [M+H]+, 피크 영역 > 89%
Figure pct00162
실시예 1.5: 유형 IIa의 분자: 모노아미드, 16개 실시예
Figure pct00163
합성 절차
반응식 9a. 중간체 KI-2 및 KI-7의 합성
Figure pct00164
절차:
KI-2 및 KI-7의 합성
2,6-디(에톡시카보닐)사이클로헥산-1,4-디온 [단계 1][참조: 문헌[Rodriguez et al. Synth. Comm. 28 (1998) 2259-69]]: THF(500 mL) 중의 1,3-디클로로아세톤(12.5 g, 0.1 mol)을 30분에 걸쳐 적하 방식으로 첨가하여 환류 온도에서 THF(1 L) 중의 디에틸 1,3-아세톤디카복실레이트(18 mL, 0.1 mol) 및 포타슘 카보네이트-325 메시(21.5 g, 0.15 mol) 현탁액을 수득하였다. 2시간 후에, 반응이 완료되었고 혼합물을 실온으로 냉각시킨 다음 Celiteⓒ를 통해 여과하였다; 고체 잔류물을 THF(200 mL)로 세척하고, 이어서 용매를 감압 하에 제거하였다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc 0 내지 20%)로 정제하여 표제 화합물(9.3 g, 37% 수율)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.01분; m/z = 257.1 [M+H]-, 피크 영역 >74%
Figure pct00165
디에틸 2,5-디히드록시이소프탈레이트 [단계 2]: [문헌[Zhong et al.: Chem Eur. J. 25 (2019) 8177-8169]으로부터 취한 프로토콜]: 실온에서 AcOH(17 mL) 중의 2,6-디(에톡시카보닐)-사이클로헥산-1,4-디온(5.0 g, 20 mmol)의 교반된 용액에 NBS(3.5 g, 20 mmol)를 30분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 추가 20분 후에, 물(100 ml)을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 원하는 생성물을 고체로서 분리하였다. 여과 및 건조 후, 표제 화합물을 백색 고체로서 단리하였다(4.6 g, 93% 수율).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.00분; m/z = 253.1 [M-H]-, 피크 영역 >90%
Figure pct00166
디에틸 2,5-비스(벤질옥시)이소프탈레이트 [단계 3]: DMF(83 mL) 중의 디에틸 2,5-디히드록시이소프탈레이트(19.0 g, 75 mmol) 및 포타슘 카보네이트-325 메시(82.6 g, 598 mmol)의 현탁액에 벤질 브로마이드(43.0 mL, 362 mmol)를 10분에 걸쳐 적하 방식으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 100℃에서 2시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후 용매를 감압 하에 제거하였다. 이어서 물(500 mL)을 잔류물에 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc(3 x 250 mL)로 추출하고, 모아진 유기 층을 염수(300 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과한 다음 감압 하에 농축하였다. 조 물질을 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc 0 내지 15%)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다(29.4　g, 90% 수율).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.38분; m/z = 435.2 [M+H]+, 피크 영역 >90%
Figure pct00167
2,5-비스(벤질옥시)-3-(에톡시카보닐)벤조산(KI-2) [단계 4]: 물(66 mL) 중의 포타슘 히드록시드(4.4 g, 79 mmol) 용액을 1,4-디옥산(430 mL) 중의 디에틸 2,5-비스(벤질옥시)이소프탈레이트(31.3 g, 72 mmol) 용액에 신속하게 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 1,4-디옥산을 감압 하에 제거하고, 이어서 Na2CO3(1 L)의 포화 수용액을 첨가하고, 수성 층을 EtOAc(3x 500 mL)로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고 진공에서 용매를 제거하였다. 잔류물을 용리액으로서 헥산/EtOAc(1/1) 후 EtOAc(1% v/v AcOH)를 사용하여 실리카 패드 상에서 여과하여 정제하여 2개의 상이한 분획을 수득하였다:
출발 물질: 디에틸 2,5-비스(벤질옥시)이소프탈레이트(20.4 g, 65% 수율).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.38분; m/z = 435.2 [M+H]+, 피크 영역 >78%
Figure pct00168
백색 솜털 고체로서 원하는 생성물인 2,5-비스(벤질옥시)-3-(에톡시카보닐)벤조산(KI-2)을 수득하였다(3.5 g, 12% 수율).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.22분; m/z = 405.1 [M-H]-, 피크 영역 >90%
Figure pct00169
이어서 농축 염산을 사용하여 Na2CO3의 원래의 포화 수성 용액을 pH 약 7로 산성화하였다. 이어서 EtOAc(2 x 500 mL)로 추출하고, 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축하여 KI-2와 KI-7의 혼합물을 수득하였다(3.0 g, 11% 수율).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.00분; m/z = 377.1 [M-H]-, 피크 영역 25%, rt = 1.22분; m/z = 405.1 [M-H]-, 피크 영역 56%
Figure pct00170
반응식 9b: KI-7의 대안적인 합성
Figure pct00171
2,6-디메틸-1,4-페닐렌 디아세테이트 [단계 1]: 피리딘(10 mL) 중의 2,6-디메틸하이드로퀴논(5.0 g, 36 mmol)의 교반된 용액에 아세트산 무수물(10 mL)을 신속하게 첨가하였다. 용액을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 이어서 용매를 감압 하에 제거하고 잔류물을 EtOAc(250 mL)로 용해하고 이어서 염산(1 M, 250 mL) 수용액, NaHCO3 포화 수용액(250 mL) 및 물(250 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고 용매를 진공에서 제거하여 백색 고체로서 표제 화합물(7.4 g, 92%)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.07분; m/z = 240.2 [M+NH4]+, 피크 영역 >90%
Figure pct00172
2,6-비스(디브로모메틸)-1,4-페닐렌 디아세테이트 [단계 2]: 1,2-디클로로에탄(130 mL) 중의 2,6-디메틸-1,4-페닐렌 디아세테이트(6.34 g, 29 mmol)의 교반된 용액에 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(AIBN)(0.93 g, 6 mmol) 및 N-브로모숙신이미드(NBS)(25.39 g, 143 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 용액을 환류 하에 24시간 동안 교반하였다. 추가의 2,2'-아조비스(2-메틸프로피오니트릴)(AIBN)(0.93 g, 6 mmol) 및 N-브로모숙신이미드(NBS)(5.08 g, 28.6 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 환류 하에 24시간 동안 추가 교반하였다. 반응을 실온으로 냉각시키고 잔류 고체를 여과하여 제거하고 DCM(250 mL)으로 세척하였다. 여과액을 소듐 히드로겐 카보네이트(250 mL)의 포화 수용액, 염산(1 M, 250 mL)의 수용액 및 염수(250 mL)로 세척하였다. 이어서 유기 층을 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축하여 오렌지색 오일로서 표제 화합물(9.38 g, 61%)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.23분; m/z = 553.1 [M+NH4]+, 피크 영역 >88%
Figure pct00173
2,5-디히드록시이소프탈알데히드 [단계 3]: 포름산(50 mL) 중의 2,6-비스(디브로모메틸)-1,4-페닐렌 디아세테이트 (3.89 g, 7.23 mmol)의 교반된 현탁액에 물(5 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 환류 하에 18시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 수성 포화 소듐 히드로겐 카보네이트(300 mL)에 천천히 부었다. 이어서 생성된 침전물을 여과하여 단리하여 갈색 고체로서 표제 화합물(0.94 g, 78%)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.74분; m/z = 165.0 [M-H]-, 피크 영역 >98%
2,5-비스(벤질옥시)이소프탈알데히드 [단계 4]: 포타슘 카보네이트-325 메시(2.34 g, 17.0 mmol)를 주위 온도에서 DMF(6 mL) 중의 2,5-디히드록시이소프탈알데히드(0.94 g, 5.7 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 이어서 벤질 브로마이드(2.0 mL, 17.0 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 생성된 혼합물을 100℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고 포화 수성 암모늄 클로라이드 용액(100 mL)으로 처리하였다. 생성된 현탁액을 30분 동안 교반하고, 여과하였다. 고체 물질을 포화 수성 암모늄 클로라이드(2 × 50 mL) 용액으로 세척하였다. 이어서 고체를 에탄올(5 mL)로 연마하고 흡인 건조하여 갈색 고체로서 원하는 생성물을 수득하였다(1.58 g, 68%)
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.28분, 이온화가 관찰되지 않음, 피크 영역 78%
Figure pct00174
2,5-비스(벤질옥시)이소프탈산(KI-7) [단계 5]: 2,5-비스(벤질옥시)이소프탈알데히드(1.58 g, 4.5 mmol)를 THF(2.0 M, 25 mL) 중의 2-메틸-2-부텐 용액에 용해하였다. 이어서 물(25 mL) 중의 소듐 클로라이트(5.1 g, 45.0 mmol) 및 포타슘 디히드로겐 포스페이트(4.6 g, 33.8 mmol) 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 NaHCO3의 포화 수용액(400 mL)에 부었다. 수성 층을 EtOAc(3 × 100 mL)으로 세척하고 농축 염산(pH 약1)으로 산성화하였다. 이어서 수성 층을 DCM(2 × 150 mL) 및 Et2O(2 × 200 mL)으로 추출하고, 모아진 유기 층을 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축하였다. 그런 다음 잔류물을 n-펜탄(3 x 50 mL)으로 연마하여 백색 고체로서 표제 화합물 KI-7을 수득하였다(0.98 g, 58%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.03분, m/z = 379.1 [M+H]+, 피크 영역 >96%
Figure pct00175
반응식 9c: KI-2Ac 2 의 합성
Figure pct00176
메틸 2,5-디아세톡시-3-메틸벤조에이트. 3-메틸살리실산을 문헌[Nudenberg et al (J. Org. Chem. 1943, 8, 500-508)]에 보고된 바와 같이 퍼설페이트로 산화하였다. 3-메틸살리실산(15.0 g, 98.6 mmol)을 물(37.5 mL) 중의 소듐 히드록시드(15.0 g, 375 mmol, 3.8 eq.)의 용액에 용해하였다. 옅은 갈색 용액을 20℃로 냉각하고 교반하면서 수산화물로 시작하여 30 내지 35℃의 온도가 유지되는 속도 및 각각의 10부가 첨가될 때까지 40% 소듐 히드록시드의 7.75 mL 부분 및 10% 포타슘 퍼설페이트 용액의 33.8 mL 부분으로 처리하였다. 첨가를 완료한 후, 교반을 1시간 동안 계속하고, 혼합물을 16 내지 20시간 동안 실온에 둔 다음, 푸른색에서 콩고(congo)가 될 때까지 농축된 HCl을 첨가하였다. 이 시점에서 미반응 3-메틸살리실산을 분리하고 여과하여 제거하였다. 여과액을 에터로 여러 회(5 × 50 mL) 추출하여 잔여 3-메틸살리실산을 회수하였다. 이어서 수용액을 농축 HCl(100 mL)로 처리한 다음 2시간 동안 환류하여 중간체 모노설페이트를 분해하였다. 따듯한 용액을 실온으로 냉각되게 하고 침전된 거의 흑색인 결정질 고체를 여과하고, 물로 세척하고, 건조하였다. 수성 여과액을 에터로 추출하여 갈색 고체로서 추가 배치(batch)의 2,5-디히드록시-3-메틸벤조산을 수득하였다(총: 7.71 g, 47%). Mp 212-214 oC;1H NMR (250 MHz, DMSO): d 10.94 (br. s., 1H), 7.00 (dd, J = 3.0 and 0.75, 1Har), 6.86 (dd, J = 3.0 및 0.75, 1Har), 2.12 (s, 3H).
에스터화. 0℃에서 질소 하에 농축된 황산(0.7 mL)을 조심스럽게 MeOH(7 mL) 중의 2,5-디히드록시-3-메틸벤조산(2.05 g, 12.2 mmol) 용액에 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 100℃에서 6시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각한 후에, 용매를 감압 하에 제거하였다. 수득된 조 생성물을 에틸 아세테이트(50 mL) 중에 용해하고 용액을 물(20 mL), 10% aq.NaHCO3(20 mL), 5% aq. HCl(20 mL), 및 염수(20 mL)로 세척하고, 이어서 건조(MgSO4)하였다. 여과 후, 유기 층을 진공에서 농축하여 잔류물을 수득하고 이를 실리카 겔(석유 에터/에틸 아세테이트 = 9/1) 상의 플래시 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체(370 mg, 75%)로서 메틸 2,5-디히드록시-3-메틸벤조에이트를 수득하였다. Mp 101-103℃; 1H NMR (250 MHz, CDCl3): d 10.56 (d, J = 0.50 Hz, 1H), 7.12 (dd, J = 3.25 및 0.50 Hz, 1Har), 6.90 (dt, J = 3.00 및 0.50 Hz, 1Har), 4.45 (s, 3H), , 2.24 (s, 3H); HRMS (ESI+): m/z 계산치 C9H11O4 [M+H]+: 183.0652; 실측치 183.0651.
아세틸화. 과잉의 아세트산 무수물을 아르곤 하에 피리딘(10 mL) 중의 메틸 2,5-디히드록시-3-메틸-벤조에이트(4.43 g, 24.3 mmol) 용액에 첨가하였다. 실온에서 12시간의 교반 후, 피리딘 및 아세트산 무수물을 감압 하에 톨루엔(25 mL)으로 동시-증발시켜 제거하였다. 이어서 조 생성물을 에틸 아세테이트(15 mL) 중에 용해하고 용액을 2% aq HCl (5 mL), 포화 aq NaHCO3(5 mL) 및 염수(5 mL)로 연속적으로 세척하였다. 유기 상을 건조(MgSO4)시키고 용매를 감압 하에 증발시켰다. 수득된 무색 오일을 실리카 겔(석유 에터/에틸 아세테이트 = 8/2) 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체(6.25 g, 97%)로서 아세틸화된 표제 화합물(2,5-아세톡시-3-메틸-벤조에이트)을 수득하였다. Mp 69-71℃; 1H NMR (250 MHz, CDCl3): d 7.58 (dd, J = 3.00 및 0.50 Hz, 1Har), 7.18 (dd, J = 3.00 및 0.75 Hz, 1Har), 3.85 (s, 3H), 2.37 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 2.22 (s, 3H); HRMS (ESI+): m/z 계산치 C13H18NO6 [M+NH4]+: 284.1129; 실측치 284.1128.
메틸 2,5-디아세톡시-3-디브로모메틸벤조에이트. 탄소 테트라클로라이드(45 mL) 중의 메틸 2,5-아세톡시-3-메틸-벤조에이트(2.15 g, 8.08 mmol), N-브로모숙신이미드(2.87 mg, 16.2 mmol, 2.0 eq.) 및 아조비스이소부티로니트릴(AIBN, 27.0 mg, 0.162 mmol, 0.02 eq.) 용액을 백색 고체가 표면 상에 부유할 때까지 약 12시간 동안 환류하였다. 냉각시킨 후, 혼합물을 여과하고, 이어서 여과액을 감압 하에 농축하였다. 수득된 무색 오일을 실리카 겔(석유 에터/에틸 아세테이트 = 9/1) 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 디브로민화된 생성물을 수득하였다(3.29 g, 84%). Mp 117-119oC; 1H NMR (250 MHz, CDCl3): d 7.86 (d, J = 2.75 Hz, 1Har), 7.78 (d, J = 2.75 Hz, 1Har), 6.81 (s, 1H), 3.86 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.33 (s, 3H); HRMS (ESI+): m/z 계산치 C13H12Br2NaO6 [M+Na]+: 444.8893; 실측치 444.8896.
메틸 2,5-디아세톡시-3-포르밀벤조에이트. 혼합물 아세톤 - H2O(4.7:1, 40 mL) 중의 메틸 2,5-디아세톡시-3-디브로모-메틸벤조에이트(2.30 g, 5.42 mmol) 및 실버 니트레이트(2.29 g, 13.5 mmol, 2.5 eq.)의 용액을 실온 및 어두운 곳에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서 혼합물을 여과하고, 여과액을 에틸 아세테이트(2 x 20 mL)로 추출하였다. 합친 유기상을 염수(5 mL)로 세척하고, 건조(MgSO4)하고 감압 하에 농축하였다. 이에 따라 수득된 무색 오일을 실리카 겔(석유 에터/에틸 아세테이트 = 9/1) 상의 플래시 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체로서 알데히드를 수득하였다. Mp 102-104 ℃; 1H NMR (250 MHz, CDCl3): 10.17 (s, 1H), 8.00 (d, J = 3.00 Hz, 1Har), 7.82 (d, J = 3.00 Hz, 1Har), 3.90 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.34 (s, 3H).
2,5-디아세톡시이소프탈산 모노메틸 에스터(KI-2Ac 2 ). 물(3.5 mL) 중의 소듐 히드로겐 포스페이트(1.35 g, 9.81 mmol, 2.5 eq.) 용액을 DMSO(14 mL) 중의 메틸 2,5-디아세톡시-3-포르밀벤조에이트(1.10 g, 3.93 mmol) 용액에 적하 방식으로 첨가하였다. 이어서 혼합물을 0℃로 냉각하고 물(3.5 mL) 중의 소듐 클로라이트(1.06 g, 9.34 mmol, 2.4 eq.) 용액을 천천히 첨가하였다. 실온에서 72시간 교반 후, 혼합물을 수성 포화 NaHCO3(10 mL)으로 켄칭하고 에틸 아세테이트(2 × 30 mL)로 추출하였다. 이어서 수성 상을 1 M HCl를 사용하여 pH=1로 산성화하고 에틸 아세테이트(2 × 30 mL)로 추출하였다. 합친 유기 상을 염수(5 mL)로 세척하고, 건조하고(MgSO4) 감압 하에 농축하였다. 수득된 오렌지색 오일을 임의의 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
모노아미드의 합성
반응식 10. 모노아미드 IIa의 합성
Figure pct00177
프로토콜: 모노아미드의 합성
아미드 커플링 및 탈보호 절차
KI-2, KI-2Ac 2 및 KI-7로부터의 동일한 절차인, KI-1 및 KI-6 단계 [3], [4], [5]로부터의 일반적인 절차를 참조한다.
실시예
Figure pct00178
Figure pct00179
조건 및 수율에 대해서: 표 2를 참조한다(도 5a 내지 c).
33) 3-(2-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-001a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.86분; m/z = 318.0 [M+H]+, 피크 영역 >92%
Figure pct00180
34) 3-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-001aTz:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.71분; m/z = 342.1 [M+H]+, 피크 영역 >99%
Figure pct00181
에틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.46분; m/z = 370.1 [M+H]+, 피크 영역 >92%
Figure pct00182
35) 2,5-디히드록시-3-(2-설포페닐아미노카보닐)벤조산, 화합물 IIa-001c:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.63분; m/z = 354.0 [M+H]+, 피크 영역 >80%
Figure pct00183
36) 3-(3-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-002a:
Figure pct00184
Figure pct00185
37) 3-(4-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산)아미드, 화합물 IIa-003a:
Figure pct00186
Figure pct00187
38) 3-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-004a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.76분; m/z = 334.0 [M+H]+, 피크 영역 >99%
Figure pct00188
39) 3-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-006a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.65분; m/z = 334.0 [M+H]+, 피크 영역 >99%
Figure pct00189
Figure pct00190
40) 3-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산, 화합물 IIa-011a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.72분; m/z = 360.1 [M-H]-, 피크 영역 >77%
Figure pct00191
41) 2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산, 화합물 IIa-012a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.73분; m/z = 362.0 [M+H], 피크 영역 >97%
Figure pct00192
42) 2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산, 화합물 IIa-013a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.68분; m/z = 362.0 [M+H]+, 피크 영역 >96%
Figure pct00193
Figure pct00194
43) 4-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산, 화합물 IIa-014a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.63분; m/z = 362.1 [M+H]+, 피크 영역 >88%
Figure pct00195
44) 5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산, 화합물 IIa-015a:
Figure pct00196
45) (3-(3-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-033a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.78분; m/z = 330.1 [M-H]-, 피크 영역 >98%
Figure pct00197
Figure pct00198
46) 3-(2-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-034a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.74분; m/z = 332.0 [M+H]+, 피크 영역 >95%
Figure pct00199
디에틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.12분; m/z = 388.1 [M+H]+, 피크 영역 >99%
Figure pct00200
47) 3-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-035a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.69분; m/z = 318.0 [M-H]-, 피크 영역 >99%
Figure pct00201
Figure pct00202
48) 3-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIa-053a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.08분; m/z = 332.0 [M+H]+, 피크 영역 >97%
Figure pct00203
실시예 1.6. 유형 IIb의 분자: 디아민으로부터의 디아미드, 1개 실시예
Figure pct00204
반응식 11. 유형 IIb의 디아미드의 합성
Figure pct00205
절차: KI-1 [3], [4], [5]로부터의 일반적인 절차를 참조한다.
예를 들어:
Figure pct00206
조건 및 수율에 대하여: 표 2를 참조한다(도 5a 내지 c).
49) 3,5-비스(2,5-디히드록시-3-카복시벤조일아미노)벤조산, 화합물 IIb-010a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.98분; m/z = 511.1 [M-H]-, 피크 영역 >93%
Figure pct00207
실시예 1.7. 유형 IIc의 분자: 이산(diacid)으로부터의 디아미드, 2개 실시예
Figure pct00208
반응식 12. R = R'인 유형 IIc의 아미드의 합성
Figure pct00209
절차: KI-6 [3], [4], [5]로부터의 일반적인 절차 참조
예를 들어
Figure pct00210
조건 및 수율에 대하여: 표 2를 참조한다(도 5a 내지 c).
50) 5-(3-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산, 화합물 IIc-007a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.20분; m/z = 469.1 [M+H]+, 피크 영역 >91%
Figure pct00211
IIc-007a의 대안적인 대량 규모 합성
2,5-디벤질옥시이소프탈산(KI-7)
5 L 재킷 용기에 2,5-디벤질옥시이소프탈알데히드(반응식 9b)(300 g, 866 mmol), 레소르시놀(286 g, 2.60 mol), KH2PO4(354 g, 2.60 mol), 아세톤(1.5 L) 및 물(516 ml)을 채웠다. 슬러리를 15 내지 25℃에서 교반하였다. 물(1 L) 중의 80% NaClO2(294 g, 2.60 mol) 용액을 15 내지 30℃에서 90분 동안 채웠다(발열). 첨가가 완료된 후, 반응을 15 내지 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 물(1175 ml) 중의 H3PO4(85 ml, 1.24 mol) 용액[약 1 M]을 10분에 걸쳐 T<30℃(발열)에서 10분에 걸쳐 충전하여 침전물을 수득하였다. 배치(batch)를 0 내지 5℃로 냉각시키고 여과하였다. 고체를 물(3 × 1.2L)로 세척하고 오븐에서 건조하여(50℃) 325.6 g의 이산 KI-7을 수득하였다. HPLC: 98.9%; NMR >95%. 보정된 수율 (90.6%).
5-(3-(3-메톡시카보닐-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디벤질옥시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 메틸 에스터. 2 L 재킷 용기에 이산 KI-7(80 g, 211 mmol), HBTU(2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트)(176.8 g, 466 mmol) 및 THF(560 ml)를 채웠다. 배치를 15 내지 25℃에서 교반하고 N-메틸이미다졸(50.6 ml, 635 mmol)을 채웠다. 30분 후에, 메틸 5-아미노-2-히드록시벤조에이트(77.8 g, 466 mmol)를 채우고 반응을 25℃에서 밤새 교반하였다. 물(1.2 L)을 채우고 배치를 20℃에서 30분 동안 교반하였다. 배치를 여과하고, 물(2 × 480 ml) 및 이어서 MeCN(320 ml)로 세척하였다. MeCN(800 ml)과 함께 생성된 고체(236 g)를 다시 용기에 채웠다. 슬러리를 50℃로 40분 동안 가열한 다음 20℃로 냉각시켰다. 배치를 여과하고 MeCN(320 ml)로 세척하였다. 고체(156 g)의 NMR 분석은 TMU, HOBt, NMI 또는 HBTU가 없음을 나타냈다. 물질을 50℃에서 밤새 건조시켜 125g의 디아미드를 수득하였다. HPLC: 98.2%. NMR: >97%. 수율: 88%.
5-(3-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디벤질옥시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산. 2 L 재킷 용기에 이전의 디아미드(110 g, 163 mmol), THF(550 ml) 및 물(1100 ml)을 채웠다. 배치를 15 내지 25℃에서 교반하고 85% KOH(32.2 g, 488 mmol)를 채웠다(약간의 발열). 용액을 50℃로 4시간 동안 가열한 다음 20℃로 냉각하고 밤새 교반하였다. 이어서 6 M aq. AcOH(550 ml, 3.3 mol)를 15 내지 25℃에서 30분에 걸쳐 채웠다. 첨가를 완료한 후, 배치를 30분 동안 교반한 다음 여과하였다. 고체를 물(3 × 550 ml)로 세척한 다음 50℃에서 건조하였다. 이로써 102 g의 유리 이산을 수득하였다. HPLC: 98.9%(0.3% 일-아미드, 0.19% 일-산). NMR: >97%. 수율: 97%.
5-(3-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산 IIc-007a. N2 하에 2 L 재킷 용기에 10% Pd/C(10 g, 50% 습윤, 유형 87 L)를 채운 다음 이전의 이산(100 g, 154 mmol), AcOH(5 ml, 88 mmol) 및 THF(1200 ml)를 채웠다. 배치를 교반한 다음 H2를 살포하고 40℃로 2시간 동안 가열하였다. 배치를 N2로 살포한 다음 여과하였다(GF/F). 용기를 THF(300 ml)로 헹구고 린스를 사용하여 필터 상의 촉매를 세척하였다. 여과액을 용기에 채우고 부피를 THF(400 ml)를 사용하여 2 L로 조정하였다. 용액을 30℃로 가온하고, SPM32(10 )를 채우고, 배치를 30℃에서 밤새 교반하였다. SPM32를 여과하고 THF(200 ml)로 세척하였다. 용매를 진공에서 제거하여 연한 황색 고체(110 g)를 수득하였다. NMR 분석은 28% THF를 나타냈다. 물질을 20℃에서 2시간 동안 EtOH(1 L)에서 슬러리가 되게 한 다음 여과하였다. 고체를 EtOH(400 ml)로 세척하고 60℃에서 밤새 오븐에서 건조하였다. NMR은 8.7% EtOH를 나타냈고 THF가 없음을 나타냈다. 물질을 80℃에서 4일 동안 추가로 건조하여 92% 수율의 회백색 고체로서 66.5 g의 IIc-007a를 수득하였다. HPLC: 99.5% (0.31% 모노아미드). NMR: 4.6% EtOH, THF 없음. ICP-OES에 의한 Pd: <2 ppm.
IIc-007a-THF 용매화물: THF 여과액을 농축하여 전형적으로 NMR에 의해 25 내지 30% THF를 함유하는 황색 고체를 수득하였으며, 이는 건조를 통해 제거할 수 없으며, 이는 비-화학량론적(non-stoichiometric) 용매화물을 나타낸다.
THF 용매화물(1.45g)의 소량 샘플을 THF(10ml) 중에서 50℃로 1시간 동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고 단리하고, 3ml THF로 세척하였다. 이로써 1.13g의 IIc-007a-THF를 수득하였다. NMR: 27% THF. HPLC: 99.6% (0.1% 모노아미드). 여과에 의해 THF 용매화물을 단리하여 순도를 증가시키고 주요 불순물(모노아미드, IIa-004a)을 0.7%에서 0.1%로 효과적으로 퍼지하였다. 회수율: 78%. THF 중의 THF 용매화물 용해도는 20℃에서 약 25 mg/ml로 계산된다.
아세톤, EtOH 및 EtOAc 중의 물질에 대해 탈용매화 실험을 수행하였다. 각각의 배치를 20 부피의 용매에서 50℃에서 1시간 동안 가열한 다음, 실온에서 단리하고 오븐에서 건조하였다(60℃). 건조 후 생성물에 혼입된 낮은 수준의 EtOH와 시스템으로부터의 THF의 우수한 퍼지로 인해 에탄올을 탈용매화 용매로 선택하였다. 12.1 g의 생성물(25% THF)에 대해 탈용매화 단계를 수행하였다. 물질에 EtOH(20 부피)를 채우고 배치를 실온에서 밤새 교반하였다. 샘플을 여과하고 이는 실온에서 성공적인 탈용매화를 나타냈다. 전반적인 수율: 8.67 g. HPLC: 99.4%. NMR: >97% (0.8% EtOH). XRPD는 단리된 생성물의 높은 결정화도를 나타낸다.
생성물 IIc-007a는 또한 DMSO 용매화물을 형성한다(3:2 비율의 DMSO:생성물).
51) 2-(3-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-히드록실벤조산, 화합물 IIc-009a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.79분; m/z = 469.1 [M+H]+, 피크 영역 >95%
Figure pct00212
Figure pct00213
실시예 1.8: 유형 IIIa의 분자: 모노아미드, 4개 실시예
Figure pct00214
전구체의 합성
반응식 13. 합성 중간체: KI-1로부터의 KI-8 및 KI-9
Figure pct00215
합성 프로토콜
중간체 KI-8 및 KI-9(KI-10 및 KI-11 경유)
에틸 2,5-비스(벤질옥시)-4-(히드록시메틸)벤조에이트(KI-10)[단계 1]: 불활성 기체(N2)의 양성 흐름 하에 THF(700 mL) 중의 KI-1(62.3 g, 153 mmol)의 -20℃에서 냉각된 용액에 BH3.THF(615.0 mL, 615 mmol)(-10℃에서)의 미리 냉각된 용액을 천천히 첨가하였다. 반응의 내부 온도가 -15℃를 초과하지 않는 방식으로 첨가를 수행하였다. 반응은 약간 가온되었고, 내부 온도는 -7℃를 초과하지 않도록 하였다. 혼합물을 이러한 온도로 2.5시간 동안 유지하였다. 이어서 반응 혼합물을 얼음/물(8 L)에 부었다. 수득된 흐릿한 백색 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반되도록 두고 잔류의 백색 현탁액을 프릿 깔때기(fritted funnel)(다공성 3)를 통해 여과하였다. 이에 따라 수득된 백색 고체를 40℃의 진공 오븐에서 밤새 추가로 건조하여, 백색 고체로서 에틸 2,5-비스(벤질옥시)-4-(히드록시메틸)벤조에이트(KI-10)(60.5 g, 97% 수율)를 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.25분; m/z = 391.2 [M-H]-, 피크 영역 >68%
Figure pct00216
대안적으로 혼합된 무수물(트리에틸아민의 존재 하에 THF 중의 이소부틸클로로포르메이트로 KI-1 처리)에 이어 혼합된 무수물을 THF 중의 소듐 보로하이드라이드로 환원시켜 중간체 KI-10을 수득할 수 있다(수율 85 내지 90%, 150g-규모).
에틸 2,5-비스(벤질옥시)-4-(클로로메틸)벤조에이트(KI-11) [단계 2]: 토실 클로라이드(17.0 g, 70 mmol)를 DCM(260 mL) 중의 KI-10(25.0 g, 64 mmol), DIPEA(12.2 mL, 70 mmol) 및 DMAP(0.778 g, 6 mmol)의 냉각된 용액(얼음조)에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 30시간 동안 교반한 후, 반응이 완료된 것으로 판단하였다. DCM(100 mL)을 첨가하고 유기 층을 분리하고, 포화 수성 소듐 히드로겐 카보네이트(4 × 50 mL), 물(2 × 50 mL) 및 염수(50 mL)로 세척하고, 소듐 설페이트 상에서 건조하고 농축하였다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc 0 내지 20%)에 적용하여 에틸 2,5-비스(벤질옥시)-4-(클로로메틸)벤조에이트(KI-11)(23.5 g, 75%)를 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.39분; m/z = 이온 없음, 피크 영역 >84%.
Figure pct00217
대안적으로, -10℃에서 KI-10을 디클로로메탄 중의 티오닐 클로라이드(1.14 당량)로 처리한 다음, 용매를 증발시키고 헵탄으로부터 침전시켜 중간체 KI-11을 수득할 수 있다(수율 90%, 300 g-규모)
에틸 2,5-비스(벤질옥시)-4-(시아노메틸)벤조에이트 [단계 3]: EtOH(90 mL)와 H2O (45 mL)의 혼합물 중의 KI-11(7.5 g, 18.2 mmol) 현탁액을 포타슘 시아나이드(1.8 g, 27.4 mmol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 75℃로 가열하고 상기 온도에서 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(500 mL)로 희석하고 EtOAc(2 × 200 mL)로 추출하고, 이어서 합친 유기상을 염수(200 mL)로 세척하고, 소듐 설페이트에서 건조하고, 여과하고 진공에서 농축하였다. 조 생성물을 에틸 2,5-비스(벤질옥시)-4-(시아노메틸)벤조에이트와 2,5-비스(벤질옥시)-4-(시아노메틸)벤조산(7.1 g)의 혼합물로서 단리하고, 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.30분; m/z = 402.2 [M+H]+, 피크 영역 >65% 및 rt = 1.15분; m/z = 374.1 [M+H]+, 피크 영역 >8%.
Figure pct00218
2,5-비스(벤질옥시)-4-(카복시메틸)벤조산(KI-9) [단계 4]: EtOH(20 mL) 중의 에틸 2,5-비스(벤질옥시)-4-(시아노메틸)벤조에이트(7.1 g, 13.2 mmol)의 현탁액에 물(50 mL) 중의 소듐 히드록시드(8.5 g, 212.5 mmol) 용액을 첨가하고 반응 혼합물을 환류 하에 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(100 mL)로 희석하고 생성된 용액을 EtOAc(2 x 100 mL)로 세척하고, 이에 따라 수득된 유기 층을 물(100 mL)로 추출하고 모든 수성 층을 모았다. 이어서 수성 층을 시트르산의 포화 수용액으로 pH 약 3으로 산성화하고, 형성된 침전물을 감압 하에 여과 건조하였다. 고체를 진공 오븐에서 40℃로 밤새 추가로 건조하여 황색 고체로서 2,5-비스(벤질옥시)-4-(카복시메틸)벤조산(KI-9)(6.4 g, 92% 수율)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.07분; m/z = 393.2 [M+H]+, 피크 영역 >74%.
Figure pct00219
2,5-비스(벤질옥시)-4-(2-에톡시카보닐메틸)벤조산(KI-8) [단계 5]: KI-9(5.5 g, 14.0 mmol)를 EtOH(30 mL) 중에 현탁하고 현탁액을 티오닐 클로라이드(0.52 mL, 7.1 mmol)로 처리하고 반응 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 소듐 바이카보네이트(1 L)의 포화 수용액에 부어, 백색 현탁액이 되었다. 고체를 여과하여 단리하고 Et2O(2 × 20 mL)로 추가로 연마하였다. 고체를 진공 오븐에서 밤새 추가로 건조시켜 백색 고체로서 2,5-비스(벤질옥시)-4-(2- 에톡시카보닐메틸)벤조산(KI-8)(4.2 g, 64%)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.23분; m/z = 419.3 [M-H]-, 피크 영역 >79%.
Figure pct00220
모노아미드의 합성
반응식 14. 모노아미드 IIIa의 합성
Figure pct00221
합성 프로토콜
아미드 커플링 및 탈보호 절차:
KI-1 및 KI-6 단계 [3], [4], [5]로부터의 일반적인 절차를 참조한다.
실시예
Figure pct00222
조건 및 수율에 대하여: 표 3을 참조한다(도 6).
52) 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산, 화합물 IIIa-001a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.89분; m/z = 332.1 [M+H]+, 피크 영역 >98%
Figure pct00223
에틸 메틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.14분; m/z = 374.2 [M+H]+, 피크 영역 >96%.
Figure pct00224
53) (2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산, 화합물 IIIa- 001aTz:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.87분; m/z = 356.1 [M+H], 피크 영역 >95%.
Figure pct00225
에틸 에스터:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.56분; m/z = 384.2 [M+H]+, 피크 영역 >95%.
Figure pct00226
Figure pct00227
54) 2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산, 화합물 IIIa-013a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.82분; m/z = 376.0 [M+H]+, 피크 영역 >89%.
Figure pct00228
55) 5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산, 화합물 IIIa-015a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.93분; m/z = 376.0 [M+H]+, 피크 영역 >96%.
Figure pct00229
에틸 디메틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.69분; m/z = 432.1 [M+H]+, 피크 영역 >97%.
Figure pct00230
Figure pct00231
실시예 1.9. 유형 IIIb의 분자: 디아민으로부터의 디아미드, 1개 실시예
Figure pct00232
실시예 15. 유형 IIIb의 디아미드의 합성
Figure pct00233
절차: KI-1 단계 [3], [4], [5]로부터의 일반적인 절차를 참조한다.
예를 들어:
Figure pct00234
조건 및 수율에 대하여: 표 3을 참조한다(도 6).
56) 3,5-비스(2,5-디히드록시-4-카복시메틸벤조일아미노)벤조산, 화합물 IIIb-010a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.08분; m/z = 539.2.1 [M-H]-, 피크 영역 80%.
Figure pct00235
트리에틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.81분; m/z = 623.3 [M-H]-, 피크 영역 94%.
Figure pct00236
Figure pct00237
실시예 1.10: 유형 IIIc의 분자. 이량체, 6개 실시예
Figure pct00238
합성 반응식 및 절차
반응식 16: X=O
Figure pct00239
합성 절차
KI-10 및 KI-11 로부터의 에터 연결 형성
에틸 2,5-디벤질옥시-4-[(2,5-디벤질옥시-4-에톡시카보니페닐)메톡시메틸]벤조에이트 [단계 1]: 얼음조 중에 냉각된, DMF(6 mL) 중의 KI-11(340 mg, 0.83 mmol) 및 KI-10(250 mg, 0.64 mmol)의 용액에 소듐 하이드라이드(76 mg, 1.9 mmol)를 조금씩 첨가하였다. 1시간 후에, 반응 혼합물을 암모늄 클로라이드(50 mL)의 포화 수용액에 붓고 물질을 EtOAc(3 × 30 mL)로 추출하고, 유기상을 물(2 x 50 mL) 및 염수(50 mL)로 추가로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하고 감압 하에 농축하였다. 조 생성물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc 0 내지 20%)로 정제하여 갈색 고체로서 표제 화합물(161 mg, 33% 수율)을 수득하였다.
탈보호 절차:
일반적인 절차 [4], [5]를 참조한다.
예를 들어
Figure pct00240
조건 및 수율에 대하여: 표 4를 참조한다(탈보호)(도 7).
57) 4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIIc-060a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.94분; m/z = 349.1 [M-H]-, 피크 영역 >90%.
Figure pct00241
반응식 17: X = NH
Figure pct00242
합성 절차
KI-10 및 KI-11 를 통해 KI-12 및 KI-13 으로부터 아민 연결 형성
에틸 2,5-비스(벤질옥시)-4-포르밀벤조에이트(KI-12): 디클로로메탄(50 mL) 중의 KI-10(3.4 g, 8.6 mmol) 용액에 망간 디옥시드(4.5 g, 51.9 mmol)를 첨가하였다. 생성된 현탁액을 환류 하에 4시간 동안 교반하였다. 반응을 셀라이트® 패드를 통해 여과하고 고체를 디클로로메탄(300 mL)으로 세척하고, 이어서 용매를 감압 하에 제거하여 황색 고체로서 표제 화합물(3.2 g, 94% 수율)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.33분; m/z = 이온 없음, 피크 영역 >93%
Figure pct00243
에틸 4-(아지도메틸)-2,5-비스(벤질옥시)벤조에이트: 톨루엔(30 mL) 중의 KI-10(3.0 g, 7.6 mmol) 및 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔(DBU)(1.5 mL. 9.9 mmol) 현탁액에 디페닐 포스포릴 아지드(DPPA)(2 mL, 9.1 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 1 M 히드로겐 클로라이드(200 mL)의 수용액을 첨가하고 생성물을 EtOAc(3 × 100 mL)로 추출하고, 합친 유기 층을 물(2 × 50 mL)로 세척하고, 소듐 설페이트 상에서 건조하고 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc 0 내지 20%)로 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물(3.1 g, 98%)을 수득하였으며 이는 시간에 지남에 따라 백색 고체가 되었다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.37분; m/z = 390.2, [M+H-N2]+, 피크 영역 >93%
Figure pct00244
에틸 4-(아미노메틸)-2,5-비스(벤질옥시)벤조에이트(KI-13): THF(60 mL) 및 물(6 mL) 중의 에틸 4-(아지도메틸)-2,5-비스(벤질옥시)벤조에이트(2.8 g, 6.7 mmol) 용액에 중합체-결합된 트리페닐포스핀(4.7 g, 약 3 mmol/g 로딩)을 첨가하고 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반되게 두었다. 여과하여 수지를 제거하고 물(100 mL) 및 EtOAc(2 × 100 mL)로 세척하였다. 상을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(100 mL)로 추가로 추출하고, 모은 유기 층을 염수(200 mL)로 세척하고, 소듐 설페이트 상에서 건조하고 농축하여 백색 고체로서 표제 화합물(KI-13)(1.8 g, 70% 수율)을 수득하였다.
UPLC-MS (염기성 방법, 2분): rt = 1.20분; m/z = 392.2, [M+H]+, 피크 영역 >93%
Figure pct00245
에틸 2,5-디벤질옥시-4-[(2,5-디벤질옥시-4-에톡시카보닐페닐)메틸아미노메틸] 벤조-에이트: KI-12(500 mg, 1.3 mmol) 및 KI-13(641 mg, 1.6 mmol)을 DCM(35 mL) 중에 용해한 후 활성화된 분자 체(10개 비드)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 이어서 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(654 mg, 3.1 mmol)를 첨가하고 생성된 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. DCM(25 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 분리 깔때기에 디캔딩하고 물(50 mL)로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하고 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc 0 내지 50%)로 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물(631 mg, 64% 수율)을 수득하였으며 이는 시간이 지남에 따라 고체가 되었다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.37분; m/z = 766.3, [M+H]+, 피크 영역 >92%
Figure pct00246
탈보호 절차: 일반적인 절차 [4], [5]를 참조한다.
조건 및 수율에 대하여: 도 7을 참조한다.
예를 들어
Figure pct00247
58) 비스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민, 화합물 IIIc-056a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.57분; m/z = 350.0 [M+H]+, 피크 영역 >96%.
Figure pct00248
반응식 18: X = NAc
Figure pct00249
합성 절차
N,N-비스-[2,5-디벤질옥시-4-에톡시카보닐페닐메틸]아세트아미드: 질소 대기 하에, DCM(6 mL) 중의 N,N-비스-[2,5-디벤질옥시-4-에톡시카보닐페닐메틸]아민(300 mg, 0.39 mmol) 및 피리딘(0.2 mL, 2.4 mmol) 용액에 아세트산 무수물(0.2 mL, 2.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc, 0 내지 50 %)로 정제하여 무색 오일로서 표제 화합물(316 mg, 92% 수율)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.44분; m/z = 808.2 [M+H]+, 피크 영역 >95%.
Figure pct00250
탈보호 절차:
일반적인 절차 [4], [5]를 참조한다.
예를 들어
Figure pct00251
조건 및 수율에 대하여: 실시예 7을 참조한다(탈보호).
59) N,N-비스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세트아미드, 화합물 IIIc-057a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.84분; m/z = 392.1 [M+H]+, 피크 영역 >99%.
Figure pct00252
Figure pct00253
반응식 19: X = NCH 2 C 6 H 3 (OH) 2 COOH
Figure pct00254
합성 절차
KI-11 및 NH 3 으로부터의 3차 아민 형성
트리스(4-에톡시카보니-2,5-디벤질옥시페닐메틸)아민 : 밀봉된 튜브에 KI-11(32.5 g, 79 mmol), 소듐 요오다이드(0.79 g, 5 mmol), MeOH(7 N) 중의 암모니아 용액(38 mL, 264 mmol) 및 EtOAc(80 mL)를 채웠다. 이어서 튜브를 밀봉하고 반응 혼합물을 60℃에서 24시간 동안 가열하였다. 24시간 후에, 출발 물질(KI-11)을 소모하고 반응 혼합물은 원하는 생성물뿐만 아니라 단량체 및 이량체 구조를 또한 함유하였다. 물(100 mL)을 첨가하고 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 100 mL)로 추출하고, 모은 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축하였다. 수득된 잔류물을 EtOAc(165 mL) 중에 용해하고 KI-11(2.5 g, 6 mmol), 소듐 요오다이드(0.79 g, 5 mmol), DIPEA(10 mL, 58 mmol)를 첨가하고 생성된 용액을 60℃에서 가열하였다. 18시간 후에, 물(100 mL)을 첨가하고 생성된 혼합물을 EtOAc(3 x 100 mL)로 추출하고, 모은 유기층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 용매로서 EtOH/EtOAc 95/5(20 mL)를 사용하여 재결정화하여 정제하여 백색 결정으로서 표제 화합물(15.0 g, 50%)을 수득하였다.
UPLC-MS (염기성 방법, 2분): rt = 1.71분; m/z = 1140.3 [M+H]+, 피크 영역 >99%.
Figure pct00255
대안적으로, 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피를 통해 생성물을 정제할 수 있다: 규모, 최대 270 g; 기기: Combiflash Torrent; 카트리지: RediSep Column, 실리카 3kg; 로딩 유형: 헵탄:톨루엔(1:1) 1L에 용해된 조. 에틸 아세테이트/헵탄으로 용리. 검출: UV - 240 nm
탈보호 절차: 일반적인 절차 [4], [5]를 참조한다.
조건 및 수율에 대하여: 실시예 7을 참조한다(탈보호).
대안적인, 대규모 탈보호 절차:
비누화. 트리스(4-에톡시카보니-2,5-디벤질옥시페닐메틸)아민(95.00 g, 0.083 mol), 소듐 히드록시드(40.00 g, 0.99 mol), 물(570 mL) 및 테트라히드로퓨란(1.9 L)을 5 L 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 반응 혼합물을 온도 블록을 사용하여 80℃에서(환류 온도는 65℃였음) 48시간 동안 가열한 다음 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 이어서 용매를 진공에서 제거하였다. 조 물질을 수집하고 물(2.85 L)로 추가로 희석하였다. 또 다른 10 L 플라스크에서, 아세트산(180 mL)과 물(950 mL) 혼합물을 실온에서 교반하였다. 물 중의 조 생성물의 혼합물을 30분에 걸쳐 아세트산 혼합물에 첨가하면서 오버헤드 교반기로 교반하였고, 크림 고체가 침전되었다. 반응 혼합물을 추가의 1시간 동안 교반하고 고체를 여과 시에 단리하였다; 모액 pH는 4,2였다. 단리된 고체를 물(1425 mL)과 함께 1시간 동안 교반한 다음 여과하였다. 모액 pH는 4,5였다. 고체를 회수하고 추가 물(1425 mL)과 함께 1시간 동안 교반한 다음 여과하였다; 모액 pH는 4,5였다. 상기 고체를 아세톤(950 mL)과 함께 1시간 동안 교반하고 여과하였다. 크림 색상의 고체를 50℃의 진공 오븐에서 48시간 동안 건조하고 분석하였다(82.00 g, 93% 수율)(수율은 90 내지 95% 사이에서 변함).
주의: pH는 생성물을 유리 산 형태로 유지하고 생성물로부터 과잉 아세트산을 제거하기 위해 세척하는 동안 중요한 매개변수이다.
이상적인 pH: 4.2 내지 4.5(최종 소듐 함량은 2 ppm 내지 20 ppm 사이에서 변함).
수소화분해 및 단리. 트리스(4-카복시-2,5-디벤질옥시페닐메틸)아민(58.00 g, 54.00 mmol, 1eq) 및 테트라히드로퓨란(1160 mL)을 2 L 둥근 바닥 플라스크에 채웠다. 혼합물을 질소로 탈기한 다음, 수소/진공 사이클 4 내지 5회로 플러싱하였다. 탄소 상의 팔라듐(JM 10% 424 Pd/C, 70 g, 15% 로딩)을 반응 혼합물에 첨가하고 25℃에서 5 내지 6시간 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 탈기하고 촉매를 셀라이트 패드를 통해 여과하여 제거하고, 이를 테트라히드로퓨란(3 × 1160 mL)으로 세척하였다. 마지막으로, 여과액을 감압 하에 농축하였다. 조 고체를 수집하고, 헵탄(1160 mL)과 함께 교반하고 여과하여 회색 고체를 수득하고, 이를 50℃의 진공 오븐에서 밤새 건조시켰다(32.50 g, 조 기반 >100 % 수율). 수집된 조 물질을 에탄올(325 mL) 중에 용해시키고 60℃로 가열하였다(맑은 용액). 이어서, 60℃에서 15 내지 20분에 걸쳐 물을 천천히 첨가하였다(325 mL)(첨가 동안 온도를 적어도 50℃로 유지). 이 단계에서 흐릿한 액체가 관찰되었다. 흐릿한 반응 혼합물을 환류 온도에서 30분 동안 교반하였다.
이 시간 후, 반응 혼합물을 추가 30분 동안 실온으로 냉각되도록 하였다. 침전된 고체를 여과에 의해 단리하고 에탄올:물(66 mL)의 1:1 혼합물로 세척하였다. 고체를 50℃의 진공 오븐에서 적어도 72시간 동안 건조하고 분석하여, 원하는 생성물 IIIc-061a(22.00 g, 76% 수율)(수율은 65 내지 75% 사이에서 변함)를 수득하였다. LCMS: >95%, NMR: >95% 순도.
Figure pct00256
트리스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민, 화합물 IIIc-061a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.74분; m/z = 516.0 [M+H]+, 피크 영역 >86%.
Figure pct00257
트리에틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.05분; m/z = 600.2 [M+H]+, 피크 영역 >82%.
Figure pct00258
Figure pct00259
반응식 20: X = S
Figure pct00260
합성 절차
KI-11 로부터 티오에터 연결 형성
반응식 21을 참조한다. 티오에터 연결을 형성하기 위한 동일한 조건.
탈보호 절차: 일반적인 절차 [4], [5]를 참조한다.
예를 들어
Figure pct00261
조건 및 수율에 대하여: 실시예 7을 참조한다(탈보호).
60) 4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIIc-058a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.84분; m/z = 365.1 [M-H]-, 피크 영역 >79%
Figure pct00262
반응식 21: X = SO 2
Figure pct00263
합성 절차
티오에터 연결의 산화
IVc-059a의 제조를 참조한다: 산화의 동일한 조건.
탈보호 절차: 일반적인 절차 [4], [5]를 참조한다.
예를 들어
Figure pct00264
조건 및 수율에 대하여: 실시예 7을 참조한다(탈보호).
61) 4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IIIc-059a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.72분; m/z = 397.1 [M-H]-, 피크 영역 >97%
Figure pct00265
실시예 1.11: 유형 IVc의 화합물
Figure pct00266
반응식 22: X = S
디메틸 에터를 통한 합성
Figure pct00267
합성 절차
5-O-메틸 겐티신산으로부터의 합성
3-포르밀-2-히드록시-5-메톡시벤조산. 헥사메틸렌테트라민(40.019 g, 0.285 mol)을 트리플루오로아세트산(190.0 mL) 중의 2-히드록시-5-메톡시벤조산(24.0 g, 0.143 mol) 혼합물에 첨가하였다. 반응을 18시간 동안 환류하였다. 완료 후, 반응을 주위 온도로 냉각하고 2 M 염산(700 mL)을 혼합물에 첨가하고 이를 주위 온도에서 24시간 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, 물(500 mL)로 세척하고 진공 오븐에서 건조하여 연황색 고체로서 3-포르밀-2-히드록시-5-메톡시벤조산을 수득하였다(21.30 g, 0.11 mol, 77.0%)
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.69분; m/z = 195.1 [M-H]-, 피크 영역 >98%
Figure pct00268
메틸 3-포르밀-2,5-디메톡시벤조에이트. 메틸 요오다이드(6.7 mL, 0.107 mol)를 DMF(100.0 mL) 중의 3-포르밀-2-히드록시-5-메톡시벤조산(10.0 g, 0.05 mol)과 포타슘 카보네이트-325 메시(28.18 g, 0.20 mol) 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 주위 온도로 냉각하고 차가운 물(400 mL)로 처리한 결과 침전물이 형성되었다. 생성된 현탁액을 10분 동안 교반한 다음, 진공 오븐에서 여과 건조하여 황색 고체로서 메틸 3-포르밀-2,5-디메톡시벤조에이트를 수득하였다(8.90 g, 0.04 mol, 78.0%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.95분; m/z = 225.1 [M+H]+, 피크 영역 >98%
Figure pct00269
메틸 3-(히드록시메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트. 소듐 보로하이드라이드(16.198 g, 0.428 mol)를 MeOH(900 mL) 중의 메틸 3-포르밀-2,5-디메톡시벤조에이트(48.0 g, 0.214 mol) 용액에 0℃에서 천천히 첨가하고 생성된 혼합물을 주위 온도에서 15분 동안 교반하였다. 용매를 진공에서 제거하고 잔류물을 DCM(200 mL) 중에 용해한 다음 물(200 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축 건조하여 백색 고체로서 메틸 3-(히드록시메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트를 수득하였다(45.6 g, 0.20 mol, 95.0%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.84분; 이온화 없음, 피크 영역 >98%
Figure pct00270
메틸 3-(클로로메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트. 티오닐 클로라이드(17.2 mL, 0.235 mol)를 주위 온도에서 30분에 걸쳐 메틸 3-(히드록시메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트(45.60 g, 0.20 mol) 용액에 적하 방식으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 완료 후, 반응 혼합물을 소듐 카보네이트(3 × 500 mL)의 포화 수용액 및 염수(500 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축 건조하여 갈색 고체로서 메틸 3-(클로로메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트를 수득하였다(49.1 g, 0.18 mol, 90%,).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.10분; 이온화 없음, 피크 영역 >92%
Figure pct00271
메틸 3-(아세틸티오메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트. 포타슘 티오아세테이트(15.54 g, 0.136 mol)를 주위 온도에서 THF(500.0 mL) 중의 메틸 3-(클로로메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트(22.20 g, 0.091 mol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 75℃에서 18시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 감압 하에 제거하여 붉은색 오일성의 잔류물을 수득하였으며 이를 포화 염수 용액(500 mL)으로 처리한 다음, 디에틸 에터(2 × 250 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 농축 건조하여 갈색 고체로서 메틸 3-(아세틸티오메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트를 수득하였다(25.50 g, 0.09 mol, 99%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.10분; 이온화 없음, 피크 영역 >92%
Figure pct00272
메틸 3-(머캅토메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트. 건조 메탄올(800 mL) 중의 메틸 3-(아세틸티오메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트(25.5 g, 89.68 mmol) 용액에, 0℃에서 적가 방식으로, 질소 대기 하에 소듐 메탄올레이트(5.81 g, 107.62 mmol) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 45분 동안 교반한 다음 Dowex X8(H+) 이온-교환 수지로 켄칭하고 15분 동안 교반하였다. 여과 후, 용매를 감압 하에 증발시켜 갈색 오일로서 조 생성물을 수득하였다(이는 2:1 비율의 원하는 생성물과 상응하는 디설파이드 화합물을 함유함). 잔류물을 DMF(400.0 mL) 중에 용해하고 질소 대기 하에 디티오트레이톨(DTT)(33.95 g, 0.26 mol)로 처리하였다. 반응 혼합물을 75℃에서 18시간 동안 교반하였다. 디설파이드의 티올로의 변환 완료 후, 용매를 증발시켰다. 생성된 잔류물을 DCM(1 L) 중에 용해하고, 염수(7 × 500 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고 농축 건조하여 갈색 오일로서 균질한 메틸 3-(머캅토메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트를 수득하였다(21.40 g, 88.32 mmol, 99%)
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.05분; m/z = 243.1 [M+H]+, 피크 영역 >95%
Figure pct00273
디메틸 3,3'-(티오비스(메틸렌))비스(2,5-디메톡시벤조에이트). 트리에틸아민(19.0 mL, 136.61 mmol)을 질소 대기 하에 메틸 3-(머캅토메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트(21.40 g, 88.32 mmol) 및 메틸 3-(클로로메틸)-2,5-디메톡시벤조에이트(22.69 g, 92.74 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 완료 후, 용매를 진공 하에 제거하여 갈색 오일 잔류물을 수득하고 이를 물(1 L)로 처리한 다음, 디에틸 에터(3 × 500 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수(5 × 250 mL)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고 농축 건조하여 갈색 오일로서 조 생성물을 수득하고, 이를 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다: 용리를 이소-헥산 중의 에틸 아세테이트(0 내지 20%) 구배로 하여 갈색 오일로서 디메틸 3,3'-(티오비스(메틸렌))비스(2,5-디메톡시벤조에이트)를 수득하였다(29.9 g, 66.37 mmol, 76%)
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.22분; m/z = 451.2 [M+H]+, 피크 영역 >92%
Figure pct00274
3,3'-(티오비스(메틸렌))비스(2,5-디메톡시벤조산). 물(30.0 mL) 중의 리튬 히드록시드 모노히드레이트(1.0 g, 23.83 mmol) 용액을 THF(100.0 mL) 중의 디메틸 3,3'-(티오비스(메틸렌))비스(2,5-디메톡시벤조에이트)(2.0 g, 4.44 mmol) 용액에 첨가하였다. 반응을 주위 온도에서 48시간 동안 교반하였다. 완료 후, 물(100 mL)을 반응에 첨가하고 혼합물을 에틸 아세테이트(100 mL)로 세척하였다. 수성 층을 1 M 수성 염산을 사용하여 pH=2로 산성화하였고 에틸 아세테이트(3 X 100 mL)로 추출하였다. 유기 층을 수집하고, 건조하고(Na2SO4), 여과 및 농축하여 갈색 고체로서 3,3'-(티오비스(메틸렌))비스(2,5-디메톡시벤조산)을 수득하였다(1.91 g, 4.11 mmol, 93%)
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.93분; m/z = 421.1 [M-H]-, 피크 영역 >95%
Figure pct00275
3-[(2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸티오메틸]-2,5-디히드록시벤조산. DCM(200.0 mL) 중의 이전의 티오에터(5.0 g, 0.01 mol) 용액에 0℃에서 DCM(100.7 mL, 0.101 mol) 중의 트리브로모보레인의 1M 용액을 천천히 첨가하고 반응 혼합물을 48시간 동안 환류하였다. 이 시간 이후에, 고체를 여과하고, DCM(500 mL)으로 세척하고 1 M 염산(50 mL) 용액에 현탁하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 환류하였다. 생성된 갈색 현탁액을 여과 건조하여 조 생성물을 수득하고, 이를 역상 컬럼 크로마토그래피(25 g, 12 CV 상에서 MeCN:H2O 5% 내지 95%)로 정제하여 백색 고체로서 2,5-디히드록시-3-[(2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸티오메틸]벤조산을 수득하였다(1.1 g, 0.003 mol, 26%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.70분; m/z = 365.1 [M-H]-, 피크 영역 >95%
Figure pct00276
실시예:
62) 3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IVc-058a:
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.70분; m/z = 365.1 [M-H]-, 피크 영역 >95%
Figure pct00277
반응식 23: X = SO 2
Figure pct00278
화합물 IVc-058a 로부터의 합성
3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산. DMF(20.0 mL) 중의 티오에터 IVc-058a(4.25 g, 9.28 mmol) 용액에 DMF(20.0 mL) 중의 3-클로로벤젠-1-카보퍼옥시산(mCPBA 순도 등급 ≤77%, 5.80 g, 25.88 mmol) 용액을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 조 생성물을 HPLC 정제에 적용하여(일반적인 조건 참조) 백색 고체(3.20 g)를 수득하고 이를 1 M HCl(50 mL)로 연마하여 백색 고체로서 원하는 생성물을 수득하였다(2.55 g, 6.40 mmol, 56%)
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.68분; m/z = 397.1 [M-H]-, 피크 영역 >95%
63) 3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산, 화합물 IVc-059a:
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.68분; m/z = 397.1 [M-H]-, 피크 영역 >95%
Figure pct00279
디메틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.94분; m/z = 427.1 [M+H]+, 피크 영역 >95%
Figure pct00280
디메틸 에스터 테트라아세테이트
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.05분; m/z = 593.1 [M-H]-, 피크 영역 >95%
Figure pct00281
대안적인, 확장 가능한 IVc-059a의 합성
반응식 24: 2,5-디벤질옥시프탈알데히드로부터 IVc-059a의 합성
Figure pct00282
2,5-비스(벤질옥시)-3-(히드록시메틸)벤즈알데히드 [단계 1]: 2,5-비스(벤질옥시)-이소프탈알데히드(25.0 g, 72.1 mmol)(반응식 9b 참조)를 THF(150 mL) 중에 용해하고 EtOH(15 mL)를 첨가하였다. 갈색 용액을 질소의 양(positive)의 흐름 하에 유지하고 실온에서 10분 동안 교반한 다음 고체 NaBH4(695 mg, 18.37 mmol)를 20분에 걸쳐 조금씩 첨가하고, 반응의 내부 온도가 25℃를 초과하지 않게 하였다(수조 사용). 반응 혼합물을 실온에서 30분동안 교반하게 둔 다음 출발 물질(총: 107 mg, 2개 부분)의 전환이 완료될 때까지 매 15분 마다 추가의 NaBH4를 첨가하였다. 이어서 반응 혼합물을 물(1.2 L)에 붓고 20분 동안 교반하였다. 이에 따라 형성된 갈색 침전물을 여과에 의해 단리하고 수득된 고체를 40℃의 진공 오븐에서 일정한 질량이 될 때까지 추가로 건조하여 갈색 오일로서 표제 화합물(22.9 g, 76% 보정된 수율)을 수득하였다. NMR 프로파일은 83%의 원하는 생성물, 15%의 과-환원된 디올, 2%의 출발 물질을 나타냈으며, 물질은 추가 정제 없이 다음 단계로 보냈다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): r.t = 1.19분, 86%, m/z = 347.2 [M-H]-
Figure pct00283
2,5-비스(벤질옥시)-3-(히드록시메틸)벤조산 [단계 2]: 2,5-비스(벤질옥시)-3-(히드록시-메틸)벤즈알데히드(44.3 g, 103 mmol, 81% 순도) 및 KH2PO4(25.9 g, 190 mmol)를 아세톤(440 mL)과 물(130 mL) 중에 용해하였다. 레소르시놀(resorcinol)(21.0 g, 191 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 물(60 mL) 중의 소듐 클로라이트(21.5 g, 191 mmol) 용액을 30분에 걸쳐 천천히 첨가하고, 내부 온도가 25℃를 초과하지 않도록 하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 H3PO4(95 mL)의 2 M 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 20분 동안 교반하고 얼음조를 사용하여 6℃로 냉각하고 여과하였다. 고체를 여과액의 pH가 약 6이 될 때까지 물로 추가로 세척하였다. 수득된 고체를 물(약 300 mL)에 현탁하고 물(200 mL) 중의 NaOH(17 g, 412 mmol)의 미리 냉각된(5 내지 10℃) 용액에 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반하고 소결 깔때기에서 여과하였다. 단리된 고체를 1 M 수성 NaOH(2 × 50 mL) 및 물(50 mL)로 추가로 세척하였다. 이어서 알칼리성 액체를 미리 냉각된(5 내지 10℃) 6 N HCl 수용액을 사용하여 pH 약 1이 될 때까지 산성화하였다. 생성된 현탁액을 20분 동안 자기적으로 교반하고 여과하고, 수득된 고체를 40℃의 진공 오븐에서 일정한 질량이 될 때까지 추가로 건조하여 연한 베이지색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다(34.8 g, 88%).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.06분, 99%, m/z = 363.2 [M-H]-.
Figure pct00284
에틸 2,5-비스(벤질옥시)-3-(히드록시메틸)벤조에이트 [단계 3]: 2,5-비스(벤질옥시)-3-(히드록시-메틸)벤조산(32.5 g, 89.3 mmol) 및 Cs2CO3(32.3 g, 99.2 mmol)을 DMF(200 mL) 중에 현탁하고 에틸 요오다이드(9.0 mL, 112 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 실온에서 3시간 동안 교반한 후에 반응 혼합물을 NH4Cl의 포화 수용액(1 L)에 붓고 고체 NaCl(약 30 g)을 첨가하였다. 10분 동안 교반한 후, 물질을 EtOAc(2 × 500 mL)로 추출하였다. 모은 유기 층을 염수(2 × 500 mL)로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축하여 갈색 오일 잔류물(42.0 g, 조(crude), 89.3 mmol)을 수득하였다. 조 물질을 추가 정제 없이 다음 단계로 옮겼다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.24분, 93%, m/z = 약한 이온화.
Figure pct00285
에틸 2,5-비스(벤질옥시)-3-(클로로메틸)벤조에이트 (KI-14) [단계 4]: 에틸 2,5-비스(벤질옥시)-3-(히드록시메틸)벤조에이트(이전 단계로부터의 42 g의 조 물질, 89.3 mmol)를 불활성 대기(N2) 하에 DCM(200 mL) 중에 용해한 다음, SOCl2(9.8 mL, 133.9 mmol)를 0℃(얼음조)에서 첨가하고 반응 혼합물을 실온까지 가온되도록 하였다. 2시간 후에 휘발성 물질을 감압 하에 제거한 다음 톨루엔(3 × 100 mL)을 사용하여 공비 증류(azeotrope distillation)하여 반 고체의 갈색 오일을 수득하였다(38.0 g, 조, 89.3 mmol).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.40분, 91%, m/z = 약한 이온화.
Figure pct00286
비스(2,5-디벤질옥시-3-에톡시카보닐페닐메틸)설파이드 [단계 5]: DMF(420 mL) 중의 KI-14(38.0 g, 조 물질, 89.3 mmol) 용액에 티오아세트아미드(8.4 g, 111.8 mmol)를 첨가하고 이어서 K2CO3 - 325 메시(16.7 g, 120.8 mmol)를 첨가하였다. 반응을 45℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응을 실온으로 냉각시킨 다음 티오아세트아미드(2.5 g, 33.3 mmol) 및 K2CO3 - 325 메시(5.0 g, 36.1 mmol)를 첨가하고 45℃에서 18시간 동안 추가로 교반하여 반응을 완료하였다. 반응 혼합물을 물(4 L)에 부었다. 반응 혼합물을 20분 동안 교반하고 EtOAc(2 L)를 첨가한 다음 이어서 고체 NaCl(약 60 g)을 첨가하였다. 상을 분리한 다음 EtOAc(1.5 L)를 사용하여 추가로 추출하였다. 모은 유기 층을 염수(1.5 L)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축하여 갈색 오일로서 조 표제 화합물(39.8 g, 44.6 mmol)을 수득하였으며 이를 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다.
UPLCMS (산성 방법, 2min): rt = 1.57분, m/z = 800.5 [M+NH4]+, 피크 영역 77%.
Figure pct00287
비스(2,5-디벤질옥시-3-에톡시카보닐페닐메틸)설폰 [단계 6]: 아세트산(850 mL) 중의 비스(2,5-디벤질옥시-3-에톡시카보닐페닐메틸)설파이드(39.8 g 조, 44.6 mmol) 용액에 30 중량%의 히드로겐 퍼옥시드(50 mL, 490 mmol) 용액을 천천히 첨가하였다. 반응을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음/물(5 L)에 붓고 실온에서 30분 동안 교반한 다음 EtOAc(2 L) 및 고체 NaCl(약 40 g)을 첨가하였다. 상을 분리한 후에, 수성 층을 EtOAc(1 L)로 한번 더 추출하였다. 모은 유기 층을 염수(1.5 L)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고 감압 하에 농축하여 갈색 고체를 수득하였다. 고체를 MTBE(250 mL) 중에 현탁하고 30분 동안 자기적으로 교반한 다음 여과하고 MTBE(150 mL)로 추가로 연마하여 표제 화합물을 수득하였다(23.56 g, 28.9 mmol, 4개 단계에 걸쳐 64% 수율).
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.48분; m/z = 832.5 [M+NH4]+, 피크 영역 96%
Figure pct00288
비스(2,5-디벤질옥시-3-카복시페닐메틸)설폰 [단계 7]: 물(100 mL) 중의 리튬 히드록시드(9.7 g, 233 mmol) 용액에 THF(350 mL) 중의 비스(2,5-디벤질옥시-3-에톡시카보닐페닐메틸)설폰(33.3 g, 38.8 mmol) 용액을 첨가하고 생성된 혼합물을 환류에서 18시간 동안 교반하였다. 이 시간 이후에, 대부분의 THF를 감압 하에 제거하여 백색 현탁액을 수득하였다. 물(3 L) 및 소듐 히드록시드 수용액(1 M, 1 L) 첨가 시, 혼합물은 현탁액을 유지하였다. 현탁액을 실온에서 18시간 동안 교반하고 6 M 수성 염산 용액을 첨가하여 수성 층을 pH 약 1로 산성화하고 생성된 고체를 여과하여 수집하고, 액체가 중성이 될 때까지 물로 세척하고, 이에 따라 수득된 백색 고체를 40℃의 진공 오븐에서 일정한 질량이 될 때까지 추가로 건조하여 백색 고체로서 표제 화합물(29.4 g, 38.7 mmol, 99%)을 수득하였다.
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.39분; m/z = 757.1 [M-H]-, 피크 영역 100%
Figure pct00289
비스(2,5-디히드록시-3-카복시페닐메틸)설폰 [단계 8], IVc-059a: EtOH(140 mL) 및 THF(140 mL)중의 비스(2,5-디벤질옥시-3-카복시페닐메틸)설폰(10.08 g, 13.28 mmol) 현탁액에 탄(charcoal) 상의 팔라듐(20% 중량, 2 g)을 물(20 mL) 중의 현탁액으로서 첨가하였다. 여러 번의 진공/수소 사이클 후 혼합물을 H2의 대기 하에 25℃에서 유지하고 20시간 동안 교반하였다. 완료 후, 혼합물을 THF를 사용하여 셀라이트®를 통해 여과하였다. 여과액을 감압 하에 농축하여 회백색 고체를 수득하였다. 이어서 잔류물을 아세토니트릴(100 mL) 중에 현탁하고 자기 교반 하에 환류로 가열하고, 이어서 혼합물을 -5℃로 냉각하고 여과하고 차가운 아세토니트릴로 추가로 세척하였다. 생성물을 40℃의 진공 오븐에서 일정한 질량이 될 때까지 추가로 건조하여 백색 고체로서 원하는 생성물을 수득하였다(5.35 g, 12.78 mmol, 96%).
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.67분; m/z = 397.1 [M-H]-, 피크 영역 100%
NMR 데이터: 상기 참조.
실시예 1.12 - 유형 V의 분자 : 참조 화합물
5-히드록시이소프탈산으로부터 유래된 디아미드
2개 실시예
Figure pct00290
합성 반응식 및 절차
반응식 25: V-001a의 합성
Figure pct00291
아미드 연결 형성
아닐린 A(2 몰) 또는 메틸 5-아미노살리실레이트를 사용하는 아미드 커플링 [3B]에 대한 일반적인 절차 B를 참조한다.
탈보호 절차: 일반적인 절차 [4], [5]를 참조한다.
보다 세부사항에 대하여 도 8을 참조한다.
예를 들어
Figure pct00292
64) 5-히드록시이소프탈산 비스-N-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)아미드(V-001a)
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 0.72분; m/z = 483.0 [M+H]+, 피크 영역 >95%
Figure pct00293
디에틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 2분): rt = 1.09분; m/z = 539.2 [M-H]-, 피크 영역 94%
Figure pct00294
Figure pct00295
65) 5-히드록시이소프탈산 비스-N-(3-카복시-4-히드록시페닐)아미드(V-002a)
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.00분; m/z = 451.1 [M-H]-, 피크 영역 97%
Figure pct00296
우레아-연결된 겐티신산 단위 1개 실시예
Figure pct00297
합성 반응식 및 절차
반응식 26: V-003a의 합성
Figure pct00298
우레아 연결 형성
KI-1로부터의 절차:
N ,N'-비스(2,5-디벤질옥시-4-에톡시카보닐페닐)우레아. 불활성 대기(N2) 하에, THF(25 mL) 중의 2,5-비스(벤질옥시)-4-(에톡시카보닐)벤조산(KI-1)(2.0 g, 4.9 mmol) 및 Et3N(1.6 mL, 11.3 mmol)의 냉각된 용액(얼음조)에 DPPA(1.1 mL, 5.2 mmol)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 천천히 가온하고 이 온도에서 3시간 동안 교반하였다. 이어서 tBuOH(8 mL)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 프로파일은 원하는 Boc-아닐린 대신 대부분의 우레아 연결 생성물을 나타냈다. 혼합물을 소듐 히드로겐카보네이트(250 mL)의 포화 용액에 붓고 5분 동안 교반하고 EtOAc(3 × 50 mL)로 추출하였다. 합한 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 여과하고, 감압 하에 농축하여 무색 오일을 수득하였다. 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(이소-헥산/EtOAc 1:0 후 30% EtOAc에 대한 구배)로 정제하여 회백색 고체로서 표제 화합물(1.1 g, 56%)을 수득하였다.
UPLC-MS (염기성 방법, 2분): rt = 1.50분; m/z = 781.2 [M+H]+, 피크 영역 85%
Figure pct00299
탈보호 절차: 일반적인 절차 [4], [5]를 참조한다.
보다 상세한 사항에 대하여 도 8을 참조한다.
예를 들어
66) N ,N'-비스(2,5-디히드록시-4-카복시페닐)우레아(V-003a)
Figure pct00300
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 0.90분; m/z = 363.1 [M-H]-, 피크 영역 93%
Figure pct00301
디에틸 에스터
UPLC-MS (산성 방법, 4분): rt = 1.79분; m/z = 419.2 [M-H]-, 피크 영역 97%
Figure pct00302
실시예 1.13: 염의 형성
a) 고체.
일반적인 프로토콜: 적절한 당량 수의 염기를 물 중의 원하는 화합물의 용액 또는 현탁액에 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 초음파 처리하고, 필요한 경우 수성 HCl 또는 과량의 염기를 첨가하여 pH를 7.0 내지 7.4 사이의 값으로 조정한 다음, 용액을 동결 건조하여 고체로서 염을 수득하였다. 대안적으로 특정 염은 DMSO 중에 용해시킨 후 EtOH로 침전시켜 수득될 수 있다(IIc-007a). 고체를 다음의 염기로부터 생성하였다: 소듐 히드록시드, 디에틸아민(DEA), 리신(Lys), 메글루민(Meg), 트리에탄올아민(TEA).
예를 들어:
pH 조정 없이 일반적인 프로토콜에 따라 고체로서 Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a의 소듐 및 디에틸암모늄(DEA) 염을 수득하였다.
- 물에서의 대략적인 용해도:
Ic-007a-DEA2: < 10 mg/mL
Ic-007a-DEA3: > 20 mg/mL
IIc-007a-DEA1: > 10 mg/mL
IIc-007a-DEA2: > 20 mg/mL
IIIc-061a-DEA3: > 25 mg/mL
- 유리 산 및 고체로서 염 안정성:
유리 산 Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a, 및 다음의 염 Ic-007a-DEA2, IIc-007a-DEA2, IIIc-061a-DEA3은 4℃, 20℃ 및 40℃의 온도에서 최대 56일 동안 고체로서 안정하였다; 염 Ic-007a-DEA3은 최대 36일 동안 동일한 온도에서 안정하였다.
b) 용액
일반적인 프로토콜: 적절한 당량 수의 염기를 물 중의 원하는 화합물의 용액 또는 현탁액에 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 초음파 처리하고, 필요한 경우 수성 HCl 또는 과량의 염기를 첨가하여 pH를 7.0 내지 7.4의 값으로 조정하여 용액으로서 염을 수득하였다. 다음의 염기를 조사하였다: 에틸아민, 트리에틸아민, 에틸렌디아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 콜린, 메글루민, 리신 및 아르기닌.
예를 들어:
Ic-007a의 염:
40℃에서 2일 동안 혼합물을 교반한 후 메글루민, 리신 및 디에탄올아민으로 가용성 염을 수득하였다. Ic-007a-Lys2 염의 고체 형태를 에탄올로 침전시켜 DMSO로부터 수득하였다. 염은 실온에서 적어도 7일 동안 물 중에서 용액으로서 안정하였다.
IIc-007a의 염:
DEA1-염: 소규모로, 모노-디에틸암모늄 염을 pH 조정 없이 일반적인 절차로 수득하였다. 용해도: 17.4 mg/mL 대 모 이산(parent diacid)의 경우 1.8 mg/mL
대규모 공정 및 특성분석:
IIc-007a(20 g, 42.7 mmol)을 EtOH(200 ml)로 채웠다. 반응을 실온에서 교반하여 슬러리를 수득하였다. DEA(4.4 ml, 42.7 mmol)를 채우고 반응을 50℃에서 2시간 동안 가열하였다. 배치를 실온으로 냉각하고 고체를 여과해냈다. 필터 케이크를 EtOH(50 mL)로 세척하고 40℃의 오븐에서 건조하여 98% 수율로 황색 고체로서 21.5 g의 모노-DEA 염을 수득하였다. NMR: 1.6% EtOH, 1.04eq DEA. HPLC: 99.6%.
IIc-007a의 모노-DEA 염에 대한 고체-상태 데이터는 XRPD 분석에서 분명한 결정질 패턴을 나타냈다. TGA 추적은 EtOH가 60 내지 80℃에서 건조(dry off)될 수 있음을 나타내는 120℃ 미만의 소량의 EtOH 손실을 나타냈다. 그런 다음 DSC에서 용융 흡열(273.8℃에서 피크)과 관련된 DEA(1:1 염에 대한 이론 13.5% wt)의 손실을 관찰한 후, 유리 산 형태의 용융이 이어졌다.
DEA2-염, pH 조정됨: pH 조정(pH=7.25에 도달하는데 필요한 Et2NH의 0.51 추가 당량)이 있는 일반 절차에 의해 수득하였다. 용액 내 염은 40℃에서 21일 후에 명확한 분해를 나타내고, 80℃에서 24시간 후에 광범위한 분해를 나타낸다.
DEA2-염, pH 조정되지 않음: pH 조정 없이 일반 절차에 의해 수득하였다. 용액의 pH = 5.87. 용액 중의 염은 4℃, 20℃ 및 40℃에서 21일 후에 분해를 나타내지 않았다.
Lys2-염, pH 조정되지 않음: 2 당량의 L-리신을 사용하여 일반적인 절차에 의해 수득하였다. 용액의 pH = 5.74.
참고: 2-히드록시이소프탈산의 비스 (N-메틸)아미드(페놀의 pKa = 6.81)와 유사하게, IIc-007a의 이소프탈산 비스-아미드 코어의 2-OH기는 현저하게 산성이며 이것이 이온화되면 분자의 분해가 일어난다. 이러한 효과는 Ic-007a에서는 관찰되지 않는다(9.8 내지 10.0 범위의 페놀성 작용기 예상 pKa). 따라서 IIc-007a의 2가양이온성(dicationic) 염 용액의 pH를 조정하지 않는 것이 중요하다.
IIIc-061a의 염:
DEA3-염, pH 조정됨: pH 조정과 함께 3 당량의 Et2NH를 사용하는 일반 절차에 의해 수득하였다(최종 pH=7.22에 도달하는 데 필요한 0.8 당량의 추가 HCl(0.5 M)). 용액 중의 염은 4℃, 20℃에서 21일 후에 분해를 나타내지 않았고, 33일 후에 40℃에서 약간의 분해를 나타냈다.
Meg3-염, pH 조정됨: 최종 pH=7.22(HCl 0.5 M)에 도달하도록 pH 조정과 함께 3 당량의 메글루민을 사용하는 일반적인 절차에 의해 수득하였다. 용액 중의 염은 4℃, 20℃에서 21일 후 및 40℃에서 14일 후 분해를 나타내지 않았다.
IVc-059a의 염,
DEA2-염, pH 조정됨: pH 조정(pH=7.3에 도달하는 데 필요한 Et2NH의 0.32 추가 당량)과 함께 일반 절차에 의해 수득하였다. 용액 중의 염은 4℃, 20℃ 및 40℃에서 26일 후에 안정성을 나타낸다.
실시예 1.14: 전구약물
Ic-007a의 전구약물
1) 2-모폴리노에틸 5-[[2,5-디히드록시-4-[[4-히드록시-3-(2-모폴리노에톡시카보닐) 페닐]카바모일]벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조에이트(Ic-007a-mpe2)
Figure pct00303
에스터화. N,N-디메틸포름아미드(4 ml) 중의 5-[[2,5-디벤질옥시-4-[(3-카복시-4-히드록시페닐) 카바모일]-벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조산(130 mg, 0.2 mmol) 현탁액을 실온에서 교반하였다. N,N-디메틸피리딘-4-아민(49 mg, 0.4 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드(0.5 ml) 중의 2-모폴리노에탄올(53 mg, 0.4 mmol) 용액을 첨가하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드(115 mg, 0.6 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 마이크로파 반응기에서 60℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 테트라히드로퓨란으로 희석하고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 중의 0 내지 40% 메탄올로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다(80 mg, 45%). LCMS (m/z) [M+H] 875.1.
수소화분해: 테트라히드로퓨란(12 ml) 및 물(4 ml) 중의 상기 수득된 디에스터(80 mg, 0.092 mmol) 용액을 제조하고 탄소 상의 10% 팔라듐(50 mg, 10% 페이스트)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 대기 하에 17시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거하고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 역상 분취 HPLC에 의해 C18 컬럼 상에서 10 내지 97%(아세토니트릴 + 0.1% 포름산):(물 + 0.1% 포름산)의 구배를 사용하여 정제하였다. 잔류물을 디에틸 에터로 연마하고 진공 하에 건조하여 황색 고체로서 표제 화합물 Ic-007a-mpe2를 수득하였다(22 mg, 35%).
Figure pct00304
2) 5-[[2,5-디히드록시-4-[[4-히드록시-3-(2-모폴리노에톡시카보닐)페닐]카바모일] 벤조일] 아미노]-2-히드록시-벤조산(Ic-007a-mpe1)
Figure pct00305
에스터화. N,N-디메틸포름아미드(7 ml) 중의 5-[[2,5-디벤질옥시-4-[(3-카복시-4-히드록시-페닐)-카바모일]벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조산(324 mg, 0.5 mmol) 및 트리에틸아민(101 mg, 0.15 ml, 1 mmol)의 용액을 실온에서 교반하였다. N,N-디메틸포름아미드(1 ml) 및 N,N-디메틸피리딘-4-아민(122 mg, 1 mmol) 중의 2-모폴리노에탄올(66 mg, 0.5 mmol) 용액을 첨가하였다. 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 히드로클로라이드(115 mg, 0.6 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음 마이크로파에서 60℃에서 4시간 동안 가열하였다. 반응을 유사한 규모로 반복하고 반응 혼합물을 합쳤다. 용매를 증발시키고 잔류물을 디에틸 에터로 연마하여 모노 및 디에스터의 혼합물을 수득하였다(230 mg). LCMS (m/z) [M+H] 762.0(모노 에스터).
수소화분해. 상기 수득된 모노 및 디에스터(230 mg)의 혼합물을 아세트산(10 ml), 테트라히드로퓨란(15 ml) 및 물(5 ml) 중에 용해하고 탄소 상의 10% 팔라듐(150 mg, 10% 페이스트)을 첨가하였다 반응 혼합물을 수소 대기 하에 16시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거하고 용매를 증발시켜 황색 검을 수득하였다(140 mg). 잔류물을 역상 분취 HPLC로 C18 컬럼 상에서 10 내지 70% (아세토니트릴 + 0.1% 포름산):(물 + 0.1% 포름산)의 구배를 사용하여 정제하였다. 잔류물을 디에틸로 연마하고 진공 하에 건조하여 황색 고체로서 표제의 모노에스터 Ic-007a-mpe1을 수득하였다(11 mg).
Figure pct00306
3) 1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에틸 5-[[4-[[3-[1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에톡시카보닐]-4-히드록시-페닐]카바모일]-2,5-디히드록시-벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조에이트(Ic-007a-pive2)
및
4) 5-[[4-[[3-[1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에톡시카보닐]-4-히드록시-페닐]카바모일]-2,5-디히드록시-벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조산(Ic-007a-pive1)
Figure pct00307
에스터화. N,N-디메틸포름아미드(10 mL) 중의 5-[[2,5-디벤질옥시-4-[(3-카복시-4-히드록시-페닐)카바모일] 벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조산(324 mg, 0.5 mmol) 및 트리에틸아민(152 mg, 0.21 mmol) 용액을 0℃에서 교반하고 1-요오도에틸 2,2-디메틸프로파노에이트(572 mg, 2 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물이 실온으로 가온되도록 하고 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 디메틸포름아미드를 증발시키고 잔류물을 디클로로메탄과 수성 소듐 메타바이설파이트 사이에서 분할하였다. 유기 상을 무수 마그네슘 설페이트 상에서 건조 증발시켜 모노 및 디에스터의 1:1 혼합물(187mg)을 수득하였다. 반응을 반복하고 에스터의 1:1 혼합물을 합하였다. LCMS (m/z) [M+H] 777.0(모노 에스터) 및 905.1(디에스터).
Figure pct00308
수소화분해
상기 수득된 모노 및 디에스터(320 mg)의 혼합물을 테트라히드로퓨란(50 ml) 및 물(5 ml) 중에 용해하고 탄소 상의 10% 팔라듐(300 mg, 10% 페이스트)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 대기 하에 20시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거하고 용매를 증발시켰다. LCMS는 단지 부분적인 탈보호가 달성되었음을 나타냈다. 잔류물을 테트라히드로퓨란(36 ml) 및 물(6 ml) 중에 용해하고 탄소 상의 10% 팔라듐(600 mg, 10% 페이스트)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 대기 하에 22시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거하고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 역상 분취 HPLC로 C18 컬럼 상에서 40 내지 97% (아세토니트릴 + 0.1% 포름산):(물 + 0.1% 포름산)의 구배를 사용하여 정제하였다. 잔류물을 디에틸 에터로 연마하고 진공 하에 건조하여 표제 생성물을 수득하였다:
Figure pct00309
바이오데이터: T1/2(마우스 혈장): 62.2분(에스터 절단됨; 1시간 후 65% 잔류); T1/2(인간 혈장): > 180분.
Figure pct00310
바이오데이터: T1/2(마우스 혈장): 44.6분(에스터 절단됨; 1시간 후 49% 잔류); T1/2(인간 혈장): > 180분.
IIc-007a의 전구약물
1) 2,2-디메틸프로판오일옥시메틸 5-[[3-[[3-(2,2-디메틸프로판오일옥시메톡시카보닐)-4-히드록시-페닐]카바모일]-2,5-디히드록시-벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조에이트 (IIc-007a-pivm2)
Figure pct00311
에스터화. N,N-디메틸 포름아미드 중의 5-[[2,5-디벤질옥시-3-[(3-카복시-4-히드록시-페닐)카바모일] 벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조산(280 mg, 0.432 mmol) 용액을 제조하고 클로로메틸 2,2-디메틸프로파노에이트(137 μL, 0.95 mmol)를 첨가하고, 이어서 트리에틸아민(167 μL, 1.2 mmol)) 및 소듐 요오다이드(143 mg, 0.95 mmol)를 첨가하였다. 교반한 용액을 50℃에서 18시간 동안 가열하였다. 이어서 용액을 냉각하고 포화 암모늄 클로라이드 용액과 에틸 아세테이트 사이에서 분할하였다. 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 여과 증발시켰다. 잔류물을 100% 이소-헥산 대 50% 에틸 아세테이트, 50% 이소-헥산의 구배를 사용하여 실리카 컬럼 상에서 크로마토그래피로 정제하여 무색 검으로서 디에스터를 수득하였다(192 mg, 51%). LCMS (m/z) [M+H] 876.9.
수소화분해: 테트라히드로퓨란(4.5 mL) 중의 상기 수득된 디에스터(192 mg, 0.219 mmol) 용액을 제조하고 물(1.5 mL) 중의 탄소 상의 10% 팔라듐(40 mg, 0.04 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 교반된 반응 혼합물을 수소 대기 하에 18시간 동안 두었다. 반응을 여과하여 촉매를 제거하고 용액을 증발시켜 크림 고체를 수득하였다(142 mg). 고체를 60% 아세토니트릴, 40% 물 대 100% 아세토니트릴(0.1% 포름산)의 구배를 사용하여 C18 컬럼 상에서 HPLC에 의해 정제하여 백색 고체로서 표제 디에스터 IIc-007a-pivm2를 수득하였다(75 mg, 49%). 1H NMR (DMSO-D6 ppm) δ 13.03 (br s, 1H), 10.43 (br s, 2H), 10.16 (s, 2H), 9.52 (br s, 1H), 8.17 (d, J=2.7Hz, 2H), 7.82 (dd, J=8.9Hz, 2.7Hz, 2H), 7.55 (s, 2H), 7.02 (d, J=8.9Hz, 2H), 5.98 (s, 4H), 1.17 (s, 18H). LCMS (m/z) [M-H] 694.9.
2) 5-[[3-[[3-[1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에톡시카보닐]-4-히드록시-페닐]카바모일]-2,5-디히드록시-벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조산(IIc-007a-pive1)
Figure pct00312
에스터화. N,N-디메틸포름아미드(10 ml) 중의 5-[[2,5-디벤질옥시-3-[(3-카복시-4-히드록시- 페닐)카바모일] 벤조일]아미노]-2-히드록시-벤조산(324 mg, 0.5 mmol) 및 트리에틸아민(101 mg, 0.14 ml, 1.0 mmol) 용액을 0℃에서 교반하였다. 1-요오도에틸 2,2-디메틸프로파노에이트(154 mg, 0.6 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 21시간 동안 교반하였다. 추가 트리에틸아민(0.14 ml, 1.0 mmol) 및 1-요오도에틸 2,2-디메틸프로파노에이트(154 mg, 0.6 mmol)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄과 소듐 메타바이설파이트 용액 사이에서 분할하였다. 유기 추출물을 합하고, 염수로 세척하고 용액을 소수성 프릿(frit)에 통과시켜 건조하였다. 여과액을 증발시켜 모노 및 디에스터 혼합물을 수득하였다. 잔류물을 이소-헥산 중의 5 내지 100% 에틸 아세테이트 및 이어서 디클로로메탄 중의 10% 메탄올로 용리하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 황색 고체로서 모노 에스터를 수득하였다(121 mg). LCMS (m/z) [M+H] 777.
수소화분해. 탄소 상의 10% 팔라듐(250 mg, 10% 페이스트)을 함유하는 테트라히드로퓨란(16 ml) 및 물(4 ml) 중의 상기 수득된 모노에스터 용액(121 mg, 0.15 mmol)을 수소 대기 하에서 18시간 동안 교반하였다. 촉매를 여과하여 제거하고 용매를 증발시켰다. 잔류물을 40 내지 97% (아세토니트릴 + 0.1% 포름산):(물 + 0.1% 포름산)의 구배를 사용하는 역상 분취 HPLC로 정제하여 황색 고체로서 모노에스터 IIc-007a-pive1을 수득하였다(34 mg). 1H NMR (DMSO-D6" ppm) δ 13.15 (br s, 1H), 10.47 (br s, 2H), 10.18 (s, 1H), 9.47 (br s, 1H), 8.21 (d, J=3 Hz 1H), 8.17 (d, J=3 Hz 1H), 7.82 (dd, J=9, 3 Hz 1H), 7.78 (dd, J=9, 3 Hz 1H), 7.59-7.55 (m, 2H), 7.03 (d, J=9 Hz 1H), 6.99 (q, J=5.4 Hz 1H), 7.96 (d, J=9 Hz 1H), 1.58 (d, J=5.4 Hz, 3H), 1.17 (s, 9H). LCMS (m/z) [M-H] 595.1.
IVc-059a의 전구약물
1) 2,5-디히드록시-3-[[2,5-히드록시-3-(2-모폴리노에톡시카보닐)페닐] 메틸설포닐-메틸]벤조산 (IVc-059a-mpe1)
Figure pct00313
에스터화. N,N-디메틸포름아미드(93 mL) 중의 2,5-디벤질옥시-3-[(2,5-디벤질옥시-3-카복시페닐) 메틸설포닐-메틸]벤조산(300 mg, 0.40 mmol) 및 2-모폴리노에탄올(53 mg, 0.40 mmol) 용액을 제조하고 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC, 93 mg, 0.48 mmol) 및 N,N-디메틸피리딘-4-아민(10 mg, 0.08 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 증발 건조하고 잔류물을 30% 아세토니트릴, 70% 물 대 100% 아세토니트릴(0.1% 포름산)의 구배를 사용하는 C18 컬럼 상의 HPLC로 정제하여 무색 검으로서 모폴리노에틸 에스터를 수득하였다(111 mg, 32%). LCMS (m/z) [M+H] 872.1.
수소화분해. 테트라히드로퓨란(3 mL) 중의 상기 모노에스터(111 mg, 0.127 mmol) 용액을 물(1 mL) 중의 탄소 상의 10% 팔라듐(20 mg, 0.019 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 교반된 반응 혼합물을 수소 대기 하에 18시간 동안 두었다.
반응을 여과하여 촉매를 제거하고 용액을 증발시켜 갈색 고체를 수득하였다. 고체를 10% 아세토니트릴, 90% 물 대 60% 아세토니트릴, 40% 물(0.1% 포름산)의 구배를 사용하는 C18 컬럼 상의 HPLCf로 정제하여 백색 고체(20.5 mg)를 수득하였다. 고체를 디에틸 에터로 연마하고 진공 하에 건조하여 백색 고체로서 표제 생성물 IVc-059a-mpe1을 수득하였다(5 mg, 8%).
Figure pct00314
바이오데이터: 마우스 혈장에서 최대 60분까지 안정함
2) 2,5-디히드록시-3-[[2,5-히드록시-3-(2-모폴리노에톡시카보닐)페닐] 메틸설포닐-메틸]벤조산 2-모폴리노에틸 에스터(IVc-059a-mpe2)
Figure pct00315
N,N-디메틸포름아미드(1 mL) 중의 2,5-디벤질옥시-3-[(2,5-디벤질옥시-3-카복시페닐)메틸설포닐메틸]벤조산(69 mg, 0.091 mmol) 및 2-모폴리노에탄올(25 mg, 0.19 mmol) 용액을 제조하고 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(42 mg, 0.48 mmol) 및 N,N-디메틸피리딘-4-아민(5 mg, 0.04 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 증발 건조하고 잔류물을 10% 메탄올, 90% 디클로로메탄을 사용하는 실리카 컬럼 상의 크로마토그래피로 정제하여 무색 검으로서 표제 생성물을 수득하였다(58 mg, 65%). LCMS (m/z) [M+H] 985.0.
테트라히드로퓨란(1.5 mL) 중의 상기 수득된 디에스터(58 mg, 0.059 mmol) 용액을 제조하고 물(0.5 mL) 중의 탄소 상의 10% 팔라듐(5 mg, 0.005 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 교반된 반응 혼합물을 수소 대기 하에 18시간 동안 두었다. 반응을 여과하여 촉매를 제거하고 용액을 증발시켜 갈색 고체를 수득하였다. 고체를 10% 아세토니트릴, 90% 물 대 60% 아세토니트릴, 40% 물(0.1% 포름산)의 구배를 사용하는 C18 컬럼 상의 HPLC로 정제하여 백색 고체를 수득하였다(13.7 mg).
고체를 디에틸 에터로 연마하고 진공 하에 건조하여 백색 고체로서 표제 생성물 IVc-059a-mpe2를 수득하였다(9.1 mg, 25%).
Figure pct00316
바이오데이터: 마우스 혈장에서 최대 60분 안정함; T1/2 (인간 혈장): > 180분.
3) 3-[[3-[1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에톡시카보닐]-2,5-디히드록시-페닐]메틸-설포닐-메틸]-2,5-디히드록시-벤조산 1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에틸 에스터(IVc-059a-pive2)
Figure pct00317
에스터화. 무수 N,N-디메틸포름아미드(5 mL) 중의 2,5-디벤질옥시-3-[(2,5-디벤질옥시-3-카복시-페닐)메틸-설포닐메틸]벤조산(200 mg, 0.263 mmol) 용액을 제조하고 트리에틸아민(88 μL, 0.63 mmol), 소듐 요오다이드(8 mg, 0.053 mmol) 및 조 1-요오도에틸 2,2-디메틸프로파노에이트(약 4.2 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 적은 부피로 증발시키고 잔류물을 디클로로메탄과 소듐 티오설페이트 용액 사이에서 분할하였다. 유기 층을 소수성 프릿에 통과시켜 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 100% 이소-헥산 대 50:50 에틸 아세테이트/이소-헥산의 구배로 용리하는 실리카 겔 컬럼 상에서 크로마토그래피로 정제하여 무색 검으로서 디-이스터를 수득하였다(110 mg, 41%). LCMS (m/z) [M+Na] 1037.0
또한 동일한 컬럼으로부터 모노에스터를 무색 검으로서 단리하였다(90 mg, 40%). LCMS (m/z) [M+Na] 909.6.
수소화분해:
Figure pct00318
테트라히드로퓨란(3 mL) 중의 상기 단리된 디에스터(110 mg, 0.108 mmol) 용액을 물(1 mL) 중의 탄소 상의 10% 팔라듐(20 mg, 0.02 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 교반된 반응 혼합물을 수소 대기 하에 48시간 동안 두었다. 반응 혼합물을 여과하여 촉매를 제거하고, 용액을 증발시키고 잔류물을 100% 디클로로메탄 대 10% 메탄올, 90% 디클로로메탄의 구배로 용리하는 실리카 컬럼 상의 크로마토그래피로 정제하여 크림 고체로서 표제 생성물 IVc-059a-pive2을 수득하였다(55 mg, 78%).
Figure pct00319
바이오데이터: 마우스 및 인간 혈장에서 신속하게 가수분해됨
4) 3-[[3-[1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에톡시카보닐]-2,5-디히드록시-페닐]메틸설포닐-메틸]-2,5-디히드록시-벤조산 IVc-059a-pive1)
수소화분해:
Figure pct00320
테트라히드로퓨란(3 mL) 중의 상기 단리된 모노에스터(90 mg, 0.104 mmol) 용액을 물(1 mL) 중의 탄소 상의 10% 팔라듐(20 mg, 0.02 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 교반된 반응 혼합물을 수소 대기 하에 48시간 동안 두었다. 반응을 여과하여 촉매를 제거하고, 용액을 증발시키고 잔류물을 100% 디클로로메탄 대 20% 메탄올, 80% 디클로로메탄의 구배로 용리하는 실리카 컬럼 상의 크로마토그래피로 정제하여 크림 고체로서 표제 생성물 IVc-059a-pive1을 수득하였다(22.5 mg, 43%).
Figure pct00321
바이오데이터: 마우스 혈장에서 신속하게 가수분해됨
5) 2,2-디메틸프로판오일옥시메틸 2,5-디히드록시-3-[[2,5-디히드록시-3-(2,2-디메틸-프로판오일옥시메톡시카보닐)페닐]메틸설포닐메틸] 벤조에이트(IVc-059a-pivm2)
Figure pct00322
에스터화. 무수 N,N-디메틸포름아미드(1 mL) 중의 2,5-디벤질옥시-3-[(2,5-디벤질옥시-3-카복시-페닐) 메틸설포닐-메틸]벤조산(100 mg, 0.131mmol) 용액을 제조하고 클로로메틸 2,2-디메틸프로파노에이트(91μL, 0.631mmol)를 첨가한 후 트리에틸아민(110 μL, 0.789 mmol) 및 소듐 요오다이드(87 mg, 0.579 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 6.5시간 동안 가열하였다. 생성된 용액을 증발시키고 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에서 분할하였다. 유기 층을 소듐 설페이트 상에서 건조하고, 여과하고 증발시켰다. 잔류물을 100% 이소-헥산 대 50% 에틸 아세테이트, 50% 이소-헥산의 구배로 용리하는 실리카 겔 컬럼 상의 크로마토그래피로 정제하여 무색 검으로서 디에스터 생성물을 수득하였다(85 mg, 66%). LCMS (m/z) [M+Na] 1010.0.
수소화분해: 테트라히드로퓨란(3 mL) 중의 상기 수득된 디에스터(85 mg, 0.086 mmol)의 용액을 물(1 mL) 중의 탄소 상의 10% 팔라듐(20 mg, 0.02 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 교반된 반응 혼합물을 수소 대기 하에 18시간 동안 두었다. 반응을 여과하여 촉매를 제거하고, 용액을 증발시키고 잔류물을 100% 이소-헥산 대 60% 에틸 아세테이트, 40% 이소-헥산의 구배로 용리하는 실리카 겔 컬럼 상의 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 디에스터 IVc-059a-pivm2를 수득하였다(31 mg, 57%).
Figure pct00323
바이오데이터: 마우스 혈장에서 신속하게 가수분해됨, T1/2 = 14.1분; T1/2 (인간 혈장): > 180분.
6) 2,5-디히드록시-3-[[2,5-디히드록시-3-(2,2-디메틸프로판오일옥시메톡시카보닐)페닐] 메틸-설포닐메틸] 벤조산(IVc-059a-pivm1)
Figure pct00324
에스터화: 무수 N,N-디메틸포름아미드(3 mL) 중의 2,5-디벤질옥시-3-[(2,5-디벤질옥시-3-카복시페닐)메틸설포닐 메틸]벤조산(300 mg, 0.395mmol) 용액을 제조하고 클로로메틸 2,2-디메틸프로파노에이트(57 μL, 0.395 mmol)를 첨가하고 이어서 트리에틸아민(68 μL, 0.489 mmol) 및 소듐 요오다이드(129 mg, 0.870 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 4시간 동안 가열하였다. 생성된 용액을 냉각시키고, 증발시켰다. 잔류물을 20% 에틸 아세테이트, 80% 이소-헥산 대 80% 에틸 아세테이트, 20% 이소-헥산의 구배로 용리하는 실리카 컬럼 상의 크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 모노에스터 생성물을 수득하였다(121 mg, 35%). LCMS (m/z) [M-H] 871.0.
수소화분해: 테트라히드로퓨란(3 mL) 중의 상기 수득된 모노에스터(121 mg, 0.138 mmol)의 용액을 물(1 mL) 중의 탄소 상의 10% 팔라듐(20 mg, 0.02 mmol)의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 교반된 반응 혼합물을 수소 대기 하에 48시간 동안 두었다. 반응을 여과하여 촉매를 제거하고, 용액을 증발시키고 잔류물을 30% 아세토니트릴, 70% 물 대 100% 아세토니트릴(0.1% 포름산)의 구배로 용리하는 C18 컬럼 상의 HPLC로 정제하여 백색 고체로서 모노에스터 IVc-059a-pivm1을 수득하였다(30 mg, 42%).
Figure pct00325
바이오데이터: 마우스 혈장에서 신속하게 가수분해됨, T1/2 = 6.7분; T1/2 (인간 혈장): > 180분.
실시예 2: 일반적인 실험 방법
NMR 분광분석법
1H NMR 스펙트럼을 Bruker Advance III NMR 분광계에서 400 MHz으로 기록하였다. 샘플을 중수소화 클로로포름(CDCl3) 또는 디메틸설폭시드(DMSO-d 6 )에서 제조하였고 미가공 데이터를 Mnova NMR 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 고해상도 질량 스펙트럼을 MaXis ESI qTOF 초고해상도 질량 분석기로 기록하였다.
UPLC-MS 분석
Acquity I-Class Sample Manager-FL, Acquity I-Class Binary Solvent Manager 및 Acquity I-Class UPLC Column Manager로 구성된 Waters Acquity UPLC 시스템에서 UPLC-MS 분석을 수행하였다. UV 검출을 Acquity I-Class UPLC PDA 검출기(210 내지 400 nm에서 스캔)를 사용하여 달성한 반면, 질량 검출은 Acquity QDa 검출기(100 내지 1250 Da에서 질량 스캐닝; 포지티브 및 네거티브 모드 동시)를 사용하여 달성하였다. Waters Acquity UPLC BEH C18 컬럼(2.1 × 50 mm, 1.7 mm)을 사용하여 분석 물질을 분리하였다.
샘플은 H2O에 MeCN의 1:1(v/v) 혼합물 1 mL에 용해(초음파 처리 여부에 관계없이)하여 제조하였다. 생성된 용액을 분석에 적용하기 전에 0.45 μm 주사기 필터를 통해 여과하였다. 사용된 모든 용매(포름산 및 36% 암모니아 용액 포함)는 HPLC 등급으로 사용하였다.
이 작업에는 네 가지 상이한 분석 방법을 사용하였으며, 자세한 내용을 아래에 제시하였다.
산성 실행(2분): 물 중 0.1% v/v 포름산[용리액 A]; MeCN 중 0.1% v/v 포름산[용리액 B]; 유속 0.8 mL/분; 주입 부피 2 μL 및 샘플 사이의 1.5분 평형 시간.
시간 (분) 용리액 A(%) 용리액 B(%)
0.00 95 5
0.25 95 5
1.25 5 95
1.55 5 95
1.65 95 5
2.00 95 5
산성 실행 (4분): 물 중의 0.1% v/v 포름산[용리액 A]; MeCN 중의 0.1% v/v 포름산[용리액 B]; 유속 0.8 mL/분; 주입 부피 2 μL 및 샘플 사이의 1.5분 평형 시간.
시간 (분) 용리액 A(%) 용리액 B(%)
0.00 95 5
0.25 95 5
2.75 5 95
3.25 5 95
3.35 95 5
4.00 95 5
산성 실행(6.5분): 10 mM 암모늄 포르메이트 + 0.1% v/v 포름산[용리액 A]; MeCN 중의 0.1% v/v 포름산[용리액 B]; 유속 0.6 mL/분; 주입 부피 2 μL.
시간 (분) 용리액 A(%) 용리액 B(%)
0.00 95 5
0.50 95 5
4.00 5 95
4.50 5 95
4.52 95 5
6.50 95 5
염기성 실행(2분): 물 중의 0.1% 암모니아[용리액 A]; MeCN 중의 0.1% 암모니아[용리액 B]; 유속 0.8 mL/분; 주입 부피 2 μL 및 샘플 사이의 1.5분 평형 시간.
시간 (분) 용리액 A(%) 용리액 B(%)
0.00 95 5
0.25 95 5
1.25 5 95
1.55 5 95
1.65 95 5
2.00 95 5
염기성 실행(4분): 물 중의 0.1% 암모니아[용리액 A]; MeCN 중의 0.1% 암모니아[용리액 B]; 유속 0.8 mL/분; 주입 부피 2 μL 및 샘플 사이의 1.5분 평형 시간.
시간 (분) 용리액 A(%) 용리액 B(%)
0.00 95 5
0.25 95 5
2.75 5 95
3.25 5 95
3.35 95 5
4.00 95 5
염기성 실행(6.5분): 10 mM 암모늄 바이카보네이트 + 0.1 % v/v 35% 암모니아 용액[용리액 A]; MeCN 중의 0.1% v/v 포름산[용리액 B]; 유속 0.6 mL/분; 주입 부피 2 μL.
시간 (분) 용리액 A(%) 용리액 B(%)
0.00 95 5
0.50 95 5
4.00 5 95
4.50 5 95
4.52 95 5
6.50 95 5
분취용 HPLC 정제
분취용 HPLC를 XBridge Prep C18 컬럼(19 × 150 mm)이 있는 Waters 자동정제 시스템을 사용하여 수행하였다. Waters 시스템은 Waters 2545 Binary Prep Pump, Waters 2767 Sample Manager, Waters SFO Column Organiser, Waters 2998 DAD, Waters 515 Make up Pump 및 Acquity QDa 질량 분석기로 구성되어 있다.
정제 시스템을 Open Access Login 모듈이 있는 MassLynx 소프트웨어(버전 4.2)에 의해 제어하였다.
이동상은 (A) 10 mM 암모늄 포르메이트 (+ 0.1% v/v 포름산) 및 (B) 아세토니트릴(+ 0.1% v/v 포름산)으로 구성되어 있다.
샘플을 약 150 mg/mL의 농도를 제공하기 위해 DMSO 중 10% v/v 물에 용해하여 준비하였다. 준비된 샘플 320 mL의 부피를 컬럼에 로딩하고 실온에서 25 mL/분의 유속으로 구배 용리를 사용하여 정제하였다. 주입 사이에 1.5분의 평형이 있다.
구배:
시간 (분) % (A)
0.0 95
0.5 95
14.5 0
17.4 0
17.5 95
18.0 95
실시예 3: 시험관 내 스크리닝 방법
실시예 3.1: 시험관 내 HUVEC 세포 FGF1, FGF2 및 VEGF-A 억제 방법
이 시험관 내 방법의 목표는 회전 타원체-기반 세포 혈관신생 분석에서 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC: human umbilical vein endothelial cell)의 FGF-2, FGF-1 또는 VEGF-A 유도 발아에 대한 화합물 효과를 평가하는 것이다. 세포에 성장 인자를 첨가하기 전에, 화합물과 함께 사전 인큐베이션하였다. 수니티닙(sunitinib)을 대조군으로 시험하였다(사전 배양 없음).
수니티닙 대조군은 예상대로 FGF-2, FGF-1 및 VEGF-A 유도 HUVEC 발아를 억제하였다. 시험된 화합물에 대해 측정된 IC50 값은 microM[μM]으로 표시되고 FGF-1, FGF2 및 VEGF-A 유도 성장(발아) 억제에 대한 값은 화학적 특성분석 후 실시예에서 각 화합물 뒤에 나열된다.
DMSO에 용해된 화합물에 대해 발아 시험을 수행하여 100배 농축 저장 용액에 도달하고 배양 배지에 용해시켰다. 참조 화합물인 수니티닙을 ProQinase GmbH에서 제공하였다. 성장 인자를 rhFGF-염기성(FGF-2), Peprotech, 미국 뉴저지 소재, #100-18C, Lot# 0415571; rhFGF-산성(FGF-1), Peprotech, 미국 뉴저지 소재, #100-17A, Lot# 031207; hVEGF-A165(ProQinase GmbH, 독일, 프라이부르크 소재; 05.02.2010)에서 구입하고 HUVEC 세포 성장의 자극을 위해 사용하였다.
시험 시스템: 풀링한 공여자의 인간 제대 정맥(HUVEC)의 내피 세포를 약 1 x 106 세포/앰플로 70% 배지, 20% FCS, 10% DMSO와 함께 냉동 보관하였다. 1차 인간 제대 정맥 내피 세포인 HUVEC 세포(PromoCell, 독일, 하이델부르크 소재)를 계대 3 내지 4 이후에 사용하였다. 세포의 형태는 부착성, 단층으로 자갈-모양으로 성장하고 내피 세포 성장 및 기저 배지(ECGM/ECBM, PromoCell)에서 배양하였다. 서브배양을 1:3으로 분할하였다; 3 내지 5일마다, 약 1 × 104 세포/cm2를 씨딩하여 37℃, 5% CO2에서 24 내지 48시간의 2배 시간(doubling time)으로 인큐베이션하였다.
시험 화합물의 희석: 각 시험 화합물의 100× 농축 용액(최종 분석 농도에 대해)을 적절한 용매(DMSO 또는 물 중)를 사용하여 제조하였다. 이러한 100× 화합물 용액을 내피 세포 성장 및 기저 배지(ECBM) 1:7.5에서 추가로 희석하여 13.33× 농축 용액을 얻었다. 75 μl의 13,33× 용액을 25 μl의 40× 농축 자극(ECBM에 용해됨)과 후속적으로 혼합하여 10× 농축 자극/화합물 혼합물을 생성하였다. 이 혼합물(100 μl)을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 HUVEC 회전타원체를 함유하는 900 μl 겔에 첨가하였다(최종 분석 농도가 생성됨).
시험 방법: 원래 공개된 프로토콜(문헌[Korff and Augustin: J Cell Sci 112: 3249-58, 1999])을 수정하여 실험을 수행하였다. 간단히 말해서, 설명된 대로(문헌[Korff and Augustin: J Cell Biol 143: 1341-52, 1998]) 400 HUVEC를 플라스틱 접시에 매달린 드롭으로 피펫팅하여 밤새 회전타원체 응집을 허용하여 회전타원체를 제조하였다. 그런 다음 50개의 HUVEC 회전타원체를 0.9 ml의 콜라겐 겔에 씨딩하고 24웰 플레이트의 개별 웰에 피펫팅하여 중합되게 하였다. 시험 화합물을 10배 농축 용액에서 성장 인자(FGF-1, FGF-2 또는 VEGF-A 최종 농도 25ng/mL)와 함께 사전 인큐베이션한 다음, 이 용액 100 μl를 중합된 겔 위에 첨가하였다. 모든 화합물을 먼저 100× 저장액으로서 용매(DMSO 또는 물)에 희석하였다(즉, 각 최종 분석 농도의 100× 저장액이 용매에서 제조되었음을 의미함). 후속적으로, 이들 저장액을 시험한 최종 농도로 배지에서 추가로 희석하였다(각 최종 분석 농도의 13.33× 저장액이 됨: 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.13 및 1.56 × 10-6 M). 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고 4% PFA(Roth, 독일 칼루스헤 소재)를 첨가하여 고정시켰다.
성장 인자 억제의 정량화: 성장 인자 및 억제제로 처리한 HUVEC 회전타원체의 발아 강도를 회전타원체 당 누적 발아 길이(CSL: cumulative sprout length)를 결정하는 영상 분석 시스템에 의해 정량화하였다. 단일 회전타원체의 사진을 도립 현미경과 디지털 영상화 소프트웨어 NIS-Elements BR 3.0(Nikon)을 사용하여 촬영하였다. 이후, 영상 분석을 위해 회전타원체 사진을 Wimasis사 홈페이지에 업로드하였다. 각 회전타원체의 누적 발아 길이를 영상화 분석 도구 WimSprout를 사용하여 결정하였다. 무작위로 선택된 10개의 회전타원체의 누적 발아 길이의 평균을 개별 데이터 포인트로서 분석하였다. IC50 측정을 위해, 원시 데이터를 100%로 설정된 용매 대조군(자극 포함) 및 0%로 설정된 기본 대조군(자극 없음)에 대한 퍼센트 HUVEC 발아로 변환하였다. IC50 값을 가변 언덕 경사(variable hill slope)가 있는 비선형 회귀 곡선 맞춤을 사용하여 하단을 0으로 제한하고 상단을 100으로 제한하는 GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
결과: 내피 세포의 성장 인자 유도 발아에 대한 용량 반응 관계를 모든 화합물에 대해 평가하였다. IC50 값을 상단 제약 조건(100% HUVEC 발아)으로서 용매 대조군의 신호 및 하단 제약 조건(0%)으로서 기본 대조군의 신호를 기반으로 하는 표준 매개변수를 사용하여 결정하였다. FGF1, FGF2 및 VEGFA의 각 화합물에 대한 각각의 IC50 값을 각 화합물 아래에 이들의 화학적 특성분석 아래에 바이오데이터 단락에 요약하였다.
실시예 3.2: 정적 조건 하에서에의 시험관 내 호중구 부착, 방법
건강한 공여자의 버피 코트(buffy coat)에서 얻은 인간 호중구를 접착 완충액(1 mM CaCl2/MgCl2 및 10% FCS를 함유하는 PBS, pH 7.2)에 3 × 106/ml로 현탁하였다. 호중구를 40 μM 및 80 μM의 화합물과 함께 37℃에서 30분 동안 사전 인큐베이션하였다.
인간 피브리노겐(내독소가 없는 PBS에서 20 μg/웰)으로 4℃에서 18시간 동안 코팅된 18-웰 유리 슬라이드에서 부착 분석을 수행하였다; 20 μl의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하고 5 μl의 fMLP 1 nM 최종 농도로 37℃에서 1분 동안 자극하였다. 세척 후, 부착 세포를 PBS 중 글루타르알데히드 1.5%에 고정하고 컴퓨터를 이용한 계수로 계수하였다. 통계 분석을 평균 및 표준 편차(SD: standard deviation)를 계산하여 수행하였다; 유의성을 쌍을 이루지 않은(unpaired) t-검정에 의해 계산하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 6(GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 수행하였다.
각 화합물에 대해 [%]로 표시되는 호중구 부착의 각각의 억제를 바이오데이터 단락의 화학적 특성 아래에 각 화합물 하에 요약하였다.
실시예 3.3: 인간 호중구에서 활성 산소 종(ROS: reactive oxygen species) 생성 억제에 대한 시험관 내 시험
원형질막과 특정 과립의 막에 위치한 NADPH 옥시다제는 과산화수소, 일중항 산소, 차아염소산염, 및 활성 히드록실 라디칼과 같은, 다른 ROS로부터 슈퍼옥사이드 음이온을 생성한다. ROS는 주변 배지 또는 막으로 둘러싸인 세포 소기관으로 방출된다. 이러한 대사 산물의 생성을 측정하는 빠르고 민감한 방법 중 하나는 화학 발광(CL: chemiluminescence)이다. 이소루미놀(Isoluminol) 증폭 CL 기술은 매우 민감하며 호중구에서 유도된 호흡 파열(주로 ROS의 세포 외 생산)을 연구하는 데 널리 사용된다.
인간 호중구를 건강한 공여자로부터 수득한 버피 코트에서 단리하였다. 단리된 호중구(3 × 106/ml)를 칼슘 및 마그네슘이 함유된 행크스 균형 염 용액(HBSS: Hanks' Balanced Salt Solution)에 현탁시켰다. 호중구를 상이한 농도(0.1, 0.3, 1, 3 및 10 μM)로 37℃에서 30분 동안 화합물과 함께 사전-인큐베이션하였다. 검은색 96웰 세포 배양 플레이트를 인간 피브리노겐(PBS 중 0.25 mg/ml)으로 코팅하고 4°C에서 밤새 또는 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 내독소가 없는 PBS로 세척하였다. 호중구를 37℃에서 10분 동안 TNF-α(20 ng/ml)와 함께 인큐베이션하였다(프라이밍). 이후 75　㎕의 세포 현탁액 및 75　㎕(이소루미놀 + HRP 용액)을 각각의 웰에 첨가하였다. Multilabel Reader victor3(Perkin Elmer, 미국 소재)을 사용하여 fMLP(1 μM 활성화 후 화학발광을 기록하였다(250초 동안 25초 마다). HBSS에 희석된 이소루미놀의 평균 화학발광 값으로 정의된 배경 값을 모든 판독값(CPS, 초당 카운트)에서 뺐다. 분석을 이중 또는 삼중으로 수행하였다.
이소루미놀 증폭된 CL 분석에서 얻은 결과는 화합물이 fMLP + TNF-α 자극된 PMN에서 농도-의존적인 방식으로 ROS 수준을 크게 감소시키는 것으로 나타났다.
[%] 및 IC50[μM]으로 표현된 0.3 μM에서의 PMN ROS 억제를 각 화합물 아래에 이의 화학적 특성분석 아래 바이오데이터 단락에 요약하였다.
실시예 3.4: 시험관 내 인간 호중구 및 인간 단핵구 염증성 사이토카인 생산, 방법
호중구와 단핵구는 내독소가 없는 조건에서 건강한 공여자의 버피 코트에서 단리하였다. 간단히 말해서, 버피 코트를 Ficoll-Paque PLUS 구배에서 계층화한 다음, 실온에서 400 × g에서 30분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 호중구를 수집하고 덱스트란 침강 후 저장성 세포용해를 수행하여 적혈구를 제거하였다. Percoll 구배를 통한 원심분리 후, 단핵구를 대신 PBMC에서 단리하였다. 인간 호중구 및 단핵구를 각각 5 × 106/ml 및 2.5 × 106/ml로 10% 저내독소 FBS(<0.5 EU/ml; 스위스 바젤 소재 BioWhittaker-Lonza로부터)가 보충된 RPMI 1640 배지에 현탁시킨 다음, 상이한 농도(20 내지 40 μM)의 화합물의 존재 또는 부재 하에, 37℃, 5% CO2 대기에서 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 약물 처리 1시간 후, 단핵구를 0.1 μg/ml로 자극한 반면, 호중구를 E. coli 0111:B4 균주(InvivoGen)의 1 μg/ml 초순수 LPS로 자극하였다. LPS 자극 6시간 후, 호중구와 단핵구를 수집하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리하였다. 무세포 상등액을 -80℃에서 즉시 동결시켰다.
무세포 상등액의 사이토카인 농도를 인간에 대해 특이적인, 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트로 측정하였다: CXCL8, IL-6, TNF-α(Mabtech, 스웨덴 소재). 이러한 ELISA의 검출 한계는 CXCL8의 경우 4 pg/ml, IL-6의 경우 10 pg/ml 및 TNF-α의 경우 4 pg/ml이었다.
통계 분석을 평균 및 표준 편차(SD)를 계산하여 수행하였다; 유의성을 쌍을 이루지 않은(unpaired) t-검정에 의해 계산하였다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 6(GraphPad Software)을 사용하여 수행하였다.
사이토카인 값을 각 화합물에 대해 ng/ml로 표시하였으며 이의 화학적 특성분석 아래 바이오데이터 단락에 각각의 화합물에 대해 요약하였다.
실시예 3.5: 1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 VEGF-수용체의 VEGF-165 유도된 인산화의 화합물에 의한 시험관 내 억제, 방법
세포 배양: 1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 0.1% 젤라틴 사전-코팅된 플라스크 또는 접시에서 최대 6계대까지 일상적으로 배양하였다. 상이한 농도(0, 1.25, 2.5, 5, 10 및 20 μM)에서 화합물 단독의 세포 생존율에 대한 영향을 Tecan Microplate Reader(Genios)를 사용하여 CCK-8 키트에 의해 평가하였다. VEGF-유도된 세포 생존율에 대한 화합물의 영향을 측정하기 위해, 혈청 및 성장 인자가 없는 배양 배지(기아 배지)에서 24시간 및 48시간 동안 HUVEC(1 × 104 세포/웰)를 다양한 농도의 화합물(0, 1.25, 2.5, 5, 10 및 20 μM)과 미리 혼합된 VEGF(25 ng/ml)로 처리하였다. 이 농도 범위의 화합물은 세포 생존에 영향을 미치지 않았다.
VEGFR-2, p-Tyr1175에 대한 토끼 1차 항체를 Cell Signaling Technology(네덜란드 레이덴 소재)에서 구입하였다. Phospho-VEGFR-2(Tyr1175) Sandwich ELISA 키트를 Cell Signaling Technology에서 구입하였다.
HUVEC를 VEGF165(25 ng/mL)로 2분 동안 자극하기 전에 따뜻한 배지로 3회의 후속 세척 단계와 함께 60분 동안 0, 0.16, 0.31, 0.63, 1.25, 2.5, 5, 10 및 20 μM의 화합물과 함께 사전-인큐베이션하였다. 항-포스포-VEGFR-2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고, 막 스트립핑 후 로딩 대조군으로서 총 VEGFR-2를 사용하였다.
VEGFR-2-인산화 결과의 억제를 마이크로M[μM] 단위의 IC50 대 억제 화합물이 없는 VEGF-처리된 HUVEC 대조군으로 표현하였다.
각 화합물에 대해 [μM] 값으로 표현된 각각의 IC50을 각각의 화합물 아래의 이의 화학적 특성분석 아래 바이오데이터 단락에 요약하였다.
실시예 3.6: 인간 전혈에 대한 LPS 유도 후 화합물에 의한 시험관 내 사이토카인 방출 억제
이 시험관 내 방법의 목적은 지질다당류(LPS) 유도된 염증 반응 후 전혈로부터 사이토카인 패널의 방출에 대한 화합물의 영향을 평가하는 것이다. LPS 유도 전에 전혈을 화합물과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 혈액 내 사이토카인 수준은 다중 FACS-기반 패널을 사용하여 측정하였다.
마이크로M[μM]으로 표현된 시험 화합물에 대해 결정된 IC50 값과 사이토카인 억제 값이 각 화합물에 대해 열거되어 있다.
LPS 유도 후 사이토카인 방출에 대한 영향을 DMSO 또는 H2O에 용해된 화합물에 대해 수행하여 10배 농축 저장 용액에 도달하고 배양 배지에 용해시켰다.
시험 시스템: 단일 공여자로부터 전혈을 제거하고(리튬 헤파린 코팅된 튜브 내로; BD Vacutainer; 367886) RPMI 1640(Thermo Fisher, 61870036)으로 1:5 희석하였다. 샘플링 30분 이내에, LPS 자극(O111:B4 - Sigma L4391;10 ng/ml 최종 농도) 전에 혈액을 화합물과 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 자극을 표준 세포 배양 조건(37℃, 5% CO2)에서 밤새(18시간) 계속하였으며, 그 후 플레이트를 원심분리하고 상등액을 제거하고 분석에 사용할 때까지 -80℃에서 동결하였다.
시험 화합물의 희석: 각 시험 화합물의 10× 농축 용액(최종 분석 농도에 대해)을 적절한 용매(DMSO 또는 물 중)로 제조하였다. 이 10× 화합물 용액(10 μl)을 미리 희석된 전혈(전혈: RPMI1640, 1:5) 90 μl에 첨가하여 최종 분석 농도를 수득하였다.
시험 방법: 희석된 전혈(80 μl)을 화합물(10 μl)과 함께 사전-인큐베이션하여 100, 30, 10, 3, 1, 0.3 및 0.1 × 10-6M의 최종 분석 농도를 수득하였다. 혈액을 37℃에서 5% CO2와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. LPS를 세포 배양 배지에서 110 ng/ml의 농도로 희석하였고; 10 μl를 전혈에 첨가하여 최종 농도가 10ng/ml가 되도록 하였다. 플레이트를 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 4℃에서 5분 동안 3,000 RPM으로 원심분리하고 상등액을 제거하고 FACS 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 동결시켰다.
제조사 지침에 따라 맞춤형 멀티플렉스 시스템(ELISA Genie)을 사용하여 사이토카인 방출을 측정하였다. 제조한 샘플을 Attune NxT 유세포 분석기(Thermo Fisher)에서 실행하였다.
사이토카인 방출 억제의 정량화: 알려진 농도 표준을 사이토카인 패널의 일부로서 실행하여 각 샘플의 각 사이토카인 농도를 정량화하였다. 이는 FCAP Array v3.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. IC50 측정을 위해, 원시 데이터를 100%로 설정된 용매 대조군에 대한 농도 백분율로 변환하였다. IC50 값을 가변 언덕 기울기를 사용한 비선형 회귀 곡선 맞춤을 사용하여 하단을 0으로, 상단을 100으로 제한하는 GraphPad Prism 8 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
결과: 전혈에서 염증 반응의 LPS 유도 후 사이토카인 방출에 대한 용량 반응 관계를 모든 화합물에 대해 평가하였다. IC50 값을 사이토카인 패널(GM-CSF, IFN-감마, IL-1베타, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12p40, IL-13, IL-17A, IL-17F, IL-18, IL-21, IL-22, IL-33, TGF-베타, TNF-알파, TNF-베타)에 대한 각각의 화합물에 대해 결정하였다.
각각의 화합물에 대해 [μM] 값으로 표현한 각각의 사이토카인 IC50을 각각의 화합물 아래 이의 화학적 특성분석 아래 바이오데이터 단락 및 표 13에도 요약하였다.
실시예 4: 화합물 제형
실시예 4.1: 화합물 Ic-007a의 경구 제형
5가지 제형을 개발하였고 적합성에 대해 검토하였다. 이들은 다음 표에 자세한 내용이 나와 있는 현탁액 및 용액이었다.
화합물 Ic-007a의 현탁액 및 용액에 대한 제형 세부사항.
현탁액 A 용액 D 용액 A 용액 B 용액 C
성분　 양 (%)　
API 1% w/v
(10 mg/mL)		 0.1% w/v
(1 mg/mL)		 1% w/v
(10 mg/mL)		 1% w/v
(10 mg/mL)		 1% w/v
(10 mg/mL)
DMSO　 5% v/v 5% v/v 5% v/v 5% v/v 5% v/v
PEG 400　 10% v/v 10% v/v 10% v/v 10% v/v 10% v/v
솔루톨 HS15 10% w/v 10% w/v 10% w/v 10% w/v 10% w/v
소듐 히드록시드 1M n/a n/a pH 6으로 pH 8로 pH 9로
물 100%까지 100%까지 100%까지 100%까지 100%까지
제조: 현탁액 A 및 용액 D:
100mL에 대한 방법 예(필요한 최종 부피에 따라 적절한 규모). 깨끗한 용기에 5 mL DMSO를 측정하여 용매 저장액을 제조하였다. 화합물 Ic-007a의 정확한 양을 칭량하고 진탕기, 와류 또는 초음파 분쇄기에서 혼합하면서 DMSO 용액에 점차적으로 첨가하였다. 솔루톨을 깨끗하고 건조한 용기에 60℃의 수조에서 녹였다. 실온에서 솔루톨이 고형화됨에 따라, 용융된 솔루톨을 제형 제조 동안 60℃의 수조에 보관하였다. 10 g(10% w/v)의 용융된 솔루톨을 가온된 적합한 표시가 있는(최종 부피 100 mL까지) 용기에 첨가하였다. 10 mL의 PEG 400을 가온된 100 mL 용기의 솔루톨에 첨가하였다. DMSO 약물 저장 용액을 솔루톨과 PEG400 혼합물에 첨가하고 내용물을 즉시 혼합하고, 35 mL의 탈이온수를 첨가하고 간헐적으로 와류하면서 40℃ 조(bath)에서 혼합하여 큰 입자를 용해시켰다. 제형을 실온으로 냉각시키고 탈이온수로 최종 100 mL 부피로 만들었다.
용액 A, B & C의 제조:
100 mL에 대한 방법 예(필요한 최종 부피에 따라 적절한 규모). 깨끗한 용기에 5 mL의 DMSO를 측정하여 용매 저장액을 제조하였다. 1 g의 화합물 Ic-007a를 칭량하고 필요한 경우 진탕기, 와류 또는 초음파 분쇄기에서 혼합하면서 DMSO 용액에 점차적으로 첨가하였다. 솔루톨을 깨끗하고 건조한 용기에 60℃의 수조에서 녹였다. 실온에서 솔루톨이 고형화됨에 따라, 용융된 솔루톨을 제형 제조 동안 60℃의 수조에 보관하였다. 10 g(10% w/v)의 용융된 솔루톨을 가온된 적합한 표시가 있는(최종 부피 100 mL까지) 용기 내로 칭량하였다. 10 mL의 PEG 400을 가온된 100 mL 용기의 솔루톨에 첨가하였다. DMSO 약물 저장 용액을 솔루톨과 PEG 400 혼합물의 표시된 용기에 첨가하고 내용물을 즉시 내용물을 혼합하였다. 35 mL의 탈이온수를 첨가하고 내용물을 혼합하고 간헐적으로 와류하면서 40℃ 조에 두어 큰 입자를 용해시켰다. 제형을 실온으로 냉각시키고 1 M 소듐 히드록시드(NaOH) 용액을 사용하여 제형을 pH 6, 7, 8 및 9의 pH로 추가로 조정하였다. 초기 제형을 1 mL 규모로 제조하였으며 출발 pH는 4.3이었다. pH 6(용액 A)을 달성하기 위해 3 μL의 NaOH 1 M 부피를 첨가하였고, pH 8(용액 B)의 경우 22 μL 및 pH 9(용액 C)의 경우 43 μL를 첨가하였다. 이러한 제형을 제조 직후에 투여하였다.
10 mg/mL 현탁액 제형 및 1 mg/mL 용액 제형은 주위 조건에서 2주에 걸쳐 물리적으로 안정한 것으로 밝혀졌다.
실시예 4.2: 화합물 Ia-001a-Tz의 경구 제형
화합물 Ia-001a-Tz를 하기 표에 나타낸 비히클 조성을 갖는 제형으로 10 mg/mL 경구 용액으로 제조하였다.
비히클은 의약 활성제가 제형화 및/또는 투여되는 용매(또는 희석제)로 사용되는 담체 또는 불활성 매질이었다.
[표 22] 화합물 Ia-001aTz의 경구 제형에 대한 제형 세부사항.
비히클 조성
A 40% PEG400, 10% 트랜스큐톨(transcutol), 10% 솔루톨 HS15, 40% 1형 물
B 40% PEG400, 10% 트랜스큐톨, 10% 솔루톨 HS15, 0.5% HPMC 606을 함유하는 40% 수용액
C 40% PEG400, 10% 트랜스큐톨, 10% 솔루톨 HS15, 0.5% 콜리돈(kollidon) VA 64를 함유하는 40% 수용액
D 40% PEG400, 10% 트랜스큐톨, 10% 크레모포어 RH40, 40% 1형 물
E 40% PEG400, 10% 트랜스큐톨, 10% 비타민 E TPGS, 40% 1형 물
F 40% PEG400, 10% 트랜스큐톨, 5% 솔루톨 HS15, 45% 1형 물
G 40% PEG400, 10% 트랜스큐톨, 5% 솔루톨 HS15, 1% 콜리돈 VA 64를 함유하는 45% 수용액
제조 방법
10 mg/g 용액을 제조하기 위해, 화합물 10 mg을 바이알에 정확하게 칭량하고 비히클 1 ml를 API에 직접 첨가하고 와류하여 용액을 수득하였다.
비히클 제조
제형 A: 4 g의 PEG400을 칭량하여 깨끗한 20 mL 유리 용기에 10 g의 비히클을 제조하였다. 1 g의 트랜스큐톨을 첨가하고, 성분들을 교반하여 혼합하였다. 여기에 솔루톨 HS15 1 g을 첨가한 후 1형 물 4g을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하여 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 B: 4 g의 PEG400을 칭량하여 깨끗한 20 mL 유리 용기에 10 g의 비히클을 제조하였다. 1 g 트랜스큐톨을 첨가하고, 성분들을 교반하여 혼합하였다. 여기에 솔루톨 HS15 1 g을 첨가하였다. 50 mg의 HPMC 606을 깨끗한 유리 바이알에 칭량하여 0.5% HPMC 606 수용액을 제조하였다. 여기에 1형 물 9.95 g을 첨가하였다. 적절한 혼합이 이루어지도록 성분을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 0.5% HPMC 606을 포함하는 수용액 4 g 을 PEG400, 트랜스큐톨 및 솔루톨 HS15의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 C: 4 g의 PEG400을 칭량하여 깨끗한 20 mL 유리 용기에 10 g의 비히클을 제조하였다. 1 g의 트랜스큐톨을 첨가하고, 성분들을 교반하여 혼합하였다. 여기에 솔루톨 HS15 1 g을 첨가하였다. 50 mg의 콜리돈 VA64를 깨끗한 유리 바이알에 칭량하여 0.5% 콜리돈 VA64 수용액을 제조하였다. 여기에 1형 물 9.95 g을 첨가하였다. 적절한 혼합이 이루어지도록 성분을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 콜리돈 VA64를 포함하는 수용액 4 g을 PEG400, 트랜스큐톨 및 솔루톨 HS15의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다. 제형 D: 4 g의 PEG400을 칭량하여 깨끗한 20 mL 유리 용기에 10 g의 비히클을 제조하였다. 1 g의 트랜스큐톨을 첨가하고, 성분들을 교반하여 혼합하였다. 여기에 1 g의 크레모포어 RH40을 첨가한 후 4 g의 1형 물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 E: 4 g의 PEG400을 칭량하여 깨끗한 20 mL 유리 용기에 10 g의 비히클을 제조하였다. 1 g의 트랜스큐톨을 첨가한 후, 성분들을 교반하여 혼합하였다. 여기에, 1 g의 비타민 E TPGS를 첨가하고, 4 g의 1형 물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 F: 4 g의 PEG400을 칭량하여 깨끗한 20 mL 유리 용기에 10 g의 비히클을 제조하였다. 1 g의 트랜스큐톨을 첨가하고, 성분들을 교반하여 혼합하였다. 여기에, 0.5 g의 솔루톨 HS15를 첨가한 후, 4.5 g의 1형 물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 G: 4 g의 PEG400을 칭량하여 깨끗한 20 mL 유리 용기에 10 g의 비히클을 제조하였다. 1 g의 트랜스큐톨을 첨가하고, 성분들을 교반하여 혼합하였다. 여기에, 0.5 g의 솔루톨 HS15를 첨가하였다. 100 mg의 콜리돈 VA64를 깨끗한 유리 바이알에 칭량하여 1% 콜리돈 VA64 수용액을 제조하였다. 여기에, 9.9 g의 1형 물을 첨가하였다. 적절한 혼합이 이루어 지도록 성분을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 콜리돈 VA64를 포함하는 4.5 g의 수용액을 PEG400, 트랜스큐톨 및 솔루톨 HS15 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
실시예 4.3. 화합물 IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a의 경구 제형
화합물 IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a를 하기 표에 상세히 설명된 성분을 사용하여 경구 제형으로서 제조하였다.
[표 23] 화합물 IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a의 경구 제형에 대한 경구 제형 세부사항
성분 양 (%w/w)
제형 1 제형 2
PEG 400 40.0 31.0
트랜스큐톨 HP 3.5 10.0
메글루민 4.0 4.0
크레모포어 RH 40 12.5 15.0
DMSO 5.0 5.0
15% SLS 수용액 35.0 35.0
50 mL 규모의 SLS 15%의 수용액 제조:
7.5 g의 SLS를 50 mL 부피 플라스크에 정확하게 칭량하였다. 물을 50 mL 부피에 첨가하고 완전한 가용화가 달성될 때까지 교반하였다.
비히클 제형 제조:
제형 1: 플라스틱 비이커에 40 g의 PEG 400(40.0%)을 칭량하여 비히클 100g을 제조하였다. 3.5 g의 트랜스큐톨(3.5%), 12.5 g의 크레모포어 RH40(12.5%), 4.0 g의 메글루민(4.0%), 5 g의 DMSO(5.0%), 및 35 g의 15% SLS 수용액(35.0%, 최종 SLS 5.25%). 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 2: 플라스틱 비이커에 40 g의 PEG 400(40.0%)을 칭량하여 비히클 100g을 제조하였다. 10.0 g의 트랜스큐톨(10.0%), 15.0 g의 크레모포어 RH40(15.0%), 4.0 g의 메글루민(4.0%), 5 g의 DMSO(5.0%), 및 35 g의 15% SLS 수용액(35.0%, 최종 SLS 5.25%). 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
10분 동안 와류 및 초음파 처리하기 전에 비히클을 각 화합물에 직접 첨가하였다. 필요한 경우, 제형의 pH를 1 M 소듐 히드록시드 또는 1 M 염산으로 조정하여 경구 투여에 적합한 pH 범위에 도달하게 하였다. IIc-007a 용액을 70 mg/mL 이하의 농도로 제조하였다. IIIc-061a 용액을 40 mg/mL 이하의 농도로 제조하였다. IVc-059a 용액을 150 mg/mL 이하의 농도로 제조하였다.
실시예 4.4: 정맥 내(IV) 제형
화합물 Ia-001a, Ia-001a-Tz, Ia-001a-Tz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIIc-061a를 정맥 내 제형으로 제조하였다.
하기 표 24에 제공된 제형 세부사항을 상이한 전임상 생체 내 모델에서 IV 투여에 사용하였다. 용액이 얻어질 때까지 소듐 히드록시드 용액으로 pH를 조절하여 각 화합물의 용액을 제조하였다.
[표 24] IV 제형 조성
성분 양 (%)　
API 약물 물질 1 % w/v
DMSO 5 % v/v
PEG 400 10 % v/v
솔루톨 HS15 10 % w/v
소듐 히드록시드 1 M 적정량을 가함
염수 용액　0.9% 100 %로
제조 방법:
10 mL에 대한 방법 예(필요한 최종 부피에 따라 적절한 규모). 0.5 mL의 DMSO를 깨끗한 용기 내로 칭량하여 용매 저장액을 제조하였다. 100 mg의 각각의 화합물을 칭량하여 필요한 경우 진탕, 와류 또는 초음파처리 상에서 혼합하며 DMSO 용액에 점차적으로 첨가하였다. 솔루톨을 깨끗하고 건조한 용기에 60℃의 수조에서 녹였다. 실온에서 솔루톨이 고형화됨에 따라, 용융된 솔루톨을 제형 제조 동안 60℃의 수조에 보관하였다. 1 g(10% w/v)의 용융된 솔루톨을 가온된 적합한 표시가 있는(최종 부피 10 mL까지) 용기 내로 칭량하였다. 1 mL PEG 400을 가온된 10 mL 용기의 솔루톨에 첨가하였다. DMSO 약물 저장 용액을 솔루톨과 PEG 400 혼합물의 표시된 용기에 첨가하고 즉시 내용물에 혼합하였다. 목표 부피의 85%를 달성하기 위해 0.9% 염수 용액*을 첨가하고 간헐적으로 와류하면서 40℃ 조에서 내용물을 혼합하여 큰 입자를 용해하였다. 제형을 실온으로 냉각시키고 0.9% 염수 용액*으로 최종 목표 부피(10 mL)로 만들고 제형의 pH를 1 M 소듐 히드록시드(NaOH) 용액을 사용하여 pH 7.4로 조정하였다. 제형을 0.2 μm 필터를 사용하여 클래스 II 생물학적 후드 내부의 멸균 바이알로 여과하였다. 동물에 투여하기 위해 제형을 사용하였다.
* 일부 화합물의 경우, 0.9% 염수 용액을 pH 7.4 PBS 용액으로 대체하였음.
실시예 4.5: 정맥 내(IV) 및 복강 내(IP) 제형
화합물 Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a, IIIc-061a를 정맥 내 및 복강 내 투여용 제형으로 제조하였다. 제형은 표 25에 상술된 바와 같이 각각의 상응하는 화합물의 몰 당량으로 물 및 디에틸아민을 함유하였다. 이들 제형을 상이한 전임상 생체 내 모델에서 IV 및 IP 투여에 사용하였다.
제조 방법:
1 mL에 대한 방법 예(필요한 최종 부피에 따라 적절한 규모). 각 화합물 10 mg을 깨끗한 바이알에 정확하게 칭량하였다. 상응하는 양의 디에틸아민을 바이알에 첨가하였다. 그 다음, 물을 첨가하여 최대 1 mL 부피가 되도록 하였다. 내용물을 와류시키거나 초음파 처리하여 용액을 형성하였다. 필요한 경우, 용액의 pH를 IV 또는 IP 투여에 적합한 범위로 만들기 위해 1 M 염산을 사용하여 변경하였다.
[표 25] IV 및 IP 제형에서 화합물에 필요한 디에틸아민 몰 당량.
화합물 Ic-007a IIc-007a IIIc-061a IVc-059a
필요한 디에틸아민 몰 당량 2.0 2.0 3.1 2.0
1 mL의 IV 제형 제조에 필요한 디에틸아민 44 μL 44 μL 62 μL 51.9 μL
실시예 4.6: 안구 제형
본 발명에 따른 몇몇 화합물은 안구 형식으로의 제형 개발을 위해 제출되었다. 화합물, 이들의 최종 농도 및 형태를 하기 표 26에 제시하였다.
[표 26] 안구 제형
화합물 농도 (% w/v) 현탁액/용액
IVc-059a 5 mg/mL (0.5) 용액
Ia-001a-Tz/004a 5 mg/mL (0.5) 용액
Ia-001a-Tz 10 mg/mL (1.0) 용액
IIIc-061a 10 mg/mL (1.0) 용액
Ia-001a 10 mg/mL (1.0) 용액
Ic-007a 5 mg/mL (0.5) 현탁액
Ib-010a 10 mg/mL (1.0) 현탁액
조성: 제형 조성은 하기 표 27에 상세히 설명되어 있다. API의 농도 및 생성되는 형식은 다양하다.
[표 27] 안구 제형 조성.
성분 양(%)
API 약물 물질 상기 표 참조
콜리포어 EL 5%　w/v
포비돈 0.5%　w/v
HPMC 0.5%　w/v
폴리솔베이트 80 0.1%　v/v
pH 7.4 PBS 완충액(NaOH 1 M로 pH 조정) 부피까지
제조 방법:
용액을 생성한 화합물의 경우, 다음 제조 방법을 따랐다:
총 50 mg의 콜리포어 EL을 깨끗한 건조 용기에 칭량하였다. 정확한 양의 화합물을 칭량하고 자기 교반기에서 혼합하면서 콜리포어 EL에 점차적으로 첨가하였다. 30℃로 가열하면 약물을 콜리포어 제제에 혼합하는 데 도움이 된다. 별도의 용기에서, 0.5% w/v의 HPMC, 0.5% w/v의 포비돈 및 0.1%의 폴리솔베이트 80 수용액을 pH 7.4 인산염-완충 식염수(PBS) 완충액으로 제조하였다. 600 μL 부피의 수용액을 혼합하면서 콜리포어 EL과 약물에 첨가하고 즉시 와류시켰다. 혼합하면서 제형에 1 M NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정하였다. 수용액을 사용하여 부피를 목표 부피로 조정하였다. 제형을 0.2 μm 필터를 사용하여 클래스 II 생물학적 후드 내부의 멸균 바이알로 여과하였다. 제형은 투여할 준비가 되었다.
현탁액을 생성하는 화합물의 경우, 다음 제조 방법을 따랐다: 50 mg 양의 콜리포어 EL을 깨끗한 건조한 용기에 칭량하였다. 다양한 화합물의 정확한 양을 칭량하고 자기 교반기에서 혼합하면서 콜리포어 EL에 점차적으로 첨가하였다. 30℃로 가열하면 약물을 콜리포어 제제에 혼합하는 데 도움이 된다. 별도의 용기에서, 0.5% w/v의 HPMC, 0.5% w/v의 포비돈 및 0.1%의 폴리솔베이트 80 수용액을 pH 7.4 인산염-완충 식염수(PBS) 완충액으로 제조하였다. 수용액을 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하였다. 600 μL 부피의 수용액을 콜리포어와 약물에 혼합하면서 첨가한 다음 즉시 와류시켰다. 제형을 연속적으로 혼합하면서 여과된 1 M NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정하였다. 수용액을 사용하여 부피를 목표 부피로 조정하였다. 제형은 응집물이 분해 및 분산되도록 하기 위해 투여 전에 초음파 처리하였다.
화합물 Ic-007a, IIc-007a의 안구 제형
[표 28] Ic-007a 및 IIc-007a를 포함하는 안구 제형의 조성.
1 2
성분 양 (%)
Ic-007a 0.5% w/v (5 mg/mL) -
IIc-007a - 0.5% w/v (5 mg/mL)
콜리포어 EL 5%　w/v 5%　w/v
포비돈 0.5%　w/v 0.5%　w/v
HPMC 0.5%　w/v 0.5%　w/v
폴리솔베이트 80 0.1% v/v 0.1% v/v
pH 7.4 PBS 완충액
(NaOH 0.5 M으로 pH 조정) 		부피까지 부피까지
제조 방법:
총 50 mg의 콜리포어 EL을 깨끗한 건조한 용기에 칭량하였다. 정확한 양의 화합물을 칭량하고 자기 교반기에서 혼합하면서 콜리포어 EL에 점차적으로 첨가하였다. 30℃로 가열하면 약물을 콜리포어 제제에 혼합하는 데 도움이 된다. 별도의 용기에서, 0.5% w/v의 HPMC, 0.5% w/v의 포비돈 및 0.1%의 폴리솔베이트 80 수용액을 pH 7.4 인산염-완충 식염수(PBS) 완충액으로 제조하였다. 600 μL 부피의 수용액을 혼합하면서 콜리포어 EL과 약물에 첨가하고 즉시 와류시켰다. 혼합하면서 제형에 1 M NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정하였다. 수용액을 사용하여 부피를 목표 부피로 조정하였다. 제형을 0.2 μm 필터를 사용하여 클래스 II 생물학적 후드 내부의 멸균 바이알로 여과하였다.
화합물 IIc-007a의 용액: 총 50 mg의 콜리포어 EL을 깨끗한 건조한 용기에 칭량하였다. 정확한 양의 화합물(목표 농도 5 mg/mL)을 칭량하고 자기 교반기에서 혼합하면서 콜리포어 EL에 점차적으로 첨가하였다. 30℃로 가열하면 약물을 콜리포어 제제에 혼합하는 데 도움이 된다. 별도의 용기에서, 0.5% w/v의 HPMC, 0.5% w/v의 포비돈 및 0.1%의 폴리솔베이트 80 수용액을 pH 7.4 인산염-완충 식염수(PBS) 완충액으로 제조하였다. 600 μL 부피의 수용액을 혼합하면서 콜리포어 EL과 약물에 첨가하고 즉시 와류시켰다. 혼합하면서 제형에 0.5 M NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정하였다. 수용액을 사용하여 부피를 목표 부피로 조정하였다. 제형을 0.2 μm 필터를 사용하여 클래스 II 생물학적 후드 내부의 멸균 바이알로 여과하였다. 제형은 투여할 준비가 되었다. 사용 전에, 화합물 IIc-007a 용액을 2분 동안 와류하고 10분 이내에 사용한다.
*겔/콜로이드 구조의 모양이 관찰될 수 있지만 와류 후 재분산됨.
화합물 Ic-007a의 현탁액: 총 50 mg의 콜리포어 EL을 깨끗한 건조한 용기에 칭량하였다. 정확한 양의 화합물(목표 농도 5 mg/mL)을 칭량하고 자기 교반기에서 혼합하면서 콜리포어 EL에 점차적으로 첨가하였다. 30℃로 가열하면 약물을 콜리포어 제제에 혼합하는 데 도움이 된다. 별도의 용기에서, 0.5% w/v의 HPMC, 0.5% w/v의 포비돈 및 0.1%의 폴리솔베이트 80 수용액을 pH 7.4 인산염-완충 식염수(PBS) 완충액으로 제조하였다.
수용액을 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하였다. 600 μL 부피의 수용액을 혼합하면서 콜리포어 EL과 약물에 첨가하고 즉시 와류시켰다. 혼합하면서 제형에 0.5 M NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정하였다. 수용액을 사용하여 부피를 목표 부피로 조정하였다.
사용 전에, 화합물 Ic-007a의 현탁액을 초음파 처리하여 다음 프로토콜을 사용하여 응집체(flocculate)/응집물(aggregate)을 부수었다: 작은 페트리 접시/비이커를 초음파 처리기 내부의 물로 채웠다. 바이알을 비이커/페트리 접시 내부에 넣고 40℃에서 10분 동안 초음파 처리하였다. 10분 후 바이알을 제거하고 2분 동안 와류하고 10분 동안 다시 초음파 처리하였다. 이 과정을 총 50분 동안 반복하였다.
IIc-007a의 안구 제형
비히클 조성 및 화합물 농도를 표 29에 나타냈다.
[표 29] 제형 A, B 및 C의 조성
제형 조성 IIc-007a 농도
A 0.4% w/w TRIS
0.5% w/w HPMC
0.5% w/w PVP K30
H2O 중의0.1% w/w tween 80		 5 mg/g
B 0.4% w/w TRIS
H2O 중의 5% w/w 크레모포어 EL		 5 mg/g
C 5% w/w 크레모포어 EL
1.2% w/w PVP K90
H2O 중의 0.9% w/w TRIS		 10 mg/g
D H2O 중의 디에틸아민 0.3% w/v 10 mg/g
10 mg/g 용액을 제조하기 위해, 화합물 10 mg을 바이알에 정확하게 칭량하고 비히클 1 ml를 API에 직접 첨가하고 와류하여 용액을 수득하였다.
5 mg/g 용액을 제조하기 위해, 화합물 5 mg을 바이알에 정확하게 칭량하고 비히클 1 ml를 API에 직접 첨가하고 와류하여 용액을 수득하였다.
비히클 제조
제형 A: 100 mL 듀란 유리병 내부에 0.25 g의 HPMC(0.5% w/w)를 칭량하여 50 g의 비히클을 제조하였다. 그런 다음 49.25 g의 1형 물을 병에 첨가한 다음 0.200 g의 TRIS(0.4% w/w), 50 mg의 Tween 80(0.1%w/w) 및 0.25 g의 PVP K30(0.5% w/w)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 B: 100 mL 듀란 유리병 내부에 2.5 g의 크레모포어 EL(5% w/w)을 칭량하여 50 g의 비히클을 제조하였다. 그런 다음 47.3 g의 1형 물을 병에 첨가한 다음 200 mg의 TRIS(0.4% w/w)를 첨가하였다.
제형 C: 100 mL 듀란 유리병 내부에 2.5 g의 크레모포어 EL(5% w/w)을 칭량하여 50 g의 비히클을 제조하였다. 그런 다음 46.45g의 1형 물을 병에 첨가한 다음 450 mg의 TRIS(0.9% w/w) 및 600 mg의 PVP K90(1.2% w/w)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 D: 디에틸아민 0.3% w/v: 14 mL 유리 바이알에 9869 μL 1형 물을 첨가하여 9.9 g 디에틸아민 비히클을 제조하였다. 그런 다음 피펫을 사용하여 44.2 μL(31.3 mg)의 디에틸아민을 바이알에 첨가하였다. 용액을 5분 동안 교반상태로 두어 균질하게 하였다.
IVc-059a의 안구 제헝
비히클 조성 및 화합물 농도가 표 30에 제시되어 있다.
[표 30] 제형 A, B 및 C의 조성
제형 조성 IVc-059a 농도
A 5% w/w 크레모포어 EL
1.2% w/w PVP K90
H2O 중의 0.9% w/w TRIS		 10 mg/g
B 디에틸아민 0.3% w/v: H2O 중
디에틸아민으로 조정된 pH		 10 mg/g
C 0.5% w/w HPMC, 0.5% w/w PVP K30,
PBS 중 0.1% w/w tween 80
NaOH로 조정된 pH		 10 mg/g
10 mg/g 용액을 제조하기 위해, 화합물 10 mg을 바이알에 정확하게 칭량하고 비히클 1 ml를 API에 직접 첨가하고 와류하여 용액을 수득하였다.
비히클 제조
제형 A: 100 mL 듀란 유리병 내부에 2.5 g의 크레모포어 EL(5% w/w)을 칭량하여 50 g의 비히클을 제조하였다. 그런 다음 46.45 g의 1형 물을 병에 첨가한 다음 450 mg의 TRIS(0.9% w/w) 및 600 mg의 PVP K90(1.2% w/w)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
제형 B: 디에틸아민 0.3% w/v: 14 mL 유리 바이알에 9869 μL 1형 물을 첨가하여 9.9 g 디에틸아민 비히클을 제조하였다. 그런 다음 피펫을 사용하여 44.2 μL(31.3 mg) 디에틸아민을 바이알에 첨가하였다. 용액을 5분 동안 교반상태로 두어 균질하게 하였다.
제형 C: 100 mL 듀란 유리병 내부에 49.45 g의 PBS(하기 제조 방법)을 칭량하여 50 g의 비히클을 제조하였다. 연속적으로, 250 mg의 HPMC(0.5% w/w), 250 mg의 PVP K30(0.5% w/w), 및 50 μL(액체 치환 피펫)의 tween 80(0.1% w/w)을 유리 병에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
PBS 제조: 799.1 mg의 NaCl, 21.6 mg의 KCl, 24.9 mg의 KH2PO4, 180.4 mg의 Na2HPO4·2H2O를 정확하게 칭량하여 100 mL 1형 물에 용해하였다. 용액 pH는 7.6이었다.
Ic-007a 및 IIc-007a의 안구 제형
화합물을 표 31에 제시된 비히클 중의 용액으로 제형화하였다.
[표 31] 제형 A, B, C 및 D의 조성
성분 양 (% w/w)
비히클 A 비히클 B 비히클 C 비히클 D
크레모포어 EL 5.0 5.0 5.0 5.0
PEG 400 0 0 0.4 0
TRIS 0.9 0.9 0.9 0.9
메글루민 0 0 0 1.0
콜로포어 RH40 0 0.2 0.2 0.2
물 94.1 93.9 93.5 92.9
50 g 규모의 비히클 제조
비히클 A: 0.45 g의 TRIS(0.9% w/w) 및 2.5 g의 크렘포어 EL(5.0% w/w)을 47.05g의 물(94.1%w/w)에 첨가하여 50g의 비히클을 제조하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
비히클 B: 0.45 g의 TRIS(0.9% w/w), 2.5 g의 크렘포어 EL(5.0% w/w) 및 이어서 0.1 g의 콜리포어 RH40(0.2% w/w)을 46.95의 물(93.9% w/w)에 첨가하여 50 g의 비히클을 제조하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
비히클 C: 0.45 g의 TRIS(0.9% w/w), 2.5 g의 크렘포어 EL(5.0% w/w) 및 이어서 0.1 g의 콜리포어 RH40(0.2% w/w) 및 0.2 g의 PEG400을 46.75의 물(93.5% w/w)에 첨가하여 50 g의 비히클을 제조하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반상태로 두어 모든 성분이 용해되도록 하였다.
비히클 D: 0.45 g TRIS(0.9%w/w), 0.5g 메글루메(1.0%w/w), 2.5 g 크렘포어 EL(5.0%w/w) 및 이어서 0.1 g 콜리포어 RH40(0.2%w/w)을 46.45의 물(92.9%w/w)에 첨가하여 50g of 비히클을 제조하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하여 모든 성분이 용해되도록 하였다.
표 32에 열거된 농도를 생성하기 위해 비히클을 API에 직접 첨가하였다. 용액이 얻어질 때까지 샘플을 와류시키고 초음파 처리하였다.
[표 32] 비히클 A, B, C 및 D를 사용하는 제형 중의 화합물 농도
API 농도 (mg/mL)
비히클 A 비히클 B 비히클 C 비히클 D
Ic-007a 10 10 10 20
IIc-007a 10 10 10 20
10 mg/g 용액을 제조하기 위해, 화합물 10 mg을 바이알에 정확하게 칭량하고 비히클 1 ml를 API에 직접 첨가하고 와류하여 용액을 수득하였다.
20 mg/g 용액을 제조하기 위해, 20 mg의 화합물을 바이알에 정확하게 칭량하고 1 ml의 비히클을 API에 직접 첨가하고 와류하여 용액을 수득하였다.
실시예 5: 화합물의 치료 활성
실시예 5.1: 급성 췌장염의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 급성 췌장염 뮤린 모델에서 평가하였다. 췌장염 매개변수의 사후(post in-life) 분석이 가능하도록 조직 샘플을 수득하였다. 화합물 투여 후 동물 노출 수준을 평가하기 위해 혈장 샘플을 또한 수득하였다.
동물: 체중이 대략 20 내지 25 g인 8 내지 10주령의 암컷 Balb/c 마우스 총 70마리를 연구에 사용하였다(Charles River). 7일의 순응 후, 이들을 상이한 군으로 할당하였다. 마우스를 꼬리 표시로 식별된 개별 마우스와 함께 IVC 케이지(케이지당 최대 5마리의 마우스)에 수용하였다. 케이지, 깔짚 및 물을 사용 전에 소독하였다. 동물에게 환경 강화 및 둥지 재료를 제공하기 위해 옥수수 속대 강화 깔짚(corn-o-cobs enrichment bedding)을 제공하였다. 모든 동물을 표준으로 인증된 상업용 식이와 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 동물 사육실은 실온 20 내지 24℃, 습도 30 내지 70% 및 12시간 명암 주기를 사용하여 유지하였다. 이 연구에 사용한 동물은 면역 능력이 있지만, 투여 용액의 준비 및 동물의 투여/칭량은 멸균 생물안전 캐비닛에서 수행하였다.
시험 물질 및 제제: 첫 번째 실험에서, 화합물 Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a를 칭량하고 DMSO에 용해시켰다. 최종 제형은 5% DMSO, 10% 솔루톨, 10% PEG400, 75% 0.9% 식염수에 있었고 pH는 0.5M NaOH 용액으로 7로 조정되었다.
두 번째 실험에서, 화합물 Ic-001aTz2, IIc-007a, IIIa-001aTz, IIIc-061a, IIIc-061a-E3, IVc-059a를 칭량하고 DMSO에 용해시켰다. 최종 제형은 5% DMSO, 10% 솔루톨, 10% PEG400, 75% 0.9% 염수 중에 있었고 pH는 0.5 M NaOH 용액을 사용하여 7로 조정하였다. 경구(PO) 투여의 경우 IVc-059a는 물에서 제형화된다. 약물 용액을 투여 당일에 제형화하였다.
이 연구의 목적은 급성 췌장염 모델에서 효능 화합물을 평가하고(14일), 췌장염 매개변수의 사후 분석을 가능하게 하는 조직 샘플을 생성하고, 첫 번째 및 마지막 주사 후 1시간 및 24시간 후에 채취한 혈액 샘플에서 얻은 첫 번째 및 마지막 주사 후 동물 노출 수준을 평가하기 위해 4개의 혈장 샘플을 생성하는 것이다.
연구 설계: 연구 첫날에 동물을 무작위로 처리군에 배정하여 체중이 균등하게 분포되도록 하였다. 마우스(음성 대조군 제외)는 세룰레인 투여 5분 전에 시험 화합물로 처리하였고, 이어서 연구 동안 매일 복강내 경로(IP)를 통해 2 μg/kg의 세룰레인을 주사하였다.
[표 33] 첫 번째 실험.
군 동물 No. 제제 투여 수준; 경로
1 3 음성 대조군 (비-유도) 비히클 (tbc); IV
2 3 음성 대조군 (유도) 비히클 (tbc); IV
3 8 피르페니돈 40 mg/kg; IV
4 8 Ia-001a 15 mg/kg; IV
5 8 Ia-001aTz 15 mg/kg; IV
6 8 Ic-001aTz/004a 15 mg/kg; IV
7 8 Ic-007a 15 mg/kg; IV
8 8 Ib-010a 150 mg/kg; PO
9 8 IIIc-061a 15 mg/kg; IV
10 8 IVc-059a 150 mg/kg; PO
[표 34] 두 번째 실험.
군 동물 No. 화합물 투여 수준; 경로
1 3 음성 대조군 (비-유도) 비히클 (tbc); IV
2 3 음성 대조군 (유도) 비히클 (tbc); IV
3 8 피르페니돈 40 mg/kg; IV
4 8 Ic-001aTz2 15 mg/kg; IV
5 8 IIc-007a 15 mg/kg; IV
6 8 IIIa-001aTz 15 mg/kg; IV
7 8 IIIc-061a 15 mg/kg; IV
8 8 IIIc-061a-E3 150 mg/kg; PO
9 8 IVc-059a 15 mg/kg; IV
10 8 IVc-059a 150 mg/kg; PO
세룰레인 투여 5분 전에 시험 화합물을 처리하였다.
[표 35] 연구 스케줄.
시간(일) T0 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14
화합물 I.V. 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 투여량 희생
세룰레인 I.P. 1st 2nd 3rd 4th 5th 6th 7th 8th 9th 10th 11th 12th 13th 14th
PK를 위한 혈액 샘플링 T0+1hT0+24h T12+24h
T13+1h
장기 분석 췌장
연속 관찰
체중: 연구에 참여한 모든 마우스의 체중을 매일 측정하고 기록하였다; 이 정보를 각 동물에 대한 정확한 투여량을 계산하는데 사용하였다.
일반적인 징후 및 증상: 마우스를 매일 관찰했으며 임의의 고통의 징후 또는 일반적인 상태의 변화, 예컨대 털 곤두섬(starred fur), 움직임 부족, 호흡 곤란을 기록하였다.
샘플링 및 사후 분석: 위에 표시된 시간에 전혈 샘플(60 μl)을 측면 꼬리 정맥에서 K2-EDTA로 코팅된 튜브 내로 채취하였다. 혈장 샘플을 준비하고 -20℃에서 냉동 보관하였다. 혈장 샘플을 화합물의 정량화를 위해 고객 생물분석 제공업체인 Eurofins(FR)로 보냈다.
최종 샘플링: 종료 전에 동물을 칭량하였다. 최종 연구 동물은 CO2 흡입을 통해 도태시켰다. 말기 혈액 샘플을 심장 천자 및 준비된 혈장을 통해 채취하였다. 리파아제 및 아밀라아제 활성은 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 ELISA를 통해 측정되하었다. 남은 혈장은 향후 사이토카인 분석을 위해 보관되었다. 췌장 조직을 절제하고 칭량하고, 절편(50 μg)을 급속 동결하고 췌장 샘플에서 화합물의 정량화를 위해 분석하였다. ELISA를 통한 MPO 활성, IL-33 및 TGF-B 수준의 측정을 위해 절편(50 μg)을 처리하였다. 나머지는 포르말린으로 고정하고 파라핀 왁스에 침지하였다. H&E 염색을 수행하고 부종, 염증성 침윤, 실질 괴사, 출혈을 검사하는 Schmidts 표준 점수 시스템을 사용하여 절편을 평가하였다. Masson의 삼색소(Trichrome) 염색을 수행하고 섬유성 조직으로 덮인 영역을 QuPath 소프트웨어를 사용하여 디지털 방식으로 정량화하였다. 말단 혈청 샘플을 사용하여 IdeXX CHEM15 및 LYTE4 클립을 사용하여 혈액 화학을 평가하였다(처리군 당 4마리 동물).
IV 치료 15일 후 급성 췌장염 결과
4가지 기준: 부종, 염증성 침윤, 실질 괴사, 출혈에 기반하고 아래에 설명된 대로 점수를 매긴 췌장 손상의 조직병리학 평가.
[표 36] 4가지 기준에 기반한 점수 수준
항목 점수 수준
0 1 2 3
간질 부종 없음 소엽 간 소엽 연관 샘꽈리 세포와 같이 단리된 섬
백혈구 침윤 없음 < 20% 20% - 50% > 50%
샘꽈리 세포 괴사 없음 < 5% 5% - 20% > 20%
출혈 없음 1-2 점 3-5 점 > 5 점
[표 37] 동물군에 대한 점수 수준 결과
점수매김 요약
간질 부종 백혈구 침윤 샘꽈리 세포 괴사 출혈
점수 1 2 3 4
음성 대조군 (비-유도) 0-0-0 0-0-0 0-0-0 0-0-0
음성 대조군(세룰레인 유도) 2-3-3 3-3-3 2-2-3 2-2-2
Ia-001a
(세룰레인 유도)		 1-1-1-1-1-2-2 3-3-3-3-3-3-3 0-1-1-1-1-1-1 1-1-1-1-1-1-2
Ia-001aTz
(세룰레인 유도)		 1-1-1-1-2-2-2-2 2-3-3-3-3-3-3-3 0-0-0-0-1-1-1-1 0-1-1-1-1-1-1-1
Ic-001aTz/004a(세룰레인 유도) 1-1-1-1-2-2-2-3 1-3-3-3-3-3-3-3 1-1-1-1-2-2-2-2 1-1-1-1-1-1-1-1
Ic-007a(세룰레인 유도) 1-1-1-1-1-1-1-1 3-3-3-3-3-3-3-3 1-1-1-1-1-1-1-1 1-1-1-1-1-1-1-1
Ib-010a(세룰레인 유도) 1-1-1-1-2-2-2-2 3-3-3-3-3-3-3-3 1-1-1-1-1-1-1-1 0-0-1-1-1-1-1-1
IIIc-061a(세룰레인 유도) 1-1-1-1-1-1-1-1 1-1-1-1-1-1-1-1 0-0-0-0-1-1-1-1 1-1-1-1-1-1-1-1
IVc-059a
(세룰레인 유도)		 1-1-1-1-1-1-1-1 1-1-1-1-1-1-1-1 0-0-1-1-1-1-2-2 1-1-1-1-1-1-1-1
피르페니돈
(세룰레인 유도)		 1-1-1-1-1-1-1-1 2-2-2-2-2-2-2-2-2 0-0-1-1-1-1-1-1 0-0-0-0-1-1-1-1
슈미트 점수
슈미트 점수는 아래 표에 설명된 바와 같이 4가지 조직병리학 기준을 기반으로 하는 화합물의 효능 평가이다. 슈미트 점수가 증가하는 화합물의 순서(최고 점수 = 10은 세룰레인 유도 + 비히클 처리이고 가장 낮은 점수 = 0은 비-유도 동물임). 도 2의 화합물에 대한 슈미트 점수의 그래프는 모든 생성물이 세룰레인 대조군 동물과 비교하여 개선된 슈미트 점수를 나타낸다.
[표 38] 슈미트 점수 및 4개의 매개변수 표
시험 화합물 간질 부종 백혈구 침윤 샘꽈리세포 괴사 출혈 슈미트 점수 (H&E)
비-유도
+
비히클		 0 0 0 0 0 온전한 정점 경계
풍부한 분비성 과립이 있는 건강한 세엽
괴사 징후 없음
부종 징후 없음
출혈 징후 없음
유도
+
IIIc-061a		 1.0 1.0 0.5 1.0 3.5 경미한 부종 관찰됨
경미한 출혈 관찰됨
경미한 샘꽈리세포 괴사 관찰됨
경미한 백혈구 침윤 관찰됨
정상 섬 형태 관찰됨
다른 치료군과 달리, 부위는비교적 정상의 전반적인 병리를 가졌지만 경미한 부종 관찰됨
유도
+
IVc-059a		 1.0 1.0 1.0 1.0 4.0 경미한 부종이 덜 관찰됨경미한 출혈이 덜 관찰됨
경미한 샘꽈리세포 괴사가 관찰됨
경미한 백혈구 침윤이 관찰됨
일부 췌도 증식이 관찰됨
호염기성 영역의 교란
유도
+
피르페니돈		 1.0 2.0 0.8 0.4 4.1 경미한 부종이 관찰됨경미한 출혈이 관찰됨
경미한 샘꽈리세포 괴사가 관찰됨
백혈구 침윤이 관찰됨
부위에서 정상 섬 형태가 관찰됨
유도
+
Ib-001aTz		 1.5 2.9 0.6 0.9 5.9 췌장 전반에 부종이 관찰됨경미한 출혈이 관찰됨
경미한 샘꽈리세포 괴사가 관찰됨
전반적으로 백혈구 침윤
비정상적인 섬 형태가 관찰됨 (미량)
호염기성 영역 교란
유도
+
Ic-007a		 1.0 3.0 1.0 1.0 6.0 경미한 부종이 관찰됨경미한 출혈이 관찰됨
경미한 샘꽈리세포 괴사가 관찰됨
백혈구 침윤이 관찰됨
호염기성 영역 교란
유도
+
Ib-010a		 1.5 3.0 1.0 0.8 6.3 췌장 및 샘꽈리 세포 전반에 부종이 관찰됨경미한 출혈이 관찰됨
경미한 샘꽈리세포 괴사가 관찰됨
백혈구 침윤이 관찰됨
호염기성 영역 교란
유도
+
Ia-001a		 1.3 3.0 0.9 1.1 6.3 췌장 전반에 부종이 관찰됨출혈이 관찰됨
경미한 샘꽈리세포의 적은 괴사가 관찰됨
전반적으로 백혈구 침윤
비정상적인 섬 형태가 관찰됨
호염기성 영역 교란
유도
+
Ic-001aTz/004a		 1.6 2.8 1.5 1.0 6.9 췌장 전반에 부종이 관찰됨경미한 출혈이 관찰됨
샘꽈리세포 괴사가 관찰됨
전반적으로 백혈구 침윤
호염기성 영역 교란
유도
+
비히클		 2.7 3.0 2.3 2.0 10.0 췌장 전반에 부종이 관찰됨특히 췌장 머리 부분에서, 출혈이 관찰됨
샘꽈리세포 괴사가 관찰됨
전반적으로 백혈구 침윤
호염기성 영역 교란
하기 표에 나타난 바와 같이, 모든 화합물 Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/004a, Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a는 "유도된" 군에 비해 IL33의 췌장 조직 수준에서의 유의한 감소를 나타냈다. TGF-B 수준은 Ic-007a, Ib-010a, IIIc-061a, IVc-059a의 경우 유의하게 감소하였다. 전반적인 슈미트 점수는 특히 모든 화합물에 대해 개선되었지만 특히 화합물 IIIc-061a, IVc-059a에 대해 개선되었다.
하기 표 39 및 40은 췌장 조직 샘플에서 MPO의 말단 췌장 농도, IL33 조직 농도 및 TGF-B 농도를 나타낸다.
시험 화합물 평균 말단 BW (초기 %) 평균 말단 췌장 중량 (g) 췌장 MPO 활성 췌장 IL33 수준 p-값 대 유도 췌장 TGF-B 수준 p-값 대 유도
비히클 93.8 0.148 2.81 76±19 --- 184±107 ---
Ia-001a 90.3 0.083 3.76 330±162 0.017 592±358 0.984
Ia-001aTz 89.1 0.084 2.68 154±49 0.000 507±289 0.663
Ic-001aTz/004a 93.5 0.104 2.15 180±54 0.000 369±195 0.113
Ic-007a 91.2 0.109 1.65 147±47 0.000 188±77 0.000
Ib-010a 91 0.091 1.83 157±70 0.000 219±140 0.00035
IIIc-061a 91.4 0.086 2.13 177±80 0.000 295±146 0.015
IVc-059a 93.3 0.09 2.88 86±23 0.000 231±199 0.020
피르페니돈 97.6 0.136 1.26 78±23 0.000 289±170 0.024
유도 93.8 0.148 2.81 628±57 0.000 592±358 0.015
시험 화합물 혈청 아밀라제 수준 혈청 리파제 수준 혈청 IL33 수준 혈청 TGF-B 수준 제형용 염수/PBS 슈미트 점수 (H&E)
비히클 43.69 11.66 37.22 10.88 - 1.0
Ia-001a 34.07 6.72 39.52 8.69 염수 6.3
Ia-001aTz 35.35 8.57 37.02 8.69 염수 5.9
Ic-001aTz/004a 36.51 8.21 35.43 8.99 PBS 6.9
Ic-007a 34.86 9.28 34.93 6.17 PBS 6.0
Ib-010a 37.46 9.06 35.36 6.87 PBS 6.3
IIIc-061a 38.38 9.79 33.72 4.65 염수 3.5
IVc-059a 38.56 10.21 46.54 5.69 염수 4.0
피르페니돈 37.71 7.65 39.16 5.5 - 4.1
유도 43.69 11.66 37.22 10.88 10.0
두 번째 실험에서 화합물 Ic-001a-TZ(2), IIc-007a, Ia-015a, IIIc-061a, IVc-059a를 양성 대조군으로서 피르페니돈 100 mg/kg을 사용하여 동일한 모델에서 15 mg/k로 평가하였다.
[표 41] 결과
군(경로 및 투여량 mg/kg) 아밀라제
mU/mL		 리파제
mU/mL		 MPO
U/mg		 IL-33
ng/mL		 TGF-B
ng/mL		 슈미트 점수 트리콤 염색
(섬유증 % 면적)
비-유도 25.887 ± 0.63 3.216 ± 0.212 1.37 ± 0.39 88 ± 37 355 ± 67 11.3 ± 0.6 0.33 ± 0.168
유도 60.858 ± 7.088 9.027 ± 1.33 2.66 ± 0.28 719 ± 97 1292 ± 263 5.9 ± 1.3 5.313 ± 2.089
피르페니돈
(100 mg/kg)		 45.171 ± 6.008 4.541 ± 1.457 1.68 ± 0.44 226 ± 151 578 ± 230 8 ± 1 1.277 ± 0.888
Ic-001a-Tz(2)
(IV, 15 mg/kg)		 50.912 ± 5.074 8.305 ± 3.036 2.63 ± 0.63 493 ± 126 696 ± 448 3.9 ± 0.8 1.366 ± 0.562
IIc-007a
(IV, 15 mg/kg)		 45.325 ± 6.579 6.481 ± 2.908 2.74 ± 0.76 340 ± 211 500 ± 195 8.3 ± 1.6 1.821 ± 1.12
Ia-015a
(IV, 15 mg/kg)		 51.669 ± 12.029 5.31 ± 2.219 2.68 ± 0.6 398 ± 148 547 ± 373 4.6 ± 0.8 1.704 ± 1.621
IIc-061a
(IV, 15 mg/kg)		 40.889 ± 6.556 5.038 ± 0.874 1.72 ± 0.21 240 ± 119 514 ± 227 10.9 ± 1.6 0.714 ± 0.452
IVc-059a
(IV, 15 mg/kg)		 41.149 ± 5.42 4.324 ± 1.121 1.813 ± 0.405 215 ± 84 403 ± 84 10.63 ± 2.33 1.048 ± 0.449
아밀라아제: Ia-015a를 제외한 모든 시험 화합물은 유도된 비히클 처리된 대조군에서보다 유의하게 더 낮은 아밀라제 활성 수준을 나타내었지만, 수준은 비-유도된 동물의 수준에 도달하지 않았다. 리파제: 혈청 내 리파제 활성은 비-유도된 동물보다 비히클로 유도하고 처리한 동물에서 더 높았다. 양성 대조군 피르페니돈, Ia-015a, IIIc-061a 및 IVc 059a를 사용한 처리는 비히클 처리된 동물에서보다 리파제 활성을 유의하게 더 낮추었다.
미엘로퍼옥시다제(MPO: Myeloperoxidase): 비히클로 유도하고 처리한 동물의 췌장 조직에서의 MPO 활성은 비-유도된 동물의 MPO 활성보다 유의하게 더 높았으며 이는 췌장염을 나타낸다. 양성 대조군 피르페니돈, IIIc-061a 및 IVc-059a로의 처리는 유도된 비히클 처리된 대조군보다 MPO 활성 수준을 유의하게 더 낮추었다.
IL-33 및 TGF-B: IIIc-061a 및 IVc-059a 투여된 PO를 제외한 모든 처리는 유도된 비히클 처리된 대조군보다 췌장 IL-33 수준을 더 낮추었다. 혈청 TGF-B 수준과 마찬가지로 유도된 비히클 처리된 대조군보다 TGF-B 수준을 유의하게 더 낮추었다.
간질 부종, 백혈구 침윤, 샘꽈리 세포 괴사 및 출혈을 기반으로 임상적으로 사용된 슈미트 점수 기준을 사용하여 H&E로 염색한 췌장 조직 절편을 평가하였다. 시험된 모든 화합물은 유도된 비히클 처리된 대조군보다 유의하게 더 낮은 슈미트 점수를 초래하였고, IIIc-061a(IV) 및 IVc-059a(IV)는 양성 대조군 피르페니돈보다 낮은 점수를 가졌다.
섬유증 염색: 시판되는 염색 키트(Abcam; ab150686, 삼색소 염색)를 사용하여 콜라겐에 대한 췌장 조직 절편을 염색하였다. QuPath 디지털 이미징 소프트웨어를 사용하여 콜라겐(파란색) 염색으로 덮인 백분율 영역을 정량화하였다. 모든 시험된 화합물은 유도된 비히클 처리된 대조군보다 삼색소 염색 영역이 유의하게 더 낮았다.
실시예 5.2: 췌장암 및 신장암의 치료 및/또는 예방:
본 연구의 목적은 암컷 C57BL/6 마우스에서 피하 뮤린 췌장암 동계 모델(Pan02) 및 암컷 BALB/c 마우스에서 신장암 동계 모델(Renca)의 치료에 대한 본 발명에 따른 화합물의 생체 내 치료 효능을 전임상적으로 평가하기 위한 것이었다.
동물: C57BL/6 마우스 암컷(Pan02 모델의 경우); BALB/c 마우스 암컷(Renca 모델의 경우), 6 내지 8주, 17 g 초과, 케이지 당 최대 5마리 마우스
Pan02 모델 치료 및 군: 화합물 Ia-001a-Tz, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIc-007a를 15 mg/kg의 용량으로 IV 볼루스 주사를 통해 2주 동안 매일 5일/주.
Renca 모델 치료 및 군: 화합물 Ia-001a-Tz, Ic-007a, Ib-010a, IVc-059a, IIc-007a를 15 mg/kg의 용량으로 IV 볼루스 주사를 통해 3주 동안 매일 7일/주.
세포 배양: Renca 종양 세포를 공기 중 5% CO2 분위기에서 37℃에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 DMEM 배지로 시험관 내에서 유지하였다. 기하 급수적 성장기의 세포를 수확하고 종양 접종 전에 세포 계수기로 정량화하였다.
세포 배양: Pan02 종양 세포를 공기 중 5% CO2 분위기에서 37℃에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지로 시험관 내에서 유지하였다. 기하 급수적 성장기의 세포를 수확하고 종양 접종 전에 세포 계수기로 정량화하였다.
Renca 모델에 대한 종양 접종: 종양 발달을 위해 0.1 mL의 PBS 중 Renca 종양 세포(1 x 106)로 각각의 마우스를 오른쪽 후면 옆구리 영역에 피하로 접종하였다.
Pan02 모델에 대한 종양 접종: 종양 발달을 위해 0.1 mL의 PBS 중 Pan02 종양 세포(3 x 106)로 각 마우스를 오른쪽 앞 옆구리 영역에 피하로 접종하였다.
무작위화: 무작위화는 평균 종양 크기가 대략 100(80 내지 110) mm3에 도달할 때 시작하였다. 두 모델 모두, 48마리의 마우스를 연구에 등록하였다. 모든 동물을 6개의 연구 그룹에 무작위로 할당하였다. 다중-작업 방법(StudyDirectorTM 소프트웨어, 버전 3.1.399.19)을 사용하여 "일치 분포(Matched distribution)" 방법에 따라 무작위화를 수행하였다. 무작위화 날짜를 0일로 표시하였다.
관찰 및 데이터 수집: 종양 세포 접종 후, 동물의 병태 및 사망률을 매일 확인하였다. 일상적인 모니터링 동안, 동물을 이동성, 음식 및 물 소비, 체중 증가/감소(무작위화 후 주 당 2회 체중 측정함), 눈/모발 매트 및 임의의 기타 이상과 같은 행동에 대한 종양 성장 및 치료의 임의의 영향을 확인하였다. 사망률 및 관찰된 임상 징후를 개별 동물에 대해 자세히 기록하였다.
종양 부피는 캘리퍼를 사용하여 2차원에서 무작위화한 후 주 당 2회 측정하였고, 부피는 공식: "V = (L x W x W)/2를 사용하여 mm3로 표현하였으며, 여기서 V는 종양 부피, L은 종양 길이 (가장 긴 종양 치수) 및 W는 종양 너비(L에 수직인 가장 긴 종양 치수)이다. 연구 종료 시 종양 중량을 측정하였다. 종양 및 체중 측정뿐만 아니라 투약도 Laminar Flow Cabinet에서 수행하였다.
연구 종점: 종양 성장 억제(TGI: Tumor growth inhibition): TGI%를 항종양 활성의 지표로 사용하였으며 다음과 같이 표현하였다: TGI(%) = 100*(1-T/C)이며 T 및 C는 각각 주어진 날에 처리군 및 대조군의 평균 종양 부피(또는 중량)이었다.
군 간의 평균 종양 부피의 차이에 대한 통계적 분석을 아래 방법 중 하나를 사용하여 수행하였다:
개별 종료일이 다양함에도 불구하고 모든 단일 군에 대해 마지막 투여/관찰일에 수집한 데이터를 사용한다.
TGI가 연구에 등록된 모든/대부분의 마우스에 대해 파생될 수 있도록 비히클군의 평균 종양 부피가 인간적 종말점에 도달하는 날에 수집한 데이터를 사용한다.
나머지 군을 계획된 대로 처리하더라도 처리군이나 대조군 중 어느 하나가 종료된 날에 수집한 데이터를 사용한다.
AUC의 차이(ΔAUC) = 선형 혼합 효과 회귀 모델로 수행한 통계 분석.
연구 종료: 효능 연구를 3주 동안 수행하였다.
통계 분석: 미리 지정된 날짜에 상이한 군의 종양 부피를 비교하기 위해, 먼저 Bartlett 검정을 사용하여 모든 군에 대한 분산의 균질성 가정을 확인하였다. Bartlett 검정의 p-값이 0.05 이상인 경우, 일원 ANOVA를 사용하여 모든 군에서 평균의 전반적인 동등성을 검정하였다. 일원 ANOVA의 p-값이 0.05 미만인 경우, 모든 쌍대(pairwise) 비교에 대해 Tukey HSD(정직한 유의차(honest significant difference)) 검정을 실행하여 사후 검정을 수행하고, 각 처리군과 비히클 군을 비교하기 위한 Dunnett 검정을 수행하였다. Bartlett 검정의 p-값이 0.05 미만인 경우, Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 모든 군 간의 중앙값의 전반적인 동등성을 검정하였다. Kruskal-Wallis 검정의 p-값이 0.05 미만인 경우, 모든 쌍대 비교에 대해 Conover 비-모수(non-parametric) 검정을 실행하거나 각 처리군을 비히클 군과 비교하는 사후 검정을 단일 단계 p-값 조정으로 수행하였다. 모든 통계 분석은 통계 컴퓨팅 및 그래픽(버전 3.3.1)을 위한 R-a 언어 및 환경에서 수행하였다. 달리 명시되지 않는 한 모든 검정은 양측이며, p-값이 0.05 미만이면 통계적으로 유의한 것으로 간주한다.
결과
[표 42] 13일차에 수집한 데이터를 갖는 시험 물질의 항종양 활성
군 처리 종양 부피 ± SEM (mm 3 ) TGI (%)
대조군 비히클, 5 μL/g, I.V., 2주 동안 QD*5 187.91 ± 11.19(8) -
화합물 IVc-059a IVc-059a, 15 mg/kg, 5 μL/g, I.V., 2주 동 안 QD*5 148.49 ± 7.05(8) 20.98%
[표 43] 13일차에 수집한 데이터를 사용한 종양 부피의 통계적 분석
검정 p-값 유의성 수준
분산 및 정규성의 동질성 검정
Bartlett 검정 2.76E-05 ***
군 간의 전반적인 동등성 검정
Kruskal-Wallis 검정 0.00965 **
개별적인 군 간의 동등성 검정
(Conover 비-모수 다대일(many-to-one) 비교 검정)
군 대조군 대 화합물 IVc-059a 0.0226 *
결과 요약
본 연구에서, 암컷 C57BL/6 마우스에서 피하 뮤린 췌장암 동계 모델(Pan02)의 치료를 위한 시험 화합물 IVc-059a의 생체 내 치료 효능을 평가하였다. 15 mg/kg I.V.로 투여한 화합물 IVc-059a는 TGI 값이 20.98%로 종양 성장을 유의하게 억제하였다(P<0.05).
[표 44] 종양 부피 Pan02 모델의 억제 평균(%)
일 0　 3　 6　 9　 13　
IVc-059a -0.11% 19.86% 18.64% 18.49% 20.98%
평균 억제% = (평균(대조군 NaCl)-평균(Cpd 처리))/평균(C대조군 NaCl) * 100%
[표 45] Renca 모델의 종양 부피 억제 평균%
일 0　 3　 6　 9　 13　 16
IVc-059a 0.05% -0.90% 5.02% 14.83% 23.07% 19.42%
실시예 5.3: 당뇨병성 망막증(DR)의 치료 및/또는 예방
동물 모델: db/db 마우스 모델을 사용하여 비당뇨 대조군으로 db/+ 마우스와 비교하였다. db/db 마우스는 렙틴 수용체 유전자에 돌연변이를 가지고 있었고 비만-유도된 제2 형 당뇨병의 모델이었다. 문헌[Bogdanov et al. PLoS One, 2014, 9, e97302]은 db/db 마우스가 당뇨병이 있는 인간의 눈에서 발생하는 신경퇴행성 과정의 특징을 재현한다고 보고하였다. 또한, 이 모델은 당뇨병에 의해 유발된 초기 미세혈관 이상(혈관 누출)을 개발하였다(문헌[Hernandez et al. Diabetes 2016, 65, 172-187; Hernandez et al. Diabetologia 2017, 60, 2285-2298]). 따라서, 이 모델은 당뇨병성 망막증(DR)의 초기 단계의 치료를 위한 본 발명의 화합물의 효능을 시험하기 위한 적절한 모델로 간주하였다.
당뇨병에 의해 유발된 혈관 누출에 대한 Ia-007a를 함유한 점안액의 효과를 db/db 마우스 모델에서 시험하였다. 마우스, db/db(BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J) 마우스 및 8주령 비-당뇨병(db/+) 마우스를 Charles River Laboratories(이탈리아, 칼코 소재)에서 구입하였다.
동물들은 임의의 음식(ENVIGO Global Diet Complete Feed for Rodents, Mucedola, 이탈리아, 밀라노 소재)과 여과된 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 마우스를 온도(20°C) 및 습도(60%)의 엄격한 환경 조건 하에 유지하였다. 또한, 이는 12시간/12시간 명/암의 주기를 가지고 있었다.
중재 연구: db/db 마우스가 10주령이 되었을 때, Ia-007a 점안액 또는 비히클 점안액을 주사기를 사용하여 각 눈의 상부 각막 표면에 직접 무작위로 투여하였다. 각 눈에 Ia-007a(5 mg/mL) 한 방울(5 μL) 또는 각 눈에 비히클(0.9% 소듐 클로라이드 5 μL)을 14일 동안 매일 2회 투여하였다. 15일차에 부검 약 1시간 전에 동물의 눈에 Ia-007a 또는 비히클 한 방울을 주입하였다. 모든 실험은 유럽 공동체(86/609/CEE)의 신조에 따라 수행하였다.
망막 혈관계의 투과성을 에반스 블루 알부민 방법을 사용하여 혈관에서 망막으로의 알부민 누출을 평가함으로써 생체 외에서 조사하였다. 이를 위해, 군 당 4마리의 동물에게 에반스 블루(E2129 SIGMA, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 용액(PBS pH 7.4에 용해된 5 mg/mL)을 복강 내 주사하였다. 주사 후 동물은 파란색으로 변하였으며, 염료 흡수 및 분포를 확인하였다. 2시간 후, 경추 탈구에 의해 마우스를 안락사시키고 눈을 적출하였다. 각 동물의 망막을 단리하고 무게를 재고 빛으로부터 빠르게 보호하였다. 평평한 장착 슬라이드를 수득하여, 장착 매체 Prolong Gold 변색 방지제(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, 미국 오레곤주 소재) 한 방울로 덮었다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(FV1000; Olympus, 독일 함부르크 소재)을 사용하여 561-nm 레이저 라인을 사용하여 X60에서 모든 망막의 상이한 무작위 필드에서 디지털 영상을 획득했으며, 각 영상을 1024픽셀 X 1024픽셀 크기의 동일한 빔 강도로 기록하였다. 알부민-결합된 에반스 블루의 정량적 분석을 위해, 0.44 mm2의 필드당 혈관외유출 수를 계산하였다. 이 분석은 마우스가 받은 치료를 알지 못하는 조사자들에 의해 수행되었다.
결과
처리 종료 시 혈당 농도 및 체중은 비히클로 처리한 db/db 마우스에서보다 Ia-007a 점안액으로 처리한 db/db 마우스에서 유사하였다. 에반스 블루의 혈관 외 위치는 당뇨병 마우스 망막에서 확인되었다(도 1, 흰색 화살표). Ia-007a를 사용한 국소 치료는 필드당 혈관외유출의 수를 유의하게 감소시킬 수 있었고, 따라서 혈액 망막 장벽의 파괴로 인한 혈관 누출을 방지할 수 있었다.
실시예 5.4: 복막염의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물의 치료 효능을 문헌[Cook AD et al. (J Immunol. 2003;171(9):4816-4823)] 및 문헌[Tsai JM et al. (Blood Adv. 2019;3(18):2713-2721. doi:10.1182/bloodadvances.2018024026)]에 의해 기술된 바와 같이 티오글리콜레이트-유도된 복막염 뮤린 모델을 사용하여 평가하였다.
복막염 유도 1시간 전에 50 mg/kg의 화합물 1 mL를 C57BL/6J 마우스의 복강내로(i.p.) 주사하였다. 이어서, 대조군으로서 멸균 티오글리콜레이트 브로쓰 4%(wt/vol) 또는 PBS 1 ml를 사용하여 복막염을 유도하였다. 3시간 후, 마우스를 5 mg/ml 케타민(ketamine) 및 1 mg/ml 자일라진(xylazine)을 함유하는 PBS 용액으로 i.p.로 주사하여 마취하고 복강을 EDTA 2 mM을 함유하는 5 ml의 빙-냉 멸균 Ca2+/Mg2+-무함유 HBSS 1X로 세척하였다. 복막 삼출물 세포(PEC: Peritoneal exudate cell)를 4℃에서 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리하고 적혈구를 세포용해시켰다. PEC를 세척하고, PBS 10% FBS에 재현탁하고, 항-CD16/CD32 및 mIgG FcR 차단제와 함께 인큐베이션한 다음 이동된 백혈구(항-CD45, 항-CD11b, 항-Ly6G, 항-CD8a, 항-CD4, 항-CD3)를 특성분석하기 위해 형광적으로 접합된 항체로 염색하였다. 7-AAD 배제에 의해 세포 생존율을 측정하였다. MACSQuant Analyzer(Miltenyi Biotec)를 사용하여 유세포 분석에 의해 표본을 수집하고 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
동물: 각 화합물에 대해 군당 4마리의 C57BL/6J 마우스 대 4마리의 비히클 처리된 마우스.
cpd로 처리: 화합물의 i.p. 주입에 의한 50mg/kg
- Ic-007a: 주입 부피: DMSO(1,375 mg) 중의 Ic-007a 68,5 μl의 화합물 + 431,5 μl의 PBS(500 μl 총 부피, 5,87 mM) 마우스 약 28 g
- IIc-007a: 주입 부피: DMSO(1,345 mg) 중의 67,25 μl의 화합물 + 431,5 μl의 PBS(500 μl 총 부피, 5,74 mM) 마우스 약 27 g
- IIIc-061a: 주입 부피: DMSO(1,175 mg) 중의 58,75 μl의 화합물 + 441,25 μl의 PBS(500 μl 총 부피, 4,56 mM) 마우스 약 23.5 g
- IVc-059a: 주입 부피: DMSO(1,045 mg) 중의 52,25 μl의 화합물 + 447,75 μl의 PBS(500 μl 총 부피, 5,25 mM) 마우스 약 20.9 g
생성물 Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a, IVc-059a를 사용한 처리를 티오글리콜레이트로 복막염을 유도하기 60분 전에 수행하였다. 판독은 티오글리콜레이트 주사 1시간 후에 수행하였다.
판독 방법: 항-CD45, 항-CD11b, 항-Ly6G, 항-CD8a, 항-CD4, 항-CD3을 사용하여 이동된 백혈구를 특성화하기 위한 유세포 분석기.
결과 및 통계 분석: 결과를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로 표시하였다. 통계 분석에는 유의 수준 0.05를 사용하는 양측 스튜던트 t 검정(two-tailed Student's t test)을 사용하였다.
결과
[표 46] 화합물 Ic-007a에 대한 데이터의 예
세포 계수 비히클 처리 마우스 C76/24 처리 마우스 감소%
백혈구
(CD45+ 세포)		 60.8 x 104 (± 10.8 x 104) 31.3 x 104 (± 6.66 x 104) 48%
PMN
(CD11b-Ly6G 이중 + 세포)		 10.4 x 104 (± 7.75 x 104) 2.03 x 104 (± 0.36 x 104) 80%
CD4+ 림프구 1.58 x 104 (± 0.54 x 104) 1.03 x 104 (± 0.15 x 104) 35%
CD8+ 림프구 1.86 x 104 (± 0.59 x 104) 0.54 x 104 (± 0.15 x 104) 71%
[표 47] 4개의 화합물에 대한 결과 요약
판독 비히클 처리 마우스에 대한 C20 처리 마우스의 감소%
세포 계수 Ic-007a IIc-007a IIIc-061a IVc-059a
백혈구 (CD45+ 세포) 48.0% 11.8% -2.4% 4.0%
PMN (CD11b-Ly6G 이중 + 세포) 80.0% 27.3% -8.3% -13.0%
CD4+ 림프구 35.0% 40.0% 42.9% 6.0%
CD8+ 림프구 71.0% 20.0% 33.3% 23.0%
화합물 Ic-007a는 가장 강력한 항-염증 효과를 보였고 백혈구 모집을 감소시켰으며(48%), PMN(80%), CD8+ 림프구(71%) 및 CD4+ 림프구(35%)에 대해 매우 강력한 효과를 나타냈다.
실시예 5.5: 당뇨병성 심근병증의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물의 치료 효능을 문헌[Li C et al. (Cardiovasc Diabetol. 2019;18(1):15. 공개 2019 Feb 2. doi:10.1186/s12933-019-0816-2)]에 의해 기술된 당뇨병성 심근병증 뮤린 모델을 사용하여 시험하였다.
동물 절차 및 약물 치료: 30마리의 8주령 KK-Ay 마우스(유전적 제2 형 당뇨병 모델) 및 C57BL/6J 마우스를 음료/사료 상자에 자유롭게 접근할 수 있는 케이지(케이지당 4 내지 6마리)에 수용하였다. 마우스를 24℃에서 12:12h의 명/암 주기로 유지되는 방에서 수용한다.
제2 형 당뇨병 모델 마우스에게 고지방-식이를 먹였다. 혈당을 매일 측정한다. 연속 2주 동안 혈당 농도가 15 mM(200 mg/dL) 이상인 마우스를 다음 실험에 사용하였다. 그 후, 동물을 군으로 무작위로 나누고(군당 15마리) 8주 동안 사육하였다. 군은 대조군을 포함한다: (1) 처리하지 않은 건강한 C57BL/6J 마우스; (2) 처리하지 않은 제2 형 당뇨병 KK-Ay 마우스; 및 (3) 본 발명의 화합물로 처리한 제2형 당뇨병 KK-Ay 마우스.
심장초음파 평가: 실험적 개입 전과 연구 기간이 끝날 때 심장초음파 측정을 수행한다. 17.5 MHz 라이너 어레이 변환기 시스템(Vevo 2100™ 고해상도 이미징 시스템, Visual Sonics)이 장착된 M-모드 심장초음파를 사용한다. 심박수(HR) 및 다음과 같은 구조적 변수를 평가한다: 확장기의 좌심실 내부 치수(LVIDD: left ventricular internal dimension in diastole), 수축기의 좌심실 내부 치수(LVIDS: left ventricular internal dimension in systole), 수축기(IVSs) 및 확장기(IVSd)의 심실 중격 두께(interventricular septal thickness in systole and in diastole), 및 확장기(LVPWd) 및 수축기(LVPWs)의 LV 후벽 두께(LV posterior wall thickness in systole and diastole). 좌심실 질량을 [(LVIDd + LVPWd + IVSd)3 - (LVIDd)3 x 1.04 x 0.8 + 0.6] 공식을 사용하여 계산한다. 좌심실 기능은 분획 단축률(FS: fractional shortening), 박출률(EF: ejection fraction) 및 E/A 비율을 포함한 다음 매개변수로 평가한다. 모든 측정은 실험군에 대해 맹검인 단일 조사자에 의해 수행한다.
심근 히드록시프롤린 농도: 좌심실의 심근 히드록시프롤린 농도를 측정하여 심근 콜라겐 함량을 추정한다. 측정은 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트(BioVision, Mountain View, 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하는 분광 광도계로 수행한다.
혈청 지질, 글루코스, 인슐린 및 HbA1c 수준의 검출: 연구가 끝나면, 마우스를 공기 중 3% 이소펜탄을 흡입하도록 하여 마취한다. 공복 혈액 표본을 각 동물의 설하 정맥을 통해 항응고제로서 리튬 헤파린을 함유하는 상업용 튜브에 수집하고 3000 rpm/분에서 6분 동안 원심분리한다. 혈장을 일반 튜브에 보관하고 분석할 때까지 -20℃에서 보관한다. 총 콜레스테롤(TC), 트리글리세리드(TG), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 및 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C) 혈장 농도를 분광광도법으로 결정한다. 혈당 수치는 글루코미터(ACCU-CHEK, Roche, 미국 소재)를 사용하여 측정한다. 밤새 금식한 후, 공복 인슐린 및 프로인슐린 수준은 각각 마우스 인슐린 및 프로인슐린 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay) 키트(Nanjing Jiancheng Biotech, 중국 소재)를 사용하여 결정한다. 혈액을 또한 크로마토그래피-분광 광도계 이온 교환 키트(Biosystems, 스페인 소재)에 의한 HbA1c 측정을 위해 보유한다.
심장 조직의 산화 스트레스 평가: 동물을 안락사시키고, 심장을 제거하고 연구 종료 시 Krebs-Ringer 용액(115　mM NaCl, 5　mM KCl, 1.2　mM KH2PO4, 25　mM NaHCO3, 1.2　mM MgSO4, 1.25　mM CaCl2 및 11　mM 글루코스)으로 역으로 헹군다. 관류 용액의 온도를 37℃로 유지한다. 그런 다음 심장의 무게를 측정하고, 심장 조직을 1 mM EDTA를 함유하는 pH 7.4의 냉각된 인산염-완충 염수(PBS)에서 얼음 위에서 균질화한다. 균질물을 7000 rpm/분으로 10분 동안 차가운 식염수에서 원심분리한다. 상등액의 단백질 농도를 표준으로서 소 혈청 알부민 키트에 의해 결정한다. 상등액은 지질 히드로퍼옥시드 수준 및 글루타티온 퍼옥시다제(GSH-Px), 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 및 말론디알데히드(MDA) 수준의 분석에 사용한다. 측정은 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트(Solarbio, 중국 소재)를 사용하는 분광 광도계로 수행한다. 지질 히드로퍼옥시드 수준은 nmol/mg 단백질로 표시한다. GSH-Px, SOD 및 MDA 수준은 각각 μmol/mg 단백질, nmol/mg 단백질, 및 mmol/mg 단백질로 표시한다. NOX4의 발현 수준은 웨스턴 블롯팅으로 측정한다. 마우스 단클론 항-Nox4(1:1000, Abcam) 및 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 이차 항체(CWBIO)를 사용한다. β-액틴(1:1000, Abcam)을 기준으로 사용한다.
조직학적 및 면역조직화학적 분석: 심장 조직을 48시간 동안 0.1 M 포스페이트 완충액 중 4% 파라포름알데히드에 고정하고, 탈수하고 파라핀에 포매하고, 4-μm 두께로 절단하고, 유리 슬라이드에 장착한다. Masson 삼색소 염색은 심근의 섬유화 정도를 평가하는 데 사용된다.
항원 검색을 위해, 탈파라핀화된 슬라이드를 100℃에서 10분 동안 10 mM 소듐 시트레이트(pH 6.0) 용액에 보관한다. 그런 다음 절편을 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해 3% 히드로겐 퍼옥시드에서 인큐베이션하고 1.5시간 동안 1차 항체(TGF-β1, 콜라겐 I 및 콜라겐 III에 대한 마우스 모노클로날 항체, Abcam)와 함께 인큐베이션한 다음, 실온에서 2.5시간 동안 상응하는 2차 항체와 함께 인큐베이션한다. 이어서, 절편을 PBS로 3회 세척하고 0.02% 디아미노 벤지딘 용액에서 2 내지 8분 동안 인큐베이션한다. 헤마톡실린으로 대조염색한 후, 슬라이드를 간단히 세척하고, 레진을 장착하고, 광학현미경으로 관찰한다.
웨스턴 블롯팅에 의한 Nrf2/ARE 및 TGF-β/SMAD 경로 분석: 웨스턴 블롯팅 프로토콜이 이전 연구에서 설명되었다. 간단히 말해서, 심근 조직을 빙냉 RIPA 완충액(150 mM 소듐 클로라이드, 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS), 0.5% 소듐 디옥시콜레이트, 1.0% NP-40, PMSF 1　mM, 및 50　mM Tris, pH 8.0) 중에서 세포용해하여 총 단백질을 추출한다. 총 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Medchem Express, 미국 소재)에 의해 정량화한다. 동일한 양의 단백질을 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분리한다. 그런 다음, 단백질은 겔에서 폴리비닐리덴 플루오라이드 막으로 옮겨진다. 5% 탈지유로 차단한 후, 막을 1차 항체(Nrf2, HO-1, TGF-β1, p-Smad2, Smad2, p-Smad3, Smad3, Smad7, α-SMA 1:1000, Abcam)에서 밤새 인큐베이션한다. 밴드를 특이적 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체(CWBIO)로 검출한다. β-액틴(1:1000, Abcam)을 총 세포 단백질의 기준으로 사용한다.
실시예 5.6: 당뇨병 및 당뇨병성 상처 치유의 치료 및/또는 예방
스트렙토조토신(STZ-유도 당뇨병)을 사용한 당뇨병 뮤린 모델을 사용하여 당뇨병성 상처 치유에 대한 본 발명의 화합물의 효능을 평가하고 피부 조직의 사후 분석을 위해 조직 샘플을 생성하였다.
동물: 체중이 대략 25 내지 30 g인 5 내지 7주령의 암컷 CD-1 마우스 총 104마리를 연구를 위해 이식하였다. 이들은 Charles River에서 구입하여 도착 후 7일 동안 적응시켰다.
동물 수용: 마우스를 꼬리 표시로 식별된 개별 마우스와 함께 IVC 케이지(케이지당 최대 5마리 마우스)에 수용하였다. 케이지, 깔짚 및 물을 사용 전에 소독하였다. 동물에게 환경 강화 및 둥지 재료를 제공하기 위해 옥수수 속대 강화 깔짚을 제공하였다. 각 케이지는 동물의 수, 성별, 계통, 생년월일, 연구 번호 및 시작 날짜 및 치료를 나타내는 카드로 명확하게 표시하였다. 케이지는 일주일에 한 번 필요한 경우 음식과 물을 교체하며 바꿔주었다.
동물 사육실을 실온 20 내지 24℃, 습도 30 내지 70%, 12시간 명/암 주기로 유지하였다.
무균 기술 및 투약: 본 연구에 사용한 동물은 면역 능력이 있지만, 투약 용액의 제조 및 동물의 투여/중량 측정은 멸균 생물안전 캐비닛에서 수행하였다. IV 투약: 화합물을 5% DMSO: 10% 솔루톨: 10% PEG400: 75% PBS에서 제형화하고 0.5 M NaOH 용액으로 pH를 7로 조정하였다. PO 투약: 제형은 물 중에 있다.
약물 용액을 투약 당일에 제형화하였으며, 투여 종료 시 남은 모든 것은 -20℃에서 보관한다.
연구 설계: 마우스(음성 대조군 제외)에 연속 5일 동안 매일 STZ(55 mg/kg; IP)를 주사하였다. 주사하기 전에 마우스를 6시간 동안 금식시켰다. 유도 완료 후 1주일차에 글루코스 수준을 모니터링하고 수준이 15 mml/L(280 mg/gL) 미만인 마우스는 이상적인 당뇨병 중증도가 발병하지 않았기 때문에 연구에서 제외하였다. 동물을 마취하고 멸균된 생검 펀치를 사용하여 전체 두께 6 mm 상처를 생성하였다. 상처를 영상화하였다(0일차). 동물을 치료하고 14일차까지 2일 마다 영상화하였다(대조군의 경우, 비-당뇨병 마우스 상처가 치유됨). 상처 영상은 그래픽으로 플롯팅된 시간에 대한 상처 면적 및 폐쇄 백분율에 대해 디지털 방식으로 평가하였다.
군 동물 No. 시험 화합물 용량 수준; 경로
1 3 (3) 음성 대조군 (비-유도) 비히클; IV
2 3 (3) 음성 대조군 (유도) 비히클; IV
3 8 (3) 피르페니돈 250 mg/kg; PO
4 8 (3) Ia-001a 15 mg/kg; IV
5 8 (3) Ia-001aTZ 15 mg/kg; IV
7 8 (3) Ib-010a 15 mg/kg; IV
8 8 (3) IIIc-061a 15 mg/kg; IV
9 8 (3) IVc-059a 15 mg/kg; IV
10 8 (3) IVc-059a 150 mg/kg; PO
처리는 2주(14일) 동안 계속한다. 괄호 안의 동물 수는 7일 동안 투여된 다음 연구 중간 PD 분석을 위해 샘플링된다.
[표 49] 연구 일정:
시간 (주) W1 W2 W3 W4 W5
STZ 용량
(5 일)		 --- ---- --- ---
시험 혈당 혈당 혈당
2일 마다 영상촬영 직후 상처 영상
 혈당
2일 마다의 상처 영상
화합물 --- --- --- IV 용량, 매일
PO 용량, 매일		 IV 용량, 매일
PO 용량, 매일
장기 7일 투약 후 샘플링한 군 당 3마리 마우스, 피부 조직 샘플링.
연속 관찰
체중: 연구에 참여한 모든 마우스의 체중을 매일 측정하고 기록하였다; 이 정보를 각 동물에 대한 정확한 투여량을 계산하는데 사용한다.
일반적인 징후 및 증상: 마우스를 매일 관찰했으며 고통의 징후 또는 일반적인 상태의 변화, 예컨대 털 곤두섬, 움직임 부족, 호흡 곤란을 기록한다.
중간 연구 샘플링: 투약 7일 후 군 당 3마리의 동물을 사멸시키고 상처 조직을 제거하고 2개의 섹션 (A) 및 (B)로 나누었다:
(A) 첫 번째 절편은 FFPE이며 H&E, Masson 삼색소, CD31, TGF-β로 염색함.
(B) 두 번째 절편을 균질화하여 다음 ELISA에 사용한다: SOD, GTPx, 카탈라제, TNF-α, IL-6, TGF-β 수준.
종료: 말기 연구 동물은 CO2 흡입을 통해 도태시킨다. 종료 전에 동물의 무게를 잰다. 조기 종료: 동물의 체중 감소가 20% 이상으로 측정되고 심각한 징후 및 증상을 보이거나 먹거나 마실 수 없는 손상된 동물에 대해 조기 종료가 수행된다.
결과:
혈당: STZ를 사용한 유도는 비-유도된 비히클 대조군과 비교하여 혈당을 유의하게 증가시켰다. Ia-001a, IIIc-061a 및 IVc-059a IV를 사용한 치료는 유도된 비히클 대조군과 비교하여 혈당 수준을 유의하게 감소시켰다. 7일 후 이미 모든 화합물은 STZ-유도 당뇨병 모델에서 어느 정도 가속화된 상처 치유를 나타내었다(도 10, 7일 투약 후 샘플링된 군당 동물 3마리). 피부 조직을 샘플링하였다.
실시예 5.7: 당뇨병성 족부 궤양의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물은 문헌[Zhang Y et al. (J Diabetes Res. 2016, 2016, 5782904. doi:10.1155/2016/5782904)]에 의해 기술된 바와 같이 당뇨병성 궤양의 랫트 모델을 사용하여 시험된다.
피부 및 기타 점막 조직의 상처-치유는 응고 사례, 급성 및 만성 염증, 재상피화, 육아 조직 형성, 상처 수축, 및 결합-조직 재형성을 포함한 일련의 복잡한 사건을 포함한다. 그러나, 노화, 영양실조(예컨대 비타민 C 및 단백질 결핍), 감염, 저산소증, 및 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome)과 같은 유전 질환과 같은 여러 유전적 및 후천적 상태는 이러한 회복 과정을 손상시킬 수 있다. 이러한 상태 중에서, 진성 당뇨병은 손상되거나 치유되지 않는 상처의 가장 흔한 원인이다. 예를 들어, 치료되지 않는 당뇨병성 족부 궤양의 85%가 궁극적으로 절단을 필요로 한다는 놀라운 데이터는 장기 고혈당증의 임상적 중요성을 강조한다. 최근 연구의 저자에 의해 요약된 "만성 상처로 가는 경로(pathway to a chronic wound)"는 전염증성 사이토카인, 반응성 산소 종, 기질 금속단백분해효소(MMP: matrix metalloproteinase), 및 기타 중성 단백질분해효소(예컨대 엘라스타제)의 수준을 높이는 대식세포의 활성화(및 호중구 축적)를 특징으로 하는 장기간 또는 만성 염증에 초점을 맞춘다. 이는, 내인성 프로테나제 억제제의 결핍과 함께, 모두 "과도한 기질 분해, 성장 인자의 분해, 및 손상된 상피화"로 이어진다.
첫 번째 실험에서, 15마리의 성체 수컷 Sprague-Dawley 랫트(체중 300 내지 325 g, Charles River Laboratories International, Inc., 매사추세츠주, 윌밍턴 소재)에 꼬리 정맥을 통해 10 mM 시트르산 염 완충액 pH 4.5(비당뇨병 대조군, NDC) 또는 스트렙토조토신을 함유하는 동일한 용액(STZ; ENZO Life Sciences, Inc., 펜실바니아주, 플리머스 미팅 소재; 70 mg/kg 체중)을 사용하여 I형 당뇨병을 유도한다. 그런 다음 랫트를 아래에 설명된 5개의 실험군(n = 3 랫트/군)에 분배한다. 모든 랫트는 음식과 물을 무제한으로 이용할 수 있다. 48시간 이내에, STZ를 주사한 랫트는 소변에서 글루코스 수치가 심각하게 상승하였다. 당뇨병 유발 3주 후에, 모든 랫트의 등 피부를 면도하고 외과용 트레핀(trephine)을 사용하여 랫트 당 각각 직경이 6 mm인 일련의 6개의 표준 상처를 만든다. 다음 5개 실험군을 확립한다(이러한 초기 실험에서, 모든 군의 처리는 7일 동안이었음; 장기 연구는 아래 실험 3에서 설명됨): 흰색 바셀린 젤리("비히클")를 매일 국소 도포하여 처리한 비당뇨병 대조군(NDC) 랫트; 비히클 단독으로 매일 국소 처리한 당뇨병 랫트(D군); 시험된 화합물로 처리한 당뇨병 랫트.
이 기간이 끝나면, 랫트당 6개의 원형 상처를 캘리퍼스로 상처 직경을 밀리미터로 측정하여 임상적으로 평가하고, 혈액 샘플을 수집하고, 랫트를 희생시키고, 하기 기술된 바와 같이 조직학적/조직화학적 및 생화학적 평가를 위해 피부 샘플을 절개한다.
표준화된 상처 생성 후 7일차에, 모든 동물을 마취하고, 혈당(One Touch Ultra Glucometer; Johnson & Johnson, 뉴저지주, 뉴 브런즈윅 소재) 및 HbA1c(Bayer A1CNow Selfcheck, 캘리포니아주, 서니베일 소재) 측정을 위해 혈액 샘플을 수집하고, 아래 절차를 완료한 후, 랫트를 CO2 흡입으로 희생시킨다.
상처 봉합을 평가하기 위한 임상 측정을 위해 사진을 촬영한다(실험군당 18개의 상처). 상처 표면의 감소 퍼센트를 치료 프로토콜 전후에 각 상처의 직경(밀리미터 단위)을 측정하여 계산한다.
7일차에 상처 조직을 랫트당 2개 부위에서 절제하고 생화학적 분석을 위해 풀링한다. 각 조직 풀을 균질화하고, 4℃에서 0.2 M NaCL 및 5 mM CaCl2를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.8) 중의 5 M 우레아로 밤새 추출한 다음, 이전에 우리가 설명한 바와 같이 11,000 × g에서 1시간 동안 원심분리한다. 상등액을 Tris-HCl, NaCl 및 CaCl2 완충액에 대해 투석하고, 프로테나제를 60% 포화도까지 첨가된 암모늄 설페이트로 부분적으로 정제한다. 침전된 프로테나제를 콜라게나제 MMP-8(Sigma-Aldrich Life Sciences Inc., 미주리주, 세인트 루이스 소재) 및 MMP-13(TSZ Scientific LLC, 메사추세츠주, 프레이밍햄 소재)에 대해 ELISA로 분석한다.
주변의 상처가 없는 조직을 포함하여 두 상처 부위 각각의 생검을 채취하여 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정한 다음, 그로스(grossing), 알코올 탈수, 자일렌 제거, 파라핀 포매 및 절편화 전에 50% 에탄올로 옮긴다. 5-마이크론 절편을 H&E 및 Masson의 삼색소(Trichrome)로 염색하고 상처 가장자리 사이의 거리를 보정된 안구 마이크로미터 및 확인된 영상 분석을 사용하여 조직형태학적으로 측정한다. 랫트당 마지막 두 군데 상처를 해부하고, 가수분해하고 하기 기술된 바와 같이 히드록시프롤린에 대해 분석한다.
14일 및 30일 치료 프로토콜 종료 시, 물리적 측정 및 조직학적 및 조직화학적 평가는 7일 실험에 대해 위에서 설명한 것과 동일하다. 또한, 세 기간 모두에 대해 6 mm 펀치 생검의 조직 샘플을 매번 1시간 동안 120℃에서 2 N NaOH에서 두 번 가수분해한다. 그런 다음 피부 조직 가수분해물의 50 μL 분취량을 콜라겐에서만 본질적으로 발견되는 아미노산인 히드록시프롤린에 대해 분석한다.
실시예 5.8: 당뇨병성 망막증 및 당뇨병성 신증의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 당뇨병의 STZ 유도 및 신장 손상을 포함하는 당뇨병성 망막증을 수반하는 DBA/2 마우스 계통을 사용하는 당뇨병성 마우스 모델을 사용하여 평가하였다. 연속 5일 동안 저용량 STZ 주사를 통한 당뇨병 유도 5주 후, 소변 알부민:Cr 비율은 연령이 일치하는 대조군의 36.9와 비교하여 424배이다.
당뇨병성 신증의 치료를 위해, DBA/2 마우스에 STZ(연속 5일 동안 저용량)로 유도하였다. 유도 완료 1주일 후, 글루코스 수준을 모니터링하고 15 mml/L(280 mg/0.1 L) 미만의 수준을 갖는 마우스는 신장 손상을 초래할 만큼 충분한 중증도의 당뇨병이 발병하지 않았기 때문에 연구에서 제외하였다. 글루코스 수준을 매주 모니터링하였으며 STZ 유도 후 5주 후에 소변 알부민 및 크레아티닌 수준을 측정하고 원하는 범위 내에 있는지 확인하여 신장 손상의 생화학적 평가를 수행하였다. 이 단계를 성공적으로 완료한 후 동물을 처리군에 할당하였다.
혈당 및 소변 알부민/크레아티닌 수준의 매주 평가와 함께 4주 동안 처리를 수행하였다(IV 투여). 처리 기간이 끝날 때, 동물에서 다음 샘플을 채취하였다:
- 글루코스 및 혈액 우레아 질소(BUN: Blood Urea Nitrogen) 측정을 위한 혈액
- 혈청 크레아티닌 측정을 위한 혈액
- 최종 알부민/크레아티닌 비율을 위한 소변
- 신장 절제 및 FFPE: 피크로-시리우스 레드(Picro-Sirius red), Masson의 삼색소 및 H&E 염색을 수행하여 혈관사이 경화증(Mesangial sclerosis), 세동맥 유리증(Arteriolar hyalinosis), GBM(glomerular Basal Membrane, 사구체 기저막) 비대의 증거와 함께, 섬유증 영역을 확인함
당뇨병성 망막증에 대한 화합물 영향을 평가하기 위해, 동물은 안저 카메라(Fundus Camera)를 통해 매주 영상을 촬영하였다. 희생 직전에, 꼬리 정맥을 통해 동물에게 FITC-덱스트란을 주사하였다. 샘플링하는 동안, 눈을 샘플링하고 포르말린으로 고정하였다. 망막 플랫마운트(Retinal Flatmount)를 준비하고 혈관의 혈관질(vascularity)과 누출에 대한 화합물 영향을 관찰하면서 형광적으로 검사하였다(높은 배경 염색으로 표시됨). 동물군(군 당 n=8마리 마우스):
군 동물 No. 화합물
1 3 음성 대조군(비-유도)
2 3 양성 대조군(유도)
3 8 카프토프릴(Captopril) 50mg/kg
4 8 Ia-001a 15 mg/kg I.V.
5 8 Ia-001aTZ 15 mg/kg I.V.
6 8 Ic-007a 15 mg/kg I.V.
7 8 Ib-010a 15 mg/kg I.V.
8 8 IIIc-061a 15 mg/kg I.V.
9 8 IVc-059a 15 mg/kg I.V.
10 8 IVc-059a 150 mg/kg P.O.
혈당 및 소변 알부민/크레아티닌을 매주 측정하며 4주(28일) 동안 처리를 계속하였다. 마지막 화합물(약제) 투여 후 희생시켜, 장기, 및 혈액 샘플링.
[표 51] 연구 일정
시간 (주) W1 W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 종료 W9
희생
STZ 용량 (5 일) --- ---- --- --- --- --- --- --- ---
시험 혈당 혈당 혈당Urine ALB/CREA 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA
화합물 --- --- --- --- --- IV 용량, 매일 IV 용량, 매일 IV 용량, 매일 IV 용량, 매일 ---
장기 혈액 (혈장)
신장
눈
연속 관찰
체중: 연구에 참여한 모든 마우스의 체중을 매일 측정하고 기록하였다; 이 정보를 각 동물에 대한 정확한 투여량을 계산하는 데 사용하였다.
일반적인 징후 및 증상: 마우스를 매일 관찰하였으며 임의의 고통의 징후 또는 일반적인 상태의 변화, 예컨대 털 곤두섬, 움직임 부족, 호흡 곤란을 기록하였다.
샘플링 및 사후 분석
● 최종 샘플링 직전에 망막 플랫마운트 평가를 위해 군당 4마리의 동물에게 FITC-덱스트란을 주입하였다.
● 최종 샘플링:
○ 각 동물에서 준비한 심장 천자 및 혈장/혈청을 통해 최종 혈액 샘플을 채취하였다.
■ 혈당 측정
■ 혈당 크레아티닌 측정
■ BUN 측정
■ 소변 ALB/CREATININE
■ CRP, TNF-α, IL-6 및 TGF-β를 위한 ELISA
■ 사이토카인 분석을 위해 잔여 혈장을 보관하였다
○ 신장 조직을 절제하고 칭량하였다
■ 가능한 생물분석 또는 기타 분석을 위해 한쪽 신장을 급속 동결하였다.
■ 한쪽 신장을 포르말린으로 고정하고 파라핀 왁스에 포매하였다.
● 다음에 대해 H&E 및 Masson의 삼색소 염색 스크리닝
○ 혈관사이(Mesangial) 및 사구체 경화증,
○ 세동맥 유리증(Arteriolar hyalinosis)
○ GBM 비후
○ FFPE인 안구 조직
● 다른 눈(처리군 당 4개)을 혈관 패턴을 측정하기 위해 망막 플랫마운트 분석에 사용하였다.
■ 혈관이 차지하는 면적
■ 혈관 누출 평가
종료: 최종 연구 동물을 CO2 흡입을 통해 도태시켰다. 종료 전에 동물의 무게를 측정하였다.
결과: 화합물 Ia-001a, IIIc-061 및 IVc-059a는 도 9에 나타낸 바와 같이 당뇨병의 STZ 유도를 갖는 DBA/2 마우스 계통에서 혈당 수준을 유의하게 감소시켰다(1주 및 2주 표시).
실시예 5.9: 베체트병(BD)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[ZHENG et al. (Acta Derm Venereol 2015; 95: 952-958)]에 기술된 바와 같이 베체트병 뮤린 모델을 사용하여 시험하였다.
베체트병은 주로 구강 및 비뇨생식기 점막과 요도에 영향을 미치는 만성 재발성 다전신 염증성 장애이다. 베체트병의 병인(etiology)과 발병과정(pathogenesis)은 알려져 있지 않지만, 환경, 감염 및 면역학적 요인을 포함하여 수많은 병인이 제안되었다; 순환하는 면역 복합체와 보체 활성화를 특징으로 하는 자가면역 기반이 점점 더 수용되고 있다. 베체트병의 면역발병과정(immunopathogenesis)을 시험하고 이해하기 위해, 환경 오염 물질, 박테리아 및 인간 열 충격 단백질 유래 펩타이드, 및 바이러스 주사를 기반으로 동물 모델이 개발되었다. 이러한 동물 모델을 개별적으로 및/또는 동시에 사용하면 베체트병에 대한 보다 효과적인 조사가 가능하다.
효율적이고 안전한 치료 선택사항을 찾기 위해 최근 동물 모델이 개발되었다. 호중구 활성화는 BD의 면역발병과정 측면 중 하나이다. 호중구는 선천성 면역 반응에서 중추적인 역할을 한다. 모낭염(pustular folliculitis), 패설지 반응(pathergy reaction), 및 전방축농(hypopyon)과 같은 전형적인 BD 병변은 상당한 호중구 침윤을 가지므로, 호중구 기능 및 활성화 상태를 조사하였다. BD에서 증가, 정상 또는 감소된 기저 및 fMLP 자극 과산화물 생성, 식세포 작용, 화학주성, 및 호중구-내피 부착에 대한 상충되는 보고가 있다. BD에 대한 HLA-형질전환 mic 추정 모델에서, 보이는 유일한 이상(abnormality)은 fMLP에 대한 반응으로 증가된 과산화물 방출이다. 동일한 연구에서 HLA-B51+ 환자와 건강한 대조군에서도 높은 과산화물 반응이 나타났다.
베체트병-유사 마우스 모델을 4 내지 5주령 수컷 암연구소(ICR: Institute of Cancer Research) 마우스의 Vero 세포에서 성장된 HSV 1형을 접종하여 개발하였다. 간단히 말해서, 실험 마우스의 귓불을 바늘로 긁고 바이러스를 10일 간격으로 두 번 접종하였다. 감염된 마우스를 최종 접종 후 16주 동안 관찰하였다. 적어도 2개의 베체트-유사 증상을 나타내는 HSV-접종 마우스를 BD-유사 마우스 모델로 사용하였다(n=5). 감염되지 않은 ICR 마우스(n = 2) 및 HSV-접종되었지만 무증상인 마우스 둘 모두.
실시예 5.10: 포도막염(UVE)의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물의 치료 효능을 문헌[Fruchon S et al. (Molecules. 2013;18(8):9305-9316. Published 2013 Aug 5. doi:10.3390/molecules18089305)]에 기술된 바와 같이 랫트에서 내독소-유도된 포도막염(EIU: Endotoxin-Induced Uveitis)을 포함하여 자가면역 포도막염의 동물 모델을 사용하여 시험하였다. 이 모델은 인간 전방 포도막염에 대해 임상적으로 관련된 모델로 간주된다. 이는 지질다당류(LPS)의 전신 투여로 구성되며, 이는 혈액-안구 장벽의 파괴 및 염증 세포 침윤과 함께 눈의 전방 및 후방 부분에서 급성 염증 반응을 유발한다. EIU의 임상 징후는 인간 질병에서 관찰된 변화를 반영한다. 따라서, 본 발명의 화합물의 치료 효과는 "황금 표준" 덱사메타손과 비교하여 랫트의 EIU 모델에서 시험하였다.
동물: 눈에 보이는 안구 결함의 징후가 없는 동물만 등록한다. 동물을 사전 시험 기간 동안 검사하며 눈에 특별한 주의를 기울인다. 이들을 실험하기 전에 일주일 동안 관찰을 유지한다. 동물을 표준 케이지에 개별적으로 수용하며 음식과 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있게 한다.
안구 내약성 연구: 연구는 3마리의 수컷 Sprague-Dawley 랫트의 3개 군으로 구성하였다. 0일차에 동물의 무게를 측정하고, 마취하고, 양 눈에 단일 5 μL 유리체내 주사로 투여하였다. 첫 번째 군에 염수 비히클(NaCl 0.9%)을 제공하고, 다른 군에는 상이한 용량의 본 발명의 화합물을 제공하였다. 그런 다음 각 동물을 임상 관찰 및 눈 검사로 평가하였다. 안구 검사에는 안저검사, 맥도날드-샤덕(McDonald-Shadduck) 점수를 매길수 있도록 하는 형광 염료를 사용한 각막의 세극등 검사(SLE: slit-lamp examination)를 포함한다. 맥도날드-샤덕 점수매김 시스템은 결막 매개변수(충혈, 붓기 및 분비물), 혈액-수성 장벽의 붕괴에 대한 추정 증거로서 수성 발적(틴달(Tyndall) 현상의 강도); 홍채에 2차 및 3차 혈관 주입; 혼탁, 이의 상대적 면적, 신생-혈관화 및 각막의 상피 완전성(플루오레세인 표지); 렌즈의 무결성을 다루고 있다. 최종 안구 검사 후, 모든 동물을 희생시켰다. 부검 시 안구를 수집하고, 12시간 동안 수정된 데이비슨(Davidson) 용액에 고정한 다음, 10% 중성 완충 포르말린으로 고정하고 조직학을 위해 처리하였다. 헤마톡실린-에오신으로 염색된 조직 절편을 위원회-인정된(board-certified) 수의 병리학자가 광학 현미경을 통해 평가하였다.
내독소-유도된 포도막염(EIU) 랫트 모델: 36마리의 암컷 알비노 루이스 랫트를 무작위로 각각 6마리씩 6개 군으로 나누었다. EIU를 200 μg의 LPS(살모넬라 티피뮤리움 유래의 지질다당류, Sigma-Aldrich, 프랑스, 생캉탱 소재)를 함유하는 무균 발열성 식염수 용액의 100 μL 발바닥 주사에 의해 유도하였다. 동물을 EIU 유도 직전에 활성 성분이 함유되지 않은 식염수 용액(NaCl 0.9%), 또는 시험된 화합물, 또는 20 μg의 덱사메타손을 양쪽 눈에 5 μL 유리체내 주사하여 처리하였다. 동물을 24시간, 즉 이 모델에서 질병의 임상 피크에 세극등(SLE)에 의해 검사하였다. 임상적 안구 염증의 강도를 각 안구에 대해 0에서 5까지의 척도로 점수를 매겼다. 0등급은 염증이 없음을 나타낸다. 1등급은 최소한의 홍채와 결막 혈관확장이 있지만 전방(AC: anterior chamber)에서 발적이나 세포가 관찰되지 않음을 나타낸다. 2등급은 중간 정도의 홍채와 결막 혈관 확장이 있지만 AC에 뚜렷한 발적이나 세포가 없음을 나타낸다. 3등급은 강렬한 홍채 혈관 확장, 발적 및 AC의 세극등 필드당 10개 미만의 세포가 있음을 나타낸다. 4등급은 3등급보다 더 심각한 임상 징후가 있으며, 전방축농의 형성 여부에 관계없이 AC의 세극등 필드당 10개 이상의 세포가 있음을 나타낸다. 5등급은 강렬한 염증 반응, AC에서 섬유소 형성 및 동공의 완전한 격리의 존재를 나타낸다. 실험이 끝나면, 즉 LPS 도전(challenge) 24시간 후에, 펜토바르비탈(pentobarbital)(30 mg/kg)을 복강 내 주사하여 랫트를 마취시킨 다음 치사량의 펜토바르비탈로 사멸시킨다.
안액의 사이토카인 농도 측정: 희생 후 각 동물의 양안에서 수양액(Aqueous humour) 및 유리체를 채취하였다. 전염증성 T 헬퍼 사이토카인 TNFα, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-17 및 IFNγ 뿐만 아니라 항-염증성 사이토카인 IL-4 및 IL-10 양을 다중 분석으로 결정하였다.
혈청 내 사이토카인 농도 측정: 세 군의 랫트(식염수 비히클, 화합물 10 μg 및 덱사메타손)의 혈청을 실험 종료 시 수집하여 -80℃에 보관하였다. 이를 제조사의 지침에 따라 FACS Calibur 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에서 Cytometric Bead Array(랫트 CBA Flex 세트, BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 새너 제이 소재)로 5개의 사이토카인(IFNγ, TNFα, IL-2, IL-4 및 IL-10) 수준의 동시 측정에 대해 사용하였다. FCAP Array 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 표준 곡선과 관련하여 각 사이토카인의 양을 분석하였다.
실시예 5.11: 당뇨병성 감각운동 다발신경병증(diabetic sensorimotor polyneuropathy) 및 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy)의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물의 치료 효능을 당뇨병성 말초 신경병증(diabetic peripheral neuropathy)의 랫트 모델을 사용하여 시험하였다(문헌[Kambiz S. et al. (PLoS One. 2015;10(6):e0131144]; PLoS One. 2015;10(5):e0126892. Published 2015 May 18. doi:10.1371/journal.pone.0126892]).
동물: WAG/RijHsd 암컷 랫트(n = 27, 10주령, 체중 130 내지 150 g)를 Charles River(프랑스 라브렐 소재)에서 구입하였다. 동물을 12시간 명/암 일정에 따라 실온에서 후드가 있는 케이지에 한 쌍으로 수용하고 물과 음식을 자유롭게 제공하였다.
당뇨병 유도: 이전에 기술된 바와 같이, 0.05 mol/L 소듐 시트레이트 완충액 pH 4.5에서 65 mg/kg 체중의 용량으로 STZ(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)의 단일 복막 내 주사에 의해 21마리의 랫트에서 당뇨병을 유도하였다. 랫트를 A, B 및 C의 3개 군으로 무작위로 할당하였다(각 군에서 n = 7). 당뇨병 유도 후, A군은 4주 후에, B군은 6주 후에, 및 C군은 8주 후에 사멸시켰다. 대조군은 STZ가 없는 동일한 부피의 비히클로 단일 복강 내 주사를 받은 6마리의 랫트로 구성하였다. 대조군 랫트를 8주 동안 추적하였다. 혈당을 글루코미터(OneTouch, LifeScan, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)에 의해 꼬리 정맥 혈액으로부터 측정하였다. 당뇨병 유발 후 4주 전체 기간 동안 랫트에서 혈당 수치가 20 mmol/L 이상일 때 당뇨병으로 진단하였다.
발바닥 뒷발 피부의 혈류 및 산소화: 결합된 레이저 도플러 유량계 및 분광 광도계 시스템(O2C, LEA Medizintechnik, 독일 기센 소재)을 매끈한 뒷발 발바닥의 혈류 및 산소 포화도를 측정하는데 비침습적으로 사용하였다. 당뇨병 및 대조군 랫트 모두에서 4, 6 및 8주에 산소 포화도 퍼센트 및 피부 혈류량을 평가하였다.
추위 노출 후 재가온 속도: 1 Hz 데이터 수집 시스템(ThermaCAM Researcher 2001 HS; FLIR Systems, 벨기에 베르챔 소재)에 의해 내장된 적외선 디지털 비디오 카메라(320 × 240 픽셀)를 사용하여 피부 온도를 평가하였으며, 모든 데이터는 노트북에 의해 지속적으로 수집하였다. 카메라와 뒷발 사이의 거리는 13 cm ± 2 cm이었다. 온도 기록의 픽셀 크기는 0.8 × 0.8 mm였다. 동물을 14℃ 플레이트에 5초 동안 놓은 후 동물을 고정시키면서 전체 뒷발 발바닥의 피부 온도를 기록하였다. ThermaCAM Researcher Pro(버전 2001-HS; FLIR Systems, 미국 오레곤주 윌슨빌 소재)를 사용하여 뒷발 발바닥의 최소 온도를 텍스트 파일로 내보냈다. 관심 영역을 뒷발 발바닥 전체를 둘러싸는 선을 그려 선택하였다. 평균 재가온 속도는 120초 당 피부 온도의 증가로 나타냈다.
열 감도: 열 과민증의 발생을 확인하기 위해, 앞서 설명한 대로 냉판 및 열판 시험을 수행하였다. 간단히 말해서, 랫트를 표면 온도가 5℃(냉판) 또는 50℃(열판)인 깨끗한 벽이 있는 개방형 챔버에 배치하였다. 이러한 실험을 간섭을 방지하기 위해 별도의 날에 수행하였다. 뒷발 움츠림 또는 핥기까지의 시간을 관찰하였다.
폰 프레이(Von Frey) 시험: 통각(nociception)에 대한 기계적 민감도 임계값을 결정하는 데 사용되는 폰 프레이(von Frey) 시험에서, 각 랫트를 메시 금속 바닥이 있는 챔버에 배치하였다. 그런 다음, 2 내지 300 g 범위의 폰 프레이 헤어를 5회 적용하고, 이전에 설명된 대로 최소 3번의 발 튕김(동물의 반사 움츠림 반응)이 관찰될 때 양의 점수를 매겼다. 대조군을 참조군으로 사용하였다.
근전도(EMGL: Electromyography): 근육에서 운동 축삭의 신경 분포(innervation)를 당뇨병군 및 대조군 동물에서 유발된 CMAP 피크-피크 진폭 및 비복근 근육의 대기 시간을 기록함으로써 평가하였다. CMAP 피크-피크 진폭 및 대기 시간을 20개 응답 배치에 대해 기록하고 평균을 내었다. 각 당뇨병군의 평균 진폭을 대조군과 비교하였다. MNCV는 자극 전극에서 기록 전극까지의 거리(mm)/대기 시간(ms)으로 계산하였다.
조직 준비: 4주, 6주 또는 8주 후, 동물을 펜토바르비탈 과다 투여(100mg/kg ip)로 사멸시켰다. 각 랫트에 대해, 뒷발의 발바닥 피부를 절개하고 4℃에서 24시간 동안 2% 파라포름알데히드-리신-페리오데이트(PLP)에 직접 침지 고정시켰다. 피부를 이전에 설명한 대로 젤라틴에 추가 처리하고 포매하였다. 마지막으로, 포매한 피부를 동결 마이크로톰으로 40 μm로 절단하고 -20℃에서 장기 보관을 위해 글리세롤에 수집하였다.
랫트의 췌장 조직을 수확하여, 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하고, 파라핀에 포매하였다. 그 후, 이 표본은 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다. 각 표본을 명시야(bright-field) 현미경으로 평가하고 디지털 슬라이드(Nanozoomer 2.0 시리즈, 일본 하마마츠 소재)로 스캔하였다.
면역조직화학: 피부에 분포하는 감각 신경 섬유의 밀도를 반정량화하고, CD-31 양성 내피 세포의 존재를 평가하기 위해 피부 절편의 면역조직화학을 이전에 설명한 대로 수행하였다. 피부 절편을 희석된 1차 항체 Protein Gene Product 9.5(PGP9.5, 1/10.000, 항-토끼, Enzo Life Sciences, 미국 뉴욕 소재), 또는 항-CD31+(1/5000, 항-토끼, Spring Bioscience, 미국 캘리포니아 소재)를 함유하는 2% BSA 칵테일에서 4℃에서 48시간 동안 인큐베이션 하였다. 이어서, 피부 절편을 90분 동안 실온에서 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)(1/200, 비오틴, Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로 표지된 적절한 2차 비오틴화 항체와 함께 인큐베이션 하였다. 이어서 3,-3' 디아미노벤지딘(DAB) 반응을 사용하여 1차 항체의 항원 결합 부위를 확인하였다. 그 후, 절편을 슬라이드에 장착하고 CD31+ 염색 절편을 0.05% 티오닌으로 4분 동안 염색하여, 각질세포를 파란색으로 착색하였다. 마지막으로, 모든 피부 섹션을 절대 에탄올(< 0.01% 메탄올)을 사용하여 탈수하고, 자일렌으로 옮기고, 퍼마운트(Fisher Scientific, 뉴햄프셔주 햄튼 소재)로 덮었다.
각 피부 섹션을 Nanozoomer 2.0 시리즈(Nanozoomer 2.0 시리즈, 일본 하마마츠 소재)에 의해 각각 8 μm의 3개 레이어로 스캔하였다. ImageScope 소프트웨어(Aperio ImageScope v11.1.2.760)에서 40× 대물렌즈를 사용하여 뒷발 발바닥의 중앙 부분(80.000 μm2)의 표피 신경 섬유에 대해 뒷발 발바닥의 4개의 근위 및 4개의 원위 피부 절편을 정량화하였다. mm2당 평균 표지된 신경 섬유 및 평균 표피 두께를 각 랫트에 대해 계산하였다. CD31-양성 세포의 퍼센트를 뒷발 발바닥의 전체 상부 진피에 걸쳐 4개의 근위 및 4개의 원위 피부 절편에서 Leica Cell-D(Olympus, 생명 과학 현미경을 위한 영상화 소프트웨어, 미국 소재)에 의해 계산하였다.
실시예 5.12: 장 섬유증의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물의 치료 효능을 문헌[Pham BT et al. (Physiol Rep. 2015;3(4):e12323. doi:10.14814/phy2.12323)]에 기술된 바와 같이 랫트 또는 뮤린 모델을 사용하여 시험하였다.
랫트 및 마우스 내장 코어의 제조: 성체 비절식 수컷 Wistar 랫트 및 C57BL/6 마우스(Harlan PBC, 네덜란드 제이스트 소재)를 사용하였다. 랫트와 마우스를 음식(Harlan chow no 2018, 네덜란드 호르스트 소재)과 물이 자유롭게 공급되는 온도 및 습도-조절실에서 12시간 명/암 주기로 수용하였다. 동물을 실험을 시작하기 전 적어도 7일 동안 적응할 수 있도록 하였다.
랫트와 마우스를 이소플루란/O2(Nicholas Piramal, 영국 런던 소재)로 마취하였다. 랫트 공장(jejunum)(위에서 약 25 cm 떨어진 곳, 길이 15cm) 및 마우스 공장(위에서 약 15 cm 떨어진 곳, 길이 10 cm)을 절제하고 25 mm d-글루코스(Merck, 독일 다름슈타트 소재), 25 mm NaHCO3(Merck), 10 mm HEPES(MP Biomedicals, 오하이오주 오로라 소재)로 보충된 빙냉 Krebs-Henseleit 완충액(KHB) 중에 보존시키고, 카보겐(carbogen)(95% O2/5% CO2)으로 포화시키고 pH 7.4로 조정하였다. 공장을 내강을 통해 KHB를 플러싱하여 세척한 다음 2 cm 분절로 나누었다. 이 분절을 37℃에서 0.9% NaCl의 3%(w/v) 아가로스 용액으로 채우고 아가로스 코어-포매 장치에 포매하였다.
인간 장 코어의 준비: 연구를 위해 췌장 십이지장절제술을 받은 환자로부터 절제된 장에서 건강한 인간 공장 조직을 수득하였다.
건강한 공장을 포매 절차까지 빙 냉 KHB에 보존하였다. 점막하층, 근육층, 및 장막을 조직 수집 후 1시간 이내에 점막에서 조심스럽게 제거하였다. 점막을 0.4 cm × 1 cm 시트로 나누었다. 이 시트를 37℃에서 0.9% NaCl의 3% 아가로스(w/v) 용액에서 포매하고 포매 장치에 삽입하였다.
PCIS의 준비: PCIS를 Krumdieck 조직 슬라이서(Alabama Research and Development)에 의해 빙냉 KHB에서 준비하였다. 3 내지 4 mg의 습윤 중량을 가진 슬라이스의 예상 두께는 300 내지 400 μm였다. 슬라이스를 실험이 시작될 때까지 빙냉 KHB에 보관하였다.
장 슬라이스 인큐베이션: 슬라이스를 인간 PCIS(hPCIS) 및 랫트 PCIS(rPCIS)용 12-웰 플레이트 또는 마우스 PCIS(mPCIS)용 24-웰 플레이트에서 인큐베이션하였다. hPCIS 및 rPCIS를 25 mm 글루코스, 50 μg/mL 겐타마이신(Invitrogen), 및 2.5 μg/mL 암포테리신-B(Invitrogen)가 보충된 L-글루타민(Invitrogen, 영국 페이즐리 소재)이 포함된 0.5 mL의 윌리엄스 배지(Williams Medium) E에서 1.3mL 및 mPCIS에서 개별적으로 인큐베이션하였다. 인큐베이터(MCO-18M, Sanyo)에서 인큐베이션(37℃ 및 80% O2/5% CO2)하는 동안 플레이트를 90 rpm(진폭 2 cm)에서 수평으로 진탕하였다. 1 내지 10 ng/mL의 농도 범위의 인간 TGF-β1(Roche Diagnostics, 독일 만하임 소재)을 포함 및 포함하지 않고, rPCIS는 최대 24시간, mPCIS 및 hPCIS는 최대 72시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 인큐베이션을 다양하게 수행하였으며(별도의 웰에서 개별적으로 인큐베이션된 3 내지 6개의 슬라이스 사용) 3 내지 16개의 상이한 인간, 랫트 또는 마우스의 장으로 반복하였다.
생존력 및 형태: PCIS의 아데노신 트리포스페이트(ATP) 함량을 측정하여 생존력을 평가하였다. 간단히 말해서, 인큐베이션 후, 슬라이스를 1 mL 초음파처리 용액(70% 에탄올 및 2 mm EDTA 포함)으로 옮기고, 액체 질소에서 급속-동결하고 -80℃에서 보관하였다. 생존력을 결정하기 위해, ATP 생물발광 키트(Roche Diagnostics, 독일 만하임 소재)를 사용하여 45초 동안 초음파 처리한 샘플의 상등액에서 ATP 수준을 측정하고 4℃에서 16.000 × g에서 2분 동안 원심분리하였다. ATP 값(pmol)을 Lowry 방법(BIO-rad RC DC Protein Assay, Bio Rad, 네덜란드 페이넨달 소재)에 의해 추정된 PCIS의 총 단백질 함량(μg)으로 정규화하였다.
형태를 평가하기 위해, 인큐베이션한 슬라이스를 4% 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매하였다. 4 μm의 절편을 절단하고 헤마톡실린 및 에오신(HE)으로 염색하였다. HE 절편을 허혈 및 재관류 후 장의 조직 손상 발생 순서를 설명하는 수정된 Park 점수에 따라 점수를 매겼다. PCIS의 7개 분절의 무결성을 0에서 3까지의 척도로 점수를 매겼다. 상피, 기질, 선와 및 근육층의 생존력은 괴사가 없는 경우 0, 대규모 괴사가 있는 경우 3으로 별도로 점수를 매겼다. 장 슬라이스의 다른 부분을 다음과 같이 평가하였다: 상피의 모양: 0 = 입방 상피, 3 = 세포의 2/3 초과가 편평하고, 융모가 평평함: 0 = 정상, 3 = 2/3 초과의 융모가 편평하고, 부종의 양: 0 = 부종 없음, 3 = 심한 부종. 최대 점수 21은 심각한 손상을 나타낸다. 인간 샘플에서, 점막근층의 형태학적 점수는 "근육층" 절편에서 결정하였다. B.T.P., W.T.v.H. 및 J.N.는 맹검 점수매김을 수행하였음; 3개의 총점의 평균을 계산하였다.
유전자 발현: 섬유증 유전자, 즉 COL1A1, αSMA, HSP47, CTGF, FN2, TGF-β1, PAI-1 및 SYN의 발현을 Taqman 또는 SYBRgreen 방법에 의해 결정하였다. hPCIS에서, ELA 유전자 발현을 또한 SYBRgreen 방법으로 측정하였다.
장 섬유증은 염증성 장 질환(IBD: inflammatory bowel disease) 환자에서 심각하지만 흔한 결과이다. IBD의 특징적인 만성 장 염증을 조절하기 위한 새로운 치료법 개발의 발전에도 불구하고, 현재까지 효과적인 항-섬유증 치료법은 존재하지 않는다. 따라서, 장 섬유증의 기본 분자 메커니즘에 대한 더 깊은 이해와 관련 동물 모델의 이용가능성은 이러한 조사 영역을 앞으로 더 나아가게 하는 데 중요하다.
IL-17 및 관련 매개체: Th17 세포는 주로 IL-17A뿐만 아니라 IL-17F, IL-21 및 IL-22를 생산하는 T 헬퍼 세포의 하위 집합을 정의하며, IBD(7)를 포함하여, 여러 만성 염증성 장애에서 점점 더 중요하게 인식되고 있다. IL-17A는 폐(8), 간(9), 및 심장(10)을 포함하여 여러 장기의 섬유증과 관련이 있다; 최근 연구는 또한 장 섬유증의 발병기전에서 IL-17/Th17 면역 반응 및 기타 관련 매개체를 연결하여 장에서의 역할을 뒷받침한다.
장 섬유증의 다른 동물 모델이 아래에 설명되어 있다:
부류 모델 투여 방식/결과
화학적 유도 DSS 식수에 투여하여, 결장 점막의 상피 손상 및 투과성을 유발하여 후속 급성 염증을 유발함; DSS의 순환은 만성 염증과 후속적인 섬유증을 유발함
TNBS TNBS/에탄올의 대장 관장제 투여는 상피 장벽을 손상시키고 T 세포-의존적 경벽 염증을 유발함; 장기 투여는 결장 섬유증을 초래함
미생물 PG-PS 맹장 또는 소장 벽에 직접 주입하면 심각한 섬유증을 동반한 육아종성 장염을 유발함
분변 주입 대변 현탁액을 결장 벽에 직접 주입하면 공격적인 대장염과 경벽 섬유증을 유발함
만성 살모넬라 감염 스트렙토마이신 전처리 후 경구 투여는 결장 점막 및 상당한 섬유증을 동반한 경벽 염증을 유발함
AIEC 감염 스트렙토마이신 전처리 후 AIEC, NRG857의 인간 CD 단리물의 위관영양은 회장-결장 염증과 Th1- 및 Th17-매개 및 섬유증을 유발함
유전적으로 조작된 마우스 TGFβ1-Tg TβRIIΔk-fib-Tg 결장에 TGFβ를 과발현하는 이러한 아데노바이러스 벡터의 관장 투여는 급성 및 만성 염증, ECM 침착 및 근육층의 비후를 유발함
MCP-1-Tg 직장에서 MCP-1을 운반하는 아데노바이러스 벡터의 교내 주입은 경벽 염증, 콜라겐 침착 및 섬유증을 유발함
IL-10 결핍 IL-10의 유전적 결실은 결장의 벽을 통한 염증성 병변, 음와 농양(crypt abscesses), 장 벽의 비후를 초래함; 회장-맹장 절제 후 소장에서 수술 후 섬유증 발병에 대한 증가된 감수성의 증거임
면역-매개 T 세포 전달 공여자 CD4+/CD45RBhigh T 세포를 면역결핍 수용자 마우스에 전달하면 소모성 질환, 대장염 및 가벼운 섬유증을 초래함
자발적 SAMP1/YitFc 마우스 계통 자발적인 말단 회장염 및 후속 섬유증 발생
실시예 5.13: 난소 섬유증의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물의 치료 효능을 실험 설정의 난소 과자극 증후군(OHSS: ovarian hyperstimulation syndrome)에서 난소 조직 병리학, 혈청 VEGF, 및 엔도텔린 1 수준에 대한 테스트 화합물의 영향을 조사하기 위해 문헌[Pala S et al. (Drug Des Devel Ther. 2015;9:1761-1766. Published 2015 Mar 24. doi:10.2147/DDDT.S75266)]에 기술된 바와 같이 난소 과자극 증후군(OHSS) 뮤린 모델을 사용하여 시험하였다.
동물: 22일령의 암컷 Wistar 알비노 랫트를 사용하여 무작위로 군으로 나누었다. 난포-자극 호르몬 10 IU를 연속 4일 동안 15마리의 랫트에 피하 투여하고, 5일째에 인간 융모 생식샘자극호르몬(human chorionic gonadotropin) 30 IU로 OHSS를 유도하였다. 군 1은 35일령 대조군 랫트를 포함하고, 군 2는 35일령 OHSS 랫트를 포함하고, 군 3은 7일 동안 시험된 화합물을 투여받은 27일령 OHSS 랫트를 포함한다. 그런 다음 모든 랫트를 35일차에 참수하였다. 모든 랫트에서 혈청 VEGF, 엔도텔린 1, 및 난포 예비력(reserve)을 평가하였다.
헤마토크릿 및 체중 측정을 13일차에 수행하였고 35일차에 케타민(75 mg/kg) 및 자일라진(10 mg/kg)의 복강 내 투여에 의해 전신 마취 하에 참수를 수행하였다.
효소-결합 면역흡착 분석법: 참수한 각 랫트로부터 약 3 mL의 혈액 샘플을 수득하였다. 혈청을 4분 동안 2,500 rpm에서 혈액 샘플의 원심분리에 의해 분리하고 VEGF 및 엔도텔린 1 분석할 때까지 -20℃에서 유지하였다. VEGF를 마우스 VEGF 효소- 결합 면역흡착 분석 키트(ELM-VEGF-001; RayBio, 미국 소재)를 사용하여 분석하고 엔도텔린을 엔도텔린 1 E/키트(EK-023-01; Phoenix Pharmaceuticals, 미국 소재)를 사용하여 측정하였다.
난소 형태: 개복술 후, 난소를 제거하고 배양 배지에서 부착 조직을 세척하고 무게를 쟀다. 난소 조직을 10% 포름알데히드로 고정한 다음, 파라핀-포매된 조직 샘플을 평균 난포 수를 추정하기 위해 4 μm 단면으로 절단하였다. 절편을 광학 현미경(Olympus BX-50)에서 OFR을 결정하기 위해 Masson의 삼색소로 염색하였다. 4 μm 두께의 단면을 이전에 설명한 방법에 따라 동일한 구조가 두 번 계산되는 것을 방지하기 위해 현미경 슬라이드에 50 μm 간격으로 장착하였다. 12개의 난포를 원시, 1차, 2차 및 3차로 분류하였다. 폐쇄성 난포(AF: atretic follicle)는 10개 이상의 농축성 핵(pyknotic nuclei)을 나타내는 난포로 정의된다; 가장 작은 난포의 경우, 폐쇄증의 기준은 퇴행성 난모세포, 조숙한 난포강(antrum) 형성, 또는 둘 모두이다.
주요 결과 측정: 주요 결과 측정은 연령(일), 체중(g), 적혈구 용적률(hematocrit)(%), 난소 무게(mg), VEGF(pg/mL) 및 엔도텔린 1(ng/mL)의 혈청 수준, 및 원시, 1차, 2차 및 3차 난포 수를 결정하는 총 난포 수이다.
실시예 5.14: 다낭성 난소 증후군(PCOS: polycystic ovary syndrome)의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물의 치료 효능을 문헌[Wang D et al. (J Ovarian Res. 2018;11(1):6. Published 2018 Jan 10. doi:10.1186/s13048-017-0375-7)]에 기술된 바와 같이 DHEA-유도된 난소 과섬유증 동물 모델을 사용하여 시험하였다.
다낭성 난소 증후군(PCOS)은 병리학적 기전이 불분명한 대사 및 내분비 장애이다. 다음 연구는 디히드로에피안드로스테론(DHEA: Dehydroepiandrosterone)-유도된 다낭성 난소 증후군(PCOS) 랫트 모델에서 변형 성장 인자-β(TGF-β) 신호 전달 경로를 통해 형성되는 난소 과섬유증을 조사한다.
동물: 무게 약 50 g의 21일령의 30마리 암컷 Sprague-Dawley(SD) 랫트를 이 이 분석에서 사용하였다. 동물을 22±1℃의 온도, 50±1%의 상대 습도, 12/12시간의 명/암 주기를 갖는 특이적-병원체 무함유(SPF: specific-pathogen-free) 환경에 수용하였다. 음식과 물을 자유롭게 제공하였다.
방법: 30마리의 암컷 Sprague-Dawley 랫트를 블랭크군(n=6), 오일군(n=6), 및 오일 + DHEA-유도 모델군(n=6+12)으로 무작위로 나누었다. 모델군은 연속 35일 동안 DHEA의 피하 주사에 의해 확립하였다. 랫트를 추가로 비히클군(n=6)과 처리군(n=6)으로 나누었다. 치료제는 하루에 한 번 제공하였으며 치료는 35일 동안 지속하였다. 치료 18일 후, 일일 발정 주기를 결정하기 위해 14일 동안 세포 유형을 판단하여 모든 랫트로부터 질 도말(vaginal smear)을 매일 수집하였다. 36일차에, 블랭크 및 오일-처리군의 모든 랫트 및 DHEA-유도된 모델군의 6마리 랫트를 안락사시키고(과량의 5% 클로랄 히드레이트의 복강 내 주사 사용), 혈액을 수집하고(상대정맥으로부터), 양측 난소 및 자궁을 해부하였다.
난소를 4℃에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정한 다음 파라핀에 포매하였다. 나머지 조직은 추가 웨스턴 블롯팅 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 분석을 위해 -80℃에서 동결하였다.
DHEA-유도 모델군의 나머지 12마리 랫트를 추가 2개 그룹으로 무작위 배정하였다: 처리군 및 비히클 처리군(대조군), 군당 6마리. 이러한 처리 동안, DHEA는 더 이상 쥐에게 투여되지 않았다. 처리를 2주 동안 지속하였으며, 그 후 모든 동물을 안락사시키고, 혈액을 수집하고, 위에서 언급한 지침에 따라 양측 난소 및 자궁을 해부하였다.
H&E 염색, 면역조직화학 및 시리우스 레드 염색을 사용하여 난소의 형태, 섬유소 및 콜라겐 국소화 및 난소의 발현을 검출하였다. 난소 단백질 및 RNA를 웨스턴 블롯 및 RT-PCR을 사용하여 조사하였다.
발정 주기: DHEA 처리 후 18일차에, 모든 랫트에서 질 도말을 수집하였다. 그런 다음 샘플을 30분 동안 톨루이딘 블루로 처리하고, 결과적으로 세포 형태 및 발정 주기를 광학 현미경(Leica Microsystems, 독일 소재)으로 조사하였다.
혈청 호르몬 수치: 혈액 샘플을 상대 정맥에서 수집하였다. 혈청은 즉시 분리하여 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)(테스토스테론(T), 에스트라디올(E2), 황체형성 호르몬(LH), 난포 자극 호르몬(FSH))(랫트 T, E2, LH 및 FSH ELISA 키트, USCN, 중국 우한 소재)에 의한 추가 호르몬 측정을 위해 -20℃에 보관하였다.
실시예 5.15: 원발성 담즙성 담관염(PBC)의 치료 및/또는 예방
본 발명의 화합물의 치료 효능을 문헌[Hohenester S et al. (Cells. 2020, 9(2), 281. doi: 10.3390/cells9020281)]에 기술된 바와 같이 PBC 뮤린 모델을 사용하여 평가하였다.
원발성 담즙성 담관염(PBC) 또는 원발성 경화성 담관염(PSC)과 같은 담즙울체성 간 질환은 만성 진행성 장애로 간경변증을 유발하고 후속 합병증을 유발하는 경우가 많다. 소수성 담즙 염(salt)은 담즙정체에서 간 섬유증을 촉진하는 것으로 간주된다. 그러나, 이러한 널리 받아들여진 가설에 대한 증거는 여전히 부족하다.
예를 들어, Mdr2 녹아웃에 의한 담즙정체의 확립된 동물 모델에서, 담즙정체 및 섬유증은 모두 담즙 손상에 2차적이다.
따라서, 담즙정체성 질환에서 간 섬유증에 대한 담즙 염 축적의 특정 기여도를 시험하기 위해, 콜레이트-섭취 Atp8b1G308V/G308V 마우스에서 유도성 간세포 담즙정체의 고유한 모델을 사용하였다. 글리코케노디옥시콜레이트(GCDCA: Glycochenodeoxycholate)는 HPLC에 의해 확인된 바와 같이 뮤린의 담즙염 풀을 인간화하기 위해 보충하였다. 담즙정체 및 간 섬유증의 바이오마커를 정량화하였다. 야생형 마우스에서 단리한 간 성상 세포(HSC: Hepatic stellate cell)를 담즙염으로 자극하였다. HSC의 증식, 세포 축적, 및 콜라겐 침착을 결정하였다. 담즙정체성 Atp8b1G308V/G308V 마우스에서, αSMA 및 콜라겐1a mRNA의 증가된 간 발현 및 과도한 간 콜라겐 침착은 GCDCA 보충 시에만 간 섬유증의 발달을 나타낸다. 시험관 내에서, 근섬유아세포의 수와 콜라겐 침착은 친수성이 아닌 소수성 담즙염과 함께 인큐베이션한 후 증가하였고 EGFR 및 MEK1/2 활성화와 관련이 있었다. 담즙염은 EGFR 및 MEK1/2 신호전달과 관련된 것으로 추정되는, HSC에 직접적인 전-섬유성 효과를 가질 수 있다.
동물 실험: 수컷 동물을 8주령의 생체 내 연구에 사용하였다. 동물을 12시간의 명-암 주기로 유지하였으며 식이와 물에 자유롭게 접근할 수 있는 풍부한 환경에 수용하였다.
혈청 생화학 및 혈청 담즙염 측정 알칼리성 포스파타제, 빌리루빈, 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제의 혈청 수준은 respons® 910 전자동 분석기(DiaSys, 독일 홀츠하임 소재)에서 신선한 혈청으로부터 정량화하였다. 총 혈청 담즙염 수준을 제조업체의 지침에 따라 Diazyme 총 담즙염 키트(Diazyme Laboratories, 미국 캘리포니아주 포웨이 소재)를 사용하여 효소적으로 정량화하였다.
간 조직학, 면역조직화학 및 히드록시프롤린 정량화 파라핀 블록을 4 μm 두께의 슬라이스로 자르고 현미경 슬라이드(Superfrost plus, Thermo Scientific/Menzel, 독일 브라운슈바이크 소재)에 장착하였다. 단계적 탈파라핀화 및 재수화 후, 슬라이드를 표준 절차에 따라 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 면역조직화학을 단일클론 토끼 항-알파 평활근 액틴 항체(Abcam, 영국 캠브리지 소재)를 사용하여 알파-SMA에 대해 수행하였다. 콜라겐 정량화를 위해, 슬라이드를 Direct Red 80(Sirius Red, Sigma-Aldrich, 독일 드름슈타트 소재)으로 1시간 동안 염색하고 에탄올에서 두 번, 자일롤에서 한 번 탈색하였다. 세포 수 대리로서 총 DNA를 정량화하기 위해, HSC를 PicoGreen®(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)과 함께 인큐베이션하고 형광 신호를 CytoFluor 4000 시스템(PerSeptive Biosystems, 미국 메사추세츠주 프라밍햄 소재)으로 검출하였다. HSC의 증식을 제조업체의 지침에 따라 BrdU-분석 키트(Roche, 독일 펜츠버그 소재)를 사용하여 정량화하였다. 총 세포 수를 정량화하기 위해, Lab-Tek II 챔버 슬라이드(Nunc, Rochester, 미국 뉴욕 소재)에 씨딩한 HSC를 DAPI(Vector, 미국 캘리포니아주 벌링게임 소재)를 포함하는 Vectashield 장착 배치와 함께 커버 슬라이드에 장착하였다. 슬라이드를 Pannoramic Midi Slide Scanner(3DHistech, 헝가리 부다패스트 소재)로 스캔하고 전체 슬라이드(0.7 cm2)에서 ImageJ2 소프트웨어로 핵 계수를 수행하였다.
시험관 내 콜라겐 정량화 세포를 PBS로 세척하고 포화 피크르산 중 0.1% 시리우스 레드로 1시간 동안 염색하였다. 그런 다음 세포를 100% 에탄올로 3회 세척하고, 결합된 염료를 50% 메탄올/소듐 히드록시드(50 mmol/L)에 용해시키고, 540 nm에서 흡수를 측정하였다.
실시예 5.16: 간 섬유증 또는 간경변(HF)의 치료 및/또는 예방
자발적인 만성 간 염증 및 섬유증을 억제하기 위한 본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Fransen Pettersson et al. (PLoS One. 2018; 13(9): e0203228. doi: 10.1371/journal.pone.0203228)]에 기술된 바와 같이 확립된 NOD-염증 섬유증(N-IF: NOD-Inflammation Fibrosis) 뮤린 모델을 사용하여 평가하였다.
동물: N-IF 마우스는 면역결핍 NOD.Rag2-/- 마우스에서 생성된 T-세포 수용체(TCR: T-cell receptor) 형질전환 자연 살해 T(NKT: natural killer T)-II 세포에 의해 유발되는 만성 염증 및 간 섬유증을 자발적으로 발생시켰다. N-IF 마우스에서 간 병리의 여러 구성 요소는 진행성 만성 염증이 섬유증의 발병에 선행하는 인간 상태의 구성 요소와 중첩된다. 또한, N-IF 마우스 간에서 발생하는 섬유증은 간 성상 세포를 발현하는 α-SMA의 축적과 관련이 있는 것으로 입증되었다. 이러한 표현형 유사성은 N-IF 마우스 모델을 간 섬유증에 대해 이용 가능한 다른 설치류 모델과 비교하여 독특하게 만들고 항-섬유성 약물 후보의 효능을 시험하는 새로운 도구를 제공한다.
동물이 건강에 좋지 않은 징후가 있는지 매일 관찰하고, 소변을 수집하고, 소변에서 단백질을 측정하였다. 간 및 신장 무게를 해부 시 기록하였다. 각 동물에서 간과 신장을 해부하여 고정하고, 절단하고, 시리우스 레드 및 H&E로 염색하였다. 각 간의 조각을 히드록시프롤린 측정에 사용하였다.
히드록시프롤린 측정: 간 및 비장의 히드록시프롤린 함량을 히드록시프롤린 비색 분석 키트(BioVision, 미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)를 사용하여 결정하였다.
조직학: 처리 후, 마우스를 마취시키고 심장 내 천자를 통해 PBS로 관류시켰다. 간과 비장의 무게를 측정하고, 장기 생검을 4% 중성-완충된 포르말린에 고정하고, 파라핀에 포매하고 절단하였다.
실시예 5.17: 비-알코올성 지방간염(NASH: non-alcoholic steatohepatitis)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Barbara Ulmasov B. et al. (Hepatology Communications, 2018, 3(2) - https://doi.org/10.1002/hep4.1298 )]에 기술된 바와 같이 NASH 뮤린 모델을 사용하여 평가하였다.
마우스: C57BL/6J 5주령 수컷 마우스를 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하며 온도, 습도 및 12시간/12시간 명/암 주기의 제어된 조건 하에서 표준 시설에 수용하였다.
NASH의 콜린 결핍, L-아미노산 한정, 고지방 마우스 모델: 콜린 결핍, 아미노산 한정, 고지방 식이(CDAHFD)22를 Research Diets(A06071309; 뉴저지주 뷰브런즈윅 소재)에서 수득하였다. 이러한 식이는 0.1% 메티오닌 및 45% Kcal% 지방(20% 라드(lard), 25% 대두유)를 포함하는 고지방 콜린 결핍 식이로서 제형화되어 있다. 대조군 식이는 지방에서 칼로리의 13.6%를 함유하는 표준 설치류 음식이다. 6주령부터 시작하여, 30마리의 마우스를 CDAHFD에 배치하고 30마리의 마우스를 표준 식이에 배치하였다. 6주가 끝나면, 각 식이군에서 10마리의 마우스를 5시간 동안 금식시키고 사멸시켰다. 혈액 및 간 샘플을 수집하였다. 간을 10% 인산염 완충 포르말린에 고정하거나, 액체 질소에 동결하거나, 향후 평가를 위해 RNA 안정화 용액에 배치하는 절편으로 나누었다. 나머지 마우스는 총 10주 동안 추가로 4주 동안 식이를 유지한 다음 금식시키고, 사멸시키고, 샘플을 수집하였다.
생화학적 분석: 간 트리글리세리드 함량을 제조사의 지침에 따라 트리글리세리드 비색 분석 키트(Cayman Chemicals, 미시건주 앤 아버 소재)를 사용하여 측정하였다. 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST: alanine aminotransferase), 글루코스, 인슐린, 트리글리세리드, 및 콜레스테롤의 혈장 수준을 Advanced Veterinary Laboratory(미주리주 세인트 루이스 소재)에 의해 상업적으로 측정하였다.
RT-PCR: 실시간 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 mRNA 풍부도의 변화를 계산하였다.
조직병리학: 포르말린으로 고정한 간 절편을 파라핀에 포매하고, 5 μm로 절편화하고, 현미경 평가를 위한 표준 프로토콜을 사용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 간 콜라겐 함량을 평가하기 위해, 파라핀-포매된 간 절편을 시리우스 레드/패스트 그린 염료로 염색하였다. 시리우스 레드는 모든 유형의 콜라겐에 결합하는 반면, 패스트 그린은 비콜라겐 단백질을 염색한다.
간 절편을 전처리하여 파라핀을 제거하고, Weigert 철 헤마톡실린 용액을 사용하여 핵을 염색하였다. 세척 후, 조직을 포화 피크르산에서 0.1% 시리우스 레드(Direct Red 80; Sigma, 미주리주 세인트 루이스 소재), 0.1% 패스트 그린 FCF 인증(Sigma)으로 2시간 동안 염색하였다. 그런 다음 슬라이드를 물로 세척하고, 에탄올과 자일렌으로 탈수한 다음 마지막으로 Permaslip(Alban Scientific, Inc., 미주리주 세인트 루이스 소재)에 장착하였다. 콜라겐 축적 정도를 형태학적 분석에 의해 평가하였다.
간 히드록시프롤린 함량 측정: 히드록시프롤린 함량을 간에 존재하는 총 콜라겐 양의 척도로 측정하였다. 간 조직을 증류수에 균질화하고, 트리클로로아세트산으로 침전시키고, 105℃에서 12 N HCl에서 48시간 동안 가수분해하였다. 샘플을 증발시키고, 건조 펠릿을 증류수에 재구성하였다. 재구성된 샘플을 13,000 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상등액을 12N HCl로 희석하여 최종 샘플에서 4 N HCl 농도를 달성하였다. 간 히드록시프롤린 함량을 민감 조직 히드록시프롤린 분석을 사용하여 결정하였다.
면역조직화학: 포르말린으로 고정한 간 조직을 표준 방법으로 파라핀을 제거하기 위해 전처리하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 실온에서 1시간 동안 메탄올 중 3.3% 과산화수소에서 인큐베이션하여 차단하였다.
간 조직에서 세포자멸 세포 검출: 간 조직에서 세포자멸 세포를 ApopTag Peroxidase Detection 키트(Millipore, 캘리포니아주 테메큘라 소재)를 사용하여 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개 디옥시우리딘 트리포스페이트 닉-말단 표지 방법(TUNEL: terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling method)에 의해 DNA 가닥 파괴를 표지하고 검출하여 확인하였다. 간세포 형태가 있는 염색된 세포자멸 세포를 계수하였다. HSC 형태의 세포자멸 세포를 검출하기 위해, TUNEL로 염색된 간 조직을 ImmPACT VIP Peroxidase Substrate 키트(Vector Laboratories)로 2차 항체 퍼옥시다제 활성이 검출된다는 점을 제외하고는 데스민(desmin)(HSC의 표지자)에 대한 항체로 후속적으로 염색하였다.
웨스턴 블롯: 웨스턴 블롯을 다음의 1차 항체를 사용하여 설명된 대로 수행하였다: 디카펜타플레직(decapentaplegic) 상동체 3(p-SMAD3)에 대한 항-인산화된 모체, ab52903, 1:1,000(Abcam); 항-글리세르알데히드 3-포스페이트 디히드로게나제(항-GAPDH), sc-25778(Santa Cruz Biotechnology, Inc., 텍사스주 달라스 소재).
실시예 5.18: 당뇨병성 신증 또는 당뇨병성 신장 질환(DN 또는 DKD)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 I형 당뇨병 마우스 모델(STZ-유도된 당뇨병)을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
동물 모델: 수컷 10주령 129/SV 마우스(Charles River, 독일 소재)를 개별적으로 환기되는 케이지에 수용하고, 수돗물에 자유롭게 접근할 수 있게 하며 표준 식이를 제공하였다. 체중-일치된 129/SV 마우스에 고혈당증(글루코스 > 15 mmol/l) 유도를 위해 1일차 및 4일차에 50 mM 소듐 시트레이트 (pH 4.5) 또는 소듐 시트레이트 완충액(비당뇨병 대조군)에서 125 mg/kg 체중 STZ(Sigma-Aldrich)를 복강 내로 투여하였다. 마우스에 연구 동안 인슐린을 투여하지 않았다.
당뇨병 마우스에 12주 동안 위약(식염수) 또는 시험된 화합물을 투여하였다. 체중과 글루코스 수치를 매주 측정하였다. HbA1c(Olympus AU400)와 신장 기능(혈청 크레아티닌)을 6주와 12주에 측정하였다. 알부민뇨를 마우스 알부민 ELISA 키트를 사용하여 평가하였다.
감각 신경 전도 속도(NCV: Sensory nerve conduction velocity) 연구를 6주 및 12주에 2% 이소플루란으로 마취한 마우스에서 수행하였다. 꼬리 감각 NCV를 3cm의 기록된 거리에서 꼬리를 따라 근위부를 자극함으로써 결정하였다. 측정을 위해 Toennies Inc.의 뉴로-스크린을 사용하였다. 12주 추적 관찰 후 마우스를 안락사시키고, 양측 개흉술 및 개복술을 수행하고, 좌심실을 통해 빙 냉 식염수 용액으로 신장을 관류시켰다.
면역조직화학: 면역형광을 위해, 파라포름알데히드-고정 및 파라핀-포매 조직 절편(2 μm)을 처리하였다. 10% 토끼 혈청으로 차단한 후, 파라핀 절편을 pP38 및 F4/80에 대한 항체와 Cy3에 접합된 2차 항체로 염색하였다.
실시예 5.19: STZ-유도된 당뇨병 모델에서 당뇨병성 신증, 당뇨병성 신장 질환 및 당뇨병성 망막증의 치료 및/또는 예방.
체중이 대략 25 내지 30 g인 5 내지 7주령의 암컷 CD-1 마우스 총 70마리를 연구에 사용하였다. 이들은 영국 Charles River에서 구입했으며 7일의 순응 기간을 가졌다. 꼬리 표시로 식별된 개별 마우스와 함께 동물을 IVC 케이지(케이지당 최대 5마리)에 수용하였다. 모든 동물을 연구 기간 동안 표준 인증된 상업적 식이 및 살균된 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 사육실은 18 내지 24℃, 55 내지 70% 습도 및 12시간 명/암 주기의 표준 조건에서 유지하였다.
이 연구에 사용된 모든 프로토콜을 동물 복지 및 윤리 검토 위원회의 승인을 받았으며, 모든 절차는 1986년 동물(과학적 절차)법의 지침에 따라 수행하였다.
마우스(음성 대조군 제외)에 연속 5일 동안 매일 STZ(55 mg/kg; IP)를 주사하였다. 주사하기 전에 마우스를 6시간 동안 굶겼다. 유도 완료 1주일 후에 글루코스 수준을 모니터링하고 수준이 15 mml/L(280 mg/gL) 미만인 마우스는 이상적인 당뇨병 중증도가 발병하지 않았기 때문에 연구에서 제외하였다. 글루코스 수치를 매주 모니터링하고 STZ 유도 후 5주 후에 소변 알부민 및 크레아티닌 수준을 측정하고 원하는 범위 내에 있는지 확인하여 신장 손상의 생화학적 평가를 수행하였다. 이 단계를 성공적으로 완료한 후 동물을 처리군에 할당하였다.
군 동물 No. 제제 투여량 수준; 경로
1 3 음성 대조군 (비-유도) 비히클; IV
2 3 음성 대조군 (유도) 비히클; IV
33 8 Ia-001a 15mg/kg; IV
4 8 Ia-001a-TZ 15mg/kg; IV
5 8 Ic-001a-Tz/1-004a 15mg/kg; IV
6 8 Ic-007a 15mg/kg; IV
7 8 Ib-010a 15mg/kg; IV
8 8 IIIc-061a 15mg/kg; IV
9 8 IVc-059a 15mg/kg; IV
10 8 카프토프릴 50mg/kg; PO
혈당 및 소변 알부민/크레아티닌을 매주 측정하여 4주(28일) 동안 치료를 계속하였다. 연구 일정은 주간(5 내지 9주) 혈당 수준, 소변 알부민 크레아티니 비율, 말기(9주) 혈액 화학 및 사이토카인, 신장 조직학 및 눈-망막 누출을 살펴보고 아래에 자세히 기술하였다.
시간(주) 1주 2주 3주 4주 5주 6주 7주 8주 9주 말기-9주 희생
STZ 5일 동안 매일 --- ---- --- --- --- --- --- --- ---
시험 혈당 혈당 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA		 혈당
소변 ALB/CREA
화합물 --- --- --- --- --- IV 용량, 매일 IV 용량, 매일 IV 용량, 매일 IV 용량, 매일 ---
장기 혈액 (혈장)
신장
눈
결과
임상 징후: 많은 처리군에서 초기 체중 감소가 관찰되었으며, 이는 예상할 수 있으며 대부분의 경우, 투여 기간이 끝날 무렵 체중이 점차적으로 회복되었다. 일부 동물의 체중은 초기 체중의 90% 미만으로 떨어졌지만, 어떤 동물도 투여 중지를 받을 필요가 없었다.
혈당: STZ에 의한 유도는 유도되지 않은 비히클 대조군과 비교하여 혈당을 유의하게 증가시켰다(표 55). IVc-059a IV를 사용한 처리는 28일차에 유도된 비히클 대조군과 비교하여 혈당 수준을 유의하게 감소**시켰다. IIIc-061a IV를 사용한 처리는 또한 혈당 수준의 감소를 가져왔지만, 이것은 통계적 유의성에 도달하지 못하였다.
[표 55] STZ-유도된 당뇨병 모델에서 암컷 ICR-CD1 마우스의 0일 및 28일차에 평균 혈당 농도. 표시된 값은 평균 ±SD를 의미한다; 비-유도 및 유도 비히클군의 경우 n=3; 다른 모든 처리군에 대해 n=8.
처리군 처리 n 평균 0일차 농도
(mmol/L) (SD)		 평균 28일차 농도
(mmol/L) (SD)		 비히클 대조군과 비교한 p-값
1 음성 대조군 (비-유도) 3 6.7 (0.2) 8.9 (1.8) n/a
2 음성 대조군 (유도) 3 24.9 (1.8) 33.0 (-) n/a
3 Ia-001a 8 25.7 (6.3) 31.6 (3.8) 0.7082
4 Ia-001a-TZ 8 24.9 (7.4) 30.8 (6.2) 0.5618
5 Ic-001a-Tz/1-004a 8 25.8 (5.7) 29.6 (7.8) 0.3745
6 Ic-007a 8 25.5 (5.7) 31.1 (4.6) 0.6241
7 Ib-010a 8 25.1 (6.1) 31.1 (3.4) 0.6110
8 IIIc-061a 8 24.8 (6.2) 26.3 (7.8) 0.0775
9 IVc-059a 8 24.3 (6.4) 23.7 (6.6) 0.0159
10 카프토프릴 8 23.7 (6.9) 32.2 (2.3) 0.8256
신장 중량: 습윤 신장 중량, 또는 동물 체중의 백분율로서 신장 중량에 통계적 차이가 없었다.
소변 알부민:크레아티닌(ALB:CRE): 소변을 매주 수집하고 각 처리군에 대해 풀링하였다. Ib-010a, IIIc-061a 및 IVc-059a로의 처리는 희생 전 마지막 처리일 28일(일정의 9주차)에 ALB:CREA(표 56)를 감소시켰다.
혈액 우레아 질소(BUN): Ic-007, Ib-010a, IIIc-061a 및 IVc-059a로 처리하면 유도된 비히클 대조군보다 혈액 우레아 질소 수준을 현저히 낮추었다.
ELISA: 치료 기간이 끝날 때 혈액을 수집하고 혈청으로 처리하였다. CRP, TGF-β, IL-6 및 TNF-α의 혈청 수준을 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 정량화하였으며, 결과를 표 56에 나타냈다.
혈청 CRP: 처리 28일 후 STZ-유도된 당뇨병 모델에서 암컷 ICR-CD1 마우스의 혈청 CRP 수준. 혈청 CRP 수준은 STZ-유도된 동물에서 유의하게 증가하였다. Ia-001a, Ia-001aTz 및 대조군 카프토프릴 처리는 비히클 유도된 대조군과 비교하여 혈청 CRP 수준을 유의하게 감소시켰다(각각 **p=0.0074, *p=0.0304 및 **p=0.0026, 일원 ANOVA, 표 56).
혈청 TGF-β: 혈청 TGF-β 수준은 STZ-유도된 대조군에서 유의하게 상승하였다. Ic-007a 및 IIIc-061a를 제외한 모든 화합물로 처리한 결과 비히클 유도된 대조군보다 TGF-β 수준을 유의하게 낮추었다(p≤0.05; 일원 ANOVA, 표 56).
혈청 IL-6 수준은 STZ-유도된 대조군에서 유의하게 상승하였다. IVc-059a 및 대조군 화합물 카프토프릴을 제외한 모든 화합물로 처리한 결과 비히클 유도된 대조군보다 IL-6 수준을 유의하게 낮추었다(p≤0.05; 일원 ANOVA, 표 56).
혈청 TNF-α 수준은 STZ-유도된 대조군에서 유의하게 상승하였다. Ia-001a, Ia-001aTz, Ic-001aTz/1-004a 및 IIIc-061a로 처리하면 비히클 유도된 대조군보다 TNF-α 수준을 유의하게 낮추었다(p≤0.05; 일원 ANOVA, 표 56).
신장 조직학: 콜라겐 정량화를 투여 기간이 끝날 때 수행하였으며 동물을 사멸시키고 신장을 절제하였다. 조직을 포르말린으로 고정하고 파라핀 왁스에 포매한 다음 제조업체의 지침에 따라 Masson의 삼색소로 염색하였다. 콜라겐을 문헌[Chen et al., 2017]에 의해 공개된 방법을 사용하여 정량화하였다. 콜라겐 적용 범위는 비-유도된 비히클 대조군과 비교하여 STZ-유도된 비히클 대조군에서 유의하게 증가하였다. IIIc-061a 및 IVc-059a 처리는 유도된 비히클 대조군과 비교하여 콜라겐 수준을 유의하게 감소시켰다(각각 p=0.0210 및 p=0.0134; 일원 ANOVA, 표 56).
질병 점수: 신장 질병 점수는 H&E 염색과 간질 및 사구체 경화증, 세동맥 유리질증 및 GBM 비후의 평가를 사용하여 정량화하였다. 분명히, 질병 점수는 비-유도된 비히클 대조군과 비교하여 STZ-유도된 비히클 대조군에서 유의하게 증가하였다. Ic-001aTz/1-004a를 제외한 모든 화합물을 사용한 처리는 유도된 비히클 대조군과 비교하여 질병 점수를 유의하게 감소시켰다(p≤0.005; 일원 ANOVA, 표 56).
눈 망막 조직학: 투여 기간이 끝날 때, 망막 플랫마운트 평가를 위해 FITC-덱스트란을 주사할 군 당 4마리의 동물의 최종 샘플링하기 직전에 동물을 사멸시키고 눈을 절제하였다. 망막 플랫 마운트를 준비하고 형광 현미경(EVOS, Thermo Fisher)을 사용하여 영상화하였다. 혈관계로 덮인 면적은 비-유도된 비히클 대조군과 비교하여 STZ-유도된 비히클 대조군에서 유의하게 증가하였다. Ic-007a, IIIc-061a 및 IVc-059a를 사용한 처리는 유도된 비히클 대조군과 비교하여 혈관계 적용 범위를 유의하게 감소시켰다(각각 p=0.0432, p=0.0337 및 p=0.0131; 일원 ANOVA, 표 56).
[표 56] 소변 알부민 크레아티닌 비율(ALB:CRE), 혈액-BUN, 혈액-CRP, 혈액-TGF-베타, 혈액-IL-6, 혈액-TNF-알파, 삼색소 염색(신장 섬유증), 질병 점수 및 처리 28일차(일정의 9주)의 안구 영역
군 처리 28일차 n ALB:
CRE		 BUN CRP TGF-베타 IL-6 TNF-알파 삼색소 염색 질병 점수 안구 영역
1 음성 대조군
(비-유도)		 3 1.45 15.8 ± 0.4 3558 ± 106 11.64 ± 0.81 70.56 ± 1.25 261.7 ± 21 0.48 ± 0.4 1 ± 0 6.7 ± 1.2
2 음성 대조군
(유도)		 3 37.04 28.6 ± 0.9 6759 ± 993 19.64 ± 1.97 151.4 ± 15.59 389 ± 24 2.63 ± 0.5 11 ± 2 11.2 ± 1
3 Ia-001a 8 35.68 25.1 ± 3.1 4759 ± 1181 15.54 ± 2.8 114.16 ± 29.96 342.3 ± 15.6 1.87 ± 0.65 7 ± 1 9.9 ± 1.9
4 Ia-001a-TZ 8 29.86 25.3 ± 3.1 5191 ± 993 14.76 ± 2.95 112.35 ± 20.01 327 ± 40.7 2.6 ± 0.98 8 ± 3 11.8 ± 1
5 Ic-001a-Tz/1-004a 8 35.10 24.1 ± 4.1 6077 ± 863 15.48 ± 1.73 104.66 ± 22.89 322.8 ± 40.1 2.48 ± 0.46 9 ± 1 10.7 ± 2.1
6 Ic-007a 8 38.10 21.7 ± 3.0 5707 ± 892 16.66 ± 2.11 109.27 ± 19.03 326.8 ± 63 2.23 ± 0.61 7 ± 1 9.1 ± 1.1
7 Ib-010a 8 24.28 20.5 ± 3.4 5915 ± 1352 13.17 ± 3.11 102.72 ± 25.4 395.6 ± 46.7 1.97 ± 0.8 6 ± 1 11.8 ± 1
8 IIIc-061a 8 24.12 22.5 ± 4.1 5963 ± 849 17.35 ± 2.09 117.59 ± 29.21 324.6 ± 43.6 1.54 ± 0.55 8 ± 1 9.1 ± 1.1
9 IVc-059a 8 18.85 22.5 ± 2.8 5691 ± 1395 13.47 ± 3.33 120.88 ± 23.05 350.2 ± 41.4 1.48 ± 0.73 7 ± 1 8.7 ± 1.2
10 카프토프릴 8 24.40 28.5 ± 7.6 4534 ± 821 14.55 ± 2.86 125.56 ± 15.75 415 ± 51.7 1.98 ± 0.47 6 ± 1 11.8 ± 1.4
실시예 5.20: 다낭성 신장 질환(PKD 또는 PCKD)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Lee EC et al. (Nat Commun 10, 4148 (2019)]에 기술된 바와 같이 Pcy 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
전임상 모델: 유전적으로 관련된 설치류 PKD 모델인 pcy 마우스는 새로운 약제 효능 평가에 사용하기 위한 인간 질병과 밀접한 상관관계가 있다. 이 모델은 인간 질병을 유발하는 유전자와 관련된 PKD를 개발하여, 인간 PKD 발달을 밀접하게 반영하는 번역 가능한 설치류 모델을 제공한다. 이는 질병 진행과 치료에 대한 반응에 대해 철저히 특성화되어 약물 발견 연구에 대한 높은 수준의 신뢰를 제공한다.
동물 모델: pcy 마우스, 인간 신장염 3형을 유발하는 동일한 유전자와 관련된 유전자 돌연변이를 지닌 CD-1-pcy Iusm 계통(CrownBio). 질병의 증상과 진행은 천천히 진행되는 신장 낭포성 질환으로 집합세관에서 발생하는 낭포와 질병이 진행됨에 따라 네프론의 다른 부분이 낭포성이 된다. 수컷과 암컷 마우스도 마찬가지로 질병에 영향을 받는다. 마우스는 5주령이었고 정상 식이, 비히클과 함께 정상 식이(음성 대조군), 각각 양성 대조군 및 시험 화합물을 모두 정상 식이와 혼합하여 제공하였다. 대조군: 화합물에 사용된 비히클은 한 동물군에서 음성 대조군으로 사용하였고 톨밥탄(tolvaptan) a 바소프레신 수용체-2(V2) 길항제는 한 동물군에서 양성 대조군으로 사용하였다.
판독 및 종료점: 조직학적 검증, 신장 중량, 혈청 BUN, 혈액 내 시험 물질 농도, 체중 및 음식 섭취를 포함하는 신장의 낭포 부피 및 섬유증을 매주 기록하였다.
실시예 5.21: 방사선-유도된 섬유증(RIF: Radiation-induced fibrosis)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Ryu SH et al. (Oncotarget. 2016, 7(13), 15554-15565, doi:10.18632/oncotarget.6952)]에 의해 기술된 바와 같이 RIF 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
방사선-유도된 섬유증(RIF)은 방사선 치료의 가장 흔한 후기 합병증 중 하나이다. RIF 마우스 모델에서, 다리 구축 분석을 화합물의 생체 내 효능을 시험하는 데 사용하였다.
방사선-유도된 섬유증(RIF)은 피부와 연조직에 세포외 기질이 과도하게 축적되는 것을 특징으로 하며, 섬유아세포의 증식은 방사선 치료의 가장 흔한 후기 합병증 중 하나이다. 또한, RIF는 죽은 섬유 조직에 대한 비가역적 과정이며 재활성화된 근섬유아세포에 의한 흉터 조직의 리모델링과 관련된 역동적인 과정이다.
RIF 마우스 모델: 수컷 BALB/c 마우스를 RIF 마우스 모델에 사용하였다. 마취 하에, 각 마우스의 오른쪽 뒷다리에 선형 가속기를 사용하여 44 Gy(22 Gy x 2주 동안 2회)의 방사선량을 투여하였다. 신체의 나머지 부분을 보호하기 위해 특별히 설계된 차폐를 사용하였고, 뒷다리 표면에 적절한 방사선량을 보장하기 위해 1 cm 두께의 볼루스를 피부에 적용하였다. 방사선 조사 후, 마우스를 무작위로 두 군으로 나누었다. 각 군을 식염수(대조군) 또는 화합물(처리군)로 하루에 한 번 처리하였다. 방사선 조사나 약물을 받지 않은 마우스를 음성 대조군으로서 사용하였다.
조사된 다리의 피부 및 연조직에서 화합물의 항-섬유성 효과를 입증하기 위해, H&E 염색을 사용하여 표피 표면에서 진피 기저까지의 상피 두께를 측정하였다.
실시예 5.22: 스타가르드병(SD)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Fang Y. et al. (Faseb Journal, 2020, DOI: 10.1096/fj.201901784RR)]에 의해 기술된 바와 같이 SD 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
동물: 마우스 착색 Abca4-/- 마우스(129S4/SvJae-Abca4tm1Ght)를 Jackson Laboratory(미국 메인주 바 하버 소재)에서 구입하였다. 착색된 야생형(WT) 마우스(129S2/SvPas)를 Janvier Labs(프랑스 르 제네스트-세인트-이슬레 소재)에서 입수하였다. 각 군에서, 수컷 대 암컷 비율은 1:1이었다. 마우스에게 자유롭게 음식과 물을 제공하며 12:12 시간의 명(케이지에서 약 50룩스)-암 주기로 사육하고 수용하였다.
청색광 조명(BLI: Blue-light illumination): 연령-일치된 착색 Abca4-/- 및 WT 마우스(9개월령)를 펜타닐(fentanyl) 0.05 mg/kg, 미다졸람 5 mg/kg 및 메데토미딘 0.5 mg/kg을 포함하는 3가지 성분의 마취제로 복강 내로 마취하였다. 동공을 0.5% 트로피카미드와 2.5% 페닐에프린 히드로클로라이드의 혼합물로 확장하였다. METHOCEL(Omni Vision, 독일 푸크하임 소재)을 각막을 촉촉하게 하기 위해 적용하였다. 조명을 비추는 동안, 노출된 눈의 각막에 유리 슬립을 놓았다. 각 마우스의 조명을 비춘 눈을 15분 동안 50 mW/cm2의 강도로 청색광(파장: 430-nm)에 노출하였다. 대조군으로 조명을 비추지 않은 눈을 미광으로부터 보호하기 위해 조심스럽게 덮었다.
광학 간섭 단층 촬영(OCT: Optical Coherence Tomography), 광학 현미경 및 투과 전자 현미경(TEM: Transmission Electron Microscopy), HPLC에 의한 비스레티노이드 정량화, 및 BLI 전 및 후 7일에 전체 필드 전자망막사진 ERG를 포함한 일련의 시험을 수행하였다.
실시예 5.23: 증식성 유리체망막병증(PVR)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Hou H et al. (Ophthalmic Res 2018;60:195-204. doi: 10.1159/000488492)] 또는 문헌[Markus B. et al. (FEBS Open Bio. 2017;7(8):1166-1177. Published 2017 Jun 29. doi:10.1002/2211-5463.12252)]에 기술된 바와 같이 PVR 마우스 모델을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
동물 샘플: PVR의 마우스 모델을 단백질 분해 효소인 디스파제의 유리체내 주사를 적용하여 사용하였다. 이 모델은 신경교 활성화뿐만 아니라 상피 및 망막하 막 형성을 유도하는 것으로 알려져 있다.
4 내지 6개월령 야생형 암컷을 펜토바비탈(90 mg·kg-1, i.p.)로 마취하고, 국소 마취를 위해 1% 프로카인 히드로클로라이드(Novocaine, EGIS, 헝가리 부다패스트 소재) 한 방울을 투여하였고 홍채 확장을 위한 트로피카미드(Mydrum, Chauvin Aubeans, 프랑스 몽펠리에 소재) 한 방울을 투여하였다. 4 마이크로리터의 디스파제(Sigma-Aldrich, 0.4U·μL-1, 멸균 생리 식염수 용액에 용해)를 자동 피펫을 사용하여 입체현미경 제어(Ctrl) 하에 오른쪽 눈에 유리체내 주사하였다. Ctrl 동물에 4 μL의 멸균 생리 식염수를 투여하였다. PVR 유도를 확인하고 질병 진행을 모니터링하기 위해 주사 후 스트라투스 광 간섭 단층 촬영 영상(OCT; Carl Zeiss Meditec, 미국 캘리포니아주 더블린 소재)를 촬영하였다. Ctrl 및 디스파제 처리한 마우스는 주사 후 14일차에 PVR 형성의 징후가 분명할 때 희생시켰다: OCT 검사에서 망막 상피막의 및/또는 망막 박리의 존재.
샘플 준비 및 정제: 메스 블레이드를 사용하여 공막 갤러와 함께 각막의 단두대 제거(guillotine removal) 후 마우스의 유리체를 단리하였으며, 이어서 렌즈를 제거하였다. 유리체를 7 m 우레아, 30 mm Tris, 2 m 티오우레아 및 4% CHAPS를 함유하는 용해 완충액(pH 8.5)으로 가용화한 후, 용해물을 빙 냉 욕조에서 5분 동안 초음파 처리하고 4℃에서 10분 동안 16 900 g에서 원심분리하였다. 상등액을 LoBind Eppendorf 튜브로 옮기고 Ready-Prep 2-D CleanUp 키트(Bio-Rad Laboratories, 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)로 제조업체의 프로토콜에 따라 정제하였다. 간단히 말해서, 침전 및 원심분리 후, 펠릿을 건조하고 7 m 우레아, 2 m 티오우레아, 4% w/v CHAPS, 1% 디티오트레이톨(DTT), 2% v/v Bio-Lyte(Bio-Rad) 및 0.001% 브로모페놀 블루를 함유하는 240 μL 재수화 완충액에 재현탁하고, 등전점 포커싱에 대해 즉시 사용하였다.
2D 겔 전기영동: 각 군에서 나온 3개의 유리체 샘플에 2-DE를 적용하였다. IPG(24 cm, pH 4 내지 7; Bio-Rad)가 있는 첫 번째 고정된 pH 구배(IPG) 스트립을 20℃에서 밤새 수동 재수화를 사용하여 추출된 유리체 단백질로 재수화하였다. 그런 다음 300 V를 3시간 동안 인가하여 등전점 포커싱을 수행하고, 5시간 후에 3500 V로 점진적으로 증가시킨 다음 18시간 동안 3500 V를 유지하였다. 등전점 포커싱 후, IPG 스트립을 평형이 될 때까지 즉시 -70℃에 두었다. IPG 스트립을 0.6% DTT를 함유하는 평형 완충액(500 mm Tris/HCl, pH 8.5, 6 m 우레아, 2% SDS, 20% 글리세롤)에서 15분 동안 평형을 유지하였고 1.2% 요오도아세트아미드를 함유한 평형 완충액에서 15분 동안 평형을 유지하였다. 두 번째 차원에서, 스트립을 12% 폴리아크릴아미드 겔 위에 놓고 아가로스로 덮었다. Protean Plus Dodeca Cell(Bio-Rad)을 사용하여 브로모페놀 블루 염료가 겔 바닥에 도달할 때까지 24시간 동안 겔당 100 mA에서 전기영동을 수행하였다. 12개의 겔 모두 동일한 조건에서 함께 실행하였다. 단백질은 사내에서 제조된 루테늄 II 트리스(바토페난트롤린 디설포네이트) 형광 염료 25를 사용하여 염색하고 겔 영상을 Pharos FX Plus Molecular Imager(Bio-Rad)를 사용하여 기록하였다. 모든 경우에 3개의 생물학적 복제물을 분석하였으며, Ctrl 및 디스파제 처리군의 샘플을 동일한 날에 함께 처리하였다.
실시예 5.24: 습식 및 건식 연령-관련 황반변성(ARMD 또는 AMD)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Matsuda Y et al. (Mol Ther Nucleic Acids. 2019;17:819-828. doi:10.1016/j.omtn.2019.07.018)]에 의해 기술된 바와 같이 AMD 뮤린 모델을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
동물: 암컷 C57BL/6J 마우스를 Charles River Laboratories Japan에서 입수하였다. 수컷 BN 랫트를 입수하였다. 수컷 New Zealand White(NZW) 토끼를 일본 Kitayama Labes에서 입수하였다. 마우스, 랫트, 및 토끼를 특별한 병원균이 없는 조건에서 유지하였다.
RPE 세포의 EMT 분석: 37℃에서 배양된 RPE 세포를 96웰 미세역가 배양 플레이트에 1 x 105세포/웰로 씨딩하였다. 24시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 3일 동안 본 발명에 따른 화합물의 존재 및 부재 하에 FGF2(2 ng/mL) 및 TGF-β2(3 ng/mL)로 처리하였다. EMT 바이오마커 α-SMA 및 콜라겐 유형 I의 mRNA 발현 수준을 정량적 실시간 PCR로 평가하였다.
마트리겔 플러그(Matrigel Plug) 분석: 0.5 mL 마트리겔 매트릭스 GFR(성장 인자 감소)-PRF(페놀 레드 유리(phenol red free))(BD Biosciences) 용액을 1 μg FGF2와 혼합하고 암컷 C57BL/6J 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다(8주, n = 3). 본 발명에 따른 화합물을 복강 내로 투여하고, 이식 후 7일차에 마트리겔 플러그를 제거하고 사진을 촬영하였다. 혈관신생의 등급을 제조업체의 지침에 따라 시안메트헤모글로빈(cyanmethemoglobin) 방법을 사용하여 마트리겔 플러그의 헤모글로빈 농도에 의해 결정하였다. 샘플의 540 nm에서의 광학 밀도(OD540) 값을 마이크로플레이트 판독기에서 측정하고, 헤모글로빈 농도를 헤모글로빈 표준(Sigma-Aldrich)에 따라 계산하였다.
마우스 레이저-유도 CNV 모델: 마드린(Mydrin)-P 안과 용액을 수컷 C57BL/6J 마우스의 눈에 주입하여 동공을 확장하였다. 그런 다음 슬릿 램프(SL-130)와 다색 레이저 광응고기(MC-300)를 사용하여 눈의 6개 부위에 레이저 조사(파장 532 nm; 스폿 크기 50 μm; 조사 시간 0.1 s; 레이저 출력 120 mW)를 수행하였으며, 큰 망막 모세혈관은 피하였다. 레이저 조사에 의한 CNV 유도 직후, 본 발명에 따른 시험된 화합물 및 대조군을 유리체내 주사를 통해 투여하였다. 레이저 조사 7일 후, 4% FITC-덱스트란 용액을 0.5 ml/동물의 부피로 꼬리 정맥에 투여하였다. FITC-덱스트란 투여 1 내지 5분 후, 동물을 경추 탈구에 의해 안락사시켰다. 안구를 제거하고 12 내지 24시간 동안 4% 파라포름알데히드-인산염 완충액에 고정하였다. 맥락막 평면 마운트를 입체 현미경 하에 준비하였다. CNV 부위의 사진은 공초점 현미경을 사용하여 촬영하였다. 레이저 유도된 CNV 동물 실험을 통해, 동물 모델의 눈에 기포가 형성됨으로써 각 조사가 성공적이었음을 확인하였다.
랫트 레이저-유도된 CNV 및 망막하 섬유증 모델: 수컷 BN 랫트를 사용하는 랫트 모델에서 동일한 기술을 사용하였다. CNV 모델의 경우, 레이저 설정은 망막-맥락막의 8개 부위에 120 mW에서 스폿 크기 80 μm 및 조사 시간 0.05초였다. 망막하 섬유증 CNV 모델의 경우, 사용된 레이저 전력은 240 mW였다. 레이저 조사 직후, 본 발명에 따른 대조군 및 시험 화합물로 유리체내 주사를 수행하였다. 망막하 섬유증 CNV 연구를 위해, (1) 식염수 비히클 및 (2) 본 발명의 화합물(1회 주사의 경우 15 ㎍/눈 또는 2주 간격으로 2 또는 3회 주사)을 사용하였다. 레이저 조사 후, CNV 연구의 경우, 평면 마운트 맥락막의 공초점 현미경 검사를 위해 핵 제거 눈을 준비하였고 위와 같은 FITC-덱스트란 프로토콜을 레이저 조사 후 14일차에 사용하였다. 망막하 섬유증 연구를 위해, 6주 후, 동물을 희생시키고, 조직병리학적 연구를 위해 적출된 눈을 준비하여 광학 현미경을 사용하여 망막하 섬유증을 정량화하였다. 눈을 파라핀 블록에 포매하고 절편화하고 일상적인 방법에 따라 Masson의 삼색소로 염색하였다. 다음 척도에 따라 2명 또는 3명의 독립적인 조사자가 맹검 방식으로 섬유증의 등급을 매겼다: 등급 0, 없음; 1등급, 최소; 2등급, 약함; 3등급, 보통; 4등급, 심각.
실시예 5.25: 익상편(PTE)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 맥락막 신생혈관 뮤린 모델(CNV), 직접 생체 내 혈관신생 분석(DIVAA) 및 익상편 뮤린 모델을 사용하여 맥락막 혈관신생 및 익상편 성장에 대해 평가하였다.
익상편은 일반적으로 불편함 및 적목 현상과 관련된 안구 표면의 양성 섬유혈관 성장이며, 질병이 진행됨에 따라 시력 감소(지형적 난시) 및 심한 경우 안구 운동성 제한과 종종 관련이 있다. 섬유성 성장 인자, 산화 스트레스 및 DNA 메틸화에 의해 유도된 다양한 전염증성 사이토카인은 익상편의 발병기전에 연루되어 있다. 이러한 요인 중 일부는 자외선(UV) 빛에 노출되면 영향을 받기 때문에, 여러 출처의 현재 증거에 따르면 햇빛에 많이 노출된 사람은 익상편의 위험이 증가한다고 시사하고 있다. 광범위한 연구에도 불구하고, 익상편의 발병기전에 대한 명확한 이해는 없지만, 발병기전에 기여하는 가장 중요한 요인 중 하나는 자외선 노출과 관련된 윤부(limbal) 줄기 세포의 종양 변화와 발암성 바이러스(인간 유두종 바이러스)의 가능한 역할이다.
현재까지, 토끼와 마우스에서 인간 상피 익상편 세포, 외인성 세포외 기질 또는 UV 산란 방사선의 주입을 사용하여 익상편에 대한 세 가지 동물 모델이 설명되어 있다. UV 산란광을 사용한 토끼 모델의 결과는 조직학적 분석 없이 조직 성장의 크기와 모양에 대한 컴퓨터 예측에 중점을 둔다. 마우스 모델은 인간 익상편의 조직학적 특성을 나타내지만, 안과적 시술을 위한 토끼의 조작은 안구 구조 및 크기가 인간의 눈 구조와 더 유사하기 때문에 더 용이하다.
방법: 마우스에 시험된 화합물이 있거나 없는 물을 투여하였다. CNV의 경우, 신생혈관 병변 부피는 레이저 유도 7일 후 공초점 현미경을 사용하여 맥락막-망막 색소 상피(RPE) 플랫 마운트에서 결정하였다. DIVAA의 경우, 10,000개의 인간 익상편 상피 세포를 함유하는 실리콘 캡슐을 마우스 옆구리에 피하 이식하였다. 11일 후, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지된 덱스트란의 뮤린 꼬리-정맥 주사 후 분광형광측정기를 사용하여 신생혈관화(NV)를 정량화하였다. 익상편 상피 세포 모델을 흉선이 없는 누드 마우스의 코 결막하 공간에 10,000개의 인간 익상편 상피 세포를 주입하여 개발하였다.
주요 결과 측정: Student t-검정을 CNV 및 DIVAA 모델에 대한 데이터를 평가하는데 사용하였으며 조직학적 준비는 익상편 병변을 평가하는데 사용하였다.
실시예 5.26: 중심 장액 맥락망막병증(CSC)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Wei-Da Chio, et al., Life Sci J 2019;16(12):115-126]. ISSN: 1097-8135)]에 의해 기술된 바와 같이 CSC 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
중심 장액 맥락망막병증(CSC)의 발병기전은 아직 완전히 이해되지 않았다. 코르티코스테로이드의 관련성은 논란의 여지가 없지만, 정확한 역할은 명확하지 않다; CSC의 기본 메커니즘의 다른 부분은 주로 플루오레세인 및 인도시아닌 녹색 혈관 조영술과 같은 영상화 기술에 의해 해명되었다. 대부분의 CSC 사례는 자체-제한적이지만, 중증 및 재발성 과정이 존재하며, 이러한 환자의 경우 암점 및 맥락막 신생혈관화의 위험이 있는 레이저 광응고술, 광역학 요법과 같은 제한된 수의 치료 선택사항만 이용 가능하다.
방법: CSCR이 있는 수컷 SD 랫트를 사용하여 치료를 수행하였다. 사례의 오른쪽 눈을 무작위로 2개군(대조군 및 시험 화합물 포함)으로 나누어 매주 간접 검안경 검사 및 OCT 스캔을 포함한 일련의 검사를 수행하였다. 모든 SD 랫트를 먼저 CSCR 모델로 유도하였다. CSCR이 OCT 영상화에서 사라지면, 화합물을 효율적인 것으로 간주하였다.
실시예 5.27: 폐뿐만 아니라 췌장, 간, 신장 및 장에도 영향을 미치는 낭포성 섬유증(CF)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[McCarron A et al. (Respir Res. 2018;19(1):54. Published 2018 Apr 2. doi:10.1186/s12931-018-0750-y)]에 기술된 바와 같이 CF 뮤린 모델을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
인간에서, 낭포성 섬유증(CF) 폐 질환은 만성 감염, 염증, 기도 리모델링 및 점액 폐쇄를 특징으로 한다. CF 마우스 모델에서 폐 발현(manifestation)의 부족은 기도 질환 발병의 조사와, 잠재적 치료제의 개발 및 시험을 방해하였다. 그러나, 최근에 생성된 랫트, 흰 족제비 및 돼지 모델을 포함한 CF 동물 모델은 다양한 정도의 중증도를 가진 잘 특성화된 폐 질환 표현형의 범위를 보여준다. 현재 사용 가능한 CF 동물 모델의 다양한 기도 표현형이 이용 가능하며 기도-관련 CF 연구에서 각 모델의 잠재적인 적용을 제시한다. 특히, 마우스 CFTR 서열에 도입된 일반적인 인간 CF-유발 돌연변이(예컨대 Phe508del 또는 Gly551Asp)가 있는 돌연변이 대립유전자가 개발되었다.
실시예 5.28: 특발성 폐섬유증(IPF)의 치료 및/또는 예방
본 발명에 따른 화합물의 치료 효능을 문헌[Chen SS et al. (J Thorac Dis. 2017;9(1):96-105. doi:10.21037/jtd.2017.01.22)]에 기술된 바와 같이 IPF 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 조사하였다.
IPF는 심각한 폐 섬유증을 동반하는 만성 진행성 간질성 폐 질환이다. IPF의 병인은 아직 명확하지 않다. 환자는 일반적으로 IPF로 진단된 후 2 내지 3년만 생존한다. IPF의 발생 및 발달은 상피 세포 손상, 섬유세포 증식, 염증 반응 및 세포외 기질 침착과 관련이 있다. IPF의 병리학적 징후는 일반적인 간질성 폐렴(UIP: interstitial pneumonia)이다. 현재, IPF 환자의 사망률은 상당히 높다. 그러나, IPF에 대한 효과적인 치료법이 부족하다. IPF-관련 사망의 주요 원인은 IPF-관련 사망의 50% 이상을 차지하는 IPF의 급성 악화(AE-IPF: acute exacerbation of IPF)이다. 대부분의 AE-IPF 환자는 위독한 상태로 인해 기관지경 검사나 폐 생검을 견딜 수 없다. AE-IPF의 생검 부족은 AE-IPF에 대한 심층 조사를 실질적으로 제한한다. AE-IPF를 모방할 수 있는 실험 동물 모델은 AE-IPF를 연구하는 데 유용한 도구가 될 것이다.
블레오마이신(BLM)-유도 IPF의 동물 모델을 사용하였다. IPF의 랫트 모델을 BLM을 사용한 기관내 관류에 의해 개발하였다. 이론적으로, BLM을 사용한 두 번째 기관내 관류는 첫 번째 관류에서 이미 폐 섬유증이 발생한 랫트에서 추가 폐 손상을 유도해야 한다. 추가적인 폐 손상은 AE-IPF의 병리학적 특성과 유사할 수 있다.
Sprague Dawley(SD) 랫트를 화합물만 처리한 대조군, 화합물 + BLM + BLM으로 처리한 AE-IPF 모델군, AE-IPF 모델군(cpd + BLM + BLM군), 화합물로 처리한 IPF 모델군(Cpd + BLM군), IPF 모델군(BLM군), 및 BLM이 없는 정상 대조군의 상이한 군들로 무작위로 나누었다.
BLM + BLM 군의 랫트는 BLM으로 첫 번째 관류 후 28일차에 BLM으로 두 번째 관류를 하였다. 다른 두 군의 랫트에 두 번째 관류로서 식염수를 투여하였다. 각 군에서 6마리의 랫트를 각각 첫 번째 관류 후 31일, 35일 및 42일에 희생시켰다.
BLM + BLM 군에 있는 랫트의 병태생리학적 특성은 AE-IPF 환자의 특성과 유사하며 설명된 바와 같이(문헌[Chen SS, J Thorac Dis 2017;9(1):96-105]), BLM을 사용한 두 번째 관류는 급성 폐 섬유증의 악화를 유도하는 것으로 보이며 랫트의 AE-IPF를 모델링하는 데 사용할 수 있다.
단일 및 각각 2개의 기관 내 블레오마이신 관류를 사용하여 유도된 AE-IPF를 사용하는 이러한 랫트 모델에서 화합물 제형의 효과는 조직병리학적 소견(급성 폐 손상에 대해 분석 및 채점된 H & E 및 Masson 염색 절편)과 생존을 개선해야 한다.
실시예 5.29: 21일차에 C57BL/6 마우스에서 블레오마이신 유도된 폐 섬유증
8 내지 10주령의 총 40마리의 수컷 Balb/c 마우스를 연구에 사용하였다. 이들은 영국 Charles River에서 구입했으며 7일의 순응 기간을 가졌다. 꼬리 표시로 식별된 개별 마우스와 함께 동물을 IVC 케이지(케이지당 최대 5마리)에 수용하였다. 모든 동물은 연구 기간 동안 표준 인증된 상업적 식이 및 살균된 물에 자유롭게 접근할 수 있게 하였다. 사육실은 18 내지 24℃, 55 내지 70% 습도 및 12시간 명/암 주기의 표준 조건에서 유지하였다.
이 연구에 사용된 모든 프로토콜은 동물 복지 및 윤리 검토 위원회의 승인을 받았으며 모든 절차는 1986년 동물(과학적 절차)법의 지침에 따라 수행하였다.
마우스를 자일라진과 케타민의 IP 주사를 사용하여 마취하였다. 적절한 마취면이 달성되면, 동물에게 기관내 경로를 통해 1.0 U/kg의 블레오마이신 설페이트를 주입하였다. 액체의 총 부피는 50 μL였다. 마우스를 하기 표 57에 나타낸 바와 같이 처리군에 무작위로 할당하였다:
군 번호 IT 유도 처리 동물 수 종료 투약 요법
1 식염수 1일차에 비히클
 6 21일차 QD (IV)
2 블레오마이신 - 0일차에 1 U/kg 1일차에 비히클 12 21일차
 QD (IV)
3 블레오마이신 - 0일차에 1 U/kg 1일차에 피르페니돈 100 mg/kg 12 21일차 QD (PO)
4 블레오마이신 - 0일차에 1 U/kg 1일차에 IVc-059a 15 mg/kg 12 21일차 QD (IV)
IV 및 양성 대조군(피르페니돈)의 투여를 블레오마이신 점적 24시간 후에 시작하였다.
약물 용액을 투여 직전에 제형화하였다. 15mg/kg의 용량(12마리, 30 g 마우스에 충분)의 경우 4.5 mg의 화합물을 칭량하였다. 75 μl(5%) DMSO를 첨가하고 약물이 용액이 될 때까지 혼합하였다. 150 μl(10%) 솔루톨을 첨가하고 부드럽게 와류하고, 150 μl(10%) PEG400을 첨가하고 부드럽게 와류하였다. 1000 μl PBS(pH7)를 첨가하고 매트릭스를 측정하여 pH 7.0이 유지되었는지 확인하였다. 나머지 PBS(총 1500 μl까지)를 첨가하였다. 화합물은 용액에 남아 있었다.
종료 후 샘플링(최종 투여일): 샘플링 당일에, 최종 투여 2시간 후, 마우스를 과량의 마취를 통해 희생시켰다. 동물을 다음에 대해 샘플링하였다:
혈청: 희생 직후, 심장 천자를 통해 혈액을 채취하여 Eppendorf 튜브에 넣었다. 튜브를 5분 동안 6,000 rpm에서 원심분리하기 전에 적어도 20분 동안 실온에서 보관하였다. 샘플을 -80℃에서 보관하였다.
육안 부검: 종료 후, 내부 장기를 노출시켜 관찰하였다. 임의의 이상을 기록하였다.
폐: 절제 전에 포르말린으로 폐를 부풀렸다. 간단히 말해서, 마우스의 기관을 노출시켰고, 블레이드를 사용하여 작은 절개를 만들었다. 봉합 재료를 절개 아래 기관 뒤쪽 주위에 부드럽게 놓고 느슨하게 묶었다. 포르말린을 폐에 부드럽게 삽입하고 봉합사를 단단히 닫아 팽창을 보장하였다. 폐를 포르말린에 넣고 콜라겐 침착 및 질병 진행 분석을 위해 삼색소 및 H&E 염색으로 염색하였다(Ashcroft 점수). 폐 조직의 절편을 급속 동결하였다.
Ashcroft 점수매김:
0 정상 폐
1 폐포 또는 세기관지 혈관의 최소 섬유증 비후
2 최소와 보통 사이
3 폐 구조에 명백한 손상 없이 벽이 적당히 두꺼워짐
4 폐 구조 손상을 동반한 중등도와 증가된 섬유증 사이
5 폐 구조에 대한 명확한 손상과 섬유 띠 또는 작은 섬유 덩어리의 형성과 함께 증가된 섬유증
6 섬유증 증가와 폐 구조의 심각한 왜곡 사이
7 구조 및 큰 섬유 영역의 심한 왜곡; "벌집 폐"
8 필드의 총 섬유질 제거
결과
임상 징후: 체중의 변화가 관찰되지 않았으며 연구 기간 동안 어떤 동물도 투여 휴가를 가질 필요가 없었다.
애쉬크로프트 점수(Ashcroft score): 각 동물의 폐를 FFPE로 절단하고, 사내 프로토콜에 따라 H&E로 염색하였다. 전체 슬라이드 영상을 제공하기 위해 Glissando 슬라이드 스캐너에서 슬라이드를 영상화하였다. 문헌[Hubner et al., 2008]에 따라 염증/섬유증의 정도를 측정하기 위해 애쉬크로프트 등급 시스템을 사용하여 각 폐에 점수를 매겼다. 점수매김을 블라인드 방식으로 수행하였다. 100 mg/kg의 피르페니돈 및 15 mg/kg의 IVc-059a 둘 모두 마우스 폐에서 섬유증의 발병을 감소시켰다(각각 p=0.0018 및 0.0130, ANOVA). 피르페니돈 처리는 IVc-059a 처리와 동일한 섬유증 발병 효과를 나타냈다(p=0.4441, 2-꼬리 T-검정). 대표적인 영상을 도 11a에 나타냈다.
도 11a는 치료 21일차의 폐 섬유증의 대표적인 영상을 보여준다: 결합 조직의 삼색소 염색의 예시 영상(×20); (A1) 비-유도(건강함); A2, 비히클 처리로 유도된 블레오마이신; A3, 피르페니돈 100 mg/kg 처리로 유도된 블레오마이신; A4, IVc-059a 처리로 유도된 블레오마이신. 도 11b는 IVc-059a 대 피르페니돈 대 비처리된 건강한 블레오마이신 유도의 애쉬크로프트 점수를 보여준다.
각 동물의 폐 전체를 포르말린으로 고정하고 70% 에탄올에 보관하였다. 이 절편을 파라핀 왁스에 포매하기 전에 증가하는 농도의 에탄올에서 탈수하였다. 절편을 5 μM로 절단하고 Superfrost 슬라이드에서 2시간 동안 구웠다. 결합 조직용으로 시판되는 키트(Abcam ab150686)를 사용하여 절편을 염색하였다. 삼색소 염색으로 덮인 퍼센트 면적을 Qupath 및 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
실시예 5.30: 시험관 내 결과 및 ADME-독성학
ADME-독성에 대한 종합적인 평가를 화합물 Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a 및 IVc-059a에 대해 수행하였다.
Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a and IVc-059a에 대해 Cardiac Ion 채널 Assays(CiPA) Core QPatch Panel을 평가하였다: CiPA에는 다음 3가지 분석을 사용하였다: Nav1.5 인간 나트륨 이온 채널 세포 기반 QPatch CiPA 분석, hERG 인간 칼륨 이온 채널 세포 기반 QPatch CiPA 분석, Cav1.2(L 유형) 인간 칼슘 이온 채널 세포 기반 QPatch CiPA 분석.
간세포 마이크로솜과 인간 간세포 대사를 평가하였다. 결합 분석, 효소, 및 흡수 분석의 포괄적인 세트와 용액 특성, 시험관 내 흡수, 대사 및 독성을 평가하였다. 유전적 독성은 AMES* 및 소핵 분석을 사용하여 평가하였다.
*에임즈(Ames)는 유전자 돌연변이를 일으킬 수 있는 화합물을 식별하기 위한 세균 분석법으로서 설치류 발암성 검사에서 높은 예측값을 보여준다. 시험관 내에서
** 염색체 손상을 유도하는 화합물(클라스토겐(clastogen) 및 아뉴겐(aneugen))의 식별에 사용되는 시험관 내 소핵 분석에서
결과
극성이 높은 화합물은 반감기가 60분 이상인 간 마이크로솜에서 낮은 대사를 나타냈다. 생존력을 볼 때 간세포에서 유의한 독성 효과는 관찰되지 않았다. 음전하를 띤 화합물의 대부분은 혈장 단백질과 강하게 결합되어 있었다. 유전독성 효과는 관찰되지 않았다. 화합물은 농도 5 μM 내지 0.1 mM에서 에임즈 변동 시험* TA100 -S9, TA100 + S9, TA1535 - S9, TA1535 + S9, TA1537 - S9, TA1537 + S9, TA98 - S9, TA98 + S9에서 유의한 영향을 나타내지 않았다. TA100 -S9, TA1535 - S9, TA1537 - S9, TA98 - S9에서 박테리아 독성이 관찰되지 않았다.
8 μM 내지 1 mM로 평가된 농도 범위에 대한 소핵 분석에서는 효과가 관찰되지 않았다.
CiPA 패널에서, Cav1.2(L형) 인간 칼슘 이온 채널 세포 기반 자동 패치 클램프 CiPA 분석, hERG 인간 칼륨 이온 채널 세포 기반 자동 패치 클램프 CiPA 분석 및 Nav1.5 인간 나트륨 이온 채널 세포 기반 자동 패치 클램프 CiPA 분석의 세 가지 세포-기반 분석을 사용하였다: 모두 3가지 농도 수준에서 평가하였으며 0.1 μM에서 10 μM 사이에서 유의한 억제가 관찰되지 않았다.
안전성 패널 분석에서 화합물은 5-HT 수송체 인간(h)(길항제 방사성리간드); 5-HT1A(h)(작용제 방사성리간드); 5-HT1B(h)(길항제 방사성리간드); 5-HT2A(h)(작용제 방사성리간드); 5-HT2B(h)(작용제 방사성리간드); 5-HT3(h)(길항제 방사성리간드); A2A(h)(작용제 방사성리간드); 아세틸콜린에스터라제(h); 알파 1A(h)(길항제 방사성리간드); 알파 2A(h)(길항제 방사성리간드); AR(h)(작용제 방사성리간드); 베타 1(h)(작용제 방사성리간드); 베타 2(h)(길항제 방사성리간드); BZD(중심)(작용제 방사성리간드); Ca2+ 채널(L, 디히드로피리딘 부위)(길항제 방사성리간드); CB1(h)(작용제 방사성리간드); CB2(h)(작용제 방사성리간드); CCK1(CCKA)(h)(작용제 방사성리간드); D1(h)(길항제 방사성리간드); D2S(h)(작용제 방사성리간드); 델타(DOP)(h)(작용제 방사성리간드); 도파민 수송체(h)(길항제 방사성리간드); ETA(h)(작용제 방사성리간드); GR(h)(작용제 방사성리간드); H1(h)(길항제 방사성리간드); H2(h)(길항제 방사성리간드); 카파(h)(KOP)(작용제 방사성리간드); KV 채널(길항제 방사성리간드); Lck 키나제(h); M1(h)(길항제 방사성리간드); M2(h)(길항제 방사성리간드); M3(h)(길항제 방사성리간드); MAO-A(길항제 방사성리간드); mu(MOP)(h)(작용제 방사성리간드); N 뉴런 알파 4베타 2(h)(작용제 방사성리간드); Na+ 채널(부위 2)(길항제 방사성리간드); NMDA(길항제 방사성리간드); 노르에피네프린 수송체(h)(길항제 방사성리간드); PDE3A(h); PDE4D2(h); 포타슘 채널 hERG(인간)- [3H] 도페틸라이드; V1a(h)(작용제 방사성리간드)에 대한 우수한 안전성 프로파일을 나타내는 다음의 효소 시스템에서 억제 효과가 없거나 매우 낮았다.
화합물의 항-염증 효과는 부분적 시클로옥시게나제 효소 억제와 일치하였으며, 예를 들어 Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a 및 IVc-059a는 COX2(시클로옥시게나제-2)의 부분적 억제를 나타냈다.
실시예 5.31: BioMap Plus를 사용한 시험관 내 프로파일링
일련의 시험관 내 분석은 생체 내 결과와 관련이 있는 혼선(crosstalk) 및 피드백 메커니즘을 보존하는 조건에서 화합물의 표현형 프로파일링을 위해 복잡한 조직 및 장기의 질병 생물학(혈관, 면역계, 피부, 폐) 및 일반 조직 생물학을 모델링하는 인간 1차 세포-기반 분석을 사용하여 수행하였다.
화합물 Ic-007a, IIc-007a, IIIc-061a, IVc-059a의 효능, 선택성, 안전성, 작용 메커니즘, 및 질병 징후를 BioMaps Plus 표현형 세포 분석(Eurofins-DiscoverX, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)을 사용하여 다음의 세포 시스템에서 30 μM, 10 μM, 3.3 μM, 1.1 μM의 농도로 평가하였다:
- 심혈관질환, 만성염증, 천식, 알레르기, 자가면역질환, 아토피질환을 평가하기 위한 정맥 내피 세포
- 심혈관 질환, 만성 염증, 자가면역 질환, 만성 염증을 평가하기 위한 정맥 내피 세포가 있는 PBMC;
- 자가면역 질환, 염증을 평가하기 위한 PBMC가 있는 B 세포;
- 폐 염증, COPD 평가를 위한 기관지 상피 세포
- 심혈관 염증, 재협착을 평가하기 위한 관상동맥 평활근 세포
- 섬유증, 만성 염증, 상처 치유, 조직 재형성, 기질 조절을 평가하기 위한 진피 섬유아세포
- 건선, 피부염, 피부 생물학을 평가하기 위한 각질세포/진피 섬유아세포
- 섬유증, 만성 염증, 기질 재형성을 평가하기 위한 폐 섬유아세포
- 심혈관 염증, 재협착, 만성 염증을 평가하기 위한 대식세포가 있는 정맥 내피 세포
Figure pct00326
결과
Ic-007a는 본 연구에서 시험한 농도에서 세포독성이 없었다. Ic-007a는 인간 1차 T 세포(30 μM) 및 섬유아세포(30 μM, 10 μM, 3.3 μM, 1.1 μM)에 대해 항증식성이었다. Ic-007a는 20개의 주석이 달린 판독값으로 활성이었으며 주요 바이오마커 활성의 매개된 변화를 생물학적 및 질병 분류별로 나열하였다. 주로 Ic-007a는 염증-관련 활성(감소된 VCAM-1, sTNFα, MIP-1α, I-TAC, MIG; 증가된 IL-8; 조절된 IP-10), 면역조절 활성(감소된 CD40, M-CSF), 및 조직 재형성 활성(감소된 콜라겐 I, 콜라겐 IV, TIMP-1, tPA, 콜라겐 III, PAI-1, uPAR, bFGF)에 영향을 주었다.
IIc-007a는 본 연구에서 시험한 농도에서 세포독성이 없었다. IIc-007a는 시험된 농도에서 이러한 인간 1차 세포에 대한 임의의 항증식 효과가 없었다.
IIc-007a는 12개의 주석이 달린 판독값으로 활성이었으며 주요 바이오마커 활성의 매개된 변화를 생물학적 및 질병 분류별로 나열하였다. 주로 IIc-007a는 염증 관련 활성(감소된 sTNFα, MIP-1α; 증가된 IL-8; 조절된 MCP-1), 면역조절 활성(감소된 sIL-10, sIL-2), 및 조직 재형성 활성(감소된 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 콜라겐 III, PAI-1)에 영향을 주었다.
IIIc-061a는 본 연구에서 시험한 농도에서 세포독성이 없었다. IIIc-061a는 시험된 농도에서 이러한 인간 1차 세포에 대한 임의의 항증식 효과가 없었다. IIIc-061a는 6개의 주석이 달린 판독값으로 활성이었으며 주요 바이오마커 활성의 매개된 변화를 생물학적 및 질병 분류별로 나열하였다. IIIc-061a는 염증-관련 활성(감소된 I-TAC, MIG), 면역조절 활성(감소된 sIL-17A), 및 조직 재형성 활성(감소된 콜라겐 I, 콜라겐 III, PAI-1)에 영향을 주었다.
IVc-059a는 본 연구에서 시험한 농도에서 세포독성이 없었다. IVc-059a는 인간 1차 내피 세포에 대해 항증식성이었다(1.1 μM). IVc-059a는 3개의 주석이 달린 판독값으로 활성이었으며 주요 바이오마커 활성의 매개된 변화를 생물학적 및 질병 분류별로 나열하였다. IVc-059a는 염증-관련 활성(감소된 sTNFα) 및 면역조절 활성(감소된 sIL-10, sIL-2)에 영향을 주었다.
실시예 5.32: 인간 망막 색소 상피 세포(RPE) ARPE-19 및 인간 망막 내피 세포(HREC)에 대한 시험관 내 결과
당뇨병 상태에 의해 유도된 내부 및 외부 혈액 망막 장벽의 파괴에 대한 화합물 Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a 및 베바시주맙(BEVA))의 효과를 평가하였다. 두 가지 다른 농도의 화합물을 25 μM 및 50 μM의 Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a로 평가하였다. RT-PCR에 의한 mRNA 발현 수준을 사용하여 형광성 덱스트란 및 전염증성 사이토카인 생성에 대한 투과성을 평가함으로써 시험된 치료의 항투과성 효과에 관련된 작용 메커니즘을 탐구하였다.
외부 혈액 망막 장벽 조건 : 인간 망막 색소 상피 세포(RPE) 배양 ARPE-19, 자발적으로 불멸화된 인간 RPE 세포주를 American Type Culture Collection(미국 버지니아주 매너서스 소재)에서 입수하였다. ARPE-19 세포를 정상혈당(euglycaemic) 조건(D-글루코스(D-Glc), 5.5 mmol/L) 및 고혈당 조건(D-글루코스, 25 mmol/L)에서 10%(vol./vol.) FBS(Hyclone; Thermo Fisher Scientific, 미국 유타주 소재) 및 1%(vol./vol.) 페니실린/스트렙토마이신(Hyclone; Thermo Fisher Scientific)이 보충된 배지(DMEM/F12)에서 5%(vol./vol.) CO2 하 37℃에서 18일 동안 배양하였다. 계대 20의 ARPE-19 세포를 사용하였고 배지를 3 내지 4일마다 교체하였다. 투과성 연구를 위해, ARPE-19 세포를 0.33　cm2 HTS-Transwells(Costar; Corning, 미국 뉴욕주 소재)에서 400,000 세포/ml(80,000 RPE 세포/웰)로 씨딩하였다. 실시간 PCR을 위해, 웨스턴 블롯 분석 및 면역형광 세포를 20,000 세포/ml로 씨딩하였다.
실험 조건 및 처리: 정상 혈당 조건과는 별도로, 18개의 상이한 조건을 25 mmol/L D-글루코스 하에 배양된 세포에서 시험하였다.
조건 1) 대조군 세포는 5 mM D-글루코스 아떠한 처리도 하지 않음
조건 2) 당뇨병 환경에 의해 유발되는 세포 손상을 예방하는 효과를 평가하기 위해 세포를 당뇨병 환경 25mM D-글루코스 + 비히클(1일 1회 적용 시 15, 16 및 17일차)로 처리함.
조건 3, 4, 5, 6, 7, 8) 세포를 25 mM D-글루코스와 두 가지 상이한 농도의 각 생성물로 처리함: 잠재적인 세포독성 효과를 평가하기 위해 72시간(1일 1회 적용 시 15, 16 및 17일차) 동안 Ic-007a(3, 4) 25 μg/mL(=53 μM) 및 50 μg/mL(=107 μM); IIc-007a(5, 6) 25 μg/mL(=53 μM) 및 50 μg/mL(=107 μM); IVc-059a(7, 8) 20 μg/mL(=50 μM) 및 40 μg/mL(=100 μM).
조건 9) 잠재적인 세포독성 효과를 평가하기 위해 세포를 72시간(1일 1회 적용 시 15, 16 및 17일차) 동안 25 mM D-글루코스 및 베바시주맙(0.2 mg/ml)으로 처리함.
조건 10) = 당뇨병 환경; 단일층의 파괴를 유발하기 위해 48시간 동안(1일 1회 적용 시 16 및 17일차) 세포를 25 mM D-글루코스 + IL-1β(10 ng/ml) + TNF-α(25 ng/ml) + VEGF(25 ng/ml)로 처리함.
조건 11, 12, 13, 14, 15, 16) 당뇨병 환경에 의해 유발되는 세포 손상 예방 효과를 평가하기 위해 세포를 당뇨병 환경(25 mM D-글루코스 + IL-1β(10 ng/ml) + TNF-α(25 ng/ml) + VEGF(25 ng/ml)) + 2개 농도의 신규 화합물(Ic-007a, IIc-007a 및 IVc-059a(1일 1회 적용 시 15, 16 및 17일차))으로 처리함.
조건 17) 당뇨병 환경에 의해 유발되는 세포 손상 예방 효과를 평가하기 위해 세포를 당뇨병 환경(25 mM D-글루코스 + IL-1β(10 ng/ml) + TNF-α(25 ng/ml) +VEGF(25 ng/ml)) + 베바시주맙(0.2 mg/mL)(1일 1회 적용 시 15, 16 및 17일차)으로 처리함.
ARPE-19 투과성 측정: RPE 세포의 투과성을 이전에 문헌[Villarroel et al. Exp Eye Res, 2009, 89, 913-920]에 의해 보고된 절차에 따라 FITC-덱스트란(40 kDa)(Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)의 정점에서 기저외측으로의 움직임을 측정하여 18일차에 결정하였다.
내부 혈액 망막 장벽 조건 : Innoprot(스페인 비스케이 소재)에서 구입한 냉동 보존 세포 바이알에서 1차 인간 망막 내피 세포(HREC)를 수득하였다. 이 세포를 37℃에서 1시간 동안 0.1 mg/mL 콜라게나아제 유형 I로 소화된 사체 눈의 인간 망막 조직에서 단리하였다. 그런 다음, 최종적으로 CD31 항체가 코팅된 자기 비드(DynaBeads; Dynal, 노르웨이 오슬로 소재)로 내피 세포를 선택하였다. HREC를 실험실에서 해동하고 5.5 mM D-글루코스, 5% FBS(소태아 혈청), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 ECG(내피 세포 성장 보충제) 보충제(Innoprot, 스페인 비스케이 소재)를 함유하는 내피 기저 배지(EBM)에서 배양하였다. 5 μg/mL의 인간 피브로넥틴(MerckMillipore, 스페인 마드리드 소재)을 세포 부착에 사용하였다. 계대 2 내지 3의 세포를 실험에 사용하였다. 실험을 위해, HREC를 컨플루언스까지 성장시킨 다음 세포 배양 배지를 24시간 동안 1% FBS가 보충된 배지로 교체한 다음 상이한 처리에 노출시켰다.
조건/처리: ARPE-19 세포에서 실험에 대해 명시된 동일한 조건을 사용하였다.
HREC 투과성의 측정: HREC 단층의 투과성을 12 x 105 세포/웰(24웰, PCF 필터, Merk Millipore)의 투과성 지지체에서 수득하였다. 삽입물을 5% CO2-공기에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하여 단일층을 형성하였다. 마지막에, 배지는 처리를 진행하기 24시간 전에 혈청이 고갈되었다. 하부 챔버는 600 μL의 완전한 EBM 배지로 채우고 상부 챔버는 100 μL의 혈청 고갈된 세포 현탁액으로 채웠다(1%).
투과성의 변화를 감지하기 위해, 100 μg/ml의 형광성 FITC-덱스트란(Sigma, 스페인 마드리드 소재)을 삽입물의 상단에 첨가하였다. SpectraMax Gemini(Molecular Devices, 캘리포니아 서니베일 소재)에서 기저 구획으로부터 200 μL의 분취량을 매 30분 마다 여기/방출 485/528 nm의 파장에서 판독하였다. 마지막으로, 덱스트란의 농도를 표준 곡선의 형광 판독값을 외삽하여 결정하였다. 각 조건을 3회 중복하여 시험하였다.
세포 생존력 및 증식: HREC에서 세포 계수 및 MTT 분석을 수행하여 시험된 조건에서 세포의 생존력을 평가하였다. HREC의 생존력과 증식을 측정하였다. 간단히 말해서, 세포를 DAPI로 염색하고 형광 도립 현미경(V-RFL-T Olympus가 있는 Olympus iX71)으로 사진을 촬영하였다(20x). 세포 핵을 각 조건에 대해 세 가지 상이한 필드에서 Image J 소프트웨어의 도움으로 계산하였다. 실험을 3회 반복하였다. 또한, MTT 분석(Sigma, 스페인 마드리드 소재)를 사용하여 세포의 생존력을 평가하였다. 간단히 말해서, 처리 후 PBS 중 5 mg/ml MTT 10 μl를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 추가로 1시간 인큐베이션하였다. 배지를 제거하고, 얻어진 포르마잔 과립을 100% 디메틸설폭시드(DMSO)에 용해한 후 ELISA 플레이트 판독기(ELx800. Bio-Tek Instruments, 미국 버몬트주 소재)를 이용하여 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 분석은 상이한 조건 사이에서 세포 증식의 변화로 인한 결과의 잠재적 편향을 배제하였다.
작용 메커니즘:
- 전염증성 사이토카인을 ARPE-19 세포에서 RT-PCR로 평가하였고 IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-18, VEGF, IL-10, FGF에 대한 mRNA를 ΔCT를 수득하기 위한 관심 유전자 및 내인성 인간 B-액틴에 대한 Ct 값과 함께 이중 델타 CT 방법 2-ΔΔCT를 사용하여 측정하였다; mRNA 값을 25 mM D-Gluc 조건에 대한 상대적인 변화로 표현하였다. (참고: 문헌[Livak KJ, Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2ΔΔCT Method, Methods, 2001, 25(4), 402-408, doi 10.1006/meth.2001.1262])
- ROS 생산을 Cell Biolabs' OxiSelectTM Intracellular ROS 분석(녹색 형광)(Bionova, 스페인 마드리드 소재)을 사용하여 평가하였다. 이러한 분석은 세포-투과성 형광 프로브 2',7'-디클로로디히드로플루오레신 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하며, 세포 ROS에 의해 높은 형광성 2', 7'- 디클로로디히드로플루오레세인(DCF)으로 산화된다.
- HREC 단일층에서 엔도텔린-1, PDGF 및 VCAM-1 발현을 면역조직화학적 분석과 RT-PCR로 분석하였다.
- TJ 발현(ZO)을 면역조직화학적 분석에 의해 ARPE-19 및 HREC 단일층에서 분석하였다.
결과:
외부 혈액 망막 장벽(ARPE19 단일층) 및 내부 혈액 망막 장벽(HREC)의 투과성 결과를 표 58에 나타내었다. 화합물 Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a는 외부 및 내부 단일층의 투과성을 감소시켰다.
비-당뇨병 및 당뇨병 환경에 노출된 ARPE19 단일층 세포에서 ROS 및 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18 및 VEGF-mRNA의 생산에 대한 화합물 Ic-007a, IIc-007a, IVc-059a의 효과를 표 59에 나타내었다.
[표 58]
FITC-덱스트란 형광 누출을 사용한 외부 혈액 망막 장벽 및 내부 혈액 망막 장벽의 투과성(ng/mL/cm 2 ).
Figure pct00327
* 당뇨병 환경(25mM D-글루코스 + VEGF, TNF-α, IL-1β)과 비교하여 [ng/mL/cm2]에서 90분 후 측정된 FITC 덱스트란 누출에 대한 p<0.05
[표 59]
비-당뇨병 및 당뇨병 환경에서 ARPE19 단일층 세포에 의한 ROS 및 TNF-α, IL-1b, IL-6, IL-18 및 VEGF mRNA 생산.
Figure pct00328
25 mM D-글루코스에 대한 ROS %; R.Q. = 25 mM D-Gluc 조건에 대한 상대적 변화로 표현된 사이토카인 및 성장 인자 값에 대한 상대 정량화 mRNA.
* 25 mM D-Glc + VEGF + TNF-α + IL-1β(당뇨병 환경)와 화합물 Ic-007a, IIc-007a, IVc-059 사이의 p<0.05

Claims (15)

  1. 화학식 (I)의 치환된 하이드로퀴논:
    Figure pct00329

    (I)
    상기 식에서:
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
    R2 및 R3은 H 또는 R5이고, 단 R2 및 R3 중 하나는 R5인 경우, 다른 하나는 H이고 R2 및 R3 중 하나가 H인 경우, 다른 하나는 R5이고;
    R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R5 = R6, R7 또는 R8이고;
    R6 = CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, CONHCH(COOR4)(CH2)kR9이고; 여기서 k = 0 내지 4이고;
    R7 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 벤조헤테로아릴이고;
    R8 = (CH2)mX(CH2)pR9이고;
    X = O, S, SO2, NH, NAc, 또는 N(CH2)qR9이고;
    R9 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린, C=O, 또는 NHCO-R10으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 헤테로아릴이고;
    R10 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 헤테로아릴이고;
    여기서 R9 및 R10의 아릴은 페닐, 나프틸, 바이페닐기로부터 선택되는, 6 내지 14개 탄소 원자를 함유하는 방향족기이고; R9 및 R10의 헤테로아릴은 1 내지 14개 탄소 원자 및 하나 이상의 질소를 함유하는 방향족기이고;
    n, m, p 및 q는 독립적으로 1 내지 4임.
  2. 화학식 (I)의 화합물:
    Figure pct00330

    상기 식에서:
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
    R2 및 R3은 H 또는 R5이고, 단 R2 및 R3 중 하나는 R5인 경우, 다른 하나는 H이고 R2 및 R3 중 하나가 H인 경우, 다른 하나는 R5이고;
    R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)를 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R5 = R6, 또는 R7이고,
    R6 = CONH-R9, CONHCOR9, CONH(CH2)n-R9, 또는 CONHCH(COOR4)(CH2)kR9이고; 여기서 k = 0 내지 4이고;
    R7 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 벤조헤테로아릴이고;
    R9 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린, C=O, 또는 NHCO-R10으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 헤테로아릴이고;
    R10 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 아릴, 헤테로아릴이고; 여기서 R9 및 R10의 아릴은 페닐, 나프틸, 바이페닐 중에서 선택되는, 6 내지 14개 탄소 원자를 함유하는 방향족기이고; R9 및 R10의 헤테로아릴은 1 내지 14개 탄소 원자 및 하나 이상의 질소를 함유하는 방향족기이고; n은 독립적으로 1 내지 4임.
  3. 제2항에 있어서, 상기 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = COOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH-R9이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = COOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R3 = H이고; R2 = R5이고
    R5 = R6 = CONH-R9이거나
    상기 화합물은:
    4-(2-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-4-(2-설포페닐아미노카보닐)벤조산;
    4-(3-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(3-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-4-(3-설포페닐아미노카보닐)벤조산;
    4-(4-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(4-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-4-(4-설포페닐아미노카보닐)벤조산;
    4-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(4-카복시-3-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3,5-비스(2,5-디히드록시-4-카복시벤조일아미노)벤조산;
    3-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산;
    2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산;
    2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산;
    4-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산;
    5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산;
    2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산;
    6-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    6-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산;
    6-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산;
    2-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산;
    3-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산;
    5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    3-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    5-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산;
    4-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    4-(4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    4-(4-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(3-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-4-(3-(1-히드록시-1H-피라졸-4-일)페닐아미노카보닐)벤조산;
    4-(2-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    에틸 4-(2-(에톡시카보닐)페닐아미노카보닐)-2,5-디아세톡시벤조에이트;
    에틸 4-(2-(에톡시카보닐)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트;
    에틸 4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디아세톡시벤조에이트;
    에틸 4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트;
    에틸 2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐아미노카보닐)벤조에이트;
    에틸 3,5-비스(2,5-디아세톡시-4-에톡시카보닐벤조일아미노)벤조에이트;
    에틸 3,5-비스(2,5-디히드록시-4-에톡시카보닐벤조일아미노)벤조에이트;
    에틸 3-(4-(에톡시카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코티네이트;
    에틸 4-(4-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트;
    3-(2-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-3-(2-설포페닐아미노카보닐)벤조산;
    3-(3-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(3-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-3-(3-설포페닐아미노카보닐)벤조산;
    3-(4-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(4-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-3-(4-설포페닐아미노카보닐)벤조산;
    3-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(4-카복시-3-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3,5-비스(2,5-디히드록시-3-카복시벤조일아미노)벤조산;
    3-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산;
    2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산;
    2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산;
    4-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산;
    5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산;
    2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산;
    6-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    6-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산;
    6-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산;
    2-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산;
    3-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산;
    5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    3-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산
    5-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산;
    4-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    4-(3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    3-(4-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(3-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-3-(3-(1-히드록시-1H-피라졸-4-일)페닐아미노카보닐)벤조산;
    3-(2-(카복시메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    에틸 3-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트; 및
    에틸 3-(2-(에톡시카보닐메틸)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조에이트;
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = SO3H이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH-R9이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = SO3H이고;
    R3 = H이고; R2 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH-R9이거나
    상기 화합물은:
    2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산;
    2,5-디히드록시-4-(2-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산;
    3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산;
    2,5-디히드록시-4-(3-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산;
    4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산;
    2,5-디히드록시-4-(4-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산;
    5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-5-히드록시벤조산;
    3,5-비스(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산;
    3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)프탈산;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)테레프탈산;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)이소프탈산;
    4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)프탈산;
    5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)이소프탈산;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)니코틴산;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)이소니코틴산;
    6-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)니코틴산;
    6-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피콜린산;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산;
    6-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산;
    3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)이소니코틴산;
    5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)니코틴산;
    5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피콜린산;
    3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피콜린산;
    5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산;
    4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)니코틴산;
    4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)피콜린산;
    (4-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)페닐)아세트산;
    (3-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)페닐)아세트산;
    (2-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)페닐)아세트산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)벤조산;
    2,5-디히드록시-3-(2-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산;
    3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)벤조산;
    2,5-디히드록시-3-(3-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산;
    4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)벤조산;
    2,5-디히드록시-3-(4-설포페닐아미노카보닐)벤젠설폰산;
    5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-5-히드록시벤조산;
    3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-5-(2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)벤조산
    3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)프탈산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)테레프탈산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)이소프탈산;
    4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)프탈산;
    5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)이소프탈산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)니코틴산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)이소니코틴산;
    6-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)니코틴산;
    6-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피콜린산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산;
    6-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산;
    3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)이소니코틴산;
    5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)니코틴산;
    5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피콜린산;
    3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피콜린산;
    5-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산;
    4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)니코틴산;
    4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)피콜린산;
    (4-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)페닐)아세트산;
    (3-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)페닐)아세트산; 및
    (2-(2,5-디히드록시-3-설포벤즈아미도)페닐)아세트산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H이고,
    R1 = (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R2 = H 또는 R5이고, R3 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH-R9이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = (CH2)nCOOR4; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R3 = H이고; R2 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH-R9이거나;
    상기 화합물은:
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산;
    (2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (2,5-디히드록시-4-(2-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산;
    3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산;
    (2,5-디히드록시-4-(3-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산;
    4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산;
    2-(2,5-디히드록시-4-(4-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산;
    5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-히드록시벤조산;
    3,5-비스(2,5-디히드록시-4-카복시메틸벤조일아미노)벤조산
    3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산;
    4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산;
    5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산;
    6-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    6-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산;
    6-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산;
    3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산;
    5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    5-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산;
    4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    (4-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산;
    (3-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산;
    (2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산;
    메틸 2-(4-(에톡시카보닐메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조에이트;
    에틸 (4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세테이트;
    디에틸 5-(4-(에톡시카보닐메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈레이트;
    메틸 3,5-비스(4-(에톡시카보닐메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조에이트;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산;
    (2,5-디히드록시-3-(2-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산;
    3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산;
    (2,5-디히드록시-3-(3-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산;
    4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)벤조산;
    (2,5-디히드록시-3-(4-설포페닐아미노카보닐)페닐)아세트산;
    5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-히드록시벤조산;
    3,5-비스(2,5-디히드록시-3-카복시메틸벤조일아미노)벤조산
    3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)테레프탈산;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산;
    4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)프탈산;
    5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소프탈산;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산;
    6-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    6-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-플루오로니코틴산;
    6-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-2,5-디카복실산;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피리딘-3,5-디카복실산;
    3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)이소니코틴산;
    5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    5-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-플루오로이소니코틴산;
    4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)니코틴산;
    4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)피콜린산;
    (4-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산;
    (3-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산; 및
    (2 -(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시벤즈아미도)페닐)아세트산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = CONH-R10이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH-R9이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = CONH-R10이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R3 = H이고; R2 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH-R9이거나.
    상기 화합물은:
    5-(4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    N1,N4-비스(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐)-2,5-디히드록시테레프탈아미드;
    5-(4-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    5-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-3-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시벤젠설폰산;
    4-(4-(4-카복시-3-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    4-(2,5-디히드록시-4-(3-히드록시-4-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시벤젠설폰산;
    2-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-2-카복시페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-5-히드록시벤조산;
    2-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-2-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-5-히드록시벤젠 설폰산;
    메틸 5-(4-(2-(1H-테트라졸-5-일)페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조에이트;
    메틸 5-(2,5-디아세톡시-4-(4-아세톡시-3-(메톡시카보닐)페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-아세톡시벤조에이트;
    메틸 5-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-3-(메톡시카보닐)페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시벤조에이트;
    메틸 2-(2,5-디히드록시-4-(4-히드록시-2-(메톡시카보닐)페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-5-히드록시벤조에이트;
    1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에틸 5-[[4-[[3-[1-(2,2-디메틸프로판오일옥시)에톡시카보닐]-4-히드록시-페닐]아미노카보닐]-2,5-디히드록시-벤조일]아미노]-2-히드록시벤조에이트
    5-(3-(3-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    5-(2,5-디히드록시-3-(4-히드록시-3-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시벤젠설폰산;
    4-(3-(3-히드록시-4-카복시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-2-히드록시벤조산;
    4-(2,5-디히드록시-3-(3-히드록시-4-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-2-히드록시벤젠설폰산;
    2-(3-(2-카복시-4-히드록시페닐아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤즈아미도)-5-히드록실벤조산; 및
    2-(2,5-디히드록시-3-(4-히드록시-2-설포페닐아미노카보닐)벤즈아미도)-5-히드록시벤젠설폰산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  7. 제2항에 있어서, 상기 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R6 = CONHCOR9이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R3 = H이고; R2 = R5이고;
    R5 = R6 = CONHCOR9이거나;
    상기 화합물은:
    N-(1,3,4,5-테트라히드록시사이클로헥실카보닐) 4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(4-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 4-카복시-2,5-디히드록시-벤즈아미드;
    N-(3-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 4-카복시-2,5-디히드록시-벤즈아미드;
    N-(3,4-디히드록시벤조일) 4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(3,5-디히드록시벤조일) 4-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(1,3,4,5-테트라히드록시사이클로헥실카보닐) 3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(4-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 3-카복시-2,5-디히드록시-벤즈아미드;
    N-(3-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 3-카복시-2,5-디히드록시-벤즈아미드;
    N-(3,4-디히드록시벤조일) 3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(3,5-디히드록시벤조일) 3-카복시-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(1,3,4,5-테트라히드록시사이클로헥실카보닐) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(4-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시-벤즈아미드;
    N-(3-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시-벤즈아미드;
    N-(3,4-디히드록시벤조일) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(3,5-디히드록시벤조일) 4-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(1,3,4,5-테트라히드록시사이클로헥실카보닐) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드;
    N-(4-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시-벤즈아미드;
    N-(3-카복시-2,5-디히드록시벤조일) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시-벤즈아미드;
    N-(3,4-디히드록시벤조일) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드; 및
    N-(3,5-디히드록시벤조일) 3-카복시메틸-2,5-디히드록시벤즈아미드
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  8. 제2항에 있어서, 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R3 = H이고; R2 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9이거나;
    상기 화합물은:
    4-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(3,5-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-4-((3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)메틸아미노카보닐)벤조산;
    4-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(3-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(4-카복시페닐메틸아미노카보닐) 2,5-디히드록시벤조산;
    3-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(3,5-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    2,5-디히드록시-3-((3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)메틸아미노카보닐)벤조산;
    3-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(3-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(4-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    (4-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (4-(3,5-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (4-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (2,5-디히드록시-4-((3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)메틸아미노카보닐)페닐)아세트산;
    (4-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (4-(3-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (4-(4-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (3-(3,4-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (3-(3,5-디히드록시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (3-((4,5-디히드록시-3-옥소사이클로헥스-1-에닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (2,5-디히드록시-3-((3,4,5-트리히드록시사이클로헥실)메틸카보닐아미노)페닐)아세트산;
    (3-(2-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산;
    (3-(3-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산; 및
    (3-(4-카복시페닐메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  9. 제2항에 있어서, 화합물은:
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = SO3H이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R6 = CONH(CH2)n-R9이거나;
    상기 화합물은:
    2-((2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)메틸)벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)메틸)벤조산; 및
    4-((2,5-디히드록시-4-설포벤즈아미도)메틸)벤조산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  10. 제2항에 있어서, 상기 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R6 = CONHCH(COOR4)(CH2)kR9이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = COOR4; (CH2)nCOOR4이고; R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R3 = H이고; R2 = R5이고;
    R5 = R6 = CONHCH(COOR4)(CH2)kR9이거나;
    상기 화합물은:
    4-(1-카복시-2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-(1-카복시-2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산
    3-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시벤조산;
    (4-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산; 및
    (3-(카복시(3,4-디히드록시페닐)메틸아미노카보닐)-2,5-디히드록시페닐)아세트산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  11. 제2항에 있어서, 상기 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10이고;
    R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R7 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 벤조헤테로아릴이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H이고;
    R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10이고;
    R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R3 = H; R2 = R5이고;
    R5= R7 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, OR4, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된 벤조헤테로아릴이거나;
    상기 화합물은:
    2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산;
    메틸 2-(4-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실레이트;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산;
    2-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산;
    2-(2,5-디히드록시-4-설포페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산;
    2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산;
    2-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산;
    2-(2,5-디히드록시-3-설포페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산;
    2-(4-(카복시메틸)-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산;
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-4-카복실산; 및
    2-(3-(카복시메틸)-2,5-디히드록시페닐)-1H-벤조[d]이미다졸-5-카복실산
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  12. 화학식 (I)의 화합물:
    Figure pct00331

    상기 식에서:
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, 또는 CONH-R10이고;
    R2 및 R3은 H 또는 R5이고, 단 R2 및 R3 중 하나는 R5인 경우, 다른 하나는 H이고 R2 및 R3 중 하나가 H인 경우, 다른 하나는 R5이고;
    R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R5 = R8이고
    R8 = (CH2)mX(CH2)pR9이고;
    X = O, S, SO2, NH, NAc, 또는 N(CH2)qR9이고;
    R9 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 플루오린, C=O, 또는 NHCO-R10으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된, 아릴, 헤테로아릴이고;
    R10 = COOR4, (CH2)nCOOR4, (CH2)nSO3H, OR4, SO3H, 아졸 [5-원 N-함유 헤테로환], 또는 플루오린으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 기로 치환된, 아릴, 헤테로아릴이고;
    여기서 R9 및 R10의 아릴은 페닐, 나프틸, 또는 바이페닐기 중에서 선택되는, 6 내지 14개 탄소 원자를 함유하는 방향족기이고;
    R9 및 R10의 헤테로아릴은 1 내지 14개 탄소 원자 및 하나 이상의 질소를 함유하는 방향족기이고;
    n, m, p 및 q는 독립적으로 1 내지 4임.
  13. 제12항에 있어서, 상기 화합물은:
    (A)
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10이고;
    R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R2 = H이고; R3 = R5이고;
    R5 = R8 = (CH2)mX(CH2)pR9이고;
    여기서 X = O, S, SO2, NH, NAc, 또는 N(CH2)qR9이거나;
    (B)
    Ra, Rb = H, C1-4아실, 아릴C1-4알킬, C6-C10아릴CO, HOOC(CH2)nCO, C1-C7알킬NHCO, 포스포노, 포스포노옥시메틸, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, 또는 C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸이고;
    R1 = COOR4, (CH2)nCOOR4, SO3H, (CH2)nSO3H, CONH-R10이고;
    R4 = H, C1-4알킬, 아릴C1-4알킬, 모폴리노-C1-C6알킬, 피롤리디노-C1-C6알킬, N-메틸피페라지노-C1-C6알킬을 포함하는 기능화된 C1-C6알킬, o-메톡시페닐(구아이아콜 에스터)을 포함하는 C6-C10아릴, C1-C6아실옥시메틸, C1-C6아실옥시-1-에틸, C1-C6알콕시카보닐옥시메틸, C1-C6알콕시카보닐옥시-1-에틸, 또는 (옥소디옥솔릴)메틸이고;
    R3 = H; R2 = R5이고;
    R5 = R8 = (CH2)mX(CH2)pR9이고;
    여기서 X = O, S, SO2, NH, NAc, 또는 N(CH2)qR9이거나;
    상기 화합물은:
    비스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민;
    4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸아미노)메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸아미노)메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    비스(2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸)아민;
    N,N-비스(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세트아미드;
    N-(2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸) N-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세트아미드;
    N-(2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸) N-(4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세트아미드;
    N,N-비스(2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸)아세트아미드;
    4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산;
    4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산;
    4-((2,5-디히드록시-4-카복시페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    4-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산;
    트리스 (4-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민;
    트리스 (4-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐메틸)아민;
    비스(3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민;
    3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸아미노)메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸아미노)메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    비스(2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸)아민;
    N,N-비스(3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세트아미드;
    N-(2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸) N-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세트아미드;
    N-(2,5-디히드록시-4-설포페닐메틸) N-(3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아세트아미드;
    N,N-비스(2,5-디히드록시-3-설포페닐메틸)아세트아미드;
    3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸티오메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산;
    3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산;
    3-((2,5-디히드록시-3-카복시페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-4-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤조산;
    3-((2,5-디히드록시-3-설포페닐)메톡시메틸)-2,5-디히드록시벤젠설폰산;
    메틸 3-((2,5-디아세톡시-3-메톡시카보닐페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-디아세톡시벤조에이트;
    메틸 3-((2,5-디히드록시-3-메톡시카보닐페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-히드록시벤조에이트;
    2-모폴리노에틸 3-((2,5-디히드록시-3-(2-모폴리노에톡시카보닐)페닐)메틸설포닐메틸)-2,5-히드록시벤조에이트;
    트리스 (3-카복시-2,5-디히드록시페닐메틸)아민; 및
    트리스 (3-에톡시카보닐-2,5-디히드록시페닐메틸)아민
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 치료학적 유효량, 또는 이의 입체 이성질체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  15. 자가면역, 면역학적, 류마티스성, 혈관 장애, 안과학적 장애, 섬유성 장애, 대사 및 위장 장애, 신경염증성 및 신경퇴행성 질환, 신생물 및 암 관련 장애, 호르몬 관련 질환, 또는 바이러스 및/또는 박테리아 감염 질환 및/또는 이들의 합병증으로부터 야기되는 면역학적 장애를 치료 및/또는 예방하는 방법으로 사용되는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물.
KR1020227034586A 2020-03-11 2021-03-08 약제로서 유용한 적어도 하나의 카복시기, 설포기 또는 아미도기를 갖는 2,5- 또는 2,6-이치환된 하이드로퀴논 유도체 KR20220152549A (ko)

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