KR20230091107A - 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 보존 방법 - Google Patents
인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 보존 방법 Download PDFInfo
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Abstract
인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 높은 생존율을 유지한 채로 보존하고, 또한 보존 후의 배양에 있어서 협잡 세포의 발생 비율을 작게 억제한다. ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식시킨 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 이하에 기재한 (a)∼(d) 중 어느 하나 또는 복수의 조건을 만족하는 시기에 채취하고, 현탁 상태로 하여 보존하는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 보존 방법. (a) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 방추상의 형태로부터 장경단경의 비가 1에 가까운 다각형상 또는 원형상의 형태로 변한 직후부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다. (b) CD44의 발현량이 직근의 계대 후에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기에 이를 때까지의 기간이다. (c) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900 세포/㎟ 이상 2,500 세포/㎟ 이하이다. (d) 직근의 계대로부터의 배양 일수가 4일 이상 14일 이하이다.
Description
본 발명은 보존한 후에 재차 배양함으로써 분화 성숙하여, 인간 각막 내피 세포 기능 특성을 발현할 수 있는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 보존 방법에 관한 것이다.
생체 외에서 인간 각막 내피 세포를 배양하는 방법으로는 특허문헌 1, 비특허문헌 1 및 비특허문헌 2에 나타낸 것과 같이 상피 성장 인자(EGF)를 부여하고, EGF를 부여하는 것에 의한 인간 각막 내피 세포의 성숙·분화에 대한 악영향을 억제하는 다른 인자를 추가로 부여함으로써 배양하는 방법이 알려져 있다.
이것에 대하여, 본 발명자들은 특허문헌 2 및 특허문헌 3에 나타낸 것과 같이 상피 성장 인자(EGF)를 가능한 한 부여하지 않고 인간 각막 내피 세포를 배양하는 방법을 개발하였다. 이 특허문헌 2 또는 특허문헌 3에 기재된 배양 방법에 의하면, 특허문헌 1, 비특허문헌 1 및 비특허문헌 2에 기재된 배양 방법에 비해 인간 각막 내피 기능 특성을 갖지 않는 협잡 세포의 발생을 가능한 한 억제하고, 인간의 생체 내에 존재하는 각막 내피 세포와 동등한 각막 내피 기능 특성을 갖는 기능성 인간 각막 내피 세포(이하, "이펙터(effector) 세포"라고도 함)의 함유율을 향상시킨 세포 집단을 얻을 수 있다.
그렇지만, 특허문헌 2 또는 특허문헌 3에 기재된 방법으로 배양된 세포 집단 또는 이 세포 집단에 포함되는 기능성 인간 각막 내피 세포를 현탁 상태로 하여 보존하는 방법은 아직 확립되어 있지 않다.
Vianna L.M.M., et al. (2016) Arg Bras Oftalmol.;79(1):37
Okumura N., et al. (2019) PLos ONE 14(6):e0218431
전술한 특허문헌 2 또는 특허문헌 3에 기재된 방법으로 배양된 세포 집단 또는 이 세포 집단에 포함되는 기능성 인간 각막 내피 세포를 재생 의료 등의 제품으로 국제적으로 공급하려면 상기 세포 집단 또는 상기 기능성 인간 각막 내피 세포를 단층 배양의 상태가 아니라 현탁 상태로 하여 적어도 수일 동안은 보존할 수 있도록 하는 것이 요망된다.
여기서, 본 발명자는 특허문헌 2 또는 특허문헌 3에 기재된 방법으로 배양된 세포 집단 또는 기능성 인간 각막 내피 세포를 현탁 상태로 하여 적어도 수일 동안 보존하는 방법에 대해 검토하였다.
더하여, 세포의 수년 이상에 걸치는 장기 보존이나 세포의 은행화에는 동결 보존이 유익하므로, 기능성 인간 각막 내피 세포를 동결 보존하는 방법의 확립에 대해서도 검토하였다.
특허문헌 2 또는 특허문헌 3에 기재되어 있는 방법에 의해 인간 각막 내피 세포를 증식시켜 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율(이하, "E-ratio"라고도 함)이 90%보다 높은 세포 집단이 될 때까지 성숙 분화시키기 위해서는 4∼5주간 이상 배양하는 것이 필요하다.
여기서, 우선은 특허문헌 2 또는 특허문헌 3에 기재된 방법으로 4주간 이상 배양해 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 90%보다 높은 세포 집단이 될 때까지 성숙 분화시킨 세포 집단을 채취해 현탁 상태로 하여 보존하는 것을 시험하였다.
그 결과, 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 90%보다 높은 세포 집단이 될 때까지 성숙 분화시킨 후의 세포 집단을 현탁 상태로 하여 보존하면 보존 후의 생존율이 낮고, 보존 후의 배양에 있어서 협잡 세포의 발생 비율이 높아져 버리는 것을 알 수 있었다.
이 결과를 받고, 본 발명자는 인간 기능성 각막 내피 세포(특허문헌 2 또는 특허문헌 3에 기재된 방법으로 배양한 것)를 유리하게 높은 생존율을 유지한 채로 현탁 상태로 보존하고, 또한 협잡 세포의 발생을 억제하는 방법에 대한 개발을 행하였다.
그 결과, 본 발명자는 기능성 인간 각막 내피 세포로 분화하는 운명이 결정된 직후이고, 또한 증식력이 높은 시기에 세포 집단을 채취해 현탁 상태로 하면, 높은 생존율을 유지한 채로 보존하고, 또한 보존 후의 배양에 있어서 협잡 세포의 발생 비율을 작게 억제할 수 있음을 발견하고, 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 신규하고, 또한 개량된 보존 방법(및 그것에 사용하는 관련 조성물)을 확립시켰다.
또, 본 발명자는 기능성 인간 각막 내피 세포로 분화하는 운명이 결정된 직후이고, 또한 증식력이 높은 시기에 세포 집단을 채취해 보존할 수 있다면, 동시기에 세포를 채취하고 계대 배양을 반복함으로써 종래에 비해 매우 짧은 기간에서의 기능성 인간 각막 내피 세포의 확대 배양이 가능하다고 생각해 기능성 인간 각막 내피 세포의 확대 배양 방법도 확립시켰다.
이와 같이, 본 발명은 적절한 배양 조건으로 배양됨으로써 기능성 인간 각막 내피 세포가 되는 것으로 운명이 정해진 세포이면, 그 세포를 미성숙의 상태로 채취해 보존 또는 계대함으로써, 생존율 향상 및 협잡 세포 저감이라고 하는 목적하는 성질을 갖는 기능성 인간 각막 내피 세포를 얻을 수 있음을 본 발명자가 발견하고 처음으로 완성한 것이다.
즉, 본 발명에 관한 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 보존 방법은 이하와 같다.
[항목 1] ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)가 비첨가 혹은 EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식시킨 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 이하에 기재한 (a)∼(d) 중 어느 하나 또는 복수의 조건을 만족하는 시기에 채취하고, 현탁 상태로 하여 보존하는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 보존 방법.
(a) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 섬유아세포 모양의 형태로부터 상기 돌기를 포함한 장단경(長短徑)의 비가 1(예를 들면, 약 2:1∼약 1:2)에 가까운 부석상(敷石狀)(예를 들면, 다각형상 또는 원형상)의 형태로 변한 직후부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다.
(b) CD44의 발현량이 직근(直近)의 계대 후에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기(plateau)에 이를 때까지의 기간이다.
(c) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 약 900 세포/㎟ 이상 약 2,500 세포/㎟ 이하이다.
(d) 파종하고 나서부터의 배양 일수가 약 4일 이상 약 14일 이하이다.
[항목 2] 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 대략 10℃ 이하 보존하는 [항목 1]에 기재된 보존 방법.
[항목 3] 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 대략 -30℃ 이하로 보존하는 [항목 1] 또는 [항목 2]에 기재된 보존 방법.
[항목 4] 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 현탁 상태로 하고 나서 약 24시간 이상 보존하는 [항목 1]∼[항목 3] 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법.
[항목 5] 상기 형질전환이 내피 간엽 전환을 포함하는 [항목 1]∼[항목 4] 중 어느 한 항에 기재된 방법.
[항목 6] 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포가 각막 내피 세포 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 각막 내피로부터 채취한 각막 내피 전구세포, 각막 내피로부터 채취한 세포, 및 직접 프로그래밍법으로 제작되는 각막 내피 전구세포 및 각막 내피 모양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 기원으로 하여 작성된 것인 [항목 1]∼[항목 5] 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법.
[항목 7] 보존 후의 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식 및/또는 분화·성숙시켜 얻은 인간 각막 내피 세포의 세포 집단이 이하의 (1)∼(8) 중 1 또는 복수의 항목을 만족하는 것인 [항목 1]∼[항목 6] 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법.
(1) 위상차 화상에 의한 외관 검사에서 섬유아세포, 이물, 변색, 또는 다른 이상이 없다.
(2) 세포 생존율이 트리판 블루(trypan blue) 염색에서 70% 이상이다.
(3) 세포 상청의 ELISA에 의한 순도 시험에서 PDGF-BB가 100 pg/㎖ 이상이다.
(4) 세포의 FACS에 의한 순도 시험 결과가 이하의 범위를 모두 만족하는 것이다.
CD166+ > 99%
CD24+ < 5%
CD44high < 5%
CD44neg∼low > 90%
CD90+ < 5%
(5) 인간 각막 내피 기능을 갖는 이펙터 세포의 함유율(E-ratio)이 90%보다 높다.
(6) 펌프 기능(Na+/K+ ATPase)이 양성이다.
(7) 배리어(barrier) 기능(ZO-1)이 양성이다.
(8) 인간 각막 내피 세포 밀도(ECD)가 1,500 세포/㎟ 이상이다.
[항목 8] 상기 이펙터 세포가 내피 간엽계 이행이 일어나지 않은 것인 [항목 7]에 기재된 보존 방법.
[항목 9] 상기 이펙터 세포가 상기 각막 내피 기능 특성을 발휘하기 위해 필요한 기능 단백을 발현하고 있거나, 또는 상기 각막 내피 기능 특성을 저해하는 저해 단백이 발현되지 않는 혹은 저해 단백의 발현이 저하되어 있는 것인 [항목 7] 또는 [항목 8]에 기재된 보존 방법.
[항목 10] 상기 기능 단백이 Na+/K+ ATPase, ZO-1, 나트륨/수소 교환체 1(NHE1), 아쿠아포린 1(AQP-1) 및 탄산탈수효소 5B(CA5B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수를 포함하는 [항목 9]에 기재된 보존 방법.
[항목 11] 상기 기능 단백이 시트르산 신타아제(CS), 아코니타아제 2(ACO2), 이소시트르산 탈수소효소 2(IDH2), 말산 탈수소효소 2(MDH2), 말산 효소 3(ME3), ACSS1, 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제 1(ACAT1), 피루브산 탈수소효소(PDH), BCAT2, 및 분기쇄 케토산 탈수소효소 2(BCKDH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 대사 관련 효소를 추가로 포함하는 [항목 9] 또는 [항목 10]에 기재된 보존 방법.
[항목 12] 상기 저해 단백이 ATP 시트르산 리아제(ACLY), 아코니타아제 1(ACO1), 이소시트르산 탈수소효소 1(IDH1), 말산 탈수소효소 1(MDH1), 말산 효소 1(ME1), ACSS2, 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제 2(ACAT2) 및 락트산 탈수소효소(LDH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종 이상의 대사 관련 효소를 포함하는 [항목 9]∼[항목 11] 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법.
또, 본 발명은 이하의 발명도 제공하는 것이다.
[항목 13] [항목 1]∼[항목 12] 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법으로 보존된 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포.
[항목 14] [항목 1]∼[항목 12] 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법으로 보존된 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 현탁액.
[항목 15] [항목 1]∼[항목 12] 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법으로 보존된 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를, ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식 및/또는 분화·성숙시키는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포의 제조 방법.
[항목 16] ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식시킨 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 이하에 기재한 (a)∼(d) 중 어느 하나 또는 복수의 조건을 만족하는 시기에 채취하고, 현탁 상태로 하는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 현탁액 제조 방법.
(a) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 섬유아세포 모양의 형태로부터 상기 돌기를 포함한 장경단경의 비가 1에 가까운 부석상의 형태로 변한 직후부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다.
(b) CD44의 발현량이 직근의 계대 후에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기에 이를 때까지의 기간이다.
(c) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900 세포/㎟ 이상 2,500 세포/㎟ 이하이다.
(d) 직근의 계대로부터의 배양 일수가 4일 이상 14일 이하이다.
[항목 17] ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식시킨 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 이하에 기재한 (a)∼(d) 중 어느 하나 또는 복수의 조건을 만족하는 시기에 채취하고, 계대하는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 배양 방법.
(a) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 섬유아세포 모양의 형태로부터 장경단경의 비가 1에 가까운 부석상의 형태로 변한 직후부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다.
(b) CD44의 발현량이 직근의 계대 후에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기에 이를 때까지의 기간이다.
(c) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900 세포/㎟ 이상 2,500 세포/㎟ 이하이다.
(d) 직근의 계대로부터의 배양 일수가 4일 이상 14일 이하이다.
본 발명에 의하면, 보존 후에 재차 배양함으로써 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 대략 90%보다 높은 세포 집단을 얻을 수 있는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 높은 생존율을 유지한 채로 적어도 수일 이상 보존할 수 있다.
그 결과, 재차 배양함으로써 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 대략 90%보다 높은 세포 집단을 재생 의료 등의 제품으로 국제적으로 공급하는 것이 가능해진다.
나아가서는, 동결 보존에 의해 마스터 세포 은행화가 가능해져, 재생 의료 등의 제품으로의 제조를 보다 효율적 및 계획적으로 행할 수 있게 된다.
[도 1] 배양 인간 각막 내피 세포의 배양 조건에 의한 세포 형태의 차이를 나타내는 위상차 현미경 사진이다(계대(Passage) 3).
[도 2] 배양 조건 2에 있어서, 계대 7까지 계대 배양한 배양 인간 각막 내피 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 3] 배양 조건 1로 배양한 계대 3의 세포 및 배양 조건 2로 배양한 계대 3 혹은 계대 7의 세포의 세포 표면 항원의 해석 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 4] 배양 조건 2로 배양한 계대 7의 세포에 대하여, Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 면역 염색법에 따라 조사한 결과를 나타내는 사진이다.
[도 5] 계대 0으로부터 배양 조건 2로 배양한 세포의 계대 7에서의 위상차 현미경 사진이다.
[도 6] 도 5의 세포에 대한 세포 표면 항원 등의 발현의 양상을 나타내는 사진 및 그래프이다.
[도 7] 본 발명의 일 실시예에 관한 동결 보존 후의 세포의 트리판 블루 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 8] 동결 보존 후에 배양 조건 2로 배양한 배양 인간 각막 내피 세포의 세포 형태의 경시 변화를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
[도 9] 동결 보존한 세포와 동결 보존하지 않고 계속 배양한 세포의 형태를 비교하는 위상차 현미경 사진이다.
[도 10] 동결 보존한 세포와 동결 보존하지 않고 계속 배양한 세포의 세포 표면 항원의 해석 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 11] 동결 보존 후의 세포에 대하여, Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 확인한 형광 현미경 사진이다.
[도 12] 세포의 보존에 적절한 채취 시기를 비교 해석하는 순서를 설명하는 도면이다.
[도 13] 도 12의 각 채취 시기에서의 세포 형태를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
[도 14] 각 채취 시기에서의 동결 보존 후의 세포의 생존율을 나타내는 도면 그래프 및 사진이다.
[도 15] 도 14의 동결 보존 후에 해동한 세포를 배양 조건 2로 35일간 배양한 세포와 동결 보존하지 않고 계대 배양한 세포의 형태를 비교하는 위상차 현미경 사진이다.
[도 16] 도 14의 동결 보존 후에 해동한 세포를 배양 조건 2로 35일간 배양한 세포와 동결 보존하지 않고 계대 배양한 세포의 표면 항원을 비교하는 그래프이다.
[도 17] 도 14의 동결 보존 후에 해동한 세포를 배양 조건 2로 35일간 배양한 세포와 동결 보존하지 않고 계대 배양한 세포의 면역 염색 결과를 비교하는 사진이다.
[도 18] 세포의 보존에 적절한 채취 시기를 비교 해석하는 순서를 설명하는 도면이다.
[도 19] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다.
[도 20] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포의 세포 표면 항원 등의 발현의 양상을 나타내는 그래프이다.
[도 21] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포의 세포 표면 항원 등의 발현의 양상을 나타내는 그래프이다.
[도 22] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포의 세포 표면 항원 등의 발현의 양상을 나타내는 그래프이다.
[도 23] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포에서의 Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 확인한 형광 현미경 사진이다.
[도 24] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포에서의 Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 확인한 형광 현미경 사진이다.
[도 25] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포에서의 Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 확인한 형광 현미경 사진이다.
[도 26] 배양 조건 2로 배양한 경우의 세포 형태의 경일(經日) 변화를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
[도 27] 배양 조건 2로 배양한 경우의 세포 형태의 경일 변화를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
[도 28] 배양 조건 2로 배양한 경우의 CD44의 발현량의 경일 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 29] 배양 조건 2로 배양한 경우의 ECD의 경일 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 30] 동결 보존 후, 배양 조건 2로 배양한 세포의 위상차 현미경 사진, 표면 항원의 해석 결과를 나타내는 그래프 및 면역 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 31] 빙온 보존 후의 배양 인간 각막 내피 세포의 트리판 블루 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 32] 도 31의 결과로부터 산출된 생존율을 나타내는 그래프이다.
[도 33] 각 보존액을 사용한 경우의 빙온 보존 후의 세포의 트리판 블루 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 34] 도 33의 결과로부터 산출된 생존율을 나타내는 그래프이다.
[도 35] 순화 배지를 보존액으로 빙온 보존한 후, 회복 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 36] 순화 배지를 보존액으로 빙온 보존한 후, 회복 배양한 세포의 면역 염색 결과를 나타내는 사진이다.
[도 37] 해동 후 8∼10일 간격으로 계대 8까지 계대 배양한 세포의 증식률과 위상차 현미경 사진이다.
[도 38] 도 29의 세포를 계대한 계대 9를 배양 조건 2로 34일간 배양한 세포의 위상차 현미경 사진 및 표면 항원의 해석 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 39] 실시예 13에서의 세포의 배양 조건을 설명하는 도면이다.
[도 40] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양 규모의 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 41] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 42] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 43] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 44] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 2] 배양 조건 2에 있어서, 계대 7까지 계대 배양한 배양 인간 각막 내피 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 3] 배양 조건 1로 배양한 계대 3의 세포 및 배양 조건 2로 배양한 계대 3 혹은 계대 7의 세포의 세포 표면 항원의 해석 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 4] 배양 조건 2로 배양한 계대 7의 세포에 대하여, Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 면역 염색법에 따라 조사한 결과를 나타내는 사진이다.
[도 5] 계대 0으로부터 배양 조건 2로 배양한 세포의 계대 7에서의 위상차 현미경 사진이다.
[도 6] 도 5의 세포에 대한 세포 표면 항원 등의 발현의 양상을 나타내는 사진 및 그래프이다.
[도 7] 본 발명의 일 실시예에 관한 동결 보존 후의 세포의 트리판 블루 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 8] 동결 보존 후에 배양 조건 2로 배양한 배양 인간 각막 내피 세포의 세포 형태의 경시 변화를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
[도 9] 동결 보존한 세포와 동결 보존하지 않고 계속 배양한 세포의 형태를 비교하는 위상차 현미경 사진이다.
[도 10] 동결 보존한 세포와 동결 보존하지 않고 계속 배양한 세포의 세포 표면 항원의 해석 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 11] 동결 보존 후의 세포에 대하여, Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 확인한 형광 현미경 사진이다.
[도 12] 세포의 보존에 적절한 채취 시기를 비교 해석하는 순서를 설명하는 도면이다.
[도 13] 도 12의 각 채취 시기에서의 세포 형태를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
[도 14] 각 채취 시기에서의 동결 보존 후의 세포의 생존율을 나타내는 도면 그래프 및 사진이다.
[도 15] 도 14의 동결 보존 후에 해동한 세포를 배양 조건 2로 35일간 배양한 세포와 동결 보존하지 않고 계대 배양한 세포의 형태를 비교하는 위상차 현미경 사진이다.
[도 16] 도 14의 동결 보존 후에 해동한 세포를 배양 조건 2로 35일간 배양한 세포와 동결 보존하지 않고 계대 배양한 세포의 표면 항원을 비교하는 그래프이다.
[도 17] 도 14의 동결 보존 후에 해동한 세포를 배양 조건 2로 35일간 배양한 세포와 동결 보존하지 않고 계대 배양한 세포의 면역 염색 결과를 비교하는 사진이다.
[도 18] 세포의 보존에 적절한 채취 시기를 비교 해석하는 순서를 설명하는 도면이다.
[도 19] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포의 생존율을 나타내는 그래프이다.
[도 20] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포의 세포 표면 항원 등의 발현의 양상을 나타내는 그래프이다.
[도 21] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포의 세포 표면 항원 등의 발현의 양상을 나타내는 그래프이다.
[도 22] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포의 세포 표면 항원 등의 발현의 양상을 나타내는 그래프이다.
[도 23] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포에서의 Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 확인한 형광 현미경 사진이다.
[도 24] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포에서의 Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 확인한 형광 현미경 사진이다.
[도 25] 도 18에 나타내는 각 채취 시기에 채취해 동결 보존한 후의 세포에서의 Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin의 발현을 확인한 형광 현미경 사진이다.
[도 26] 배양 조건 2로 배양한 경우의 세포 형태의 경일(經日) 변화를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
[도 27] 배양 조건 2로 배양한 경우의 세포 형태의 경일 변화를 나타내는 위상차 현미경 사진이다.
[도 28] 배양 조건 2로 배양한 경우의 CD44의 발현량의 경일 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 29] 배양 조건 2로 배양한 경우의 ECD의 경일 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 30] 동결 보존 후, 배양 조건 2로 배양한 세포의 위상차 현미경 사진, 표면 항원의 해석 결과를 나타내는 그래프 및 면역 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 31] 빙온 보존 후의 배양 인간 각막 내피 세포의 트리판 블루 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 32] 도 31의 결과로부터 산출된 생존율을 나타내는 그래프이다.
[도 33] 각 보존액을 사용한 경우의 빙온 보존 후의 세포의 트리판 블루 염색의 결과를 나타내는 사진이다.
[도 34] 도 33의 결과로부터 산출된 생존율을 나타내는 그래프이다.
[도 35] 순화 배지를 보존액으로 빙온 보존한 후, 회복 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 36] 순화 배지를 보존액으로 빙온 보존한 후, 회복 배양한 세포의 면역 염색 결과를 나타내는 사진이다.
[도 37] 해동 후 8∼10일 간격으로 계대 8까지 계대 배양한 세포의 증식률과 위상차 현미경 사진이다.
[도 38] 도 29의 세포를 계대한 계대 9를 배양 조건 2로 34일간 배양한 세포의 위상차 현미경 사진 및 표면 항원의 해석 결과를 나타내는 그래프이다.
[도 39] 실시예 13에서의 세포의 배양 조건을 설명하는 도면이다.
[도 40] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양 규모의 변화를 나타내는 그래프이다.
[도 41] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 42] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 43] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
[도 44] 도 39의 각 배양 조건에서의 세포 수량과 배양한 세포의 위상차 현미경 사진이다.
이하에, 본 발명의 일 실시형태에 대해 설명한다.
본 실시형태에 관한 보존 방법은 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 보존하는 방법이다.
이들 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포는, 예를 들면, 특허문헌 2 또는 특허문헌 3에 기재된 방법에 따라 ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 배양된 것이다.
아울러, 본원 명세서에서는 이 특허문헌 2로 든 일본 특원2020-032139의 기재 및 특허문헌 3으로 든 국제공개 2017/110094호 공보의 기재를 적절히 참작해 원용하는 것으로 한다.
상기 인간 각막 내피 세포 또는 상기 인간 각막 내피 전구세포는 인간 각막 내피 세포 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 각막 내피로부터 채취한 각막 내피 전구세포, 각막 내피로부터 채취한 세포, 및 직접 프로그래밍법으로 제작되는 각막 내피 전구세포 및 각막 내피 모양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 기원으로 하여 작성된 것인 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 인간 각막 내피 전구세포란 분화 성숙함으로써 인간 각막 내피 세포로 되는 운명의 세포를 나타내는 개념이며, 분화 운명이 결정되는 도중 단계에 있는 것을 포함한다.
상기 배지는 인간 각막 내피 세포를 배양할 때에 사용되는 기본 배지, 예를 들면, Opti-MEM-I, Essential 6, DMEM/F12 등에 적절히 첨가제를 첨가한 것을 사용할 수 있다.
ROCK 저해제("Rho 키나아제 저해제"라고도 함)로는 하기 문헌: 미국 특허 4678783호, 특허 제3421217호, 국제공개 95/28387, 국제공개 99/20620, 국제공개 99/61403, 국제공개 02/076976, 국제공개 02/076977, 국제공개 2002/083175, 국제공개 02/100833, 국제공개 03/059913, 국제공개 03/062227, 국제공개 2004/009555, 국제공개 2004/022541, 국제공개 2004/108724, 국제공개 2005/003101, 국제공개 2005/039564, 국제공개 2005/034866, 국제공개 2005/037197, 국제공개 2005/037198, 국제공개 2005/035501, 국제공개 2005/035503, 국제공개 2005/035506, 국제공개 2005/080394, 국제공개 2005/103050, 국제공개 2006/057270, 국제공개 2007/026664 등에 개시된 화합물을 들 수 있다. 이들 화합물은 각각에 개시된 문헌에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 구체예로는 1-(5-이소퀴놀린설포닐) 호모피페라진 또는 그의 염(예를 들면, 파수딜(1-(5-이소퀴놀린설포닐) 호모피페라진)), (+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-1-(4-피리딜카르바모일) 시클로헥산((R)-(+)-트랜스-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복사미드) 또는 그의 염(예를 들면, Y-27632((R)-(+)-트랜스-(4-피리딜)-4-(1-아미노에틸)-시클로헥산카르복사미드 2 염산염 1 수화물 등을 들 수 있다. 이들 화합물은, 와코 준야쿠 주식회사나 아사히 가세이 파마 등으로부터 구입해 입수하는 것도 가능하다.
상기 배지 중의 ROCK 저해제의 농도는, 예를 들면, 1∼100 μM인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5∼20 μM, 특히 바람직하게는 10 μM이다.
형질전환을 일으키는 농도 미만의 농도란 상피 성장 인자(EGF)의 농도가 대상이 되는 각막 내피 세포의 형질전환(예를 들면, 내피 간엽계 이행)이 생기는 농도보다도 작은 또는 EGF가 전혀 포함되지 않은 것을 의미한다. 몇 개의 실시형태에서는 형질전환을 일으키는 농도보다도 낮은 EGF 농도는, 예를 들면, 약 0 ng/㎖ 이상 약 5 ng/㎖ 이하, 약 1 ng/㎖ 이상 약 4 ng/㎖ 이하, 약 2 ng/㎖ 이상 약 3 ng/㎖ 이하, 약 0 ng/㎖ 이상 약 2 ng/㎖ 이하, 약 0 ng/㎖ 이상 약 1 ng/㎖ 이하, 및 그 사이의 임의의 양이다. 보다 구체적으로는, EGF의 형질전환을 일으키는 농도 미만의 농도로는, 예를 들면, 2 ng/㎖ 미만, 바람직하게는 1 ng/㎖ 미만, 더욱 바람직하게는 0.5 ng/㎖ 미만, EGF의 첨가에 의한 인간 각막 내피 세포의 분화 성숙 과정에 대한 악영향을 완전하게 배제할 수 있다고 하는 관점으로부터, 특히 바람직하게는 0 ng/㎖(비첨가)인 것이 바람직하다. 몇 개의 실시형태에서는 배지에는, 예를 들면 상류 또는 하류의 신호 전달체에 작용함으로써 EGF 효과를 모방하는 다른 성장 인자도 포함되지 않는다.
아울러, 형질전환("상전이"라고도 함)이란 세포의 형질이 이전의 상태와는 상이한(정상이 아닌) 상태로 변화하는 것을 말하며, 세포가 무제한으로 분열을 행하게 되는 암화, 또는 조직의 기본형의 벽을 넘어 변화하거나 하는 동적인 화생(化生) 등을 포함한다. 형질전환의 구체적인 예로는, 예를 들면, 상피 간엽계 이행(EMT), 섬유화, 노화, 내피 간엽계 이행 등과 같은 세포 상태상 이전(CST)을 들 수 있다.
그러나, 본 실시형태에 관한 인간 각막 내피 세포의 보존 방법은 ROCK 저해제를 함유하고, EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 사용해 증식시킨 인간 각막 내피 세포 또는 인간 각막 내피 전구세포를 포함하는 세포 집단을 이하에 기재한 (a)∼(d) 중 어느 하나 또는 복수의 각 지표에 의해 규정된 시기(예를 들면, 분화 사건이 일어나기 이전 등)에 채취해 현탁 상태로 하여 보존하는 것을 특징으로 한다.
세포를 채취하는 시기는 이들 (a)∼(d)의 모든 지표를 만족하고 있는 것이 바람직하지만, 이들 모두를 만족하고 있을 필요는 없고, 어느 하나 이상(예를 들면, (a)만)을 만족하는 것이어도 된다.
(a) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 섬유아세포 모양의 형태로부터 상기 돌기를 포함한 장경단경의 비가 1에 가까운 부석상의 형태로 변한 직후부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다.
(b) CD44의 발현량이 직근의 계대 후에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기에 이를 때까지의 기간이다.
(c) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900 세포/㎟ 이상 2,500 세포/㎟ 이하이다.
(d) 직근의 계대로부터의 배양 일수가 4일 이상 14일 이하이다.
이하에 (a)∼(d)에 기재된 각 지표("평가 기준"이라고도 함)에 대해 설명한다.
우선 (a)에 대해 설명한다.
인간 각막 내피 세포를 전술한 것과 같은 ROCK 저해제를 함유하고, EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 사용해 증식시키면 성숙 분화의 과정에서 이하와 같이 세포 형태가 변화한다.
전술한 배지를 넣은 배양 플레이트에 파종한 직후의 인간 각막 내피 세포 및/또는 각막 내피 전구세포는 섬유아세포 모양의 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 형태이다. 배양 일수가 경과함에 따라 가늘고 긴 돌기가 작아지고, 돌기를 포함한 장경과 단경의 비(장단경의 비)가 1에 가깝고(예를 들면, 약 1.5:1, 1.25:1, 1.1:1, 1:1.1, 1:1.25, 1:1.5, 및 이들 사이의 임의의 비율), 인간의 생체 내에서의 각막 내피 세포와 유사한 부석상(예를 들면, 6각형상 등의 다각형상 또는 원형상)의 형태가 된다. 그 후, 세포의 크기가 보다 균일하게 되고, 충분히 분화 성숙한 기능성 각막 내피 세포가 되면, 세포끼리가 접착해 세포 간의 경계선이 불명료하게 된다.
이와 같이 계대로부터의 배양 일수에 의해 변천하는 세포의 형태가 전술한 (a)인 시기, 즉, 생체 내에서의 각막 내피 세포와 유사한 형태를 갖고는 있지만, 완전하게 분화 성숙하기 전의 시기에 세포를 채취하는 점이 본 실시형태에 관한 보존 방법의 특징점의 하나이다.
이 시기에 세포를 채취하고, 본 명세서에 기재되어 있는 것과 같이 현탁 상태로 보존하면, 보존 후에 재차 배양함으로써 기능성 인간 각막 내피 세포(이하, "이펙터 세포"라고도 함)의 함유율(이하, "E-ratio"라고도 함)이 대략 90%보다 높은 세포 집단을 얻을 수 있는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 높은 생존율을 유지한 채로 적어도 수일 이상 보존할 수 있다.
다음으로 (b)에 대해 설명한다.
인간 각막 내피 세포를 전술한 것과 같은 ROCK 저해제를 함유하고, EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 사용해 증식시키면, 성숙 분화의 과정에서 표면 항원인 CD44의 발현량이 이하와 같이 변화한다.
CD44의 발현량은 인간 각막 내피 세포를 전술한 배지를 넣은 배양 플레이트에 파종한 직후(1∼2일째)에 크게 증대하고, 배양 일수를 거침에 따라 대수적으로 감소하고, 어느 정도 세포가 분화 성숙하면 일정량으로 정착하는(안정기에 이르는) 것이 관찰되고 있다.
이 CD44의 발현량이 (b)와 같이 되어 있는 시기, 즉, CD44의 발현량이 계대 직후보다는 감소하고 있지만, 충분히 분화 성숙해 CD44의 발현량이 안정기에 이른 세포보다는 많은 시기에 세포를 채취하는 점이 본 실시형태의 특징점의 하나이다. 아울러, 이 CD44의 발현량은, 예를 들어, CD44에 대한 항체를 사용한 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 해석 등에 의해 정량할 수 있다. 예를 들면, PE-Cy7 결합 CD44 항체를 이용해 실시예 3의 항체-세포 비율로 염색한 후, FACSCanto™ II로 해석한 경우이면, 상술한 시기는 상기 배지를 사용해 35일간 배양한 시점의 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 CD44의 발현량을 나타내는 평균 형광 강도의 값을 1로 한 경우의, CD44의 발현량을 나타내는 평균 형광 강도의 상대값이 1보다 크고 60 이하, 보다 바람직하게는 50 이하인 시기라고도 말할 수 있다. 이 시기에 세포를 채취해 현탁 상태로 보존하면, 보존 후에 재차 배양함으로써 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 대략 90%보다 높은 세포 집단을 얻을 수 있는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 높은 생존율을 유지한 채로 적어도 수일 이상 보존할 수 있다. 이 CD44의 발현량은, 예를 들면, 정량 PCR 등의 플로우 사이토메트리 해석 이외의 방법에 의해 측정하는 것도 가능하다. 다만, 모든 실시형태에 있어서 절대적인 정량은 필요없고, 오히려 발현 패턴을 정성적으로 평가할 수 있음에 유의해야 한다.
(c)에 대해 설명한다.
인간 각막 내피 세포는 전술한 배지를 넣은 배양 플레이트에 파종한 후 거의 직선적으로 증가하고, 충분히 분화 성숙하면 각막 내피 세포 밀도(이하, "ECD"라고도 함)의 값이 일정값으로 정착함을 알 수 있다.
이 ECD의 값이 (c)와 같이 되어 있는 시기, 즉, 세포 밀도가 증가하고 있는 증식기이지만, 이미 기능성 인간 각막 내피 세포로 분화하는 운명이 결정된 시기에 세포를 채취하는 점이 본 실시형태의 특징점의 하나이다. 이 시기에 세포를 채취해 현탁 상태로 함으로써, 보존 후에 재차 배양하면 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 90%보다 높은 세포 집단을 얻을 수 있는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 높은 생존율을 유지한 채로 적어도 수일 이상 보존할 수 있다.
ECD의 값이 전술한 (c)의 시기(약 900 세포/㎟ 이상 약 2,500 세포/㎟ 이하)에 채취하는 것이 바람직하지만, 약 1,000 세포/㎟ 이상 약 2,400 세포/㎟ 이하, 약 1,200 세포/㎟ 이상 약 2,000 세포/㎟ 이하, 약 1,200 세포/㎟ 이상 약 1,800 세포/㎟ 미만 등의 시기에 채취하는 것이어도 된다. 몇 개의 실시형태에서는 상기의 범위의 조합의 사이에 있는 ECD 값도 이용할 수 있다.
배양 개시 시의 각막 내피 세포 밀도는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 300 세포/㎟ 이상 500 세포/㎟ 이하의 범위인 것이 바람직하다.
아울러, 각막 내피 세포 밀도(ECD)는, 예를 들면, 세포를 배양 용기로부터 TrypLE 등의 세포 박리액에 의해 박리해 세포 현탁액을 제조하고, 그 일부를 이용해 혈구 계산반을 이용해 세포 수를 계측하는 것이나, 위상차 현미경으로 촬상한 사진 등에 근거해 해석 소프트웨어(예를 들면, KSSE-400EB 등)에 의해 구할 수 있다.
(d)에 대해 설명한다.
전술한 배지를 넣은 배양 플레이트에 파종하고 난 후, 약 4일 이상 약 14일 이하의 시기, 보다 바람직하게는 약 6일 이상 약 11일 이하의 시기에 채취하면, 이상에서 기술한 (a)∼(c)의 시기에 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 채취할 수 있으므로 바람직하다.
전술한 시기에 채취된 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포는 적절히 최적인 온도에서 보존하는 것이면 되지만, 예를 들면, 약 10℃ 이하 등의 저온 보존, 약 4℃ 이하, 약 0℃ 이하 등의 빙온 보존, 약 -10℃ 이하, 약 -30℃ 이하, 약 -80℃ 이하, 액체 질소 탱크 중 등의 동결 보존되는 것이 바람직하다.
보존하고 있는 동안의 온도는 보존 중에 다소 변동해도 상관없지만, 예를 들면, 동결하고 난 후 사용을 위해 해동할 때까지 사이에는 전술한 온도 범위 내로 유지해 두는 것이 바람직하다.
인간 각막 내피 세포를 현탁 상태로 보존하는 기간은 생산 거점으로부터 치료를 행하는 기관으로의 수송 시간 등에 따라 적절히 설정 가능하지만, 저온 보존, 빙온 보존, 동결 보존에 무관하게 24시간 이상인 것이 바람직하고, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 일주간 정도 등의 장기간 보존하는 것이 바람직하다. 특히, 동결 보존의 경우에는 수개월 사이∼수십년의 보존도 가능하다라고 생각된다.
인간 각막 내피 세포를 현탁해 보존할 때의 현탁액 또는 보존액으로는 빙온 보존의 경우에는 배양에 사용한 순화 배지가 바람직하지만, 이것에 한정되지 않고, 예를 들면, 일반적으로 배양 세포를 보존할 때에 사용되는 보존액을 사용할 수 있다.
동결 보존의 경우에는 일반적으로 널리 동물 세포의 동결 보존에 사용되는 동결 보호제를 포함하는 현탁액을 사용할 수 있다.
이와 같은 동결 보호제로는 세포막 투과성의 동결 보호제인 하기의 것을 들 수 있다. 디메틸설폭시드, 에틸렌 글리콜(EG), 프로필렌 글리콜(PG), 1,2-프로판디올(1,2-PD), 1,3-프로판디올(1,3-PD), 부틸렌 글리콜(BG), 이소프렌 글리콜(IPG), 디프로필렌 글리콜(DPG) 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 또는 2종 이상인 동결 보호제.
이상에서 설명한 것과 같은 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 보존 방법에 의하면, 인간 각막 내피 세포 및 또는 인간 각막 내피 전구세포를 예상 이상으로 높은 생존율을 유지한 채로 장기간 보존할 수 있다. 이와 같이 장기간 보존할 수 있는 이유로는 성숙 분화 후에 비해 ERK(p44/42 MAPK)의 활성화(인산화)가 항진하고 있는 시기의 세포를 채취해 보존하고 있는 것이 요인의 하나는 아닐까 생각된다.
추가로, 기능성 각막 내피 세포를 얻기 위해서는 역상전이성을 극복할 필요가 있지만, 상기 시기인 것에 더하여 전술한 (a)∼(d)의 각 지표에 의해 규정된 시기에 채취한 인간 각막 내피 세포 또는 인간 각막 내피 전구세포는 이미 기능성 인간 각막 세포로 분화하는 운명이 결정된 후에 채취하고 있기 때문에, 현탁 상태로 보존한 후에 배양을 재개해도 상전이가 억제되어 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 90%보다 높은 세포 집단을 유리하게 얻을 수 있는 것이라고 생각된다. 추가로 말하면, 기능성 인간 각막 내피 세포로 분화하는 운명이 이미 결정되어 있는 세포를 채취하고 있으므로, 보존한 세포를, 예를 들면 그대로 환자에게 투여하는 것도 가능하다.
상기 보존한 세포 또는 보존 후에 재배양한 세포는 눈의 질환 또는 상해를 치료하기 위해 대상자(환자)의 눈에, 예를 들면 투여나 이식 등에 의해 송달되는데 적절한 것으로 할 수 있다.
상기 투여 시에는 이들 세포를 그대로 투여하는 것이어도 되고, 이들 세포를 함유하는 의약의 제조에 사용하는 것이어도 된다. 아울러, 상기 질환 또는 상해는 각막에 관한 것인 것이 바람직하다.
전술한 보존 방법에 의해 보존한 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 저온에서 보존하고 있는 상태(예를 들면, 약 -20℃ 이하)로부터 25℃ 등의 상온∼37℃ 정도까지 되돌리고, 재차 배지에 파종해 소정 기간 배양한 후(이하, "회복 후"라고도 함)에, 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 90%보다 높은 세포 집단을 얻을 수 있는지 여부는 이하에 기재한 (1)∼(8) 중 하나 또는 복수의 조건("평가 기준"이라고도 함)을 만족하고 있는지 여부에 의해 확인할 수 있다.
아울러, 상기 소정 기간이란 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포가 충분히 분화 성숙하는 기간이면 되지만, 예를 들면, 파종으로부터 및 4주간(예를 들면, 28일) 이상인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 파종으로부터 및 5주간(예를 들면, 35일) 이상이다.
(1) 위상차 화상에 의한 외관 검사에서 섬유아세포, 이물, 변색, 또는 다른 이상이 없다.
(2) 세포 생존율이 트리판 블루 염색에서 70% 이상이다.
(3) 세포 상청의 ELISA에 의한 순도 시험에서 PDGF-BB가 적어도 약 100 pg/㎖ 이상이다.
(4) 세포의 FACS에 의한 순도 시험 결과가 이하의 범위를 모두 만족하는 것이다.
CD166+ > 99%
CD24+ < 5%
CD26+ < 5%
CD44high < 5%
CD44neg∼low > 90%
CD90+ < 5%
(5) 이펙터 세포(E-ratio) > 대략 90%이다.
(6) 펌프 기능(Na+/K+ ATPase)이 양성이다.
(7) 배리어 기능(ZO-1)이 양성이다.
(8) ECD가 1,500 세포/㎟ 이상이다.
아울러, 본 명세서에 있어서 기능성 인간 각막 내피 세포(이펙터 세포)란 인간의 생체 내에 존재하는 인간 각막 내피 세포와 동일한 각막 내피 특성을 갖는 인간 각막 내피 세포, 또는 인간의 안전방(眼前房) 내에 주입함으로써 인간 각막 기능을 야기할 수 있는 인간 각막 내피 세포를 가리킨다. 보다 구체적으로 설명하면, 이펙터 세포란 전술한 (1)∼(8)의 조건 중, 특히 (4)의 조건인 CD166+ 및 CD24- 및 CD44neg∼low 중 적어도 하나 이상을 만족하는 세포를 가리킨다. 아울러, 이들 지표 중, CD26+ < 5%에 대해서는 특허문헌 2에 있어서 CD44high < 5%인 세포 집단에 있어서는 반드시 달성되고 있음이 이미 확인되어 있다.
인간 각막 기능을 야기할 수 있는 것은 각막 내피 특성을 야기할 수 있는(예를 들면, 각막 혼탁이나 수화 부종의 개선, 그 결과 지속적으로 장기에 걸쳐 각막 내피 세포 밀도를 유지시켜 시력 개선으로 연결되는 효능을 갖는 등) 것을 포함하는 개념이다.
특허문헌 3에 기재되어 있는 것과 같이, 각막 내피 특성을 갖는 기능성 인간 각막 내피 세포에 있어서는 각막 내피 특성에 연결되는 기능 단백의 발현이 확인됨을 알 수 있다.
상기 기능 단백으로는 Na+/K+ ATPase나 ZO-1, 나트륨/수소 교환체 1(NHE1) 및/또는 아쿠아포린 1(AQP-1), 탄산탈수효소 5B(CA5B) 등을 들 수 있다.
또, 특허문헌 3에 있어서 검증되고 있는 것과 같이, ROCK 저해제의 존재 하이고, 형질전환을 일으키는 농도 미만의 EGF의 존재 하에 있어서 증식 및/또는 분화·성숙시킨 인간 각막 내피 세포는 세포질이나 핵에 있어서 작동하는 TCA 대사 경로에 관한 효소에 의한 대사 산물, 그 중에서도 아세틸 코엔자임 A(AcCoA)에 의한 히스톤의 아세틸화 등의 후생적(epigenetic) 다유전자의 활성화가 회피됨으로써, 배양 세포의 상전이가 억제되어 있다고 생각된다. 그 증거로서, 이들 기능성 인간 각막 내피 세포는 그 미토콘드리아에 있어서 시트르산 신타아제(CS), 아코니타아제 2(ACO2), 이소시트르산 탈수소효소 2(IDH2), 말산 탈수소효소 2(MDH2), 말산 효소 3(ME3), ACSS1, 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제 1(ACAT1), 피루브산 탈수소효소(PDH), BCAT2, 및 분기쇄 케토산 탈수소효소 2(BCKDH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 대사 관련 효소의 발현이 항진하고 있음이 확인되고 있고, 이들도 기능 단백에 포함되는 것이다. 이것으로부터, ATP 시트르산 리아제(ACLY), 아코니타아제 1(ACO1), 이소시트르산 탈수소효소 1(IDH1), 말산 탈수소효소 1(MDH1), 말산 효소 1(ME1), ACSS2, 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제 2(ACAT2) 및 락트산 탈수소효소(LDH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종 이상의 대사 관련 효소인 저해 단백이 발현하고 있지 않거나, 거의 발현하고 있지 않다고 생각된다.
본 발명은 이상에서 설명한 것에 한정되지 않는다.
예를 들면, 사용하는 배지는 반드시 상기 실시형태에 있어서 설명한 조성의 것일 필요는 없고, 세포 채취 시나 재배양 시에 전술한 각 평가 기준을 만족하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 얻을 수 있는 것이면 되는 것은 말할 필요도 없다.
그 외, 본 발명의 취지에 반하지 않는 한에 있어서, 여러 가지의 변형이나 실시형태의 조합을 행해도 상관없다.
[실시예]
이하에, 여러 가지 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
이하의 실시예에서는 헬싱키 선언 등의 의료적인 윤리 규정, GCH 등의 규정, 및 쿄토부립 의과대학 그 외에서 규정되는 규정을 준수하고, 발명자가 소속하는 조직에 관계하는 윤리위원회의 승인 하에 행하였다. 필요한 설명과 동의를 취득한 다음, 이하의 실험을 행하였다.
(실시예 1: 배양 조건에 의한 상전이 세포 출현율에 대한 영향의 확인)
이 실시예 1에서는 ROCK 저해제를 함유하고, 또한 EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식 및/또는 분화·성숙시킴으로써, 기능성 인간 각막 내피 세포(이펙터 세포)를 매우 높은 비율로 함유하는 세포 집단을 배양할 수 있음을 확인하였다. 동일 기증자(donor) 유래 각막으로부터 채취한 각막 내피 세포를 첨가물 조성이 상이한 2 종류의 배양액으로 배양하고, 기능성 인간 각막 내피 세포(이펙터 세포) 함유율 등의 세포 품질에 대한 영향을 조사하였다.
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 18세 남성의 것이다.
사용한 배지는 Opti-MEM-I + 8 중량% FBS + 200 ㎎/㎖ CaCl2 + 0.08 중량% 콘드로이친 황산 + 20 ㎍/㎖ 아스코르브산 + 50 ㎍/㎖ 겐타마이신이다.
이하 실험의 배양 조건 1에서는 상기 배지에 대하여 0.5 ng/㎖ EGF, 10 μM SB203580, 10 μM Y-27632를 첨가물로서 첨가한 배지를 이용하였다.
한편, 배양 조건 2에서는 상기 배지에 대하여 10 μM Y-27632만을 첨가물로서 첨가하고 EGF 및 SB203580가 비첨가된 배지를 이용하였다.
(세포의 배양)
시애틀 안구 은행으로부터 입수한 기증자 각막으로부터 각막 내피 세포를 데스메 막(Descemet's membrane)과 함께 박리하고, 콜라게나아제에 의해 37℃에서 하룻밤 처리한 후, 배양 조건 1의 배지에 현탁하고, I형 콜라겐 코팅된 6 웰 플레이트에 1 눈 당 1 웰의 비율로 파종하였다. 이 웰을 CO2 인큐베이터 내에 설치하여 34일간 배양하였다. 배지 교환은 1주간 당 2회의 빈도로 행하였다.
10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 세포를 배양 접시로부터 박리한 후, 회수 세포 수를 혈구 계산판에 의해 측정하였다. 세포 현탁액을 2개로 나누고, 한 쪽을 배양 조건 1의 배지에, 다른 쪽을 배양 조건 2의 배지를 넣은 새로운 배양 용기에 각각 400 세포/㎟의 세포 밀도로 파종하고, 재차 CO2 인큐베이터 내에서 42일간 배양하였다.
10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 세포를 배양 접시로부터 박리한 후, 회수 세포 수를 혈구 계산판에 의해 측정하고, 400 세포/㎟의 세포 밀도로 파종하고, 재차 CO2 인큐베이터 내에서 29∼42일간 배양하는 조작을 각각의 배양 조건 하에서 반복하여 계대 배양을 반복하였다.
(위상차 사진에 의한 세포 형태의 확인)
배양 조건 1 또는 배양 조건 2로 배양한 계대 3(배양 조건 1과 배양 조건 2로 나눈 후 3대째)의 세포의 위상차 사진을 도 1에 나타낸다.
이 도 1로부터, 배양 조건 1에서는 다수의 세포의 크기가 분명히 큰 상전이 세포가 출현하고 있음을 알 수 있다. 한편으로, 배양 조건 2에서는 계대를 거듭해도 세포의 크기가 균일하게 유지되고 있어, 상전이 세포의 출현이나 증가가 억제되고 있음을 알 수 있다.
도 2는 배양 조건 2에 있어서, 계대 7까지 계대 배양한 세포의 위상차 사진이지만, 이 단계에서도 도 1의 경우와 거의 변함없이 세포의 크기가 균일하게 유지되고 있고, 상전이 세포의 출현이나 증가가 억제되고, 이물, 변색, 또는 다른 이상이 없음을 알 수 있다.
(표면 항원의 해석)
도 3은 배양 조건 1로 배양한 계대 3의 세포 또는 배양 조건 2로 배양한 계대 3 혹은 계대 7의 세포의 세포 표면 항원의 플로우 사이토메트리에 의한 해석 결과를 나타내는 것이다. 세포 표면 항원의 해석은 후술하는 실시예 4와 동일하게 행하였다.
이 도 3의 결과로부터도, 배양 조건 2에서는 계대 7까지 계대 배양을 반복해도 인간 각막 내피 세포에서의 표면 항원인 CD166+CD24-CD44neg∼low의, 혹은 CD44neg∼lowCD90neg∼low의 특징을 나타내는 이펙터 세포의 비율이 높고, 목적하는 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 높은 세포 집단이 배양되고 있음을 알 수 있었다.
아울러, CD166+CD24-CD44neg∼low라고 하는 지표에 대해서는, 도 3의 상단의 그래프에서 CD166+CD24-의 게이트 A에 포함되어 있는 세포 집단을 추출한 다음, 중단의 그래프에서 CD44의 발현량을 조사하고 있다. 또, CD44neg∼lowCD90neg∼low라고 하는 지표에 대해서는, 도 3의 상단, 중단의 그래프와는 독립적으로 도 3의 하단의 그래프에서 조사하고 있다. 이것은 도 6, 도 10, 도 16, 도 20, 도 21, 도 22, 도 30, 도 38 등에 있어서도 동일하다.
이들 표면 항원의 발현량에 대해서는 이하와 같이 정의되는 것이다.
「-」 또는 「neg」란 발현이 실질적으로 관찰되지 않는, 즉 음성을 의미한다.
「+」란 전술한 음성이 아닌 것, 즉 발현이 유의하게 관찰되는 것, 양성을 의미한다.
「low」란 발현이 확인되는 것을 약양성, 중양성, 강양성으로 3 단계로 구별한 경우의 약양성에 해당하고, 이 약양성에 미치지 않은 발현량인 것은 음성이 된다.
「high」란 발현이 확인되는 것을 약양성, 중양성, 강양성으로 3 단계로 구별한 경우의 강양성에 해당한다.
전술한 CD 마커 등의 표면 항원의 발현 강도는 표지된 형광의 종류, 기기 설정에 의해 형광 강도가 상이하기 때문에 수치로의 정의는 어렵지만, 예를 들면, 이하의 조건에서의 약양성, 중양성, 강양성은 각각 이하와 같은 형광 강도의 범위에서 정의할 수 있다.
조건: PE-Cy7 표지 항-인간 CD44 항체(BD Biosciences)를 사용하고, FACSCanto™ II의 Area Scaling Factor의 설정값을 Blue laser=0.75, 전압 설정값을 PE-Cy7=495로 한 경우.
약양성: 형광 강도가 대략 3,800 미만이다.
중양성: 형광 강도가 대략 3,800 이상∼27,500 미만이다.
강양성: 형광 강도가 대략 27,500 이상이다.
예를 들면, 도 3에 있어서, 음성인지 양성인지를 판단하는 마커에 대해서는 그래프에 음성과 양성의 영역("게이트"라고도 함)을 나누는 실선이 그어져 있다.
또, 도 3에 있어서, 약양성, 중양성, 강양성의 3 단계로 구별하는 마커에 대해서는 3개의 영역("게이트"라고도 함)을 구별하는 테두리를 기재하도록 하고 있다.
또한, 도면 중의 백분율은 전술한 각 영역에 속하는 세포의 비율을 나타내는 것이다.
(면역 염색에 의한 기능 단백의 발현 확인)
추가로, 배양 조건 2로 배양한 계대 7의 세포에 대하여, Na+/K+ ATPase 및 ZO-1의 발현을 면역 염색법에 의해 조사하였다. 계대 7로 계대한 후, 동일한 배지에서 주 2회의 빈도로 배지 교환하면서 40일간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 빙냉 메탄올 또는 4% 파라포름알데히드/인산 완충액으로 세포를 고정하였다. PBS(-)로 세정한 후, PBS(-) + 0.02 중량% Triton X-100으로 10분간 투과 처리를 하였다. 그 후, PBS(-) + 1 중량% 소 혈청 알부민으로 실온, 1시간 이상 블로킹을 행하였다. 블로킹 후, 마우스 항-Na+/K+ ATPase 항체, 또는 마우스 항-ZO-1 항체, 또는 마우스 항-N-Cadherin 항체와 4℃에서 하룻밤 반응시켰다. PBS(-)로 4회 세정한 후, AlexaFluor555 표지 항-마우스 IgG 항체를 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS(-)로 세정한 후, 5 ㎍/㎖의 DAPI로 10분간 반응시켜 핵을 염색하고, 추가로 PBS(-)로 3회 세정한 후, 형광 현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다.
도 4의 결과로부터도, 배양 조건 2로 배양한 계대 7의 거의 모든 세포에 있어서, 기능성 인간 각막 내피 세포에서의 중요한 기능 단백인 Na+/K+ ATPase, ZO-1, 및 N-Cadherin을 발현하고 있음이 확인되었다.
(PDGF-BB 생산량의 확인)
배양 조건 2로 배양한 계대 7의 계대 후 34일째의 배양 상청을 회수하고, 배양 상청 중에 분비된 PDGF-BB의 농도를 인간 PDGF-BB ELISA 키트(Abcam,＃ab184860)에 의해 조사하였다. 그 결과, 배양 상청 중의 PDGF-BB 농도는 328.4±19.6 pg/㎖이고, 규격값 100 pg/㎖ 이상을 만족하고 있음이 확인되었다.
(고찰)
이상의 결과로부터, 본 명세서에서 개시하는 몇 개의 실시형태에 의하면, ROCK 저해제를 함유하고, 또한 EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식 및/또는 분화·성숙시킴으로써, 상전이 세포의 출현을 억제하고 기능성 인간 각막 내피 세포를 매우 높은 비율로 함유하는 세포 집단을 배양할 수 있음을 확인할 수 있었다. 또, 본 발명자들의 경험으로부터, Y-27632 이외에도, ROCK 저해의 특성을 나타내는 화합물이 동일하게 또는 그 이상으로 효과적임을 이해할 수 있다. 몇 개의 실시형태에서는 ROCK 저해의 특성을 나타내는 화합물로서 AT-13148, BA-210, β-엘레멘, 크로만 1, DJ4, 파수딜, GSK-576371, GSK429286A, H-1152, 히드록시파수딜, 이부프로펜, LX-7101[24], 네타르수딜, RKI-1447, 리파수딜, TCS-7001, 티아조비빈, 베로수딜(AR-12286), Y-27632, Y-30141, Y-33075, 및 Y-39983으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수의 조합을 포함하고 있어도 된다.
(실시예 2: 상전이를 억제하는 배양 조건의 확인)
실시예 2에서는 기증자 각막으로부터의 초대 배양(계대 0)으로부터 전술한 배양 조건 2로 배양한 세포 집단이 기능성 인간 각막 내피 세포를 높은 비율로 함유하는 것임을 확인하였다.
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 27세 남성의 것이다.
배지는 실시예 1의 배양 조건 2와 동일한 것을 사용하였다.
(세포의 배양)
시애틀 안구 은행으로부터 입수한 기증자 각막으로부터 각막 내피 세포를 데스메 막과 함께 박리하고, 콜라게나아제에 의해 37℃에서 하룻밤 처리한 후, 상기 배양 조건 2의 배지에 현탁하고, I형 콜라겐 코팅된 6 웰 플레이트에 1 눈 당 1 웰의 비율로 파종하였다. 이 웰을 CO2 인큐베이터 내에 설치하여 40일간 배양하였다. 배지 교환은 1주간 당 1회의 빈도로 행하였다.
10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 세포를 배양 접시로부터 박리한 후, 회수 세포 수를 혈구 계산판에 의해 측정하였다. 이 세포 현탁액을 배양 조건 2의 배지를 넣은 새로운 배양 용기에 각각 400 세포/㎟의 세포 밀도로 파종하고, 재차 CO2 인큐베이터 내에서 32일간 배양하였다.
10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 세포를 배양 접시로부터 박리한 후, 회수 세포 수를 혈구 계산판에 의해 측정하고, 400 세포/㎟의 세포 밀도로 파종하고, 재차 CO2 인큐베이터 내에서 38∼44일간 배양하는 조작을 각각의 배양 조건 하에서 반복하여 계대 배양을 반복하였다.
(위상차 사진에 의한 세포 형태의 확인)
전술한 것과 같이 하여 배양한 계대 7의 세포의 위상차 사진을 도 5에 나타낸다.
이 도 5의 위상차 사진으로부터, 본 실시예에서 배양한 계대 7의 세포는 세포의 크기가 균일하게 유지되고 있고, 상전이 세포의 출현이나 증가가 억제되고 있음을 알 수 있다.
(표면 항원의 해석)
실시예 1과 동일한 순서로 본 실시예의 계대 7의 세포에 대해 표면 항원을 해석한 결과를 도 6b의 그래프에 나타낸다. 이 결과로부터, 본 실시예의 계대 7의 대부분의 세포에 있어서, 기능성 인간 각막 내피 세포에서의 표면 항원의 특징이 나타났다.
이 결과로부터, 본 실시예에 있어서도 본 배양 조건에서는 계대 7까지 장기 계대해도 목적하는 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 높은 세포 집단을 높은 수준으로 유지한 채로 배양할 수 있음을 확인할 수 있었다.
(세포 면역 염색에 의한 기능 단백의 발현 확인)
추가로, 본 실시예에서 배양한 계대 7의 세포에 대하여, Na+/K+ ATPase, ZO-1및 N-Cadherin의 발현을 실시예 1과 동일하게 하여 면역 염색법에 따라 조사한 결과를 도 6a에 나타낸다.
이 결과로부터도, 본 실시예에서 배양한 계대 7의 거의 모든 세포에 있어서, 인간 각막 내피 세포에서의 중요한 기능 단백인 Na+/K+ ATPase, ZO-1 및 N-Cadherin을 발현하고 있음이 확인되었다.
(PDGF-BB 생산량의 확인)
본 실시예에서 배양한 계대 0∼7의 배양 상청에 대하여, 배양 상청 중에 분비된 PDGF-BB의 농도를 인간 PDGF-BB ELISA 키트(Abcam,＃ab184860)에 의해 조사한 결과를 도 6c에 나타낸다. 어느 계대에 있어서도 규격값 100 pg/㎖ 이상을 만족하고 있음이 확인되었다.
(고찰)
이 실시예 2의 결과로부터, 초대 배양(계대 0)에서부터도 상기 배양 조건 2의 배지(ROCK 저해제를 함유하고, 또한 EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지)를 이용함으로써, 계대 7이라고 하는 장기간에 걸친 배양에서도 상전이를 억제하고, 목적하는 기능성 인간 각막 내피 세포를 매우 높은 비율로 함유하는 세포 집단을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.
인간 각막 내피 세포의 상전이는 불가역적인 것이라고 생각되고 있고, 실제로 한 번 상전이해 버린 세포를 배양 조건 2의 배지로 배양해도 기능성 인간 각막 내피 세포로 되돌리는 것은 할 수 없다. 그 때문에 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 높은 세포 집단을 얻기 위해서는 계대 0 또는 계대 1 등의 가능한 빠른 단계로부터 배양 조건 2에서 사용하고 있는 ROCK 저해제를 함유하고, 또한 EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지에서 배양하는 것이 바람직하다.
(실시예 3: 세포의 동결 보존과 생존율의 확인)
실시예 3에서는 전술한 배양 조건 2로 배양한 세포 집단을 계대 후의 특정 배양 시기에 회수함으로써, 기능성 인간 각막 내피 세포를 높은 생존율로 동결 보존할 수 있고, 또한 해동 후에 배양 조건 2로 배양함으로써 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 높은 세포 집단을 얻을 수 있음을 확인하였다.
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 29세 여성의 것이다.
배지는 실시예 1의 배양 조건 2와 동일한 것을 사용하였다.
(배양과 동결 보존)
실시예 2와 동일한 조건으로 계대 3까지 배양한 세포(계대 후 136일째)의 세포를 10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 배양 접시로부터 박리해 2개로 나누고, 1개를 실시예 1의 배양 조건 2의 배지에 현탁하고, I형 콜라겐으로 코팅된 배양 플레이트에 400 세포/㎟의 세포 밀도로 파종하였다. 나머지를 CELLBANKER I(일본 전약공업 주식회사)에 1 ㎖ 당 1,000,000 세포가 되도록 현탁하고, 이 세포 현탁액을 세포 동결 보존 튜브(Corning Inc.)에 1개 당 400 ㎕씩 분주하였다. 이 세포 현탁액을 포함한 세포 동결 보존 튜브를 빙상에서 1시간 정치한 후, 일부 튜브를 액체 질소 탱크의 기층 부분에 넣어 동결·보존하고, 나머지 튜브를 동물 세포 동결 처리 용기 BICELL(일본 프리저 주식회사)에 넣고, 초저온 프리저(PHC 홀딩스 주식회사)를 이용해 -80℃에서 동결·보존하였다(대조예).
전자의 파종한 세포는 파종 후 4일째에 동일한 배지에서 배지 교환을 행하고, 5일째에 10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 배양 플레이트로부터 세포를 회수(채취)하였다. 회수한 세포를 상기와 동일한 방법으로 동결·보존하였다(실시예 3).
(생존율의 확인)
이와 같이 하여 동결 보존한 각각의 세포를 튜브마다 37℃로 보온한 욕조 중에서 해동하고, 상기 배양 조건 2의 배지 4 ㎖로 1회 세정하였다. 세정 후의 세포를 상기 배양 조건 2의 배지 400 ㎕에 현탁하였다.
이 현탁액 10 ㎕와 0.4 중량% 트리판 블루 용액(Sigma Aldrich Corp.) 10 ㎕를 혼합하고, 혈구 계산반 상에서 살아있는 세포, 죽은 세포를 각각 계측하였다. 결과를 도 7 및 표 1에 나타낸다. 도 7 중, 희게 보이는 세포가 살아있는 세포를, 푸르게 염색된 세포가 죽은 세포를 나타내고 있다.
| 본 실시예 | 대조예 | |
| 액체 질소 보존 | 94.5% | 66.4% |
| -80℃ 보존 | 89.4% | 53.1% |
(고찰)
이 실시예 3의 결과로부터, 400 세포/㎟의 세포 밀도로 상기 배양 조건 2의 배지에 파종한 후 5일째에 회수해 동결 보존한 경우, 동결 보존 후에 있어서도 높은 생존율을 유지함을 확인할 수 있었다. 한편으로, 동일하게 하여 성숙 분화 후(136일 배양 후)에 세포를 채취해 보존한 대조예에 있어서는 생존율이 크게 저하되어 있음을 알 수 있었다. 또, 14세, 남성 기증자 유래의 각막을 이용해 계대 파종 후 35일째(계대 5)에 회수한 성숙 분화 후의 세포를 동일한 방법으로 동결 보존을 한 경우에 있어서도, 융해 후의 생존율은 액체 질소 보존한 것에서 49.5%, -80℃ 보존한 것에서 63%로 표 1에 기재된 대조예와 동일한 레벨이었다.
(실시예 4: 동결 보존한 후에 회복시킨 세포의 평가)
실시예 4에서는 실시예 3에서 동결 보존한 세포를 융해·회복시켜 얻은 세포 집단에 대하여, 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 높은 채로 유지되고 있는지 여부에 대해 조사하였다.
(위상차 사진에 의한 세포 형태의 확인)
실시예 3과 동일한 기증자 유래의 세포(계대 3)를 동일한 방법으로 동결 보존한 세포 현탁액 380 ㎕를 실시예 3과 동일한 방법으로 융해 조작을 행하고, 상기 배양 조건 2의 배지에서 2 ㎖로 메스업 하고, I형 콜라겐으로 코팅된 6 웰 세포 배양 플레이트의 1 웰에 파종하였다. 5% v/v의 CO2를 포함하는 가습 대기 하, 37℃에서 배양을 행하였다. 배지는 전술한 것과 동일한 배양 조건 2의 배지에서 주에 2회 교환하고, 정기적으로 위상차 현미경으로 관찰을 행하였다. 관찰된 세포 형태의 경시 변화를 도 8에 나타낸다.
도 8의 결과로부터, 동결 보존 후의 세포는 증식하여, 크기가 균일한 부석상(다각형상 또는 원형상 등)의 형태가 됨을 관찰할 수 있었다.
추가로, 실시예 3에서 동결 보존하지 않고 35일째까지 배양한 세포와 실시예 3에서 4일째에 회수하지 않고 배지 교환을 계속하여 35일째까지 계속 배양한 세포를 위상차 현미경으로 비교한 결과가 도 9이다.
도 9의 결과로부터, 동결 보존한 세포와 동결 보존하지 않고 계속 배양한 세포 사이의 형태의 차이는 볼 수 없었다.
(표면 항원의 확인: FACS 해석)
실시예 3에서 냉동 보존하지 않고 35일째까지 배양한 세포와 본 실시예에서 35일간 배양한 세포를 10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 배양 플레이트로부터 회수하고, FACS 버퍼(PBS + 0.5 중량% BSA + 0.05 중량% NaN3) 중에 4×106 세포/㎖가 되도록 현탁시켰다. 이 세포 현탁액 20 ㎕를 20 ㎕의 항체 용액 1 또는 항체 용액 2와 혼합하고, 차광 하, 4℃에서 1.5∼2시간 인큐베이트하였다.
사용한 항체 용액은 이하와 같다. 아울러, 메이커의 기재가 없는 항체는 모두 BD Biosciences로부터 입수한 것이다.
(항체 용액 1) FITC 결합 항-인간 CD90 mAb(4 ㎕), PE 결합 항-인간 CD166 mAb(4 ㎕), PerCP-Cy5.5 결합 항-인간 CD24 mAb(1 ㎕), PE-Cy7 결합 항-인간 CD44 mAb(0.25 ㎕) 및 APC 결합 항-인간 CD105(eBioscience, 1 ㎕)를 FACS 버퍼에서 20 ㎕로 메스업 한 것.
FACS 버퍼로 세정한 후, 세포를 FACSCanto™ II(BD Biosciences, S/N=V33896101710)로 해석하였다. 결과를 도 10에 나타낸다. 또, FACSCanto™ II의 각 형광의 전압 설정값은 이하와 같았다. FSC=270, SSC=380, FITC=290, PE=290, PerCP-Cy5.5=410, PE-Cy7=495, APC=430. 또, Area Scaling Factor의 설정값은 하기와 같았다. FSC=0.5, Blue Lasor=0.75, Red Lasor=0.8.
도 10의 표면 항원의 해석 결과로부터, 동결 보존한 세포와 동결 보존하지 않고 계속 배양한 세포 사이에 CD166+CD24-CD44neg∼low(게이트 1) 혹은 CD44neg∼lowCD90neg∼low(하단 패널 좌하의 게이트)의 특징을 나타내는 이펙터 세포의 함유율에 차이는 볼 수 없었다.
(면역 염색에 의한 평가: 면역 세포 염색)
본 실시예에서 35일간 배양한 세포를 10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 회수하고, 상기 배양 조건 2의 배지에 현탁하고, I형 콜라겐으로 코팅된 배양 플레이트에 400 세포/㎟의 세포 밀도가 되도록 파종하였다.
동일한 배지에서 주 2회의 빈도로 배지 교환하면서 5주간 배양한 후, 실시예 1과 동일한 방법으로 면역 염색하였다. 단, 항체는 1차 항체로서 마우스 항-Na+/K+ ATPase 항체 및 토끼 항-ZO-1 항체, 2차 항체로서 AlexaFluor488 표지 항-토끼 IgG 항체 및 AlexaFluor555 표지 항-마우스 IgG 항체를 이용하였다. 형광 현미경으로 관찰하고, 결과를 도 11에 나타낸다.
이 결과로부터, 동결 보존한 세포에 있어서도 융해 후에 회복 배양함으로써 인간 각막 내피 세포의 기능 단백인 Na+/K+ ATPase 및 ZO-1의 발현이 정상적으로 발현함을 확인할 수 있었다.
(고찰)
이상의 결과로부터, 실시예 3에서 동결 보존한 후 융해·회복한 세포 집단은 동결 보존하지 않고 배양을 계속한 세포와 동일하게 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 높음을 확인할 수 있었다.
(실시예 5: 다른 배지를 사용한 경우의 동결 보존과 생존율의 확인)
실시예 5에서는 동결 보존 후의 생존율에 대한 배지의 종류의 영향을 조사하였다.
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 18세 남성 및 10세 남성의 것이다.
사용한 배지는 Essential 6 + 8 중량% FBS + 50 ㎍/㎖ 겐타마이신 + 10 μM Y-27632이다.
아울러, Essential 6 배지는 널리 세포 배양에 이용되고 있는 DMEM/F12 배지를 기본으로 하여 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 등을 첨가한 것으로, 그 조성이 공개되어 있는 것이다.
(동결 보존 후의 생존율의 확인)
전술한 실시예 3과 동일한 순서로 트리판 블루 염색법에 의해 생존율을 조사하였다. 결과를 이하의 표 2에 나타낸다.
| 생존율 | ||
| 기증자 1(18 Y) | 기증자 2(10 Y) | |
| 액체 질소 보존 | 76.5% | 81.7% |
| -80℃ 보존 | 77.7% | 76.6% |
(고찰)
실시예 3과 거의 동일한 생존율이 관찰된 것으로부터, 상이한 기본 배지를 사용한 경우에 있어서도 본 발명의 효과를 달성할 수 있음을 확인할 수 있었다.
(실시예 6: 세포의 채취 시기의 최적화)
실시예 6에서는 동결 보존할 때의 세포의 채취 시기에 대해 최적화하기 위한 검토를 행하였다.
(실시예 6-a: 세포의 채취 시기의 검토)
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 41세 여성의 것이다.
배지는 실시예 1의 배양 조건 2와 동일한 것을 사용하였다.
(배양과 동결 보존)
시애틀 안구 은행으로부터 입수한 상기 기증자 각막을 실시예 2와 동일한 조건으로 계대 2까지 배양하였다. 계대 3으로의 계대 시에 세포 현탁액을 5개의 플라스크로 나누고, 1개는 그대로 배양을 계속하고, 나머지 4개의 플라스크에 대해서는 계대로부터 3, 7, 10, 14일째에 각각 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 CELLBANKER I에 1 ㎖ 당 1,000,000 세포가 되도록 현탁하였다.
이 세포 현탁액을 액체 질소 탱크의 기층 부분에 넣고 동결해 액체 질소 탱크 내에서 동결 보존하였다.
배양을 계속하고 있던 1번째 플라스크의 세포를 계대 후 35일째에 I형 콜라겐 코팅된 24 웰 플레이트에 400 세포/㎟의 세포 밀도로 계대하였다.
액체 질소 탱크 내에서 동결 보존하고 있던 세포에 대해서도 배양을 계속하고 있던 세포와 동일한 날에 각각 해동 조작을 행하였다. 해동에는 ThowSTAR 동결 세포 융해 스테이션(Model CFTS, Astero Bio)을 사용하였다.
해동 후, 상기 배양 조건 2의 배지에서 세정한 세포를 I형 콜라겐 코팅된 24 웰 플레이트에 400 세포/㎟의 세포 밀도가 되도록 파종하였다.
이것을 5% v/v의 CO2를 포함하는 가습 대기 하, 37℃에서 배양하였다. 배지는 주에 2회의 빈도로 교환하였다. 24 웰 플레이트에 대한 파종으로부터 35일째에 FACS 해석 및 면역 세포 염색에 의해 단백질의 발현을 비교 해석하였다. 순서에 대해서는 도 12에 개요를 기재하였다. 각 세포 로트의 동결 보존을 위해 회수한 날의 세포 형태의 위상차 현미경 사진을 도 13에 나타낸다. 또, 동결 보존한 세포의 융해 후의 생존율 및 트리판 블루 염색 결과의 사진을 도 14에, 회복 배양 후 37일째의 위상차 현미경 사진, FACS 해석 및 면역 세포 염색의 결과를 도 15∼도 17에 나타낸다. 아울러, FACS 해석 및 면역 세포 염색에 대해서는 실시예 4와 동일한 순서로 행하였다.
(고찰)
도 13의 결과로부터, 계대 파종 후 14일째까지 세포 크기, 형태 모두 큰 변화가 보이고, 14일째에는 35일째의 기능성 인간 각막 내피 세포와 유사한 형상이 되어 있는 것으로부터, 이 시기까지는 세포가 분화 단계에 있음을 추측할 수 있다.
도 14의 결과로부터, 계대로부터 3일에 회수해 냉동 보존한 세포는 융해·회복 후의 생존율이 50%를 하회하고 있었지만, 14일째에 회수·동결 보존한 세포는 이것보다도 높게 생존율이 약 70%이고, 또한 7일째 또는 10일째에 회수·동결 보존한 세포는 추가로 높은 생존율을 나타내어, 계대 후의 회수 시기의 차이에 의해 생존율이 크게 상이함을 확인할 수 있었다.
또, 도 15∼도 17의 결과로부터, 또, 7일째, 10일째 또는 14일째에 회수·동결 보존한 세포는 융해 후의 회복 배양에 의해 동결 보존하지 않고 배양한 세포와 동등한 비율로 기능성 인간 각막 내피 세포를 함유하는 세포군이 되는 것으로 나타났다.
이 결과로부터, 냉동 보존 후에도 생존율이 높고, 또한 융해 후의 회복 배양에 의해 동결 보존하지 않고 배양한 세포와 동등한 비율로 기능성 인간 각막 내피 세포를 함유하는 세포군을 얻기 위해서는 직근의 계대로부터 4일 이상 14일 이하의 기간에 세포를 채취해 보존하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.
(실시예 6-b: 세포의 채취 시기의 최적화)
이 실시예는 실시예 6-a에서 밝혀진 세포의 채취 시기에 대하여, 추가로 최적화를 도모하기 위해 행한 것이다.
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 8세 남성의 것이다.
배지는 실시예 1의 배양 조건 2와 동일한 것을 사용하였다.
(배양과 동결 보존)
시애틀 안구 은행으로부터 입수한 상기 기증자 각막을 실시예 2와 동일한 조건으로 계대 4까지 배양하였다. 계대 5로의 계대 시에 세포 현탁액을 5개의 플라스크로 나누고, 계대로부터 6, 7, 8, 9, 10일째에 각각 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 STEMCELL-BANKER, 10% DMSO/90% FBS, 또는 BAMBANKER hRM(8일째만)에 1 ㎖ 당 1,000,000 세포가 되도록 현탁하였다.
이 세포 현탁액을 액체 질소 탱크의 기층 부분에 넣고 동결해 액체 질소 탱크 내에서 동결 보존하였다.
10일째의 회수·동결 보존하고 나서 200일 후(6일째에 회수·동결한 경우에는 204일 후)에 각각 해동 조작을 행하였다. 해동에는 37℃의 욕조를 사용하였다.
해동 후, 상기 배양 조건 2의 배지에서 세정한 세포를 I형 콜라겐 코팅된 24 웰 플레이트에 400 세포/㎟의 세포 밀도가 되도록 파종하였다.
이것을 5% v/v의 CO2를 포함하는 가습 대기 하, 37℃에서 배양하였다. 배지는 주에 2회의 빈도로 교환하였다. 24 웰 플레이트에 대한 파종으로부터 35일째에 FACS 해석 및 면역 세포 염색에 의해 단백질의 발현을 비교 해석하였다. 순서에 대해서는 도 18에 개요를 기재하였다. 동결 보존한 세포의 융해 후의 생존율을 도 19에, 회복 배양 후 35일째의 FACS 해석 및 면역 세포 염색의 결과를 도 20∼도 25에 나타낸다. 생존율의 확인은 다른 실시예와 동일하게 트리판 블루 염색에 의해 행하였다. 또, FACS 해석 및 면역 세포 염색에 대해서는 실시예 4와 동일한 순서로 행하였다. 도 19 우측의 막대 그래프는 8일째에 채취한 세포에 대하여, STEMCELL-BANKER, 10% DMSO/90% FBS, 또는 BAMBANKER hRM의 어느 하나를 동결 보존액으로 사용한 경우의 생존율을 각각 나타내고 있다.
(고찰)
도 19의 결과로부터, 직근의 계대로부터 6일 이상 10일 이하로 회수해 냉동 보존한 세포는 융해·회복 후의 생존율이 모두 80%를 넘는 높은 생존율을 나타내어, 이 시기에 회수하는 것이 보다 바람직한 것으로 나타났다. 또, 도 19의 우측에 나타낸 그래프로부터, 전술한 기간에 채취해 보존한 세포이면 동결 보존액의 종류를 변경한 경우에 있어서도 충분히 높은 생존율을 나타냄을 알 수 있었다.
또, 도 20∼도 25의 결과로부터, 이 시기에 회수·동결 보존한 세포는 융해 후의 회복 배양에 의해 높은 기능성 인간 각막 내피 세포를 유지하는 세포군이 되는 것으로 나타났다. 또, 보존액의 종류를 변경한 경우에 있어서도 보존 후의 생존율이나 회복 배양 후의 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유 비율에 큰 변화가 없음을 확인할 수 있었다.
(실시예 7: 세포의 채취 시기를 나타내는 다른 지표에 대하여)
실시예 6에서는 세포의 채취 시기의 지표로서 플레이트에 파종(계대)하고 난 후의 일수에 대해 검토하였다. 실시예 7에 있어서는 실시예 6에서 특정된 시기의 세포가 갖는 특징을 조사함으로써, 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 채취하는 시기를 특정하는 다른 지표에 대해 검토하였다.
(실시예 7-a: 세포 형태에 의한 지표에 대하여)
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 29세 남성의 것이다.
배지는 실시예 1의 배양 조건 2와 동일한 것을 사용하였다.
(세포의 배양과 세포 형태의 관찰)
시애틀 안구 은행으로부터 입수한 상기 기증자 각막으로부터 각막 내피 세포를 데스메 막과 함께 박리하고, 콜라게나아제에 의해 37℃에서 하룻밤 처리한 후, 상기 배지에 현탁하고, I형 콜라겐 코팅된 6 웰 플레이트에 1 눈 당 1 웰의 비율로 파종하였다. 전술한 실시예 2와 동일한 순서로 제4 계대까지 배양하였다. 배지 교환은 1주간 당 2회의 빈도로 행하였다.
제5 계대로 계대한 후, 동일한 조건으로 배양하고, 각 날짜의 세포 형태를 위상차 현미경으로 촬영하였다. 그 결과를 도 26, 보다 명확하게 하기 위하여 도 26의 일부의 확대도를 도 27에 나타낸다.
(고찰)
이 도 26 및 도 27의 결과로부터, 계대 파종 후 1일째, 2일째는 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 섬유아세포 모양의 형태가 되지만, 3일째부터 장경과 단경이 근사값으로 변화하고, 5일째에는 장단경의 비가 1에 가까운 이른바 부석상(다각형상 또는 원형상)의 생체 내 각막 내피 세포와 유사한 형상으로 변함을 관찰할 수 있었다. 이와 같이 큰 형태 변화는 파종 후 5일째까지 볼 수 있었다.
파종 후 2주째에는 세포의 크기가 균질하게 되고, 3주째부터는 개개의 세포의 경계가 명료한 상태로부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되고, 세포-세포 사이끼리의 접착이 형성되어, 약간 세포가 조밀하게 되어 가는 성숙 단계에 있는 것이라고 생각된다.
이상의 관찰로부터, 본 배양 조건에서는 파종 후 2주간(14일째)까지 재분화가 일어나고, 그 후 성숙 과정으로 이행하는 것이라고 추측된다.
실시예 6-a의 결과와 대조하여, 목적하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 채취할 수 있는 시기는 「세포 형태가 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 섬유아세포 모양의 형태로부터 미세한 돌기만을 갖는 장단경의 비가 1에 가까운 이른바 부석상(다각형상 또는 원형상)의 생체 내 각막 내피 세포와 유사한 형상으로 변한 직후부터 세포-세포 사이끼리의 접착이 형성되어 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다」라고 정의할 수 있다.
여기에서는 실시예 6-a의 일수를 기준으로 하고 있지만, 계대 시의 세포 밀도나 배양 조건 등에 따라서는 세포가 성숙하기까지 필요한 배양 일수가 변동할 가능성이 있다고 생각된다. 그러한 경우에 있어서도 이 실시예에서 얻은 세포 형태를 지표로서 세포를 채취하면, 적절한 시기에 세포를 채취할 수 있다고 생각된다.
(실시예 7-b: CD44의 발현량에 의한 채취 시기의 지표에 대하여)
세포의 채취 시기는 CD44의 발현량에 의해서도 확인할 수 있다.
실시예 7-a의 제5 계대로 계대한 후, 동일한 조건으로 배양한 세포에 대하여, 각 날짜의 CD44의 발현량을 플로우 사이토미터에 의해 계측하였다.
(실험에 사용한 재료)
· 실시예 7-a와 동일한 세포
· FACS 버퍼 및 항체 용액은 실시예 4와 동일한 것을 사용하였다.
(CD44의 발현량의 계측)
실시예 7-a의 제5 계대로 계대한 후, 동일한 조건으로 소정 일수 배양한 세포를 PBS(-)로 세정한 후, 10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)로 처리함으로써 배양 플레이트로부터 회수하고, FACS 버퍼 중에 4×106 세포/㎖가 되도록 현탁시켰다. 이 세포 현탁액 20 ㎕를 실시예 4와 동일한 방법으로 항체 염색한 후, FACSCanto™ II(BD Biosciences)로 해석하였다. 결과를 도 28에 나타낸다.
(결과·고찰)
CD44의 평균 형광 강도는 파종(계대) 직후에 15,000 이상으로 상승한 후 11일째까지 대수적으로 감소하고 있었다. 17일째에는 거의 안정기에 이르고 있어, 계대 파종 후 대략 2주간에 분화가 종료하여 성숙 과정으로 이행하는 것이라고 생각된다.
실시예 6-a의 결과 및 도 28의 결과로부터, 목적하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 채취할 수 있는 시기는 CD44의 발현량이 계대 후 1∼2일째에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기에 이를 때까지의 기간이라고 생각된다.
여기에서는 실시예 6-a의 일수를 기준으로 하고 있지만, 계대 시의 세포 밀도나 배양 조건 등에 따라서는 세포가 성숙하기까지 필요한 배양 일수가 변동할 가능성이 있다고 생각된다. 그러한 경우에 있어서도, 이 실시예에서 얻은 CD44의 발현량을 지표로 세포를 채취하면 적절한 시기에 세포를 채취할 수 있다고 생각된다.
(실시예 7-c: 세포 밀도에 의한 채취 시기의 지표에 대하여)
실시예 7-a의 세포에 대하여 계대 후부터의 ECD(각막 내피 세포 밀도) 경일 변화를 KSSE-400EB에 의해 계측하였다.
(실험에 사용한 재료)
· 실시예 7-a와 동일한 세포
· 해석 소프트웨어: KSSE-400EB(KONAN Medical)
(세포 밀도의 계측)
400 세포/㎟의 밀도로 제5 계대로 계대 파종한 실시예 7-a의 세포를 계대 후 2, 4, 6, 9, 12, 17, 35일째의 각 시점에서 PBS(-)로 세정하고, 위상차 현미경으로 사진 촬영하였다. 얻어진 화상을 KSSE-400EB 소프트웨어로 해석하였다. 그 결과를 도 29에 나타낸다.
(결과·고찰)
ECD(각막 내피 세포 밀도)는 제5 계대로의 계대 파종 직후부터 17일째까지 직선적으로 증가해 가고, 17일째 이후에 안정기에 이르렀다. 이 결과로부터, 계대 파종 후의 증식기는 성숙 과정으로 이행하는 17일째 무렵까지 계속된다고 생각된다. 이 증식기 중에서도 인간 성숙 분화 세포로 분화하는 운명이 결정된 시기∼성숙 과정으로 이행하기 전이라고 하는 한정된 시기에 채취하려면, 실시예 6-a의 결과와 대조하여, ECD의 값이 900 세포/㎟ 이상이고, 2,500 세포/㎟ 이하인 시기에 채취하는 것이 좋다고 생각된다.
여기에서는 실시예 6-a의 일수를 기준으로 하고 있지만, 계대 시의 세포 밀도나 배양 조건 등에 따라서는 세포가 성숙하기까지 필요한 배양 일수가 변동할 가능성이 있다고 생각된다. 그러한 경우에 있어서도, 이 실시예에서 얻은 세포 밀도를 지표로서 세포를 채취하면, 적절한 시기에 세포를 채취할 수 있다고 생각된다.
(실시예 8: 장기 동결 보존한 세포의 생존율과 회복 배양 후의 품질의 확인)
실시예 8에서는 실시예 6 및 7에서 최적화한 조건으로 동결 보존한 세포를 장기간 보존한 경우의 생존율, 및 회복 배양 후의 품질에 대해 조사하였다.
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 8세 남성의 것이다.
배지는 실시예 1의 배양 조건 2와 동일한 것을 사용하였다.
(세포의 배양과 동결 보존)
시애틀 안구 은행으로부터 입수한 상기 기증자 각막으로부터 각막 내피 세포를 데스메 막과 함께 박리하고, 콜라게나아제에 의해 37℃에서 하룻밤 처리한 후, 상기 배지에 현탁하고, I형 콜라겐 코팅된 6 웰 플레이트에 1 눈 당 1 웰의 비율로 파종하였다. 전술한 실시예 2와 동일한 순서로 제2 계대까지 배양하였다. 배지 교환은 1주간 당 2회의 빈도로 행하였다. 파종으로부터 7일째에 세포를 회수하고, 실시예 6과 동일한 방법에 의해 동결하고, 액체 질소 세포 보존 용기 중에서 보존하였다.
보존으로부터 99일째, 160일째, 171일째에 세포를 욕조 중에서 융해하고, 실시예 3과 동일한 순서로 트리판 블루 염색법에 따라 생존율을 조사하였다. 또, 죽은 세포가 파괴되어 버려 외관의 생존율이 올라버린 것은 아닌가 하는 의문을 해소하기 위하여, 냉동 보존에 제공한 세포 수와 냉동 보존 후에 생존율을 조사했을 때의 세포 수의 비인 회수율(냉동 보존 후의 세포 수/냉동 보존에 제공한 세포 수)에 대해서도 조사하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
| 액체 질소 중 보존 기간 | 생존율 | 회수율 |
| 99일 | 89.9% | 97.5% |
| 160일 | 87.4% | 104.0% |
| 171일 | 90.7% | 94.8% |
(동결 보존 후에 회복 배양한 세포의 품질 평가)
이 중, 99일간 액체 질소 보존한 세포에 대하여, 배양 조건 2로 33일간 배양하고, 세포 형태, FACS 해석, 면역 세포 염색에 의한 기능 단백 발현을 평가한 결과를 도 30a∼도 30c에 나타낸다. FACS 해석 및 면역 세포 염색에 대해서는 실시예 4와 동일한 순서로 행하였다. KSS-400EB 소프트웨어로 해석한 세포 밀도는 3,344±150.8 세포/㎟, 32일째의 배양 상청의 PDGF-BB의 농도는 217.5±1.53 pg/㎖였다. 이상과 같이, 본 발명에 의해 회복 배양 후에 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 높은 세포 집단을 얻을 수 있는 세포 집단을 5개월 이상의 기간에 걸쳐 생존율을 90% 이상 유지한 채로 동결 보존할 수 있음을 확인할 수 있었다.
(실시예 9: 세포의 빙온 보존과 생존율의 확인)
실시예 9에서는 세포를 현탁액 상태로 빙온 보존한 경우의 생존율에 대한 계대 후 회수 시기의 영향에 대해 조사하였다.
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 8세 남성의 것이다.
배지는 실시예 1의 배양 조건 2와 동일한 것을 사용하였다.
각 샘플은 이하와 같다.
샘플 1: 실시예 2와 동일한 순서로 배양하고, 동결 보존하지 않고 계대 3으로 94일간 배양한 세포.
샘플 2: 실시예 2와 동일한 순서로 배양하고, 계대 2의 7일째에 회수해 실시예 3과 동일한 순서로 동결 보존하고, 해동 후 계대 3으로 33일간 배양한 세포.
샘플 3: 실시예 2와 동일한 순서로 배양하고, 계대 2의 7일째에 회수해 실시예 3과 동일한 순서로 동결 보존하고, 해동 후 계대 5까지 계대를 반복하고, 계대 6으로 9일간 배양한 세포.
(빙온 보존과 보존 후의 생존율)
전술한 샘플 1∼샘플 3을 10× TrypLE™ Select(Thermo Fisher Scientific)에 의해 배양 용기로부터 박리하고, 세포 현탁액을 제조하였다.
각 세포 현탁액의 일부(10 ㎕)를 트리판 블루 염색한 후, 살아있는 세포 수 및 죽은 세포 수를 혈구 계산반을 이용해 계측하였다. 이 계측 결과를 기초로 3.33×106 세포/㎖의 세포 밀도가 되도록 각각의 순화 배지에서 현탁하고, 1.5 ㎖용의 시판되는 마이크로 튜브에 넣어 빙중에서 보존하였다.
(빙온 보존 후의 생존율의 확인)
보존 개시로부터 1, 2, 3 및 4일째에 각 세포 현탁액의 일부(10 ㎕)를 채취하고, 트리판 블루 염색한 후, 혈구 계산반을 이용해 살아있는 세포 수 및 죽은 세포 수를 계측하여 세포의 생존율을 산출하였다. 도 31에는 트리판 블루 염색의 결과를, 도 32에는 도 31의 결과로부터 산출된 생존율을 각각 나타낸다.
도 32의 결과로부터, 샘플 1은 1일째, 샘플 2에서는 2일째에 생존율이 70%를 하회하고 있는데 대해, 샘플 3에서는 4일째에서도 80%를 넘는 생존율을 유지하고 있음을 알 수 있었다.
(고찰)
이상의 결과로부터, 동결 보존과 동일하게 직근의 계대 후 4일 이상 14일 이하의 시기에 회수해 보존하면, 성숙 후에 회수한 경우에 비해 빙온 보존에 있어서도 생존율이 높은 채로 유지할 수 있음이 확인되었다.
(실시예 10: 세포의 빙온 보존에서의 보존액의 영향)
실시예 10에서는 빙온 보존할 때에 사용하는 보존액의 종류에 의한 생존율에 대한 영향을 조사하였다.
(실험에 사용한 재료)
실험에 사용한 세포는 실시예 9의 샘플 3이다.
실험에 사용한 보존액은 이하와 같다.
보존액 A: 순화 배지
보존액 B: 당일 제조한 실시예 1의 배양 조건 2의 배지
보존액C: 당일 제조한 Opti-MEM + 100 μM Y-27632
(빙온 보존과 생존율의 확인)
실시예 9의 샘플 3의 세포를 전술한 보존액 A, B 또는 C에 3.33×106 세포/㎖의 세포 밀도가 되도록 현탁하고, 빙중에서 보존하였다.
보존 개시로부터 1, 2, 3 및 4일째에 각 세포 현탁액의 일부(10 ㎕)를 채취하고, 트리판 블루 염색한 후, 혈구 계산반을 이용해 살아있는 세포 수 및 죽은 세포 수를 계측하여 세포의 생존율을 산출하였다. 도 33에는 트리판 블루 염색의 결과를, 도 34에는 도 33의 결과로부터 산출된 생존율을 각각 나타낸다.
도 34의 결과로부터, 어느 보존액을 사용한 경우에 있어서도 적어도 2일간은 70% 이상의 생존율을 유지할 수 있음을 알 수 있었다.
또, 순화 배지이면 4일째 이후에 있어서도 80% 이상의 높은 생존율을 유지할 수 있음을 알 수 있었다.
(고찰)
이상의 결과로부터, 빙온 보존에 있어서 사용할 수 있는 보존액은 다방면에 걸치는 것을 추론할 수 있다.
또, 보다 적합한 보존액을 사용함으로써 빙온 보존에 있어서도 4일을 상회하는 장기간에 걸쳐서 인간 각막 내피 세포의 생존율을 80% 이상으로 높은 채로 유지할 수 있음을 알 수 있었다.
(실시예 11: 빙온 보존한 세포의 기능성 인간 각막 내피 세포로의 분화 성숙 기간의 평가)
실시예 11에서는 빙온 보존한 세포가 인간에 대한 이식과 동일한 세포 밀도로 파종한 경우에 인간에 이식한 경우와 동일하게 조기에 기능성 인간 각막 내피 세포로 분화 성숙하는지를 확인하였다.
(세포 형태의 평가)
인간에 대한 이식에서는 3.33×106 세포/㎖의 세포 밀도의 현탁액 300 ㎕를 전방(前房) 내에 주입하고 있다. 여기서, 실시예 9에 있어서, 보존액 A를 사용해 4일간 빙온 보존한 세포 현탁액(인간에 대한 이식 시와 동등한 세포 밀도를 가짐)을 인간 내피 면에 가까운 면적을 갖는 24 웰 플레이트(직경 약 7.78 mm, 바닥 면적 190 ㎟, I형 콜라겐 코팅됨)에 300 ㎕ 파종하였다. 파종 후, 실시예 1의 배양 조건 2로 7일간 배양하였다. 이 때의 위상차 현미경 사진을 도 35에 나타낸다.
도 35로부터, 4일간 빙온 보존한 세포에 있어서도 인간에 대한 이식과 동일한 세포 밀도로 파종한 경우, 파종 후 1주간에 기능성 인간 각막 내피 세포의 형태로 되어 있음을 알 수 있다.
(면역 염색법에 따른 평가)
도 35의 세포를 빙냉 메탄올로 고정화하고, 인간 각막 내피 세포의 기능 단백인 Na+/K+ ATPase 및 ZO-1의 발현을 면역 염색법에 따라 확인하였다. 결과를 도 36에 나타낸다.
도 36의 결과로부터, 거의 모든 세포에 있어서 Na+/K+ ATPase 및 ZO-1의 발현을 확인할 수 있었다.
(고찰)
이상의 결과로부터, 빙온에서 4일간 보존한 세포에 있어서도 인간에 대한 이식 시와 동등한 세포 밀도로 파종한 경우, 인간에 대한 이식 시와 동일하게 1주간에 분화 성숙하고, 인간 각막 내피 세포 기능 단백을 발현함을 확인할 수 있었다.
이 실시예 11에 있어서, 파종 후 1주간이라고 하는 단기간에 기능성 인간 각막 내피 세포의 집단을 얻을 수 있는 이유의 하나로는 증식 기간이 불필요한 고밀도로 파종했기 때문에 파종 후 곧바로 분화 성숙으로 향했기 때문이라고 생각된다.
(실시예 12: 냉동 보존 후의 인간 각막 내피 세포의 단기 확대 배양)
이상의 실시예 1∼실시예 11에 있어서, 직근의 계대로부터 14일 이내에 세포를 회수한 경우에 있어서도 보존 후의 배양에서 상전이가 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 여기서, 실시예 12에서는 14일 이내에 세포를 회수해 계대를 반복하는 방법에 의해 종래보다도 단기간에 인간 각막 내피 세포를 증식시키는 것을 시험하였다.
(배양 조건)
실시예 2와 동일한 순서로 계대 2의 7일째까지 배양하고, 이 계대 2의 7일째의 세포를 회수해 실시예 3과 동일한 순서로 동결 보존하였다.
동결 보존 후의 세포 현탁액을 해동하고, 배양 개시 시의 세포 밀도가 400 세포/㎟의 세포 밀도가 되도록 파종하고, 8일부터 10일에 계대하는 것을 계대 8까지 반복해 세포를 증식시켰다.
(결과와 고찰)
이 결과를 도 37 및 표 4에 나타낸다. 아울러, 도 37의 위상차 현미경 사진은 계대 8의 10일째의 것이다.
이들 도 37 및 표 4의 결과로부터, 세포 수를 1,000배로 하기 위하여 종래의 방법에서는 반년 이상 걸리고 있었지만, 본 실시예에 의하면 불과 50일 정도로까지 단축할 수 있음을 알 수 있었다.
추가로, 이 계대 8의 10일째의 세포를 계대 9로 계대하고, 배양 조건 2로 34일간 배양한 세포의 위상차 현미경 사진을 도 38a에, FACS 해석에 의한 표면 항원의 해석 결과를 도 38b에 나타낸다. FACS 해석은 실시예 4와 동일한 순서로 행하였다. 분화 성숙 전인 파종 후 8일부터 10일 간격으로 계대를 반복한 세포도, 최종적으로 ROCK 저해제를 함유하고, 또한 EGF의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 추가로 배양함으로써 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 충분히 높은 세포 집단을 얻을 수 있음을 확인할 수 있었다.
(실시예 13: 인간 각막 내피 세포의 단기 확대 배양)
전술한 실시예 12에 있어서는 동결 보존 후의 세포 현탁액을 해동해 단기 확대 배양한 예를 기재하였지만, 본 실시예에 있어서는 냉동 보존하고 있지 않은 세포에 대한 단기 확대 배양을 시험하였다.
(실험에 사용한 재료)
사용한 기증자 각막은 29세 남성의 것 및 8세 여성의 것이다.
(배양 조건)
동일한 기증자 각막 중 1개 눈을 실시예 1의 배양 조건 1로 35일 간격으로 계대해 배양하였다(대조예 1). 다시 1개 눈을 실시예 1의 배양 조건 2로 배양하고, 계대 1에 대한 계대 시에 2개로 나누고, 한 쪽을 실시예 1의 배양 조건 2로 35일 간격으로 계대해 배양하고(대조예 2), 다른 쪽을 실시예 12와 동일하게 8일 전후(5일∼11일)의 간격으로 계대를 반복해 배양하였다(실시예 13). 순서의 개요를 도 39에 나타낸다.
(결과와 고찰)
도 40에 증식률로부터 산출한 수량과 배양 규모를 나타낸다. 8일 전후의 간격으로 계대를 반복한 본 실시예의 단기 확대 배양법에서는 80일 이내에 20억개의 세포, T-25 플라스크로 환산하면 500 플라스크 분의 세포를 얻을 수 있음이 나타났다.
또, 계대 4까지 전술한 단기 확대 배양법으로 배양하고, 계대 5에서 약 5주간 배양한 세포와 대략 동일한 일수 배양한 대조예 2의 세포, 계대 5까지 배양한 대조예 2의 세포의 사진 및 수량의 비교를 도 41 및 도 42에 나타낸다.
동일하게 계대 6까지 단기 확대 배양법으로 배양하고, 계대 7에서 약 5주간 배양한 세포와 대략 동일한 일수 배양한 대조예 2의 세포, 계대 7까지 배양한 대조예 2의 세포의 사진 및 수량의 비교를 도 43 및 도 44에 나타낸다.
(고찰)
도 41∼도 44의 결과로부터, 본 실시예에서의 단기 확대 배양법에 의해서도 기능성 인간 각막 내피 세포의 함유율이 충분히 높은 세포 집단을 단기간에 고수량으로 얻을 수 있음이 나타났다.
(실시예 1∼실시예 13에 대한 고찰)
이상의 각 실시예의 결과로부터, 적절한 배양 조건으로 배양됨으로써 기능성 인간 각막 내피 세포가 되는 것으로 운명이 정해진 세포이면, 그 세포를 미성숙한 상태로 채취해 보존 또는 계대하더라도 목적하는 기능성 인간 각막 내피 세포를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (31)
- ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식시킨 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 이하에 기재한 (a)∼(d) 중 어느 하나 또는 복수의 조건을 만족하는 시기에 채취하고, 현탁 상태로 하여 보존하는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 보존 방법:
(a) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 방추상의 형태로부터 장경단경의 비가 1에 가까운 다각형상 또는 원형상의 형태로 변한 직후부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다;
(b) CD44의 발현량이 직근(直近)의 계대 후에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기(plateau)에 이를 때까지의 기간이다;
(c) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900 세포/㎟ 이상 2,500 세포/㎟ 이하이다;
(d) 직근의 계대로부터의 배양 일수가 4일 이상 14일 이하이다. - 청구항 1에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 10℃ 이하에서 보존하는 보존 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 -30℃ 이하에서 보존하는 보존 방법. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 현탁 상태로 하고 나서 24시간 이상 보존하는 보존 방법. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형질전환이 내피 간엽 전환을 포함하는 보존 방법. - 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포가 각막 내피 세포 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 각막 내피로부터 채취한 각막 내피 전구세포, 각막 내피로부터 채취한 세포, 및 직접 프로그래밍법으로 제작되는 각막 내피 전구세포 및 각막 내피 모양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 기원으로 하여 작성된 것인 보존 방법. - 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
보존 후의 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식 및/또는 분화·성숙시켜 얻은 인간 각막 내피 세포의 세포 집단이 이하의 (1)∼(8) 중 1 또는 복수의 항목을 만족하는 것인 보존 방법:
(1) 위상차 화상에 의한 외관 검사에서 섬유아세포, 이물, 변색, 또는 다른 이상이 없다;
(2) 세포 생존율이 트리판 블루 염색에서 70% 이상이다;
(3) 세포 상청의 ELISA에 의한 순도 시험에서 PDGF-BB가 100 pg/㎖ 이상이다;
(4) 세포의 FACS에 의한 순도 시험 결과가 이하의 범위를 모두 만족하는 것이다;
CD166+ > 99%
CD24+ < 5%
CD44high < 5%
CD44neg∼low > 90%
CD90+ < 5%
(5) 인간 각막 내피 기능을 구비하고 있는 이펙터 세포의 함유율(E-ratio)이 90%보다 높다;
(6) 펌프 기능(Na+/K+ ATPase)이 양성이다;
(7) 배리어 기능(ZO-1)이 양성이다;
(8) 인간 각막 내피 세포 밀도(ECD)가 1,500 세포/㎟ 이상이다. - 청구항 7에 있어서,
상기 이펙터 세포가 내피 간엽계 이행이 일어나지 않은 것인 보존 방법. - 청구항 7 또는 청구항 8에 있어서,
상기 이펙터 세포가 각막 내피 기능 특성을 발휘하기 위해 필요한 기능 단백을 발현하고 있거나, 또는 상기 각막 내피 기능 특성을 저해하는 저해 단백이 발현되지 않거나 혹은 저해 단백의 발현이 저하되어 있는 것인 보존 방법. - 청구항 9에 있어서,
상기 기능 단백이 Na+/K+ ATPase, ZO-1, 나트륨/수소 교환체 1(NHE1), 아쿠아포린 1(AQP-1) 및 탄산탈수효소 5B(CA5B)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 복수를 포함하는 보존 방법. - 청구항 9 또는 청구항 10에 있어서,
상기 기능 단백이 시트르산 신타아제(CS), 아코니타아제 2(ACO2), 이소시트르산 탈수소효소 2(IDH2), 말산 탈수소효소 2(MDH2), 말산 효소 3(ME3), ACSS1, 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제 1(ACAT1), 피루브산 탈수소효소(PDH), BCAT2, 및 분기쇄 케토산 탈수소효소 2(BCKDH2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 또는 복수의 대사 관련 효소를 추가로 포함하는 보존 방법. - 청구항 9 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
상기 저해 단백이 ATP 시트르산 리아제(ACLY), 아코니타아제 1(ACO1), 이소시트르산 탈수소효소 1(IDH1), 말산 탈수소효소 1(MDH1), 말산 효소 1(ME1), ACSS2, 아세틸 CoA 아세틸 트랜스퍼라아제 2(ACAT2) 및 락트산 탈수소효소(LDH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종 이상의 대사 관련 효소를 포함하는 보존 방법. - 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법으로 보존된 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포.
- 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법으로 보존된 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 현탁액.
- 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법으로 보존된 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식 및/또는 분화·성숙시키는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포의 제조 방법.
- ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식시킨 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 이하에 기재한 (a)∼(d) 중 어느 하나 또는 복수의 조건을 만족하는 시기에 채취하고, 현탁 상태로 하는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 현탁액 제조 방법:
(a) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 섬유아세포 모양의 형태로부터 상기 돌기를 포함한 장경단경의 비가 1에 가까운 부석상의 형태로 변한 직후부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다;
(b) CD44의 발현량이 직근의 계대 후에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기에 이를 때까지의 기간이다;
(c) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900 세포/㎟ 이상 2,500 세포/㎟ 이하이다;
(d) 직근의 계대로부터의 배양 일수가 4일 이상 14일 이하이다. - ROCK 저해제를 함유하고, 또한 상피 성장 인자(EGF)의 함유량이 형질전환을 일으키는 농도 미만인 배지를 이용해 증식시킨 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 이하에 기재한 (a)∼(d) 중 어느 하나 또는 복수의 조건을 만족하는 시기에 채취하고, 계대하는 것을 특징으로 하는 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 배양 방법:
(a) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 불규칙한 가늘고 긴 돌기를 갖는 방추상의 섬유아세포 모양의 형태로부터 장경단경의 비가 1에 가까운 부석상의 형태로 변한 직후부터 세포 간의 경계가 불명료하게 되기 직전까지의 기간이다;
(b) CD44의 발현량이 직근의 계대 후에 보여지는 최대값의 절반 이하가 된 때로부터 안정기에 이를 때까지의 기간이다;
(c) 상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900 세포/㎟ 이상 2,500 세포/㎟ 이하이다;
(d) 직근의 계대로부터의 배양 일수가 4일 이상 14일 이하이다. - 배양한 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 보존하는 방법으로서,
복수의 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 얻는 공정과,
상기 복수의 세포의 적어도 일부를 분리하여 평가용의 세포 집단과 보존용의 세포 집단을 생성하는 공정과,
상기 세포 집단의 적어도 일부를 이하의 (a), (b), (c) 및 (d)의 평가 기준 중 하나 이상에 대해 평가하는 공정과,
(a) 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 방추형으로부터 (ⅰ) 다각형 또는 (ⅱ) 장축과 단축의 비가 1에 가까운 타원형 중 어느 것으로 변화하고, 또한 세포 간의 경계가 명료해져 있는 세포를 특정하는 것이고,
(b) CD44의 발현량이 직전의 계대 후에 관찰된 최대값의 절반 이하의 레벨로 CD44를 발현한 후, 일정량의 CD44를 발현하는 세포를 특정하는 것이고,
(c) 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900개/㎟ 이상 2,500개/㎟ 이하인 것을 식별하는 것이고, 및
(d) 상기 평가로부터 직전의 계대까지의 기간이 4일 이상 14일 이하인지 여부를 특정하는 것이고;
평가용의 세포 집단이 상기 (a), (b), (c) 및 (d) 중 어느 평가 기준을 하나 이상 만족하고 있는 경우에, 세포 집단으로부터 적어도 일부의 세포를 보존하기 위해 보존 매체에 배치하는 공정을 구비하는 보존 방법. - 청구항 18에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 10℃ 이하에서 보존하는 보존 방법. - 청구항 18 또는 청구항 19에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포를 24시간 이상 보존하는 보존 방법. - 청구항 18 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포가 각막 내피 세포 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 각막 내피로부터 채취한 각막 내피 전구세포, 각막 내피로부터 채취한 세포, 및 직접 프로그래밍법으로 제작되는 각막 내피 전구세포 및 각막 내피 모양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 기원으로 하여 작성된 것인 보존 방법. - 배양한 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 처리하는 방법으로서,
복수의 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포를 배양액을 포함하는 배양 용기 내에서 배양하는 공정과,
상기 복수의 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 적어도 일부를 분리하여 평가용의 세포 집단과 나머지 세포 집단을 생성하는 공정과,
세포 집단의 적어도 일부를 이하의 (a), (b), (c) 및 (d)의 평가 기준 중 하나 이상에 대해 평가하는 공정과,
(a) 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 형태가 방추형으로부터 (ⅰ) 다각형 또는 (ⅱ) 장축과 단축의 비가 1에 가까운 타원형 중 어느 것으로 변화하고, 또한 세포 간의 경계가 명료해져 있는 세포를 특정하는 것이고,
(b) CD44의 발현량이 직전의 계대 후에 관찰된 최대값의 절반 이하의 레벨로 CD44를 발현한 후, 일정량의 CD44를 발현하는 세포를 특정하는 것이고,
(c) 인간 각막 내피 세포 및/또는 인간 각막 내피 전구세포의 세포 밀도가 900개/㎟ 이상 2,500개/㎟ 이하인 것을 식별하는 것이고, 및
(d) 상기 평가로부터 직전의 계대까지의 기간이 4일 이상 14일 이하인지 여부를 특정하는 것이고;
상기 평가용의 세포 집단이 상기 (a), (b), (c) 및 (d)의 평가 기준 중 하나 이상을 만족하고 있는 경우에, 세포 집단으로부터 세포의 적어도 일부를 보존하기 위해 보존 매체에 배치하는 공정, 또는 상기 평가용의 세포 집단이 (a), (b), (c) 및 (d)의 각 평가 기준을 만족하지 않는 경우에, 배양액을 포함하는 배양 용기에 상기 나머지 세포 집단으로부터 적어도 일부의 세포를 넣고, 추가로 일정 기간 배양하는 공정을 포함하는 처리 방법. - 청구항 22에 있어서,
상기 배양액이 ROCK 저해제를 포함하고, 배양액이 세포의 형질전환을 일으키는 농도 이하의 상피 성장 인자(EGF)를 포함하고 있는 처리 방법. - 청구항 22 또는 청구항 23에 있어서,
상기 배양액이 ROCK 저해제를 포함하고, 상기 배양액이 상피 성장 인자(EGF)의 농도가 2 ng/㎖ 이하인 처리 방법. - 청구항 24에 있어서,
상기 배양액이 EGF를 함유하지 않는 처리 방법. - 청구항 22 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
상기 인간 각막 내피 세포 및/또는 상기 인간 각막 내피 전구세포가 각막 내피 세포 유래 세포, 다능성 줄기 세포, 간엽계 줄기 세포, 각막 내피로부터 채취한 각막 내피 전구세포, 각막 내피로부터 채취한 세포, 및 직접 프로그래밍법으로 제작되는 각막 내피 전구세포 및 각막 내피 모양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포를 기원으로 하여 작성된 것인 처리 방법. - 청구항 18 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법 또는 처리 방법에 의해 보존된 세포를 보존 상태로부터 꺼내고, 추가 배양을 위해 새로운 배양 용기로 되돌리는 공정을 추가로 포함하고, 추가 배양에 제공된 세포가 이하의 (1)∼(8)의 평가 기준 중 하나 이상을 만족하는 방법:
(1) 위상차 화상에 의한 외관 검사에서 섬유아세포, 이물, 변색, 또는 다른 이상이 없다;
(2) 세포 생존율이 트리판 블루 염색에서 70% 이상이다;
(3) 세포 상청의 ELISA에 의한 순도 시험에서 PDGF-BB가 100 pg/㎖ 이상이다;
(4) 세포의 FACS에 의한 순도 시험 결과가 이하의 범위를 모두 만족하는 것이다;
CD166+ > 99%
CD24+ < 5%
CD44high < 5%
CD44neg∼low > 90%
CD90+ < 5%
(5) 인간 각막 내피 기능을 구비하고 있는 이펙터 세포의 함유율(E-ratio)이 90%보다 높다;
(6) 펌프 기능(Na+/K+ ATPase)이 양성이다;
(7) 배리어 기능(ZO-1)이 양성이다;
(8) 인간 각막 내피 세포 밀도(ECD)가 1,500 세포/㎟ 이상이다. - 청구항 18 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법 또는 처리 방법에 의해 보존되고, 상기 보존 상태로부터 꺼내진 세포가 눈의 질환 또는 상해를 치료하기 위해 대상자의 눈에 송달하는데 적합한 것인 방법.
- 청구항 18 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법 또는 처리 방법에 의해 보존되고, 상기 보존 상태로부터 꺼내진 세포가 눈의 질환 또는 상해를 치료하기 위해 대상자의 눈에 송달하는 의약품의 제조에 적합한 것인 보존 방법.
- 청구항 18 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 기재된 보존 방법 또는 처리 방법에 의해 보존되고, 상기 보존 상태로부터 꺼내진 세포가 눈의 질환 또는 상해의 치료에 사용하는데 적합한 것인 보존 방법.
- 청구항 28 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
상기 눈의 질환 또는 상기 상해가 각막의 질환 또는 손상인 방법.
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