CN116583593A - 人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法 - Google Patents

人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法 Download PDF

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Abstract

将人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞在维持高生存率的同时进行保存，且在保存后的培养中将杂质细胞的发生比例抑制得小。一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)‑(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集，使其成为悬浮状态并进行保存：(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从纺锤状的形态转变为长径短径的比接近1的多边形或圆形的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下；(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。

Description

人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法
技术领域
本发明涉及可以通过在保存后再次培养而分化成熟、表达人角膜内皮细胞功能特性的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法。
背景技术
作为体外培养人角膜内皮细胞的方法，如专利文献1、非专利文献1以及非专利文献2所示，已知有给予表皮生长因子(EGF)并进一步给予其它因子从而进行培养的方法，所述其它因子抑制因给予EGF而对人角膜内皮细胞的成熟、分化带来的不良影响。
对此，如专利文献2及专利文献3所示，本发明人等开发了尽可能不给予表皮生长因子(EGF)而培养人角膜内皮细胞的方法。与专利文献1、非专利文献1以及非专利文献2记载的培养方法相比，根据该专利文献2或专利文献3记载的培养方法，能够尽可能抑制不具有人角膜内皮功能特性的杂质细胞(夾雑細胞)的产生，得到与存在于人体内的角膜内皮细胞具有同等角膜内皮功能特性的功能性人角膜内皮细胞(以下也称为效应细胞)的含有率提高的细胞群。
但是，还没有建立将通过专利文献2或专利文献3记载的方法培养的细胞群或该细胞群中含有的功能性人角膜内皮细胞以悬浮状态进行保存的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开2017/110094号公报
专利文献2：国际公开2009/028631号公报
专利文献3：日本特愿2020-032139
非专利文献
非专利文献1：Vianna L.M.M.,et al.(2016)Arg Bras Oftalmol.；79(1):37
非专利文献2：Okumura N.,et al.(2019)PLos ONE 14(6):e0218431
发明内容
发明要解决的技术问题
通过所述专利文献2或专利文献3记载的方法培养的细胞群或该细胞群中含有的功能性人角膜内皮细胞作为再生医疗等产品在国际上供给时，希望所述细胞群或所述功能性人角膜内皮细胞可以在悬浮状态下至少保存数日，而不是单层培养的状态。
因此，本发明人研究了将通过专利文献2或专利文献3记载的方法培养的细胞群或功能性人角膜内皮细胞在悬浮状态下至少保存数日的方法。
此外，冷冻保存对于细胞数年以上的长期保存、细胞的库化(バンク化)有益，还对冷冻保存功能性人角膜内皮细胞的方法的建立进行了研究。
通过专利文献2或专利文献3记载的方法，为了使人角膜内皮细胞增殖，成熟分化到成为功能性人角膜内皮细胞的含有率(以下也称为E-ratio)高于90％的细胞群，需要培养4周-5周以上。
因此，首先尝试收集通过专利文献2或专利文献3记载的方法培养4周以上的使其成熟分化到成为功能性人角膜内皮细胞的含有率高于90％的细胞群的细胞群，使其成为悬浮状态进行保存。
结果得知，若将使其成熟分化到成为功能性人角膜内皮细胞的含有率高于90％的细胞群后的细胞群在悬浮状态下保存，则保存后的生存率低，在保存后的培养中杂质细胞的发生比例变高。
根据该结果，本发明人进行了关于将人功能性角膜内皮细胞(通过专利文献2或专利文献3记载的方法培养的细胞)在有利地维持高生存率的同时以悬浮状态保存且抑制杂质细胞的产生的方法的开发。
其结果，本发明人发现，只要在确定分化为功能性人角膜内皮细胞的命运后即刻且在增殖力高的时期收集细胞群使其成为悬浮状态，就可以在维持高生存率的同时进行保存，且在保存后的培养中将杂质细胞的发生比例抑制得小，建立了人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的新颖和改进的保存方法(及其所用的相关组合物)。
另外，本发明人认为，如果可以在确定分化为功能性人角膜内皮细胞的命运后即刻且在增殖力高的时期收集、保存细胞群，则通过在同一时期收集细胞、重复传代培养，能够在和以往相比非常短的期间内进行功能性人角膜内皮细胞的扩大培养，还建立了功能性人角膜内皮细胞的扩大培养方法。
这样，本发明人发现并首次完成了如下内容：在本发明中，只要是通过在适当培养条件下培养而注定成为功能性人角膜内皮细胞的细胞，通过在未成熟的状态下将该细胞收集并保存或传代，可以得到具有生存率提高及杂质细胞减少的目标性质的功能性人角膜内皮细胞。
解决技术问题的技术手段
即，本发明所涉及的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法如下。
[项目1]一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)-(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)为非添加或EGF的含量小于引起转化(形質転換)的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集，使其成为悬浮状态并进行保存：
(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为包含所述突起的长短径比接近1(例如约2:1-约1:2)的铺路石状(例如多边形或圆形)的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；
(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；
(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为约900个细胞/mm2以上约2500个细胞/mm2以下；
(d)从接种开始的培养天数为约4天以上约14天以下。
[项目2]如[项目1]所述的保存方法，其中，在约10℃以下保存所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。
[项目3]如[项目1]或[项目2]所述的保存方法，其中，在约-30℃以下保存所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。
[项目4]如[项目1]-[项目3]中任一项所述的保存方法，其中，在使所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞成为悬浮状态后保存约24小时以上。
[项目5]如[项目1]-[项目4]中任一项所述的保存方法，其中，所述转化包括内皮间质转化。
[项目6]如[项目1]-[项目5]中任一项所述的保存方法，其中，所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞是以选自于由角膜内皮细胞由来的细胞、多能干细胞、间充质干细胞、从角膜内皮收集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮收集的细胞以及由直接编程法制作的角膜内皮前体细胞和角膜内皮样细胞所组成的组的细胞作为起源而制作的细胞。
[项目7]如[项目1]-[项目6]中任一项所述的保存方法，其中，使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使保存后的所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞增殖和/或分化、成熟所得的人角膜内皮细胞的细胞群满足以下(1)-(8)中的一个或多个项目：
(1)在通过相位差成像进行的外观检查中，没有成纤维细胞、异物、变色或其它异常；
(2)细胞生存率在台盼蓝染色中为70％以上；
(3)细胞上清在通过ELISA进行的纯度试验中PDGF-BB为100pg/mL以上；
(4)细胞在通过FACS进行的纯度试验结果中满足以下所有范围：
CD166+>99％
CD24+<5％
CD44high<5％
CD44neg-low>90％
CD90+<5％；
(5)具有人角膜内皮功能的效应细胞的含有率(E-ratio)高于90％；
(6)泵功能(Na+/K+ATPase)为阳性；
(7)屏障功能(ZO-1)为阳性；
(8)人角膜内皮细胞密度(ECD)为1500个细胞/mm2以上。
[项目8]如[项目7]所述的保存方法，其中，所述效应细胞是未发生内皮间质转化的细胞。
[项目9]如[项目7]或[项目8]所述的保存方法，其中，所述效应细胞表达发挥所述角膜内皮功能特性所必需的功能蛋白，或者，不表达抑制所述角膜内皮功能特性的抑制蛋白或抑制蛋白的表达降低。
[项目10]如[项目9]所述的保存方法，其中，所述功能蛋白包括选自于由Na+/K+ATPase、ZO-1、钠/氢交换体1(NHE1)、水通道蛋白1(AQP-1)和碳酸脱水酶5B(CA5B)所组成的组中的一种或多种。
[项目11]如[项目9]或[项目10]所述的保存方法，其中，所述功能蛋白进一步包括选自于由柠檬酸合酶(CS)、乌头酸酶2(ACO2)、异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、苹果酸脱氢酶2(MDH2)、苹果酸酶3(ME3)、ACSS1、乙酰CoA乙酰基转移酶1(ACAT1)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、BCAT2和支链酮酸脱氢酶2(BCKDH2)所组成的组中的一种或多种代谢相关酶。
[项目12]如[项目9]-[项目11]中任一项所述的保存方法，其中，所述抑制蛋白包括选自于由ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、乌头酸酶1(ACO1)、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、苹果酸脱氢酶1(MDH1)、苹果酸酶1(ME1)、ACSS2、乙酰CoA乙酰基转移酶2(ACAT2)和乳酸脱氢酶(LDH)所组成的组中的至少1种以上的代谢相关酶。
另外，本发明还提供以下发明。
[项目13]通过[项目1]-[项目12]中任一项所述的保存方法保存的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞。
[项目14]通过[项目1]-[项目12]中任一项所述的保存方法保存的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的悬浮液。
[项目15]一种人角膜内皮细胞的制备方法，其特征在于，使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使通过[项目1]-[项目12]中任一项所述的保存方法保存的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞增殖和/或分化、成熟。
[项目16]一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)-(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集，使其成为悬浮状态：
(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为包含所述突起的长径短径的比接近1的铺路石状的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；
(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；
(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下；
(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。
[项目17]一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的培养方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)-(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集、传代：
(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为长径短径的比接近1的铺路石状的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；
(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；
(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下；
(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。
有益效果
根据本发明，可以将人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞在维持高生存率的同时保存至少数天以上，所述人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞可以通过在保存后再次培养而得到功能性人角膜内皮细胞的含有率高于约90％的细胞群。
其结果，通过再次培养，可以将功能性人角膜内皮细胞的含有率高于约90％的细胞群作为再生医疗等产品在国际上供给。
此外，通过冷冻保存可以实现主细胞库化，可以使得作为再生医疗等产品的制造变得更有效且有计划地进行。
附图说明
[图1]示出培养人角膜内皮细胞的培养条件导致的细胞形态的差异的相位差显微镜照片(第3代)。
[图2]在培养条件2中传代培养到第7代的培养人角膜内皮细胞的相位差显微镜照片。
[图3]示出培养条件1下培养的第3代的细胞以及培养条件2下培养的第3代或第7代的细胞的细胞表面抗原的分析结果的图。
[图4]示出对培养条件2下培养的第7代的细胞通过免疫染色法研究Na+/K+ATPase、ZO-1和N-钙粘蛋白的表达的结果的照片。
[图5]从第0代开始在培养条件2下培养的细胞的第7代中的相位差显微镜照片。
[图6]示出关于图5的细胞的细胞表面抗原等的表达的情况的照片及图。
[图7]示出根据本发明一个实施例的冷冻保存后的细胞的台盼蓝染色结果的照片。
[图8]示出冷冻保存后在培养条件2下培养的培养人角膜内皮细胞的细胞形态的经时变化的相位差显微镜照片。
[图9]比较冷冻保存的细胞和不冷冻保存而继续培养的细胞的形态的相位差显微镜照片。
[图10]示出冷冻保存的细胞和不冷冻保存而继续培养的细胞的细胞表面抗原的分析结果的图。
[图11]对冷冻保存后的细胞确认Na+/K+ATPase、ZO-1和N-钙粘蛋白的表达的荧光显微镜照片。
[图12]说明对适合于细胞保存的收集时期进行比较分析的步骤的图。
[图13]表示图12的各收集时期的细胞形态的相位差显微镜照片。
[图14]示出各收集时期的冷冻保存后的细胞生存率的图和照片。
[图15]比较将图14的冷冻保存后解冻的细胞在培养条件2下培养了35天的细胞和不冷冻保存而传代培养的细胞的形态的相位差显微镜照片。
[图16]比较将图14的冷冻保存后解冻的细胞在培养条件2下培养了35天的细胞和不冷冻保存而传代培养的细胞的表面抗原的图。
[图17]比较将图14的冷冻保存后解冻的细胞在培养条件2下培养了35天的细胞和不冷冻保存而传代培养的细胞的免疫染色结果的照片。
[图18]说明对适合于细胞保存的收集时期进行比较分析的步骤的图。
[图19]示出在图18所示的各收集时期收集、冷冻保存后的细胞的生存率的图。
[图20]表示在图18所示的各收集时期收集、冷冻保存后的细胞的细胞表面抗原等的表达的情况的图。
[图21]表示在图18所示的各收集时期收集、冷冻保存后的细胞的细胞表面抗原等的表达的情况的图。
[图22]表示在图18所示的各收集时期收集、冷冻保存后的细胞的细胞表面抗原等的表达的情况的图。
[图23]确认在图18所示的各收集时期收集、冷冻保存后的细胞中的Na+/K+ATPase、ZO-1和N-钙粘蛋白的表达的荧光显微镜照片。
[图24]确认在图18所示的各收集时期收集、冷冻保存后的细胞中的Na+/K+ATPase、ZO-1和N-钙粘蛋白的表达的荧光显微镜照片。
[图25]确认在图18所示的各收集时期收集、冷冻保存后的细胞中的Na+/K+ATPase、ZO-1和N-钙粘蛋白的表达的荧光显微镜照片。
[图26]表示在培养条件2下培养时细胞形态的经日变化的相位差显微镜照片。
[图27]表示在培养条件2下培养时细胞形态的经日变化的相位差显微镜照片。
[图28]表示在培养条件2下培养时CD44的表达量的经日变化的图。
[图29]表示在培养条件2下培养时ECD的经日变化的图。
[图30]冷冻保存后，在培养条件2下培养的细胞的相位差显微镜照片、示出表面抗原分析结果的图以及示出免疫染色结果的照片。
[图31]示出冰温保存后的培养人角膜内皮细胞的台盼蓝染色结果的照片。
[图32]示出从图31的结果计算出的生存率的图。
[图33]示出使用各保存液时冰温保存后的细胞的台盼蓝染色结果的照片。
[图34]示出从图33的结果计算出的生存率的图。
[图35]将条件培养基(馴化培地)作为保存液冰温保存后，恢复培养的细胞的相位差显微镜照片。
[图36]示出将条件培养基作为保存液冰温保存后，恢复培养的细胞的免疫染色结果的照片。
[图37]解冻后以8-10天的间隔传代培养到第8代的细胞的增殖率和相位差显微镜照片。
[图38]示出将图29的细胞传代的第9代在培养条件2下培养34天的细胞的相位差显微镜照片和表面抗原分析结果的图。
[图39]说明实施例13中的细胞培养条件的图。
[图40]示出图39的各培养条件下的细胞产率和培养规模的变化的图。
[图41]图39的各培养条件下的细胞产率和培养的细胞的相位差显微镜照片。
[图42]图39的各培养条件下的细胞产率和培养的细胞的相位差显微镜照片。
[图43]图39的各培养条件下的细胞产率和培养的细胞的相位差显微镜照片。
[图44]图39的各培养条件下的细胞产率和培养的细胞的相位差显微镜照片。
具体实施方式
以下对本发明的一个实施方式进行说明。
本实施方式所涉及的保存方法是保存人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的方法。
这些人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞例如是根据专利文献2或专利文献3记载的方法使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基培养的细胞。
另外，在本申请说明书中，适当参考援引作为该专利文献2列举的日本特愿2020-032139的记载以及作为专利文献3列举的国际公开2017/110094号公报的记载。
所述人角膜内皮细胞或所述人角膜内皮前体细胞优选是以选自于由角膜内皮细胞由来的细胞、多能干细胞、间充质干细胞、从角膜内皮收集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮收集的细胞以及由直接编程法制作的角膜内皮前体细胞和角膜内皮样细胞所组成的组的细胞作为起源而制作的细胞。
在本说明书中，人角膜内皮前体细胞是表示具有通过分化成熟而成为人角膜内皮细胞的命运的细胞的概念，包括处于确定分化命运的中途阶段的细胞。
所述培养基可以使用在培养人角膜内皮细胞时使用的基本培养基，例如可以使用向Opti-MEM-I、Essential 6、DMEM/F12等中添加适当添加剂的培养基。
作为ROCK抑制剂(也称为Rho激酶抑制剂)可以列举以下文献中公开的化合物：美国专利4678783号、日本特許第3421217号、国际公开95/28387、国际公开99/20620、国际公开99/61403、国际公开02/076976、国际公开02/076977、国际公开2002/083175、国际公开02/100833、国际公开03/059913、国际公开03/062227、国际公开2004/009555、国际公开2004/022541、国际公开2004/108724、国际公开2005/003101、国际公开2005/039564、国际公开2005/034866、国际公开2005/037197、国际公开2005/037198、国际公开2005/035501、国际公开2005/035503、国际公开2005/035506、国际公开2005/080394、国际公开2005/103050、国际公开2006/057270、国际公开2007/026664等。这些化合物可以通过公开了所述化合物的各文献中描述的方法来制造。作为具体例可以举出1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪或其盐(例如法舒地尔(1-(5-异喹啉磺酰基)高哌嗪))、(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-1-(4-吡啶基氨基甲酰基)环己烷((R)-(+)-反式-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺)或其盐(例如Y-27632((R)-(+)-反式-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己烷甲酰胺二盐酸盐一水合物))等。这些化合物也可以从和光純薬株式会社、旭化成ファーマ等购买得到。
所述培养基中ROCK抑制剂的浓度例如优选为1μM-100μM，更优选5μM-20μM，特别优选10μM。
作为小于引起转化的浓度的浓度，意为表皮生长因子(EGF)的浓度小于作为对象的角膜内皮细胞发生转化(例如内皮间质转化)的浓度或完全不含EGF。在一些实施方式中，低于引起转化的浓度的EGF浓度例如为约0ng/ml以上约5ng/ml以下、约1ng/ml以上约4ng/ml以下、约2ng/ml以上约3ng/ml以下、约0ng/ml以上约2ng/ml以下、约0ng/ml以上约1ng/ml以下，以及其间的任意量。更具体地，作为小于引起转化的浓度的EGF浓度，例如为小于2ng/mL、优选小于1ng/mL、进一步优选小于0.5ng/mL；从能够完全排除因EGF添加导致的对人角膜内皮细胞的分化成熟过程的不良影响的观点出发，特别优选0ng/mL(非添加)。在一些实施方式中，培养基例如还不包含通过作用于上游或下游的信号转导体来模仿EGF效果的其它生长因子。
另外，转化(也称为相变(相転移))是指细胞性状变化为与以前的状态不同(不正常)的状态，包括细胞变为无限制地进行分裂的癌化、或者越过组织基本形态的壁而发生变化的动态化生等。作为转化的具体示例，例如可列举诸如上皮间质转化(EMT)、纤维化、老化、内皮间质转化等细胞状态相变(CST)。
因此，本实施方式所涉及的人角膜内皮细胞的保存方法的特征在于，在满足以下所列举的(a)-(d)中的任一个或多个各指标所规定的时期(例如在分化事件发生之前等)，对含有使用含有ROCK抑制剂且EGF的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞或人角膜内皮前体细胞的细胞群进行收集，使其成为悬浮状态并进行保存。
收集细胞的时期优选满足这些(a)-(d)的全部指标，但并非必须满足全部这些指标，也可以满足任一个以上(例如仅满足(a))。
(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为包含所述突起的长径短径的比接近1的铺路石状的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间。
(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间。
(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下。
(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。
以下对(a)-(d)中记载的各指标(也称为评价基准)进行说明。
首先，对(a)进行说明。
若使用如上所述的含有ROCK抑制剂且EGF的含量小于引起转化的浓度的培养基使人角膜内皮细胞增殖，则在成熟分化的过程中细胞形态如下所述发生变化。
接种到包含所述培养基的培养板上后即刻的人角膜内皮细胞和/或角膜内皮前体细胞是具有成纤维细胞样的不规则细长突起的纺锤状形态。随着培养天数推移，细长突起变小，包含突起的长径和短径的比(长短径比)接近1(例如约1.5:1、1.25:1、1.1:1、1:1.1、1:1.25、1:1.5以及其间的任意比率)，在人体内形成类似于角膜内皮细胞的铺路石状(例如6边形等多边形或圆形)的形态。然后，若细胞大小变得更均匀，成为充分分化成熟的功能性角膜内皮细胞，则细胞之间粘连，细胞间的边界线变得不清楚。
这样根据从传代开始的培养天数而变迁的细胞形态在所述(a)的时期(即具有类似于体内的角膜内皮细胞的形态但仍为完全分化成熟前的时期)收集细胞这一点是本实施方式所涉及的保存方法的特征点之一。
若在该时期收集细胞并如本说明书所记载的那样以悬浮状态保存，则可以将人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞在维持高生存率的同时保存至少数天以上，所述人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞可以通过在保存后再次培养而得到功能性人角膜内皮细胞(以下也称为效应细胞)的含有率(以下也称为E-ratio)高于约90％的细胞群。
然后，对(b)进行说明。
若使用如上所述的含有ROCK抑制剂且EGF的含量小于引起转化的浓度的培养基使人角膜内皮细胞增殖，则在成熟分化的过程中表面抗原CD44的表达量如下所述发生变化。
观察到CD44的表达量在将人角膜内皮细胞接种到包含所述培养基的培养板后即刻(第1-2天)大幅增加，随着培养天数推移而呈对数减少，细胞分化成熟到某种程度后稳定落到一定的量(达到平台)。
在该CD44的表达量成为(b)这样的时期(即CD44的表达量与传代后即刻相比减少，但与充分分化成熟、CD44的表达量达到平台的细胞相比更多的时期)收集细胞这一点是本实施方式的特征点之一。另外，该CD44的表达量例如可以通过使用针对CD44的抗体的流式细胞术分析等进行定量。例如，若使用PE-Cy7结合CD44抗体以实施例3的抗体-细胞比率染色后，在用FACSCantoTM II进行分析的情况下，可以说所述时期为将示出使用所述培养基培养35天的时刻的所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的CD44的表达量的平均荧光强度的值设为1的情况下，示出CD44的表达量的平均荧光强度的相对值大于1且为60以下的时期，更优选为50以下的时期。只要在该时期对细胞进行收集、以悬浮状态保存，则可以将人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞在维持高生存率的同时保存至少数天以上，所述人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞可以通过在保存后再次培养而得到功能性人角膜内皮细胞的含有率高于约90％的细胞群。该CD44的表达量也可以通过例如定量PCR等流式细胞术分析以外的方法进行测定。但是应注意的是，所有实施方式中都不需要绝对定量，而是可以定性地评价表达谱。
对(c)进行说明。
已知人角膜内皮细胞在接种到包含所述培养基的培养板后几乎线性地增加，若充分分化成熟则角膜内皮细胞密度(以下也称为ECD)的值稳定落到为一定的值。
在该ECD的值成为(c)这样的时期(即虽然是细胞密度不断增加的增殖期，但已经确定了分化为功能性人角膜内皮细胞的命运的时期)收集细胞这一点是本实施方式的特征点之一。通过在该时期对细胞进行收集并使其成为悬浮状态，可以将人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞在维持高生存率的同时保存至少数天以上，所述人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞可以通过在保存后再次培养而得到功能性人角膜内皮细胞的含有率高于90％的细胞群。
ECD的值优选在所述(c)的时期(约900个细胞/mm2以上约2500个细胞/mm2以下)收集，也可以在约1000个细胞/mm2以上约2400个细胞/mm2以下、约1200个细胞/mm2以上约2000个细胞/mm2以下、约1200个细胞/mm2以上小于约1800个细胞/mm2等时期收集。在一些实施方式中，也可以使用在上述范围的组合之间的ECD值。
培养开始时的角膜内皮细胞密度没有特别限定，例如优选为300个细胞/mm2以上500个细胞/mm2以下的范围。
另外，例如可以通过TrypLE等细胞剥离液将细胞从培养容器剥离而制备细胞悬浮液，使用其中一部分使用血细胞计数板测量细胞数、根据由相位差显微镜拍摄的照片等通过分析软件(例如KSSE-400EB等)求出角膜内皮细胞密度(ECD)。
对(d)进行说明。
在接种到包含所述培养基的培养板后，若在约4天以上约14天以下的时期，更优选在约6天以上约11天以下的时期收集，则可以在上述(a)-(c)的时期收集人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞，因此优选。
在所述时期收集的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞适宜地在最适温度下保存即可，例如，优选在约10℃以下等低温保存；在约4℃以下、约0℃以下等冰温保存；在约-10℃以下、约-30℃以下、约-80℃以下、液氮罐中等冷冻保存。
保存期间的温度可以在保存中略有变动，例如，从冷冻到为了使用而解冻的期间，优选保持在所述温度范围内。
将人角膜内皮细胞以悬浮状态保存的期间，可以根据从生产据点向进行治疗的机构的输送时间等适当设定，但无论是在低温保存、冰温保存还是冷冻保存的情况下，优选为24小时以上，优选进行2天以上、3天以上、4天以上、1周左右等的长期保存。特别的，认为在冷冻保存的情况下可以保存数月-数十年。
作为悬浮保存人角膜内皮细胞时的悬浮液或保存液，在冰温保存的情况下，优选用于培养的条件培养基，但不限于此，例如可以使用通常在保存培养细胞时使用的保存液。
在冷冻保存的情况下，可以使用通常广泛用于动物细胞的冷冻保存的含有冷冻保护剂的悬浮液。
作为这样的冷冻保护剂，可以举出作为细胞膜透过性冷冻保护剂的下述物质：选自于由二甲基亚砜、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、1,2-丙二醇(1,2-PD)、1,3-丙二醇(1,3-PD)、丁二醇(BG)、异戊二醇(IPG)、二丙二醇(DPG)和甘油所组成的组中的1种或2种以上的冷冻保护剂。
根据如上所述的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法，可以将人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞在维持在预期以上的高生存率的同时长期保存。作为可以这样长期保存的理由，认为其要因之一是收集并保存与成熟分化后相比ERK(p44/42MAPK)的活化(磷酸化)为亢进时期的细胞。
此外，为了得到功能性角膜内皮细胞，需要克服易相变性(易相転移性)，在所述时期的基础上，认为在由所述(a)-(d)的各指标规定的时期收集的人角膜内皮细胞或人角膜内皮前体细胞是在已经确定分化为功能性人角膜内皮细胞的命运后收集的，因此即使在悬浮状态下保存后重新开始培养，也可以抑制相变，对于得到功能性人角膜内皮细胞的含有率高于90％的细胞群是有利的。更进一步地说，由于收集了已经确定分化为功能性人角膜内皮细胞的命运的细胞，因此，保存的细胞例如也可以直接给予患者。
所述保存的细胞或保存后再培养的细胞可应用于通过例如给药或移植等递送至受试者(患者)的眼，以用于治疗眼的疾病或伤害。
在所述给药时，可以直接将这些细胞进行给药，也可以用于制备含有这些细胞的药品。另外，所述疾病或伤害优选与角膜有关。
在将通过所述保存方法保存的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞从在低温下保存的状态(例如约-20℃以下)恢复到25℃等常温-37℃左右并再次接种到培养基中培养规定期间后(以下也称为恢复后)，对于能否得到功能性人角膜内皮细胞的含有率高于90％的细胞群，可以根据是否满足以下所列举的(1)-(8)中的一个或多个条件(也称为评价基准)来确认。
另外，所述规定期间只要是人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞充分分化成熟的期间即可，例如优选从接种开始及4周(例如28天)以上，进一步优选从接种开始及5周(例如35天)以上。
(1)在通过相位差成像进行的外观检查中，没有成纤维细胞、异物、变色或其它异常；
(2)细胞生存率在台盼蓝染色中为70％以上；
(3)细胞上清在通过ELISA进行的纯度试验中PDGF-BB为至少约100pg/mL以上；
(4)细胞在通过FACS进行的纯度试验结果中满足以下所有范围：
CD166+>99％
CD24+<5％
CD26+<5％
CD44high<5％
CD44neg-low>90％
CD90+<5％；
(5)效应细胞(E-ratio)>约90％；
(6)泵功能(Na+/K+ATPase)为阳性；
(7)屏障功能(ZO-1)为阳性；
(8)ECD为1500个细胞/mm2以上。
另外，本说明书中的功能性人角膜内皮细胞(效应细胞)是指具有与存在于人体内的人角膜内皮细胞同样的角膜内皮特性的人角膜内皮细胞，或是通过注入人的眼前房内能够诱导人角膜功能的人角膜内皮细胞。更具体地说，效应细胞是指满足所述(1)-(8)的条件中特别是(4)的条件，即CD166+、CD24-和CD44neg-low中的至少一个以上的细胞。另外，在这些指标中，关于CD26+<5％，在专利文献2中已经确认了在CD44high<5％的细胞群中一定可以实现。
能够诱导人角膜功能是包括能够诱导角膜内皮特性(例如角膜混浊、水肿的改善这样的结果，持续地长期保持角膜内皮细胞密度，具有与视力改善相关联的功效等)在内的概念。
如专利文献3所记载的，已知在具有角膜内皮特性的功能性人角膜内皮细胞中确认了与角膜内皮特性相关联的功能蛋白的表达。
作为所述功能蛋白，可以举出Na+/K+ATPase、ZO-1、钠/氢交换体1(NHE1)和/或水通道蛋白1(AQP-1)、碳酸脱水酶5B(CA5B)等。
另外，如在专利文献3中所验证的，认为在ROCK抑制剂的存在下，在小于引起转化的浓度的EGF的存在下使其增殖和/或分化、成熟的人角膜内皮细胞通过避免在细胞质或细胞核中发挥作用的基于与TCA代谢路径有关的酶得到的代谢产物，特别是基于乙酰辅酶A(AcCoA)进行的组蛋白的乙酰化等表观遗传性的多基因的活化，抑制了培养细胞的相变。作为证据，确认了这些功能性人角膜内皮细胞在其线粒体中的选自于由柠檬酸合酶(CS)、乌头酸酶2(ACO2)、异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、苹果酸脱氢酶2(MDH2)、苹果酸酶3(ME3)、ACSS1、乙酰CoA乙酰基转移酶1(ACAT1)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、BCAT2和支链酮酸脱氢酶2(BCKDH2)所组成的组中的一种或多种代谢相关酶的表达亢进，这些也包含于功能蛋白中。因此，认为作为选自于由ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、乌头酸酶1(ACO1)、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、苹果酸脱氢酶1(MDH1)、苹果酸酶1(ME1)、ACSS2、乙酰CoA乙酰基转移酶2(ACAT2)和乳酸脱氢酶(LDH)所组成的组中的至少1种以上的代谢相关酶的抑制蛋白不表达或几乎不表达。
本发明不限于以上说明的内容。
例如，不言而喻，使用的培养基不一定需要是所述实施方式中予以说明的组成，只要可以得到满足细胞收集时、再培养时的所述各评价基准的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞即可。
另外，只要不违背本发明的主旨，也可以进行各种变形、实施方式的组合。
实施例
以下列举各实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些。
在以下实施例中，遵守赫尔辛基宣言等医疗伦理规定、GCH等规定以及京都府立医科大学等其它所规定的规定，在与发明人所属的组织有关的伦理委员会的批准下进行。在得到必要的知情同意的基础上，进行了以下实验。
(实施例1：确认培养条件对相变细胞发生率的影响)
在该实施例1中，通过使用含有ROCK抑制剂且EGF的含量小于引起转化的浓度的培养基进行增殖和/或分化、成熟，确认可以培养出以非常高的比例含有功能性人角膜内皮细胞(效应细胞)的细胞群。在添加物组成不同的2种培养液中培养从来自同一捐献者的角膜收集的角膜内皮细胞，研究了对功能性人角膜内皮细胞(效应细胞)含有率等细胞品质的影响。
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自18岁男性。
使用的培养基为Opti-MEM-I+8质量％FBS+200mg/ml CaCl2+0.08质量％硫酸软骨素+20μg/ml抗坏血酸+50μg/ml庆大霉素。
在以下实验的培养条件1中，使用对所述培养基添加了0.5ng/ml EGF、10μMSB203580、10μM Y-27632作为添加物的培养基。
另一方面，在培养条件2中，使用对所述培养基仅添加了10μMY-27632作为添加物，而不添加EGF和SB203580的培养基。
(细胞的培养)
从由西雅图眼库(シアトルアイバンク)得到的捐献者角膜上，将角膜内皮细胞连同后弹力膜(デスメ膜)一起剥离，通过胶原酶在37℃下过夜处理后，悬浮于培养条件1的培养基中，以每1眼1孔的比例接种到经I型胶原蛋白包被的6孔板中。将该孔设置在CO2培养箱中培养34天。培养基更换以每周2次的频率进行。
通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)将细胞从培养皿上剥离后，通过血细胞计数板测定回收的细胞数。将细胞悬浮液分成两份，分别以400个细胞/mm2的细胞密度接种，一份接种到培养条件1的培养基中，另一份接种到含有培养条件2的培养基的新培养容器中，再次在CO2培养箱中培养42天。
通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)将细胞从培养皿上剥离后，通过血细胞计数板测定回收的细胞数，以400个细胞/mm2的细胞密度接种，再次在CO2培养箱内在各自的培养条件下重复培养29天-42天的操作，重复进行传代培养。
(通过相位差照片确认细胞形态)
在培养条件1或培养条件2下培养的第3代(分为培养条件1和培养条件2后的第3代)的细胞的相位差照片如图1所示。
从该图1可知，在培养条件1下，出现了大量细胞大小明显大的相变细胞。另一方面，可知在培养条件2下，即使重复传代，细胞大小也得以均匀地维持，相变细胞的出现或增加被抑制。
图2是在培养条件2中传代培养到第7代的细胞的相位差照片，但在该阶段也可知几乎与图1的情况没有变化，细胞大小得以均匀地维持，相变细胞的出现或增加被抑制，没有异物、变色或其它异常。
(表面抗原的分析)
图3示出了培养条件1下培养的第3代的细胞、或培养条件2下培养的第3代或第7代的细胞的细胞表面抗原通过流式细胞术得到的分析结果。细胞表面抗原的分析与后述的实施例4同样地进行。
从该图3的结果也可知，在培养条件2下，即使重复传代培养到第7代，示出人角膜内皮细胞中的表面抗原的CD166+CD24-CD44neg-low、或CD44neg-lowCD90neg-low的特征的效应细胞的比例也高，培养了目标功能性人角膜内皮细胞含有率高的细胞群。
另外，关于CD166+CD24-CD44neg-low这样的指标，在图3上段的图中，在提取CD166+CD24-的门(ゲート)A中所含的细胞群的基础上，用中段的图研究CD44的表达量。另外，关于CD44neg-lowCD90neg-low这样的指标，与图3上段、中段的图相独立地，在图3下段的图中进行研究。这在图6、图10、图16、图20、图21、图22、图30、图38等中也同样。
关于这些表面抗原的表达量，如下进行定义。
“-”或“neg”是指实质上没有观察到表达，即意为阴性。
“+”是指不是所述阴性，即显著观察到表达，意为阳性。
“low”是指将确认表达的物质区分为弱阳性、中阳性、强阳性3个等级的情况下的弱阳性，不满足该弱阳性的表达量的物质为阴性。
“high”是指将确认表达的物质区分为弱阳性、中阳性、强阳性3个等级的情况下的强阳性。
对于所述CD标志物等表面抗原的表达强度，荧光强度根据标记荧光种类、机器设定的不同而不同，因此难以用数值进行定义，然而，例如，以下条件下的弱阳性、中阳性、强阳性分别可以通过以下的荧光强度的范围来进行定义。
条件：使用PE-Cy7标记的抗人CD44抗体(BD Biosciences)，将FACSCantoTM II的Area Scaling Factor的设定值设为Blue laser＝0.75，voltage设定值设为PE-Cy7＝495的情况下。
弱阳性：荧光强度小于约3800。
中阳性：荧光强度为约3800以上-小于27500。
强阳性：荧光强度为约27500以上。
例如，在图3中，对于判断是阴性还是阳性的标志物，在图中画出将阴性和阳性的区域(也称为门)分开的实线。
另外，在图3中，对于在弱阳性、中阳性、强阳性这3个等级中进行区分的标志物，记载了区分3个区域(也称为门)的框。
另外，图中的百分率表示属于所述各区域的细胞的比例。
(通过免疫染色确认功能蛋白的表达)
进而，对于在培养条件2下培养的第7代的细胞，通过免疫染色法研究Na+/K+ATPase和ZO-1的表达。传代至第7代后，在相同培养基中以每周2次的频率更换培养基并同时培养40天后，除去培养上清，用冰冷甲醇或4％多聚甲醛/磷酸缓冲液固定细胞。用PBS(-)清洗后，用PBS(-)+0.02质量％Triton X-100进行10分钟透化处理。然后，用PBS(-)+1质量％牛血清白蛋白在室温下进行1小时以上的封闭。封闭后，在4℃下与小鼠抗Na+/K+ATPase抗体、小鼠抗ZO-1抗体或小鼠抗N-钙粘蛋白抗体过夜反应。用PBS(-)清洗4次后，使AlexaFluor555标记的抗小鼠IgG抗体在室温下反应1小时。用PBS(-)清洗后，用5μg/mlDAPI反应10分钟以对细胞核进行染色，进一步用PBS(-)清洗3次后，用荧光显微镜观察。其结果如图4所示。
从图4的结果也确认了，在培养条件2下培养的第7代的几乎全部细胞中，表达功能性人角膜内皮细胞中的重要功能蛋白即Na+/K+ATPase、ZO-1和N-钙粘蛋白。
(PDGF-BB产生量的确认)
回收培养条件2下培养的第7代传代后第34天的培养上清，通过人PDGF-BB ELISA试剂盒(Abcam，#ab184860)研究分泌到培养上清中的PDGF-BB的浓度。结果确认了培养上清中的PDGF-BB浓度为328.4±19.6pg/mL，满足标准值100pg/mL以上。
(讨论)
根据以上结果可以确认的是，根据本说明书公开的一些实施方式，通过使用含有ROCK抑制剂且EGF的含量小于引起转化的浓度的培养基进行增殖和/或分化、成熟，可以抑制相变细胞的出现，可以培养以非常高的比例含有功能性人角膜内皮细胞的细胞群。另外，根据本发明人等的经验，可以理解的是，除Y-27632以外，示出ROCK抑制的特性的化合物同样有效或更有效。在一些实施方式中，作为示出ROCK抑制的特性的化合物，可以包括选自于由AT-13148、BA-210、β-榄香烯、色满1、DJ4、法舒地尔(ファスジル)、GSK-576371、GSK429286A、H-1152、羟基法舒地尔、布洛芬、LX-7101[24]、奈舒地尔(ネタルスジル)、RKI-1447、瑞舒地尔(リパスジル)、TCS-7001、チアゾビビン、维罗舒地尔(ベロスジル)(AR-12286)、Y-27632、Y-30141、Y-33075以及Y-39983所组成的组中的一种或多种的组合。
(实施例2：抑制相变的培养条件的确认)
在实施例2中，确认了从捐献者角膜的初代培养(第0代)到所述培养条件2培养的细胞群以高比例含有功能性人角膜内皮细胞。
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自27岁男性。
培养基使用与实施例1的培养条件2相同的培养基。
(细胞的培养)
从由西雅图眼库得到的捐献者角膜上，将角膜内皮细胞连同后弹力膜一起剥离，通过胶原酶在37℃下过夜处理后，悬浮于所述培养条件2的培养基中，以每1眼1孔的比例接种到经I型胶原蛋白包被的6孔板中。将该孔设置在CO2培养箱中培养40天。培养基更换以每周1次的频率进行。
通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)将细胞从培养皿上剥离后，通过血细胞计数板测定回收的细胞数。将该细胞悬浮液分别以400个细胞/mm2的细胞密度接种到含有培养条件2的培养基的新培养容器中，再次在CO2培养箱中培养32天。
通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)将细胞从培养皿上剥离后，通过血细胞计数板测定回收的细胞数，以400个细胞/mm2的细胞密度接种，再次在CO2培养箱内在各自的培养条件下重复培养38天-44天的操作，重复进行传代培养。
(通过相位差照片确认细胞形态)
如上所述培养的第7代的细胞的相位差照片如图5所示。
从该图5的相位差照片可知，本实施例中培养的第7代的细胞的细胞大小得以均匀地维持，相变细胞的出现或增加被抑制。
(表面抗原的分析)
以与实施例1同样的步骤，图6B的图示出了对本实施例的第7代的细胞分析表面抗原的结果。根据该结果，本实施例的第7代的几乎全部细胞中，示出了功能性人角膜内皮细胞中的表面抗原的特征。
从该结果可以确认，在本实施例中，在本培养条件下，即使长期传代到第7代，也可以在以高水平维持目标功能性人角膜内皮细胞的含有率高的细胞群的同时进行培养。
(通过免疫染色确认功能蛋白的表达)
进而，对于本实施例中培养的第7代细胞，与实施例1同样地通过免疫染色法研究Na+/K+ATPase、ZO-1和N-钙粘蛋白表达的结果示于图6A。
从该结果也确认了，在本实施例中培养的第7代的几乎全部细胞中，表达人角膜内皮细胞中的重要功能蛋白即Na+/K+ATPase、ZO-1和N-钙粘蛋白。
(PDGF-BB产生量的确认)
关于本实施例中培养的第0-7代的培养上清，通过人PDGF-BB ELISA试剂盒(Abcam，#ab184860)研究分泌到培养上清中的PDGF-BB浓度的结果示于图6C。确认了任一代中均满足标准值100pg/mL以上。
(讨论)
根据该实施例2的结果可以确认，从初代培养(第0代)也可以通过使用所述培养条件2的培养基(含有ROCK抑制剂且EGF的含量小于引起转化的浓度的培养基)，从而在第7代这样的长期间培养中也抑制相变，得到以非常高的比例含有目标功能性人角膜内皮细胞的细胞群。
认为人角膜内皮细胞的相变是不可逆的，实际上，一旦细胞发生相变，即使在培养条件2的培养基中培养也不能返回到功能性人角膜内皮细胞。因此，为了得到功能性人角膜内皮细胞含有率高的细胞群，优选从第0代或第1代等尽可能早的阶段开始用在培养条件2中使用的那样的含有ROCK抑制剂且EGF的含量小于引起转化的浓度的培养基进行培养。
(实施例3：细胞的冷冻保存和生存率的确认)
实施例3中确认了，通过在传代后的特定培养时期回收在所述培养条件2下培养的细胞群，可以以高生存率冷冻保存功能性人角膜内皮细胞，并且在解冻后通过在培养条件2下培养，可以得到功能性人角膜内皮细胞的含有率高的细胞群。
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自29岁女性。
培养基使用与实施例1的培养条件2相同的培养基。
(培养和冷冻保存)通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)将在与实施例2相同的条件下培养到第3代的细胞(传代后第136天)的细胞从培养皿上剥离后分成两份，将一份悬浮于实施例1的培养条件2的培养基中，以400个细胞/mm2的细胞密度接种于由I型胶原蛋白包被的培养板上。将剩余细胞悬浮于CELLBANKER I(日本全薬工業株式会社)，使其成为每1ml 1,000,000个细胞，将该细胞悬浮液以每管400μl逐一分注于细胞冷冻保存管(Corning Inc.)中。将含有该细胞悬浮液的细胞冷冻保存管在冰上静置1小时后，将一部分管放入液氮罐的气层部分进行冷冻、保存，将剩余的管放入动物细胞冷冻处理容器BICELL(日本フリーザ株式会社)，使用超低温冷冻器(PHCホールディングス株式会社)在-80℃下冷冻、保存(对照例)。
前者的接种细胞在接种后第4天用相同培养基进行培养基更换，在第5天通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)从培养板回收(收集)细胞。将回收的细胞以与上文同样的方法冷冻、保存(实施例3)。
(生存率的确认)
将这样冷冻保存的各细胞连同管一起在保温至37℃的热水浴中解冻，用4ml所述培养条件2的培养基清洗1次。将清洗后的细胞悬浮于400μl所述培养条件2的培养基中。
混合10μl该悬浮液和10μl 0.4质量％台盼蓝溶液(Sigma Aldrich Corp.)，在血细胞计数板上分别测量活细胞、死细胞。结果示于图7和表1。在图7中，看上去是白色的细胞表示活细胞，蓝色染色的细胞表示死细胞。
[表1]
本实施例 对照例
液氮保存 94.5％ 66.4％
-80℃保存 89.4％ 53.1％
(讨论)
根据该实施例3的结果可以确认，在以400个细胞/mm2的细胞密度接种于所述培养条件2的培养基后第5天回收并冷冻保存的情况下，即使在冷冻保存后也维持高生存率。另一方面，在同样地在成熟分化后(培养136天后)收集细胞并保存的对照例中，发现生存率大幅降低。另外，在使用来自14岁男性捐献者的角膜由同样方法冷冻保存传代接种后第35天(第5代)回收的成熟分化后的细胞的情况下，解冻后的生存率为液氮保存的49.5％、-80℃保存的63％，与表1所记载的对照例为同水平。
(实施例4：冷冻保存后恢复的细胞的评价)
在实施例4中，对于使实施例3中冷冻保存的细胞解冻、恢复而得到的细胞群，研究了功能性人角膜内皮细胞的含有率是否维持在高水平状态。
(通过相位差照片确认细胞形态)
用与实施例3同样的方法，对由同样的方法将与实施例3相同的来自捐献者的细胞(第3代)冷冻保存的细胞悬浮液380μl进行解冻操作，用所述培养条件2的培养基定容为2ml，接种至由I型胶原蛋白包被的6孔细胞培养板的1孔中。在含有5％v/vCO2的加湿大气中在37℃下进行培养。培养基用与上文相同的培养条件2的培养基每周更换2次，定期用相位差显微镜进行观察。观察到的细胞形态的经时变化示于图8。
根据图8的结果，可以观察到冷冻保存后的细胞增殖，形成大小均匀的铺路石状(多边形或圆形等)的形态。
进而，用相位差显微镜比较在实施例3中不冷冻保存而培养到第35天的细胞与在实施例3中在第4天不回收而继续更换培养基培养到第35天的细胞的结果为图9。
根据图9的结果，未发现冷冻保存的细胞和未冷冻保存而继续培养的细胞之间的形态差异。
(表面抗原的确认：FACS分析)
通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)将在实施例3中不冷冻保存而培养到第35天的细胞和在本实施例中培养了35天的细胞从培养板回收，悬浮于FACS缓冲液(PBS+0.5质量％BSA+0.05质量％NaN3)，使其成为4×106个细胞/ml。将20μL该细胞悬浮液与20μL抗体溶液1或抗体溶液2混合，在遮光下于4℃下孵育1.5小时-2小时。
使用的抗体溶液如下。另外，没有制造商的记载的抗体全部是从BD Biosciences得到的。
(抗体溶液1)将FITC结合抗人CD90 mAb(4μL)、PE结合抗人CD166 mAb(4μL)、PerCP-Cy5.5结合抗人CD24 mAb(1μL)、PE-Cy7结合抗人CD44 mAb(0.25μL)以及APC结合抗人CD105(eBioscience、1μL)用FACS缓冲液定容到20μL的溶液。
用FACS缓冲液清洗后，用FACSCantoTM II(BD Biosciences、S/N＝V33896101710)分析细胞。结果如图10所示。另外，FACSCantoTM II的各荧光的voltage设定值如下。FSC＝270、SSC＝380、FITC＝290、PE＝290、PerCP-Cy5.5＝410、PE-Cy7＝495、APC＝430。另外，Area Scaling Factor的设定值如下。FSC＝0.5、Blue Lasor＝0.75、Red Lasor＝0.8。
根据图10的表面抗原分析结果，在冷冻保存的细胞和不冷冻保存而继续培养的细胞之间，示出CD166+CD24-CD44neg-low(门1)或CD44neg-low CD90neg-low(下段子图左下的门)的特征的效应细胞的含有率没有差异。
(通过免疫染色进行评价：免疫细胞染色)
通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)回收在本实施例中培养了35天的细胞，悬浮于所述培养条件2的培养基中，接种到由I型胶原蛋白包被的培养板上，使其成为400个细胞/mm2的细胞密度。
在相同培养基中以每周2次的频率更换培养基并同时培养5周后，用与实施例1同样的方法进行免疫染色。但是，就抗体而言，使用小鼠抗Na+/K+ATPase抗体和兔抗ZO-1抗体作为一抗，使用AlexaFluor488标记的抗兔IgG抗体和AlexaFluor555标记的抗小鼠IgG抗体作为二抗。用荧光显微镜观察的结果示于图11。
从该结果可以确认，即使在冷冻保存的细胞中，通过在解冻后进行恢复培养，作为人角膜内皮细胞的功能蛋白的Na+/K+ATPase及ZO-1的表达也是正常表达的。
(讨论)
根据以上结果，可以确认在实施例3中冷冻保存后解冻、恢复的细胞群与不冷冻保存而继续培养的细胞同样，功能性人角膜内皮细胞的含有率高。
(实施例5：使用其它培养基时的冷冻保存和生存率的确认)
在实施例5中，研究了培养基种类对冷冻保存后的生存率的影响。
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自18岁男性和10岁男性。
使用的培养基为Essential 6+8质量％FBS+50μg/ml庆大霉素+10μMY-27632。
另外，Essential 6培养基以广泛用于细胞培养的DMEM/F12培养基为基础并添加抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒等，其组成是公开的。
(冷冻保存后生存率的确认)
按照与上述实施例3相同的步骤，通过台盼蓝染色法研究生存率。结果如下表2所示。
[表2]
(讨论)
观察到与实施例3几乎相同的生存率，因此可以确认即使在使用不同的基本培养基的情况下也可以发挥本发明的效果。
(实施例6：细胞收集时期的优化)
在实施例6中，对冷冻保存时细胞的收集时期进行了优化的研究。
(实施例6-a：细胞收集时期的研究)
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自41岁女性。
培养基使用与实施例1的培养条件2相同的培养基。
(培养和冷冻保存)
将从西雅图眼库得到的所述捐献者角膜在与实施例2相同的条件下培养到第2代。在传代到第3代时，将细胞悬浮液分到5个烧瓶中，1个原样继续培养，剩余4个烧瓶分别在传代后第3、7、10、14天回收细胞。将回收的细胞悬浮于CELLBANKER I中，使其成为每1ml 1,000,000个细胞。
将该细胞悬浮液放入液氮罐的气层部分冷冻，在液氮罐内冷冻保存。
在传代后第35天，以400个细胞/mm2的细胞密度将继续培养的第1个烧瓶的细胞传代到经I型胶原蛋白包被的24孔板上。
对于在液氮罐内冷冻保存的细胞，也与继续培养的细胞在同一天分别进行解冻操作。在解冻中使用ThowSTAR冷冻细胞解冻站(Model CFTS，Astero Bio)。
解冻后，将用所述培养条件2的培养基清洗的细胞接种到经I型胶原蛋白包被的24孔板上，使其成为400个细胞/mm2的细胞密度。
将其在含有5％v/v CO2的加湿大气中在37℃下进行培养。培养基以每周2次的频率进行更换。在接种至24孔板上后第35天，通过FACS分析和免疫细胞染色对蛋白质表达进行了比较分析。关于步骤在图12中记载了概要。图13中示出了为了冷冻保存各细胞批次而进行回收之日的细胞形态的相位差显微镜照片。另外，将冷冻保存的细胞解冻后的生存率及台盼蓝染色结果的照片示于图14，将恢复培养后第37天的相位差显微镜照片、FACS分析及免疫细胞染色的结果示于图15-图17。另外，对于FACS分析和免疫细胞染色，按照与实施例4相同的步骤进行。
(讨论)
根据图13的结果，看到了到传代接种后第14天的细胞尺寸、形态都发生了很大变化，在第14天成为与第35天的功能性人角膜内皮细胞相似的形状，因此可以推测到该时期为止细胞处于分化阶段。
从图14的结果可以确认的是，从传代后3天回收并冷冻保存的细胞在解冻、恢复后的生存率低于50％；在第14天回收、冷冻保存的细胞的生存率比其更高，约为70％；进而，在第7天或第10天回收、冷冻保存的细胞示出甚至更高的生存率，根据传代后回收时期的不同，生存率有很大差异。
另外，图15-图17的结果还示出，在第7天、第10天或第14天回收、冷冻保存的细胞通过解冻后的恢复培养，成为含有与不冷冻保存而培养的细胞相同比例的功能性人角膜内皮细胞的细胞群。
根据该结果可知，为了得到在冷冻保存后生存率也高、且通过解冻后的恢复培养而含有与不冷冻保存而培养的细胞相同比例的功能性人角膜内皮细胞的细胞群，优选从最近的传代开始4天以上14天以下的期间收集细胞并保存。
(实施例6-b：细胞收集时期的优化)
该实施例是试图对实施例6-a中明确的细胞收集时期进行进一步优化而进行的。
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自8岁男性。
培养基使用与实施例1的培养条件2相同的培养基。
(培养和冷冻保存)
将从西雅图眼库得到的所述捐献者角膜在与实施例2相同的条件下培养到第4代。在传代到第5代时，将细胞悬浮液分到5个烧瓶中，分别在传代后第6、7、8、9、10天回收细胞。将回收的细胞悬浮于STEMCELL-BANKER、10％ DMSO/90％ FBS或BAMBANKER hRM(仅第8天)，使其成为每1ml 1,000,000个细胞
将该细胞悬浮液放入液氮罐的气层部分冷冻，在液氮罐内冷冻保存。
在第10天的回收、冷冻保存后的200天后(在第6天回收、冷冻的情况则为204天后)，分别进行解冻操作。解冻中使用37℃的热水浴。
解冻后，将用所述培养条件2的培养基清洗的细胞接种到经I型胶原蛋白包被的24孔板上，使其成为400个细胞/mm2的细胞密度。
将其在含有5％v/v CO2的加湿大气中在37℃下进行培养。培养基以每周2次的频率进行更换。在接种至24孔板上后第35天，通过FACS分析和免疫细胞染色对蛋白质表达进行了比较分析。关于步骤在图18中记载了概要。将冷冻保存的细胞解冻后的生存率示于图19，将恢复培养后第35天的FACS分析及免疫细胞染色的结果示于图20-图25。生存率的确认与其它实施例同样地通过台盼蓝染色进行。另外，对于FACS分析和免疫细胞染色，按照与实施例4同样的步骤进行。图19右侧的柱状图分别示出了对于第8天收集的细胞，在将STEMCELL-BANKER、10％ DMSO/90％FBS或BAMBANKER hRM中的任一个用作冷冻保存液时的生存率。
(讨论)
根据图19的结果，从最近的传代开始在6天以上10天以下回收、冷冻保存的细胞示出了解冻、恢复后的生存率均超过80％的高生存率，表明在该时期回收更为理想。另外，根据图19右侧所示的图可知，只要是在所述期间收集并保存的细胞，即使在改变冷冻保存液种类的情况下也示出足够高的生存率。
另外，根据图20-图25的结果，示出了该时期回收、冷冻保存的细胞通过解冻后的恢复培养，成为维持高功能性人角膜内皮细胞的细胞群。另外，可以确认的是，即使在改变保存液种类的情况下，保存后的生存率、恢复培养后的功能性人角膜内皮细胞的含有比例也没有大的变化。
(实施例7：关于示出细胞收集时期的其它指标)
在实施例6中，作为细胞收集时期的指标，研究了在板上接种(传代)后的天数。在实施例7中，通过研究在实施例6中确定的时期的细胞所具有的特征，研究了确定人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的收集时期的其它指标。
(实施例7-a：关于基于细胞形态的指标)
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自29岁男性。
培养基使用与实施例1的培养条件2相同的培养基。
(细胞的培养和细胞形态的观察)
从由西雅图眼库得到的所述捐献者角膜上，将角膜内皮细胞连同后弹力膜一起剥离，通过胶原酶在37℃下过夜处理后，悬浮于所述培养基中，以每1眼1孔的比例接种到经I型胶原蛋白包被的6孔板上。按照与所述实施例2相同的步骤培养到第4传代。培养基更换以每周2次的频率进行。
传代到第5传代后，在相同条件下培养，用相位差显微镜拍摄每天的细胞形态。其结果示于图26，为了更清楚而将图26的局部放大图示于图27。
(讨论)
根据该图26及图27的结果，传代接种后第1天、第2天成为具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态，但从第3天开始长径和短径向近似值变化，在第5天可以观察到转变为长短径比接近1的类似于铺路石状(多边形或圆形)的体内角膜内皮细胞的形状。这种大的形态变化是到接种后第5天观察到的。
在接种后第2周，细胞大小变得均质；从第3周开始，从各个细胞的边界清楚的状态开始变成细胞间的边界不清楚，认为细胞-细胞彼此间形成粘连，处于细胞稍微变密的成熟阶段。
根据以上观察，推测在本培养条件下，到接种后2周(第14天)发生再分化，之后过渡到成熟过程。
对比实施例6-a的结果可知，可以收集目标人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的时期可以定义为“细胞形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为只具有微小突起的长短径比接近1的类似于铺路石状(多边形或圆形)的体内角膜内皮细胞的形状后即刻直到细胞-细胞彼此间形成粘连，细胞间的边界即将变得不清楚前的期间”。
尽管在此以实施例6-a的天数为基准，但认为到细胞成熟所需的培养天数可能根据传代时的细胞密度和培养条件等而变动。即使在这种情况下，只要以该实施例中得到的细胞形态为指标收集细胞，就可以在适当的时期收集细胞。
(实施例7-b：关于基于CD44表达量的收集时期的指标)
细胞的收集时期也可以通过CD44的表达量来确认。
在传代到实施例7-a的第5传代后，对于在相同条件下培养的细胞，通过流式细胞术测量每天的CD44表达量。
(实验中使用的材料)
·与实施例7-a相同的细胞
·使用与实施例4相同的FACS缓冲液和抗体溶液。
(CD44表达量的测量)
在传代到实施例7-a的第5传代后，将在相同条件下培养规定天数的细胞用PBS(-)清洗后，通过用10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)进行处理，从培养板回收，悬浮于FACS缓冲液中，使其成为4×106个细胞/ml。将20μL该细胞悬浮液以与实施例4相同的方法进行抗体染色后，用FACSCantoTM II(BD Biosciences)进行分析。结果示于图28。
(结果、讨论)
CD44的平均荧光强度在接种(传代)后立即上升到15000以上，然后到第11天为止呈对数减少。第17天基本达到了平台，认为传代接种后约2周分化结束，过渡到成熟过程。
根据实施例6-a的结果和图28的结果，认为可以收集目标人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的时期是从CD44的表达量成为从传代后第1-2天所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间。
尽管在此以实施例6-a的天数为基准，但认为到细胞成熟所需的培养天数可能根据传代时的细胞密度和培养条件等而变动。即使在这种情况下，只要以该实施例中得到的CD44的表达量为指标收集细胞，就可以在适当的时期收集细胞。
(实施例7-c：关于基于细胞密度的收集时期的指标)
通过KSSE-400EB测量实施例7-a的细胞传代后的ECD(角膜内皮细胞密度)经日变化。
(实验中使用的材料)
·与实施例7-a相同的细胞
·分析软件：KSSE-400EB(KONAN Medical)
(细胞密度的测量)
将以400个细胞/mm2的细胞密度传代接种到第5传代的实施例7-a的细胞在传代后第2、4、6、9、12、17、35天的各时刻进行PBS(-)清洗，用相位差显微镜拍照。用KSSE-400EB软件分析得到的图像。其结果示于图29。
(结果、讨论)
ECD(角膜内皮细胞密度)从传代接种到第5传代后即刻直到第17天呈线性增加，第17天以后达到平台。根据该结果，认为传代接种后的增殖期持续到过渡到成熟过程的第17天左右。即使在该增殖期中，对于在限定于确定分化为人成熟分化细胞的命运的时期-过渡到成熟过程之前的时期的收集，对比实施例6-a的结果可知，认为在ECD的值为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下的时期收集较好。
尽管在此以实施例6-a的天数为基准，但认为到细胞成熟所需的培养天数可能根据传代时的细胞密度和培养条件等而变动。即使在这种情况下，只要以该实施例中得到的细胞密度为指标收集细胞，就可以在适当的时期收集细胞。
(实施例8：确认长期冷冻保存的细胞的生存率和恢复培养后的品质)
在实施例8中，对在通过实施例6和7优化的条件下冷冻保存的细胞进行长期保存的情况下的生存率和恢复培养后的品质进行了研究。
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自8岁男性。
培养基使用与实施例1的培养条件2相同的培养基。
(细胞的培养和冷冻保存)
从由西雅图眼库得到的所述捐献者角膜上，将角膜内皮细胞连同后弹力膜一起剥离，通过胶原酶在37℃下过夜处理后，悬浮于所述培养基中，以每1眼1孔的比例接种到经I型胶原蛋白包被的6孔板上。按照与所述实施例2相同的步骤培养到第2传代。培养基更换以每周2次的频率进行。在接种后第7天回收细胞，通过与实施例6同样的方法冷冻，保存在液氮细胞保存容器中。
在保存开始第99天、第160天、第171天将细胞在热水浴中解冻，按照与实施例3同样的步骤，通过台盼蓝染色法研究生存率。另外，为了消除死细胞已经被破坏后可能引起表观生存率上升的疑虑，还研究了供于冷冻保存的细胞数与冷冻保存后研究生存率时的细胞数之比即回收率(冷冻保存后的细胞数/供于冷冻保存的细胞数)。其结果示于表3。
[表3]
液氮中保存期间 生存率 回收率
99天 89.9％ 97.5％
160天 87.4％ 104.0％
171天 90.7％ 94.8％
(冷冻保存后恢复培养的细胞的品质评价)
其中，对于液氮保存99天的细胞，在培养条件2下培养33天，通过细胞形态、FACS分析、免疫细胞染色从而评价功能蛋白表达的结果如图30A-图30C所示。对于FACS分析和免疫细胞染色，按照与实施例4相同的步骤进行。用KSS-400EB软件分析的细胞密度为3344±150.8个细胞/mm2，第32天培养上清的PDGF-BB的浓度为217.5±1.53pg/mL。如上所述，可以确认的是，通过本发明，可以将细胞群在长达5个月以上的期间在将生存率维持在90％以上的同时进行冷冻保存，所述细胞群在恢复培养后可以得到功能性人角膜内皮细胞的含有率高的细胞群。
(实施例9：细胞的冰温保存和生存率的确认)
在实施例9中，研究了传代后回收时期对在悬浮液状态下冰温保存细胞时的生存率的影响。
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自8岁男性。
培养基使用与实施例1的培养条件2相同的培养基。
各样品如下。
样品1：按照与实施例2相同的步骤培养，不进行冷冻保存，在第3代中培养94天的细胞。
样品2：按照与实施例2相同的步骤培养，在第2代的第7天回收，按照与实施例3相同的步骤冷冻保存，解冻后在第3代中培养33天的细胞。
样品3：按照与实施例2相同的步骤培养，在第2代的第7天回收，按照与实施例3相同的步骤冷冻保存，解冻后重复传代到第5代，在第6代中培养9天的细胞。
(冰温保存和保存后的生存率)
通过10×TrypLETM Select(Thermo Fisher Scientific)将所述样品1-样品3从培养容器中剥离，制备细胞悬浮液。
对各细胞悬浮液的一部分(10μl)进行台盼蓝染色后，使用血细胞计数板测量活细胞数和死细胞数。基于该测量结果，悬浮于各自的条件培养基中，使其成为3.33×106个细胞/ml的细胞密度，并将其放入1.5mL容量的市售微管中，在冰中保存。
(冰温保存后的生存率的确认)
在保存开始第1、2、3和4天收集各细胞悬浮液的一部分(10μl)，进行台盼蓝染色后，使用血细胞计数板测量活细胞数及死细胞数，计算细胞的生存率。分别地，图31示出了台盼蓝染色的结果，图32示出了从图31的结果计算出的生存率。
根据图32的结果可知，样品1在第1天、样品2在第2天的生存率低于70％，与之相对，样品3即使在第4天也可以维持超过80％的生存率。
(讨论)
根据以上结果可以确认的是，与冷冻保存同样，只要在最近的传代后4天以上14天以下的时期回收保存，则与成熟后回收的情况相比，在冰温保存中也可以维持高生存率的状态。
(实施例10：细胞的冰温保存中的保存液的影响)
在实施例10中，研究了冰温保存时使用的保存液种类对生存率的影响。
(实验中使用的材料)
实验中使用的细胞是实施例9的样品3。
实验中使用的保存液如下。
保存液A：条件培养基
保存液B：当天制备的实施例1的培养条件2的培养基
保存液C：当天制备的Opti-MEM+100μM Y-27632
(冰温保存和生存率的确认)
将实施例9的样品3的细胞悬浮于所述保存液A、B或C中，使其成为3.33×106个细胞/ml的细胞密度，保存在冰中。
在保存开始第1、2、3和4天收集各细胞悬浮液的一部分(10μl)，进行台盼蓝染色后，使用血细胞计数板测量活细胞数及死细胞数，计算细胞的生存率。分别地，图33示出了台盼蓝染色的结果，图34示出了从图33的结果计算出的生存率。
根据图34的结果可知，在使用任一种保存液的情况下都可以在至少2天内维持70％以上的生存率。
另外，还可知如果是条件培养基，即使在第4天以后也可以维持80％以上的高生存率。
(讨论)
根据以上结果可以推测，在冰温保存中可以使用的保存液有多种选择。
另外，可知通过使用更合适的保存液，即使是冰温保存，也可以在长达超过4天的长期间将人角膜内皮细胞的生存率维持为高达80％以上。
(实施例11：评价冰温保存的细胞向着功能性人角膜内皮细胞的分化成熟期间)
在实施例11中，确认了在将冰温保存的细胞以与向人进行移植同样的细胞密度进行接种的情况下，与向人移植的情况同样，早期分化成熟为功能性人角膜内皮细胞。
(细胞形态的评价)
在向人进行的移植中，将3.33×106个细胞/ml的细胞密度的悬浮液300μl注入前房内。因此，在实施例9中，将使用保存液A冰温保存了4天的细胞悬浮液(具有与向人进行移植时相同的细胞密度)300μl接种到具有接近人内皮表面的面积的24孔板(直径约7.78mm，底面积190mm2，经I型胶原蛋白包被)中。接种后，在实施例1的培养条件2下培养7天。此时的相位差显微镜照片示于图35。
从图35可知，即使是冰温保存了4天的细胞，在以与向人进行移植时同样的细胞密度进行接种的情况下，在接种后1周也成为了功能性人角膜内皮细胞的形态。
(通过免疫染色法进行评价)
将图35的细胞用冰冷甲醇固定化，通过免疫染色法确认了人角膜内皮细胞的功能蛋白即Na+/K+ATPase和ZO-1的表达。结果示于图36。
根据图36的结果，在几乎所有细胞中都可以确认Na+/K+ATPase和ZO-1的表达。
(讨论)
根据以上结果可以确认的是，即使是冰温保存了4天的细胞，在以与向人进行移植时同样的细胞密度进行接种的情况下，也与向人进行移植时相同，在1周内分化成熟，表达人角膜内皮细胞功能蛋白。
在该实施例11中，作为可以在接种后1周这样的短时间内得到功能性人角膜内皮细胞群的理由之一，认为是由于不需要增殖期间而以高密度进行接种，因此接种后马上趋向分化成熟。
(实施例12：冷冻保存后的人角膜内皮细胞的短期扩大培养)
在以上的实施例1-实施例11中，可以确认即使在从最近的传代开始14天以内回收细胞的情况下，在保存后的培养中也不会发生相变。因此，在实施例12中，尝试了通过在14天内回收细胞并重复传代的方法而在比以往短的时间内使人角膜内皮细胞增殖。
(培养条件)
按照与实施例2相同的步骤培养到第2代的第7天，回收该第2代的第7天的细胞，按照与实施例3相同的步骤冷冻保存。
将冷冻保存后的细胞悬浮液解冻，以使培养开始时的细胞密度为400个细胞/mm2的细胞密度进行接种，重复在8天到10天进行传代直到第8代，使细胞增殖。
(结果和讨论)
该结果示于图37和表4。另外，图37的相位差显微镜照片是第8代的第10天的照片。
[表4]
从这些图37及表4的结果可知，为了使细胞数达到1000倍，以往的方法花费了半年以上，但根据本实施例可以缩短到仅仅50天左右。
此外，图38A示出了将该第8代的第10天的细胞传代到第9代并在培养条件2下培养34天的细胞的相位差显微镜照片；图38B示出了基于FACS分析的表面抗原的分析结果。FACS分析按照与实施例4同样的步骤进行。可以确认的是，通过使用最终含有ROCK抑制剂且EGF的含量低于引起转化的浓度的培养基进一步进行培养，即使是在分化成熟前、接种后以8天到10天的间隔重复传代的细胞，也可以得到功能性人角膜内皮细胞的含有率足够高的细胞群。
(实施例13：人角膜内皮细胞的短期扩大培养)
在所述实施例12中，记载了将冷冻保存后的细胞悬浮液解冻并进行短期扩大培养的示例；而在本实施例中，尝试了对未冷冻保存的细胞进行短期扩大培养。
(实验中使用的材料)
使用的捐献者角膜来自29岁男性和8岁女性。
(培养条件)
将同一捐献者角膜中的1只眼在实施例1的培养条件1下以35天的间隔进行传代、培养(对照例1)。将另1只眼在实施例1的培养条件2下培养，在向第1代传代时分为两份，一份在实施例1的培养条件2下以35天的间隔进行传代、培养(对照例2)，另一份与实施例12同样地以8天左右(5天-11天)的间隔重复传代、培养(实施例13)。步骤的概要示于图39。
(结果和讨论)
图40示出了根据增殖率计算出的产率和培养规模。在以8天左右的间隔重复传代的本实施例的短期扩大培养法中，示出了若换算成80天以内、20亿个细胞、T-25烧瓶，则可以得到500个烧瓶的细胞。
此外，图41和图42示出了用所述短期扩大培养法培养到第4代并在第5代中培养约5周的细胞与培养了大致相同天数的对照例2的细胞、培养到第5代的对照例2的细胞的照片以及产率的比较。
同样，图43和图44示出了通过短期扩大培养方法培养到第6代并在第7代中培养约5周的细胞与培养了大致相同天数的对照例2的细胞、培养到第7代的对照例2的细胞的照片以及产率的比较。
(讨论)
图41-图44的结果示出了，通过本实施例的短期扩大培养法还可以在短期间且高产率地得到功能性人角膜内皮细胞的含有率充分高的细胞群。
(关于实施例1-实施例13的讨论)
根据以上各实施例的结果可知，只要是通过在适当的培养条件下培养而注定成为功能性人角膜内皮细胞的细胞，则即使在未成熟的状态下收集该细胞并保存或传代，也可以得到目标功能性人角膜内皮细胞。

Claims (31)

1.一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的保存方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)-(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集，使其成为悬浮状态并进行保存：
(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从纺锤状的形态转变为长径短径的比接近1的多边形或圆形的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；
(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；
(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下；
(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。
2.如权利要求1所述的保存方法，其中，
在10℃以下保存所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。
3.如权利要求1所述的保存方法，其中，
在-30℃以下保存所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。
4.如权利要求1-3中任一项所述的保存方法，其中，
在使所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞成为悬浮状态后保存24小时以上。
5.如权利要求1-4中任一项所述的保存方法，其中，
所述转化包括内皮间质转化。
6.如权利要求1-5中任一项所述的保存方法，其中，
所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞是以选自于由角膜内皮细胞由来的细胞、多能干细胞、间充质干细胞、从角膜内皮收集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮收集的细胞以及由直接编程法制作的角膜内皮前体细胞和角膜内皮样细胞所组成的组的细胞作为起源而制作的细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的保存方法，其中，
使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使保存后的所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞增殖和/或分化、成熟所得的人角膜内皮细胞的细胞群满足以下(1)-(8)中的一个或多个项目：
(1)在通过相位差成像进行的外观检查中，没有成纤维细胞、异物、变色或其它异常；
(2)细胞生存率在台盼蓝染色中为70％以上；
(3)细胞上清在通过ELISA进行的纯度试验中PDGF-BB为100pg/mL以上；
(4)细胞在通过FACS进行的纯度试验结果中满足以下所有范围：
CD166+>99％
CD24+<5％
CD44high<5％
CD44neg-low>90％
CD90+<5％；
(5)具有人角膜内皮功能的效应细胞的含有率(E-ratio)高于90％；
(6)泵功能(Na+/K+ATPase)为阳性；
(7)屏障功能(ZO-1)为阳性；
(8)人角膜内皮细胞密度(ECD)为1500个细胞/mm2以上。
8.如权利要求7所述的保存方法，其中，
所述效应细胞是未发生内皮间质转化的细胞。
9.如权利要求7或8所述的保存方法，其中，
所述效应细胞表达发挥角膜内皮功能特性所必需的功能蛋白，或者，不表达抑制所述角膜内皮功能特性的抑制蛋白或抑制蛋白的表达降低。
10.如权利要求9所述的保存方法，其中，
所述功能蛋白包括选自于由Na+/K+ATPase、ZO-1、钠/氢交换体1(NHE1)、水通道蛋白1(AQP-1)和碳酸脱水酶5B(CA5B)所组成的组中的一种或多种。
11.如权利要求9或10所述的保存方法，其中，
所述功能蛋白进一步包括选自于由柠檬酸合酶(CS)、乌头酸酶2(ACO2)、异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、苹果酸脱氢酶2(MDH2)、苹果酸酶3(ME3)、ACSS1、乙酰CoA乙酰基转移酶1(ACAT1)、丙酮酸脱氢酶(PDH)、BCAT2和支链酮酸脱氢酶2(BCKDH2)所组成的组中的一种或多种代谢相关酶。
12.如权利要求9-11中任一项所述的保存方法，其中，
所述抑制蛋白包括选自于由ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)、乌头酸酶1(ACO1)、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、苹果酸脱氢酶1(MDH1)、苹果酸酶1(ME1)、ACSS2、乙酰CoA乙酰基转移酶2(ACAT2)和乳酸脱氢酶(LDH)所组成的组中的至少1种以上的代谢相关酶。
13.通过权利要求1-12中任一项所述的保存方法保存的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞。
14.通过权利要求1-12中任一项所述的保存方法保存的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的悬浮液。
15.一种人角膜内皮细胞的制备方法，其特征在于，
使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使通过权利要求1-12中任一项所述的保存方法保存的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞增殖和/或分化、成熟。
16.一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的悬浮液的制备方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)-(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集，使其成为悬浮状态：
(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为包含所述突起的长径短径的比接近1的铺路石状的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；
(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；
(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下；
(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。
17.一种人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的培养方法，其特征在于，在满足以下所列举的(a)-(d)中的任一个或多个条件的时期，对使用含有ROCK抑制剂且表皮生长因子(EGF)的含量小于引起转化的浓度的培养基使其增殖的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞进行收集、传代：
(a)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的形态从具有不规则细长突起的纺锤状成纤维细胞样的形态转变为长径短径的比接近1的铺路石状的形态后即刻直到细胞间的边界即将变得不清楚前的期间；
(b)从CD44的表达量成为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下时直到达到平台的期间；
(c)所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个细胞/mm2以上2500个细胞/mm2以下；
(d)从最近的传代开始的培养天数为4天以上14天以下。
18.一种保存方法，所述保存方法是保存经培养的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的方法，所述保存方法具备：
得到多个人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的工序；
分离所述多个细胞的至少一部分，生成用于评价的细胞群和用于保存的细胞群的工序；
对所述细胞群的至少一部分进行关于以下(a)、(b)、(c)和(d)的评价基准中的一个以上的评价的工序：
(a)确定人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的形态从纺锤形变化为(i)多边形或(ii)长轴与短轴的比接近1的椭圆形的任一者且细胞间的边界清楚的细胞，
(b)确定在CD44的表达量为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下的水平下使CD44表达后，表达一定量的CD44的细胞，
(c)识别人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个/mm2以上2500个/mm2以下，以及，
(d)确定从所述评价开始直到最近的传代为止的期间是否为4天以上14天以下；以及
在用于评价的细胞群满足所述(a)、(b)、(c)和(d)中的任一个的评价基准的一个以上的情况下，从细胞群中将至少一部分细胞配置在保存介质中以用于进行保存的工序。
19.如权利要求18所述的保存方法，其中，
在10℃以下保存所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞。
20.如权利要求18或19所述的保存方法，其中，
将所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞保存24小时以上。
21.如权利要求18-20中任一项所述的保存方法，其中，
所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞是以选自于由角膜内皮细胞由来的细胞、多能干细胞、间充质干细胞、从角膜内皮收集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮收集的细胞以及由直接编程法制作的角膜内皮前体细胞和角膜内皮样细胞所组成的组的细胞作为起源而制作的细胞。
22.一种处理方法，所述处理方法是处理经培养的人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的方法，所述处理方法包括：
在包含培养液的培养容器中培养多个人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的工序；
分离所述多个人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的至少一部分，生成用于评价的细胞群和剩余细胞群的工序；
对细胞群的至少一部分进行关于以下(a)、(b)、(c)和(d)的评价基准中的1个以上的评价的工序：
(a)确定人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的形态从纺锤形变化为(i)多边形或(ii)长轴与短轴的比接近1的椭圆形的任一者且细胞间的边界清楚的细胞，
(b)确定在CD44的表达量为最近的传代后所观察到的最大值的一半以下的水平下使CD44表达后，表达一定量的CD44的细胞，
(c)识别人角膜内皮细胞和/或人角膜内皮前体细胞的细胞密度为900个/mm2以上2500个/mm2以下，以及，
(d)确定从所述评价开始直到最近的传代为止的期间是否为4天以上14天以下；以及
在所述用于评价的细胞群满足所述(a)、(b)、(c)和(d)的评价基准中的1个以上的情况下，从细胞群中将至少一部分细胞配置在保存介质中以用于进行保存的工序；或者在所述用于评价的细胞群不满足(a)、(b)、(c)和(d)的各评价基准的情况下，从所述剩余细胞群中将至少一部分细胞放入含有培养液的培养容器中，进一步培养一定期间的工序。
23.如权利要求22所述的处理方法，其中，
所述培养液含有ROCK抑制剂，培养液含有引起细胞的转化的浓度以下的表皮生长因子(EGF)。
24.如权利要求22或23所述的处理方法，其中，
所述培养液含有ROCK抑制剂，所述培养液的表皮生长因子(EGF)的浓度为2ng/ml以下。
25.如权利要求24所述的处理方法，其中，
所述培养液不含EGF。
26.如权利要求22-25中任一项所述的处理方法，其中，
所述人角膜内皮细胞和/或所述人角膜内皮前体细胞是以选自于由角膜内皮细胞由来的细胞、多能干细胞、间充质干细胞、从角膜内皮收集的角膜内皮前体细胞、从角膜内皮收集的细胞以及由直接编程法制作的角膜内皮前体细胞和角膜内皮样细胞所组成的组的细胞作为起源而制作的细胞。
27.一种方法，所述方法进一步包括将通过权利要求18-26中任一项所述的保存方法或处理方法保存的细胞从保存状态取出，放回到新培养容器以用于额外培养的工序，提供给额外培养的细胞满足以下(1)-(8)的评价基准中的1个以上：
(1)在通过相位差成像进行的外观检查中，没有成纤维细胞、异物、变色或其它异常；
(2)细胞生存率在台盼蓝染色中为70％以上；
(3)细胞上清在通过ELISA进行的纯度试验中PDGF-BB为100pg/mL以上；
(4)细胞在通过FACS进行的纯度试验结果中满足以下所有范围：
CD166+>99％
CD24+<5％
CD44high<5％
CD44neg-low>90％
CD90+<5％；
(5)具有人角膜内皮功能的效应细胞的含有率(E-ratio)高于90％；
(6)泵功能(Na+/K+ATPase)为阳性；
(7)屏障功能(ZO-1)为阳性；
(8)人角膜内皮细胞密度(ECD)为1500个细胞/mm2以上。
28.一种方法，所述方法将通过权利要求18-26中任一项所述的保存方法或处理方法保存并从该保存状态取出的细胞应用于递送至受试者的眼以用于治疗眼的疾病或伤害。
29.一种保存方法，所述方法将通过权利要求18-26中任一项所述的保存方法或处理方法保存并从该保存状态取出的细胞应用于递送至受试者的眼的药品的制备以用于治疗眼的疾病或伤害。
30.一种保存方法，所述方法将通过权利要求18-26中任一项所述的保存方法或处理方法保存并从该保存状态取出的细胞应用于治疗眼的疾病或伤害。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中，
所述眼的疾病或所述伤害是角膜的疾病或损伤。
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