BR112019020699A2 - Método de criopreservação - Google Patents

Abstract

células-tronco/progenitoras da árvore biliar humana (hbtscs) estão sendo usadas para terapias celulares de pacientes com cirrose hepática. foi estabelecido um método de criopreservação para otimizar o abastecimento de hbtscs para esses programas clínicos e que compreende meio de kubota livre de soro (km) suplementado com sulfóxido de dimetila 10% (dmso), albumina humana recombinante -3% e hialuronanos 0,1%. hbtscs criopreservadas versus recém isoladas foram similares in vitro com relação à auto-replicação, traços de severidade e multipotência. elas foram capazes de se diferenciar em hepatócitos, colangiócitos ou ilhotas pancreáticas funcionais, gerando níveis similares de secreção de albumina ou de níveis de insulina induzíveis por glicose. hbtscs criopreservadas versus recém isoladas foram igualmente capazes de enxertia em camundongos imunocomprometidos gerando células com expressão gênica específica para humanos e níveis de albumina humana em soro murídeo que eram maiores para hbtscs criopreservadas do que para hbtscs recém isoladas. a criopreservação bem-sucedida de hbtscs facilita o estabelecimento de bancos de células de hbtscs que oferecem vantagens logísticas para programas clínicos para o tratamento de doença hepática.

Description

MÉTODO DE CRIOPRESERVAÇÃO

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. 119(e) para o Pedido U.S. N° 62/482.644, depositado em 6 de abril de 2017, cuja totalidade é incorporada por referência nesse relatório descritivo.

FUNDAMENTOS

[002] Apresente invenção está relacionada de forma geral ao campo de métodos de criopreservação para células.

[003] Em trabalho prévio, os Requerentes demonstraram a presença de células que expressam uma constelação de marcadores endodérmicos em glândulas (peri)-biliares de duetos biliares extra-hepáticos ^[1-4j . Essas observações ín sítu em tecidos humanos foram complementadas pela demonstração in vitro de que subpopulações de células-tronco (SOX9+/PDX1+/SOX17+/EpCAM+; SOX9+/PDXl+/SOX17+/EpCAM-) isoladas do epitélio biliar possuem manutenção e autorrenovação de longo prazo (in vitro), e são capazes de dar origem a uma prole mais restrita de linhagens hepáticas e pancreáticas maduras diferentes ^[1-4j . p descoberta dessas células, denominadas células-tronco/progenitoras da árvore biliar humana (hBTSCs), abre um novo cenário com implicações relevantes em diferentes questões, incluindo a embriologia do fígado, epitélio biliar e pâncreas, fisiopatologia da árvore biliar, carcinogênese hepatobiliar e pancreática e, finalmente, medicina regenerativa do fígado e pâncreas ^[1-4j . A esse respeito, a demonstração recente da contraparte das hBTSCs (presumidamente descendentes de hBTSCs) encontrada dentro das criptas das vesículas biliares, denominadas células-tronco/progenitoras da vesícula biliar humana

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 11/80

2/63 (hGSCs)^[5i, aumenta a possibilidade de um uso clinico dessas populações de células-tronco/progenitoras endodérmicas com capacidade multipotencial e de diferenciação (hBTSCs e hGSCs) para terapias celulares de doenças hepáticas. Com destaque, essas células são facilmente isoláveis e cultiváveis e possuem um potencial imunogênico e oncogênico baixo ou nulo ^[6] . Considerando os vários obstáculos no abastecimento de células para medicina regenerativa ^[71 _{f a} árvore biliar podería representar uma fonte ideal de célulastronco e progenitores para medicina regenerativa. Na verdade, os Requerentes transplantaram com sucesso hBTSCs recém isoladas em pacientes cirróticos com benefícios em termos de melhora das funções hepáticas.

[004] Tecidos humanos são de difícil obtenção, e as exigências atuais para programas clínicos para que células sejam recém isoladas dificultam o abastecimento de células para tratamentos de pacientes. Por essa razão, a criopreservação representa uma etapa obrigatória para usos de rotina de produtos de células em programas clínicos de terapias celulares. Diversas técnicas de criopreservação diferentes foram propostas, incluindo o uso de agentes de criopreservação ^[8, ^9], uma técnica de revestimento de células [ío-12] , técnicas de precondicionamento ^[13j _e congelamento gradual ^[14, isj . infelizmente, com relação aos tipos de células isoladas de órgãos sólidos, como células hepáticas, uma grande variabilidade em termos de viabilidade celular e eficiência de enxertia após descongelamento foi relatada ^[13, ¹⁶' ^17] . Terry e cols. uu , por exemplo, propuseram o uso de albumina sérica humana purificada como uma alternativa ao soro a fim de preservar viabilidade elevada e obter uma

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 12/80

3/63 condição de criopreservação definida. Mais recentemente, Turner e cols.^ll9] desenvolveram uma estratégia eficiente para preservar a expressão de moléculas de adesão durante criopreservação de célula-tronco hepática humana (hHpSC) por uso de dois tampões inteiramente definidos livres de soro, que foram suplementados com hialuronanos (HA) : Crystor-10 (CS10; Biolife Solutions, Bothell, WA, EUA) ou meio de Kubota (PhoenixSongs Biologicals, Branford, CT) .

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[005] Aspectos da presente revelação estão relacionados a um método para criopreservação de células-tronco/ progenitoras da árvore biliar humana (hBTSCs), que compreende a coleta de células-tronco/progenitoras da árvore biliar humana; adição de uma solução de criopreservação às células, em que a solução de criopreservação compreende (a) um meio basal que compreende lipídeos, (b) hialuronanos (HA) , (c) um crioprotetor, (d) um antioxidante e (e) um fator de substituição de soro, opcionalmente albumina; e (iii) resfriamento das células desde uma temperatura inicial até uma temperatura final na qual as células são congeladas.

[006] Em algumas modalidades, o hialuronano está em uma concentração entre cerca de 0,05% e 0,15%, opcionalmente em uma concentração de cerca de 0,1%.

[007] Em algumas modalidades, o crioprotetor compreende um ou mais de açúcar, glicerol e DMSO. Em algumas modalidades, o crioprotetor está em uma concentração entre cerca de 1% e 20%, opcionalmente em uma concentração de cerca de 10%.

[008] Em algumas modalidades, o antioxidante compreende um ou mais de selênio, Vitamina E, Vitamina C e glutationa

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 13/80

4/63 reduzida .

[009] Em algumas modalidades, a albumina é albumina purificada e/ou albumina humana, opcionalmente albumina humana derivada do plasma ou albumina humana recombinante. Em algumas modalidades, a albumina está em uma concentração entre cerca de 1 a 5%, opcionalmente em uma concentração de cerca de 3%.

[010] Em algumas modalidades, a solução de criopreservação compreende um ou mais tampões disponíveis comercialmente ou de algum outro modo revelados, que podem compreender um ou mais dos componentes (a) até (e). Exemplos não limitantes incluem meio de Kubota, Cryostor, Viaspan, RPMI-1640, DME/F12 e GIBCO's Konckout Serum Replacement.

[Oil] Em algumas modalidades, a etapa (iii) é alcançada usando congelamento lento programável. Em modalidades adicionais, a etapa (iii) compreende a redução da temperatura inicial em uma taxa de cerca de 1°C por minuto até que uma temperatura final seja alcançada. Em algumas modalidades, a etapa (iii) compreende:

(a) resfriamento de células desde uma temperatura inicial até uma temperatura final de cerca de -80°C usando dióxido de carbono sólido, ou (b) resfriamento de células desde uma temperatura inicial até uma temperatura final de cerca de -196°C usando nitrogênio líquido. É observado que a etapa (iii) pode ser alcançada, em certas modalidades, usando os métodos de congelamento rápido revelados nesse relatório descritivo.

[012] Aspectos adicionais se relacionam a um método de descongelamento das células-tronco/progenitoras criopreservadas da árvore biliar humana (hBTSCs) reveladas

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 14/80

5/63 nesse relatório descritivo. Exemplos não limitantes de descongelamento adequado, por exemplo, (1) descongelamento de células criopreservadas de acordo com o método revelado nesse relatório descritivo, (ii) adição de uma primeira solução-tampão; (iii) separação das células do meio de criopreservação e da primeira solução-tampão; e (iv) ressuspensão das células em uma segunda solução-tampão.

[013] Em algumas modalidades a primeira e/ou segunda solução-tampão compreende soro ou um meio de substituição de soro. Em algumas modalidades, o soro é soro bovino fetal. Em algumas modalidades, o meio de substituição de soro pode ser um ou mais de Knockout Serum Replacement Medium de GIBCO e meio de Kubota, opcionalmente suplementado com albumina, que, por sua vez, opcionalmente é albumina humana derivada do soro. Em algumas modalidades, o soro está em uma concentração entre cerca de 2% até 20%, opcionalmente entre cerca de 10% até 20%, cerca de 10% ou cerca de 20%. É observado que esse método de descongelamento com muito soro pode ser vantajoso para minimizar a formação de cristal de gelo, em que um tampão não isotônico é usado por causa da necessidade de teor elevado de lipideos nesse processo. Em algumas modalidades, o soro está em uma concentração entre cerca de 2% até 5%. É observado que esse método de descongelamento com pouco soro pode ser usado quando um tampão isotônico é usado, porque não é necessário um teor elevado de lipideos. Em algumas modalidades, o meio de substituição de soro compreende albumina em uma concentração entre cerca de 1% até 5%.

[014] Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda solução-tampão compreende um tampão de descongelamento. É

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 15/80

6/63 observado que alguns tampões de descongelamento disponíveis comercialmente compreendem soro ou um substituto de soro. Também é observado que algumas modalidades podem incluir descongelamento por outros meios que não aqueles prescritos nesse relatório descritivo acima.

[015] É ainda observado que existem várias formas para separar células de um meio, por exemplo, meio de cultura, solução-tampão e/ou solução de criopreservação. Exemplos não limitantes incluem centrifugação das células; filtração das células através de uma peneira ou filtro; e filtração do tipo prensa francesa.

[016] Aspectos adicionais se relacionam a um método de cultivo de células-tronco/progenitoras descongeladas criopreservadas da árvore biliar humana que compreende o plaqueamento das células congeladas de acordo com o método revelado nesse relatório descritivo; cultivo das células em uma incubadora; remoção da solução-tampão; e substituição da solução-tampão com um meio de cultura projetado para o crescimento e/ou diferenciação de célulastronco/progenitoras da árvore biliar humana.

[017] Em algumas modalidades, as células são incubadas na incubadora por entre cerca de 6 a 7 horas.

[018] Em algumas modalidades, o meio de cultura projetado para o crescimento e/ou diferenciação de célulastronco/progenitoras da árvore biliar humana compreende meio de Kubota e/ou um meio definido hormonalmente (HDM) para a diferenciação de células (por exemplo, para restrição de linhagem em hepatócitos, e depois HDM-H).

[019] Aspectos adicionais estão relacionados a uma composição que compreende diversas células-tronco/

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 16/80

7/63 progenitoras criopreservadas da árvore biliar humana de acordo com os métodos revelados nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, essas células podem ser descongeladas ou congeladas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[020] As FIGS. 1A-1E retratam funções biológicas das células após criopreservação/descongelamento. A) A viabilidade celular foi avaliada pelo teste de exclusão de Azul Tripano após descongelamento das células criopreservadas em diferentes soluções (N = 9 experimentos). A viabilidade foi significantemente maior na solução 1 (Soil) e Sol3 vs. Sol2A, Sol2B, solução de controle (CTRL), e recém células isoladas (Sem Crio). Nenhuma diferença foi encontrada entre Soil e Sol3. Os dados são expressos como média ± DP de 9 experimentos; Cl = p < 0,001 Soil e Sol3 vs. Sol2A, Sol2B e CTRL; a = p < 0,001 Sem Crio vs. todas as outras Soluções. Composição da solução: Soil = Meio de Kubota (KM) , DMSO (10%), albumina humana recombinante (15%), ácido hialurônico (0,1% P/V); Sol2A = KM, ácido hialurônico (0,1% P/V), DMSO (10%); Sol2B = KM, ácido hialurônico (0,05% P/V), DMSO (10%); Sol3 = KM, DMSO (10%), albumina humana recombinante (15%); CTRL= KM, DMSO (10%), albumina humana recombinante (1,5%) . B) A senescência celular foi avaliada pelo teste de X-Gal em culturas obtidas de células criopreservadas ou recém isoladas (Sem Crio) obtidas dos mesmos doadores. Os gráficos mostram a percentagem de células X-Gal-negativas (células não senescentes). Células X-Galnegativas excediam 95% após criopreservação. Nenhuma diferença foi observada entre Soil e Sol3, e entre células criopreservadas e células frescas de controle (Sem Crio).

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 17/80

8/63

Sol2A demonstrou uma senescência maciça de células descongeladas cultivadas (δ = p < 0, 0001 vs. outras) . Os dados são expressos como média ± DP de 3 experimentos. C) Taxa de proliferação expressa como taxa semanal de duplicação da população (PD) em culturas de hBTSCs criopreservadas em Soil, Sol3, e controles recém isolados (Sem Crio) . Células criopreservadas (Soil e Sol3) demonstraram uma taxa semanal de PD maior com relação às células não criopreservadas (§ = p < 0,01) . Os dados são expressos como média ± DP de 8 experimentos. D) O Tempo de Duplicação da População (PDT) pareceu menor em Soli (com ácido hialurônico/HA) do que Sol3 (sem HA) e controles recém isolados (Sem Crio) (C^: = p < 0,001 vs. outras), e em Sol3 vs. controles recém isolados (Sem Crio) (é = p < 0, 0001 vs. Sem Crio) . Os dados são expressos como média ± DP de 8 experimentos. E) O número de colônias foi cotado no dia 3 de cultura. hBTSCs revestidas com HA e hBTSCs não revestidas foram comparadas. Os gráficos ilustram o número de colônias formadas após descongelamento de células criopreservadas em Soil e Sol3. Um número maior de colônias (31,56 ± 8,43) desenvolvidas em culturas de Soil do que Sol3 (10,11 ± 3,85) ($ = p < 0, 000001) . Os dados são expressos como média ± DP de 18 experimentos.

[021] A FIG. 2 mostra a expressão de genes de pluripotência e de molécula adesão em culturas de células criopreservadas na solução 1 (Soil), Sol3, ou células-tronco (hBTSCs) da árvore biliar humana recém isoladas, que não são criopreservadas (Sem Crio) . Expressão gênica relativa de SOX2. hBTSCs criopreservadas tanto em Soil quanto em Sol3 mostravam expressão aumentada. Os dados são expressos como média ± erro-padrão (SE) de 9 experimentos; * = p < 0,05.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 18/80

9/63

Expressão gênica relativa de PDX1. hBTSCs criopreservadas tanto em Soil quanto em Sol3 mostravam expressão aumentada. Os dados são expressos como média ± SE de 9 experimentos; * = p < 0,05. Expressão gênica relativa de NANOG. hBTSCs criopreservadas tanto em Soil quanto em Sol3 mostravam expressão aumentada. Os dados são expressos como média ± SE de 9 experimentos; § = p < 0,01. Expressão gênica relativa de SOX17. hBTSCs criopreservadas tanto em Soil quanto em 3 mostravam expressão aumentada. Os dados são expressos como média ± SE de 9 experimentos; * = p < 0,05. Expressão gênica relativa de OCT4. hBTSCs criopreservadas tanto em Soil quanto em Sol3 mostravam expressão aumentada. Os dados são expressos como média ± SE de 9 experimentos; § = p < 0,01. Expressão gênica relativa de CD44. Os dados são expressos como média ± erro-padrão (SE) de 6 experimentos. Expressão gênica relativa de ITGpl. hBTSCs criopreservadas tanto em Soil quanto em Sol3 exibiam expressão reduzida. Os dados são expressos como média ± SE de 6 experimentos; * = p < 0,05. Expressão gênica relativa de ITG[34. hBTSCs criopreservadas tanto em Soil quanto em 3 mostravam expressão aumentada. Os dados são expressos como média ± SE de 6 experimentos; * = p < 0,05 Sem Crio vs. outras. Expressão gênica relativa de CDH1. hBTSCs criopreservadas tanto em Soil quanto em Sol3 exibiam expressão reduzida. Os dados são expressos como média ± SE de 6 experimentos; § = p < 0,01.

[022] As FIGS. 3A-3B mostram expressão de genes de pluripotência e multipotência em culturas de hBTSCs criopreservadas ou recém isoladas sob meio de autorrenovação (KM) ou definido hormonalmente para múltiplos destinos maduros endodérmicos (hepatocitico/HM, colangiocitico/CM,

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 19/80

10/63 ilhotas pancreáticas/PM). A) Expressão gênica relativa de SOX2, EpCAM, OCT4, PDX1, SOX17, SOX2 em hBTSCs criopreservadas em Soil e em Sol3 (não mostrado) sob condições de cultura diferentes. hBTSCs previamente criopreservadas cultivadas sob condições de autorrenovação em meio de Kubota (KM) reduziram a expressão de genes de pluripotência e multipotência quando transferidas em meio definido hormonalmente para destinos maduros endodérmicos particulares (hepatocítico/HM, colangiocítico/CM, ilhotas pancreáticas/PM). Os dados são expressos como média ± DP de 3 experimentos; * = p < 0,05; § = p < 0,01; ** = p < 0,05 HM vs. CM e PM; §§ = p < 0,05 PM vs. CM e HM. B) Expressão gênica relativa de Nanog, SOX2, EpCAM, OCT4, PDX1, SOX17, SOX2 em hBTSCs cultivadas recém isoladas (EI) em condições definidas diferentes. hBTSCs cultivadas recém isoladas sob condições de autorrenovação em meio de Kubota (KM) reduziram a expressão de genes de pluripotência e multipotência quando transferidas em meio definido hormonalmente para destinos maduros endodérmicos particulares (hepatocítico/HM, colangiocítico/CM, ilhotas pancreáticas/PM). Os dados são expressos como média ± DP de 3 experimentos; * = p < 0,05;

§ =	P <	0, 01	* * —	p < 0,05 HM vs.	CM	e PM; §§ =	: P <	í 0,05 PM
vs.	CM e	HM.
	[023	] As	FIGS.	4A-4B mostram	a	expressão	de	genes de
destinos	maduros	específicos	em	culturas	de	hBTSCs

criopreservadas ou recém isoladas em condições de autorrenovação (meio de Kubota-KM) ou meio definido hormonalmente para destinos maduros endodérmicos particulares (hepatocítico/HM, colangiocítico/CM, ilhotas pancreáticas/PM). A) Expressão gênica relativa de CYP3A4,

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 20/80

11/63 albumina (ALB), transferrina (TRANSE), insulina (INS), glucagon, Receptor de Secretina (SR), CFTR, ASBT em hBTSCs criopreservadas cultivadas em condições definidas diferentes. hBTSCs previamente criopreservadas cultivadas em condições de autorrenovação em meio de Kubota (KM) aumentaram a expressão de genes específicos associados com destinos adultos quando transferidas no meio definido hormonalmente apropriado (hepatocítico/HM, colangiocítico/CM, ilhotas pancreáticas/PM). Os dados são expressos como média ± DP de 3 experimentos; * = p < 0,05; § = p < 0,01; ^Ω = p < 0,001;

= p < 0,0001. B) Expressão gênica relativa de CYP3A4, albumina (ALB), transferrina (TRANSF), insulina (INS), glucagon, Receptor de Secretina (SR), CFTR, ASBT em hBTSCs recém isoladas cultivadas em condições definidas diferentes. hBTSCs cultivadas recém isoladas em condições de autorrenovação em meio de Kubota (KM) aumentaram a expressão de genes específicos associados com destinos maduros quando transferidas no meio definido hormonalmente relacionado (hepatocítico/HM, colangiocítico/CM, ilhotas pancreáticas/ PM) . Os dados são expressos como média ± DP de 3 experimentos; * = p < 0,05; § = p < 0,01; D = p < 0,001;

= p < 0,0001.

[024] As FIGS. 5A-5B retratam alterações morfológicas, fenotípicas e funcionais induzidas por meios de cultura hormonalmente definidos, comparados com meio de Kubota/KM (condição basal) para demonstrar a diferenciação eficaz de hBTSCs criopreservadas. A) hBTSCs criopreservadas foram descongeladas e depois cultivadas em meios customizados especificamente para induzir diferenciação em hepatócitos (HM) , colangiocítos (CM) ou células pancreáticas (PM) . Após

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 21/80

12/63 dias em HM, células com formato cubóide que expressam albumina (marcadores de hepatócito) eram evidentes (N = 5). Após 15 dias em CM, agrupamentos de células que expressam CK19 apareceram (N = 5). Após 14 dias, as monocamadas em PM fazem uma transição para bolas densas de células agregadas que brotam das bordas das colônias e que contêm células que expressam insulina (Figura 10) (N = 5) . As Figuras são representativas de culturas de células criopreservadas em Soil (N = 5) . B) A diferenciação de hBTSCs criopreservadas descongeladas e cultivadas em meio hepatocitico (HM) foi demonstrada pela secreção de albumina com relação às células de controle cultivadas em condições de autorrenovação em meio de Kubota (KM) (dados são expressos como média ± DP de 6 experimentos; § = p < 0,01 HM vs. KM), que resultou menor com relação à HepG2 (* = p < 0,05 HepG2 vs. KM), mas similar às células recém isoladas (não mostrado). C) Em meio pancreático (PM), hBTSCs tanto criopreservadas quanto recém isoladas adquiriram propriedade de secreção de insulina (Peptideo-C) que era regulada pela concentração de glicose (dados são expressos como média ± DP de 7 experimentos; § = p < 0,01 concentração baixa vs. alta de glicose, ti = p < 0,001 concentração baixa vs. alta de glicose).

[025] As FIGS. 6A-6C retratam enxerto de fígado ín vivo e diferenciação em hepatócitos de hBTSCs (criopreservadas vs. recém isoladas) após transplante intraesplênico em camundongos SCID. Trinta dias após injeção de hBTSC no baço, fígados e soro foram analisados. A) Cortes de fígados foram analisados por imunoistoquímica utilizando anti-mitocôndrias humanas. hBTSCs recém isoladas e criopreservadas mostraram eficiência de enxertia similar no parênquima hepático

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 22/80

13/63 murideo (N = 3) . A expressão de mitocôndrias humanas no parênquima hepático de camundongos SCID indicava que 2,626 ± 1,530% e 3,722 ± 0,639% da massa de células parenquimatosas do hospedeiro eram derivadas de hBTSCs recém isoladas e criopreservadas transplantadas, respectivamente (dados são expressos como a média ± DP de 3 experimentos). B) Cortes de fígados foram analisados por RT-qPCR quanto à expressão gênica de albumina humana. A expressão gênica de albumina humana no parênquima hepático de camundongos SCID foi maior (§ = p < 0,01) quando hBTSCs criopreservadas (5,19 x 10~⁷ ± 3,06 x 10~⁷) foram transplantadas, comparado com quando hBTSCs recém isoladas (1,90 x 10~¹⁰ ± 1,09 x 10~¹⁰) foram transplantadas. (Os dados são expressos como a média ± DP de 3 experimentos). C) Os níveis de albumina sérica humana nos camundongos SCID foram significantemente maiores (3 = p < 0,0001) quando hBTSCs criopreservadas (76,39 ± 17,04 ng/ml) foram transplantadas com relação às hBTSCs recém isoladas (24,13 ± 1,44 ng/ml). (Os dados são expressos como média ± DP de 3 experimentos).

[026] As FIGS. 7A-7D retratam clonogenicidade de célula única por meio de imagens de fase de contraste (Ampliações lOx) de uma colônia única em diferentes tempos de cultura. A) Dia 1, B) Dia 3, C) Dia 7, D) Dia 10.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[027] Modalidades de acordo com a presente revelação serão descritas mais inteiramente a seguir. Aspectos da revelação, no entanto, podem ser exemplificados em formas diferentes e não devem ser considerados como limitados às modalidades apresentadas nesse relatório descritivo. Ao invés disso, essas modalidades são fornecidas de modo que

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 23/80

14/63 essa revelação seja mais detalhada e completa, e englobarão totalmente o escopo da invenção para aqueles habilitados na técnica. A terminologia usada na descrição nesse relatório descritivo tem o único objetivo de descrever modalidades particulares e não visa ser limitante. Todas as referências mencionadas nesse relatório descritivo e ao longo do pedido são incorporadas por referência.

[028] Salvo definição em contrário, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados como comumente compreendidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa invenção pertence. Será ainda subentendido que termos, tais como aqueles definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpretados como tendo um significado que é consistente com seu significado no contexto do presente pedido e técnica relevante e não devem ser interpretados em um sentido idealizado ou inteiramente formal, salvo quando expressamente definido nesse relatório descritivo. Embora não definidos explicitamente abaixo, esses termos devem ser interpretados de acordo com seus significados comuns.

[029] A terminologia usada na descrição nesse relatório descritivo tem o objetivo único de descrever modalidades particulares, e não visa limitar a invenção. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas nesse relatório descritivo são incorporadas por referência em sua totalidade.

[030] A prática de presente tecnologia irá empregar, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de cultura de tecido, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular, e DNA recombinante, que

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 24/80

15/63 fazem parte dos conhecimentos da técnica. Veja, por exemplo, Sambrook e Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^a Edição; a série Ausubel e cols. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson e cols. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press em Oxford University Press); MacPherson e cols. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow e Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5^a Edição; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Patente U.S. N° 4.683.195; Hames e Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames e Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller e Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer e Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); e Herzenberg e cols, eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology.

[031] Salvo quando o contexto indica em contrário, deseja-se especificamente que as várias características da invenção descritas nesse relatório descritivo podem ser usadas em qualquer combinação. Além disso, a revelação também contempla que, em algumas modalidades, qualquer característica ou combinação de características apresentadas nesse relatório descritivo pode ser excluída ou omitida.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 25/80

16/63

Para ilustrar, se o relatório descritivo estabelece que um complexo compreende componentes A, B e C, deseja-se especificamente que qualquer um de A, B ou C, ou uma combinação destes, pode ser omitido e reivindicado isoladamente ou em qualquer combinação.

[032] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que são variadas ( + ) ou (-) por incrementos de 1,0 ou 0,1, como apropriado ou, alternativamente por uma variação de +/- 15% ou, alternativamente, 10% ou, alternativamente, 5% ou, alternativamente, 2%. Deve ser subentendido, embora nem sempre explicitamente estabelecido, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo cerca de. Também deve ser subentendido, embora nem sempre explicitamente estabelecido, que os reagentes descritos nesse relatório descritivo são meramente exemplares e que equivalentes desses são conhecidos na técnica.

Definições

[033] Como usadas na descrição da invenção e nas reivindicações em anexo, as formas no singular um, uma, o e a visam incluir também as formas no plural, a menos que o contexto determine claramente de forma diferente.

[034] O termo cerca de, como usado nesse relatório descritivo quando se refere a um valor mensurável como, por exemplo, uma quantidade ou concentração (por exemplo, a percentagem de colágeno nas proteínas totais no arcabouço de biomatriz) e semelhantes, visa englobar variações de 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou até mesmo 0,1% da quantidade especificada.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 26/80

17/63

[035] Os termos ou aceitável, eficaz ou suficiente quando usados para descrever a seleção de quaisquer componentes, faixas, formas de dose etc. revelados nesse relatório descritivo, visa significar que esse componente, faixa, forma de dose etc. é adequado para o objetivo desej ado.

[036] Também como usado nesse relatório descritivo, o termo e/ou se refere e engloba qualquer uma e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a ausência de combinações quando interpretado na alternativa (ou).

[037] Os termos tampão e/ou meios de enxágue são usados nesse relatório descritivo para se referir aos reagentes usados na preparação dos arcabouços de biomatriz.

[038] Com usado nesse relatório descritivo, o termo célula se refere a uma célula eucariótica. Em algumas modalidades, essa célula é de origem animal e pode ser uma célula-tronco ou uma célula somática. O termo população de células se refere a um grupo de uma ou mais células do mesmo tipo de célula ou de tipos de células diferentes com a mesma origem ou com uma origem diferente. Em algumas modalidades, essa população de células pode ser derivada de uma linhagem de célula; em algumas modalidades, essa população de células pode ser derivada de uma amostra de um órgão ou tecido.

[039] Com usado nesse relatório descritivo, o termo que compreende visa significar que as composições e métodos incluem os elementos citados, mas não excluem outros. Como usada nesse relatório descritivo, a frase transicional que consiste basicamente em (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como englobando os materiais ou etapas citadas

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 27/80

18/63 e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e inéditas da modalidade citada. Veja, In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (ênfase no original); veja também MPEP § 2111.03. Dessa forma, o termo que consiste basicamente em, como usado nesse relatório descritivo, não deve ser interpretado como equivalente a que compreende. O termo que consiste em deve significar que exclui mais do que elementos-traço de outros ingredientes e etapas do método substanciais para administração das composições reveladas nesse relatório descritivo. Aspectos definidos por cada um desses termos de transição estão dentro do escopo da presente revelação.

[040] O termo cultura ou cultura de células significa a manutenção de células em um ambiente artificial, bidimensional (2D, monocamada) ou tridimensional (3D), ín vitro ou ex vivo (formatos polarizados de células quando em certas formas de matriz ou quando flutuantes), em algumas modalidades como células aderentes (por exemplo, culturas de monocamada) ou como culturas de agregados flutuantes de esferóides ou organóides. O termo esferóide indica um agregado flutuante de células, todas sendo do mesmo tipo de célula (por exemplo, um agregado de uma linhagem de célula); um organóide é um agregado flutuante de células formado por múltiplos tipos de células. Em algumas modalidades, o organóide pode ser um agregado de epitélios e um ou mais tipos de células mesenquimais que compreendem endotélios e/ou células estromais ou estreladas. O termo sistema de cultura de células é usado nesse relatório descritivo para se referir às condições de cultura nas quais uma população de células pode sobreviver ou ser desenvolvida.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 28/80

19/63

[041] O termo meio de cultura é usado nesse relatório descritivo para se referir a uma solução nutriente para o cultivo, crescimento ou proliferação de células. Em algumas modalidades, ela compreende um ou mais de aminoácidos, vitaminas, sais, lipideos, minerais, elementos-traço) e que mimetiza os constituintes químicos do fluido intersticial. O meio de cultura pode ser caracterizado por propriedades funcionais como, por exemplo, mas limitação, a habilidade para manter as células em um estado particular (por exemplo, um estado pluripotente, um estado quiescente etc.), para células maduras — em alguns casos, especificamente, para promover a diferenciação de células-tronco/progenitoras em células de uma linhagem particular. Um exemplo não limitante de meio de cultura usado para células-tronco/progenitoras é o meio de Kubota, que é adicionalmente definido nesse relatório descritivo abaixo. Em algumas modalidades, o meio pode ser um meio de semeadura usado para apresentar ou introduzir células em certo ambiente.

[042] Mais especificamente, um meio basal é um tampão formado por aminoácidos, açúcares, lipideos, vitaminas, minerais, sais, elementos-traço e vários nutrientes em composições que mimetizam os constituintes químicos do fluido intersticial em torno das células. Esses meios podem opcionalmente ser suplementados com soro para fornecer as moléculas de sinalização exigidas (hormônios, fatores de crescimento) necessárias para dirigir um processo biológico (por exemplo, proliferação, diferenciação) ou como uma fonte de inibidores para enzimas usadas tipicamente na preparação de suspensões de células.

[043] Embora o soro possa ser autólogo para os tipos de

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 29/80

20/63 células usados em culturas, ele é mais comumente soro de animais rotineiramente abatidos para fins agrícolas ou alimentares como, por exemplo, soro de vacas, carneiros, cabras, cavalos etc. Meios suplementado com soro podem ser opcionalmente referidos como meios suplementados com soro (SSM).

[044] Como usado nesse relatório descritivo, o termo diferenciação significa que condições especificas fazem com que as células madureçam em tipos de células adultas que produzem produtos gênicos adultos específicos.

[045] Os termos equivalente ou equivalente biológico são usados de forma intercambiável quando se referem a uma molécula, material biológico ou celular particular e visam aqueles que possuem homologia mínima, embora ainda mantenham a estrutura ou funcionalidade desejadas.

[046] Com usado nesse relatório descritivo, o termo expressão se refere ao processo pelo qual polinucleotideos são transcritos em mRNA e/ou ao processo pelo qual o mRNA transcrito está subsequentemente sendo traduzido em peptídeos, polipeptideos ou proteínas. Se o polinucleotídeo é derivado de DNA genômico, a expressão pode incluir splicing do mRNA em uma célula eucariótica. O nível de expressão de um gene pode ser determinado por medição da quantidade de mRNA ou proteína em uma amostra de célula ou tecido; além disso, o nível de expressão de múltiplos genes pode ser determinado para estabelecer um perfil de expressão para uma amostra particular.

[047] Com usado nesse relatório descritivo, o termo funcional pode ser usado para modificar qualquer molécula, material biológico ou celular com a intenção de que obtenha

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 30/80

21/63 um efeito especificado particular.

[048] 0 termo gene, como usado nesse relatório descritivo, visa amplamente incluir qualquer sequência de ácidos nucleicos transcrita em uma molécula RNA, seja o RNA codificador (por exemplo, mRNA) ou não codificador (por exemplo, ncRNA).

[049] Com usado nesse relatório descritivo, o termo gera e seus equivalentes (por exemplo, geração, gerado etc.) são usados de forma intercambiável com produz e seus equivalentes, quando se refere às etapas do método que geram uma colônia-, órgão- ou organóide-modelo particular.

[050] O termo isolado, como usado nesse relatório descritivo, se refere às moléculas ou materiais biológicos ou celulares que são substancialmente livres de outros materiais.

[051] O termo meio de Kubota, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um meio inteiramente definido, livre de soro, projetado para células-tronco endodérmicas e que as habilita a se expandir clonogenicamente em um modo de divisão autorreplicativo (especialmente se em substratos de hialuronano ou, em 3D, se hialuronanos são adicionados ao meio) . Meio de Kubota pode se referir a qualquer meio basal que não contém cobre, cálcio reduzido (< 0,5 mM) , insulina, transferrina/Fe, uma mistura de ácidos graxos livres purificados ligados à albumina purificada e, opcionalmente, também lipoproteina de alta densidade. O meio de Kubota ou seu equivalente é usado livre de soro, especialmente em seleção de cultura para células-tronco endodérmicas, e contém apenas uma mistura definida de sinais purificados (insulina, transferrina/Fe), lipídeos e

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 31/80

22/63 nutrientes. Em algumas modalidades, ele pode ser usado transitoriamente como um SSM usando níveis baixos (tipicamente 5% ou menos) de soro para o processo de semeadura de introdução de células nos arcabouços de matriz e a fim de inativar enzimas usadas na preparação de suspensões de células; a mudança para o meio de Kubota livre de soro o mais rapidamente possível (por exemplo, dentro de 5-6 horas) é ótima.

[052] Em certas modalidades, o meio é formado por um meio basal livre de soro (por exemplo, RPMI 1640 ou DME/F12) que não contém cobre, cálcio reduzido (< 0,5 mM) e suplementado com insulina (5 gg/ml), transferrina/Fe (5 gg/ml), lipoproteína de alta densidade (10 gg/ml), selênio (10¹⁰ M) , zinco (10~¹² M) , nicotinamida (5 gg/ml), e uma mistura de ácidos graxos livres purificados ligados a uma forma de albumina purificada. Métodos exemplares, não limitantes, para a preparação desses meios foram publicados em outro local, por exemplo, Kubota H., Reid L.M., Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 2000; 97: 12.132-12.137, Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui e cols. Hepatology. 2010; 52 (4) : 1.443-54, Turner e cols.; Journal of Biomedical Biomaterials. 2000; 82 (1) : páginas 156-168; Y. Wang, H.L. Yao, C.B. Cui e cols. Hepatology. Outubro de 2010 52 (4) : 1.443-54, cujas revelações são incorporadas nesse relatório descritivo por referência. Variantes do meio de Kubota podem ser usadas para certos tipos de células por fornecimento de fatores e suplementos adicionais para permitir a expansão sob condições livres de soro. Por exemplo, meio de Kubota pode ser modificado para permitir a amplificação transitória de células ou progenitores comprometidos (por exemplo,

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 32/80

23/63 hepatoblastos) e de outros estágios de linhagem de maturação posteriores às populações de célula-tronco para sobreviver e se expandir ex vivo sob condições livres de soro. Um exemplo disso é o meio de Kubota modificado para expansão ex vivo de hepatoblastos e seus descendentes, progenitores comprometidos: meio de Kubota livre de soro é ainda suplementado com fator de crescimento de hepatócitos (HGF) , fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e, algumas vezes, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). A expansão de células resultante ocorre com autorreplicação minima (se houver). 0 meio é especialmente eficaz se as células estão em substratos de colágeno do tipo IV e laminina ou embebidas em hidrogéis 3-D contendo mais do que 50% de colágeno do tipo IV e laminina.

[053] Os termos ácido nucleico, polinucleotídeo e oligonucleotídeo são usados de forma intercambiável e se referem a uma forma polimérica de nucleotideos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotideos ou ribonucleotideos ou análogos destes. Polinucleotideos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. A seguir serão mostrados exemplos não limitantes de polinucleotideos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, etiqueta (tag) de EST ou SAGE), éxons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossomal, RNAi, ribozimas, cDNA, polinucleotideos recombinantes, polinucleotideos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas e iniciadores de ácido nucleico.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 33/80

24/63

[054] Um polinucleotideo pode compreender nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presentes, modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polinucleotideo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotideo pode ainda ser modificado após a polimerização, por exemplo, por conjugação com um componente de marcação. O termo também se refere às moléculas tanto de fita dupla quanto de fita simples. A menos que especificado de outro modo ou necessário, qualquer aspecto dessa tecnologia que seja um polinucleotideo engloba tanto a forma de fita dupla quanto cada uma das duas formas complementares de fita simples conhecidas ou previstas como constituintes da forma de fita dupla.

Abreviações

[055] As seguintes abreviações são usadas nos exemplos revelados abaixo.

[056] ALB, Albumina; ASBT, Transportador de Ácido Biliar Apical Sódio-Dependente; bFGF, Fator de Crescimento básico de Fibroblastos; CDH1, Caderina 1; CFTR, Regulador de Condutância Transmembrana da Fibrose Cística; CK, Citoqueratina; CYP3A4, Citocromo P450 3A4; DMSO, Sulfóxido de Dimetila; DPBS, Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco; EGF, Fator de Crescimento Epidérmico; EpCAM, Molécula de Adesão à Célula Epitelial; FBS, Soro Bovino Fetal; GAPDH, Gliceraldeído 3-Fosfato Desidrogenase; GMP, Boas Práticas de Fabricação; HA, Hialuronanos; hBTSCs, Células-Tronco/Progenitoras da Árvore Biliar Humana; HGF, Fator de Crescimento de Hepatócitos; hGSCs, Células

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 34/80

25/63

Tronco/Progenitoras da Vesícula Biliar Humana; hHpSC, células-tronco hepáticas humanas; HDM, meio definido hormonalmente, livre de soro; HSA, Albumina Sérica Humana; INS, Insulina; ITGB1, Integrina βΐ; ITGB4, Integrina β4; KM, meio de Kubota; MKM, Meio de Kubota Modificado; NANOG, homeobox Nanog; OCT4, Fator de Transcrição de Ligação ao Octâmero 4; OSM, Oncostatina M; PBG, Glândula Peribiliar; PD, Duplicação da População; PDT, Tempo de Duplicação da População; PDX1, Homeobox Pancreático e Duodenal 1; RT-qPCR, Reação em Cadeia de Polimerase Quantitativa por Transcrição Reversa; SCID, Imunodeficiência Severa Combinada; SD, Desvio-Padrão; SOX, HMG box Sry-Relacionado; SR, Receptor de Secretina; T3, Triiodotiroxina 3; TRANSF, Transferrina; VEGF, Fator de Crescimento Endotelial Vascular.

Modos de realização da revelação

[057] Em geral, as técnicas de criopreservação se baseiam no uso de tampões isotônicos. Esses tampões reconhecidamente possuem a menor propensão para gerar a formação de cristais de gelo, na medida em que não há mudanças de água em função de efeitos osmóticos.

[058] Um exemplo disso é Cryostor, um tampão de criopreservação vendido por Biolife Solutions e que é um derivado do tampão de preservação de órgãos da Universidade de Wisconsin. O tampão-base é isotônico e é suplementado com uma proteína anticongelante (como a encontrada em animais que vivem no Ártico) + um crioconservante (DMSO) + um açúcar (um tamanho específico de dextrana).

[059] Os Requerentes descobriram que o uso de um tampão não isotônico podería ser apropriado para criopreservação. Por exemplo, o meio de Kubota não é isotônico, mas os efeitos

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 35/80

26/63 osmóticos são aliviados pelos hialuronanos. Os hialuronanos formam um complexo com os receptores de superfície para moléculas de adesão e bloqueiam sua internalização. Portanto, quando as células são descongeladas, elas são capazes de aderir imediatamente. Além disso, os Requerentes demonstraram que é ideal para as células-tronco que elas não devam ser mudadas de um tipo de tampão para outro. Ao invés disso, elas são mantidas no mesmo meio com uso dos suplementos para minimizar quaisquer efeitos osmóticos. Na verdade, se as células são criopreservadas em meio de Kubota, elas podem ser descongeladas nele e plaqueadas, permitindo que os usuários evitem a etapa de centrifugação (por exemplo, eliminando a preocupação sobre ter DMSO no meio por poucas horas durante adesão, e simplesmente deixando que as células adiram e depois gentilmente removendo o meio após poucas horas. 0 meio pode então ser substituído com meio de Kubota livre de soro fresco). Aspectos relacionados ao uso de meio de Kubota em criopreservação são revelados em PCT/US2011/035498, incorporado por referência nesse relatório descritivo.

[060] Em geral, todos os tampões de criopreservação usam um crioconservante como, por exemplo, DMSO. Crioconservantes naturais incluem açúcar (por exemplo, glicose) ou glicerol; esses são crioconservantes de ocorrência natural em várias espécies animais. Embora glicerol possa ser usado, ele é bem viscoso. No passado, os pesquisadores verificaram que DMSO possui uma tendência a ser mais solúvel e mais fácil de usar. Alguns tampões de criopreservação adicionam uma proteína anticongelante derivada de animais que são encontrados nos climas árticos. Essas proteínas foram caracterizadas e

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 36/80

27/63 clonadas, o que permite sua disponibilidade comercialmente.

[061] Muitos tampões crioconservantes usam um antioxidante. Exemplos não limitantes incluem selênio, vitamina E e vitamina C.

[062] Metodologias de criopreservação de congelamento lento e rápido são conhecidas na técnica. Para criopreservação rápida, um método típico é adicionar as células ao tampão crioconservante, embalar a ampola ou recipiente em algodão, e colocá-lo em um congelador a -80°C. As viabilidades das células não são tão boas (por exemplo, em torno de 60-70%) como com o congelamento lento, mas, para algumas finalidades, esse método mais bruto é aceitável. Para congelamento ótimo, para obter viabilidades celulares no descongelamento acima de 80-90%, devem ser usados métodos de congelamento lento. Há várias formas de câmaras de congelamento computadorizadas que reduzirão a temperatura um grau de cada vez até que ela alcance -80°C; elas frequentemente incluem uma estratégia computadorizada de manter as células por um tempo mais longo em uma temperatura na qual o gelo começa a se formar para minimizar o dano por cristais de gelo às células.

[063] Quando é feita a criopreservação de células-tronco, deve haver níveis elevados de lipideos no tampão. Os Requerentes conseguiram isso usando meio de Kubota que é repleto com ácidos graxos livres complexados com albumina purificada. Outro meio, Knockout Serum Replacement Medium de GIBCO, similarmente usa um lote de lipideos, e é reconhecidamente empregado para a criopreservação de células ES e células iPS.

[064] Os Requerentes ainda descobriram que o uso de

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 37/80

28/63 níveis maiores (níveis próximos daqueles in vivo) de albumina humana recombinante altamente purificada durante criopreservação gerou resultados inesperadamente superiores.

[065] Aspectos da presente revelação se relacionam a um método para criopreservação de células-tronco/progenitoras da árvore biliar humana (hBTSCs), que compreende a coleta de células-tronco/progenitoras da árvore biliar humana; adição de uma solução de criopreservação às células, em que a solução de criopreservação compreende (a) um meio basal que contém lipideos, (b) hialuronanos (HA), (c) um crioprotetor, (d) um antioxidante, e (e) um fator de substituição de soro, opcionalmente albumina; e (iii) resfriamento das células desde uma temperatura inicial até uma temperatura final na qual as células são congeladas.

[066] Em algumas modalidades, o hialuronano está em uma concentração entre cerca de 0,05% e 0,15%, opcionalmente em uma concentração de cerca de 0,1%.

[067] Em algumas modalidades, o crioprotetor compreende um ou mais de açúcar, glicerol e DMSO. Em algumas modalidades, o crioprotetor está em uma concentração entre cerca de 1% e 20%, opcionalmente em uma concentração de cerca de 10%.

[068] Em algumas modalidades, o antioxidante compreende um ou mais de selênio, Vitamina E, Vitamina C e glutationa reduzida.

[069] Em algumas modalidades, a albumina é albumina purificada e/ou albumina humana, opcionalmente albumina humana derivada do plasma ou albumina humana recombinante. Em algumas modalidades, a albumina está em uma concentração entre cerca de 1 a 5%, opcionalmente em uma concentração de

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 38/80

29/63 cerca de 3%, que mimetiza a concentração conhecida de albumina no soro (3-5%).

[070] Em algumas modalidades, a solução de criopreservação compreende um ou mais tampões disponíveis comercialmente ou de algum outro modo revelados que podem compreender um ou mais dos componentes (a) até (e). Exemplos não limitantes incluem meio de Kubota, Cryostor, RPMI-1640, DME/F12, e GIBCO's Konckout Serum Replacement.

[071] Em algumas modalidades, a etapa (iii) é alcançada usando congelamento lento programável. Em modalidades adicionais, a etapa (iii) compreende a redução da temperatura inicial em uma taxa de cerca de 1°C por minuto até que uma temperatura final seja alcançada. Em algumas modalidades, a etapa (iii) compreende:

(a) resfriamento de células desde uma temperatura inicial até uma temperatura final de cerca de -80°C usando dióxido de carbono sólido, ou (b) resfriamento de células desde uma temperatura inicial até uma temperatura final de cerca de -196°C usando nitrogênio líquido. É observado que etapa (iii) pode ser alcançada, em certas modalidades, usando os métodos de congelamento rápido revelados nesse relatório descritivo.

[072] Aspectos adicionais se relacionam a um método de descongelamento das células-tronco/progenitoras criopreservadas da árvore biliar humana (hBTSCs) reveladas nesse relatório descritivo. Exemplos não limitantes de descongelamento adequado, por exemplo, (i) descongelamento de células criopreservadas de acordo com o método revelado nesse relatório descritivo, (ii) adição de uma primeira solução-tampão; (iii) separação das células do meio de

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 39/80

30/63 criopreservação e da primeira solução-tampão; e (iv) ressuspensão das células em uma segunda solução-tampão.

[073] Em algumas modalidades a primeira e/ou segunda solução-tampão compreende soro ou um meio de substituição de soro. Em algumas modalidades, o soro é soro bovino fetal. Em algumas modalidades, o meio de substituição de soro pode ser um ou mais de Knockout Serum Replacement Medium de GIBCO e meio de Kubota, opcionalmente suplementado com albumina, que, por sua vez, opcionalmente é albumina humana derivada do soro. Em algumas modalidades, o soro está em uma concentração entre cerca de 2% até 20%, opcionalmente entre cerca de 10% até 20%, cerca de 10% ou cerca de 20%. É observado que esse método de descongelamento com muito soro pode ser vantajoso para minimizar a formação de cristal de gelo, em que um tampão não isotônico é usado por causa da necessidade de teor elevado de lipídeos nesse processo. Em algumas modalidades, o soro está em uma concentração entre cerca de 2% até 5%. É observado que esse método de descongelamento com pouco soro pode ser usado quando um tampão isotônico é usado, porque não é necessário um teor elevado de lipídeos. Em algumas modalidades, o meio de substituição de soro compreende albumina em uma concentração entre cerca de 1% até 5%.

[074] Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda solução-tampão compreende tampão de descongelamento. É observado gue alguns tampões de descongelamento disponíveis comercialmente compreendem soro ou substituto de soro. Também é observado que algumas modalidades podem incluir descongelamento por outros meios que não aqueles prescritos nesse relatório descritivo acima.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 40/80

31/63

[075] É ainda observado que existem várias formas para separar células do sobrenadante, por exemplo, meio de cultura, solução-tampão e/ou solução de criopreservação. Exemplos não limitantes incluem centrifugação das células; filtração das células através de uma peneira ou filtro; e filtração do tipo prensa francesa.

[076] Aspectos adicionais se relacionam a um método de cultivo de células-tronco/progenitoras descongeladas criopreservadas da árvore biliar humana que compreende o plaqueamento das células congeladas de acordo com o método revelado nesse relatório descritivo; cultivo das células em uma incubadora; remoção da solução-tampão; e substituição da solução-tampão com um meio de cultura projetado para o crescimento e/ou diferenciação de célulastronco/progenitoras da árvore biliar humana.

[077] Em algumas modalidades, as células são incubadas na incubadora por entre cerca de 6 a 7 horas.

[078] Em algumas modalidades, o meio de cultura projetado para o crescimento e/ou diferenciação de célulastronco/progenitoras da árvore biliar humana compreende meio de Kubota e/ou um meio definido hormonalmente (HDM) para a diferenciação de células (por exemplo, para restrição de linhagem em hepatócitos, e depois HDM-H).

[079] Aspectos adicionais estão relacionados a uma composição que compreende diversas célulastronco/progenitoras criopreservadas da árvore biliar humana de acordo com os métodos revelados nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, essas células podem ser descongeladas ou congeladas.

Exemplos

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 41/80

32/63

[080] Os exemplos seguintes são não limitantes e ilustrativos de procedimentos que podem ser usados em vários casos na prática da revelação. Adicionalmente, todas as referências reveladas nesse relatório descritivo abaixo são incorporadas por referência em sua totalidade.

Exemplo 1 — Estudos de criopreservação

I. Materiais e métodos

Aquisição de tecido humano.

[081] Para experimentos in vitro, árvore biliar extrahepática humana, que compreende dueto hepático comum, dueto biliar, dueto cistico, vesícula biliar e ampola hepatopancreática, foi obtida de doadores de órgãos do Departamento Paride Stefanini do General Surgery and Organ Transplantation, Sapienza University of Rome, Roma, Itália. Autorização informada para o uso de tecidos para fins de pesquisa foi obtida do nosso programa de transplante. Todas as amostras eram derivadas de adultos entre as idades de 19 e 73 anos. Para experimentos in vivo, foram utilizadas hBTSCs isoladas de fígados fetais. Fetos humanos (idade gestacional de 16-22 semanas) foram obtidos por término eletivo da gravidez do Department of Gynecology (Sapienza, University of Rome, Itália). Autorização informada foi obtida da mãe antes do aborto. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local do Sapienza University Hospital. Os protocolos receberam a aprovação de nosso Conselho de Revisão Institucional, e o processamento obedeceu às Boas Práticas de Fabricação (cGMP). O protocolo de pesquisa foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Umberto I University Hospital, Roma.

Processamento de tecido.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 42/80

33/63

[082] Amostras de tecido foram processadas como descrito previamente (1, 5, 6, 28-30). Resumidamente, os tecidos foram digeridos em Serum-Free Dendritic Cell Medium GMP (CellGro # 20801-0500) suplementado com 0,1% Octalbin 20% (Octapharma # 5400454), 1 nM de selênio, antibióticos, 300 U/ml de Colagenase NB 1 GMP (Serva #17452.01), 100 U/ml de Pulmozyme (Roche #18450.02), a 37°C com agitação frequente por 30-45 min. As suspensões foram filtradas através de um filtro de trama metálica de 800 microns (aço inoxidável inox IDEALE ACLRI9) e centrifugadas a 270 g por 10 min antes da ressuspensão. A seguir, as suspensões de células foram passadas consecutivamente através de um filtro de trama de 100 e 30 microns (μ) ; a seguir, foi feita a contagem de células por East-Read 102 (BiosigmaSrl, Venice, Itália) e medição da viabilidade celular pelo ensaio de Azul Tripano (expressa como % de células viáveis em relação às células totais). A viabilidade celular (exclusão de Azul Tripano) foi consistentemente maior do que 95%.

Procedimentos de classificação de EpCAM.

[083] As células foram classificadas quanto à expressão de molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM) por utilização de partículas magnéticas como indicado pelo fabricante (MiltenyiBiotec Inc., Alemanha). Resumidamente, as células EpCAM+ foram marcadas magneticamente com MicroBeads de EpCAM (MiltenyiBiotec Inc., N° de Catálogo 130-061-101). A seguir, a suspensão de células foi carregada em uma Coluna de LS MACS (Miltenyi Biotec Inc., N° de Catálogo 130-042-401) que foi colocada no campo magnético de um Separador MACS. As células EpCAM+ foram suspensas em meio basal em uma concentração de 300.000 células por ml, e usadas

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 43/80

34/63 como a suspensão de células final.

Isolamento de células em condições de GMP e testagem de esterilidade.

[084] Para produzir hBTSCs em condições de cGMP para aplicação clínica futura, as vesículas biliares foram processadas seguindo The Rules Governing Medicinal Products in the European Union e as diretrizes européias de boas práticas de fabricação para produtos medicinais para uso humano (EudraLex — Volume 4 Good Manufacturing Practice Guidelines).

Meios e soluções .

[085] Todos os meios foram filtrados de forma estéril (filtro de 0,22 gm) e mantidos no escuro a 4°C antes do uso. RPMI-1640, o meio basal usado para todas as culturas de células, e soro bovino fetal (FBS) foram obtidos de GIBCO/Invitrogen (Carlsbad, CA) . Todos os reagentes foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO), salvo especificação em contrário. Fatores de crescimento, exceto aqueles observados, foram adquiridos de R&D Systems (Minneapolis, MN) .

[086] Meio de Kubota (KM) é um meio livre de soro desenvolvido para sobrevida e expansão de célulastronco/progenitoras endodérmicas 11 e subsequentemente foi demonstrado ser bem-sucedido com células-tronco hepáticas humanas ²⁸<²⁹, células-tronco da árvore biliar humana L³'⁴, Células-tronco/progenitoras pancreáticas humanas e célulastronco hepáticas l² de roedor. Ele consiste em qualquer meio basal (aqui sendo RPMI 1640) sem cobre, cálcio reduzido (0,3 mM) , 10~⁹ M de Selênio, 4,5 mM de Nicotinamida, 0,1 nM de heptahidrato de sulfato de zinco, 10~⁸ M de hidrocortisona

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 44/80

35/63 (ou dexametasona) , 5 pg/ml de transferrina/Fe, 5 pg/ml de insulina, 10 pg/ml de lipoproteina de alta densidade, albumina sérica humana (ou bovina) 0,1% (HSA ou BSA), e uma mistura de ácidos graxos livres purificados que são adicionados ligados à HSA purificada. O protocolo detalhado de sua preparação foi relatado primeiramente por Kubota e Reid ³¹ e subsequentemente resumido em várias revisões í⁸. Ele agora está disponível comercialmente por meio de PhoenixSongs Biologicals (Branford, CT) .

[087] Para estudos de diferenciação, meio de Kubota livre de soro foi suplementado com cálcio (concentração final de 0,6 mM) , cobre (10~¹² M) e 20 ng/ml de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) e referido como meio de Kubota modificado (MKM). Foram preparados três HDMs diferentes para induzir diferenciação seletiva de hBTSCs:

HDM para diferenciação de hepatócito (HM): foi preparado suplementando MKM com 7 pg/L de glucagon, 2 g/L de galactose, 1 nM de triiodotiroxina 3 (T3), 10 ng/ml de Oncostatina M (OSM); 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico (EGF), 20 ng/ml de fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e 1 μΜ de dexametasona ⁴'⁶.

- HDM para diferenciação de colangiócito (CM) : MKM suplementado com 20 ng/ml de fator de crescimento de célula endotelial vascular (VEGF) 165 e 10 ng/ml de HGF ⁴'⁶.

- HDM para diferenciação de célula da ilhota pancreática (PM): MKM sem hidrocortisona, suplementado com B27 2%, 0,1 mM de ácido ascórbico, 0,25 μΜ de ciclopamina, 1 μΜ de ácido retinóico; bFGF foi adicionado pelos primeiros 4 dias e depois substituído com 50 ng/ml de exendina-4 e 20 ng/ml de HGF ⁴'⁵.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 45/80

36/63

Métodos e tampões para criopreservação

[088] As células foram destacadas dos vários substratos plásticos para serem coletadas e criopreservadas. Culturas de células destacadas foram centrifugadas a 270 g por 10 minutos, e 1 ml da solução de criopreservação foi adicionado aos péletes de células. Finalmente, os tampões que contêm as células foram transferidos em frascos Nunc (Unimed # 6302598). Esses foram colocados em Nalgene Cryo 1°C Freezing Container (Nalgene, N° de Catálogo 5100-0001). O método de criopreservação usado foi por redução da temperatura a 1°C por minuto até -80°C; após 24 horas, as células foram colocadas em nitrogênio liquido a -196°C.

[089] Diferentes tampões de criopreservação candidatos foram testados. Eles foram preparados no dia do uso e na quantidade de 10 ml cada. Os tampões são derivados daqueles estabelecidos por Turner, e cols. 11. Todos consistem em meio de Kubota, um meio livre de soro desenvolvido para célulastronco/progenitoras endodérmicas e suplementado com DMSO 10%; além disso, KM contém albumina purificada à qual está ligada uma mistura de ácidos graxos livres purificados. Em alguns dos tampões, níveis adicionais, maiores, de albumina foram adicionados. A albumina é preparada a partir de soluções de albumina humana recombinante (Octalbin 20%; Octapharma # 5400454). Dessa forma, a solução de 15% é 15% da preparação de Octalbin 20% ou uma percentagem final de 3%; o 1,5% é, portanto, 0,3%. As distinções entre os tampões são as seguintes:

- Soil: albumina humana recombinante (15%), HA (0,1%)

- Sol2A: HA (0,1%)

- Sol2B: HA (0,05%),

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 46/80

37/63

- Sol3: albumina humana recombinante (15%),

- CTRL: albumina humana recombinante (1,5%),

HA foi preparada usando 200 mg de hialuronato de sódio suspenso em 30 ml de KM.

Descongelamento das células .

[090] As células congeladas no Nunc (Unimed # 6302598) foram descongeladas e 1 ml de meio de cultura com Albumina Derivada do Soro Humano 20% foi adicionado lentamente (gota a gota). A seguir, o conteúdo foi transferido em um tubo de Falcon de 15 ml; o volume foi levado lentamente até 5 ml com KM, e depois submetido à centrifugação a 270 g por 10 minutos 1. Após centrifugação. o sobrenadante foi removido, eliminando o DMSO que foi usado para a criopreservação. O pélete de células foi ressuspenso até o volume exigido para plaqueamento com KM suplementado com soro 10% ⁴. Estudos analíticos incluíram aqueles que avaliam a viabilidade celular de células descongeladas que foram congeladas com as diferentes soluções de criopreservação, e a expressão gênica, por meio do uso de RT-qPCR, tanto de moléculas de adesão (ITGB1, ITGB4, CD44, CDH1), que são marcadores de células-tronco pluripotentes, quanto de marcadores de células-tronco endodérmicas (PDX1, OCT4, SOX17, SOX2, Nanog).

Culturas de células e expansão clonal.

[091] Células EpCAM+ não separadas e separadas (aproximadamente 3 X 10⁵) , obtidas de amostras de tecido biliar, foram semeadas em placas de cultura de plástico de 3 cm de diâmetro e mantidas de um dia para o outro (aproximadamente 12 horas) em KM com FBS 10%. A seguir, as culturas de células foram mantidas em KM livre de soro e

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 47/80

38/63 observadas por pelo menos 2 meses. Para testagem da expansão clonal de hBTSCs, uma única suspensão de células foi obtida, e as células foram plaqueadas em uma placa de cultura de plástico em uma densidade de semeadura clonal (500/cm²) 33 em KM, condições sob as quais elas se autorreplicam aproximadamente a cada 36-40 horas indefinidamente (especialmente se em condições de oxigênio reduzido (2%)). Hepatoblastos só duram cerca de 5-7 dias sob essas condições (eles exigem fatores adicionais para sobrevida e expansão por um prazo mais longo). Células epiteliais maduras do fígado, árvore biliar e pâncreas não sobrevivem além de uma semana em KM livre de soro.

Viabilidade celular.

[092] A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de exclusão de Azul Tripano (Sigma #302 643-25G). As células que coram azul estavam mortas; as células viáveis não coravam. Esse corante foi usado a 1:1 v/v com a solução de células. A contagem de células foi realizada por meio do uso de EAST-READ 102 (Biosigma # BSV100). A viabilidade celular foi calculada imediatamente após o descongelamento das células.

Senescência.

[093] A senescência das células descongeladas foi determinada pelo teste de X-Gal (Sigma # CS0030) ³⁴ . Usamos uma densidade de células de 2,6 x 10⁴ células/cm², e as células foram desenvolvidas por três dias antes da testagem. As células criopreservadas em Soil e Sol3, aquelas que demonstraram as maiores viabilidades no descongelamento, foram adicionalmente analisadas com o teste de X-Gal. Os resultados foram comparados com controles: células que não

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 48/80

39/63 foram criopreservadas. Os controles eram formados por células que foram cultivadas, destacadas e depois plaqueadas para o ensaio para imitar o processo que gera células recém isoladas.

Duplicação da população.

[094] A taxa de proliferação foi analisada na mesma população de hBTSCs, semeadas em 6 placas multipoços na densidade de 1 x 10⁴ célula/cm² e cultivadas por 7 dias. As contagens de células foram realizadas sob as seguintes condições de cultura:

- hBTSCs criopreservadas em Soil

- hBTSCs criopreservadas em Sol3

- hBTSCs recém isoladas (não criopreservadas)

[095] O meio foi trocado a cada três dias, usando KM livre de soro. A média do número de células foi calculado em três amostras experimentais para cada condição, e a densidade de células foi expressa como a média de células/cm² ± desviopadrão (SD). As células foram destacadas dos suportes e foram contadas pelo ensaio de Azul Tripano. Para esses experimentos usamos somente células viáveis.

[096] O PDT foi calculado na fase de crescimento exponencial pela seguinte equação (l)³³:

(24) PDT= logio x ΔΤ/logio (N₇d) logio (Nid)

[097] N_7d é o número de células no dia 7, e Nid é o número de células no dia 1.

[098] Para determinar a taxa de PD, hBTSCs foram inicialmente semeadas na densidade de 1 x 10⁴ célula/cm² em meio de cultura. Foram usadas três amostras para cada condição. A seguinte equação (2) foi aplicada:

(2) PD= logio (N) — logio (N_s) /logio (²)

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 49/80

40/63

[099] N é o número de células coletadas e N_s é o número inicial de células plaqueadas.

Contagem de colônias

[100] As colônias de hBTSC começaram a aparecer entre 1 e 2 semanas após plaqueamento e eram facilmente identificadas por inspeção a lOx com a microscópio óptico. Qualquer tamanho de colônia foi contado como uma, sejam elas as grandes a > 3.000 células ou as pequenas a < 200 células. Cada poço da lâmina da câmara de 8 poços foi avaliado usando ampliação de lOx para colônias e contado após 2-3 semanas de cultura. Observações do número, tamanho e morfologia das colônias foram anotadas. Considerando que as maiores viabilidades no descongelamento foram dadas por células criopreservadas em tampões de Soil e Sol3, essas células foram submetidas a ensaios adicionais para avaliar suas respostas ao congelamento 11.

Análise por reação em cadeia de polimerase quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR).

[101] Extrações de RNA foram realizadas em tecidos de fígado de camundongo ou de culturas de hBTSCs. RNA total de culturas de células derivadas da árvore biliar intrahepática e extra-hepática foi extraído pelos procedimentos de Chomczynski e Sacchil ³⁶. Usamos os genes de GAPDH e βACTINA como genes de referência para dados in vitro e in vivo, respectivamente.

[102] A qualidade e quantidade do RNA foram avaliadas com o Experion Automated Electrophoresis System RNA equipado com o RNA StSens Analysis Chip (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) como descrito previamente. A expressão dos genes foi realizada por transcrição reversa e

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 50/80

41/63 amplificação por qPCR realizada em um tubo fechado (OneStep RT-qPCR por Qiagen, Hamburg, Alemanha) em amostras de RNA total extraído de células e tecidos. Esses genes foram coamplifiçados com o gene de GAPDH produzido internamente usado como uma referência. A expressão gênica foi medida pela quantificação de amplicons com microeletroforese capilar on-chip realizada com o Sistema Experion (Bio-Rad, UK) . A expressão do gene de interesse foi calculada pela proporção das concentrações do gene de interesse e do gene de GAPDH de referência in vitro e de β-actina in vivo (relatadas pelo instrumento em nmol/1).

[103] Os seguintes genes de interesse (GOI) foram amplificados usando os pares de iniciadores relatados para cada um deles. A proporção de concentrações de GOI e dos genes de referência, especificamente, GAPDH for CDH1, CD44, ITGB1/4, SOX2/17, PDX1, EpCAM, NANOG, OCT, CYP3A4, TRANSFERRINA, SR, ASBT, CFTR, INS, GLUCAGON e beta-actina para albumina humana e muridea, foi presumida como sendo a expressão relativa de GOT ϊ nxciadoiés {5

EH Cadérfiiii a íixaluroriioc

3- £4:

.................. ................í li. Je

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 51/80

42/63

S®Í2	W .SvTWíS	< ' , <0' ( 1 x <; s >
	!	> ' \ \ . \ ; * v l s i 3 *
PDX1	'NM JOOSOv	\ \ v < 4 v
TICC Al í ü( )C A1A AlTl’CA
EpCAM	NM Μ·23Μ-ν	f’Ç CG GC'i(;G'iG'-Gl'GA
2 < : i i : ; : 1 V l i Ϊ < A '. j í Si í l ·'·. : f 3
N/mog	NM..OOS6M	AG \ ÍN( CIC// ACGGAG¥.'T
' A· Η'CS ’ iÍ. '' - i < G í <:>5/p
OCI'4	AM..OÕ27ÍH	'('LU . M M Gi A A ;
CAACC \CA(' ÍCGÍMCCICA
CYF3A4		AAt;TCG( A T(· GàaG.Í T. V.’At A
A A GG A Q AG A \AC TG C TCGTG
	NM	31 IC( IA<X s h;A fíMCM·: -As
GAu v'i C' * M !<h C
(W	NNAUWMíÇ	; · C \ \ K G>À3 ν iú O' 2 s í Ai v
? s( fí '.(Λίυ-ΪΙ'Χ ΐΧν'μχ G;
ASBT	NM	TG ÍM Í’TGCC1 K CICTGTCAG
GGCAGC A UTT ΑΊ A A JUAGC AC
C.FTR	\M	AÂA.AGGCCAGCGTTGTCTCC
TGAAGCCAGCTCTCTATCCCA
INS	NM tít>O2i)7 ΝΜ ϋΟ1Ηϋ5«7	GCAGi'Cn'TG'j GG AACC A AC AC
C.( CCGC.M At FAGG1AGAGA
' ϊ i ‘ \	\ \ < ;	Gaí. G‘iC«<'u;'r X»
' \G-P !'» ' \ V'.fi N r- ' '

Medição da secreção de albumina em hBTSCs

[104] As hBTSCs passaram por um período de autorreplicação em meio de Kubota livre de soro (KM) após plaqueamento em discos de cultura de plástico. As células foram semeadas na densidade de 3,8 x 10⁵ células/cm² em KM. O meio foi trocado a cada 3 dias. Após 1 semana de cultivo em KM, as culturas foram submetidas ao KM (controles) ou a um HDM customizado para hepatócitos. O experimento de secreção de albumina foi realizado após mais 2 semanas de cultivo. Por todo o periodo do ensaio, as células não foram passadas.

[105] Meio de cultura de células coletado ao longo de 24 horas foi analisado em triplicata pelo kit de ELISA especifico para albumina humana (Albumin Human ELISA Kit,

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 52/80

43/63

Abeam, Cambridge, UK, N° de Catálogo ab 108788) . Meio foi coletado e armazenado a -20°C. Os valores são expressos como microgramas por milhão de células por 28 mililitros de meio de cultura. A avaliação da secreção de albumina humana no meio do sobrenadante também foi realizada em células HepG2 adquiridas comercialmente de Lonza (Basel, Suíça), uma linhagem de célula de carcinoma hepatocelular humano bem diferenciada, utilizada como um controle positivo.

Medição da secreção de peptideo-C em hBTSCs

[106] As hBTSCs passaram por um período de autorreplicação em KM livre de soro após plaqueamento em discos de cultura de plástico. As células foram semeadas na densidade de 5,2 χ 10⁵ célula/cm² em KM. O meio foi trocado a cada 3 dias. Após 1 semana de cultivo em KM, as culturas foram submetidas ao KM (controles) ou a um HDM customizado para diferenciação das células-tronco em ilhotas pancreáticas. O experimento de ataque de glicose foi realizado após mais 2 semanas de cultivo. Por todo o período do ensaio, as células não foram passadas.

[107] As células foram lavadas três vezes com Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS, GIBCO, N° de Catálogo 14190144) . A seguir, as células foram incubadas por 2 horas com meio Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) com 5,5 mM de glicose e antibióticos; CMRL é um meio livre de proteína, quimicamente definido, com níveis maiores de nucleosideos e vitaminas e reconhecidamente útil para células humanas e de primatas. O meio de incubação foi coletado e armazenado a -20°C. As células foram novamente gentilmente lavadas três vezes com DBPS, e depois incubadas por 2 horas em CMRL livre de glicose suplementado com 28 mM

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 53/80

44/63 de glicose e antibióticos. Novamente, meio de cada poço foi coletado e armazenado a -20°C. As células foram contadas usando ensaios de Azul Tripano. Amostras de culturas a 5,5 mM versus 28 mM de glicose foram usadas para ensaios de síntese de peptídeo-C. 0 teor de peptídeo-C humano no meio foi medido por um kit de ELISA (R&D, Ref DICPOO) e normalizado para o número de células de cada amostra. A quantidade de peptídeo-C gerada em resposta ao ataque com nível alto de glicose foi dividida pela quantidade gerada pelo ataque com nível baixo de glicose para gerar o índice da secreção média de peptídeo-C. 0 índice de estimulação da secreção de peptídeo-C é calculado como a proporção entre peptídeo-C secretado no meio sob concentração elevada de glicose e peptídeo-C secretado sob concentração basal (baixa) de glicose; a concentração de peptídeo-C no meio foi quantificada por ELISA na mesma amostra de célula e durante um período de tempo fixo (2 h).

Transplante de células em camundongos SCID.

[108] Todos os experimentos animais foram realizados de acordo com a diretriz da EU 2010/63/EU para experimentos animais e com as diretrizes institucionais de Sapienza. O protocolo experimental animal foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética da Sapienza University of Rome e Umberto I University Hospital of Rome (Prot. 541). Camundongos SCID (T/SOPF NOD.CB17 PRKDC/J) (N = 4) eram animais machos, com 4 semanas de idade, e foram usados como os hospedeiros para transplante de células humanas. Os animais foram sedados com um fármaco anestésico (2,2,2-Tribromoetanol). A seguir, 2 x 10⁶ hBTSCs recém isoladas ou criopreservadas e descongeladas foram suspensas em 100 μΐ de solução salina e injetadas no

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 54/80

45/63 fígado por meio do baço. Controles simulados foram infundidos apenas com 100 μΐ de solução salina. Todos os animais foram intimamente monitorados até a recuperação, e tiveram livre acesso à ração e água. Todos os protocolos animais obedeceram às nossas diretrizes institucionais. Não ocorreu nenhuma mortalidade. Em 30 dias após o transplante de células, os camundongos foram sacrificados e os fígados removidos para análises posteriores. Amostras de fígado foram colocadas em Reagente Trizol para análises gênicas ou em formalina 4% para análises patológicas e imunoistoquímicas. Amostras de sangue foram coletadas do coração, centrifugadas, e amostras de soro armazenadas a -20°C para quantificação de albumina humana por ELISA (ABCAM # adl08788).

Microscopia óptica (LM), imunoistoquimica (IHC) e imunofluorescência (IF)

[109] As amostras foram fixadas em formalina 10% tamponada por 2-4 horas, embebidas em parafina de baixa temperatura de fusão (55-57°C), e cortes de 3-4 gm foram corados com hematoxilina-eosina e vermelho Sirius /verde Fast, de acordo com protocolos-padrão. Para IHC, a atividade de peroxidase endógena foi bloqueada por incubação por 30 min em peróxido de hidrogênio metanólico (2,5%). Os antígenos foram recuperados, como indicado pelo vendedor, por aplicação de Proteinase K (Dako, código Sol3020) por 10 min em temperatura ambiente. Os cortes foram então incubados de um dia para o outro a 4 °C com anticorpos primários.

Anticorpos primários

Nome	Hospedeiro/ isótipo	Fonte	N° de Catálogo	Diluição	Aplicação
Albumina	IgG de coelho	Abeam	AB 108788	1: 100	ELISA

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 55/80

46/63

SOX9	IgG de coelho	Millipore	AB5809	1 : 100	IHC
Insulina	IgG de porquinhoda-índia	DAKO	IS002	1: 100	IHC e ELISA
CK19	IgGl de camundongo	DAKO	M0888	1: 100	IHC/IF
Antimitocôndrias humanas	IgGl de camundongo	Chemicon	MAB 1273	1: 200	IHC
SOX17	IgG de cabra	R&D	AF1924	1: 50	IHC/IF

[110] As amostras foram enxaguadas duas vezes com PBS por 5 min, incubadas por 2 0 min em temperatura ambiente com anticorpo secundário biotinilado (LSAB+ System-HRP, Dako, código K0690; Glostrup, Dinamarca) e depois com Estreptavidina-HRP (LSAB+ System-HRP, Dako, código K0690). Diaminobenzidina (Dako) foi usada como substrato, e os cortes foram contracorados com hematoxilina. Para imunofluorescência em cultura de células, as câmaras das lâminas foram fixadas em acetona por 10 min em temperatura ambiente e depois enxaguadas com PBS-Tween 20. A ligação não específica de proteína foi bloqueada por soro de cabra normal 5%. As células fixadas foram incubadas com anticorpos primários. A seguir, as células foram lavadas e incubadas por 1 h com anticorpos secundários isótipo-específicos marcados (AlexaFluor-546 anti-camundongo, Alexafluor-488 anti-camundongo, Alexafluor-488 anti-coelho, AlexaFluor-546 anti-cabra, Invitrogen, Life Technologies Ltd, Paisley, UK) e contracoradas com 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualização dos núcleos das células. Para todas as imunorreações, controles negativos (o anticorpo primário foi substituído com soro pré-imune) também foram incluídos. Os cortes/culturas foram examinados de forma codificada por

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 56/80

47/63

Leica Microsystems DM 4500 B Light and Fluorescence Microscopy (Weltzlar, Alemanha) equipado com uma câmara de video JenoptikProg Res CIO Plus Videocam (Jena, Alemanha). A coloração de IF também foi analisada por Microscopia Confocal (Leica TCS-SP2) . As observações de LM, IHC e IF foram processadas com um Sistema de Análise de Imagens (IAS — Delta Sistemi, Roma- Itália) e foram realizadas independentemente por dois patologistas de forma cega.

Controles positivos e negativos

ANTÍGENO	MÉTODOS	CONTROLE POSITIVO	CONTROLE NEGATIVO
Albumina	ELISA	Hepatócitos humanos maduros	hBTSCs em KM
Mitocôndrias humanas	IHC/IF	Fígado humano	Fígado de camundongo
Hep-Parl	IHC/IF	Fígado humano	Fígado de camundongo
Albumina humana	IHC/IF	Fígado humano	Fígado de camundongo

[111] Todas as contagens foram realizadas em seis campos não superpostos (ampliação x20) para cada lâmina; pelo menos 3 lâminas diferentes foram retiradas de cada amostra. Para coloração de IHC/IF, o número de células positivas foi contado de forma cega, aleatória, em seis campos não superpostos (ampliação x20) para cada lâmina/cultura, e os dados são expressos como % de células positivas.

Análise estatística

[112] Os dados foram expressos como média ± DP. Análises estatísticas foram realizadas pelo software estatístico SPSS (SPSS Inc. Chicago IL, EUA) . Diferenças entre grupos para parâmetros de distribuição não normal foram testadas por testes U de Mann—Whitney. A significância estatística foi definida em um valor-p < 0,05.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 57/80

48/63

II. Resultados

Viabilidade, senescência e formação de colônia por hBTSCs criopreservadas.

[113] As hBTSCs foram criopreservadas em uma solução de controle basal (DMSO 10%, albumina humana 1,5% em KM) por 412 semanas e, depois foram descongeladas e semeadas em uma densidade de 10.000 células/ml em placas de plástico. As Figuras 1 e 7 mostram a viabilidade e morfologia celulares de culturas de hBTSCs após 4 semanas de criopreservação na solução de controle basal. Após descongelamento, as células foram desenvolvidas por um período de 30 dias em meio de Kubota (KM) . As hBTSCs foram capazes de formar colônias de células que eram morfologicamente similares àquelas geradas por células recém isoladas (Figura 7). Testamos vários tampões de criopreservação. Todos eles eram compostos por KM livre de soro suplementado com sulfóxido de dimetila 10% (DMSO) e com distinções no conteúdo de concentrações diferentes de albumina humana e HA. O percentual de células viáveis foi avaliado após 4 semanas de criopreservação e imediatamente após descongelamento (N = 9). Células em Solução 1 (Soil: suplementada ainda com HA 0,1% + albumina humana recombinante 15%) tiveram uma viabilidade média de 72,78 ± 5,65%. Aquelas em Solução 3 (Sol3: suplementada ainda com albumina humana recombinante 15%) tiveram uma viabilidade média de 78,89 ± 6,51%. Soil e Sol3 geraram viabilidades após descongelamento que eram significantemente maiores (p < 0,001) do que aquelas nos outros tampões. As viabilidades médias em Solução 2A (Sol2A: suplementada com HA 0,1%) foram de 53,33 ± 13,23%; aquelas em Solução 2B (Sol2B: suplementada com 0,05% HA) foram de 50,56 ± 5,27%,

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 58/80

49/63 e aquelas na solução de controle (CTRL: suplementada com albumina humana recombinante 1,5%) foram de 50,00 ± 6,61%. Nenhuma diferença significante na viabilidade celular foi encontrada entre a Soil e a Sol3 (Figura IA).

[114] A seguir, os Requerentes avaliaram a senescência celular (X-Gal) em culturas obtidas de células criopreservadas ou recém isoladas dos mesmos doadores. O número de células X-Gal-negativas (não senescentes) excedeu 95% após criopreservação (Figura 1B). Nenhuma diferença foi observada entre Soil (com HA; 98,57 ± 0,36; N = 9) e Sol3 (sem HA; 96,72 ± 0,66; N = 9; p > 0,05), e entre células criopreservadas e recém isoladas (98,00 ± 0,53; N = 9; p > 0,05) . Células senescentes negativas foram acentuadamente menores em Sol2A (4,85 ± 0,80; N = 9; p < 0,0001) do que outras condições. A duplicação da população de células (PD) em culturas confirmou a manutenção ótima das propriedades funcionais in vitro das hBTSCs criopreservadas em Soil e Sol3. A PD, na verdade, foi significantemente maior em Soil (1,11 ± 0,01) e Sol3 (0,98 ± 0,01), quando comparada com aquelas que eram recém isoladas (0,81 ± 0,01) (N = 8; p < 0,01) (Figura 1C). O tempo de PD (PDT) foi significantemente menor em Soil (com HA) do que Sol3 (sem HA) (6,32 ± 0,02 vs. 7,14 ± 0,02 dias; N = 8; p < 0,001), e em Sol3, quando comparado com células recém isoladas (8,67 ± 0,03 dias) (N = 8; p < 0,0001) (Figura 1D).

[115] A formação de colônia é um marcador substituto da capacidade de semeadura e enxerto. O número de colônias, formadas por 200-3.000 células, foi dramaticamente aumentado em células criopreservadas em Soil (com HA, 31,56 ± 8,43, N = 18), quando comparado com aqueles em Sol3 (sem HA, 10,11

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 59/80

50/63 ± 3,85, N = 18; p < 0,000001) (Figura IE).

Expressão de marcadores de célula-tronco e moléculas de adesão em hBTSCs criopreservadas.

[116] Para avaliar se a criopreservação afeta o fenótipo da célula-tronco, foi avaliada a expressão de genes essenciais comumente expressos por células-tronco endodérmicas. Esses incluem genes de pluripotência (OCT4, NANOG, SOX2) e fatores de transcrição endodérmicos (SOX17, PDX1) . Esses foram avaliados antes e depois de 1 mês de criopreservação. Curiosamente, os genes de célula-tronco foram mais altamente expressos em hBTSCs criopreservadas em Soil e Sol3 do que em células recém isoladas [SOX2 (p < 0,05), PDX1 (p < 0,05), NANOG (p < 0,01), SOX17 (p < 0,05), e OCT4 (p < 0,01); N = 5] (Figura 2).

[117] Como mostrado por Turner e cols. ²⁰, o enxerto após transplante de células se correlaciona bem com o nível de expressão de moléculas de adesão. Portanto, os Requerentes analisaram por RT-qPCR a expressão gênica de diferentes genes que codificam moléculas de adesão, incluindo CD44 (o receptor de hialuronano), ITGB1 (integrina beta-1), ITGB4 (integrina beta-4) e CDH1 (caderina 1). Nenhuma diferença significante foi encontrada em células submetidas a diferentes tampões de criopreservação versus células recém isoladas na expressão de CD44 (Figura 2), enquanto a expressão de ITGB1 e CDH1 estava diminuída em células criopreservadas, comparadas com hBTSCs recém isoladas (ITGB1, p < 0,05; CDH1N = 5; p < 0,01) (Figura 6B e 6C) ; a expressão de ITGB4 aumentou em hBTSCs criopreservadas (p < 0,05) (Figura 2).

Multipotência é preservada com criopreservação.

[118] Os genes de multipotência são expressos em hBTSCs

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 60/80

51/63 sob condições de autorrenovação e depois desaparecem mediante diferenciação em direção a células maduras. Os Requerentes testaram culturas de hBTSCs após criopreservação em Soil (Figura 3A, 4A) , Sol3 (dados não mostrados) versus células recém isoladas (Figura 3B, 4B). Para as condições de diferenciação, os Requerentes usaram diferentes meios hormonalmente definidos (HDM) especificamente customizados para induzir a diferenciação de hBTSCs em hepatócitos (HM), colangiócitos (CM) ou ilhotas pancreáticas (PM) maduras. KM sem hidrocortisona foi usado como um controle, na medida em que esse meio é permissivo para expansão de células e é neutro para diferenciação em direção tanto ao fígado quanto ao pâncreas (glicocorticóides devem ser evitados para diferenciação pancreática). hBTSCs criopreservadas (Figura 3A), bem como células recém isoladas (Figura 3B), mostraram expressão diminuída dos genes de pluripotência (NANOG, OCT4, e SOX2) e genes de células-tronco endodérmica (EpCAM, PDX1, e SOX17) após duas semanas em cultura em HDMs customizadas para diferenciação das células-tronco em destinos hepatocíticos (HM), pancreáticos (PM) ou biliares (CM) (p < 0,05) . Quando hBTSCs (Soil e recém isoladas) foram transferidas de KM para HM por 2 semanas, foram observados aumentos significantes na expressão de genes específicos para hepatócito maduro, incluindo (por exemplo, Albumina (Alb) ; N = 5; p < 0,01 vs. KM; Transferrina (Transf); N = 5;

p < 0,05 vs. KM e Citocromo P450 3A4 (CYP3A4); N = 5; p < 0,01 vs. KM) (Figura 4) . Similarmente, quando hBTSCs (Soil e recém isoladas) foram transferidas em PM ou CM por 2 semanas, foram observados aumentos significantes de expressões gênicas ilhota pancreática-específicas (Insulina

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 61/80

52/63 (Ins), N = 5, p < 0,05; Glucagon N = 5, p < 0,01 PM vs. KM), e de expressões gênicas especificas para grandes colangiócitos (Receptor de Secretina (SR), N = 5, p < 0,01; regulador da condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR), N = 5, p < 0,01; transportador de ácido biliar apical sódio-dependente (ASBT), N = 5, p < 0,05 CM vs. KM) (Figura 4) . As hBTSCs em HDMs desenvolveram alterações características na morfologia e traços fenotípicos. Especificamente, após 15 dias em HM, foram observadas células com formato cubóide que expressam albumina (marcadores de hepatócito) (Figura 5A) (N = 5); após 15 dias em CM, agrupamentos de células que expressam Citoqueratina 19 (CK19) apareceram (Figura 5A) (N = 5); enquanto hBTSCs em PM produziram, após 14 dias, bolas densas de células agregadas que brotam das bordas das colônias e que contêm células que expressam insulina (Figura 5A) (N = 5). Nenhuma diferença significante foi observada entre Soil, Sol3 e células recém isoladas (N = 5).

[119] Os Requerentes então avaliaram em um nível funcional como as hBTSCs criopreservadas podem se diferenciar eficazmente in vitro em células hepatócito-like ou células da ilhota pancreática-like. hBTSCs criopreservadas cultivadas em HM adquiriram a capacidade de produzir e secretar albumina (N = 7; p < 0,01 em HM vs. KM), embora em uma extensão ligeiramente menor com relação à HepG2 (p < 0,05) (Figura 5B) . Quando cultivadas em PM, hBTSCs adquiriram secreção de insulina que era regulada por concentração de glicose (concentração baixa versus alta de glicose; N = 7; p < 0,01 vs. glicose baixa) (Figura 5C). Enxerto in vivo eficaz de hBTSCs criopreservadas.

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 62/80

53/63

[120] Para determinar se hBTSCs criopreservadas podem eficazmente se enxertar e proliferar nos fígados em camundongos imunocomprometidos, células foram transplantadas no baço de camundongos SCID. Os fígados foram então analisados 30 dias após o transplante de células por imunoistoquímica com um anticorpo para mitocôndrias humanas, como descrito previamente ⁵. Como mostrado na Figura 6A, hBTSCs criopreservadas (Soil) foram enxertadas no parênquima hepático com a mesma eficiência que células recém isoladas (N = 3; p > 0,05). Na verdade, a expressão de mitocôndrias humanas no parênquima hepático dos camundongos SCID indicou que 2,626 ± 1,530% e 3,722 ± 0,639 da massa de células parenquimatosas do hospedeiro compreendiam células humanas derivadas de hBTSCs recém isoladas ou criopreservadas, respectivamente (Figura 6A) . Para confirmar o enxerto e diferenciação eficazes de hBTSCs criopreservadas transplantadas nos fígados murídeos, medimos o mRNA de albumina humana no fígado e albumina humana (proteína) no soro. A expressão de albumina humana mRNA do fígado foi significantemente maior (N = 3; p < 0,01) em camundongos transplantados com hBTSCs criopreservadas (5,19 x 10~⁷ ± 3,06 x 10~⁷) do que camundongos transplantados com hBTSCs recém isoladas (1,90 x 10~¹⁰ ± 1,09 x 10~¹⁰) (Figura 6B) . Consequentemente, nos mesmos animais, os níveis de albumina sérica humana foram significantemente maiores (N = 3; p < 0,0001) em camundongos transplantados com hBTSCs criopreservadas (76,39 ± 17,04 ng/ml) do que camundongos transplantados com hBTSCs recém isoladas (24,13 ± 1,44 ng/ml) (Figura 6C).

III. Discussão

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 63/80

54/63

[121] Os Requerentes estabeleceram um protocolo de criopreservação bem-sucedido para hBTSCs composto por meio de Kubota livre de soro (KM) suplementado com DMSO (10%), HA (0,1%) e altas concentrações de albumina humana recombinante (15%) . Os achados cruciais que levam a essa conclusão são que: 1) hBTSCs podem sobreviver e ter uma viabilidade elevada no descongelamento (aproximadamente 80%) após 120 dias de criopreservação se submetidas a esse tampão de criopreservação; 2) a taxa de proliferação in vitro (tempos de duplicação da população) e a capacidade de formação de colônia foram aumentadas por suplementação de tampões de criopreservação com HA (0,1%); 3) hBTSCs criopreservadas em tampões que contêm altas concentrações de albumina ± HA, se diferenciaram eficientemente in vitro em destinos maduros (hepatócitos, colangiócitos ou células-β pancreáticas funcionais); 4) hBTSCs criopreservadas no tampão que contém

altas concentrações de	albumina +	HA	se enxertaram e
diferenciaram eficazmente in vivo	após	transplante em
camundongos SCID.
[122] Os Requerentes	observam	que	eles efetuaram

processos de isolamento e criopreservação/descongelamento de células sob condições de GMP; somente experimentos in vitro não foram estratégias de grau de GMP de criopreservação de células. Os Requerentes visam proteger os mecanismos de viabilidade celular e a capacidade proliferativa e se basearam no uso de tampões isotônicos, proteínas anticongelantes (de animais do Ártico), antioxidantes e reagentes de congelamento como, por exemplo, DMSO ou glicerol. Os métodos existentes funcionam bem para subpopulações de células hematopoiéticas, na medida em que

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 64/80

55/63 elas inerentemente possuem componentes da matriz extracelular que não possuem domínios de ligação à célula e, portanto, as células são capazes de flutuar. Dessa forma, sua adesão e outras funções matriz-dependentes estão intactas e não são afetadas de forma adversa por criopreservação. Em contraste, o isolamento de células de órgãos sólidos exige atividade enzimática que dissolve a matriz fazendo com que as células sejam dispersas em suspensões de células, o que torna essas células vulneráveis aos efeitos adversos da criopreservação em atividades dependentes da matriz ²⁰. Células hepáticas, incluindo hepatócitos, são representativas de células de órgãos sólidos e que demonstram as enormes dificuldades encontradas na criopreservação ¹⁴. Além disso, a criopreservação de células-tronco/progenitoras possui obstáculos adicionais em relação àqueles para células maduras, na medida em que muitos aditivos de tampões de criopreservação, por exemplo, soro, podem eliminar traços de células-tronco e, em paralelo, desencadear diferenciação ²⁰. Os Requerentes demonstraram previamente que esses obstáculos podem ser superados por utilização de um meio isotônico como, por exemplo, Cryostor (Crystor-10) ou um meio de célula-tronco livre de soro, inteiramente definido, KM suplementado com hialuronanos, um constituinte dominante da química da matriz de nichos de células-tronco ²¹. Nesse estudo, fomos capazes de aprimorar ainda mais as condições por adição de níveis elevados de albumina humana recombinante (concentração final: aproximadamente 3%). Os Requerentes avaliaram a manutenção, após criopreservação, de propriedades fenotipicas cruciais da célula como, por exemplo, viabilidade, semeadura, taxa de

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 65/80

56/63 proliferação e potencial de diferenciação L¹⁹. Primeiramente, os Requerentes observaram que a criopreservação em tampão livre de soro (Soil ou Sol3) contendo níveis elevados de albumina humana recombinante (aproximadamente 3%) resultou em uma viabilidade celular significantemente melhor, após descongelamento, quando comparado com células nos outros tampões testados. Portanto, a suplementação com altas concentrações de albumina humana (aproximadamente 3%, comparados com 0,3%) facilita a manutenção da viabilidade celular após descongelamento. Previamente, Terry e cols. ¹⁴ propuseram que a albumina sérica humana podería representar uma alternativa ao soro fetal presumindo que os níveis elevados de albumina contidos no soro é o determinante principal do efeito crioprotetor do soro; nossos resultados confirmaram o papel da albumina como um agente crioprotetor.

[123] Os Requerentes ainda demonstraram que a criopreservação em soluções que contêm alta concentração de albumina ± HA protege as hBTSCs da senescência celular. A senescência celular está correlacionada com o encurtamento do telômero durante divisões da célula, mas células-tronco se contrapõem à senescência por meio de atividade de telomerase elevada ²²'²3, _e isso foi demonstrado por Reid e se associa em células-tronco hepáticas ²²<²³· As taxas de proliferação in vitro foram analisadas por ensaios de duplicação da população nos quais demonstramos a preservação das capacidades de proliferação por hBTSCs criopreservadas com relação às células recém isoladas. Tanto a semeadura quanto a proliferação se correlacionavam com a capacidade de formação de colônia ²⁰. Os Requerentes testaram se as

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 66/80

57/63 propriedades de formação de colônia são influenciadas por qualquer um dos tampões de criopreservação. A expressão de algumas moléculas de adesão (por exemplo, ITGB4) foi aumentada e aquela de CD44 não foi afetada, enquanto outras foram reduzidas (ITGB1, CDH1). Além disso, as proliferações em células criopreservadas em Soil versus Sol3 foram similares, mas com aumentos dramáticos na formação de colônia naquelas em Soil que contém tanto os níveis elevados de albumina quanto também HA. É notável que todas as subpopulações de células-tronco e progenitores no fígado expressam CD44, o receptor para HA, e que a apoptose está aumentada em células que são incapazes de readquirir proteínas de adesão rapidamente após descongelamento ²⁰. HA representa o constituinte principal do nicho de célulastronco do fígado ²⁴. Turner e cols. ²⁰ observaram que o uso de suplementação com hialuronanos constitui uma opção bemsucedida para uma criopreservação ótima de célulastronco/progenitoras hepáticas humanas (hHpSC). Aqui, os Requerentes demonstraram um papel positivo de HA como um agente de precondicionamento que favorecería o enxerto de células após criopreservação. Na verdade, dados obtidos por RT-qPCR demonstraram que, em hBTSCs criopreservadas em Soil, a expressão de moléculas de adesão está parcialmente preservada, enquanto genes de pluripotência e células-tronco endodérmicas estão inteiramente preservados, comparada com a expressão em células recém isoladas. Esses dados são concordantes com os resultados prévios por Turner e cols.²⁰. Finalmente, e o mais importante, o potencial de diferenciação de hBTSCs não foi afetado e foi similar àquele de células recém isoladas quando criopreservadas em Soil ou 3 contendo

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 67/80

58/63 concentração elevada de albumina ± HA 1-4,25. ]g_a verdade, os Requerentes demonstraram in vitro, em meios customizados especificamente para induzir a diferenciação seletiva de hBTSCs em hepatócitos, colangiócitos ou células pancreáticas, que as capacidades de diferenciação também estão bem preservadas por nosso protocolo de criopreservação. Elas não são influenciadas por HA. Isso também foi demonstrado em um nível funcional por avaliação da capacidade de síntese/secreção albumina de células diferenciadas em direção a hepatócitos e pela produção de insulina, tanto em condições basais quanto após ataque de glicose, em células diferenciadas em direção a células pancreáticas.

[124] Finalmente, e o mais importante, os Requerentes demonstraram que hBTSCs criopreservadas em tampões que contêm albumina elevada + HA (Soil) e transplantadas em camundongos SCID exibiram uma eficiência de enxertia e diferenciação ainda melhor do que células recém isoladas. 0 percentual de fígados murídeos que abrigam células humanas e a síntese e secreção de albumina humana foram, na verdade, melhores para hBTSCs criopreservadas do que para hBTSCs recém isoladas (Soil vs. recém isoladas) . Esse resultado surpreendente está de acordo com observações in vitro nas quais HA melhor o enxerto da célula e com observações in vivo nas quais células revestidas com HA mostraram taxas maiores de enxerto de fígado, após transplante, do que células recém isoladas ²⁶.

[125] As hBTSCs são facilmente isoladas sob as condições de GMP de tecidos humanos de doadores de qualquer idade e já foram usadas para terapia celular de pacientes com cirrose

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 68/80

59/63 hepática avançada ²⁷. Considerando a disponibilidade extremamente ampla de tecidos da árvore biliar para seu isolamento e considerando suas características biológicas, hBTSCs possuem um enorme potencial aplicativo para a medicina regenerativa do fígado e pâncreas, incluindo diabetes. Nesse estudo, hBTSCs foram criopreservadas com sucesso sem perda de funções cruciais da célula; isso facilita o estabelecimento de um banco de células de hBTSCs que possam ser armazenadas e usadas rapidamente, oferecendo vantagens logísticas para terapias celulares de doenças hepáticas.

Referências

[126] 1. Cardinale, V. e cols. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology 54, 2.159-2.172 (2011).

[127] 2. Cardinale, V. e cols. The biliary tree - a reservoir of multipotent stem cells. Nature reviews. Gastroenterology & hepatology 9, 231-240 (2012) .

[128] 3. Carpino, G. e cols. Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages. Journal of anatomy 220, 186-199 (2012) .

[129] 4. Semeraro, R. e cols. The fetal liver as cell source for the regenerative medicine of liver and pâncreas. Annals of Translational Medicine 1, 13 (2013) .

[130] 5. Carpino, G. e cols. Evidence for multipotent endodermal stem/progenitor cell populations in human gallbladder. Journal of Hepatology 60, 1.194-1.202 (2014).

[131] 6. Riccio, M. e cols. The Fas/Fas ligand apoptosis

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 69/80

60/63 pathway underlies immunomodulatory properties of human biliary tree stem/progenitor cells. Journal of Hepatology 61, 1.097-1.105 (2014) .

[132] 7. Lanzoni, G. e cols. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pâncreas. Stem Cells 31, 2.047-2.060 (2013).

[133] 8. Cardinale, V. e cols. Transplantation of human fetal biliary tree stem/progenitor cells into two patients with advanced liver cirrhosis. BMC Gastroenterology 14, 204 (2014) .

[134] 9. Novicki, D.L., Irons, G.P., Strom, S.C., Jirtle, R. e Michalopoulos, G. Cryopreservation of isolated rat hepatocytes. In Vitro 18, 393-399 (1982).

[135] 10. Lozoya, O.A. e cols. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials 32, 7.389-7.402 (2011).

[136] 11. Dixit, V., Darvasi, R., Arthur, M., Lewin, K. e Gitnick, G. Cryopreserved microencapsulated hepatocytes -transplantation studies in Gunn rats. Transplantation 55, 616-622 (1993).

[137] 12. Guyomard, C., Rialland, L., Fremond, B., Chesne, C. e Guillouzo, A. Influence of alginate gel entrapment and cryopreservation on survival and xenobiotic metabolism capacity of rat hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology 141, 349-356 (1996).

[138] 13. Canaple, L. e cols. Maintenance of primary murine hepatocyte functions in multicomponent polymer capsules--in vitro cryopreservation studies. Journal of Hepatology 34, 11-18 (2001).

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 70/80

61/63

[139] 14. Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R.R. e Hughes, R.D. Cryopreservation of isolated human hepatocytes for transplantation: State of the art. Cryobiology 53, 149-159 (2006) .

[140] 15. Gomez-Lechon, M.J., Lopez, P. e Castell, J.V. Biochemical functionality and recovery of hepatocytes after deep freezing storage. In Vitro 20, 826-832 (1984) .

[141] 16. Rijntjes, P.J., Moshage, H.J., Van Gernert, P.J., De Waal, R. e Yap, S.H. Cryopreservation of adult human hepatocytes. The influence of deep freezing storage on the viability, cell seeding, survival, fine structures and albumin synthesis in primary cultures. Journal of Hepatology 3, 7-18 (1986).

[142] 17. Alexandre, E. e cols. Cryopreservation of adult human hepatocytes obtained from resected liver biopsies. Cryobiology 44, 103-113 (2002) .

[143] 18. Adams, R.M. e cols. Effective cryopreservation and long-term storage of primary human hepatocytes with recovery of viability, differentiation, and replicative potential. Cell Transplantation 4, 579-586 (1995).

[144] 19. Turner, R., Gerber, D. e Reid, L. The future of cell transplant therapies: a need for tissue grafting. Transplantation 90, 807-810 (2010) .

[145] 20. Turner, R.A., Mendel, G., Wauthier, E., Barbier, C. e Reid, L.M. Hyaluronan supplemented buffers preserve adhesion mechanisms facilitating cryopreservation of human hepatic stem/progenitor cells. Cell Transplantation 21, 2.257-2.266 (2012).

[146] 21. Wang, Z. , Hisatake, G. e Yang, L. Liverspecific deceased donor risk indices. Hepatology research:

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 71/80

62/63 the Official Journal of the Japan Society of Hepatology 44, 159-164 (2014).

[147] 22. Schmelzer, E. e Reid, L.M. Human telomerase activity, telomerase and telomeric template expression in hepatic stem cells and in livers from fetal and postnatal donos. European Journal of Gastroenterology & Hepatology 21, 1.191-1.198 (2009).

[148] 23. Cardinale, V. e cols. Multipotent stem cells in the biliary tree. Italian journal of Anatomy and Embryology = Archivio Italiano di Anatomia ed Embriologia 115, 85-90 (2010).

[149] 24. Wang, Y. e cols. Paracrine signals from mesenchymal cell populations govern the expansion and differentiation of human hepatic stem cells to adult liver fates. Hepatology 52, 1.443-1.454 (2010).

[150] 25. Wang, Y. e cols. Biliary tree stem cells, precursors to pancreatic committed progenitors: evidence for possible life-long pancreatic organogenesis. Stem Cells 31, 1.966-1.979 (2013).

[151] 26. Nevi, L. e cols. Hyaluronan coating improves liver engraftment of transplanted human biliary tree stem/progenitor cells. Stem Cell Research & Therapy 8, 68 (2017) .

[152] 27. Cardinale, V. e cols. Adult Human Biliary Tree Stem Cells Differentiate to beta-Pancreatic Islet Cells by Treatment with a Recombinant Human Pdxl Peptide. PloS One 10, e0134677 (2015).

[153] 28. Wauthier, E. e cols. Hepatic stem cells and hepatoblasts: identification, isolation, and ex vivo maintenance. Methods in Cell Biology 86, 137-225 (2008).

Petição 870190141376, de 30/12/2019, pág. 72/80

63/63

[154] 29. Schmelzer, E. e cols. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donos. The Journal of Experimental Medicine 204, 1.973-1.987 (2007).

[155] 30. Semeraro, R. e cols. Multipotent stem/progenitor cells in the human foetal biliary tree. Journal of Hepatology 57, 987-994 (2012).

[156] 31. Kubota, H. e Reid, L.M. Clonogenic hepatoblasts, common precursors for hepatocytic and biliary lineages, are lacking classical major histocompatibility complex class I antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 12.132-12.137 (2000) .

[157] 32. Harrill, J.A. e cols. Lineage-dependent effects of aryl hydrocarbon receptor agonists contribute to liver tumorigenesis. Hepatology 61, 548-560 (2015).

[158] 33. Kajstura, J. e cols. Evidence for human lung stem cells. The New England Journal of Medicine 364, 1.7951.806 (2011) .

[159] 34. Fedorovich, N.E. e cols. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials 30, 344-353 (2009).

[160] 35. Pisciotta, A. e cols. Human serum promotes osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro and in vivo. PloS One 7, e50542 (2012) .

[161] 36. Ribaudo, R., Gilman, M., Kingston, R.E., Chomczynski, P. e Sacchi, N. Preparation of RNA from tissues and cells. Current Protocols in Neuroscience / Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [e cols.] Anexo 1, Anexo II (2001) .

Claims (21)

1. Método para criopreservação de célulastronco/progenitoras da árvore biliar humana, caracterizado por compreender:

(i) coleta de células-tronco/progenitoras da árvore biliar humana;

(ii) adição de uma solução de criopreservação às células, em que a solução de criopreservação compreende (a) um meio basal que compreende lipideos, (b) hialuronanos (HA) em uma concentração entre cerca de 0,05% e 0,15%, (c) um crioprotetor, (d) um antioxidante, e (e) albumina em uma concentração entre cerca de 1 a 5%; e (iii) resfriamento das células de uma temperatura inicial até uma temperatura final na qual as células são congeladas.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hialuronano está em uma concentração de cerca de 0,1%.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor é selecionado de açúcar, glicerol e sulfóxido de dimetila (DMSO), opcionalmente em uma concentração entre cerca de 1% e 20%.

4. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o crioprotetor é DMSO em uma concentração de cerca de 10%.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antioxidante é selecionado de selênio, Vitamina E, Vitamina C e glutationa reduzida.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a albumina está em uma

Petição 870190098582, de 02/10/2019, pág. 17/23

2/5 concentração de cerca de 3%.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a albumina é albumina purificada.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a albumina é albumina humana, opcionalmente albumina humana derivada do plasma ou albumina humana recombinante.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de criopreservação compreende meio de Kubota, RPMI-1640, DME/F12 ou Knockout Serum Replacement Medium de GIBCO.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende a redução da temperatura inicial em uma taxa de cerca de 1°C por minuto até que uma temperatura final seja alcançada.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (iii) compreende:

(a) resfriamento das células da temperatura inicial até a temperatura final de cerca de -80 °C usando dióxido de carbono sólido, ou (b) resfriamento das células da temperatura inicial até a temperatura final de cerca de -196°C usando nitrogênio liquido.

12. Método de descongelamento de célulastronco/progenitoras criopreservadas da árvore biliar humana, caracterizado por compreender:

(i) descongelamento de células criopreservadas de acordo com o método conforme definido na reivindicação 1;

(ii) adição de uma primeira solução-tampão que

Petição 870190098582, de 02/10/2019, pág. 18/23

3/5 compreende soro ou meio de substituição de soro;

(iii) separação das células do meio de criopreservação e da primeira solução-tampão; e (iv) ressuspensão das células em uma segunda soluçãotampão que compreende soro ou meio de substituição de soro.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o soro é soro bovino fetal ou o meio de substituição de soro é Knockout Serum Replacement Medium de GIBCO ou meio de Kubota suplementado com albumina, opcionalmente albumina humana derivada do soro.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o soro está em uma concentração entre cerca de 2% até 20%, opcionalmente entre cerca de 10% e 20%, cerca de 10% ou cerca de 20%.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio de substituição de soro compreende albumina em uma concentração entre cerca de 1% até 5%, opcionalmente albumina humana derivada do soro.

16. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura e/ou solução-tampão compreendem um tampão de descongelamento • 17 . Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) compreende:

(a) centrifugação das células;

(b) filtração das células através de uma peneira ou filtro; ou (c) utilização de filtração do tipo prensa francesa.

18. Método de cultivo de células-tronco/progenitoras descongeladas criopreservadas da árvore biliar humana, caracterizado por compreender:

Petição 870190098582, de 02/10/2019, pág. 19/23

4/5 (i) plaqueamento de células descongeladas conforme definidas na reivindicação 12;

(ii) cultivo das células em uma incubadora;

(iii) remoção da solução-tampão; e (iv) substituição da solução-tampão com um meio de cultura projetado para o crescimento e/ou diferenciação de células-tronco/progenitoras da árvore biliar humana.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a etapa (ii) é realizada por entre cerca de 6 a 7 horas.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura projetado para o crescimento e/ou diferenciação de célulastronco/progenitoras da árvore biliar humana compreende meio de Kubota e/ou um meio definido hormonalmente (HDM) para a diferenciação de células (por exemplo, para restrição de linhagem em hepatócitos, e depois HDM-H).

21. Composição caracterizada por compreender diversas células-tronco/progenitoras criopreservadas da árvore biliar

humana produzidas pelo método conforme definido na reivindicação 1. 22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que as diversas células-

tronco/progenitoras criopreservadas da árvore biliar humana estão descongeladas.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que as diversas célulastronco/progenitoras criopreservadas da árvore biliar humana são descongeladas de acordo com o método conforme definido na reivindicação 12.

Petição 870190098582, de 02/10/2019, pág. 20/23

5/5

24. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que as diversas célulastronco/progenitoras criopreservadas da árvore biliar humana estão congeladas.