JP2887325B2 - デコリンによる細胞増殖の抑制 - Google Patents
デコリンによる細胞増殖の抑制Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、細胞生物学、特に細胞増殖の制御に関す
る。
る。
発明の背景 通常の状態では、細胞の増殖は厳しく制御された工程
であり、迅速な増殖は、胚の発達および組織の再生に必
要であるが、その一方増殖は、完成された組織において
は停止されなければならない。細胞増殖は、主として成
長因子によって制御されるようである。既知の成長因子
の大半は誘発性を有し、それには、表皮成長因子、血小
板由来の成長因子、様々なインターロイキンおよびコロ
ニー刺激因子が包含される。少数の細胞増殖の負に制御
する因子もまた知られている。形質転換成長因子βは、
いくつかの細胞タイプの増殖を阻止する多機能因子であ
るが、増殖も刺激し得る。他の増殖阻止物質には、様々
なインターフェロンが包含され、増殖阻止の役割はヘパ
リン、ヘパラン硫酸およびそれらの断片に起因してい
る。
であり、迅速な増殖は、胚の発達および組織の再生に必
要であるが、その一方増殖は、完成された組織において
は停止されなければならない。細胞増殖は、主として成
長因子によって制御されるようである。既知の成長因子
の大半は誘発性を有し、それには、表皮成長因子、血小
板由来の成長因子、様々なインターロイキンおよびコロ
ニー刺激因子が包含される。少数の細胞増殖の負に制御
する因子もまた知られている。形質転換成長因子βは、
いくつかの細胞タイプの増殖を阻止する多機能因子であ
るが、増殖も刺激し得る。他の増殖阻止物質には、様々
なインターフェロンが包含され、増殖阻止の役割はヘパ
リン、ヘパラン硫酸およびそれらの断片に起因してい
る。
増殖制御であまりよく知られていない機構は、細胞が
近接した位置関係にあることに関する。正常の細胞は互
いに接触すると、増殖を中止する。この現象は、通常、
接触による増殖阻止として知られており、正常な組織構
造の形成には明らかに重要である。
近接した位置関係にあることに関する。正常の細胞は互
いに接触すると、増殖を中止する。この現象は、通常、
接触による増殖阻止として知られており、正常な組織構
造の形成には明らかに重要である。
多数の重要な病理条件は、異常な細胞増殖が原因とな
っている。このような状態の最も主要なものは癌であ
る。増殖に関与する要素による他の疾病には、滑膜組織
の異常成長による慢性間接リウマチ、糸球体間質細胞が
増殖する糸球体腎炎、および異常に増殖する細胞が平滑
筋細胞である、動脈硬化症が含まれる。
っている。このような状態の最も主要なものは癌であ
る。増殖に関与する要素による他の疾病には、滑膜組織
の異常成長による慢性間接リウマチ、糸球体間質細胞が
増殖する糸球体腎炎、および異常に増殖する細胞が平滑
筋細胞である、動脈硬化症が含まれる。
上記の例から、細胞増殖を制御するための新しい方法
を開発する必要があることは明白である。本発明は、こ
の必要性について取り組むとともに、他の関連した利点
を提供する。
を開発する必要があることは明白である。本発明は、こ
の必要性について取り組むとともに、他の関連した利点
を提供する。
発明の要旨 本発明は、プロテオグリカンであるデコリン（PG−II
またはPG−40としても知られる）に関する。本発明は、
デコリンをコードする遺伝子によってトランスフェクト
され、この遺伝子を発現する細胞およびそれによって生
産される組換えデコリンを提供する。このようなトラン
スフェクトされた細胞培養物の培養後の（spent）培養
培地は、正常または異常細胞の増殖を抑制するのに使用
され得る。更に、精製されたデコリンは、細胞増殖を抑
制するのに使用され得る。
またはPG−40としても知られる）に関する。本発明は、
デコリンをコードする遺伝子によってトランスフェクト
され、この遺伝子を発現する細胞およびそれによって生
産される組換えデコリンを提供する。このようなトラン
スフェクトされた細胞培養物の培養後の（spent）培養
培地は、正常または異常細胞の増殖を抑制するのに使用
され得る。更に、精製されたデコリンは、細胞増殖を抑
制するのに使用され得る。
図面の簡単な説明 第１図は、増幅されていない、および増幅されたトラ
ンスフェクタント（transfectant）におけるデコリンの
発現を示す。
ンスフェクタント（transfectant）におけるデコリンの
発現を示す。
第２図は、CHO細胞におけるデコリン コアタンパク
の発現を示すラジオグラムである。
の発現を示すラジオグラムである。
第３図は、CHO細胞におけるデコリンの発現によって
生じる形態の変化を示す。
生じる形態の変化を示す。
第４図は、培養物中のデコリン発現細胞およびコント
ロールのCHO細胞の増殖を示すグラフである。
ロールのCHO細胞の増殖を示すグラフである。
第５図は、培養後の培養培地のCHO細胞の形態に対す
る影響を示す顕微鏡写真である。
る影響を示す顕微鏡写真である。
第６図は、培養後の培養培地の、Harvey ras遺伝子で
形質転換されたNIH 3T3細胞の形態に対する影響を示す
顕微鏡写真である。
形質転換されたNIH 3T3細胞の形態に対する影響を示す
顕微鏡写真である。
第７図は、デコリン発現細胞系であるクローン61の培
養液の培養培地の、DEAE−セファロースから溶離パター
ンを示す。
養液の培養培地の、DEAE−セファロースから溶離パター
ンを示す。
発明の詳細な説明 プロテオグリカンは、１またはそれ以上のグリコサミ
ノグリカン鎖を有するタンパクである。既知のプロテオ
グリカンは様々な機能を行い、様々な細胞部分において
見いだされる。しかし、その多くは、細胞外マトリック
スの成分であり、そのマトリックスにおいてこれらのプ
ロテオグリカンは細胞をマトリックスに組み入れたり、
細胞をマトリックスに付着させたりする働きをする。
ノグリカン鎖を有するタンパクである。既知のプロテオ
グリカンは様々な機能を行い、様々な細胞部分において
見いだされる。しかし、その多くは、細胞外マトリック
スの成分であり、そのマトリックスにおいてこれらのプ
ロテオグリカンは細胞をマトリックスに組み入れたり、
細胞をマトリックスに付着させたりする働きをする。
PG−IIまたはPG−40としても知られるデコリンは、繊
維芽細胞によって生産される小さなプロテオグリカンで
ある。そのコアタンパクは、分子量約40,000ダルトンを
有する。コアは、配列決定されており（本願で参考のた
めに引用した、KrusiusおよびRuoslahti,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 83:7683（1986）;Dayら、Biochem.J.248:801
（1987））、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸タイ
プの単一なグリコサミノグリカン鎖を有することが知ら
れている（本願で参考のために引用した、Pearson,ら、
J.Biol.Chem.258:15101（1983））。デコリンに関する
すでに既知の機能は、タイプＩおよびタイプIIコラーゲ
ンへの結合、およびこのコラーゲンによる筋原繊維の形
成に対する影響のみである（Vogelら、Biochem.J.223:5
87（1984））。
維芽細胞によって生産される小さなプロテオグリカンで
ある。そのコアタンパクは、分子量約40,000ダルトンを
有する。コアは、配列決定されており（本願で参考のた
めに引用した、KrusiusおよびRuoslahti,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 83:7683（1986）;Dayら、Biochem.J.248:801
（1987））、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸タイ
プの単一なグリコサミノグリカン鎖を有することが知ら
れている（本願で参考のために引用した、Pearson,ら、
J.Biol.Chem.258:15101（1983））。デコリンに関する
すでに既知の機能は、タイプＩおよびタイプIIコラーゲ
ンへの結合、およびこのコラーゲンによる筋原繊維の形
成に対する影響のみである（Vogelら、Biochem.J.223:5
87（1984））。
デコリンの分子生物学研究は、細胞増殖の制御におけ
るその役割について、予想外の発見に現在達しており、
これらの発見により本発明の基礎が形成される。
るその役割について、予想外の発見に現在達しており、
これらの発見により本発明の基礎が形成される。
3T3およびCOS細胞のような他の細胞もまた使用され得
るが、デコリンcDNAは、チャイニーズハムスターの卵巣
（CHO）細胞、好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼ（d
hfr）を生産しないような細胞にトランスフェクトされ
る。このようなトランスフェクションは、当該技術分野
に既知の方法によって成し遂げられる。トランスフェク
トされた細胞を、次いで培地において増殖させる。
るが、デコリンcDNAは、チャイニーズハムスターの卵巣
（CHO）細胞、好ましくはジヒドロ葉酸レダクターゼ（d
hfr）を生産しないような細胞にトランスフェクトされ
る。このようなトランスフェクションは、当該技術分野
に既知の方法によって成し遂げられる。トランスフェク
トされた細胞を、次いで培地において増殖させる。
ヒト デコリンcDNAがトランスフェクトされ、このcD
NAからのプロテオグリカンを発現する、チャイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞は、もとの細胞よりも基層部
（substratum）により付着するようである。更に、cDNA
からのデコリンを発現する細胞の増殖を抑制すると、そ
れらは様々なコントロール細胞よりも低い飽和濃度に増
殖した。これらのコントロールは、デコリンのコアタン
パクを発現する構築物でトランスフェクトされ、デコリ
ンを発現する細胞と同程度に増幅された細胞を含んでい
た。これらの細胞は、もとのCHO細胞と類似していた。
増殖および付着の変化の程度は、生産されたデコリンの
量に比例していた。
NAからのプロテオグリカンを発現する、チャイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞は、もとの細胞よりも基層部
（substratum）により付着するようである。更に、cDNA
からのデコリンを発現する細胞の増殖を抑制すると、そ
れらは様々なコントロール細胞よりも低い飽和濃度に増
殖した。これらのコントロールは、デコリンのコアタン
パクを発現する構築物でトランスフェクトされ、デコリ
ンを発現する細胞と同程度に増幅された細胞を含んでい
た。これらの細胞は、もとのCHO細胞と類似していた。
増殖および付着の変化の程度は、生産されたデコリンの
量に比例していた。
更に、付着および飽和濃度における変化は、組換えデ
コリンを発現する細胞の培養後の培養培地およびこのよ
うな培養培地から単離され、精製されたデコリンにおい
て再現することができた。これらの発見は、細胞増殖の
制御においてデコリンが、以前には知られていなかった
役割を果しており、細胞増殖を調整するのに使用され得
ることを示している。腫瘍遺伝子で形質転換された3T3
細胞にて見られる効力は、本発明が増殖性疾病の治療に
おいて有用であり得ることを示唆している。
コリンを発現する細胞の培養後の培養培地およびこのよ
うな培養培地から単離され、精製されたデコリンにおい
て再現することができた。これらの発見は、細胞増殖の
制御においてデコリンが、以前には知られていなかった
役割を果しており、細胞増殖を調整するのに使用され得
ることを示している。腫瘍遺伝子で形質転換された3T3
細胞にて見られる効力は、本発明が増殖性疾病の治療に
おいて有用であり得ることを示唆している。
本願で使用される、「デコリン」という用語は、Krus
iusおよびRuoslahti、前出、において、それであるとさ
れる特性を有する構造的特性を有し、実施例IIIの方法
によって決定されるように、細胞増殖を抑制するプロテ
オグリカンをさしていう。ヒト繊維芽細胞デコリンは、
本願で参考のために引用されているKrusiusおよびRuosl
ahti、前出、第２図において示されるアミノ酸配列を実
質的に有する。「デコリン」は、機能的特性を保持する
天然の組成物およびその修飾物の両方をさしていう。
iusおよびRuoslahti、前出、において、それであるとさ
れる特性を有する構造的特性を有し、実施例IIIの方法
によって決定されるように、細胞増殖を抑制するプロテ
オグリカンをさしていう。ヒト繊維芽細胞デコリンは、
本願で参考のために引用されているKrusiusおよびRuosl
ahti、前出、第２図において示されるアミノ酸配列を実
質的に有する。「デコリン」は、機能的特性を保持する
天然の組成物およびその修飾物の両方をさしていう。
本願で使用される用語「実質的に精製されたデコリ
ン」とは、実施例IVにおいて示される実験方法によって
得られる精製度をさしていう。
ン」とは、実施例IVにおいて示される実験方法によって
得られる精製度をさしていう。
本発明の組換えデコリンは、天然のプロテオグリカン
の構造に実質的に相当する構造を有する。しかし、制限
された変形は、デコリンの活性を破壊せずに成し遂げら
れ得る。
の構造に実質的に相当する構造を有する。しかし、制限
された変形は、デコリンの活性を破壊せずに成し遂げら
れ得る。
実施例Ｉ デコリンおよびデコリンコアタンパクの発現 本願で参考のために引用されているKrusiusおよびRuo
slahti,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7683（1986）にお
ける1.8kbの全長のデコリンcDNAをデコリン発現ベクタ
ーの構築に使用した。この細胞系はATCC（American Typ
e Culture Collection,12301 Parklawn Dr.,Rockville,
MD 20852 USA）に受託番号CRL10332で寄託されている。
デコリンコアタンパクを発現するために、セリンをコー
ドするTCTである第４コドンを、トレオニンをコードす
るACTに変化させるというcDNAの変異を、本願で参考の
ために引用されているKunkel,Proc.Natl.Acad.Sci USA
82:488（1985）に従って、位置特異的変異により行っ
た。哺乳類発現ベクターpSV2−DecorinおよびpSV2−Dec
orin/CP（core protein）を、3.4 kbのpSV2のHind III
−BamH I断片（本願で参考のために引用されているMull
iganおよびBerg,Science 209:1423（1980）に記載）に
デコリンcDNAまたは変異デコリンcDNAをそれぞれ連結さ
せることによって構築した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（dhfr）を産生しCHO細胞（CHO−DG44）を、リン酸カル
シウム沈澱方法（本願で参考のために引用されているGr
aham,F.およびVan der Eb,Virology 52:456（1973））
によってpSV2−DecorinまたはpSV2−Decorin/CPおよびp
SV2dhfrでコトランスフェクトした。トランスフェクト
された細胞を、９％の透析胎児ウシ血清、2mMのグルタ
ミン、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlス
トレプトマイシンを補足した、ヌクレオシドが入ってい
ないα改変最小必須培地（α−MEM,GIBCO,Long Islan
d）において培養した。トランスフェクトされた細胞か
らのコロニーをクローニングシリンダで採取し、これを
増殖させ（expanded）、35SO4で標識した培地上澄み液
による免疫沈澱によってデコリンの発現を検査した。大
量のデコリンを発現するクローンについて、メトトレキ
セート（MTX,Kaufman and Sharp,J.Mol.Biol.159:601
（1982））の濃度を0.64μＭに段階的に増加させること
によって遺伝子増幅を行った。増幅されたすべての細胞
系を、限界希釈法またはMTX耐性の単一コロニーを採取
することによってクローン化した。これらの樹立細胞系
の保存培養物をMTX含有培地中に保持した。実験に使用
する前に、保存培養物からのMTXを含まない培地中で細
胞を継代培養し、MTXの影響の可能性を除去するため
に、この培地の中を少なくとも一回通過させた。コント
ロールは、pSV2dhfrのみでトランスフェクトし、その後
実験細胞と全く同様に処理した。35SO4または3H−ロイ
シンによる細胞の代謝標識および免疫沈澱を、本願で参
考のために引用されているBrennanら、J.Biol.Chem 25
9:13742（1984）に説明されるように実施した。
slahti,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7683（1986）にお
ける1.8kbの全長のデコリンcDNAをデコリン発現ベクタ
ーの構築に使用した。この細胞系はATCC（American Typ
e Culture Collection,12301 Parklawn Dr.,Rockville,
MD 20852 USA）に受託番号CRL10332で寄託されている。
デコリンコアタンパクを発現するために、セリンをコー
ドするTCTである第４コドンを、トレオニンをコードす
るACTに変化させるというcDNAの変異を、本願で参考の
ために引用されているKunkel,Proc.Natl.Acad.Sci USA
82:488（1985）に従って、位置特異的変異により行っ
た。哺乳類発現ベクターpSV2−DecorinおよびpSV2−Dec
orin/CP（core protein）を、3.4 kbのpSV2のHind III
−BamH I断片（本願で参考のために引用されているMull
iganおよびBerg,Science 209:1423（1980）に記載）に
デコリンcDNAまたは変異デコリンcDNAをそれぞれ連結さ
せることによって構築した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（dhfr）を産生しCHO細胞（CHO−DG44）を、リン酸カル
シウム沈澱方法（本願で参考のために引用されているGr
aham,F.およびVan der Eb,Virology 52:456（1973））
によってpSV2−DecorinまたはpSV2−Decorin/CPおよびp
SV2dhfrでコトランスフェクトした。トランスフェクト
された細胞を、９％の透析胎児ウシ血清、2mMのグルタ
ミン、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlス
トレプトマイシンを補足した、ヌクレオシドが入ってい
ないα改変最小必須培地（α−MEM,GIBCO,Long Islan
d）において培養した。トランスフェクトされた細胞か
らのコロニーをクローニングシリンダで採取し、これを
増殖させ（expanded）、35SO4で標識した培地上澄み液
による免疫沈澱によってデコリンの発現を検査した。大
量のデコリンを発現するクローンについて、メトトレキ
セート（MTX,Kaufman and Sharp,J.Mol.Biol.159:601
（1982））の濃度を0.64μＭに段階的に増加させること
によって遺伝子増幅を行った。増幅されたすべての細胞
系を、限界希釈法またはMTX耐性の単一コロニーを採取
することによってクローン化した。これらの樹立細胞系
の保存培養物をMTX含有培地中に保持した。実験に使用
する前に、保存培養物からのMTXを含まない培地中で細
胞を継代培養し、MTXの影響の可能性を除去するため
に、この培地の中を少なくとも一回通過させた。コント
ロールは、pSV2dhfrのみでトランスフェクトし、その後
実験細胞と全く同様に処理した。35SO4または3H−ロイ
シンによる細胞の代謝標識および免疫沈澱を、本願で参
考のために引用されているBrennanら、J.Biol.Chem 25
9:13742（1984）に説明されるように実施した。
第１図は、還元条件の下でSDS−７％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法を使用して、増幅されていない、お
よび増幅されたトランスフェクタントにおけるデコリン
の発現を示す。（Ａ）ヒトデコリンのNH2末端に対して
調製されたウサギ抗ペプチド抗血清によって免疫沈澱し
た、35SO4で標識された培養物上澄み液（Krusiusおよび
Ruoslahti、前出）。（Ｂ）培地に分泌された、35SO4で
標識されたすべての産物。（Ｃ）培地に分泌されたすべ
ての3H−ロイシンで標識された産物。レーン1:pSV2dhfr
でトランスフェクトされ、増幅されていないクローンで
ある、コントロールのトランスフェクタントA;レーン2:
コントロールのトランスフェクタントＡからのクローン
であって、0.64μＭのMTX耐性にまで増幅されたクロー
ンである、コントロールのトランスフェクタントC;レー
ン3:0.2pg/細胞／日のデコリンを発現する、増幅されて
いない第１トランスフェクタントである、クローン1;レ
ーン4:0.32μＭのMTX耐性にまで増幅され、4pg/細胞／
日のデコリンを発現するクローンである、クローン31;
レーン5:0.64μＭのMTX耐性にまで増幅され、25pg/細胞
／日のデコリンを発現するクローンである、クローン6
1。
ミドゲル電気泳動法を使用して、増幅されていない、お
よび増幅されたトランスフェクタントにおけるデコリン
の発現を示す。（Ａ）ヒトデコリンのNH2末端に対して
調製されたウサギ抗ペプチド抗血清によって免疫沈澱し
た、35SO4で標識された培養物上澄み液（Krusiusおよび
Ruoslahti、前出）。（Ｂ）培地に分泌された、35SO4で
標識されたすべての産物。（Ｃ）培地に分泌されたすべ
ての3H−ロイシンで標識された産物。レーン1:pSV2dhfr
でトランスフェクトされ、増幅されていないクローンで
ある、コントロールのトランスフェクタントA;レーン2:
コントロールのトランスフェクタントＡからのクローン
であって、0.64μＭのMTX耐性にまで増幅されたクロー
ンである、コントロールのトランスフェクタントC;レー
ン3:0.2pg/細胞／日のデコリンを発現する、増幅されて
いない第１トランスフェクタントである、クローン1;レ
ーン4:0.32μＭのMTX耐性にまで増幅され、4pg/細胞／
日のデコリンを発現するクローンである、クローン31;
レーン5:0.64μＭのMTX耐性にまで増幅され、25pg/細胞
／日のデコリンを発現するクローンである、クローン6
1。
第２図は、CHO細胞におけるデコリンコアタンパクの
発現を示す。レーン１および2:3H−ロイシンで標識され
た培養物上澄み液を第１図に説明されるように免疫沈澱
した。レーン３および4:培地に分泌される、すべての3H
−ロイシン標識産物。レーン１および3:pSV2−Decorin/
CPでトランスフェクトされたCHO細胞。レーン２および
4:pSV2dhfrでトランスフェクトされたコントロールCHO
細胞。
発現を示す。レーン１および2:3H−ロイシンで標識され
た培養物上澄み液を第１図に説明されるように免疫沈澱
した。レーン３および4:培地に分泌される、すべての3H
−ロイシン標識産物。レーン１および3:pSV2−Decorin/
CPでトランスフェクトされたCHO細胞。レーン２および
4:pSV2dhfrでトランスフェクトされたコントロールCHO
細胞。
第３図は、CHO細胞におけるデコリンの発現によって
生じる形態の変化を示す生物形態写真である:A,MTXで増
幅しなかったコントロールCHO細胞（コントロール細胞
系Ａ）;B,0.64μＭのMTX耐性に対して増幅したコントロ
ールCHO細胞（コントロール細胞系Ｃ）（ＡおよびＢと
もデコリンcDNAでトランスフェクトされなかった）;C,
クローン31,デコリンを中レベルで発現（11pg/細胞／日
のデコリン生産）;D,クローン61,デコリンを高レベルで
発現（25pg/細胞／日のデコリン生産）。
生じる形態の変化を示す生物形態写真である:A,MTXで増
幅しなかったコントロールCHO細胞（コントロール細胞
系Ａ）;B,0.64μＭのMTX耐性に対して増幅したコントロ
ールCHO細胞（コントロール細胞系Ｃ）（ＡおよびＢと
もデコリンcDNAでトランスフェクトされなかった）;C,
クローン31,デコリンを中レベルで発現（11pg/細胞／日
のデコリン生産）;D,クローン61,デコリンを高レベルで
発現（25pg/細胞／日のデコリン生産）。
第４図は、培養物中のデコリン発現細胞およびコント
ロールのCHO細胞の増殖を示すグラフである：異なるレ
ベルのデコリンを発現する３つの代表的な細胞系の増殖
曲線を示す；（黒四角）クローン61;（黒丸）クローン3
1;（白丸）コントロール細胞系Ａ。
ロールのCHO細胞の増殖を示すグラフである：異なるレ
ベルのデコリンを発現する３つの代表的な細胞系の増殖
曲線を示す；（黒四角）クローン61;（黒丸）クローン3
1;（白丸）コントロール細胞系Ａ。
実施例II 細胞の広がり（spreading）および飽和濃度の 実施例Ｉの細胞系を、ウェル当り3X105細胞濃度でMTX
を含まない培地中の24のウェルプレートにプレートし
た。24時間後、培地を取り換え（ウェル当り0.3ml）、
細胞を更に24時間インキュベートした。これらの培養物
上澄み液中のデコリンの濃度を競合ELISAによって決定
した（本願で参考のために引用されているEngvall,Met
h.Enzymol.70:419（1980））。簡単に述べると、培養物
上澄み液とデコリンに対するウサギ抗ペプチド抗体との
混合物を、ヒト胎児膜から精製したデコリンでコートし
たマイクロタイタープレートのウェル中でインキュベー
トした（Brennanら、前出）。ウェルに結合した抗体の
量を、第２抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ
抗ウサギIgGによって決定した。精製したデコリンの様
々な濃度を使用して標準曲線を作製した。24時間のイン
キュベーションを行った後、血球計によって細胞の数を
数えた。
を含まない培地中の24のウェルプレートにプレートし
た。24時間後、培地を取り換え（ウェル当り0.3ml）、
細胞を更に24時間インキュベートした。これらの培養物
上澄み液中のデコリンの濃度を競合ELISAによって決定
した（本願で参考のために引用されているEngvall,Met
h.Enzymol.70:419（1980））。簡単に述べると、培養物
上澄み液とデコリンに対するウサギ抗ペプチド抗体との
混合物を、ヒト胎児膜から精製したデコリンでコートし
たマイクロタイタープレートのウェル中でインキュベー
トした（Brennanら、前出）。ウェルに結合した抗体の
量を、第２抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ
抗ウサギIgGによって決定した。精製したデコリンの様
々な濃度を使用して標準曲線を作製した。24時間のイン
キュベーションを行った後、血球計によって細胞の数を
数えた。
表Ｉに示されるように、デコリン遺伝子でトランスフ
ェクトされた細胞は、コントロールの細胞よりも広い広
がりの領域を示した。デコリン発現が増幅されたところ
では、広がりの領域は発現が増大するとともに増加し
た。
ェクトされた細胞は、コントロールの細胞よりも広い広
がりの領域を示した。デコリン発現が増幅されたところ
では、広がりの領域は発現が増大するとともに増加し
た。
表Ｉはまた、デコリンを発現する細胞、およびコント
ロール細胞の飽和濃度を示す。飽和濃度を決定するため
に、細胞（1.2X105）を、60mmの培養皿中のMTXを含まな
い培地にプレートした。６時間後、細胞を、３％のパラ
ホルムアルデヒドで固定し、トルイジン青で染色した。
拡散の定量評価を、像分析器（Olympus）の表面集積プ
ログラム（surface integration program）で細胞が広
がった表面領域を測定することによって行った。広がっ
ていない細胞を測定から除いた。50の細胞からの平均お
よび標準偏差値を示す。
ロール細胞の飽和濃度を示す。飽和濃度を決定するため
に、細胞（1.2X105）を、60mmの培養皿中のMTXを含まな
い培地にプレートした。６時間後、細胞を、３％のパラ
ホルムアルデヒドで固定し、トルイジン青で染色した。
拡散の定量評価を、像分析器（Olympus）の表面集積プ
ログラム（surface integration program）で細胞が広
がった表面領域を測定することによって行った。広がっ
ていない細胞を測定から除いた。50の細胞からの平均お
よび標準偏差値を示す。
実施例III 培養後の培地の効果の分析 CHO細胞およびHarvey ras遺伝子で形質転換されたNIH
3T3細胞の形態に対する、培養後の培地の影響を調べ
た。これは、クローン61からの２日間培養後の培地（約
20μg/mlのデコリンを含む）およびコントロール細胞系
Ｃからの同様に培養した培地に（デコリンを含まな
い）、2X105細胞／皿の濃度で、35mmの皿中にCHO細胞を
プレートすることによって、行われた。上記、細胞系
は、実施例Ｉに記載のものである。
3T3細胞の形態に対する、培養後の培地の影響を調べ
た。これは、クローン61からの２日間培養後の培地（約
20μg/mlのデコリンを含む）およびコントロール細胞系
Ｃからの同様に培養した培地に（デコリンを含まな
い）、2X105細胞／皿の濃度で、35mmの皿中にCHO細胞を
プレートすることによって、行われた。上記、細胞系
は、実施例Ｉに記載のものである。
第５図は、上記の処理後のCHO細胞の形態を示し、第
６図は、処理後の、腫瘍遺伝子で形質転換された3T3細
胞の形態を示す。第５図は、デコリン発現CHO細胞また
はコントロールCHO細胞の培養後の培養培地の添加によ
り引き起こされた親CO細胞の形態に対する影響を示す顕
微鏡による生物形態写真である。（Ａ）コントロールラ
インＣの培養後の培養培地の存在下で培養されたCHO細
胞。（Ｂ）クローン61の培養後の培養培地の存在下で培
養されたCHO細胞。第６図は、デコリン発現CHO細胞また
はコントロールCHO細胞の培養後の培養培地の添加によ
り引き起こされた、Harvey ras遺伝子で形質転換された
NIH 3T3（ras−3T3）細胞の形態に対する影響を示す顕
微鏡による生物形態写真である。（Ａ）コントロールラ
インＣの培養後の培養培地の存在下で培養されたras−3
T3細胞。（Ｂ）クローン61の培養後の培養培地の存在下
で培養されたras−3T3細胞。観察されるように、デコリ
ンを発現する細胞系であるクローン61からの培養後の培
地は、デコリンを発現する細胞自身において観察される
のと同様の形態を誘導した。このように処理された腫瘍
遺伝子で形質転換された3T3細胞は、通常の細胞とほぼ
同様の形態を示す。この形態は、しばしば「接触抑制形
態」と呼ばれ、正常の成長の制御を示すものと思われ
る。この現象によると、コントロール培地で処理された
培養物と比較してこれらの培養物中には細胞が少なかっ
た。これらの結果は、デコリンを発現する細胞系からの
培地が、組換えデコリン発現細胞自身で見られる形態上
のおよび増殖阻止の効果を生み出すことを示す。
６図は、処理後の、腫瘍遺伝子で形質転換された3T3細
胞の形態を示す。第５図は、デコリン発現CHO細胞また
はコントロールCHO細胞の培養後の培養培地の添加によ
り引き起こされた親CO細胞の形態に対する影響を示す顕
微鏡による生物形態写真である。（Ａ）コントロールラ
インＣの培養後の培養培地の存在下で培養されたCHO細
胞。（Ｂ）クローン61の培養後の培養培地の存在下で培
養されたCHO細胞。第６図は、デコリン発現CHO細胞また
はコントロールCHO細胞の培養後の培養培地の添加によ
り引き起こされた、Harvey ras遺伝子で形質転換された
NIH 3T3（ras−3T3）細胞の形態に対する影響を示す顕
微鏡による生物形態写真である。（Ａ）コントロールラ
インＣの培養後の培養培地の存在下で培養されたras−3
T3細胞。（Ｂ）クローン61の培養後の培養培地の存在下
で培養されたras−3T3細胞。観察されるように、デコリ
ンを発現する細胞系であるクローン61からの培養後の培
地は、デコリンを発現する細胞自身において観察される
のと同様の形態を誘導した。このように処理された腫瘍
遺伝子で形質転換された3T3細胞は、通常の細胞とほぼ
同様の形態を示す。この形態は、しばしば「接触抑制形
態」と呼ばれ、正常の成長の制御を示すものと思われ
る。この現象によると、コントロール培地で処理された
培養物と比較してこれらの培養物中には細胞が少なかっ
た。これらの結果は、デコリンを発現する細胞系からの
培地が、組換えデコリン発現細胞自身で見られる形態上
のおよび増殖阻止の効果を生み出すことを示す。
実施例IV 培養後の培地からのデコリンの精製 クローン61細胞を、９％の透析胎児ウシ血清、2mMの
グルタミン、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg
/mlのストレプトマイシンを補足した、ヌクレオチドを
含まないα−MEM培地中、８−175cm2の培養フラスコで9
0％の集密度にまで増殖させた。90％の集密度となった
ときに、培地を、１個のフラスコあたり６％の透析胎児
ウシ血清を補足したヌクレオシドを含まない25mlのα−
MEMに換えた。この培地は、あらかじめ0.05Mのリン酸緩
衝剤、pH7.4中の0.25MのNaClで平衡化したDEAE セファ
ロース ファスト フロー カラム（Pharamacia）を通
過させてある。細胞を３日間培養し、培養後の培地を採
取し、迅速に0.5mMのフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド、１μg/mlのペプスタチン、0.04mg/mlのアプロ
チニンおよび5mMのEDTAとなるように調製した。
グルタミン、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg
/mlのストレプトマイシンを補足した、ヌクレオチドを
含まないα−MEM培地中、８−175cm2の培養フラスコで9
0％の集密度にまで増殖させた。90％の集密度となった
ときに、培地を、１個のフラスコあたり６％の透析胎児
ウシ血清を補足したヌクレオシドを含まない25mlのα−
MEMに換えた。この培地は、あらかじめ0.05Mのリン酸緩
衝剤、pH7.4中の0.25MのNaClで平衡化したDEAE セファ
ロース ファスト フロー カラム（Pharamacia）を通
過させてある。細胞を３日間培養し、培養後の培地を採
取し、迅速に0.5mMのフェニルメチルスルホニルフルオ
ライド、１μg/mlのペプスタチン、0.04mg/mlのアプロ
チニンおよび5mMのEDTAとなるように調製した。
400mlの培養後の培地をまず、ゼラチン−セファロー
スに通過させ、繊維芽細胞およびセファロースに結合す
る物質を除去した。次いで通り抜けたフラクションを、
50mMのTris/HCl,pH7.4および0.2MのNaCl中で予備平衡化
させたDEAE−セファロースと混合し、これを４℃で一晩
ゆるやかに混合することによって吸収させた。このスラ
リーを、1.6cmX24cmのカラムに注ぎ、0.2MのNaClを含む
50mMのTris/HCl、pH7.4で更に洗浄し、50mMのTris/HC
l、pH7.4中、0.2M−0.8MのNaClの直線勾配で溶離した。
デコリンの濃度を、上記のように競合ELISAによって決
定した。
スに通過させ、繊維芽細胞およびセファロースに結合す
る物質を除去した。次いで通り抜けたフラクションを、
50mMのTris/HCl,pH7.4および0.2MのNaCl中で予備平衡化
させたDEAE−セファロースと混合し、これを４℃で一晩
ゆるやかに混合することによって吸収させた。このスラ
リーを、1.6cmX24cmのカラムに注ぎ、0.2MのNaClを含む
50mMのTris/HCl、pH7.4で更に洗浄し、50mMのTris/HC
l、pH7.4中、0.2M−0.8MのNaClの直線勾配で溶離した。
デコリンの濃度を、上記のように競合ELISAによって決
定した。
第７図は、DEAE−セファロース ファスト フローに
おける溶離パターンを示す。観察されるように、デコリ
ンを、培地中に存在するタンパクの塊から分離し、最高
の免疫反応を示すフラクションから実質的に純粋な形で
回収し得た。
おける溶離パターンを示す。観察されるように、デコリ
ンを、培地中に存在するタンパクの塊から分離し、最高
の免疫反応を示すフラクションから実質的に純粋な形で
回収し得た。
本発明を、好ましい実施態様を参照して説明したが、
本発明の精神を逸脱せずに様々な改変を行うことが可能
であるこは理解されなければならない。従って、本発明
は、以下の請求項によってのみ限定される。
本発明の精神を逸脱せずに様々な改変を行うことが可能
であるこは理解されなければならない。従って、本発明
は、以下の請求項によってのみ限定される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヤマグチ，ユウ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122 サン ディエゴ，ナンバー．92, デコロ ストリート 4178 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1986［83］ｐ．7683−7687 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1982 ［257］ｐ．11256−11260
Claims (3)
- 【請求項１】デコリンを産生する動物細胞からの培養後
の培地にデコリンによって抑制され得る動物細胞を接触
させることによって、該デコリンによって抑制され得る
動物細胞の増殖を抑制する方法であって、該デコリン産
生動物細胞が、デコリンcDNAでトランスフェクトされた
動物細胞であって、そして該動物細胞が、細胞増殖阻害
活性の組換えデコリンを分泌し得る、方法。 - 【請求項２】実質的に精製された組換えデコリンと、デ
コリンによって抑制され得る動物細胞とを接触させるこ
とによって、該デコリンによって抑制され得る動物細胞
の増殖を抑制する方法であって、ここで該組換えデコリ
ンが天然の組織源由来の精製に関連した不純物を実質的
に含有せず、細胞増殖阻害活性を有する、方法。 - 【請求項３】前記精製組換えデコリンが、デコリンcDNA
でトランスフェクトされた動物細胞によって産生され、
該動物細胞が、細胞増殖阻害活性の組換えデコリンを分
泌し得る、請求項２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21270288A | 1988-06-28 | 1988-06-28 | |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8061486A Division JPH09117278A (ja) | 1988-06-28 | 1996-03-18 | デコリンによる細胞増殖の抑制 |
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|---|---|
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| JP8061486A Pending JPH09117278A (ja) | 1988-06-28 | 1996-03-18 | デコリンによる細胞増殖の抑制 |
| JP2002158174A Pending JP2003034651A (ja) | 1988-06-28 | 2002-05-30 | デコリンによる細胞増殖の抑制 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8061486A Pending JPH09117278A (ja) | 1988-06-28 | 1996-03-18 | デコリンによる細胞増殖の抑制 |
| JP2002158174A Pending JP2003034651A (ja) | 1988-06-28 | 2002-05-30 | デコリンによる細胞増殖の抑制 |
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| US6509314B1 (en) * | 1988-06-28 | 2003-01-21 | The Burnham Institute | Methods of preventing or reducing scarring with decorin or biglycan |
| US5654270A (en) * | 1988-06-28 | 1997-08-05 | La Jolla Cancer Research Foundation | Use of fibromodulin to prevent or reduce dermal scarring |
| ATE233568T1 (de) * | 1991-11-14 | 2003-03-15 | Jolla Cancer Res Found | Inhibitoren von zellregulationsfaktoren und verfahren zur verhütung oder verminderung von narbenbildung |
| US5830847A (en) * | 1992-10-30 | 1998-11-03 | Hsc Research & Development Limited Partnership | Soluble TGF-β-binding endoglin polypeptides and homodimers |
| US5650389A (en) * | 1993-03-01 | 1997-07-22 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Methods for the inhibition of complement activation |
| US5453492A (en) * | 1993-07-28 | 1995-09-26 | La Jolla Cancer Research Foundation | 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β |
| US5567807A (en) * | 1994-07-08 | 1996-10-22 | La Jolla Cancer Research Foundation | Processes for the purification of human recombinant decorin and the detection of guanidinium ions |
| AU1284999A (en) | 1997-10-28 | 1999-05-17 | Jain, Mukesh | (in vitro) differentiation of vascular smooth muscle cells, methods and reagentsrelated thereto |
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| EP2050460A1 (en) | 2001-09-24 | 2009-04-22 | Imperial Innovations Limited | PYY and agonists thereof for modification of feeding behaviour |
| JP4733922B2 (ja) | 2002-01-10 | 2011-07-27 | インペリアル・イノベ−ションズ・リミテッド | 摂食行動の修正 |
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| JP5481028B2 (ja) * | 2004-10-13 | 2014-04-23 | ザ オハイオ ステート ユニバーシティー リサーチ ファウンデーション | ウイルス関連リンパ増殖性障害を処置または予防するための方法 |
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2002
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Non-Patent Citations (2)
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| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８２［２５７］ｐ．１１２５６−１１２６０ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６［８３］ｐ．７６８３−７６８７ |
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