JP2003034651A - デコリンによる細胞増殖の抑制 - Google Patents
デコリンによる細胞増殖の抑制Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞外マトリックス成分のタイプおよび／ま
たは量に影響を与える薬剤を提供すること。 【解決手段】 実質的に精製された組換えデコリンを含
む、細胞外マトリックス成分のタイプおよび／または量
に影響を与える薬剤を調製するための組成物であって、
該デコリンが、デコリンの天然組成物および細胞増殖抑
制活性を有するその改変物からなる群から選択され、こ
こで該精製組換えデコリンが天然の組織源からの精製に
関連した夾雑物を実質的に含有せず、細胞増殖抑制活性
を有する、組成物。
たは量に影響を与える薬剤を提供すること。 【解決手段】 実質的に精製された組換えデコリンを含
む、細胞外マトリックス成分のタイプおよび／または量
に影響を与える薬剤を調製するための組成物であって、
該デコリンが、デコリンの天然組成物および細胞増殖抑
制活性を有するその改変物からなる群から選択され、こ
こで該精製組換えデコリンが天然の組織源からの精製に
関連した夾雑物を実質的に含有せず、細胞増殖抑制活性
を有する、組成物。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞生物学、特に
細胞増殖の制御に関する。 【０００２】 【従来の技術】通常の状態では、細胞の増殖は厳しく制
御された工程であり、迅速な増殖は、胚の発達および組
織の再生に必要であるが、その一方増殖は、完成された
組織においては停止されなければならない。細胞増殖
は、主として成長因子によって制御されるようである。
既知の成長因子の大半は誘発性を有し、それには、表皮
成長因子、血小板由来の成長因子、様々なインターロイ
キンおよびコロニー刺激因子が包含される。少数の細胞
増殖の負に制御する因子もまた知られている。形質転換
成長因子βは、いくつかの細胞タイプの増殖を阻止する
多機能因子であるが、増殖も刺激し得る。他の増殖阻止
物質には、様々なインターフェロンが包含され、増殖阻
止の役割はヘパリン、ヘパラン硫酸およびそれらの断片
に起因している。 【０００３】増殖制御であまりよく知られていない機構
は、細胞が近接した位置関係にあることに関する。正常
の細胞は互いに接触すると、増殖を中止する。この現象
は、通常、接触による増殖阻止として知られており、正
常な組織構造の形成には明らかに重要である。 【０００４】多数の重要な病理条件は、異常な細胞増殖
が原因となっている。このような状態の最も主要なもの
は癌である。増殖に関与する要素による他の疾病には、
滑膜組織の異常成長による慢性間接リウマチ、糸球体間
質細胞が増殖する糸球体腎炎、および異常に増殖する細
胞が平滑筋細胞である、動脈硬化症が含まれる。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】上記の例から、細胞増
殖を制御するための新しい方法を開発する必要があるこ
とは明白である。本発明は、この必要性について取り組
むとともに、他の関連した利点を提供する。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は、プロテオグリ
カンであるデコリン(PG-IIまたはPG-40としても知られ
る)に関する。本発明は、デコリンをコードする遺伝子
によってトランスフェクトされ、この遺伝子を発現する
細胞およびそれによって生産される組換えデコリンを提
供する。このようなトランスフェクトされた細胞培養物
の培養後の(spent)培養培地は、正常または異常細胞の
増殖を抑制するのに使用され得る。更に、精製されたデ
コリンは、細胞増殖を抑制するのに使用され得る。 【０００７】本発明は、デコリンcDNAでトランスフェク
トされた動物細胞を提供し、ここで上記デコリンは、デ
コリンの天然組成物およびその機能的特性を保持するそ
の改変物からなる群から選択され、そして上記動物細胞
は、細胞増殖阻害活性の組換えデコリンを分泌し得る。 【０００８】本発明はまた、実質的に精製された組換え
デコリンを提供し、ここで上記デコリンは、デコリンの
天然組成物およびその機能的特性を保持するその改変物
からなる群から選択され、そして上記精製組換えデコリ
ンは天然の組織源由来の精製に関連した不純物を実質的
に含有せず、細胞増殖阻害活性を有する。 【０００９】本発明はまた、成熟コアタンパク質の４位
のアミノ酸であるセリンの位置に、スレオニンを有し、
そして天然の組織源由来の精製に関連した不純物を実質
的に含有せず、細胞増殖阻害活性を有する、実質的に精
製された組換えデコリンを提供する。 【００１０】さらに、本発明は、上記の動物細胞から産
生される、上記の実質的に精製された組換えデコリンを
提供する。 【００１１】本発明はまた、上記動物細胞から産生され
る、成熟コアタンパク質の４位のアミノ酸であるセリン
の位置に、スレオニンを有し、そして天然の組織源由来
の精製に関連した不純物を実質的に含有せず、細胞増殖
阻害活性を有する実質的に精製された組換えデコリンを
提供する。 【００１２】さらに、本発明は、デコリンを産生する動
物細胞からの培養後の培地にデコリンによって抑制され
得る動物細胞を接触させることによって、上記デコリン
によって抑制され得る動物細胞の増殖を抑制する方法を
提供し、ここで上記精製組換えデコリン産生細胞は上記
動物細胞である。 【００１３】本発明はまた、本発明の実質的に精製され
た組換えデコリンと、デコリンによって抑制され得る動
物細胞とを接触させることによって、上記デコリンによ
って抑制され得る動物細胞の増殖を抑制する方法を提供
する。 【００１４】好ましい実施態様では、この方法におい
て、上記精製組換えデコリンが上記の動物細胞によって
産生される。 【００１５】さらに本発明は、増殖性疾病の治療用の薬
剤を調製するための、本発明の実質的に精製された組換
えデコリンの使用を提供する。 【００１６】好ましい実施態様では、上記使用におい
て、上記疾病は、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎または
アテローム硬化症である。 【００１７】本発明はまた、細胞外マトリックス成分の
タイプおよび／または量に影響を与える薬剤を調節する
ための、本発明の実質的に精製された組換えデコリンの
使用を提供する。 【００１８】 【発明の実施の形態】プロテオグリカンは、１またはそ
れ以上のグリコサミノグリカン鎖を有するタンパクであ
る。既知のプロテオグリカンは様々な機能を行い、様々
な細胞部分において見いだされる。しかし、その多く
は、細胞外マトリックスの成分であり、そのマトリック
スにおいてこれらのプロテオグリカンは細胞をマトリッ
クスに組み入れたり、細胞をマトリックスに付着させた
りする働きをする。 【００１９】PG-IIまたはPG-40としても知られるデコリ
ンは、繊維芽細胞によって生産される小さなプロテオグ
リカンである。そのコアタンパクは、分子量約40,000ダ
ルトンを有する。コアは、配列決定されており(本願で
参考のために引用した、KrusiusおよびRuoslahti, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 83:7683(1986); Dayら、Bioc
hem. J. 248:801(1987))、コンドロイチン硫酸／デルマ
タン硫酸タイプの単一なグリコサミノグリカン鎖を有す
ることが知られている(本願で参考のために引用した、P
earson, ら、J. Biol. Chem. 258:15101(1983))。デコ
リンに関するすでに既知の機能は、タイプＩおよびタイ
プIIコラーゲンヘの結合、およびこのコラーゲンによる
筋原繊維の形成に対する影響のみである(Vogelら、Bioc
hem. J. 223:587(1984))。 【００２０】デコリンの分子生物学研究は、細胞増殖の
制御におけるその役割について、予想外の発見に現在達
しており、これらの発見により本発明の基礎が形成され
る。 【００２１】3T3およびCOS細胞のような他の細胞もまた
使用され得るが、デコリンcDNAは、チャイニーズハムス
ターの卵巣(CHO)細胞、好ましくはジヒドロ葉酸レダク
ターゼ(dhfr)を生産しないような細胞にトランスフェク
トされる。このようなトランスフェクションは、当該技
術分野に既知の方法によって成し遂げられる。トランス
フェクトされた細胞を、次いで培地において増殖させ
る。 【００２２】ヒトデコリンcDNAがトランスフェクトさ
れ、このcDNAからのプロテオグリカンを発現する、チャ
イニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、もとの細胞より
も基層部(substratum)により付着するようである。更
に、cDNAからのデコリンを発現する細胞の増殖を抑制す
ると、それらは様々なコントロール細胞よりも低い飽和
濃度に増殖した。これらのコントロールは、デコリンの
コアタンパクを発現する構築物でトランスフェクトさ
れ、デコリンを発現する細胞と同程度に増幅された細胞
を含んでいた。これらの細胞は、もとのCHO細胞と類似
していた。増殖および付着の変化の程度は、生産された
デコリンの量に比例していた。 【００２３】更に、付着および飽和濃度における変化
は、組換えデコリンを発現する細胞の培養後の培養培地
およびこのような培養培地から単離され、精製されたデ
コリンにおいて再現することができた。これらの発見
は、細胞増殖の制御においてデコリンが、以前には知ら
れていなかった役割を果しており、細胞増殖を調整する
のに使用され得ることを示している。腫瘍遺伝子で形質
転換された3T3細胞にて見られる効力は、本発明が増殖
性疾病の治療において有用であり得ることを示唆してい
る。 【００２４】本願で使用される、「デコリン」という用
語は、KrusiusおよびRuoslahti、前出、において、それ
であるとされる特性を有する構造的特性を有し、実施例
IIIの方法によって決定されるように、細胞増殖を抑制
するプロテオグリカンをさしていう。ヒト繊維芽細胞デ
コリンは、本願で参考のために引用されているKrusius
およびRuoslahti、前出、図２において示されるアミノ
酸配列を実質的に有する。「デコリン」は、機能的特性
を保持する天然の組成物およびその修飾物の両方をさし
ていう。 【００２５】本願で使用される用語「実質的に精製され
たデコリン」とは、実施例IVにおいて示される実験方法
によって得られる精製度をさしていう。 【００２６】本発明の組換えデコリンは、天然のプロテ
オグリカンの構造に実質的に相当する構造を有する。し
かし、制限された変形は、デコリンの活性を破壊せずに
成し遂げられ得る。 【００２７】 【実施例】（実施例Ｉ）デコリンおよびデコリンコアタ
ンパクの発現 本願で参考のために引用されているKrusiusおよびRuosl
ahti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7683(1986)にお
ける1.8kbの全長のデコリンcDNAをデコリン発現ベクタ
ーの構築に使用した。この細胞系はＡＴＣＣ（American
Type CultureCollection,12301 Parklawn Dr., Rockvi
lle MD20852 USA）に受託番号ＣＲＬ１０３３２で寄託
されている。デコリンコアタンパクを発現するために、
セリンをコードするTCTである第４コドンを、トレオニ
ンをコードするACTに変化させるというcDNAの変異を、
本願で参考のために引用されているKunkel, Proc. Nat
l.Acad. Sci USA 82:488(1985)に従って、位置特異的変
異により行った。哺乳類発現ベクターpSV2-Decorinおよ
びpSV2-Decorin/CP(core protein)を、3.4kbのpSV2のHi
ndIII-Bam HI断片(本願で参考のために引用されているM
ulliganおよびBerg,Science 209:1423(1980)に記載)に
デコリンcDNAまたは変異デコリンcDNAをそれぞれ連結さ
せることによって構築した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ
(dhfr)を産生しないCHO細胞(CHO-DG44)を、リン酸カル
シウム沈澱方法(本願で参考のために引用されているGra
ham. F. およびVan der Eb. Virology 52:456(1973))に
よってpSV2-DecorinまたはpSV2-Decorin/CPおよびpSV2d
hfrでコトランスフェクトした。トランスフェクトされ
た細胞を、9%の透析胎児ウシ血清、2mMのグルタミン、1
00ユニット／mlのペニシリンおよび100μg/mlストレプ
トマイシンを補足した、ヌクレオシドが入っていないα
改変最小必須培地(α-MEM,GIBCO, Long Island)におい
て培養した。トランスフェクトされた細胞からのコロニ
ーをクローニングシリンダで採取し、これを増殖させ(e
xpanded)、35SO4で標識した培地上澄み液による免疫沈
澱によってデコリンの発現を検査した。大量のデコリン
を発現するクローンについて、メトトレキセート(MTX,
Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601(1982))の
濃度を0.64μMに段階的に増加させることによって遺伝
子増幅を行った。増幅されたすべての細胞系を、限界希
釈法またはMTX耐性の単一コロニーを採取することによ
ってクローン化した。これらの樹立細胞系の保存培養物
をMTX含有培地中に保持した。実験に使用する前に、保
存培養物からのMTXを含まない培地中で細胞を継代培養
し、MTXの影響の可能性を除去するために、この培地の
中を少なくとも一回通過させた。コントロールは、pSV2
dhfrのみでトランスフェクトし、その後実験細胞と全く
同様に処理した。35SO4または3H-ロイシンによる細胞の
代謝標識および免疫沈澱を、本願で参考のために引用さ
れているBrennanら、J. Biol. Chem 259:13742(1984)に
説明されるように実施した。 【００２８】図１は、還元条件の下でSDS-7%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法を使用して、増幅されていな
い、および増幅されたトランスフェクタントにおけるデ
コリンの発現を示す。（Ａ）ヒトデコリンのNH2末端に
対して調製されたウサギ抗ペプチド抗血清によって免疫
沈滅した、35SO4で標識された培養物上澄み液(Krusius
およびRuoslahti、前出)。（Ｂ）培地に分泌された、35
SO4で標識されたすべての産物。（Ｃ）培地に分泌され
たすべての3H-ロイシンで標識された産物。レーン１：p
SV2dhfrでトランスフェクトされ、増幅されていないク
ローンである、コントロールのトランスフェクタント
Ａ；レーン２：コントロールのトランスフェクタントＡ
からのクローンであって、0.64μMのMTX耐性にまで増幅
されたクローンである、コントロールのトランスフェク
タントＣ；レーン３：0.2pg／細胞／日のデコリンを発
現する、増幅されていない第１トランスフェクタントで
ある、クローン１；レーン４：0.32μMのMTX耐性にまで
増幅され、4pg／細胞／日のデコリンを発現するクロー
ンである、クローン３１；レーン５：0.64μMのMTX耐性
にまで増幅され、25pg／細胞／日のデコリンを発現する
クローンである、クローン６１。 【００２９】図２は、CHO細胞におけるデコリンコアタ
ンパクの発現を示す。レーン１および２：3H-ロイシン
で標識された培養物上澄み液を図１に説明されるように
免疫沈澱した。レーン３および４：培地に分泌される、
すべての3H-ロイシン標識産物。レーン１および３：pSV
2-Decorin/CPでトランスフェクトされたCHO細胞。レー
ン２および４：pSV2dhfrでトランスフェクトされたコン
トロールCHO細胞。 【００３０】（実施例II） 細胞の広がり(spreading)および飽和濃度の定量 実施例Ｉの細胞系を、ウェル当り３×105細胞濃度でMTX
を含まない培地中の24のウェルプレートにプレートし
た。24時間後、培地を取り換え(ウェル当り0.3ml)、細
胞を更に24時間インキュベートした。これらの培養物上
澄み液中のデコリンの濃度を競合ELISAによって決定し
た(本願で参考のために引用されているEngvall, Meth.
Enzymol. 70:419(1980))。簡単に述べると、培養物上澄
み液とデコリンに対するウサギ抗ペプチド抗体との混合
物を、ヒト胎児膜から精製したデコリンでコートしたマ
イクロタイタープレートのウェル中でインキュベートし
た(Brennanら、前出)。ウェルに結合した抗体の量を、
第２抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサ
ギIgGによって決定した。精製したデコリンの様々な濃
度を使用して標準曲線を作製した。24時間のインキュベ
ーションを行った後、血球計によって細胞の数を数え
た。 【００３１】表１に示されるように、デコリン遺伝子で
トランスフェクトされた細胞は、コントロールの細胞よ
りも広い広がりの領域を示した。デコリン発現が増幅さ
れたところでは、広がりの領域は発現が増大するととも
に増加した。 【００３２】表１はまた、デコリンを発現する細胞、お
よびコントロール細胞の飽和濃度を示す。飽和濃度を決
定するために、細胞(1.2×105)を、60mmの培養皿中のMT
Xを含まない培地にプレートした。６時間後、細胞を、3
%のパラホルムアルデヒドで固定し、トルイジン青で染
色した。拡散の定量評価を、像分析器(Olympus)の表面
集積プログラム(surface integration program)で細胞
が広がった表面領域を測定することによって行った。広
がっていない細胞を測定から除いた。50の細胞からの平
均および標準偏差値を示す。 【００３３】 【表１】【００３４】（実施例III） 培養後の培地の効果の分析 CHO細胞およびHarvey ras遺伝子で形質転換されたNIH 3
T3細胞の形態に対する、培養後の培地の影響を調べた。
これは、クローン61からの２日間培養後の培地(約20μg
/mlのデコリンを含む)およびコントロール細胞系Ｃから
の同様に培養した培地に(デコリンを含まない)、２×10
5細胞／皿の濃度で、35mmの皿中にCHO細胞をプレートす
ることによって、行われた。上記、細胞系は、実施例Ｉ
に記載のものである。 【００３５】図５は、上記の処理後のCHO細胞の形態を
示し、図６は、腫瘍遺伝子で形質転換された3T3細胞処
理後の形態を示す。観察されるように、デコリンを発現
する細胞系であるクローン31からの培養後の培地は、デ
コリンを発現する細胞自身において観察されるのと同様
の形態を誘導した。このように処理された腫瘍遺伝子で
形質転換された3T3細胞は、通常の細胞とほぼ同様の形
態を示す。この形態は、しばしば「接触抑制形態」と呼
ばれ、正常の成長の制御を示すものと思われる。この現
象によると、コントロール培地で処理された培養物と比
較してこれらの培養物中には細胞が少なかった。これら
の結果は、デコリンを発現する細胞系が、組換えデコリ
ン発現細胞自身で見られる形態上のおよび増殖の阻止効
果を生み出すことを示す。 【００３６】（実施例IV） 培養後の培地からのデコリンの精製 クローン61細胞を、9%の透析胎児ウシ血清、2mMのグル
タミン、100ユニット／mlのペニシリンおよび100μg/ml
のストレプトマイシンを補足した、ヌクレオチドを含ま
ないα-MEM培地中、8-175cm2の培養フラスコで90%の集
密度にまで増殖させた。90%の集密度となったときに、
培地を、１個のフラスコあたり6%の透析胎児ウシ血清を
補足したヌクレオシドを含まない25mlのα-MEMに変え
た。この培地は、あらかじめ0.05Mのリン酸緩衝剤、pH
7.4中の0.25MのNaClで平衡化したＤＥＡＥ セファロー
ス ファスト フロー カラム(Pharamacia)を通過させ
てある。細胞を３日間培養し、培養後の培地を採取し、
迅速に0.5mMのフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド、１μg/mlのペプスタチン、0.04mg/mlのアプロチニ
ンおよび5mMのEDTAとなるように調製した。 【００３７】400mlの培養後の培地をまず、ゼラチン−
セファロースに通過させ、繊維芽細胞およびセファロー
スに結合する物質を除去した。次いで通り抜けたフラク
ションを、50mMのTris/HCl, pH7.4および0.2MのNaCl中
で予備平衡化させたDEAE-セファロースと混合し、これ
を４℃で一晩ゆるやかに混合することによって吸収させ
た。このスラリーを、1.6cm×24cmのカラムに注ぎ、0.2
MのNaClを含む50mMのTris/HCl、pH7.4で更に洗浄し、50
mMのTris/HCl、pH7.4中、0.2M-0.8MのNaClの直線勾配で
溶離した。デコリンの濃度を、上記のように競合ELISA
によって決定した。 【００３８】図７は、DEAE-セファロースファストフロ
ーにおける溶離パターンを示す。観察されるように、デ
コリンを、培地中に存在するタンパクの塊から分離し、
最高の免疫反応を示すフラクションから実質的に純枠な
形で回収し得た。 【００３９】本発明を、好ましい実施態様を参照して説
明したが、本発明の精神を逸脱せずに様々な改変を行う
ことが可能であることは理解されなければならない。従
って、本発明は上記の特許請求の範囲によってのみ限定
される。 【００４０】 【発明の効果】本発明により、デコリンをコードする遺
伝子によってトランスフェクトされ、この遺伝子を発現
する細胞およびそれによって生産される組換えデコリン
が提供される。従って、本発明により細胞増殖を制御す
るための新しい方法が提供される。さらに、本発明によ
り、異常な細胞増殖が原因となる多数の重要な病理状態
の治療が提供される。
細胞増殖の制御に関する。 【０００２】 【従来の技術】通常の状態では、細胞の増殖は厳しく制
御された工程であり、迅速な増殖は、胚の発達および組
織の再生に必要であるが、その一方増殖は、完成された
組織においては停止されなければならない。細胞増殖
は、主として成長因子によって制御されるようである。
既知の成長因子の大半は誘発性を有し、それには、表皮
成長因子、血小板由来の成長因子、様々なインターロイ
キンおよびコロニー刺激因子が包含される。少数の細胞
増殖の負に制御する因子もまた知られている。形質転換
成長因子βは、いくつかの細胞タイプの増殖を阻止する
多機能因子であるが、増殖も刺激し得る。他の増殖阻止
物質には、様々なインターフェロンが包含され、増殖阻
止の役割はヘパリン、ヘパラン硫酸およびそれらの断片
に起因している。 【０００３】増殖制御であまりよく知られていない機構
は、細胞が近接した位置関係にあることに関する。正常
の細胞は互いに接触すると、増殖を中止する。この現象
は、通常、接触による増殖阻止として知られており、正
常な組織構造の形成には明らかに重要である。 【０００４】多数の重要な病理条件は、異常な細胞増殖
が原因となっている。このような状態の最も主要なもの
は癌である。増殖に関与する要素による他の疾病には、
滑膜組織の異常成長による慢性間接リウマチ、糸球体間
質細胞が増殖する糸球体腎炎、および異常に増殖する細
胞が平滑筋細胞である、動脈硬化症が含まれる。 【０００５】 【発明が解決しようとする課題】上記の例から、細胞増
殖を制御するための新しい方法を開発する必要があるこ
とは明白である。本発明は、この必要性について取り組
むとともに、他の関連した利点を提供する。 【０００６】 【課題を解決するための手段】本発明は、プロテオグリ
カンであるデコリン(PG-IIまたはPG-40としても知られ
る)に関する。本発明は、デコリンをコードする遺伝子
によってトランスフェクトされ、この遺伝子を発現する
細胞およびそれによって生産される組換えデコリンを提
供する。このようなトランスフェクトされた細胞培養物
の培養後の(spent)培養培地は、正常または異常細胞の
増殖を抑制するのに使用され得る。更に、精製されたデ
コリンは、細胞増殖を抑制するのに使用され得る。 【０００７】本発明は、デコリンcDNAでトランスフェク
トされた動物細胞を提供し、ここで上記デコリンは、デ
コリンの天然組成物およびその機能的特性を保持するそ
の改変物からなる群から選択され、そして上記動物細胞
は、細胞増殖阻害活性の組換えデコリンを分泌し得る。 【０００８】本発明はまた、実質的に精製された組換え
デコリンを提供し、ここで上記デコリンは、デコリンの
天然組成物およびその機能的特性を保持するその改変物
からなる群から選択され、そして上記精製組換えデコリ
ンは天然の組織源由来の精製に関連した不純物を実質的
に含有せず、細胞増殖阻害活性を有する。 【０００９】本発明はまた、成熟コアタンパク質の４位
のアミノ酸であるセリンの位置に、スレオニンを有し、
そして天然の組織源由来の精製に関連した不純物を実質
的に含有せず、細胞増殖阻害活性を有する、実質的に精
製された組換えデコリンを提供する。 【００１０】さらに、本発明は、上記の動物細胞から産
生される、上記の実質的に精製された組換えデコリンを
提供する。 【００１１】本発明はまた、上記動物細胞から産生され
る、成熟コアタンパク質の４位のアミノ酸であるセリン
の位置に、スレオニンを有し、そして天然の組織源由来
の精製に関連した不純物を実質的に含有せず、細胞増殖
阻害活性を有する実質的に精製された組換えデコリンを
提供する。 【００１２】さらに、本発明は、デコリンを産生する動
物細胞からの培養後の培地にデコリンによって抑制され
得る動物細胞を接触させることによって、上記デコリン
によって抑制され得る動物細胞の増殖を抑制する方法を
提供し、ここで上記精製組換えデコリン産生細胞は上記
動物細胞である。 【００１３】本発明はまた、本発明の実質的に精製され
た組換えデコリンと、デコリンによって抑制され得る動
物細胞とを接触させることによって、上記デコリンによ
って抑制され得る動物細胞の増殖を抑制する方法を提供
する。 【００１４】好ましい実施態様では、この方法におい
て、上記精製組換えデコリンが上記の動物細胞によって
産生される。 【００１５】さらに本発明は、増殖性疾病の治療用の薬
剤を調製するための、本発明の実質的に精製された組換
えデコリンの使用を提供する。 【００１６】好ましい実施態様では、上記使用におい
て、上記疾病は、リウマチ様関節炎、糸球体腎炎または
アテローム硬化症である。 【００１７】本発明はまた、細胞外マトリックス成分の
タイプおよび／または量に影響を与える薬剤を調節する
ための、本発明の実質的に精製された組換えデコリンの
使用を提供する。 【００１８】 【発明の実施の形態】プロテオグリカンは、１またはそ
れ以上のグリコサミノグリカン鎖を有するタンパクであ
る。既知のプロテオグリカンは様々な機能を行い、様々
な細胞部分において見いだされる。しかし、その多く
は、細胞外マトリックスの成分であり、そのマトリック
スにおいてこれらのプロテオグリカンは細胞をマトリッ
クスに組み入れたり、細胞をマトリックスに付着させた
りする働きをする。 【００１９】PG-IIまたはPG-40としても知られるデコリ
ンは、繊維芽細胞によって生産される小さなプロテオグ
リカンである。そのコアタンパクは、分子量約40,000ダ
ルトンを有する。コアは、配列決定されており(本願で
参考のために引用した、KrusiusおよびRuoslahti, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 83:7683(1986); Dayら、Bioc
hem. J. 248:801(1987))、コンドロイチン硫酸／デルマ
タン硫酸タイプの単一なグリコサミノグリカン鎖を有す
ることが知られている(本願で参考のために引用した、P
earson, ら、J. Biol. Chem. 258:15101(1983))。デコ
リンに関するすでに既知の機能は、タイプＩおよびタイ
プIIコラーゲンヘの結合、およびこのコラーゲンによる
筋原繊維の形成に対する影響のみである(Vogelら、Bioc
hem. J. 223:587(1984))。 【００２０】デコリンの分子生物学研究は、細胞増殖の
制御におけるその役割について、予想外の発見に現在達
しており、これらの発見により本発明の基礎が形成され
る。 【００２１】3T3およびCOS細胞のような他の細胞もまた
使用され得るが、デコリンcDNAは、チャイニーズハムス
ターの卵巣(CHO)細胞、好ましくはジヒドロ葉酸レダク
ターゼ(dhfr)を生産しないような細胞にトランスフェク
トされる。このようなトランスフェクションは、当該技
術分野に既知の方法によって成し遂げられる。トランス
フェクトされた細胞を、次いで培地において増殖させ
る。 【００２２】ヒトデコリンcDNAがトランスフェクトさ
れ、このcDNAからのプロテオグリカンを発現する、チャ
イニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、もとの細胞より
も基層部(substratum)により付着するようである。更
に、cDNAからのデコリンを発現する細胞の増殖を抑制す
ると、それらは様々なコントロール細胞よりも低い飽和
濃度に増殖した。これらのコントロールは、デコリンの
コアタンパクを発現する構築物でトランスフェクトさ
れ、デコリンを発現する細胞と同程度に増幅された細胞
を含んでいた。これらの細胞は、もとのCHO細胞と類似
していた。増殖および付着の変化の程度は、生産された
デコリンの量に比例していた。 【００２３】更に、付着および飽和濃度における変化
は、組換えデコリンを発現する細胞の培養後の培養培地
およびこのような培養培地から単離され、精製されたデ
コリンにおいて再現することができた。これらの発見
は、細胞増殖の制御においてデコリンが、以前には知ら
れていなかった役割を果しており、細胞増殖を調整する
のに使用され得ることを示している。腫瘍遺伝子で形質
転換された3T3細胞にて見られる効力は、本発明が増殖
性疾病の治療において有用であり得ることを示唆してい
る。 【００２４】本願で使用される、「デコリン」という用
語は、KrusiusおよびRuoslahti、前出、において、それ
であるとされる特性を有する構造的特性を有し、実施例
IIIの方法によって決定されるように、細胞増殖を抑制
するプロテオグリカンをさしていう。ヒト繊維芽細胞デ
コリンは、本願で参考のために引用されているKrusius
およびRuoslahti、前出、図２において示されるアミノ
酸配列を実質的に有する。「デコリン」は、機能的特性
を保持する天然の組成物およびその修飾物の両方をさし
ていう。 【００２５】本願で使用される用語「実質的に精製され
たデコリン」とは、実施例IVにおいて示される実験方法
によって得られる精製度をさしていう。 【００２６】本発明の組換えデコリンは、天然のプロテ
オグリカンの構造に実質的に相当する構造を有する。し
かし、制限された変形は、デコリンの活性を破壊せずに
成し遂げられ得る。 【００２７】 【実施例】（実施例Ｉ）デコリンおよびデコリンコアタ
ンパクの発現 本願で参考のために引用されているKrusiusおよびRuosl
ahti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7683(1986)にお
ける1.8kbの全長のデコリンcDNAをデコリン発現ベクタ
ーの構築に使用した。この細胞系はＡＴＣＣ（American
Type CultureCollection,12301 Parklawn Dr., Rockvi
lle MD20852 USA）に受託番号ＣＲＬ１０３３２で寄託
されている。デコリンコアタンパクを発現するために、
セリンをコードするTCTである第４コドンを、トレオニ
ンをコードするACTに変化させるというcDNAの変異を、
本願で参考のために引用されているKunkel, Proc. Nat
l.Acad. Sci USA 82:488(1985)に従って、位置特異的変
異により行った。哺乳類発現ベクターpSV2-Decorinおよ
びpSV2-Decorin/CP(core protein)を、3.4kbのpSV2のHi
ndIII-Bam HI断片(本願で参考のために引用されているM
ulliganおよびBerg,Science 209:1423(1980)に記載)に
デコリンcDNAまたは変異デコリンcDNAをそれぞれ連結さ
せることによって構築した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ
(dhfr)を産生しないCHO細胞(CHO-DG44)を、リン酸カル
シウム沈澱方法(本願で参考のために引用されているGra
ham. F. およびVan der Eb. Virology 52:456(1973))に
よってpSV2-DecorinまたはpSV2-Decorin/CPおよびpSV2d
hfrでコトランスフェクトした。トランスフェクトされ
た細胞を、9%の透析胎児ウシ血清、2mMのグルタミン、1
00ユニット／mlのペニシリンおよび100μg/mlストレプ
トマイシンを補足した、ヌクレオシドが入っていないα
改変最小必須培地(α-MEM,GIBCO, Long Island)におい
て培養した。トランスフェクトされた細胞からのコロニ
ーをクローニングシリンダで採取し、これを増殖させ(e
xpanded)、35SO4で標識した培地上澄み液による免疫沈
澱によってデコリンの発現を検査した。大量のデコリン
を発現するクローンについて、メトトレキセート(MTX,
Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601(1982))の
濃度を0.64μMに段階的に増加させることによって遺伝
子増幅を行った。増幅されたすべての細胞系を、限界希
釈法またはMTX耐性の単一コロニーを採取することによ
ってクローン化した。これらの樹立細胞系の保存培養物
をMTX含有培地中に保持した。実験に使用する前に、保
存培養物からのMTXを含まない培地中で細胞を継代培養
し、MTXの影響の可能性を除去するために、この培地の
中を少なくとも一回通過させた。コントロールは、pSV2
dhfrのみでトランスフェクトし、その後実験細胞と全く
同様に処理した。35SO4または3H-ロイシンによる細胞の
代謝標識および免疫沈澱を、本願で参考のために引用さ
れているBrennanら、J. Biol. Chem 259:13742(1984)に
説明されるように実施した。 【００２８】図１は、還元条件の下でSDS-7%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法を使用して、増幅されていな
い、および増幅されたトランスフェクタントにおけるデ
コリンの発現を示す。（Ａ）ヒトデコリンのNH2末端に
対して調製されたウサギ抗ペプチド抗血清によって免疫
沈滅した、35SO4で標識された培養物上澄み液(Krusius
およびRuoslahti、前出)。（Ｂ）培地に分泌された、35
SO4で標識されたすべての産物。（Ｃ）培地に分泌され
たすべての3H-ロイシンで標識された産物。レーン１：p
SV2dhfrでトランスフェクトされ、増幅されていないク
ローンである、コントロールのトランスフェクタント
Ａ；レーン２：コントロールのトランスフェクタントＡ
からのクローンであって、0.64μMのMTX耐性にまで増幅
されたクローンである、コントロールのトランスフェク
タントＣ；レーン３：0.2pg／細胞／日のデコリンを発
現する、増幅されていない第１トランスフェクタントで
ある、クローン１；レーン４：0.32μMのMTX耐性にまで
増幅され、4pg／細胞／日のデコリンを発現するクロー
ンである、クローン３１；レーン５：0.64μMのMTX耐性
にまで増幅され、25pg／細胞／日のデコリンを発現する
クローンである、クローン６１。 【００２９】図２は、CHO細胞におけるデコリンコアタ
ンパクの発現を示す。レーン１および２：3H-ロイシン
で標識された培養物上澄み液を図１に説明されるように
免疫沈澱した。レーン３および４：培地に分泌される、
すべての3H-ロイシン標識産物。レーン１および３：pSV
2-Decorin/CPでトランスフェクトされたCHO細胞。レー
ン２および４：pSV2dhfrでトランスフェクトされたコン
トロールCHO細胞。 【００３０】（実施例II） 細胞の広がり(spreading)および飽和濃度の定量 実施例Ｉの細胞系を、ウェル当り３×105細胞濃度でMTX
を含まない培地中の24のウェルプレートにプレートし
た。24時間後、培地を取り換え(ウェル当り0.3ml)、細
胞を更に24時間インキュベートした。これらの培養物上
澄み液中のデコリンの濃度を競合ELISAによって決定し
た(本願で参考のために引用されているEngvall, Meth.
Enzymol. 70:419(1980))。簡単に述べると、培養物上澄
み液とデコリンに対するウサギ抗ペプチド抗体との混合
物を、ヒト胎児膜から精製したデコリンでコートしたマ
イクロタイタープレートのウェル中でインキュベートし
た(Brennanら、前出)。ウェルに結合した抗体の量を、
第２抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサ
ギIgGによって決定した。精製したデコリンの様々な濃
度を使用して標準曲線を作製した。24時間のインキュベ
ーションを行った後、血球計によって細胞の数を数え
た。 【００３１】表１に示されるように、デコリン遺伝子で
トランスフェクトされた細胞は、コントロールの細胞よ
りも広い広がりの領域を示した。デコリン発現が増幅さ
れたところでは、広がりの領域は発現が増大するととも
に増加した。 【００３２】表１はまた、デコリンを発現する細胞、お
よびコントロール細胞の飽和濃度を示す。飽和濃度を決
定するために、細胞(1.2×105)を、60mmの培養皿中のMT
Xを含まない培地にプレートした。６時間後、細胞を、3
%のパラホルムアルデヒドで固定し、トルイジン青で染
色した。拡散の定量評価を、像分析器(Olympus)の表面
集積プログラム(surface integration program)で細胞
が広がった表面領域を測定することによって行った。広
がっていない細胞を測定から除いた。50の細胞からの平
均および標準偏差値を示す。 【００３３】 【表１】【００３４】（実施例III） 培養後の培地の効果の分析 CHO細胞およびHarvey ras遺伝子で形質転換されたNIH 3
T3細胞の形態に対する、培養後の培地の影響を調べた。
これは、クローン61からの２日間培養後の培地(約20μg
/mlのデコリンを含む)およびコントロール細胞系Ｃから
の同様に培養した培地に(デコリンを含まない)、２×10
5細胞／皿の濃度で、35mmの皿中にCHO細胞をプレートす
ることによって、行われた。上記、細胞系は、実施例Ｉ
に記載のものである。 【００３５】図５は、上記の処理後のCHO細胞の形態を
示し、図６は、腫瘍遺伝子で形質転換された3T3細胞処
理後の形態を示す。観察されるように、デコリンを発現
する細胞系であるクローン31からの培養後の培地は、デ
コリンを発現する細胞自身において観察されるのと同様
の形態を誘導した。このように処理された腫瘍遺伝子で
形質転換された3T3細胞は、通常の細胞とほぼ同様の形
態を示す。この形態は、しばしば「接触抑制形態」と呼
ばれ、正常の成長の制御を示すものと思われる。この現
象によると、コントロール培地で処理された培養物と比
較してこれらの培養物中には細胞が少なかった。これら
の結果は、デコリンを発現する細胞系が、組換えデコリ
ン発現細胞自身で見られる形態上のおよび増殖の阻止効
果を生み出すことを示す。 【００３６】（実施例IV） 培養後の培地からのデコリンの精製 クローン61細胞を、9%の透析胎児ウシ血清、2mMのグル
タミン、100ユニット／mlのペニシリンおよび100μg/ml
のストレプトマイシンを補足した、ヌクレオチドを含ま
ないα-MEM培地中、8-175cm2の培養フラスコで90%の集
密度にまで増殖させた。90%の集密度となったときに、
培地を、１個のフラスコあたり6%の透析胎児ウシ血清を
補足したヌクレオシドを含まない25mlのα-MEMに変え
た。この培地は、あらかじめ0.05Mのリン酸緩衝剤、pH
7.4中の0.25MのNaClで平衡化したＤＥＡＥ セファロー
ス ファスト フロー カラム(Pharamacia)を通過させ
てある。細胞を３日間培養し、培養後の培地を採取し、
迅速に0.5mMのフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド、１μg/mlのペプスタチン、0.04mg/mlのアプロチニ
ンおよび5mMのEDTAとなるように調製した。 【００３７】400mlの培養後の培地をまず、ゼラチン−
セファロースに通過させ、繊維芽細胞およびセファロー
スに結合する物質を除去した。次いで通り抜けたフラク
ションを、50mMのTris/HCl, pH7.4および0.2MのNaCl中
で予備平衡化させたDEAE-セファロースと混合し、これ
を４℃で一晩ゆるやかに混合することによって吸収させ
た。このスラリーを、1.6cm×24cmのカラムに注ぎ、0.2
MのNaClを含む50mMのTris/HCl、pH7.4で更に洗浄し、50
mMのTris/HCl、pH7.4中、0.2M-0.8MのNaClの直線勾配で
溶離した。デコリンの濃度を、上記のように競合ELISA
によって決定した。 【００３８】図７は、DEAE-セファロースファストフロ
ーにおける溶離パターンを示す。観察されるように、デ
コリンを、培地中に存在するタンパクの塊から分離し、
最高の免疫反応を示すフラクションから実質的に純枠な
形で回収し得た。 【００３９】本発明を、好ましい実施態様を参照して説
明したが、本発明の精神を逸脱せずに様々な改変を行う
ことが可能であることは理解されなければならない。従
って、本発明は上記の特許請求の範囲によってのみ限定
される。 【００４０】 【発明の効果】本発明により、デコリンをコードする遺
伝子によってトランスフェクトされ、この遺伝子を発現
する細胞およびそれによって生産される組換えデコリン
が提供される。従って、本発明により細胞増殖を制御す
るための新しい方法が提供される。さらに、本発明によ
り、異常な細胞増殖が原因となる多数の重要な病理状態
の治療が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、増幅されていない、および増幅された
トランスフェクタント(transfectant)におけるデコリン
の発現を示す電気泳動写真である。 【図２】図２は、CHO細胞におけるデコリンコアタンパ
クの発現を示すラジオグラムである電気泳動写真であ
る。 【図３】図３は、CHO細胞におけるデコリンの発現によ
って生じる形態の変化を示す生物形態写真である。 【図４】図４は、培養物中のデコリン発現細胞およびコ
ントロールのCHO細胞の増殖を示すグラフである。 【図５】図５は、培養後の培養培地のCHO細胞の形態に
対する影響を示す顕微鏡による生物形態写真である。 【図６】図６は、培養後の培養培地の、Harvey ras遺伝
子で形質転換されたNIH 3T3細胞の形態に対する影響を
示す顕微鏡による生物形態写真である。 【図７】図７は、デコリン発現細胞系であるクローン61
の培養液の培養培地の、DEAE-セファロースからの溶離
パターンを示すグラフである。
トランスフェクタント(transfectant)におけるデコリン
の発現を示す電気泳動写真である。 【図２】図２は、CHO細胞におけるデコリンコアタンパ
クの発現を示すラジオグラムである電気泳動写真であ
る。 【図３】図３は、CHO細胞におけるデコリンの発現によ
って生じる形態の変化を示す生物形態写真である。 【図４】図４は、培養物中のデコリン発現細胞およびコ
ントロールのCHO細胞の増殖を示すグラフである。 【図５】図５は、培養後の培養培地のCHO細胞の形態に
対する影響を示す顕微鏡による生物形態写真である。 【図６】図６は、培養後の培養培地の、Harvey ras遺伝
子で形質転換されたNIH 3T3細胞の形態に対する影響を
示す顕微鏡による生物形態写真である。 【図７】図７は、デコリン発現細胞系であるクローン61
の培養液の培養培地の、DEAE-セファロースからの溶離
パターンを示すグラフである。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/02
// Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ
(72)発明者 エルキ アイ． ルオスラーティ
アメリカ合衆国 カリフォルニア 92067
ランチョ サンタ フェ，ピー．オー.
ボックス 1054
(72)発明者 ユウ ヤマグチ
アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122
サン ディエゴ，ナンバー．92，デコロ
ストリート 4178
Ｆターム(参考） 4B065 AA90X BB18 BB19 CA44
4C084 AA02 BA05 DC50 NA14 ZA451
ZA811 ZA961 ZB151
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 実質的に精製された組換えデコリンを含
む、細胞外マトリックス成分のタイプおよび／または量
に影響を与える薬剤を調製するための組成物であって、
該デコリンが、デコリンの天然組成物および細胞増殖抑
制活性を有するその改変物からなる群から選択され、こ
こで該精製組換えデコリンが天然の組織源からの精製に
関連した夾雑物を実質的に含有せず、細胞増殖抑制活性
を有する、組成物。
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