JPH03503846A - デコリンによる細胞増殖の抑制 - Google Patents
デコリンによる細胞増殖の抑制Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
デフリンによる の 勺
発明の分野
本発明は、細胞生物学、特に細胞増殖の制御に関する。
発明の背景
通常の状態では、細胞の増殖は厳しく制御された工程であり、迅速な増殖は、胚
の発達および組織の再生に必要であるが、その一方増殖は、完成された組織にお
いては停止されなければならない。細胞増殖は、主として成長因子によって制御
されるようである。既知の成長因子の大半は誘発性を有し、それには、表皮成長
因子、血小板由来の成長因子、様々なインターロイキンおよびコロニー刺激因子
が包含される。少数の細胞増殖の負に制御する因子もまた知られている。形質転
換成長因子βは、い(つかの細胞タイプの増殖を阻止する多機能因子であるが、
増殖も刺激し得る。他の増殖阻止物質には、様々なインターフェロンが包含され
、増殖阻止の役割はヘパリン、ヘパラン硫酸およびそれらの断片に起因している
。
増殖制御であまりよく知られていない機構は、細胞が近接した位置関係にあるこ
とに関する。正常の細胞は互いに接触すると、増殖を中止する。この現象は、通
常、接触による増殖阻止として知られており、正常な組繊構造の形成には明らか
に重要である。
多数の重要な病理条件は、異常な細胞増殖が原因となっている。このような状態
の最も主要なものは癌である。増殖に関与する要素による他の疾病には、1骨膜
組織の異常成長による慢性間接リウマチ、糸球体間質細胞が増殖する糸球体腎炎
、および異常に増殖する細胞が平滑筋細胞である、動脈硬化症が含まれる。
上記の例から、細胞増殖を制御するための新しい方法を開発する必要があること
は明白である。本発明は、この必要性について取り組むとともに、他の関連した
利点を提供する。
発明の要旨
本発明は、プロテオグリカンであるデフリン(PG−11またはPG−40とし
ても知られる)に関する。本発明は、デフリンをコードする遺伝子によってトラ
ンスフェクトされ、この遺伝子を発現する細胞およびそれによって生産される組
換えデフリンを提供する。このようなトランスフェクトされた細胞培養物の培養
後の(spent)培養培地は、正常または異常細胞の増殖を抑制するのに使用
され得る。更に、精製されたデフリンは、細胞増殖を抑制するのに使用され得る
。
図面の簡単な説明
第1図は、増幅されていない、および増幅されたトランスフェクトント(tra
nsfectant)におけるデフリンの発現を示す。
第2図は、CIO細胞におけるデフリン コアタンパクの発現を示すラジオグラ
ムである。
第3図は、 CHO細胞におけるデフリンの発現によって生じる形態の変化を示
す。
第4図は、培養物中のデフリン発現細胞およびコントロールのCHO細胞の増殖
を示すグラフである。
第5図は、培養後の培養培地のCHO細胞の形態に対する影響を示す顕微鏡写真
である。
第6図は、培養後の培養培地の、Harvey ras遺伝子で形質転換された
Ni1(3T3細胞の形態に対する影響を示す顕微鏡写真である。
第7図は、デフリン発現細胞系であるクローン61の培養液)培養培地の、DE
AE−セファロースからの溶離パターンを示す。
発明の詳細な説明
プロテオグリカンは、1またはそれ以上のグリコサミノグリカン鎖を有するタン
パクである。既知のプロテオグリカンは様々な機能を行い、様々な細胞部分にお
いて見いだされる。
しかし、その多くは、細胞外マトリックスの成分であり、そのマトリックスにお
いてこれらのプロテオグリカンは細胞をマトリックスに組み入れたり、細胞をマ
トリックスに付着させたりする働きをする。
PG−11またはPG−40としても知られるデフリンは、繊維芽細胞によって
生産される小さなプロテオグリカンである。そのコアタンパクは、分子量約40
.000ダルトンを有する。コアは、配列決定されており(本願で参考のために
引用した、KrusiuSおよびRuoslahti、 Proc、 Natl
、 Acad、 Sci、 USA 83ニア683 (1986): Day
ら、Biochem、 J、 248:801 (19g?))、コンドロ
イチン硫酸/デルマタン硫酸タイプの単一なグリコサミノグリカン鎖を有するこ
とが知られている(本願で参考のために引用した、Pearson、ら、J、
Biol、 Chet 258:15101 (1983))。
デフリンに関するすでに既知の機能は、タイブエおよびタイプI+フラーゲンへ
の結合、およびこのコラーゲンによる筋原繊維の形成に対する影響のみである(
Vogelら、Biochem、 J。
223:587 (1984))。
デフリンの分子生物学研究は、細胞増殖の制御におけるその役割について、予想
外の発見に現在達しており、これらの発見により本発明の基礎が形成される。
3T3およびCO3細胞のような他の細胞もまた使用され得るが、デフリンcD
NAは、チャイニーズハムスターの卵巣(CHO)細胞、好ましくはジヒドロ葉
酸レダクターゼ(dhfr)を生産しないような細胞にトランスフェクトされる
。このようなトランスフェクンゴンは、当該技術分野に既知の方法によって成し
遂げられる。トランスフェクトされた細胞を、次いで培地において増殖させる。
ヒト デフリンcDNAがトランスフェクトされ、このcDNAからのプロテオ
グリカンを発現する、チャイニーズハムスター卵巣(C)to)細胞は、もとの
細胞よりも基層部(5ubstratun+)により付着するようである。更に
、cDNAからのデフリンを発現する細胞の増殖を抑制すると、それらは様々な
コントロール細胞よりも低い飽和濃度に増殖した。これらのコントロールは、デ
フリンのコアタンパクを発現する構築物でトランスフェクトされ、デフリンを発
現する細胞と同程度に増幅された細胞を含んでいた。これらの細胞は、もとのC
HO細胞と類似していた。増殖および付着の変化の程度は、生産されたデフリン
の量に比例していた。
更に、付着および飽和濃度における変化は、組換えデフリンを発現する細胞の培
養後の培養培地およびこのような培養培地から単離され、精製されたデフリンに
おいて再現することができた。これらの発見は、細胞増殖の制御においてデフリ
ンが、以前には知られていなかった役割を果しており、細胞増殖を調整するのに
使用され得ることを示している。腫瘍遺伝子で形質転換された3T3細胞にて見
られる効力は、本発明が増殖性疾病の治療において有用であり得ることを示唆し
ている。
本願で使用される、「デフリン」という用語は、KrusiusおよびRuos
lahti、前出、において、それであるとされる特性を有する構造的特性を有
し、実施例II+の方法によって決定されるように、細胞増殖を抑制するプロテ
オグリカンをさしていう。ヒト繊維芽細胞デフリンは、本願で参考のために引用
されているKrusiusおよびRuoslahti、前出、第2図において示
されるアミノ酸配列を実質的に有する。「デフリン」は、機能的特性を保持する
天然の組成物およびその修飾物の両方をさしていう。
本願で使用される用語「実質的に精製されたデコツ:/」とは、実施例[Vにお
いて示される実験方法によって得られる精製度をさしていう。
本発明の組換えデフリンは、天然のプロテオグリカンの構造に実質的に相当する
構造を有する。しかし、制限された変形は、デフリンの活性を破壊せずに成し遂
げられ得る。
実施例I
デフリンおよびデフリンコアタンパクの本願で参考のために引用されているKr
usiusおよびRuoslahti、 Proc、 Natl、 Acad、
Sci、 USA 83ニア683 (1986)における1、8kbの全長
のデフリンcDNAをデフリン発現ベクターの構築に使用した。デフリンコアタ
ンパクを発現するために、セリンをコードするTCTである第4コドンを、トレ
オニンをコードするACTに変化させるというcDNAの変異を、本願で参考の
ために引用されているKunkel、 Proc、 Natl、 Acad、
Sci USA 82:488(1985)に従って、位置特異的変異により行
った。哺乳類発現ベクターpS’/2−DecorinおよびpsV2−Dec
orin/ CP (core protein)を、3.4kbのpsV2の
Hindlll−Ban+旧断片(本願で参考のために引用されているMull
iganおよびBerg、 5cience 209:1423 (1980)
に記載)にデフリンcDNAまたは変異デフリンcDNAをそれぞれ連結させる
ことによって構築した。ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhf r)を産生しCH
O細胞(C1(0−DG44 ’)を、リン酸カルシウム沈澱方法(本願で参考
のために引用されているGraham、 FおよびVan der Eb、 V
irology 52:456 (1973))によってpSV2−Decor
inまたはpsV2−Decorin/ CPおよびpsV2dhfrでコトラ
ンスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、9%の透析胎児ラン血清、
2 mMのグルタミン、100 ユニット/mlのペニシリンおよび100μg
7m lストレプトマイシンを補足した、ヌクレオシドが入っていないα改変最
小必須培地(α−MEM、 GIBCO,Long l5land)において培
養した。トランスフェクトされた細胞からのコロニーをクローニングシリンダで
採取し、これを増殖させ(expanded)、35SOムで標識した培地上澄
み液による免疫沈澱によってデフリンの発現を検査した。
大量のデフリンを発現するクローンについて、メトトレキセ−) (MTX、
Kaufman and 5harp、 J、 Mo1. B
iol、 1.59:601 (P
982))の濃度を0.64μMに段階的に増加させることによって遺伝子増幅
を行った。増幅されたすべての細胞系を、限界希釈法またはMTX耐性の単一コ
ロニーを採取することによってクローン化した。これらの樹立細胞系の保存培養
物をMTX含有培地中に保持した。実験に使用する前に、保存培養物からのMT
Xを含まない培地中で細胞を継代培養し、MTXの影響の可能性を除去するため
に、この培地の中を少なくとも一回通過させた。コントロールは、psV2dh
frのみでトランスフェクトし、その後実験細胞と全く同様に処理した。35S
o4または3トロイシンによる細胞の代謝標識および免疫沈澱を、本願で参考の
ために引用されているBrenr+anら、J、 Biol、 Che+* 2
59:13742(1984)に説明されるように実施した。
第1図は、還元条件の下で5DS−7%ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を使
用して、増幅されていない、および増幅されたトランスフェクトントにおけるデ
フリンの発現を示す。(A)ヒトデコリンのNH2末端に対して調製されたウサ
ギ抗ペプチド抗血清によって免疫沈澱した、35SO4で標識された培養物上澄
み液(KrusiusおよびRuoslahti、前出)。 (B)培地に分泌
された、35S□、で標識されたすべての産物。(C)培地に分泌されたすべて
の3H−ロイシンで標識された産物。レーン1: psV2dhfrでトランス
フェクトされ、増幅されていないクローンである、コントロールのトランスフエ
クタントA;レーン2:コントロールのトランスフェクトントAからのクローン
であって、0.64μMのMTX耐性にまで増幅されたクローンである、コント
ロールのトランスフエクタントC;レーン3:0.2pg/細胞/日のデフリン
を発現する、増幅されていない第1トランスフエクタントである、クローン1;
レーン4:0゜32μMのMTX耐性にまで増幅され、4 pg/細胞7日のデ
フリンを発現するクローンである、クローン31;レーン5:0.64μMのM
TX耐性にまで増幅され、25 pg/細胞/ヨのデフリンを発現するクローン
である、クローン61゜
第2図は、CHO細胞におけるデフリンコアタンパクの発現を示す。レーン1お
よび2:3H−ロイシンで標本された培養物上澄み液をヌ1図に説明されるよう
に免疫沈澱した。レーン3および4:培地に分泌される、すべての3H−ロイシ
ン標識産物。レーン1および3: pSV2−Decorin/CPでトランス
フェクトされたCHO細胞。レーン2および4 : psV2dhfrでトラン
スフェクトされたコントロールCHO細胞。
実施例11
の広が 5re2din および ゛ の実施例Iの細胞系を、ウェル当
り3 X 105細胞濃度でMTXを含まない培地中の24のウェルプレートに
プレートした。24時間後、培地を取り換え(ウェル当り0.3+ol)、細胞
を更に24時間インキュベートした。これらの培養物上澄み液中のデフリンの濃
度を競合ELISAによって決定したく本願で参考のために引用されているEn
gvall、 Meth、 Enzymol、 70:419 (1980>)
。
闇単に述べると、培養物上澄み液とデフリンに対するウサギ抗ペプチド抗体との
混合物を、ヒト胎児膜から精製したデフリンでコートしたマイクロタイタープレ
ートのウェル中でインキュベートした( Brennanら、前出)。ウェルに
結合した抗体の量を、第2抗体としてアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ
IgGによって決定した。精製したデフリンの様々な濃度を使用して標準曲線を
作製した。24時間のインキュベーシヨンを行った後、血球計によって細胞の数
を数えた。
表Iに示されるように、デフリン遺伝子でトランスフェクトされた細胞は、コン
トロールの細胞よりも広い広がりの領域を示した。デフリン発現が増幅されたと
ころでは、広がりの領域は発現が増大するとともに増加した。
表工はまた、デフリンを発現する細胞、およびコントロール細胞の飽和濃度を示
す。飽和濃度を決定するために、細胞(1,2X 105)を、60 m+*(
7)培養皿中(7)MTXを含まない培地にプレートした。6時間後、細胞を、
3%のパラホルムアルデヒドで固定し、トルイジン青で染色した。拡散の定量評
価を、像分析器(Olympus)の表面集積プログラム(surface i
ntegration prograIll)で細胞が広がった表面領域を測定
することによって行った。広がっていない細胞を測定から除いた。5oの細胞か
らの平均および標準偏差値を示す。
(L゛X7:体白う
表I
デフリンの産生およびトランスフェクタントの広がりMTX テ′コ
リン 飽和り叶ン トランスフェクノlン
耐性 産生 広がり領域 濃度(μM) (μg/10’ (
μM2/細胞) (x 1O−5)細胞7日)
コントロール pSV2dhfr 0−32 0 25
85±693 10.4±2.5ラインB
コントロール pS’/2dhfr O,6402659±586
10.6±1.8ラインC
+ psV2dhfr
実施例II+
立 ′の立地の の
CHO細胞および1(arvey ras遺伝子で形質転換されたNIH3T3
細胞の形態に対する、培養後の培地の影響を調べた。これは、クローン61から
の2日間培養後の培地(約20μg/m lのデフリンを含む)およびコントロ
ール細胞系Cからの同様に培養した培地に(デフリンを含まない)、2 X 1
05細胞/皿の濃度で、35mmの血中にCHO細胞をプレートすることによっ
て、行われた。上記、細胞系は、実施例Iに記載のものである。
第5図は、上記の処理後のC1(O細胞の形態を示し、第6図は、膿瘍遺伝子で
形質転換された3T3細胞処理後の形態を示す。観察されるように、デフリンを
発現する細胞系であるクローン31からの培養後の培地は、デフリンを発現する
細胞自身において観察されるのと同様の形態を誘導した。このように処理された
腫瘍遺伝子で形質転換された3T3細胞は、通常の細胞とほぼ同様の形態を示す
。この形態は、しばしば「接触抑制形態」と呼ばれ、正常の成長の制御を示すも
のと思われる。この現象によると、コントロール培地で処理された培養物と比較
してこれらの培養物中には細胞が少なかった。これらの結果は、デフリンを発現
する細胞系が、組換えデコリン発現細胞口身で見られる形態上のおよび増殖の阻
止効果を生み出すことを示す。
実施例IV
立後の立地からのデフリンの ′
クローン61細胞を、9%の透析胎児ウシ血清、2 mMのグルタミン、100
ユニツト/mlのペニシリンおよび100μg/m 1のストレプトマイシンを
補足した、ヌクレオチドを含まないα−MEM培地中、8−175 am2の培
養フラスコで90%の集密度にまで増殖させた。90%の集密度となったときに
、培地を、1個のフラスコあたり6%の透析胎児ウシ血清を補足したヌクレオシ
ドを含まない25m1のα−MEMに変えた。この培地は、あらかじめ0.05
Mのリン酸緩衝剤、pH7,4中の0.25MのNaC1で平衡化したDEAE
セファロース ファスト )ロー カラム(Pharamacia)を通過
させである。細胞を3日間培養し、培養後の培地を採取し、迅速に0.5mMの
フェニルメチルスルホニルフルオライド、1Mg/mlのペプスタチン、0.0
4 mg/mlのアプロチニンおよび51WMのE DTAとなるように調製し
た。
400m1の培養後の培地をまず、ゼラチン−セファロースに通過させ、繊維芽
細胞およびセファロースに結合する物質を除去した。次いで通り抜けたフラク/
ヨンを、50 mMのTris/HC1、pH1,4および0.2MのNaC1
中で予備平衡化させたDEAE−セファロースと混合し、これを4’Cで一晩ゆ
るやかに混合することによって吸収させた。このスラリーを、1.6 cIII
X 24 crr+のカラムに注ぎ、0.2MのNaClを含む50 n+Mの
Tris/HCI、 pH7,4で更に洗浄し、50 o+MのTris/H
CI、 pH7,4中、0.2 M−0,8MのNaC1の直線勾配で溶離し
た。デフリンの濃度を、上記のように競合ELISAによって決定した。
第7図は、DEAE−セファロース ファスト フローにおける溶離パターンを
示す。観察されるように、デフリンを、培地中に存在するタンパクの塊から分離
し、最高の免疫反応を示すフラクションから実質的に純粋な形で回収し得た。
本発明を、好ましい実施態様を参照して説明したが、本発明の精神を逸脱せずに
様々な改変を行うことが可能であるこは理解されなければならない。従って、本
発明は、以下の請求項によってのみ限定される。
l II+ 1−′)′jI1ml#。
寸 1
FIGURE 2
FIGURE 5
FIGLrRE 6
デ′7ノ、/(μg/mす
Claims (7)
- 1.デコリンcDNAでトランスフェクトされた細胞。
- 2.請求項1の細胞によって産生された組換えデコリン。
- 3.実質的に精製されたデコリン。
- 4.デコリンを産生する細胞からの培養後の培地に細胞を接触させることによっ て、該細胞の増殖を抑制する方法。
- 5.前記デコリンを産生する細胞が請求項1の細胞である、請求項4に記載の方 法。
- 6.実質的に精製されたデコリンに細胞を接触させることによって、該細胞の増 殖を抑制する方法。
- 7.前記精製されたデコリンが組換え手段によって産生される、請求項6に記載 の方法。
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