KR101782632B1 - 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물 또는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 암 치료용 조성물은 종래에 항암제로 사용되고 있는 세툭시맙에 대해 내성을 갖는 종양 세포의 성장 억제 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 조성물은 암, 특히 항암제에 내성을 갖는 암의 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF CANCER COMPRISING ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR}

본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 170 kDa의 제1형 막 단백질로서, 다양한 종류의 종양에서 과잉 발현되는 것으로 알려져 있다. 표피 성장 인자 수용체의 과잉발현은 암인 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부암, 경부암, 난소암 및 전립선암에서 관찰된다. 표피 성장 인자 수용체가 과잉 발현된 종양 세포는 표피 성장 인자 수용체의 리간드인 표피 성장 인자(EGF) 및 형질전환 성장 인자-α(TGF-α)를 생산한다. 이때, 상기 리간드는 표피 성장 인자 수용체에 결합하여 세포 증식과 종양 성장을 유도한다. 따라서, 표피 성장 인자 수용체에 대한 항체를 사용하여 표피 성장 인자 수용체에 표피 성장 인자가 결합하는 것을 저해하면 암세포의 성장을 억제하여 암을 치료할 수 있으며, 이는 표피 성장 인자 수용체에 대한 단일 클론 항체를 대상으로 하여 이미 실험적으로 증명되었다.

현재 임상 분야에서 표피 성장 인자 수용체에 대한 항체로 암 치료에 사용되고 있는 C225 항체(제품명: Erbitux; ImClone사, 미국)는 KRAS 유전자에 돌연변이를 갖는 환자에게서는 그 효과가 현저히 감소하는 것이 잘 알려져 있어, 상기 항체를 대체할 수 있는 개선된 치료용 항체의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 본 발명에 따른 항체를 포함하는, 항암제에 내성을 갖는 암의 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 항체를 이용하여 항암제에 내성을 갖는 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체 및 항암제를 이용한 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고, 상기 항체가, a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항암제에 내성을 갖는 암의 치료 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 또한 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항암제를 투여하는 1차 투여 단계, 및 상기 본 발명에 따른 항체를 투여하는 2차 투여 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 암 치료용 조성물 또는 암 치료 방법은 종래에 항암제로 사용되고 있는 세툭시맙에 대해 내성을 갖는 종양 세포의 성장 억제 활성을 나타낸다. 따라서, 상기 조성물 또는 치료 방법은 암, 특히 항암제에 내성을 갖는 암의 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 KRAS 변이 대장암 세포주인 SW48 G12C(A) 또는 SW48 G13D(B)에서, 본 발명의 일 실시예에서 제조된 항-EGFR 항체인 GC1118의 항종양 효과를 확인한 그래프이다.
도 2는 세툭시맙에 내성을 갖는 SW48 G12C 종양 모델에서, 세툭시맙과 본 발명의 일 실시예에서 제조된 GC1118을 순차적으로 투여하였을 때 항종양 효과를 확인한 그래프이다.
도 3은 약물의 교차 투약에 따른 항종양 효과를 확인하기 위하여, SW48 G13D 종양 모델에서 세툭시맙 또는 GC1118을 투여하다가 중단한 시점의 종양 부피를 확인한 그래프이다.
도 4는 세툭시맙 또는 GC1118을 투여하다가 중단한 SW48 G13D 종양 모델에서, 2차 투여약물로 약물을 교차 투여하였을 때 항종양 효과를 확인한 그래프이다.
도 5는 1차 및 2차 투여약물로 세툭시맙(Ce)을 투여받아 세툭시맙에 대한 내성을 갖는 SW48 G13D 종양 모델에서, 본 발명의 일 실시예에서 제조된 GC1118(GC)을 투여하였을 때 항종양 효과를 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고, 상기 항체가, a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 상보성 결정 영역(CDR)1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 항체는, a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역일 수 있다. 한편, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 공지된 인간 항체의 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역일 수 있고, 구체적으로 상기 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역은 각각 서열번호 11 또는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 EGFR의 과발현에 의해 발생하는 암의 치료에 사용될 수 있다. EGFR의 과발현에 의해 발생하는 암은 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부암, 경부암, 난소암, 전립선암, 대장암 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 항암제에 내성을 갖는 암일 수 있다.

상기 항암제는 EGFR을 표적으로 하는 항암제일 수 있고, 이의 구체적인 예로는 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 네시투무맙(necitumumab) 등이 있다.

한편, 본 발명에 따른 조성물은 항암제를 더 포함할 수 있으며, 상기 항암제는 상술한 바와 같다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에 따른 항체는, 세툭시맙 또는 파니투무맙에 내성을 나타내는 KRAS 돌연변이 종양 세포에서 종양의 성장을 유의적으로 억제함으로써, 단독 또는 상기 EGFR을 표적으로 하는 항암제와 함께 병용으로 투여하여 암의 치료에서 시너지 효과를 낼 수 있다.

본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물은, 본 발명의 항체에 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 항암제에 내성을 갖는 암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 상기 서술한 바와 같다.

상기 항암제는 EGFR을 표적으로 하는 항암제일 수 있다. 구체적으로, 상기 항암제는 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙 또는 네시투무맙일 수 있고, 더 구체적으로 세툭시맙 또는 파니투무맙일 수 있다. 또한, 상기 암은 EGFR의 과발현에 의해 발생하는 암일 수 있고, 구체적으로 항암제에 내성을 갖는 암일 수 있다.

본 발명에 따른 항체의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택가능하다. 또한, 상기 항체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.

상기 항체를 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는, 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비내, 정맥 내 투여가 있다.

상기 투여는 2주일에 1회 이상, 구체적으로 2주일에 1 내지 4회로 나누어 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 투여는 1주일에 1 내지 2회, 또는 2주일에 1회일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 투여는 1주일에 2회로 나누어 투여될 수 있다. 상기 투여시, 투여량은 체중 1 ㎏ 당 1 내지 50 ㎎, 구체적으로 1 내지 20 ㎎일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 투여량은 체중 1 ㎏ 당 10 ㎎일 수 있다. 상기 언급된 범위보다 적은 투여량이 보다 적합할 수도 있고, 해로운 부작용을 일으키지 않으면서도 보다 많은 투여량이 사용될 수도 있으며, 보다 많은 투여량의 경우는 하루에 걸쳐 수회의 적은 투여량으로 분배되어 투여될 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 항암제를 투여하는 1차 투여 단계, 및 상기 본 발명에 따른 항체를 투여하는 2차 투여 단계를 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 암의 치료 방법은 상기와 같은 항체 또는 항암제를 포함할 수 있으며, 구체적인 투여 용량, 방법, 횟수 등은 상기 서술한 바와 같다.

본 발명에 따른 암의 치료 방법은 약물의 교차 투여를 통해, 특정 약물에 내성을 갖거나 재발한 암을 치료하는데 있어서 시너지 효과를 제공할 수 있다.

상기 1차 및 2차 투여는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 상기 1차 및 2차 투여가 순차적인 경우, 투여 간격은 1 내지 50일, 구체적으로 3 내지 36일 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명에 따른 항체는, 세툭시맙을 1차로 투여하여, 상기 약물에 대해 내성을 획득한 종양 모델에서도 이의 성장을 억제하는 효과를 갖는다. 특히, 1차 및 2차로 세툭시맙을 투여하여 세툭시맙에 대해 내성을 갖는 종양 모델에서도 3차로 본 발명에 따른 항체를 투여하였을 때 종양의 성장을 억제하는 효과를 나타냄으로써, 공지된 항-EGFR 항체에 의한 항암 기전과는 상이한 기전을 통해 종양의 성장을 억제하는 것을 알 수 있다.

따라서, 상기 항체는 화학요법으로 암을 치료한 환자에서 재발된 암의 치료에도 사용될 수 있다.

본 발명은 1차 투여약물로써 본 발명에 따른 항체 또는 항암제를 포함하고, 2차 투여약물로써 상기 본 발명에 따른 항체를 포함하는 암 치료용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 암 치료용 키트는 상기와 같은 항체 또는 항암제를 포함할 수 있으며, 구체적인 투여 용량, 방법, 횟수 등은 상기 서술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 항- EGFR 항체의 선별 및 제조

표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 사람 골수 RNA, 사람 흉선 RNA, 사람 비장 RNA 및 사람 B 세포 RNA를 혼합하여 항체 유전자 라이브러리를 구축하였다. 상기 RNA 유전자 라이브러리로부터 분리한 RNA 유전자를 주형으로 cDNA를 합성한 뒤, 상기 cDNA를 주형으로 각각 scFv 영역, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 맞게 고안된 프라이머를 사용하여 항체 DNA를 합성하였다. 상기 합성된 항체 DNA를 파아지-디스플레이 벡터 pKS4H에 삽입하여 항체 DNA 라이브러리를 제작하였다. 그 후, 상기 항체 DNA 라이브러리로 표피 성장 인자 수용체에 결합하는 항체를 패닝 기법으로 선별하였다. 패닝은 4회 수행되었고, 최종 선별된 DNA 라이브러리를 포함하는 콜로니로부터 항체의 발현을 유도하였다. 이때, 항체의 발현 여부는 표피 성장 인자 수용체가 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 ELISA로 측정하였다.

상기 과정으로 선별된 항체 단편을 완전한 형태의 면역글로불린으로 제조하기 위하여 녹십자사의 항체 발현 벡터인 pRC13 및 pKC12(B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간 항체의 가변영역을 삽입할 수 있는 항체발현 플라스미드, 대한민국 등록특허 제10-523732호 참조; 기탁번호 KCLRF-BP-00054)를 사용하였다. 상기 벡터에 삽입된 항체 단편은 CHO 세포에 도입되어 완전한 형태의 면역글로불린으로 발현되었고, 이렇게 발현된 항체는 단백질 A-아가로스 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech, 미국)으로 정제되었다(구체적인 항체의 선별 및 제조방법은 대한민국 등록특허 제10-0092401호에 기재된 바와 같다).

그 결과, 선별 및 제조된 항체를 GC1118이라고 명명하였다. 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변 영역을 포함하고 있다.

실험예 1. 항- EGFR 항체의 단독 투여에 의한 항종양 효과 확인

상기 실시예 1에서 선별된 항-EGFR 항체인 GC1118의 항종양 효과를 확인하였다. 항종양 효과 확인 시, 약물 투약을 중단하지 않음에도 치료 효과가 관찰되지 않은 경우 약물에 대한 내재적 저항을 지닌다고 하였다. 또한, 약물 투약을 중단한 뒤 재발한 종양에 다시 약물을 투약했을 때 치료 효과를 보이지 않는 경우에는 획득성 저항이라고 하였다.

먼저 KRAS 단백질(서열번호 13)의 G12C 또는 G13D에 변이가 있는, 변이 대장암 세포주인 SW48 G12C 또는 SW48 G13D 세포(X-man isogenic cell lines, Cambridge, UK)는 10% 우태아혈청(Life Technologies, USA) 및 0.4 ㎎/㎖의 G-418(Invitrogen, USA)을 첨가한 RPMI1640 배지에서 계대 배양하였다. 상기 세포가 약 80%의 밀집도(confluency)로 배양되었을 때쯤, 상기 세포에 트립신을 처리하여 세포를 부유화시키고, 이를 모아 2,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 배양액을 제거하고 우태아혈청 및 G-418이 포함되지 않은 RPMI1640 배지로 다시 부유화시키고, 다시 원심분리하여 배지를 제거하였다. 이와 같은 과정을 2번 반복한 뒤, 세포 농도가 1x10⁸ cell/㎖가 되도록 RPMI1640 배지로 부유화시켰다. 상기 농도의 세포 100 ㎕를 26 게이지의 주사기를 이용하여 6 내지 7 주령의 누드 마우스의 옆구리 피하에 접종하였다. 2 내지 3일 간격으로 종양 크기를 관찰하여 종양의 생착 및 성장을 확인하였고, 종양 용적은 장축x단축²x0.523의 계산식으로 측정하였다.

상기 식으로 계산된 종양 용적이 100 내지 200 ㎣에 도달하였을 때, 세툭시맙, 파니투무맙 또는 GC1118을 주 2회 10 ㎎/㎏의 양으로 복강 투여하여 항종양 효과를 평가하였다.

상기 항-EGFR 항체를 투여한 뒤, 종양의 성장율을 확인한 결과를 도 1에 나타내었다. 종양 성장율(relative tumor volume, RTV %)은 V0 대비 Vx 백분율로 계산하였다. Vx는 효과 측정 시점에서 종양의 부피를 나타내고, V0는 실험 시작 시점의 종양 부피이다. 각 그룹의 상대 종양 발달률(T/C %)은 측정시점에서 PBS 그룹의 종양 성장율 대비 각 그룹의 종양 성장율의 백분율로 계산하였다. 최종적으로 약물에 의한 종양 억제율은 100에서 상대 종양 발달률을 제한 값을 나타낸다.

그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이 SW48 G12C 종양 모델에 세툭시맙 또는 파니투무맙을 투여하였을 때, 투여 28일 이후부터 종양의 성장율이 급격히 증가하여 종양 억제 효과가 확인되지 않았다. 한편, 투여 28일까지 세툭시맙 및 파니투무맙의 종양 억제율은 각각 58.3% 및 57.5%였으나, 투여 65일에는 상기 두 약물의 종양 억제율이 각각 16.7% 및 14%로 감소하였다. 그러나, GC1118의 종양 억제율은 투여 28일에 66.5%였고, 투여 65일에도 74.2%로 해당 모델에서 저항성이 나타나지 않았다. 따라서, SW48 G12C 종양 모델은 세툭시맙 및 파니투무맙에 대해 내재적 저항을 보였다.

한편, 도 1B에 나타난 바와 같이, SW48 G13D 종양 모델에서는 세툭시맙 및 GC1118에서 통계적으로 유의한 종양 억제 효과가 확인되었다. 상기 두 종류의 약물이 모두 SW48 G13D 종양 모델에서 종양의 크기를 억제하였고, 이는 투여 종료시점에서도 97%의 높은 억제율을 나타내었다.

실험예 2. 세툭시맙 투여 후, GC1118 또는 파니투무맙의 투여에 의한 항종양 효과 확인

상기 실험예 1에서 투여 28일 이후부터 세툭시맙의 항종양 효과가 감소하는 것을 확인함으로써, 투여 22일부터 세툭시맙대신 GC1118 또는 파니투무맙을 주 2회 10 ㎎/㎏의 양으로 복강 투여하였을 때 항종양 효과를 확인하였다.

먼저, 실험은 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하였고, 투여 28일 전에는 세툭시맙을 투여하다가, 투여 28일 이후에는 GC1118 또는 파니투무맙을 투여하였다.

그 결과, 각 그룹의 상대종양 발달율을 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.

투여일	상대종양 발달율(%)
	PBS 투여그룹	세툭시맙 투여그룹	파니투무맙 투여그룹	GC118 투여그룹	세툭시맙→파니투무맙 투여그룹	세툭시맙→GC118 투여그룹
0	100	100	100	100	100	100
4	100	87.07	83.33	98.21	88.89	80.77
7	100	62.91	71.98	96.57	60.44	81.94
11	100	44.42	47.15	60.01	49.88	47.09
15	100	50.91	44.55	54.56	44.55	51.40
19	100	38.30	39.67	36.52	38.02	40.61
22	100	39.09	37.53	33.10	38.00	40.00
25	100	44.64	45.57	30.62	43.40	54.09
28	100	41.66	42.46	33.55	58.17	66.15
35	100	61.89	65.61	31.27	70.17	41.57
40	100	73.65	67.72	34.03	85.29	51.92
44	100	72.58	71.79	30.95	76.39	38.13
49	100	66.53	60.44	27.70	58.86	29.21
56	100	73.02	74.96	24.40	65.59	35.23
65	100	83.28	85.96	25.77	71.38	26.43

상기 표 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 투여 28일까지 종양의 성장을 약 60%로 억제하던 세툭시맙의 효과가 28일 이후에는 감소하였다. 반면, 투여 28일 이후부터 GC1118을 투여하는 경우, 투여 65일에도 73.6%로 종양의 성장 억제 효과가 유의적으로 유지되었다. 한편, 세툭시맙을 투여하다 투여 28일 이후부터 파니투무맙을 투여하는 경우에는 항종양 효과가 유지되지 않고, 투여 65일에는 28.6%로 감소하였다.

따라서, 상기로부터 세툭시맙에 대해 내재적 저항을 보이는 종양의 성장을 억제하기 위하여 GC1118을 사용하거나, 세툭시맙을 초기에 사용하고, 치료 반응성이 나빠지는 시점에서 GC1118로 약물을 변경하면 유의한 치료효과를 기대할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 3. 획득성 저항성을 보이는 대장암 모델에서 약물 교차 투약에 따른 항종양 효과 확인

상기 실험예 1에서 세툭시맙에 대해 저항성을 보이지 않은 SW48 G13D 종양 모델에 세툭시맙 또는 GC1118을 주 2회 10 ㎎/㎏의 양으로 복강 투여하였다. 그 후, 도 3에 나타난 바와 같이, 투여 41일에 종양조직이 98% 이상 억제되었을 때 약물 투여를 중단하였다.

약물의 투여가 중단된 종양은 다시 자라기 시작하여 77일에는 종양 크기가 평균 231 내지 308 ㎣에 도달하였다. 상기 성장한 종양을 하기 표 2에 나타난 바와 같이 각각 두 개의 그룹으로 나누어 각각 세툭시맙 또는 GC1118을 주 2회 10 ㎎/㎏의 양으로 복강 투여하였다.

그룹	평균 종양 크기(㎣)	개수
세툭시맙→GC1118	254	8
세툭시맙→세툭시맙	231	60
GC1118→GC1118	308	8
GC1118→세툭시맙	296	5

먼저, 세툭시맙을 41일 동안 투여한 뒤, 77일까지 약물 투여를 중단하여 다시 자란 종양에 세툭시맙 또는 GC1118을 투여한 경우의 평균 종양 크기를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

평균 종양 크기(㎣)	77일	143일	146일	149일	153일
세툭시맙→세툭시맙	231	1215	1245	1335	1548
세툭시맙→GC1118	254	479	460	568	625

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 세툭시맙을 투여한 뒤 다시 자란 종양에 세툭시맙을 다시 투여한 경우 종양의 성장이 억제되지 않고, 계속 증가하여 153일째 종양의 크기는 재투약시점인 77일을 기준으로 약 6.7배 증가하였다. 반면, GC1118을 투여한 경우에는 종양의 크기가 약 2.4배 증가하여, 2차로 GC1118을 투여하였을 때 종양의 성장이 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다.

상기 결과로부터 세툭시맙을 1차로 투여한 뒤, 재발한 종양은 세툭시맙에 대해 획득성 저항을 나타내는 것을 알 수 있었다. 따라서, 재발한 종양에 세툭시맙을 다시 투여하였을 때는 세툭시맙에 의한 항종양 효과가 나타나지 않았다. 그러나, 재발한 종양에 GC1118을 처리한 경우에는 항종양 효과가 나타났고, 이로부터 1차로 세툭시맙을 사용한 뒤 재발한 종양의 치료에 GC1118이 유의적인 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

한편, GC1118을 41일 동안 투여한 뒤, 77일까지 약물 투여를 중단하여 다시 자란 종양에 세툭시맙 또는 GC1118을 주 2회 10 ㎎/㎏의 양으로 복강 투여한 경우의 평균 종양 크기를 하기 표 4 및 도 3에 나타내었다.

평균 종양 크기(㎣)	77일	143일	146일	149일	153일
GC1118→세툭시맙	296	880	874	985	1182
GC1118→GC1118	308	205	195	230	244

상기 표 4 및 도 3에 나타난 바와 같이, GC1118을 투여한 뒤 다시 자란 종양에 세툭시맙을 투여한 경우에는 평균 종양 크기가 약 4배 증가한 반면, 다시 자란 종양에 GC1118을 다시 투여한 경우에는 종양의 크기가 약 21% 감소하였다. 이로부터 재발한 종양이, 1차로 투여된 GC1118에 대해서 획득성 저항을 나타내지 않았음을 알 수 있다.

한편, 각 투여 시점에 따른 종양 크기를, 77일째를 기준으로 백분율 값으로 표 5에 나타내었다.

(77일=100%)	77일	143일	146일	149일	153일
세툭시맙→세툭시맙	100	526	539	578	670
GC1118→세툭시맙	100	297	295	333	399
세툭시맙→GC1118	100	188	181	223	246
GC1118→GC1118	100	66	63	75	79

표 5에 나타난 바와 같이, 1차로 GC1118을 투여하고, 재발한 종양에 세툭시맙을 투여한 경우는, 상기 표 3의 결과에서 1차로 세툭시맙을 투여하고, 재발한 종양에 GC1118을 투여한 경우와 유사한 결과를 보였다.

결론적으로, 세툭시맙을 투여하고 재발한 종양은 획득성 저항이 관찰되었고, 여기에 GC1118을 투여하였을 때 항종양 효과를 확인할 수 있었다. 반면, GC1118을 투여하고 재발한 종양은 획득성 저항이 관찰되지 않았으며, 2차로 투여한 GC1118 및 세툭시맙이 모두 유의적인 효과를 나타내었다.

따라서, 같은 EGFR을 표적하는 항체라도, GC1118은 세툭시맙 또는 파니투무맙과 저항성을 유발하는 성격이 다른 특성을 보이기 때문에, 세툭시맙을 지속적으로 사용하여 내성이 생긴 종양 세포에서도 우수한 항종양 효과를 나타낼 수 있다.

실험예 4. 3차 투여약물로서 GC1118 의 항종양 효과 확인

상기 실험예 3에서 1차 및 2차로 세툭시맙을 투여한 종양 모델에서 평균 종양 크기가 407 내지 438 ㎣인 개체를 선별하여, 하기 표 6에 나타난 바와 같이 통계적으로 유의한 차이가 없도록 두 그룹으로 나누었다. 그 후, 두 그룹에 3차로 GC1118 또는 세툭시맙을 주 2회 10 ㎎/㎏의 양으로 복강 투여하여 항종양 효과를 확인하였다.

그룹	평균 종양 크기(㎣)	개수
세툭시맙→세툭시맙→세툭시맙	438	9
세툭시맙→세툭시맙→GC1118	407	9

그 결과, GC1118 또는 세툭시맙의 투여에 따른 평균 종양 크기 변화를 표 7 및 도 5에 나타내었고, 각 투여 시점에 따른 종양 크기를, 153일째를 기준으로 백분율 값으로 표 8에 나타내었다.

평균 종양 크기(㎣)	153일	188일	192일	195일	202일
세툭시맙→세툭시맙→세툭시맙	438	1831	1982	2322	2301
세툭시맙→세툭시맙→GC1118	407	718	738	837	878

(153일=100%)	153일	188일	192일	195일	202일
세툭시맙→세툭시맙→세툭시맙	100	418	452	530	525
세툭시맙→세툭시맙→GC1118	100	176	181	206	216

상기 표 7 및 도 5에 나타난 바와 같이, 3차 약물로 세툭시맙을 투여한 그룹의 경우 투여 시작 시점에 평균 438 ㎣였던 평균 종양 크기가 종료 시점인 202일째에는 2301 ㎣로 성장하였다. 반면, GC1118을 투여한 경우 407 ㎣였던 종양크기가 종료 시점에는 878 ㎣으로 성장하였다.

또한, 표 8에 나타난 바와 같이, 세툭시맙을 투여한 그룹과 비교하여 GC1118을 투여한 그룹의 상대 종양 발달율(T/C %)은 41.14%로서, 세툭시맙보다 GC1118을 투여했을 때 더 유의적인 항종양 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

<110> GREEN CROSS Corporation MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF CANCER COMPRISING ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR <130> FPD/201512-0001 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of heavy chain variable region of human antibody <400> 1 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 2 of heavy chain variable region of human antibody <400> 2 Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 3 of heavy chain variable region of human antibody <400> 3 His Gly Ser Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of light chain variable region of human antibody <400> 4 Arg Ser Asn Gln Asp Leu Thr His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 2 of light chain variable region of human antibody <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 3 of light chain variable region of human antibody <400> 6 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of human antibody <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Ser Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala Trp Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of human antibody <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Asp Leu Thr His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of light chain variable region of human antibody <400> 9 Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Met Gly Ile Gly Asn Asn Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of human antibody <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Met Gly 20 25 30 Ile Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 11 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region of human antibody <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 12 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region of human antibody <400> 12 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 13 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly His Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Asp Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Lys His Lys Glu Lys Met Ser Lys Asp Gly Lys Lys 165 170 175 Lys Lys Lys Lys Ser Lys Thr Lys Cys Val Ile Met 180 185

Claims (21)

1. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고,
   상기 항체가,
   서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
   을 포함하는, 암을 치료하기 위한 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 항체가,
   서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 암이 항암제에 내성을 갖는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 항암제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 항암제가 EGFR을 표적으로 하는 항암제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 항암제가 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 니모투주맙(nimotuzumab) 또는 네시투무맙(necitumumab)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
7. EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 투여하는 단계를 포함하고,
   상기 항체가,
   서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
   을 포함하는, 인간을 제외한 동물에서 항암제에 내성을 갖는 암의 치료 방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 항암제가 EGFR을 표적으로 하는 항암제인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 항암제가 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙 또는 네시투무맙인 것을 특징으로 하는, 방법.
   
10. 제7항에 있어서, 2주일에 1 내지 4회 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
11. 제10항에 있어서, 1주일에 1 내지 2회 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
12. 제10항에 있어서, 2주일에 1회 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
13. 제7항에 있어서, 투여량은 체중 1 ㎏ 당 1 내지 20 ㎎인 것을 특징으로 하는, 방법.
    
14. EGFR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항암제를 투여하는 1차 투여 단계, 및
    EGFR에 특이적으로 결합하는 상기 항체를 투여하는 2차 투여 단계를 포함하고;
    상기 항체가,
    서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
    을 포함하는, 인간을 제외한 동물에서 암의 치료 방법.
    
15. 제14항에 있어서, 상기 2차 투여는 1차 투여 후 1 내지 50일의 간격을 두고 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
16. 제14항에 있어서, 상기 항암제가 EGFR을 표적으로 하는 항암제인 것을 특징으로 하는, 방법.
    
17. 제16항에 있어서, 상기 항암제가 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙 또는 네시투무맙인 것을 특징으로 하는, 방법.
    
18. 제14항에 있어서, 2주일에 1 내지 4회 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
19. 제18항에 있어서, 1주일에 1 내지 2회 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
20. 제18항에 있어서, 2주일에 1회 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
    
21. 제14항에 있어서, 투여량은 체중 1 ㎏ 당 1 내지 20 ㎎인 것을 특징으로 하는, 방법.

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