KR20180137502A

KR20180137502A - 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20180137502A
Application number: KR1020187031020A
Authority: KR
Inventors: 원종화; 임양미; 허민규
Original assignee: 주식회사 녹십자; 재단법인 목암생명과학연구소
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2018-12-27
Also published as: PL3449939T3; ES2912903T3; EP3449939B1; US20190119388A1; CN109195627B; CN109195627A; KR102128556B1; WO2017188472A1; EP3449939A4; US11198733B2; EP3449939A1; JP2019514909A; HRP20220576T1; LT3449939T; SI3449939T1; DK3449939T3; JP6701382B2; HUE058745T2

Abstract

본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이를 억제하는 약학 조성물과 상기 조성물을 이용하여 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 상기 조성물 또는 방법은 EGFR 리간드에 의해 유도되는 다양한 위암 세포주의 침윤을 억제하는데 효과적이다. 따라서, 상기 약학 조성물은 암의 전이를 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물

본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물과 상기 조성물을 이용하여 암의 전이를 억제하는 방법에 관한 것이다.

암이 한 조직에서 형성되어 증식하면서 다른 조직으로 이동하는 것을 전이라고 한다. 일단 전이가 일어나면 치료의 효과가 좋지 않을 뿐만 아니라, 재발의 가능성도 높은 것으로 알려져 있다. 암의 전이과정은 이동(migration), 부착(adhesion), 침윤(invasion) 등의 단계로 구성되어 있으며, 이 중 어느 하나를 억제한다면 암의 전이를 억제할 수 있다.

한편, 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)는 170 kDa의 제1형 막 단백질로서, 다양한 종류의 종양에서 과다 발현된다. EGFR은 리간드인 EGF(epidermal growth factor) 및 TGF-α(tumor growth factor-α)와의 결합을 통해 활성화되어 종양 세포의 증식을 유도한다고 보고된 바 있다. 이에, EGFR은 종양의 증식을 억제하기 위한 표적으로 연구되고 있다.

그러나, EGFR을 표적으로 하는 항체를 이용하여 암의 전이를 억제할 수 있는지 여부에 대해서는 알려진 바가 없다. 이에, 본 발명자들은 EGFR을 표적으로 하는 항체가 위암 세포주의 침윤을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이를 억제하는 약학 조성물과 상기 조성물을 이용하여 암의 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고, 상기 항체가, a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 암의 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 암의 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 암의 전이 억제용 조성물 또는 암의 전이를 억제하는 방법은, EGFR 리간드에 의해 유도되는 다양한 위암 세포주의 이동 및 침윤을 억제하는데 효과적이다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 방법은 암의 전이를 억제하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 NCI-N87 세포주에 HB-EGF를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 NCI-N87 세포주에 TGF-α를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 NCI-N87 세포주에 AREG를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HB-EGF에 의해 세포이동이 유도된 NCI-N87 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 5는 TGF-α에 의해 세포이동이 유도된 NCI-N87 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 6은 AREG에 의해 세포이동이 유도된 NCI-N87 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 7은 NCI-N87 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 처리하였을 때, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 8은 AGS 세포주에 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 HB-EGF에 의해 세포이동이 유도된 AGS 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 10은 AREG 에 의해 세포이동이 유도된 AGS 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 11은 AGS 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 처리하였을 때, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 12는 NUGC3 세포주에 HB-EGF를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 13은 NUGC3 세포주에 TGF-α를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 14는 NUGC3 세포주에 AREG를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 15는 HB-EGF에 의해 세포이동이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 16은 TGF-α에 의해 세포이동이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 17은 AREG에 의해 세포이동이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 18은 AGS 세포주에 HB-EGF를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 19는 AGS 세포주에 TGF-α를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 20은 HB-EGF에 의해 침윤이 유도된 AGS 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 21은 TGF-α에 의해 침윤이 유도된 AGS 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 22는 AREG에 의해 침윤이 유도된 AGS 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 23은 NUGC3 세포주에 HB-EGF를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 24는 NUGC3 세포주에 TGF-α를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 25는 NUGC3 세포주에 AREG를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 26은 HB-EGF에 의해 침윤이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 27은 TGF-α에 의해 침윤이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 28은 AREG에 의해 침윤이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고, 상기 항체가, a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 상보성 결정 영역(CDR)1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 암의 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 항체는, a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역일 수 있다. 한편, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 공지된 인간 항체의 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역일 수 있고, 구체적으로 상기 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역은 각각 서열번호 11 또는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “암의 전이”는 암세포가 원발장기에서 다른 장기로 이동하여 증식하는 것을 의미한다. 암세포가 신체의 다른 부분으로 이동하는 것은, 원발암에서 암조직이 성장하여 주의의 장기를 직접적으로 침윤하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 이동하여 전이되는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 조성물은 암의 전이를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 이때, 상기 전이는 EGFR 리간드에 의해 유도되거나 촉진될 수 있다. 상기 EGFR 리간드는 HB-EGF(heparin binding-EGF-like growth factor), TGF-α(transforming growth factor-α), AREG(amphiregulin) 또는 이의 조합일 수 있다. 또한, 상기 암은 고형암이고, 이는 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부암, 경부암, 난소암, 전립선암, 대장암 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 위암일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 암의 전이를 효과적으로 억제하므로, 본 발명의 조성물에 암의 전이를 억제하는 효과가 있음이 공지된 물질을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 본 발명의 항체에 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기에 따른 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 제형화하여 사용될 수 있다. 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있다. 또한, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 90 중량%, 또는 약 80 중량% 내지 약 89.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.

상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택 가능하다. 또한, 상기 항체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.

상기 항체를 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는, 피하, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 척추 내, 수강막 내, 정맥 내 투여가 있다.

상기 투여는 2주일에 1회 이상, 구체적으로 2주일에 1 내지 2회로 나누어 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 투여는 1주일에 1회, 또는 2주일에 1회일 수 있다. 상기 투여시, 1주일에 1회 투여하는 경우, 투여량은 몸무게당 1 내지 6 ㎎/㎏ 또는 3 내지 5 ㎎/㎏일 수 있다. 2주일에 1회 투여하는 경우, 투여량은 몸무게당 3 내지 15 ㎎/㎏, 5 내지 12 ㎎/㎏, 6 내지 10 ㎎/㎏ 또는 7 내지 9 ㎎/㎏일 수 있다.

또한, 본 발명은 암의 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 EGFR 리간드에 의한 암의 이동 및 침윤을 억제함으로써, 암의 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 상기 암은 고형암이고, 이는 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부암, 경부암, 난소암, 전립선암, 대장암 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 위암일 수 있다.

발명의 실시를 위한 형태

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 항-EGFR 항체의 선별 및 제조

표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 사람 골수 RNA, 사람 흉선 RNA, 사람 비장 RNA 및 사람 B 세포 RNA를 혼합하여 항체 유전자 라이브러리를 구축하였다. 상기 RNA 유전자 라이브러리로부터 분리한 RNA 유전자를 주형으로 cDNA를 합성한 뒤, 상기 cDNA를 주형으로 각각 scFv 영역, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 맞게 고안된 프라이머를 사용하여 항체 DNA를 합성하였다. 상기 합성된 항체 DNA를 파아지-디스플레이 벡터 pKS4H(녹십자, 대한민국, 대한민국 등록특허 제10-0635370호 참조)에 삽입하여 항체 DNA 라이브러리를 제작하였다. 그 후, 상기 항체 DNA 라이브러리로 EGFR에 결합하는 항체를 패닝 기법으로 선별하였다. 패닝은 4회 수행되었고, 최종 선별된 DNA 라이브러리를 포함하는 콜로니로부터 항체의 발현을 유도하였다. 이때, 항체의 발현 여부는 EGFR이 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 ELISA로 측정하였다.

상기 과정으로 선별된 항체 단편을 완전한 형태의 면역글로불린으로 제조하기 위하여 녹십자사의 항체 발현 벡터인 pRC13 및 pKC12(B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간 항체의 가변영역을 삽입할 수 있는 항체발현 플라스미드, 대한민국 등록특허 제10-523732호 참조; 기탁번호 KCLRF-BP-00054)를 사용하였다. 상기 벡터에 삽입된 항체 단편은 CHO 세포에 도입되어 완전한 형태의 면역글로불린으로 발현되었고, 이렇게 발현된 항체는 단백질 A-아가로스 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech, 미국)으로 정제되었다(구체적인 항체의 선별 및 제조방법은 대한민국 등록특허 제10-0092401호에 기재된 바와 같다).

그 결과, 선별 및 제조된 항체를 GC1118이라고 명명하였다. 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변 영역을 포함하고 있다.

I. 항-EGFR 항체의 위암 세포주 이동 억제 효과 확인

실험예 1. 항-EGFR 항체의 투여에 의한 NCI-N87 위암 세포주의 이동 억제 효과 확인

1-1. EGFR 리간드에 의한 NCI-N87 위암 세포주의 이동 유도

위암 세포주인 NCI-N87 세포주가 EGFR 리간드에 의해 암세포의 이동이 유도되는 조건을 확립하기 위하여 세포 이동 분석을 수행하였다.

먼저, NCI-N87 세포주(ATCC, 미국)는 10% 소태아 혈청, 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 배양한 세포를 T175 플라스크의 70%가 차도록 분주하였다. 24시간 후 1xPBS로 세척하고, 무혈청 RPMI1640 배지로 교체하여 상기와 동일한 조건하에서 배양하여 준비하였다.

한편, 1xPBS에 5 ㎍/㎖의 제1형 콜라겐을 희석하고, 트랜스웰 인서트(insert)에 250 ㎕의 희석된 콜라겐을 채운 뒤, 냉장고에서 24시간 동안 방치하였다. 제1형 콜라겐으로 코팅된 트랜스웰 인서트를 1 ㎖의 1xPBS로 세척하고, 클린 벤치(clean bench)에서 건조시켰다. 상기 준비된 NCI-N87 세포주를 트립신 처리하여 모아 무혈청 배지에 재현탁하고, 트렌스웰 인서트 당 4x10⁶개의 세포가 되도록 분주하였다. 또한, 24-웰 플레이트에 750 ㎕의 무혈청 배지를 채우고, EGFR 리간드를 첨가하고, 상기 트랜스웰 인서트를 넣었다. 이때, HB-EGF(heparin binding-EGF-like growth factor, 259-HE-250, R&D systems, 미국) 및 TGF-α(transforming growth factor-α, 239-A-100, R&D systems, 미국)는 0, 20, 100 또는 500 ng/㎖ 로, AREG(amphiregulin, 262-AR, R&D Systems, 미국)는 0, 40, 200 또는 1,000 ng/㎖로 첨가하였다. 24-웰 플레이트는 상기와 동일한 조건에서 6시간 동안 배양하고, 염색을 하여 이동이 유도된 세포들을 확인하였다.

구체적으로, 24-웰 플레이트의 배지를 제거하고, 700 ㎕의 1xPBS를 넣고, 여기에 트랜스웰 인서트를 담가 세척하였다. 1xPBS를 제거하고, 500 ㎕의 4% 파라포름알데하이드를 채우고, 15분 동안 인서트를 담가 세포를 고정시켰다. 파라포름알데하이드를 제거하고, 다시 동량의 1xPBS로 인서트를 세척하고, 500 ㎕의 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액을 채운 뒤, 30분 동안 인서트를 담가 세포를 염색하였다. 그 후, 500 ㎖ 비이커에 증류수를 넣고, 인서트를 세척하였다. 세척된 인서트 안쪽에 남아있는 세포는 면봉으로 닦아내었다. 염색된 세포를 100 ㎕의 10% 아세트산 용액으로 용출시킨 뒤, 595 ㎚의 파장에서 ELISA 플레이트 리더로 OD값을 측정하였다. 그 결과, HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 리간드로 첨가한 뒤 측정한 OD 값을 각각 도 1 내지 3에 나타내었다.

도 1 내지 3에 나타난 바와 같이, NCI-N87 세포주의 이동을 유도하기 위해 첨가할 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG 리간드의 농도는 각각 20, 20 및 500 ng/㎖로 결정하였다.

1-2. HB-EGF로 이동이 유도된 NCI-N87 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인

NCI-N87 세포주에 20 ng/㎖의 HB-EGF를 처리하여 세포의 이동을 유도하였다. 여기에 0.04, 0.2, 1 또는 5 ㎍/㎖의 GC1118, 또는 비교예로서 0.04, 0.2, 1 또는 5 ㎍/㎖의 세툭시맙(cetuximab, CTX; MERCK, 미국)과 5 ㎍/㎖의 파니투무맙(panitumumab, Pani; Amgen, 미국)을 첨가하였으며, 그 외에는 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 GC1118에 의해 암세포의 이동이 억제되는 것을 확인하였다.

이동 억제 효과는, HB-EGF만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, GC1118 및 세툭시맙은 모두 농도 의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 구체적으로 0.04 ㎍/㎖에서 세툭시맙은 이동을 억제하는 효과를 나타내지 않았으나, GC1118은 20%로 세포의 이동을 억제하였다. 또한, 5 ㎍/㎖에서 세툭시맙 및 파니투무맙은 40%의 억제 효과를 보인 반면, GC1118은 60%로 암세포의 이동을 억제하였다.

1-3. TGF-α로 이동이 유도된 NCI-N87 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인

HB-EGF 대신 20 ng/㎖의 TGF-α로 세포의 이동을 유도하였고, 비교예로서 세툭시맙을 첨가하였으며, 그 외에는 실험예 1-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.

이동 억제 효과는, TGF-α만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, GC1118 및 세툭시맙은 모두 농도 의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 구체적으로 0.04 ㎍/㎖에서 세툭시맙 및 GC1118은 이동 억제 효과를 보이지 않았으나, 5 ㎍/㎖에서는 그 효과를 나타내었다.

1-4. AREG로 이동이 유도된 NCI-N87 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인

HB-EGF 대신 500 ng/㎖의 AREG로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 1-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.

이동 억제 효과는, AREG만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, GC1118 및 세툭시맙은 모두 농도 의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 구체적으로 0.04 ㎍/㎖에서 세툭시맙 및 GC1118은 이동 억제 효과를 보이지 않았으나, 0.2 ㎍/㎖ 이상부터 그 효과를 나타내었다.

1-5. GC1118 항체 및 다른 EGFR 항체에 의한 암세포의 이동 억제 효과 비교

GC1118 항체와 EGFR 또는 HER2 표적하는 다른 항체들이 암세포의 이동을 억제하는 효과를 비교하였다.

먼저, 20 ng/㎖의 HB-EGF 또는 TGF-α, 또는 500 ng/㎖의 AREG를 첨가하여 암세포의 이동을 유도하였다. 여기에 1 ㎍/㎖의 세툭시맙, 파니투무맙, 트라스트주맙(trastzumab, Trast; Roche, 미국) 또는 GC1118을 첨가하고, 대조군으로서는 면역글로불린을 사용하였다. 그 외에는 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.

이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, EGFR을 표적으로 하는 항체인 세툭시맙, 파니투무맙 및 GC1118은 세포의 이동을 억제하였으나, HER2를 표적으로 하는 항체인 트라스투주맙은 그 효과가 미미하였다. 한편, HB-EGF에 의해 유도된 세포의 이동은 GC1118에 의해서만 억제된 반면, TGF-α 및 AREG에 의해 유도된 세포의 이동은 EGFR을 표적으로 하는 항체 간에 차이를 보이지 않았다.

실험예 2. 항-EGFR 항체의 투여에 의한 AGS 위암 세포주의 이동 억제 효과 확인

2-1. EGFR 리간드에 의한 AGS 위암 세포주의 이동 유도

AGS 세포주(ATCC, 미국)에서 EGFR 리간드에 의해 암세포의 이동이 유도되는 조건을 확립하였다. 트랜스웰 인서트에 3x10⁶개의 세포를 분주하였고, 그 외에는 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 그 결과, HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 리간드로서 첨가한 뒤, 측정한 OD 값을 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이 AGS 세포주의 이동을 유도하기 위해 첨가할 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG 리간드의 농도는 각각 20, 20 및 500 ng/㎖로 결정하였다.

2-2. HB-EGF로 이동이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인

AGS 위암 세포주를 사용하였고, 그 외에는 실험예 1-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 하였다. 이동 억제 효과는, HB-EGF만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, GC1118이 세툭시맙보다 AGS 세포주의 이동을 억제하는 효과가 우수하였다. 구체적으로, 0.04 ㎍/㎖ 에서 세툭시맙은 이동 억제효과를 보이지 않았고, 5 ㎍/㎖에서는 약 40%로 암세포의 이동을 억제하였다. 반면, GC1118은 0.04 및 5 ㎍/㎖에서 각각 40% 및 90%로 암세포의 이동을 억제하였다.

2-3. AREG로 이동이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인

AGS 위암 세포주에서 1,000 ng/㎖의 AREG로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 1-4와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다. 이동 억제 효과는, AREG만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, GC1118 및 세툭시맙은 모두 농도 의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 구체적으로, 두 항체 모두 0.04 ㎍/㎖에서도 60%로 우수한 암세포 이동 억제 효과를 나타내었다.

2-4. GC1118 항체 및 다른 EGFR 항체에 의한 암세포의 이동 억제 효과 비교

0.2 ㎍/㎖ 농도의 세툭시맙, 파니투무맙, 트라스트주맙 또는 GC1118을 첨가하였고, 그 외에는 실험예 1-5와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다. 이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, EGFR을 표적으로 하는 항체인 세툭시맙, 파니투무맙 및 GC1118은 세포의 이동을 억제하였으나, HER2를 표적으로 하는 항체인 트라스트주맙은 효과가 없었다. 한편, 세포 염색 결과, GC1118은 세툭시맙 또는 파니투무맙보다 더 적은 수의 세포가 이동한 것으로 나타났으나, OD 값은 다른 항체들과 큰 차이가 없었다. 이는 이동된 세포의 수가 적어 OD 값에서 큰 차이를 나타내지 않은 것으로 보인다.

실험예 3. EGFR 리간드에 의한 NUGC3 위암 세포주의 이동 억제 효과 확인

3-1. EGFR 리간드에 의한 NUGC3 위암 세포주의 이동 유도

NUGC3 세포주(ATCC, 미국)에서 EGFR 리간드에 의해 암세포의 이동이 유도되는 조건을 확립하였다. 트랜스웰 인서트에 2x10⁶개의 세포를 분주하였고, HB-EGF 및 TNF-α는 0, 0.4, 2, 10, 50 및 250 ng/㎖로, AREG는 0, 1.6, 8, 40, 200 및 1,000 ng/㎖로 첨가하였다. 그 외에는 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 그 결과, HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 리간드로 첨가한 뒤 측정한 OD 값을 각각 도 12 내지 14에 나타내었다.

도 12 내지 14에 나타난 바와 같이, AGS 세포주의 이동을 유도하기 위해 첨가할 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG 리간드의 농도는 각각 50, 50 및 500 ng/㎖로 결정하였다.

3-2. HB-EGF로 이동이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 비교

NUGC3 세포주에서 50 ng/㎖의 HB-EGF로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 1-5와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다. 이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타난 바와 같이, 세툭시맙, 파니투무맙 및 트라스트주맙은 HB-EGF로 유도된 세포의 이동을 억제하지 못하였으나, GC1118은 40%로 세포의 이동을 억제하였다.

3-3. TGF-α로 이동이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 비교

HB-EGF 대신 50 ng/㎖의 TGF-α로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 3-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.

이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타난 바와 같이, 세툭시맙, 파니투무맙 및 GC1118은 TGF-α로 유도된 세포의 이동을 억제하지 못하였으나, 트라스트주맙은 세포의 이동을 억제하지 못하였다.

3-4. AREG로 이동이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 비교

HB-EGF 대신 500 ng/㎖의 AREG로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 3-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.

이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에 나타난 바와 같이, EGFR을 표적으로 하는 항체인 세툭시맙, 파니투무맙 및 GC1118은 세포의 이동을 억제하였으나, HER2를 표적으로 하는 항체인 트라스투주맙은 그 효과가 없었다.

II. 항-EGFR 항체의 위암 세포주 전이 억제 효과 확인

실험예 4. 항-EGFR 항체의 투여에 의한 AGS 위암 세포주의 전이 억제 효과 확인

4-1. EGFR 리간드에 의한 AGS 암세포의 침윤 유도

위암 세포주인 AGS 세포주가 EGFR 리간드에 의해 침윤이 유도되는 조건을 확립하기 위하여 마트리겔 챔버 분석을 수행하였다.

먼저, 위암 세포주인 AGS 세포주는 10% 소태아 혈청, 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 배양한 세포를 T175 플라스크의 60%가 차도록 분주하였다. 24시간 후, 세포를 1xPBS로 세척하고, 무혈청 RPMI1640 배지로 교체하여 상기와 동일한 조건하에서 배양하여 준비하였다.

한편, 마트리겔 챔버(Cat. No. 354483, Corning, 미국)에 0.5 ㎖의 소태아 혈청이 첨가된 RPMI1640 배지(침윤배지)를 채우고, 2시간 동안 재수화시킨(rehydrate) 뒤, 배지를 제거하였다. 상기 준비된 세포를 트립신 처리하여 모으고, 0.1% 소혈청 알부민이 포함된 무혈청 배지에 재현탁하였다. 24-웰 플레이트에 750 ㎕의 침윤배지를 채우고, HB-EGF 및 TGF-α를 10, 20 또는 50 ng/㎖로 첨가하였다. 500 ㎕의 침윤 배지를 넣은 24-웰 플레이트에 챔버를 올린 뒤, 상기 재현탁한 세포를 챔버 당 3x10⁶개가 되도록 첨가하였다. 이를 상기와 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하고, 염색을 하여 침윤이 유도된 세포들을 확인하였다.

구체적으로, 24-웰 플레이트의 배지를 제거하고, 500 ㎕의 1xPBS를 첨가한 뒤, 여기에 챔버를 담가 세척하였다. 1xPBS를 제거하고, 24-웰 플레이트에 500 ㎕의 4% 파라포름알데하이드를 채우고, 10분 동안 챔버를 담가 세포를 고정시켰다. 파라포름알데하이드를 제거하고, 500 ㎕의 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액을 채운 뒤, 10분 동안 챔버를 담가 세포를 염색하였다. 그 후, 500 ㎖ 비이커에 증류수를 넣고, 챔버를 세척하였다. 세척된 챔버 안쪽에 침윤되지 않은 세포는 면봉으로 닦아내고, 이를 1시간 동안 실온에서 건조시켰다. 또한, 상기 염색된 세포는 100 ㎕의 10% 아세트산 용액으로 용출시킨 뒤, 595 ㎚의 파장에서 ELISA 플레이트 리더로 OD값을 측정하였다. 그 결과, HB-EGF 또는 TGF-α를 리간드로 첨가한 뒤 측정한 OD 값을 각각 도 18 또는 19에 나타내었다.

도 18 및 19에 나타난 바와 같이, AGS 세포주는 HB-EGF 및 TGF-α 리간드에 의해 침윤이 유도되었다. 10, 20 또는 50 ng/㎖로 HB-EGF를 첨가한 경우 대조군과 비교하여 각각 4.1, 4.5 또는 3.9배로 침윤이 증가하였다. 또한, 동일한 농도로 TGF-α를 첨가한 경우 대조군과 비교하여 각각 1.8, 1.8 또는 1.9배로 침윤이 증가하였다.

4-2. HB-EGF로 침윤이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인

20 ng/㎖의 HB-EGF로 세포의 침윤을 유도하였고, 그 외에는 실험예 4-1과 동일한 조건 및 방법으로 실험을 하였다. 이때, 실험군으로서 1 ㎍/㎖의 GC1118을 첨가하였고, 비교예로서 1 ㎍/㎖의 세툭시맙, 파니투무맙 또는 트라스트주맙을 사용하였다. 실험은 두 세트씩 세 번 반복하여 그 평균값을 나타내었다.

침윤 억제 효과는, HB-EGF만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 표 1 및 도 20에 나타내었다.

	HB-EGF(20 ng/㎖)	GC1118(1 ㎍/㎖)	세툭시맙(1 ㎍/㎖)	파니투무맙(1 ㎍/㎖)	트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1	99.3	50.6	101.0	98.8	87.4
1-2	100.7	56.8	93.8	98.5	93.6
2-1	100.3	57.7	91.8	92.2	83.1
2-2	99.7	64.2	102.9	106.8	86.4
3-1	111.7	33.3	88.6	83.2	95.3
3-2	88.3	34.9	86.2	92.5	91.3
평균(%)	100.0	49.6	94.0	95.3	89.5
표준편차	7.4	12.8	6.7	8.0	4.7

표 1 및 도 20에 나타난 바와 같이, GC1118이 HB-EGF에 의해 유도된 AGS 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로, 세툭시맙, 파니투무맙 또는 트라스트주맙은 각각 6%, 4.7% 또는 10.5%로 세포의 침윤을 억제하였으나, GC1118은 50.4%로 세포의 침윤을 억제하였다.

4-3. TGF-α로 침윤이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인

HB-EGF 대신 20 ng/㎖의 TGF-α로 세포의 침윤을 유도하였고, 그 외에는 실험예 4-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.

침윤 억제 효과는, TGF-α만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 2 및 도 21에 나타내었다.

	TGF-α(20 ng/㎖)	GC1118(1 ㎍/㎖)	세툭시맙(1 ㎍/㎖)	파니투무맙(1 ㎍/㎖)	트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1	98.0	45.1	78.6	37.9	110.8
1-2	102.0	41.6	83.9	44.8	106.4
2-1	99.7	31.2	50.1	39.0	69.4
2-2	100.3	33.8	46.2	33.8	90.9
3-1	98.0	57.9	65.0	61.9	90.4
3-2	102.0	54.8	66.0	57.9	95.4
평균(%)	100.0	44.1	66.0	45.9	93.9
표준편차	1.83	10.82	14.93	11.50	14.62

표 2 및 도 21에 나타난 바와 같이, GC1118이 TGF-α에 의해 유도된 AGS 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로, 세툭시맙 또는 트라스트주맙은 각각 35% 및 6.1%로 세포의 침윤을 억제하였으나, GC1118은 55.9%로, 54.1%로 세포의 침윤을 억제한 파니투무맙과 유사한 효과를 보였다.

4-4. AREG로 침윤이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인

HB-EGF 대신 1,000 ng/㎖의 AREG로 세포의 침윤을 유도하고, 실험을 두 세트씩 2회 반복하였으며, 그 외에는 실험예 4-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.

침윤 억제 효과는, AREG만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 3 및 도 22에 나타내었다.

	AREG(1,000 ng/㎖)	GC1118(1 ㎍/㎖)	세툭시맙(1 ㎍/㎖)	파니투무맙(1 ㎍/㎖)	트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1	93.8	55.3	65.2	68.8	93.8
1-2	106.2	61.3	60.3	58.4	107.0
2-1	95.4	51.8	54.2	51.5	96.7
2-2	104.6	53.1	52.3	49.9	115.5
평균(%)	100.0	55.4	58.0	57.2	103.3
표준편차	6.34	4.21	5.87	8.62	9.96

표 3 및 도 22에 나타난 바와 같이, GC1118이 AREG에 의해 유도된 AGS 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로 GC1118은 44.6%로, 대조군인 세툭시맙(42%) 또는 파니투무맙(42.8%)과 유사한 수준으로 세포주의 침윤을 억제하였다.

실험예 5. 항-EGFR 항체의 투여에 의한 NUGC3 위암 세포주의 전이 억제 효과 확인

5-1. EGFR 리간드에 의한 NUGC3 암세포의 침윤 유도

NUGC3 세포주에서 EGFR 리간드에 의해 암세포의 침윤이 유도되는 조건을 확립하기 위하여 마트리겔 챔버 분석을 수행하였다. 침윤 유도를 위해 EGFR 리간드인 10, 20 또는 50 ng/㎖의 HB-EGF 및 TGF-α, 및 40, 200 및 500 ng/㎖의 AREG를 첨가하였고, 그 외에는 실험예 4-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 그 결과, HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 리간드로 첨가한 뒤 측정한 OD 값을 각각 도 23 내지 25에 나타내었다.

도 23 내지 25에 나타난 바와 같이, NUGC3 세포주는 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG 리간드에 의해 침윤이 유도되었다. 구체적으로 10, 20 또는 50 ng/㎖의 HB-EGF를 처리한 경우, 세포의 침윤이 각각 2.3, 3.5 및 4.8배 증가하였고, 10, 20 또는 50 ng/㎖의 TGF-α를 처리한 경우, 세포의 침윤이 각각 1.7, 1.9 및 1.9배 증가하였다. 한편, 40, 200 및 500 ng/㎖의 AREG를 처리한 경우, 세포의 침윤이 각각 1.2, 1.3 및 1.5배 증가하였다.

5-2. HB-EGF로 침윤이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인

NUGC3 세포주에 50 ng/㎖의 HB-EGF를 처리하여 세포의 침윤을 유도하였고, 그 외에는 실험예 4-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.

침윤 억제 효과는, HB-EGF만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 4 및 도 26에 나타내었다.

	HB-EGF(50 ng/㎖)	GC1118(1 ㎍/㎖)	세툭시맙(1 ㎍/㎖)	파니투무맙(1 ㎍/㎖)	트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1	106.6	18.8	76.1	91.5	87.3
1-2	93.4	21.0	81.5	83.0	99.7
2-1	100.3	57.7	91.8	92.2	83.1
2-2	99.7	64.2	102.9	106.8	86.4
3-1	95.3	41.7	106.9	99.6	86.4
3-2	104.7	31.9	84.6	78.4	89.6
평균(%)	100.0	39.2	90.6	91.9	88.7
표준편차	5.13	18.84	12.22	10.42	5.77

표 4 및 도 26에 나타난 바와 같이, GC1118이 HB-EGF에 의해 유도된 NUGC3 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로, 세툭시맙, 파니투무맙, 또는 트라스트주맙은 각각 9.4%, 8.1% 및 11.3%로 세포의 침윤을 억제하였으나, GC1118은 60.8%로 세포의 침윤을 억제하였다. 즉, NUGC3 세포주에서 HB-EGF에 의해 유도된 세포의 침윤은 GC1118 특이적으로 억제되었다.

5-3. TGF-α로 침윤이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인

HB-EGF 대신 50 ng/㎖의 농도의 TGF-α를 처리하였으며, 그 외에는 실험예 5-2와 동일한 방법으로 GC1118에 의해 암세포의 침윤이 억제되는 것을 확인하였다.

침윤 억제 효과는, TGF-α만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 5 및 도 27에 나타내었다.

	TGF-α(50 ng/㎖)	GC1118(1 ㎍/㎖)	세툭시맙(1 ㎍/㎖)	파니투무맙(1 ㎍/㎖)	트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1	104.1	31.5	27.7	36.0	90.3
1-2	95.9	27.3	31.0	28.9	74.3
2-1	84.5	31.4	37.5	43.2	92.8
2-2	115.5	30.0	41.0	34.7	84.8
3-1	105.8	36.4	40.0	29.9	112.6
3-2	94.2	38.3	41.4	33.3	114.2
평균(%)	100.0	32.5	36.5	34.3	94.8
표준편차	10.77	4.12	5.74	5.13	15.72

표 5 및 도 27에 나타난 바와 같이, GC1118이 TGF-α에 의해 유도된 NUGC3 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로 GC1118은 67.5%로, 대조군인 세툭시맙(63.5%) 또는 파니투무맙(65.7%)과 유사한 수준으로 세포주의 침윤을 억제하였다.

5-4. AREG로 침윤이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인

HB-EGF 대신 500 ng/㎖의 농도의 AREG를 처리하였으며, 그 외에는 실험예 4-4와 동일한 방법으로 GC1118에 의해 암세포의 침윤이 억제되는 것을 확인하였다.

침윤 억제 효과를 확인하기 위해, AREG만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 6 및 도 28에 나타내었다.

	AREG(500 ng/㎖)	GC1118(1 ㎍/㎖)	세툭시맙(1 ㎍/㎖)	파니투무맙(1 ㎍/㎖)	트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1	100.2	40.2	48.8	40.2	89.0
1-2	99.8	50.7	50.7	47.8	90.7
2-1	99.6	59.8	65.9	62.9	89.0
2-2	100.4	59.6	59.6	61.1	111.8
3-1	97.3	62.4	59.8	64.9	103.8
3-2	102.7	56.1	64.2	62.4	94.7
평균(%)	100.0	54.8	58.2	56.5	96.5
표준편차	1.74	8.21	6.98	10.09	9.35

표 6 및 도 28에 나타난 바와 같이, GC1118이 AREG에 의해 유도된 NUGC3 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로 GC1118은 45.2%로, 대조군인 세툭시맙(41.8%) 또는 파니투무맙(43.5%)과 유사한 수준으로 세포주의 침윤을 억제하였다.

<110> GREEN CROSS CORPORATION MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR INHIBITING METASTASIS OF CANCER COMPRISING ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR <130> PCB602010GCC <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of heavy chain variable region of human antibody <400> 1 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 2 of heavy chain variable region of human antibody <400> 2 Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 3 of heavy chain variable region of human antibody <400> 3 His Gly Ser Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of light chain variable region of human antibody <400> 4 Arg Ser Asn Gln Asp Leu Thr His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 2 of light chain variable region of human antibody <400> 5 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 3 of light chain variable region of human antibody <400> 6 Met Gln Gly Thr His Trp Pro Trp Thr 1 5 <210> 7 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of human antibody <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Ser Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala Trp Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of human antibody <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Asp Leu Thr His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR 1 of light chain variable region of human antibody <400> 9 Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Met Gly Ile Gly Asn Asn Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 10 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of human antibody <400> 10 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Met Gly 20 25 30 Ile Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 11 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain constant region of human antibody <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 12 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain constant region of human antibody <400> 12 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 1 5 10 15 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105

Claims

표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고,
상기 항체가,
a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
을 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항체가,
a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
을 포함하는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암이 고형암인, 조성물.
제3항에 있어서, 상기 고형암이 위암인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 전이는 EGFR 리간드에 의해 유도 또는 촉진되는 것인, 조성물.
제5항에 있어서, EGFR 리간드는 HB-EGF(heparin binding-EGF-like growth factor), TGF-α(transforming growth factor-α), AREG(amphiregulin) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물이 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 및 이의 혼합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 더 포함하는, 조성물.
a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는 암의 전이를 억제하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 항체가,
a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
을 포함하는 것인, 방법.
암의 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한,
a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체의 용도.
제10항에 있어서, 상기 항체가,
a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
을 포함하는 것인, 용도.