WO2017188472A1 - 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물 - Google Patents

표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting cancer metastasis comprising an antibody that specifically binds an epidermal growth factor receptor as an active ingredient and a method for inhibiting cancer metastasis using the composition.
  • cancer metastasis is formed in one tissue and proliferates before it moves to another tissue. Once metastasis has occurred, not only is the treatment not as effective, but the likelihood of relapse is high. Cancer metastasis is composed of migration, adhesion, invasion, and the like. If any one of these is inhibited, cancer metastasis can be suppressed.
  • Epidermal growth factor receptor is a type 1 membrane protein of 170 kDa that is overexpressed in various types of tumors.
  • EGFR has been reported to be activated through the binding of ligands EGF (epidermal growth factor) and TGF- ⁇ (tumor growth factor- ⁇ ) to induce the proliferation of tumor cells.
  • EGF epidermal growth factor
  • TGF- ⁇ tumor growth factor- ⁇
  • the present invention comprises an antibody that specifically binds to the epidermal growth factor receptor as an active ingredient, wherein the antibody is a) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively A heavy chain variable region comprising the CDR1, CDR2 and CDR3 shown, the light chain variable region comprising the CDR1, CDR2 and CDR3 represented by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, the heavy chain constant region, and the light chain, respectively Constant region; Or b) a heavy chain variable region comprising CDR1, CDR2, and CDR3 represented by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3, respectively, represented by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6
  • a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer comprising a light chain variable region, a heavy chain constant
  • the invention also provides a method of inhibiting metastasis of cancer comprising administering a composition of the invention to a subject.
  • the present invention also provides the use of a composition of the invention for use in the manufacture of a medicament for inhibiting metastasis of cancer.
  • composition for inhibiting metastasis of a cancer or a method for inhibiting metastasis of a cancer according to the present invention is effective in inhibiting migration and invasion of various gastric cancer cell lines induced by EGFR ligands.
  • the compositions or methods of the present invention can be usefully used to inhibit metastasis of cancer.
  • 1 is a graph showing the degree to which HB-EGF is added to the NCI-N87 cell line according to the concentration, and thus the cells migrated.
  • FIG. 2 is a graph showing the degree of TGF- ⁇ added to the NCI-N87 cell line according to the concentration, and the cells moved accordingly.
  • Figure 3 is a graph showing the degree to which the AREG is added to the NCI-N87 cell line according to the concentration, and the cells moved accordingly.
  • FIG. 4 is a graph comparing GC1118 to the NCI-N87 cell line induced cell migration by HB-EGF according to the concentration, and the degree of cell migration compared to the control group.
  • 5 is a graph comparing GC1118 to NCI-N87 cell line induced cell migration by TGF- ⁇ according to the concentration, and the degree of cell migration compared to the control group.
  • FIG. 6 is a graph comparing GC1118 to NCI-N87 cell line induced cell migration by AREG according to the concentration, and the degree of cell migration compared to the control group.
  • Figure 7 is a graph comparing the degree of movement of cells when the NCI-N87 cell line treated with various EGFR or HER2 antibodies to the control group.
  • FIG. 8 is a graph showing the degree of movement of cells according to the concentration of HB-EGF, TGF- ⁇ or AREG added to the AGS cell line.
  • FIG. 9 is a graph comparing GC1118 to the AGS cell line induced by HB-EGF according to the concentration, and thus the degree of cell migration compared to the control group.
  • FIG. 10 is a graph comparing GC1118 to the AGS cell line induced by AREG according to the concentration, and the degree of cell migration according to the control.
  • FIG. 11 is a graph comparing the degree of cell migration when the AGS cell line is treated with antibodies to various EGFR or HER2.
  • FIG. 12 is a graph showing the degree to which the HB-EGF was added to the NUGC3 cell line according to the concentration, and the cells moved accordingly.
  • Figure 13 is a graph showing the degree to which the TGF- ⁇ is added to the NUGC3 cell line according to the concentration, the cell moved accordingly.
  • Figure 14 is a graph showing the degree to which the AREG is added to the NUGC3 cell line according to the concentration, the cell moves accordingly.
  • 15 is a graph comparing antibodies to various EGFR or HER2 to NUGC3 cell lines induced cell migration by HB-EGF, and thus the degree of cell migration compared to the control group.
  • FIG. 16 is a graph comparing the migration of cells to NUGC3 cell lines induced by TGF- ⁇ and various EGFR or HER2 antibodies.
  • Figure 17 is a graph comparing the movement of the cells to the NUGC3 cell line induced by AREG to a variety of EGFR or HER2, and thus the degree of cell migration compared to the control.
  • Figure 18 is a graph showing the degree of infiltration of HB-EGF according to the concentration of the AGS cell line, thereby infiltrating the cells.
  • FIG. 19 is a graph showing the degree of infiltration of TGF- ⁇ according to the concentration of AGS cell lines and accordingly cells.
  • 20 is a graph comparing antibodies to various EGFR or HER2 to AGS cell lines induced by HB-EGF infiltration, and thus the degree of cell infiltration compared to the control group.
  • 21 is a graph comparing antibodies to various EGFR or HER2 to AGS cell lines induced by TGF- ⁇ invasion, and thus the degree of cell infiltration compared to the control group.
  • FIG. 22 is a graph comparing antibodies to various EGFR or HER2 to AGS cell lines induced by AREG invasion, and thus the degree of cell infiltration compared to the control group.
  • Figure 23 is a graph showing the degree of infiltration of HB-EGF according to the concentration of the NUGC3 cell line, according to the cells.
  • 25 is a graph showing the degree of infiltration of AREG according to the concentration of AREG added to the NUGC3 cell line.
  • FIG. 26 is a graph comparing antibodies to various EGFR or HER2 to NUGC3 cell lines induced by HB-EGF infiltration, and thus the degree of cell infiltration compared to the control group.
  • FIG. 27 is a graph comparing the infiltration of various EGFR or HER2 to NUGC3 cell lines induced by TGF- ⁇ infiltration, and thus the degree of cell infiltration compared to the control group.
  • FIG. 28 is a graph comparing antibodies to various EGFR or HER2 to NUGC3 cell lines induced by AREG invasion, and thus the degree of cell infiltration compared to the control group.
  • the present invention includes an antibody that specifically binds to epidermal growth factor receptor (EGFR) as an active ingredient, wherein the antibody comprises a) complementarity determinations represented by amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • a heavy chain variable region comprising region (CDR) 1, CDR2 and CDR3, a light chain variable region comprising a CDR1, CDR2 and CDR3 represented by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, a heavy chain constant region, And light chain constant region; Or b) a heavy chain variable region comprising CDR1, CDR2, and CDR3 represented by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3, respectively, represented by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6
  • a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of cancer comprising a light chain variable region, a heavy chain constant region, and a light chain constant region comprising CDR1, CDR2, and CDR3.
  • the antibody comprises a) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, a heavy chain constant region, and a light chain constant region; Or b) a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, a heavy chain constant region, and a light chain constant region.
  • the heavy chain constant region and the light chain constant region may be a heavy chain constant region or a light chain constant region of a known human antibody, and specifically, the heavy chain constant region or the light chain constant region may be represented by an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12, respectively.
  • cancer As used herein, the term “metastasis of cancer” means that cancer cells migrate from the primary organ to another organ and proliferate. The migration of cancer cells to other parts of the body includes the growth of cancerous tissue in primary cancer, directly invading the organ of attention, and migration along the blood vessels or lymphatic vessels to other organs far away.
  • the composition according to the invention can be used to inhibit metastasis of cancer.
  • the metastasis may be induced or promoted by the EGFR ligand.
  • the EGFR ligand may be heparin binding-EGF-like growth factor (HB-EGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), amphiregulin (AREG), or a combination thereof.
  • the cancer is solid cancer, which may include lung cancer, breast cancer, colon cancer, stomach cancer, brain cancer, bladder cancer, head cancer, neck cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colon cancer and the like.
  • the cancer may be gastric cancer.
  • composition of the present invention may further include one or more substances known to have an effect of inhibiting metastasis of cancer.
  • composition according to the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier for the antibody of the present invention.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition are conventionally used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • compositions according to the invention may further comprise one or more pharmaceutically acceptable additives selected from the group consisting of excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives.
  • the compositions according to the above can each be formulated and used according to conventional methods. In particular, methods known in the art may be employed and formulated to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal. The formulations can then be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules. In addition, dispersants or stabilizers may be further included. In addition, the compositions may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
  • the carrier may comprise about 1% to about 90%, or about 80% to about 89.99% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition of the present invention, wherein the pharmaceutically acceptable additive is about 0.1% by weight To about 20% by weight.
  • the present invention also provides a method of inhibiting metastasis of cancer comprising administering the composition to a subject.
  • the subject may be a mammal, specifically a human.
  • the route of administration and dosage of the antibody according to the invention can be administered to the subject in a variety of ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence of side effects, the optimal method of administration and dosage can be selected by the skilled person in the appropriate range.
  • the antibody may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances whose therapeutic effect is known for the disease to be treated, or may be formulated in combination with other drugs.
  • examples thereof include subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular, oral, rectal, spinal, intramedullary and intravenous administration.
  • the administration may be administered at least once every two weeks, specifically, once or twice every two weeks. More specifically, the administration may be once a week or once every two weeks. In the administration, when administered once a week, the dosage may be 1 to 6 mg / kg or 3 to 5 mg / kg. When administered once every two weeks, the dosage may be 3 to 15 mg / kg, 5 to 12 mg / kg, 6 to 10 mg / kg or 7 to 9 mg / kg.
  • the present invention also provides the use of the composition for use in the manufacture of a medicament for inhibiting metastasis of cancer.
  • the composition according to the invention can be used in the manufacture of a medicament for inhibiting cancer metastasis by inhibiting the migration and invasion of cancer by the EGFR ligand.
  • the cancer is solid cancer, which may include lung cancer, breast cancer, colon cancer, stomach cancer, brain cancer, bladder cancer, head cancer, neck cancer, ovarian cancer, prostate cancer, colon cancer, and the like.
  • the cancer may be gastric cancer.
  • human bone marrow RNA, human thymus RNA, human spleen RNA and human B cell RNA were mixed to build an antibody gene library.
  • antibody DNA was synthesized using primers designed for scFv region, heavy chain variable region and light chain variable region, respectively.
  • the synthesized antibody DNA was inserted into a phage-display vector pKS4H (see Green Cross, Korea, Republic of Korea Patent No. 10-0635370) to prepare an antibody DNA library.
  • the antibody binding to EGFR with the antibody DNA library was selected by the panning technique. Panning was performed four times and induced expression of the antibody from colonies containing the final selected DNA library. At this time, the expression of the antibody was measured by ELISA using a 96-well plate coated with EGFR.
  • pRC13 and pKC12 antibody expression plasmids capable of inserting variable regions of human antibodies against surface antigens of hepatitis B virus
  • the antibody fragment inserted into the vector was introduced into CHO cells and expressed as a complete form of immunoglobulin, and the expressed antibody was purified by protein A-agarose column (Amersham Pharmacia Biotech, USA) (selection and preparation of specific antibodies). Method is as described in Korean Patent No. 10-0092401).
  • the antibody is represented by the heavy chain variable region comprising CDR1, CDR2 and CDR3 represented by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively, by the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6
  • Light chain variable region comprising CDR1, CDR2, and CDR3, a heavy chain constant region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, and a light chain constant region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the gastric cancer cell line was carried out cell migration assay to establish the conditions under which the migration of cancer cells by the EGFR ligand.
  • the NCI-N87 cell line (ATCC, USA) was cultured under 37 ° C., 5% CO 2 conditions using RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin. It was. The cultured cells were aliquoted so that 70% of the T175 flask was filled. After 24 hours, the cells were washed with 1 ⁇ PBS, replaced with serum-free RPMI1640 medium, and cultured under the same conditions as above.
  • Type 1 collagen was diluted in 1 ⁇ PBS, 250 ⁇ l of diluted collagen was filled in a transwell insert, and then left in a refrigerator for 24 hours.
  • Transwell inserts coated with collagen type 1 were washed with 1 ml of 1 ⁇ PBS and dried on a clean bench.
  • the prepared NCI-N87 cell line was trypsinized, pooled, resuspended in serum-free medium, and aliquoted to 4 ⁇ 10 6 cells per transwell insert.
  • 24-well plates were filled with 750 ⁇ L of serum free medium, EGFR ligand was added, and the transwell insert was added.
  • heparin binding-EGF-like growth factor, 259-HE-250, R & D systems (USA) and TGF- ⁇ are 0 At 20, 100 or 500 ng / ml, AREG (amphiregulin, 262-AR, R & D Systems, USA) was added at 0, 40, 200 or 1,000 ng / ml. 24-well plates were incubated for 6 hours under the same conditions as above, and stained to identify cells induced with migration.
  • the medium of the 24-well plate was removed, 700 ⁇ l of 1 ⁇ PBS was added, and the transwell insert was soaked and washed.
  • 1 ⁇ PBS was removed, 500 ⁇ l of 4% paraformaldehyde was filled, and the insert was immersed for 15 minutes to fix the cells.
  • the paraformaldehyde was removed, the insert was washed again with the same amount of 1 ⁇ PBS, filled with 500 ⁇ l of 0.1% crystal violet solution, and the insert was soaked for 30 minutes to stain the cells.
  • distilled water was put into a 500 ml beaker and the insert was washed. Cells remaining inside the washed inserts were wiped with a cotton swab.
  • the concentrations of HB-EGF, TGF- ⁇ or AREG ligands to be added to induce migration of NCI-N87 cell lines were determined to be 20, 20 and 500 ng / ml, respectively.
  • NCI-N87 cell line was treated with 20 ng / ml HB-EGF to induce cell migration.
  • 0.04, 0.2, 1 or 5 ⁇ g / ml of GC1118, or 0.04, 0.2, 1 or 5 ⁇ g / ml of cetuximab (CTX; MERCK, USA) and 5 ⁇ g / ml of Panitu Mumab (panitumumab, Pani; Amgen, USA) was added, and other than that it was confirmed that the movement of cancer cells by GC1118 under the same conditions and methods as Experimental Example 1-1.
  • the migration inhibitory effect was calculated by calculating the percentage of cells that migrated when each antibody was treated based on the case where only HB-EGF was added, as a percentage of the OD value, and the results are shown in FIG. 4.
  • both GC1118 and cetuximab inhibited the migration of cancer cells in a concentration dependent manner. Specifically, cetuximab showed no effect of inhibiting migration at 0.04 ⁇ g / ml, but GC1118 inhibited cell migration by 20%. In addition, cetuximab and panitumumab showed an inhibitory effect of 40% at 5 ⁇ g / ml, while GC1118 inhibited cancer cell migration by 60%.
  • the effect of inhibiting migration was calculated by calculating the percentage of cells migrated when each antibody was treated based on the case where only TGF- ⁇ was added, and the results are shown in FIG. 5.
  • both GC1118 and cetuximab inhibited cancer cell migration in a concentration dependent manner. Specifically, cetuximab and GC1118 did not show a migration inhibitory effect at 0.04 ⁇ g / ml, but at 5 ⁇ g / ml.
  • the effect of inhibiting migration was calculated by calculating the percentage of cells that migrated when each antibody was treated based on the case where only AREG was added, as a percentage of the OD value, and the results are shown in FIG. 6.
  • GC1118 and cetuximab both inhibited the migration of cancer cells in a concentration dependent manner. Specifically, cetuximab and GC1118 did not show a migration inhibitory effect at 0.04 ⁇ g / ml, but showed an effect from 0.2 ⁇ g / ml or more.
  • GC1118 antibody and other antibodies targeting EGFR or HER2 were compared to inhibit the migration of cancer cells.
  • HB-EGF or TGF- ⁇ 20 ng / ml of HB-EGF or TGF- ⁇ , or 500 ng / ml of AREG was added to induce the migration of cancer cells.
  • Others were carried out under the same conditions and methods as in Experimental Example 1-1.
  • the effect of inhibiting migration was calculated by calculating the percentage of cells migrated when each antibody was treated based on the case where only EGFR ligand was added as a percentage of the OD value, and the result is shown in FIG. 7.
  • cetuximab, panitumumab, and GC1118 antibodies targeting EGFR, inhibited cell migration, but trastuzumab, an antibody targeting HER2, had little effect.
  • the migration of cells induced by HB-EGF was inhibited only by GC1118, whereas the migration of cells induced by TGF- ⁇ and AREG showed no difference between antibodies targeting EGFR.
  • the concentrations of HB-EGF, TGF- ⁇ , or AREG ligand to be added to induce migration of AGS cell lines were determined to be 20, 20 and 500 ng / ml, respectively.
  • AGS gastric cancer cell line was used, and the other experiments were conducted under the same conditions and methods as in Experimental Examples 1-2.
  • the effect of inhibiting migration was calculated as a percentage of the OD value of the cells that migrated when each antibody was treated based on the case where only HB-EGF was added, and the results are shown in FIG. 9.
  • GC1118 was superior to cetuximab in inhibiting migration of AGS cell lines. Specifically, cetuximab showed no migration inhibitory effect at 0.04 ⁇ g / ml, and inhibited cancer cell migration by about 40% at 5 ⁇ g / ml. In contrast, GC1118 inhibited cancer cell migration by 40% and 90% at 0.04 and 5 ⁇ g / ml, respectively.
  • both GC1118 and cetuximab inhibited the migration of cancer cells in a concentration dependent manner. Specifically, both antibodies showed an excellent cancer cell migration inhibitory effect at 60% even at 0.04 ⁇ g / ml.
  • Cetuximab, panitumumab, trastuzumab or GC1118 at a concentration of 0.2 ⁇ g / ml was added, and the experiment was carried out under the same conditions and methods as in Experimental Examples 1-5.
  • the effect of inhibiting migration was calculated by calculating the percentage of cells migrated when each antibody was treated based on the case where only EGFR ligand was added as a percentage of the OD value, and the results are shown in FIG. 11.
  • cell staining showed that GC1118 migrated fewer cells than cetuximab or panitumumab, but the OD value was not significantly different from other antibodies. This is due to the small number of migrated cells and does not appear to show a significant difference in OD values.
  • the concentrations of HB-EGF, TGF- ⁇ or AREG ligand to be added to induce migration of AGS cell lines were determined to be 50, 50 and 500 ng / ml, respectively.
  • the migration of cells to 50 ng / ml HB-EGF in the NUGC3 cell line was induced, except that the experiment was carried out under the same conditions and methods as in Experimental Example 1-5.
  • the migration inhibitory effect was calculated by calculating the percentage of cells that migrated when each antibody was treated based on the case where only EGFR ligand was added as a percentage of the OD value, and the results are shown in FIG. 15.
  • cetuximab, panitumumab and trastuzumab did not inhibit the migration of HB-EGF-induced cells, but GC1118 inhibited the migration of cells by 40%.
  • the migration inhibitory effect was calculated by calculating the percentage of cells that migrated when each antibody was treated based on the case where only EGFR ligand was added as a percentage of the OD value, and the results are shown in FIG. 16.
  • cetuximab, panitumumab and GC1118 did not inhibit the migration of TGF- ⁇ -induced cells, but trastuzumab did not inhibit the migration of cells.
  • the effect of inhibiting migration was calculated by calculating the percentage of cells migrated when each antibody was treated based on the case where only EGFR ligand was added as a percentage of the OD value, and the result is shown in FIG. 17.
  • Matrigel chamber analysis was performed to establish the conditions in which AGS cell line, a gastric cancer cell line, is induced by EGFR ligand.
  • AGS cell line which is a gastric cancer cell line, was cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions using RPMI1640 medium to which 10% fetal bovine serum, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin were added. Cultured cells were aliquoted to fill 60% of the T175 flask. After 24 hours, cells were washed with 1 ⁇ PBS, replaced with serum-free RPMI1640 medium, and cultured under the same conditions as above.
  • the Matrigel chamber (Cat. No. 354483, Corning, USA) was filled with RPMI1640 medium (infiltration medium) to which 0.5 ml of fetal bovine serum was added, rehydrated for 2 hours, and then the medium was removed. .
  • the prepared cells were collected by trypsinization and resuspended in serum-free medium containing 0.1% bovine serum albumin.
  • a 24-well plate was filled with 750 ⁇ l of infiltration medium and HB-EGF and TGF- ⁇ were added at 10, 20 or 50 ng / ml. After raising the chamber in a 24-well plate containing 500 ⁇ l of infiltration medium, the resuspended cells were added to 3 ⁇ 10 6 cells per chamber. This was incubated for 24 hours under the same conditions as above, and stained to identify the cells in which infiltration was induced.
  • the medium of the 24-well plate was removed, 500 ⁇ l of 1 ⁇ PBS was added and the chamber was immersed in and washed. 1 ⁇ PBS was removed, a 24-well plate was filled with 500 ⁇ l of 4% paraformaldehyde and the chamber soaked for 10 minutes to fix the cells. Paraformaldehyde was removed, 500 ⁇ l of 0.1% crystal violet solution was filled, and the chamber was soaked for 10 minutes to stain the cells. Then, distilled water was put into a 500 ml beaker and the chamber was washed. Uninfiltrated cells inside the washed chamber were wiped with a cotton swab and dried at room temperature for 1 hour.
  • the stained cells were eluted with 100 ⁇ l of 10% acetic acid solution, and the OD value was measured by an ELISA plate reader at a wavelength of 595 nm.
  • the OD value measured after adding HB-EGF or TGF- ⁇ as a ligand is shown in Fig. 18 or 19, respectively.
  • AGS cell lines were induced by HB-EGF and TGF- ⁇ ligands.
  • the addition of HB-EGF at 10, 20 or 50 ng / ml increased infiltration by 4.1, 4.5 or 3.9 times, respectively, compared to the control.
  • TGF- ⁇ was added at the same concentration, infiltration increased by 1.8, 1.8 or 1.9 times, respectively, compared to the control.
  • Inhibition inhibitory effect is calculated by calculating the percentage of cells infiltrated when treated with each antibody on the basis of the addition of only HB-EGF as a percentage of the OD value and the results are shown in Table 1 and FIG.
  • HB-EGF (20 ng / ml) GC1118 (1 ⁇ g / ml) Cetuximab (1 ⁇ g / ml) Panitumumab (1 ⁇ g / ml) Trastuzumab (1 ⁇ g / ml) 1-1 99.3 50.6 101.0 98.8 87.4 1-2 100.7 56.8 93.8 98.5 93.6 2-1 100.3 57.7 91.8 92.2 83.1 2-2 99.7 64.2 102.9 106.8 86.4 3-1 111.7 33.3 88.6 83.2 95.3 3-2 88.3 34.9 86.2 92.5 91.3 Average(%) 100.0 49.6 94.0 95.3 89.5 Standard Deviation 7.4 12.8 6.7 8.0 4.7
  • GC1118 inhibited the invasion of AGS cell lines induced by HB-EGF with good effect. Specifically, cetuximab, panitumumab or trastuzumab inhibited cell infiltration by 6%, 4.7% or 10.5%, respectively, while GC1118 inhibited cell infiltration by 50.4%.
  • TGF- ⁇ (20 ng / ml) GC1118 (1 ⁇ g / ml) Cetuximab (1 ⁇ g / ml) Panitumumab (1 ⁇ g / ml) Trastuzumab (1 ⁇ g / ml) 1-1 98.0 45.1 78.6 37.9 110.8 1-2 102.0 41.6 83.9 44.8 106.4 2-1 99.7 31.2 50.1 39.0 69.4 2-2 100.3 33.8 46.2 33.8 90.9 3-1 98.0 57.9 65.0 61.9 90.4 3-2 102.0 54.8 66.0 57.9 95.4 Average(%) 100.0 44.1 66.0 45.9 93.9 Standard Deviation 1.83 10.82 14.93 11.50 14.62
  • GC1118 inhibited the infiltration of AGS cell lines induced by TGF- ⁇ with good effect. Specifically, cetuximab or trastuzumab inhibited cell infiltration by 35% and 6.1%, respectively, but GC1118 showed a similar effect to panitumumab which inhibited cell infiltration by 55.9%.
  • Invasion inhibition effect is calculated by calculating the percentage of cells infiltrated when treated with each antibody based on the case where only AREG is added, and the results are shown in Table 3 and Figure 22, respectively.
  • GC1118 inhibited the infiltration of AGS cell lines induced by AREG with good effect. Specifically, GC1118 was 44.6%, which inhibited cell line infiltration to a level similar to that of control cetuximab (42%) or panitumumab (42.8%).
  • Matrigel chamber analysis was performed to establish the conditions under which cancer cells are infiltrated by the EGFR ligand in the NUGC3 cell line. 10, 20 or 50 ng / ml of HB-EGF and TGF- ⁇ , and 40, 200 and 500 ng / ml of AREG were added to infiltrate the infiltration, and the same conditions as in Experimental Example 4-1 and It was performed by the method. As a result, OD values measured after addition of HB-EGF, TGF- ⁇ or AREG as ligands are shown in FIGS. 23 to 25, respectively.
  • NUGC3 cell line was induced by HB-EGF, TGF- ⁇ or AREG ligand. Specifically, when treated with 10, 20 or 50 ng / ml of HB-EGF, cell infiltration increased 2.3, 3.5 and 4.8 times, respectively, and when treated with 10, 20 or 50 ng / ml of TGF- ⁇ , Cell infiltration increased 1.7, 1.9 and 1.9 fold, respectively. On the other hand, treatment with 40, 200 and 500 ng / ml of AREG increased cell infiltration by 1.2, 1.3 and 1.5 fold, respectively.
  • NUGC3 cell line was treated with 50 ng / ml of HB-EGF to induce cell infiltration.
  • the experiment was carried out under the same conditions and methods as in Experimental Example 4-2.
  • Inhibition inhibitory effect is calculated by the percentage of cells infiltrated when treated with each antibody on the basis of the addition of only HB-EGF as a percentage of the OD value and the results are shown in Table 4 and Figure 26, respectively.
  • HB-EGF 50 ng / ml
  • GC1118 1 ⁇ g / ml
  • Cetuximab 1 ⁇ g / ml
  • Panitumumab (1 ⁇ g / ml)
  • Trastuzumab 1 ⁇ g / ml) 1-1 106.6 18.8 76.1 91.5 87.3 1-2 93.4 21.0 81.5 83.0 99.7 2-1 100.3 57.7 91.8 92.2 83.1 2-2 99.7 64.2 102.9 106.8 86.4 3-1 95.3 41.7 106.9 99.6 86.4 3-2 104.7 31.9 84.6 78.4 89.6 Average(%) 100.0 39.2 90.6 91.9 88.7 Standard Deviation 5.13 18.84 12.22 10.42 5.77
  • GC1118 inhibited the infiltration of NUGC3 cell lines induced by HB-EGF with good effect. Specifically, cetuximab, panitumumab, or trastuzumab inhibited cell infiltration by 9.4%, 8.1% and 11.3%, respectively, while GC1118 inhibited cell invasion by 60.8%. That is, infiltration of HB-EGF induced cells in the NUGC3 cell line was specifically inhibited GC1118.
  • TGF- ⁇ at a concentration of 50 ng / ml was treated instead of HB-EGF, and other than that, it was confirmed that cancer cell infiltration was inhibited by GC1118 in the same manner as in Experimental Example 5-2.
  • Inhibition inhibitory effect is calculated by calculating the percentage of cells infiltrated when treated with each antibody based on the case of adding only TGF- ⁇ as a percentage of the OD value and the results are shown in Table 5 and Figure 27, respectively.
  • TGF- ⁇ 50 ng / ml
  • GC1118 1 ⁇ g / ml
  • Cetuximab 1 ⁇ g / ml
  • Panitumumab (1 ⁇ g / ml)
  • Trastuzumab 1 ⁇ g / ml) 1-1 104.1 31.5 27.7 36.0 90.3 1-2 95.9 27.3 31.0 28.9 74.3 2-1 84.5 31.4 37.5 43.2 92.8 2-2 115.5 30.0 41.0 34.7 84.8 3-1 105.8 36.4 40.0 29.9 112.6 3-2 94.2 38.3 41.4 33.3 114.2 Average(%) 100.0 32.5 36.5 34.3 94.8 Standard Deviation 10.77 4.12 5.74 5.13 15.72
  • GC1118 inhibited the infiltration of NUGC3 cell lines induced by TGF- ⁇ with good effect. Specifically, GC1118 was 67.5%, which inhibited cell line infiltration to a level similar to that of control cetuximab (63.5%) or panitumumab (65.7%).
  • AREG was treated at a concentration of 500 ng / ml, and it was confirmed that cancer cell infiltration was inhibited by GC1118 in the same manner as in Experimental Example 4-4.
  • GC1118 inhibited the infiltration of NUGC3 cell lines induced by AREG with good effect. Specifically, GC1118 was 45.2%, which inhibited cell line infiltration at a level similar to that of control cetuximab (41.8%) or panitumumab (43.5%).

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Abstract

본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이를 억제하는 약학 조성물과 상기 조성물을 이용하여 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 상기 조성물 또는 방법은 EGFR 리간드에 의해 유도되는 다양한 위암 세포주의 침윤을 억제하는데 효과적이다. 따라서, 상기 약학 조성물은 암의 전이를 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물
본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물과 상기 조성물을 이용하여 암의 전이를 억제하는 방법에 관한 것이다.
암이 한 조직에서 형성되어 증식하면서 다른 조직으로 이동하는 것을 전이라고 한다. 일단 전이가 일어나면 치료의 효과가 좋지 않을 뿐만 아니라, 재발의 가능성도 높은 것으로 알려져 있다. 암의 전이과정은 이동(migration), 부착(adhesion), 침윤(invasion) 등의 단계로 구성되어 있으며, 이 중 어느 하나를 억제한다면 암의 전이를 억제할 수 있다.
한편, 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)는 170 kDa의 제1형 막 단백질로서, 다양한 종류의 종양에서 과다 발현된다. EGFR은 리간드인 EGF(epidermal growth factor) 및 TGF-α(tumor growth factor-α)와의 결합을 통해 활성화되어 종양 세포의 증식을 유도한다고 보고된 바 있다. 이에, EGFR은 종양의 증식을 억제하기 위한 표적으로 연구되고 있다.
그러나, EGFR을 표적으로 하는 항체를 이용하여 암의 전이를 억제할 수 있는지 여부에 대해서는 알려진 바가 없다. 이에, 본 발명자들은 EGFR을 표적으로 하는 항체가 위암 세포주의 침윤을 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 전이를 억제하는 약학 조성물과 상기 조성물을 이용하여 암의 전이를 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고, 상기 항체가, a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 암의 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 암의 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 암의 전이 억제용 조성물 또는 암의 전이를 억제하는 방법은, EGFR 리간드에 의해 유도되는 다양한 위암 세포주의 이동 및 침윤을 억제하는데 효과적이다. 따라서, 본 발명의 조성물 또는 방법은 암의 전이를 억제하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 NCI-N87 세포주에 HB-EGF를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 NCI-N87 세포주에 TGF-α를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 NCI-N87 세포주에 AREG를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 HB-EGF에 의해 세포이동이 유도된 NCI-N87 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 5는 TGF-α에 의해 세포이동이 유도된 NCI-N87 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 6은 AREG에 의해 세포이동이 유도된 NCI-N87 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 7은 NCI-N87 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 처리하였을 때, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 8은 AGS 세포주에 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 HB-EGF에 의해 세포이동이 유도된 AGS 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 10은 AREG 에 의해 세포이동이 유도된 AGS 세포주에 GC1118을 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 11은 AGS 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 처리하였을 때, 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 12는 NUGC3 세포주에 HB-EGF를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 13은 NUGC3 세포주에 TGF-α를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 14는 NUGC3 세포주에 AREG를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 나타낸 그래프이다.
도 15는 HB-EGF에 의해 세포이동이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 16은 TGF-α에 의해 세포이동이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 17은 AREG에 의해 세포이동이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 이동한 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 18은 AGS 세포주에 HB-EGF를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 19는 AGS 세포주에 TGF-α를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 20은 HB-EGF에 의해 침윤이 유도된 AGS 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 21은 TGF-α에 의해 침윤이 유도된 AGS 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 22는 AREG에 의해 침윤이 유도된 AGS 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 23은 NUGC3 세포주에 HB-EGF를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 24는 NUGC3 세포주에 TGF-α를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 25는 NUGC3 세포주에 AREG를 농도에 따라 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 나타낸 그래프이다.
도 26은 HB-EGF에 의해 침윤이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 27은 TGF-α에 의해 침윤이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
도 28은 AREG에 의해 침윤이 유도된 NUGC3 세포주에 다양한 EGFR 또는 HER2에 대한 항체를 첨가하고, 이에 따라 세포가 침윤된 정도를 대조군과 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고, 상기 항체가, a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 상보성 결정 영역(CDR)1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역을 포함하는, 암의 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 항체는, a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는 b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역일 수 있다. 한편, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 공지된 인간 항체의 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역일 수 있고, 구체적으로 상기 중쇄 불변 영역 또는 경쇄 불변 영역은 각각 서열번호 11 또는 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “암의 전이”는 암세포가 원발장기에서 다른 장기로 이동하여 증식하는 것을 의미한다. 암세포가 신체의 다른 부분으로 이동하는 것은, 원발암에서 암조직이 성장하여 주의의 장기를 직접적으로 침윤하는 것과 멀리 있는 다른 장기로 혈관이나 림프관을 따라 이동하여 전이되는 것을 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 암의 전이를 억제하기 위해 사용될 수 있다. 이때, 상기 전이는 EGFR 리간드에 의해 유도되거나 촉진될 수 있다. 상기 EGFR 리간드는 HB-EGF(heparin binding-EGF-like growth factor), TGF-α(transforming growth factor-α), AREG(amphiregulin) 또는 이의 조합일 수 있다. 또한, 상기 암은 고형암이고, 이는 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부암, 경부암, 난소암, 전립선암, 대장암 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 위암일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 암의 전이를 효과적으로 억제하므로, 본 발명의 조성물에 암의 전이를 억제하는 효과가 있음이 공지된 물질을 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 본 발명의 항체에 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기에 따른 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 제형화하여 사용될 수 있다. 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있다. 또한, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 90 중량%, 또는 약 80 중량% 내지 약 89.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택 가능하다. 또한, 상기 항체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 항체를 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는, 피하, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 척추 내, 수강막 내, 정맥 내 투여가 있다.
상기 투여는 2주일에 1회 이상, 구체적으로 2주일에 1 내지 2회로 나누어 투여될 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 투여는 1주일에 1회, 또는 2주일에 1회일 수 있다. 상기 투여시, 1주일에 1회 투여하는 경우, 투여량은 몸무게당 1 내지 6 ㎎/㎏ 또는 3 내지 5 ㎎/㎏일 수 있다. 2주일에 1회 투여하는 경우, 투여량은 몸무게당 3 내지 15 ㎎/㎏, 5 내지 12 ㎎/㎏, 6 내지 10 ㎎/㎏ 또는 7 내지 9 ㎎/㎏일 수 있다.
또한, 본 발명은 암의 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 EGFR 리간드에 의한 암의 이동 및 침윤을 억제함으로써, 암의 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 상기 암은 고형암이고, 이는 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부암, 경부암, 난소암, 전립선암, 대장암 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 위암일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 항- EGFR 항체의 선별 및 제조
표피 성장 인자 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여, 사람 골수 RNA, 사람 흉선 RNA, 사람 비장 RNA 및 사람 B 세포 RNA를 혼합하여 항체 유전자 라이브러리를 구축하였다. 상기 RNA 유전자 라이브러리로부터 분리한 RNA 유전자를 주형으로 cDNA를 합성한 뒤, 상기 cDNA를 주형으로 각각 scFv 영역, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 맞게 고안된 프라이머를 사용하여 항체 DNA를 합성하였다. 상기 합성된 항체 DNA를 파아지-디스플레이 벡터 pKS4H(녹십자, 대한민국, 대한민국 등록특허 제10-0635370호 참조)에 삽입하여 항체 DNA 라이브러리를 제작하였다. 그 후, 상기 항체 DNA 라이브러리로 EGFR에 결합하는 항체를 패닝 기법으로 선별하였다. 패닝은 4회 수행되었고, 최종 선별된 DNA 라이브러리를 포함하는 콜로니로부터 항체의 발현을 유도하였다. 이때, 항체의 발현 여부는 EGFR이 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 ELISA로 측정하였다.
상기 과정으로 선별된 항체 단편을 완전한 형태의 면역글로불린으로 제조하기 위하여 녹십자사의 항체 발현 벡터인 pRC13 및 pKC12(B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 인간 항체의 가변영역을 삽입할 수 있는 항체발현 플라스미드, 대한민국 등록특허 제10-523732호 참조; 기탁번호 KCLRF-BP-00054)를 사용하였다. 상기 벡터에 삽입된 항체 단편은 CHO 세포에 도입되어 완전한 형태의 면역글로불린으로 발현되었고, 이렇게 발현된 항체는 단백질 A-아가로스 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech, 미국)으로 정제되었다(구체적인 항체의 선별 및 제조방법은 대한민국 등록특허 제10-0092401호에 기재된 바와 같다).
그 결과, 선별 및 제조된 항체를 GC1118이라고 명명하였다. 상기 항체는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 불변 영역, 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 불변 영역을 포함하고 있다.
I. 항- EGFR 항체의 위암 세포주 이동 억제 효과 확인
실험예 1. 항- EGFR 항체의 투여에 의한 NCI-N87 위암 세포주의 이동 억제 효과 확인
1-1. EGFR 리간드에 의한 NCI-N87 위암 세포주의 이동 유도
위암 세포주인 NCI-N87 세포주가 EGFR 리간드에 의해 암세포의 이동이 유도되는 조건을 확립하기 위하여 세포 이동 분석을 수행하였다.
먼저, NCI-N87 세포주(ATCC, 미국)는 10% 소태아 혈청, 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 배양한 세포를 T175 플라스크의 70%가 차도록 분주하였다. 24시간 후 1xPBS로 세척하고, 무혈청 RPMI1640 배지로 교체하여 상기와 동일한 조건하에서 배양하여 준비하였다.
한편, 1xPBS에 5 ㎍/㎖의 제1형 콜라겐을 희석하고, 트랜스웰 인서트(insert)에 250 ㎕의 희석된 콜라겐을 채운 뒤, 냉장고에서 24시간 동안 방치하였다. 제1형 콜라겐으로 코팅된 트랜스웰 인서트를 1 ㎖의 1xPBS로 세척하고, 클린 벤치(clean bench)에서 건조시켰다. 상기 준비된 NCI-N87 세포주를 트립신 처리하여 모아 무혈청 배지에 재현탁하고, 트렌스웰 인서트 당 4x106개의 세포가 되도록 분주하였다. 또한, 24-웰 플레이트에 750 ㎕의 무혈청 배지를 채우고, EGFR 리간드를 첨가하고, 상기 트랜스웰 인서트를 넣었다. 이때, HB-EGF(heparin binding-EGF-like growth factor, 259-HE-250, R&D systems, 미국) 및 TGF-α(transforming growth factor-α, 239-A-100, R&D systems, 미국)는 0, 20, 100 또는 500 ng/㎖ 로, AREG(amphiregulin, 262-AR, R&D Systems, 미국)는 0, 40, 200 또는 1,000 ng/㎖로 첨가하였다. 24-웰 플레이트는 상기와 동일한 조건에서 6시간 동안 배양하고, 염색을 하여 이동이 유도된 세포들을 확인하였다.
구체적으로, 24-웰 플레이트의 배지를 제거하고, 700 ㎕의 1xPBS를 넣고, 여기에 트랜스웰 인서트를 담가 세척하였다. 1xPBS를 제거하고, 500 ㎕의 4% 파라포름알데하이드를 채우고, 15분 동안 인서트를 담가 세포를 고정시켰다. 파라포름알데하이드를 제거하고, 다시 동량의 1xPBS로 인서트를 세척하고, 500 ㎕의 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액을 채운 뒤, 30분 동안 인서트를 담가 세포를 염색하였다. 그 후, 500 ㎖ 비이커에 증류수를 넣고, 인서트를 세척하였다. 세척된 인서트 안쪽에 남아있는 세포는 면봉으로 닦아내었다. 염색된 세포를 100 ㎕의 10% 아세트산 용액으로 용출시킨 뒤, 595 ㎚의 파장에서 ELISA 플레이트 리더로 OD값을 측정하였다. 그 결과, HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 리간드로 첨가한 뒤 측정한 OD 값을 각각 도 1 내지 3에 나타내었다.
도 1 내지 3에 나타난 바와 같이, NCI-N87 세포주의 이동을 유도하기 위해 첨가할 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG 리간드의 농도는 각각 20, 20 및 500 ng/㎖로 결정하였다.
1-2. HB - EGF로 이동이 유도된 NCI-N87 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인
NCI-N87 세포주에 20 ng/㎖의 HB-EGF를 처리하여 세포의 이동을 유도하였다. 여기에 0.04, 0.2, 1 또는 5 ㎍/㎖의 GC1118, 또는 비교예로서 0.04, 0.2, 1 또는 5 ㎍/㎖의 세툭시맙(cetuximab, CTX; MERCK, 미국)과 5 ㎍/㎖의 파니투무맙(panitumumab, Pani; Amgen, 미국)을 첨가하였으며, 그 외에는 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 GC1118에 의해 암세포의 이동이 억제되는 것을 확인하였다.
이동 억제 효과는, HB-EGF만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, GC1118 및 세툭시맙은 모두 농도 의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 구체적으로 0.04 ㎍/㎖에서 세툭시맙은 이동을 억제하는 효과를 나타내지 않았으나, GC1118은 20%로 세포의 이동을 억제하였다. 또한, 5 ㎍/㎖에서 세툭시맙 및 파니투무맙은 40%의 억제 효과를 보인 반면, GC1118은 60%로 암세포의 이동을 억제하였다.
1-3. TGF -α로 이동이 유도된 NCI-N87 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인
HB-EGF 대신 20 ng/㎖의 TGF-α로 세포의 이동을 유도하였고, 비교예로서 세툭시맙을 첨가하였으며, 그 외에는 실험예 1-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.
이동 억제 효과는, TGF-α만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, GC1118 및 세툭시맙은 모두 농도 의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 구체적으로 0.04 ㎍/㎖에서 세툭시맙 및 GC1118은 이동 억제 효과를 보이지 않았으나, 5 ㎍/㎖에서는 그 효과를 나타내었다.
1-4. AREG로 이동이 유도된 NCI-N87 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인
HB-EGF 대신 500 ng/㎖의 AREG로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 1-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.
이동 억제 효과는, AREG만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, GC1118 및 세툭시맙은 모두 농도 의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 구체적으로 0.04 ㎍/㎖에서 세툭시맙 및 GC1118은 이동 억제 효과를 보이지 않았으나, 0.2 ㎍/㎖ 이상부터 그 효과를 나타내었다.
1-5. GC1118 항체 및 다른 EGFR 항체에 의한 암세포의 이동 억제 효과 비교
GC1118 항체와 EGFR 또는 HER2 표적하는 다른 항체들이 암세포의 이동을 억제하는 효과를 비교하였다.
먼저, 20 ng/㎖의 HB-EGF 또는 TGF-α, 또는 500 ng/㎖의 AREG를 첨가하여 암세포의 이동을 유도하였다. 여기에 1 ㎍/㎖의 세툭시맙, 파니투무맙, 트라스트주맙(trastzumab, Trast; Roche, 미국) 또는 GC1118을 첨가하고, 대조군으로서는 면역글로불린을 사용하였다. 그 외에는 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, EGFR을 표적으로 하는 항체인 세툭시맙, 파니투무맙 및 GC1118은 세포의 이동을 억제하였으나, HER2를 표적으로 하는 항체인 트라스투주맙은 그 효과가 미미하였다. 한편, HB-EGF에 의해 유도된 세포의 이동은 GC1118에 의해서만 억제된 반면, TGF-α 및 AREG에 의해 유도된 세포의 이동은 EGFR을 표적으로 하는 항체 간에 차이를 보이지 않았다.
실험예 2. 항- EGFR 항체의 투여에 의한 AGS 위암 세포주의 이동 억제 효과 확인
2-1. EGFR 리간드에 의한 AGS 위암 세포주의 이동 유도
AGS 세포주(ATCC, 미국)에서 EGFR 리간드에 의해 암세포의 이동이 유도되는 조건을 확립하였다. 트랜스웰 인서트에 3x106개의 세포를 분주하였고, 그 외에는 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 그 결과, HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 리간드로서 첨가한 뒤, 측정한 OD 값을 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이 AGS 세포주의 이동을 유도하기 위해 첨가할 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG 리간드의 농도는 각각 20, 20 및 500 ng/㎖로 결정하였다.
2-2. HB - EGF로 이동이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인
AGS 위암 세포주를 사용하였고, 그 외에는 실험예 1-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 하였다. 이동 억제 효과는, HB-EGF만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, GC1118이 세툭시맙보다 AGS 세포주의 이동을 억제하는 효과가 우수하였다. 구체적으로, 0.04 ㎍/㎖ 에서 세툭시맙은 이동 억제효과를 보이지 않았고, 5 ㎍/㎖에서는 약 40%로 암세포의 이동을 억제하였다. 반면, GC1118은 0.04 및 5 ㎍/㎖에서 각각 40% 및 90%로 암세포의 이동을 억제하였다.
2-3. AREG로 이동이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 확인
AGS 위암 세포주에서 1,000 ng/㎖의 AREG로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 1-4와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다. 이동 억제 효과는, AREG만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, GC1118 및 세툭시맙은 모두 농도 의존적으로 암세포의 이동을 억제하였다. 구체적으로, 두 항체 모두 0.04 ㎍/㎖에서도 60%로 우수한 암세포 이동 억제 효과를 나타내었다.
2-4. GC1118 항체 및 다른 EGFR 항체에 의한 암세포의 이동 억제 효과 비교
0.2 ㎍/㎖ 농도의 세툭시맙, 파니투무맙, 트라스트주맙 또는 GC1118을 첨가하였고, 그 외에는 실험예 1-5와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다. 이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, EGFR을 표적으로 하는 항체인 세툭시맙, 파니투무맙 및 GC1118은 세포의 이동을 억제하였으나, HER2를 표적으로 하는 항체인 트라스트주맙은 효과가 없었다. 한편, 세포 염색 결과, GC1118은 세툭시맙 또는 파니투무맙보다 더 적은 수의 세포가 이동한 것으로 나타났으나, OD 값은 다른 항체들과 큰 차이가 없었다. 이는 이동된 세포의 수가 적어 OD 값에서 큰 차이를 나타내지 않은 것으로 보인다.
실험예 3. EGFR 리간드에 의한 NUGC3 위암 세포주의 이동 억제 효과 확인
3-1. EGFR 리간드에 의한 NUGC3 위암 세포주의 이동 유도
NUGC3 세포주(ATCC, 미국)에서 EGFR 리간드에 의해 암세포의 이동이 유도되는 조건을 확립하였다. 트랜스웰 인서트에 2x106개의 세포를 분주하였고, HB-EGF 및 TNF-α는 0, 0.4, 2, 10, 50 및 250 ng/㎖로, AREG는 0, 1.6, 8, 40, 200 및 1,000 ng/㎖로 첨가하였다. 그 외에는 실험예 1-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 그 결과, HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 리간드로 첨가한 뒤 측정한 OD 값을 각각 도 12 내지 14에 나타내었다.
도 12 내지 14에 나타난 바와 같이, AGS 세포주의 이동을 유도하기 위해 첨가할 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG 리간드의 농도는 각각 50, 50 및 500 ng/㎖로 결정하였다.
3-2. HB - EGF로 이동이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 비교
NUGC3 세포주에서 50 ng/㎖의 HB-EGF로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 1-5와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다. 이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 세툭시맙, 파니투무맙 및 트라스트주맙은 HB-EGF로 유도된 세포의 이동을 억제하지 못하였으나, GC1118은 40%로 세포의 이동을 억제하였다.
3-3. TGF -α로 이동이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 비교
HB-EGF 대신 50 ng/㎖의 TGF-α로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 3-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.
이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 세툭시맙, 파니투무맙 및 GC1118은 TGF-α로 유도된 세포의 이동을 억제하지 못하였으나, 트라스트주맙은 세포의 이동을 억제하지 못하였다.
3-4. AREG로 이동이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 이동 억제 효과 비교
HB-EGF 대신 500 ng/㎖의 AREG로 세포의 이동을 유도하였고, 그 외에는 실험예 3-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.
이동 억제 효과는, EGFR 리간드만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 이동한 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, EGFR을 표적으로 하는 항체인 세툭시맙, 파니투무맙 및 GC1118은 세포의 이동을 억제하였으나, HER2를 표적으로 하는 항체인 트라스투주맙은 그 효과가 없었다.
II. 항- EGFR 항체의 위암 세포주 전이 억제 효과 확인
실험예 4. 항- EGFR 항체의 투여에 의한 AGS 위암 세포주의 전이 억제 효과 확인
4-1. EGFR 리간드에 의한 AGS 암세포의 침윤 유도
위암 세포주인 AGS 세포주가 EGFR 리간드에 의해 침윤이 유도되는 조건을 확립하기 위하여 마트리겔 챔버 분석을 수행하였다.
먼저, 위암 세포주인 AGS 세포주는 10% 소태아 혈청, 100 U/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 배양한 세포를 T175 플라스크의 60%가 차도록 분주하였다. 24시간 후, 세포를 1xPBS로 세척하고, 무혈청 RPMI1640 배지로 교체하여 상기와 동일한 조건하에서 배양하여 준비하였다.
한편, 마트리겔 챔버(Cat. No. 354483, Corning, 미국)에 0.5 ㎖의 소태아 혈청이 첨가된 RPMI1640 배지(침윤배지)를 채우고, 2시간 동안 재수화시킨(rehydrate) 뒤, 배지를 제거하였다. 상기 준비된 세포를 트립신 처리하여 모으고, 0.1% 소혈청 알부민이 포함된 무혈청 배지에 재현탁하였다. 24-웰 플레이트에 750 ㎕의 침윤배지를 채우고, HB-EGF 및 TGF-α를 10, 20 또는 50 ng/㎖로 첨가하였다. 500 ㎕의 침윤 배지를 넣은 24-웰 플레이트에 챔버를 올린 뒤, 상기 재현탁한 세포를 챔버 당 3x106개가 되도록 첨가하였다. 이를 상기와 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하고, 염색을 하여 침윤이 유도된 세포들을 확인하였다.
구체적으로, 24-웰 플레이트의 배지를 제거하고, 500 ㎕의 1xPBS를 첨가한 뒤, 여기에 챔버를 담가 세척하였다. 1xPBS를 제거하고, 24-웰 플레이트에 500 ㎕의 4% 파라포름알데하이드를 채우고, 10분 동안 챔버를 담가 세포를 고정시켰다. 파라포름알데하이드를 제거하고, 500 ㎕의 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액을 채운 뒤, 10분 동안 챔버를 담가 세포를 염색하였다. 그 후, 500 ㎖ 비이커에 증류수를 넣고, 챔버를 세척하였다. 세척된 챔버 안쪽에 침윤되지 않은 세포는 면봉으로 닦아내고, 이를 1시간 동안 실온에서 건조시켰다. 또한, 상기 염색된 세포는 100 ㎕의 10% 아세트산 용액으로 용출시킨 뒤, 595 ㎚의 파장에서 ELISA 플레이트 리더로 OD값을 측정하였다. 그 결과, HB-EGF 또는 TGF-α를 리간드로 첨가한 뒤 측정한 OD 값을 각각 도 18 또는 19에 나타내었다.
도 18 및 19에 나타난 바와 같이, AGS 세포주는 HB-EGF 및 TGF-α 리간드에 의해 침윤이 유도되었다. 10, 20 또는 50 ng/㎖로 HB-EGF를 첨가한 경우 대조군과 비교하여 각각 4.1, 4.5 또는 3.9배로 침윤이 증가하였다. 또한, 동일한 농도로 TGF-α를 첨가한 경우 대조군과 비교하여 각각 1.8, 1.8 또는 1.9배로 침윤이 증가하였다.
4-2. HB - EGF로 침윤이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인
20 ng/㎖의 HB-EGF로 세포의 침윤을 유도하였고, 그 외에는 실험예 4-1과 동일한 조건 및 방법으로 실험을 하였다. 이때, 실험군으로서 1 ㎍/㎖의 GC1118을 첨가하였고, 비교예로서 1 ㎍/㎖의 세툭시맙, 파니투무맙 또는 트라스트주맙을 사용하였다. 실험은 두 세트씩 세 번 반복하여 그 평균값을 나타내었다.
침윤 억제 효과는, HB-EGF만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 표 1 및 도 20에 나타내었다.
HB-EGF(20 ng/㎖) GC1118(1 ㎍/㎖) 세툭시맙(1 ㎍/㎖) 파니투무맙(1 ㎍/㎖) 트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1 99.3 50.6 101.0 98.8 87.4
1-2 100.7 56.8 93.8 98.5 93.6
2-1 100.3 57.7 91.8 92.2 83.1
2-2 99.7 64.2 102.9 106.8 86.4
3-1 111.7 33.3 88.6 83.2 95.3
3-2 88.3 34.9 86.2 92.5 91.3
평균(%) 100.0 49.6 94.0 95.3 89.5
표준편차 7.4 12.8 6.7 8.0 4.7
표 1 및 도 20에 나타난 바와 같이, GC1118이 HB-EGF에 의해 유도된 AGS 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로, 세툭시맙, 파니투무맙 또는 트라스트주맙은 각각 6%, 4.7% 또는 10.5%로 세포의 침윤을 억제하였으나, GC1118은 50.4%로 세포의 침윤을 억제하였다.
4-3. TGF -α로 침윤이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인
HB-EGF 대신 20 ng/㎖의 TGF-α로 세포의 침윤을 유도하였고, 그 외에는 실험예 4-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.
침윤 억제 효과는, TGF-α만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 2 및 도 21에 나타내었다.
TGF-α(20 ng/㎖) GC1118(1 ㎍/㎖) 세툭시맙(1 ㎍/㎖) 파니투무맙(1 ㎍/㎖) 트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1 98.0 45.1 78.6 37.9 110.8
1-2 102.0 41.6 83.9 44.8 106.4
2-1 99.7 31.2 50.1 39.0 69.4
2-2 100.3 33.8 46.2 33.8 90.9
3-1 98.0 57.9 65.0 61.9 90.4
3-2 102.0 54.8 66.0 57.9 95.4
평균(%) 100.0 44.1 66.0 45.9 93.9
표준편차 1.83 10.82 14.93 11.50 14.62
표 2 및 도 21에 나타난 바와 같이, GC1118이 TGF-α에 의해 유도된 AGS 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로, 세툭시맙 또는 트라스트주맙은 각각 35% 및 6.1%로 세포의 침윤을 억제하였으나, GC1118은 55.9%로, 54.1%로 세포의 침윤을 억제한 파니투무맙과 유사한 효과를 보였다.
4-4. AREG로 침윤이 유도된 AGS 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인
HB-EGF 대신 1,000 ng/㎖의 AREG로 세포의 침윤을 유도하고, 실험을 두 세트씩 2회 반복하였으며, 그 외에는 실험예 4-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.
침윤 억제 효과는, AREG만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 3 및 도 22에 나타내었다.
AREG(1,000 ng/㎖) GC1118(1 ㎍/㎖) 세툭시맙(1 ㎍/㎖) 파니투무맙(1 ㎍/㎖) 트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1 93.8 55.3 65.2 68.8 93.8
1-2 106.2 61.3 60.3 58.4 107.0
2-1 95.4 51.8 54.2 51.5 96.7
2-2 104.6 53.1 52.3 49.9 115.5
평균(%) 100.0 55.4 58.0 57.2 103.3
표준편차 6.34 4.21 5.87 8.62 9.96
표 3 및 도 22에 나타난 바와 같이, GC1118이 AREG에 의해 유도된 AGS 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로 GC1118은 44.6%로, 대조군인 세툭시맙(42%) 또는 파니투무맙(42.8%)과 유사한 수준으로 세포주의 침윤을 억제하였다.
실험예 5. 항- EGFR 항체의 투여에 의한 NUGC3 위암 세포주의 전이 억제 효과 확인
5-1. EGFR 리간드에 의한 NUGC3 암세포의 침윤 유도
NUGC3 세포주에서 EGFR 리간드에 의해 암세포의 침윤이 유도되는 조건을 확립하기 위하여 마트리겔 챔버 분석을 수행하였다. 침윤 유도를 위해 EGFR 리간드인 10, 20 또는 50 ng/㎖의 HB-EGF 및 TGF-α, 및 40, 200 및 500 ng/㎖의 AREG를 첨가하였고, 그 외에는 실험예 4-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행하였다. 그 결과, HB-EGF, TGF-α 또는 AREG를 리간드로 첨가한 뒤 측정한 OD 값을 각각 도 23 내지 25에 나타내었다.
도 23 내지 25에 나타난 바와 같이, NUGC3 세포주는 HB-EGF, TGF-α 또는 AREG 리간드에 의해 침윤이 유도되었다. 구체적으로 10, 20 또는 50 ng/㎖의 HB-EGF를 처리한 경우, 세포의 침윤이 각각 2.3, 3.5 및 4.8배 증가하였고, 10, 20 또는 50 ng/㎖의 TGF-α를 처리한 경우, 세포의 침윤이 각각 1.7, 1.9 및 1.9배 증가하였다. 한편, 40, 200 및 500 ng/㎖의 AREG를 처리한 경우, 세포의 침윤이 각각 1.2, 1.3 및 1.5배 증가하였다.
5-2. HB - EGF로 침윤이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인
NUGC3 세포주에 50 ng/㎖의 HB-EGF를 처리하여 세포의 침윤을 유도하였고, 그 외에는 실험예 4-2와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였다.
침윤 억제 효과는, HB-EGF만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 4 및 도 26에 나타내었다.
HB-EGF(50 ng/㎖) GC1118(1 ㎍/㎖) 세툭시맙(1 ㎍/㎖) 파니투무맙(1 ㎍/㎖) 트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1 106.6 18.8 76.1 91.5 87.3
1-2 93.4 21.0 81.5 83.0 99.7
2-1 100.3 57.7 91.8 92.2 83.1
2-2 99.7 64.2 102.9 106.8 86.4
3-1 95.3 41.7 106.9 99.6 86.4
3-2 104.7 31.9 84.6 78.4 89.6
평균(%) 100.0 39.2 90.6 91.9 88.7
표준편차 5.13 18.84 12.22 10.42 5.77
표 4 및 도 26에 나타난 바와 같이, GC1118이 HB-EGF에 의해 유도된 NUGC3 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로, 세툭시맙, 파니투무맙, 또는 트라스트주맙은 각각 9.4%, 8.1% 및 11.3%로 세포의 침윤을 억제하였으나, GC1118은 60.8%로 세포의 침윤을 억제하였다. 즉, NUGC3 세포주에서 HB-EGF에 의해 유도된 세포의 침윤은 GC1118 특이적으로 억제되었다.
5-3. TGF -α로 침윤이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인
HB-EGF 대신 50 ng/㎖의 농도의 TGF-α를 처리하였으며, 그 외에는 실험예 5-2와 동일한 방법으로 GC1118에 의해 암세포의 침윤이 억제되는 것을 확인하였다.
침윤 억제 효과는, TGF-α만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 5 및 도 27에 나타내었다.
TGF-α(50 ng/㎖) GC1118(1 ㎍/㎖) 세툭시맙(1 ㎍/㎖) 파니투무맙(1 ㎍/㎖) 트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1 104.1 31.5 27.7 36.0 90.3
1-2 95.9 27.3 31.0 28.9 74.3
2-1 84.5 31.4 37.5 43.2 92.8
2-2 115.5 30.0 41.0 34.7 84.8
3-1 105.8 36.4 40.0 29.9 112.6
3-2 94.2 38.3 41.4 33.3 114.2
평균(%) 100.0 32.5 36.5 34.3 94.8
표준편차 10.77 4.12 5.74 5.13 15.72
표 5 및 도 27에 나타난 바와 같이, GC1118이 TGF-α에 의해 유도된 NUGC3 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로 GC1118은 67.5%로, 대조군인 세툭시맙(63.5%) 또는 파니투무맙(65.7%)과 유사한 수준으로 세포주의 침윤을 억제하였다.
5-4. AREG로 침윤이 유도된 NUGC3 위암 세포주에서 GC1118 항체의 침윤 억제 효과 확인
HB-EGF 대신 500 ng/㎖의 농도의 AREG를 처리하였으며, 그 외에는 실험예 4-4와 동일한 방법으로 GC1118에 의해 암세포의 침윤이 억제되는 것을 확인하였다.
침윤 억제 효과를 확인하기 위해, AREG만을 첨가한 경우를 기준으로 각 항체를 처리하였을 때 침윤된 세포의 비율을 OD 값에 대한 백분율로 계산하여 그 결과를 각각 표 6 및 도 28에 나타내었다.
AREG(500 ng/㎖) GC1118(1 ㎍/㎖) 세툭시맙(1 ㎍/㎖) 파니투무맙(1 ㎍/㎖) 트라스트주맙(1 ㎍/㎖)
1-1 100.2 40.2 48.8 40.2 89.0
1-2 99.8 50.7 50.7 47.8 90.7
2-1 99.6 59.8 65.9 62.9 89.0
2-2 100.4 59.6 59.6 61.1 111.8
3-1 97.3 62.4 59.8 64.9 103.8
3-2 102.7 56.1 64.2 62.4 94.7
평균(%) 100.0 54.8 58.2 56.5 96.5
표준편차 1.74 8.21 6.98 10.09 9.35
표 6 및 도 28에 나타난 바와 같이, GC1118이 AREG에 의해 유도된 NUGC3 세포주의 침윤을 우수한 효과로 억제하였다. 구체적으로 GC1118은 45.2%로, 대조군인 세툭시맙(41.8%) 또는 파니투무맙(43.5%)과 유사한 수준으로 세포주의 침윤을 억제하였다.

Claims (11)

  1. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함하고,
    상기 항체가,
    a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
    b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
    을 포함하는 암의 전이 억제용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가,
    a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
    b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
    을 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 암이 고형암인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 고형암이 위암인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 전이는 EGFR 리간드에 의해 유도 또는 촉진되는 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, EGFR 리간드는 HB-EGF(heparin binding-EGF-like growth factor), TGF-α(transforming growth factor-α), AREG(amphiregulin) 및 이의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물이 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 및 이의 혼합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 더 포함하는, 조성물.
  8. a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
    b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
    을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체를 개체에 투여하는 것을 포함하는 암의 전이를 억제하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체가,
    a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
    b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
    을 포함하는 것인, 방법.
  10. 암의 전이를 억제하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한,
    a) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
    b) 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 9, 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 각각 표시되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
    을 포함하는 EGFR에 특이적으로 결합하는 항체의 용도.
  11. 제10항에 있어서, 상기 항체가,
    a) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역; 또는
    b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역, 중쇄 불변 영역, 및 경쇄 불변 영역
    을 포함하는 것인, 용도.
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