CN109195627A - 包含与表皮生长因子受体特异性结合的抗体作为活性成分的用于抑制癌症转移的药物组合物 - Google Patents

包含与表皮生长因子受体特异性结合的抗体作为活性成分的用于抑制癌症转移的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含与表皮生长因子受体特异性结合的抗体作为活性成分的用于抑制癌症转移的药物组合物，以及使用所述组合物抑制癌症转移的方法。所述组合物或方法对抑制由EGFR配体诱导的多种胃癌细胞系的侵袭是有效的。因此，所述药物组合物可有效地用于抑制癌症的转移。

Description

包含与表皮生长因子受体特异性结合的抗体作为活性成分的 用于抑制癌症转移的药物组合物
技术领域
本发明涉及包含与表皮生长因子受体特异性结合的抗体作为活性成分的用于抑制癌症转移的药物组合物，以及使用所述组合物抑制癌症转移的方法。
背景技术
如果癌症在一个组织中形成并随着其生长移动到另一个组织，则被称为转移。一旦转移发生，治疗不仅无效，而且复发的可能性很高。癌症转移的过程由迁移、黏附、侵袭等步骤构成，并且任一个步骤的抑制都可抑制癌症的转移。
同时，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是170kDa的1型膜蛋白，其在多种类型的肿瘤中过表达。已经报道，EGFR通过与配体EGF(表皮生长因子)和TGF-α(肿瘤生长因子-α)结合而被活化，以诱导肿瘤细胞的增殖。因此，已经研究将EGFR作为抑制肿瘤增殖的靶标。
然而，尚不清楚能够靶向EGFR的抗体是否可用于抑制癌症的转移。因此，本发明人已经证实了靶向EGFR的抗体抑制胃癌细胞系的侵袭，并且完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供包含与表皮生长因子受体特异性结合的抗体作为活性成分的用于抑制癌症转移的药物组合物，以及使用所述组合物抑制癌症转移的方法。
问题的解决方案
为了实现本发明的上述目的，提供了用于抑制癌症转移的药物组合物，其包含作为活性成分的与表皮生长因子受体(EGFR)特异性结合的抗体，其中所述抗体包含：a)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或b)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。
此外，本发明提供了用于抑制癌症转移的方法，其包括施用本发明的组合物。
此外，本发明提供了本发明组合物用于制备用于抑制癌症转移的药物的用途。
发明的有益效果
根据本发明用于抑制癌症转移的组合物或用于抑制癌症转移的方法对抑制由EGFR配体诱导的多种胃癌细胞系的迁移和侵袭是有效的。因此，本发明的组合物或方法可有效地用于抑制癌症的转移。
附图简述
图1是示出取决于添加至NCI-N87细胞系的HB-EGF浓度的细胞迁移程度的图。
图2是示出取决于添加至NCI-N87细胞系的TGF-α浓度的细胞迁移程度的图。
图3是示出取决于添加至NCI-N87细胞系的AREG浓度的细胞迁移程度的图。
图4是示出与对照组相比，取决于添加至NCI-N87细胞系的GC1118浓度的细胞迁移程度的图，其中细胞迁移由HB-EGF诱导。
图5是示出与对照组相比，取决于添加至NCI-N87细胞系的GC1118浓度的细胞迁移程度的图，其中细胞迁移由TGF-α诱导。
图6是示出与对照组相比，取决于添加至NCI-N87细胞系的GC1118浓度的细胞迁移程度的图，其中细胞迁移由AREG诱导。
图7是示出与对照组相比，当向NCI-N87细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞迁移程度的图。
图8是示出取决于添加至AGS细胞系的HB-EGF、TGF-α或AREG浓度的细胞迁移程度的图。
图9是示出与对照组相比，取决于添加至AGS细胞系的GC1118浓度的细胞迁移程度的图，其中细胞迁移由HB-EGF诱导。
图10是示出与对照组相比，取决于添加至AGS细胞系的GC1118浓度的细胞迁移程度的图，其中细胞迁移由AREG诱导。
图11是示出与对照组相比，当向AGS细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞迁移程度的图。
图12是示出取决于添加至NUGC3细胞系的HB-EGF浓度的细胞迁移程度的图。
图13是示出取决于添加至NUGC3细胞系的TGF-α浓度的细胞迁移程度的图。
图14是示出取决于添加至NUGC3细胞系的AREG浓度的细胞迁移程度的图。
图15是示出与对照组相比，当向NUGC3细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞迁移程度的图，其中细胞迁移由HB-EGF诱导。
图16是示出与对照组相比，当向NUGC3细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞迁移程度的图，其中细胞迁移由TGF-α诱导。
图17是示出与对照组相比，当向NUGC3细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞迁移程度的图，其中细胞迁移由AREG诱导。
图18是示出取决于添加至AGS细胞系的HB-EGF浓度的细胞侵袭程度的图。
图19是示出取决于添加至AGS细胞系的TGF-α浓度的细胞侵袭程度的图。
图20是示出与对照组相比，当向AGS细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞侵袭程度的图，其中侵袭由HB-EGF诱导。
图21是示出与对照组相比，当向AGS细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞侵袭程度的图，其中侵袭由TGF-α诱导。
图22是示出与对照组相比，当向AGS细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞迁移程度的图，其中侵袭由AREG诱导。
图23是示出取决于添加至NUGC3细胞系的HB-EGF浓度的细胞侵袭程度的图。
图24是示出取决于添加至NUGC3细胞系的TGF-α浓度的细胞侵袭程度的图。
图25是示出取决于添加至NUGC3细胞系的AREG浓度的细胞侵袭程度的图。
图26是示出与对照组相比，当向NUGC3细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞侵袭程度的图，其中侵袭由HB-EGF诱导。
图27是示出与对照组相比，当向NUGC3细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞侵袭程度的图，其中侵袭由TGF-α诱导。
图28是示出与对照组相比，当向NUGC3细胞系添加多种EGFR或HER2抗体时细胞侵袭程度的图，其中侵袭由AREG诱导。
实施本发明的最佳方式
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明提供了用于抑制癌症转移的药物组合物，其包含作为活性成分的与表皮生长因子受体(EGFR)特异性结合的抗体，其中所述抗体包含：a)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或b)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：9、SEQID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。
特别地，抗体可以包含a)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的重链可变区，由SEQID NO：8的氨基酸序列表示的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或b)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的重链可变区，由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。重链恒定区和轻链恒定区可以是已知人抗体的重链恒定区或轻链恒定区。特别地，重链恒定区和轻链恒定区可分别具有由SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列。
如本文所用，术语“癌症转移”意指癌细胞从原发器官迁移到另一个器官并增殖。癌细胞迁移至身体其他部分包括直接侵入周围器官的原发性癌症中癌组织的生长，以及癌症沿着血管或淋巴管转移至其他远端器官。
根据本发明的组合物可用于抑制癌症转移。在本文中转移可以由EGFR配体诱导或促进。EGFR配体可以是HB-EGF(肝素结合-EGF样生长因子(heparin binding-EGF-likegrowth factor))、TGF-α(转化生长因子-α)、AREG(双调蛋白)、或其组合。癌症可以是实体癌，其可以包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌等。特别地，癌症可以是胃癌。
由于根据本发明的组合物有效地抑制癌症转移，因此本发明的组合物还可以包含已知具有抑制癌症转移效果的一种或更多种物质。
根据本发明的药物组合物除了本发明的抗体之外还可以包含可药用载体。
本发明药物组合物中所包含的可药用载体通常用于制剂中。其示例包括：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等，但不限于此。
本发明的药物组合物还可以包含一种或更多种选自以下的可药用添加剂：赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂和防腐剂。根据本发明的组合物可以根据常规方法配制。特别地，组合物可以通过选择已知方法配制以在向哺乳动物施用后提供活性成分的快速、持续或延迟释放。在本文中，制剂可以是油或水性介质中的溶液剂、混悬剂、糖浆剂或乳剂的形式，或提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式。此外，还可以包含分散剂或稳定剂。此外，组合物可以作为单一治疗剂或与其他治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用。
可包含的载体的量为基于本发明药物组合物的总重量的约1wt％至约90wt％，或约80wt％至约89.99wt％，并且可包含的可药用添加剂的量为约0.1wt％至约20wt％。
本发明还提供了用于抑制癌症转移的方法，其包括将上述组合物施用于对象的步骤。
对象可以是哺乳动物，特别是人。对于根据本发明的抗体的施用途径和剂量，其可以根据患者的状况和副作用以多种方式和量施用于对象，并且最佳施用方法和剂量范围可以由本领域技术人员选择。此外，抗体可以与已知对待治疗的疾病具有治疗效果的另一种药物或生理活性物质组合施用，或者可以以组合药物的形式配制。
当肠胃外施用抗体时，其示例包括皮下、腹膜内、肌内、经口、直肠、脊椎内、鞘内、静脉内施用。
上述施用可以每2周进行一次或更多次，特别地以每2周一次或两次的分剂量。更特别地，施用可以每周一次或每两周一次进行。在本文中，当每周一次施用时，剂量可以是1至6mg/kg体重或3至5mg/kg体重。当每两周一次施用时，剂量可以是3至15mg/kg体重、5至12mg/kg体重、6至10mg/kg体重或7至9mg/kg体重。
本发明还提供了上述药物组合物在制备用于抑制癌症转移的药物中的用途。
根据本发明的组合物可用于制备药物，所述药物用于通过抑制由EGFR配体促进的癌症的迁移和侵袭来抑制癌症转移。癌症是实体癌，并且可以包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌等。特别地，癌症可以是胃癌。
具体实施方式
在下文中，通过实施例详细解释本发明。以下实施例旨在进一步举例说明本发明而不限制其范围。
实施例1.抗EGFR抗体的筛选和制备
为了筛选与EGFR特异性结合的抗体，通过混合人骨髓RNA、人胸腺RNA、人脾RNA和人B细胞RNA构建抗体基因文库。使用从RNA基因文库分离的RNA基因作为模板合成cDNA，然后使用cDNA作为模板，使用分别为scFv区、重链可变区和轻链可变区设计的引物合成抗体DNA。将合成的抗体DNA插入噬菌体展示载体pKS4H中(参见Green Cross，Korea，韩国专利No.10-0635370)以制备抗体DNA文库。然后，使用抗体DNA文库通过淘选技术选择与EGFR结合的抗体。进行4次淘选并诱导来自包含最终选择的DNA文库的菌落的抗体表达。在这里，使用EGFR包被的96孔板通过ELISA检测抗体的表达。
为了使用选择的抗体片段构建完整形式的免疫球蛋白，使用Green Cross Inc.的抗体表达载体pRC13和pKC12(其中可以插入针对乙肝病毒表面抗原的人抗体的可变区的抗体表达质粒，韩国专利No.10-523732；保藏号KCLRF-BP-00054)。将插入载体中的抗体片段导入CHO细胞中并表达为完整形式的免疫球蛋白，并通过蛋白质A-琼脂糖柱(AmershamPharmacia Biotech，USA)纯化表达的抗体(选择和制备抗体的具体方法如韩国专利No.10-0092401所述)。
结果，将选择和制备的抗体命名为GC1118。该抗体包含：包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，由SEQ ID NO：11的氨基酸序列表示的重链恒定区，和由SEQ ID NO：12的氨基酸序列表示的轻链恒定区。
I.抗EGFR抗体对胃癌细胞系迁移的抑制效果的检查
实验实施例1.通过施用抗EGFR抗体对NCI-N87胃癌细胞系的迁移抑制效果的检查
1-1.通过EGFR配体诱导NCI-N87胃癌细胞系迁移
进行细胞迁移分析以建立通过EGFR配体诱导NCI-N87细胞系(胃癌细胞系)的癌细胞迁移的条件。
首先，在37℃和5％CO2的条件下，在补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养NCI-N87细胞系(ATCC，USA)。将培养的细胞分配直至填充T175烧瓶的70％。24小时后，用1×PBS洗涤细胞并将培养基更换为无血清RPMI1640培养基，并在与上述相同的条件下培养和制备细胞。
同时，用1×PBS稀释5μg/ml的1型胶原蛋白，并用250μl稀释的胶原蛋白填充transwell插入物(insert)并在冰箱中放置24小时。将I型胶原蛋白包被的transwell插入物用1ml的1×PBS洗涤并在洁净台中干燥。将制备的NCI-N87细胞系用胰蛋白酶消化、收集并重悬于无血清培养基中，并以每个transwell插入物4×106个细胞分配。此外，用750μl无血清培养基填充24孔板，向其中添加EGFR配体，并将transwell插入物放置在其中。在这里，以0ng/ml、20ng/ml、100ng/ml或500ng/ml添加HB-EGF(肝素结合-EGF样生长因子，259-HE-250，R&D systems，USA)和TGF-α(转化生长因子-α，239-A-100，R&D systems，USA)，而以0ng/ml、40ng/ml、200ng/ml或1,000ng/ml添加AREG(双调蛋白，262-AR，R&D Systems，USA)。将24孔板在与上述相同的条件下孵育6小时，然后染色以鉴定被诱导迁移的细胞。
具体地，除去24孔板的培养基，添加700μl的1×PBS，并将transwell插入物浸入其中并洗涤。除去1×PBS，在其中填充500μl的4％多聚甲醛，并通过将插入物浸泡15分钟来固定细胞。除去多聚甲醛，并用等体积的1×PBS再次洗涤插入物。在用500μl的0.1％结晶紫溶液填充后，将插入物浸泡30分钟以对细胞染色。然后，将蒸馏水添加到500ml烧杯，并洗涤插入物。用棉签擦拭经洗涤的插入物内的剩余细胞。将染色的细胞用100μl的10％乙酸溶液洗脱，并用ELISA平板读数器在595nm波长下测量OD值。结果，在添加作为配体的HB-EGF、TGF-α或AREG后测量的OD值分别如图1至3所示。
如图1至3所示，添加以诱导NCI-N87细胞系迁移的HB-EGF、TGF-α和AREG配体的浓度分别确定为20ng/ml、20ng/ml和500ng/ml。
1-2.GC1118抗体在通过HB-EGF诱导迁移的NCI-N87胃癌细胞系中的迁移抑制效果的检查
用20ng/ml的HB-EGF处理NCI-N87细胞系以诱导细胞迁移。向其中添加0.04μg/ml、0.2μg/ml、1μg/ml或5μg/ml的GC1118或作为比较例的0.04μg、0.2μg、1μg或5μg的西妥昔单抗(CTX；MERCK，USA)和5μg/ml的帕尼单抗(Pani；Amgen，USA)。通过与实验实施例1-1相同的条件和方法检查GC1118对癌细胞迁移的抑制。
对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加HB-EGF的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图4所示。
如图4所示，GC1118和西妥昔单抗二者均以浓度依赖性方式抑制癌细胞迁移。具体地，西妥昔单抗在0.04μg/ml时不抑制迁移，但GC1118使细胞迁移抑制20％。此外，在5μg/ml时，西妥昔单抗和帕尼单抗使癌细胞迁移抑制40％，而GC1118抑制60％。
1-3.GC1118抗体在通过TGF-α诱导迁移的NCI-N87胃癌细胞系中的迁移抑制效果的检查
通过用20ng/ml的TGF-α代替HG-EGF诱导细胞迁移，添加西妥昔单抗作为比较例，并且另外，通过与实验实施例1-2相同的条件和方法进行实验。
对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加TGF-α的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图5所示。
如图5所示，GC1118和西妥昔单抗二者均以浓度依赖性方式抑制癌细胞迁移。具体地，西妥昔单抗和GC1118在0.04μg/ml时未显示迁移抑制效果，但在5μg/ml时显示出效果。
1-4.GC1118抗体在通过AREG诱导迁移的NCI-N87胃癌细胞系中的迁移抑制效果的检查
通过用500ng/ml AREG代替HG-EGF诱导细胞迁移，并且另外，通过与实验实施例1-2相同的条件和方法进行实验。
对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加AREG的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图6所示。
如图6所示，GC1118和西妥昔单抗二者均以浓度依赖性方式抑制癌细胞迁移。具体地，西妥昔单抗和GC1118在0.04μg/ml时未显示迁移抑制效果，但在0.2μg/ml或更高时显示出效果。
1-5.GC1118与其他EGFR抗体对癌细胞的迁移抑制效果的比较
比较了GC1118抗体与其他靶向EGFR或HER2的抗体对癌细胞的迁移抑制效果。
首先，添加20ng/ml的HB-EGF或TGF-α或500ng/ml的AREG以诱导癌细胞迁移。向其中添加1μg/ml西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗(Trast；Roche，USA)或GC1118，并使用免疫球蛋白作为对照。另外，通过与实验实施例1-1相同的条件和方法进行实验。
对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加EGFR配体的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图7所示。
如图7所示，靶向EGFR的抗体西妥昔单抗、帕尼单抗和GC1118抑制细胞迁移，但靶向HER2的抗体曲妥珠单抗显示很小的效果。同时，通过HB-EGF诱导的细胞迁移仅受GC1118抑制，而通过TGF-α或AREG诱导的细胞迁移在靶向EGFR的抗体之间未显示出差异。
实验实施例2.抗EGFR抗体对AGS胃癌细胞系的迁移抑制效果的检查
2-1.通过EGFR配体诱导AGS胃癌细胞迁移
建立通过EGFR配体诱导AGS细胞系(ATCC，USA)的癌细胞迁移的条件。将3×106个细胞分配到每个transwell插入物中，并且另外，通过与实验实施例1-1相同的条件和方法进行实验。结果，在添加作为配体的HB-EGF、TGF-α或AREG后测量的OD值如图8所示。
如图8所示，添加以诱导AGS细胞系迁移的HB-EGF、TGF-α和AREG配体的浓度分别确定为20ng/ml、20ng/ml和500ng/ml。
2-2.GC1118抗体在通过HB-EGF诱导迁移的AGS胃癌细胞系中的迁移抑制效果的检查
使用AGS细胞系，并且另外，通过与实验实施例1-2相同的条件和方法进行实验。对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加HB-EGF的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图9所示。
如图9所示，与西妥昔单抗相比，GC1118对AGS细胞系显示出优异的迁移抑制效果。具体地，西妥昔单抗在0.04μg/ml时未显示迁移抑制效果，并且在5μg/ml时使癌细胞迁移抑制约40％。同时，GC1118在0.04μg/ml和5μg/ml时分别使癌细胞迁移抑制40％和90％。
2-3.GC1118抗体在通过AREG诱导迁移的AGS胃癌细胞系中的迁移抑制效果的检查
在AGS胃癌细胞系中，通过1,000ng/rnl的AREG诱导细胞迁移，并且另外，通过与实验实施例1-4相同的条件和方法进行实验。对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加AREG的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图10所示。
如图10所示，GC1118和西妥昔单抗二者均以浓度依赖性方式抑制癌细胞迁移。具体地，即使在0.04μg/ml时，这两种抗体也对癌细胞显示出60％的优异的迁移效果。
2-4.GC1118抗体与其他EGFR抗体对癌细胞的迁移抑制效果的比较
添加浓度为0.2μg/ml的西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗或GC1118，并且另外，通过与实验实施例1-5相同的条件和方法进行实验。对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加EGFR配体的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图11所示。
如图11所示，靶向EGFR的抗体西妥昔单抗、帕尼单抗和GC1118抑制细胞迁移，但靶向HER2的抗体曲妥珠单抗未显示抑制效果。同时，作为细胞染色的结果，与西妥昔单抗或帕尼单抗相比，GC1118导致更少的迁移细胞数目，但OD值与其他抗体没有显著差异。似乎迁移细胞的数目太少而不能产生OD值的显著差异。
实验实施例3.对通过EGFR配体的NUGC3胃癌细胞系迁移的抑制的检查
3-1.通过EGFR配体诱导NUGC3胃癌细胞系迁移
建立通过EGFR配体诱导NUGC3细胞系(ATCC，USA)的癌细胞迁移的条件。将2×106个细胞分配到每个transwell插入物中，并以0ng/ml、0.4ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml和250ng/ml添加HB-EGF和TNF-α，而以0ng/ml、1.6ng/ml、8ng/ml、40ng/ml、200ng/ml和1,000ng/ml添加AREG。并且另外，通过与实验实施例1-1相同的条件和方法进行实验。结果，在添加作为配体的HB-EGF、TGF-α或AREG后测量的OD值，如图12至14所示。
如图12至14所示，添加以诱导AGS细胞系迁移的HB-EGF、TGF-α和AREG配体的浓度分别确定为50ng/ml、50ng/ml和500ng/ml。
3-2.GC1118抗体在通过HB-EGF诱导迁移的NUGC3胃癌细胞系中的迁移抑制的比较
在NUGC3细胞系中，通过50ng/ml的HB-EGF诱导细胞迁移，并且另外，通过与实验实施例1-5相同的条件和方法进行实验。对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加EGFR配体的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图15所示。
如图15所示，西妥昔单抗、帕尼单抗和曲妥珠单抗不抑制HB-EGF诱导的细胞迁移，但GC1118使细胞迁移抑制40％。
3-3.GC1118抗体对通过TGF-α诱导的NUGC3胃癌细胞迁移的迁移抑制效果的检查
通过用50ng/ml的TGF-α代替HB-EGF诱导细胞迁移，并且另外，通过与实验实施例3-2相同的条件和方法进行实验。
对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加EGFR配体的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图16所示。
如图16所示，西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗和GC1118抑制TGF-α诱导的细胞迁移，但曲妥珠单抗不抑制细胞迁移。
3-4.GC1118抗体在通过AREG诱导迁移的NUGC3胃癌细胞系中的迁移抑制的比较
通过用500ng/ml的AREG代替HB-EGF诱导细胞迁移，并且另外，通过与实验实施例3-2相同的条件和方法进行实验。
对于迁移抑制效果，将用各抗体处理时的迁移细胞相对于在仅添加EGFR配体的情况下的迁移细胞的比计算为OD值的百分比，结果如图17所示。
如图17所示，靶向EGFR的抗体西妥昔单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗和GC1118抑制细胞迁移，但靶向HER2的抗体曲妥珠单抗未显示出抑制效果。
II.抗EGFR抗体对胃癌细胞系转移的抑制效果
实验实施例4.抗EGFR抗体施用对AGS胃癌细胞系转移的抑制效果的检查
4-1.通过EGFR配体诱导AGS癌细胞侵袭
进行Matrigel室分析以建立通过EGFR配体诱导AGS细胞系(胃癌细胞系)侵袭的条件。
首先，在37℃和5％CO2的条件下，在补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中培养AGS细胞系(胃细胞系)。将培养的细胞分到T175烧瓶的60％中。24小时后，用1×PBS洗涤细胞，并更换为无血清RPMI1640培养基，并在与上述相同的条件下培养。
同时，用补充有0.5ml胎牛血清的RPMI1640培养基(侵袭培养基)填充Matrigel室(目录号354483，Coming，USA)，然后将其再水化2小时，然后除去培养基。通过胰蛋白酶消化收集制备的细胞，并重悬于补充有0.1％牛血清白蛋白的无血清培养基中。用750μl侵袭培养基填充24孔板，并以10ng/ml、20ng/ml或50ng/ml添加HB-EGF和TGF-α。将室放置于含有500μl侵袭培养基的24孔板上，并以每室3×106个细胞添加重悬的细胞。将细胞在与上述相同的条件下培养24小时，然后染色以鉴定诱导侵袭的细胞。
具体地，除去24孔板的培养基，向其中添加500μl的1xPBS，然后将室浸泡并洗涤。除去1xPBS，用500μl的4％多聚甲醛填充24孔板，并浸泡10分钟以固定细胞。除去多聚甲醛并填充500μl的0.1％结晶紫溶液，然后将室浸泡10分钟以对细胞染色。此后，将蒸馏水添加到500ml烧杯，并洗涤室。用棉签擦拭经洗涤室内的非侵袭细胞，然后在室温下干燥1小时。此外，将染色的细胞用100μl的10％乙酸溶液洗脱，并用ELISA板读数器在595nm波长下测量OD值。结果，在添加作为配体的HB-EGF和TGF-α后测量的OD值分别如图18和19所示。
如图18和图19所示，HB-EGF和TGF-α配体诱导AGS细胞系的侵袭。当以10ng/ml、20ng/ml和50ng/ml添加HB-EGF时，与对照相比，侵袭分别提高了4.1、4.5和3.9倍。当以相同浓度添加TGF-α时，与对照相比，侵袭分别提高了1.8、1.8和1.9倍。
4-2. GC1118抗体在通过HB-EGF诱导侵袭的AGS胃癌细胞系中的侵袭抑制效果的检查
通过20ng/ml的HB-EGF诱导侵袭，并且另外，通过与实验实施例4-1相同的条件和方法进行实验。在这里，添加1μg/ml的GC1118作为实验组，并且使用1μg/ml的西妥昔单抗、1μg/ml的帕尼单抗和1μg/ml的曲妥珠单抗作为比较例。实验用两组重复三次，并示出了平均值。
对于侵袭抑制效果，将用各抗体处理时的侵袭细胞相对于在仅添加HG-EGF的情况下的侵袭细胞的比计算为OD值的百分比，结果如表1和图20所示。
[表1]
如表1和图20所示，GC1118显示出优异的抑制通过HB-EGF诱导的AGS细胞系侵袭的效果。具体地，西妥昔单抗、帕尼单抗和曲妥珠单抗分别使细胞侵袭抑制6％、4.7％和10.5％，而GC1118抑制50.4％。
4-3. GC1118抗体在通过TGF-α诱导侵袭的AGS胃癌细胞系中的侵袭抑制效果的检查
通过用20ng/ml的TGF-α代替HB-EGF诱导侵袭，并且另外，通过与实验实施例4-2相同的条件和方法进行实验。
对于侵袭抑制效果，将用各抗体处理时的侵袭细胞相对于在仅添加TGF-α的情况下的侵袭细胞的比计算为OD值的百分比，结果如表2和图21所示。
[表2]
如表2和图21所示，GC1118显示出优异的抑制通过TGF-α诱导的AGS细胞系侵袭的效果。具体地，西妥昔单抗和曲妥珠单抗分别使细胞侵袭抑制35％和6.1％，但GC1118抑制55.9％，与帕尼单抗类似，后者使细胞侵袭抑制54.1％。
4-4. GC1118抗体在通过AREG诱导侵袭的AGS胃癌细胞系中的侵袭抑制效果的检查
通过用1000ng/ml的AREG代替HB-EGF诱导侵袭，并且实验用两组重复两次，并且另外，通过与实验实施例4-2相同的条件和方法进行实验。
对于侵袭抑制效果，将用各抗体处理时的侵袭细胞相对于在仅添加AREG的情况下的侵袭细胞的比计算为OD值的百分比，结果如表3和图22所示。
[表3]
如表3和图22所示，GC1118显示出优异的抑制通过AREG诱导的AGS细胞系侵袭的效果。具体地，GC1118使细胞侵袭抑制44.6％，这与对照组西妥昔单抗(42％)或帕尼单抗(42.8％)的抑制水平类似。
实验实施例5.抗EGFR抗体施用对NUGC3胃癌细胞系转移的抑制效果的检查
5-1.通过EGFR配体诱导NUGC3癌细胞侵袭
进行Matrigel室分析以建立通过EGFR配体诱导NUGC3细胞系(胃癌细胞系)侵袭的条件。对于侵袭诱导，添加10ng/ml、20ng/ml或50ng/ml的HB-EGF和TGF-α，以及40ng/ml、200ng/ml和500ng/ml的AREG，其均是EGFR配体。另外，通过与实验实施例4-1相同的条件和方法进行实验。结果，在添加作为配体的HB-EGF、TGF-α和AREG后测量的OD值分别如图23至25所示。
如图23至25所示，HB-EGF、TGF-α或AREG配体诱导NUGC3细胞系的侵袭。具体地，当用10ng/ml、20ng/ml和50ng/ml的HB-EGF处理细胞时，细胞侵袭分别提高了2.3倍、3.5倍和4.8倍，当用10ng/ml、20ng/ml和50ng/ml的TGF-α处理细胞时，细胞侵袭分别提高了1.7倍、1.9倍和1.9倍。同时，当用40ng/ml、200ng/ml和500ng/ml的AREG处理时，细胞侵袭分别提高了1.2倍、1.3倍和1.5倍。
5-2. GC1118抗体在通过HB-EGF诱导侵袭的NUGC3胃癌细胞系中的侵袭抑制效果的检查
通过用50ng/ml的HB-EGF处理NUGC3细胞系诱导细胞侵袭，并且另外，通过与实验实施例4-2相同的条件和方法进行实验。
对于侵袭抑制效果，将用各抗体处理时的侵袭细胞相对于在仅添加HG-EGF的情况下的侵袭细胞的比计算为OD值的百分比，结果如表4和图26所示。
[表4]
如表4和图26所示，GC1118显示出优异的抑制通过HB-EGF诱导的NUGC3细胞系侵袭的效果。具体地，西妥昔单抗、帕尼单抗和曲妥珠单抗分别使细胞侵袭抑制9.4％、8.1％和11.3％，而GC1118抑制60.8％。也就是说，通过HB-EGF诱导的NUGC3细胞系中的细胞侵袭被以GC1118特异性方式抑制。
5-3.GC1118抗体在通过TGF-α诱导侵袭的NUGC3胃癌细胞系中的侵袭抑制效果的检查
添加浓度为50ng/ml的TGF-α代替HB-EGF用于处理，并且另外，通过与实验实施例5-2中相同的方法检测GC1118对癌细胞侵袭的抑制。
对于侵袭抑制效果，将用各抗体处理时的侵袭细胞相对于在仅添加TGF-α的情况下的侵袭细胞的比计算为OD值的百分比，结果如表5和图27所示。
[表5]
如表5和图27所示，GC1118显示出优异的抑制通过TGF-α诱导的NUGC3细胞系侵袭的效果。具体地，GC1118使细胞侵袭抑制67.5％，这与对照组西妥昔单抗(63.5％)或帕尼单抗(65.7％)的抑制水平类似。
5-4.GC1118抗体在通过AREG诱导侵袭的NUCC3胃癌细胞系中的侵袭抑制效果的检查
添加浓度为500ng/ml的AREG代替HB-EGF用于处理，并且另外，通过与实验实施例4-4相同的方法检查GC1118对癌细胞侵袭的抑制。
为了检查侵袭抑制效果，将用各抗体处理时的侵袭细胞相对于在仅添加AREG的情况下的侵袭细胞的比计算为OD值的百分比，结果如表6和图28所示。
[表6]
如表6和图28所示，GC1118显示出优异的抑制通过AREG诱导的NUGC3细胞系侵袭的效果。具体地，GC1118使细胞侵袭抑制45.2％，这与对照组西妥昔单抗(41.8％)或帕尼单抗(43.5％)的抑制水平类似。
<110> GREEN CROSS CORPORATION
MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE
<120> 包含与表皮生长因子受体特异性结合的抗体的用于抑制癌症转移的药物组合物
<130> PCB602010GCC
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体重链可变区的CDR1
<400> 1
Asp Tyr Asp Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体重链可变区的CDR2
<400> 2
Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体重链可变区的CDR3
<400> 3
His Gly Ser Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体轻链可变区的CDR1
<400> 4
Arg Ser Asn Gln Asp Leu Thr His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体轻链可变区的CDR2
<400> 5
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体轻链可变区的CDR3
<400> 6
Met Gln Gly Thr His Trp Pro Trp Thr
1 5
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体重链可变区
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Leu Gly Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly Ser Pro Gly Tyr Thr Leu Tyr Ala Trp Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体轻链可变区
<400> 8
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn Gln Asp Leu Thr His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 9
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体轻链可变区的CDR1
<400> 9
Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Met Gly Ile Gly Asn Asn Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 10
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体轻链可变区
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Asp Met Gly
20 25 30
Ile Gly Asn Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 11
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体重链恒定区
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 12
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗体轻链恒定区
<400> 12
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (11)

1.用于抑制癌症转移的药物组合物，其包含作为活性成分的与表皮生长因子受体(EGFR)特异性结合的抗体，其中所述抗体包含：
a)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或
b)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述抗体包含：
a)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的重链可变区，由SEQ ID NO：8的氨基酸序列表示的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或
b)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的重链可变区，由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。
3.权利要求1所述的组合物，其中所述癌症是实体癌。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述实体癌是胃癌。
5.权利要求1所述的组合物，其中所述转移由EGFR配体诱导或促进。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述EGFR配体选自肝素结合-EGF样生长因子(HB-EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、双调蛋白(AREG)、及其组合。
7.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物还包含选自以下的任一种：可药用载体、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、及其混合物。
8.用于抑制癌症转移的方法，其包括向对象施用与EGFR特异性结合的抗体，所述抗体包含：
a)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或
b)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。
9.权利要求8所述的方法，其中所述抗体包含：
a)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的重链可变区，由SEQ ID NO：8的氨基酸序列表示的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或
b)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的重链可变区，由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。
10.与EGFR特异性结合的抗体在制备用于抑制癌症转移的药物中的用途，所述抗体包含：
a)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或
b)包含分别由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区，包含分别由SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的CDRl、CDR2和CDR3的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。
11.权利要求10所述的用途，其中所述抗体包含：
a)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的重链可变区，由SEQ ID NO：8的氨基酸序列表示的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区；或
b)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的重链可变区，由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的轻链可变区，重链恒定区，和轻链恒定区。
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