ES2708662T3

ES2708662T3 - Péptidos hidrofóbicos modificados para el diagnóstico hepático específico

Info

Publication number: ES2708662T3
Application number: ES12703539T
Authority: ES
Inventors: Walter Mier; Stephan Urban; Stefan Mehrle; Uwe Haberkorn; Thomas Mueller; Vasileios Askoxylakis
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Universitaet Heidelberg
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ; Universitaet Heidelberg
Priority date: 2011-02-10
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2019-04-10
Anticipated expiration: 2032-02-10
Also published as: CN103402546A; JP2014510050A; TR201901259T4; CN103402546B; US20140356284A1; BR112013020369A2; JP2017081952A; BR112013020369B1; BR112013020369A8; US10363323B2; JP6486003B2; EP2673003B1; WO2012107577A1; EP2673003A1

Abstract

Péptido hidrofóbico modificado de la fórmula [X - P - Y - Ro]Ap en donde P es un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos NPLGFXaaP, en donde Xaa es un aminoácido arbitrario; X es una secuencia de aminoácidos que comprende NX1SX2X3, que tiene una longitud de m= 5, 6, 7 u 8 aminoácidos, en donde X1, X2 y X3 es un aminoácido arbitrario y en donde uno o más de los aminoácidos portan uno o más grupos para la modificación hidrofóbica seleccionados de la acilación, preferentemente con ácidos carboxílicos, ácidos grasos, ácidos grasos de C8 a C22, aminoácidos con cadenas laterales lipofílicas, y la adición de porciones hidrofóbicas seleccionadas de colesterol, derivados de colesterol, fosfolípidos, glicolípidos, ésteres de glicerol, esteroides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, farnesol, grupos alifáticos, compuestos poliaromáticos; Y es una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de n aminoácidos, en donde n es al menos 1; m + n >= 11; R es una modificación C-terminal de dicho péptido hidrofóbico modificado, que es preferentemente una porción que protege de la degradación seleccionada de amida, D-aminoácido, aminoácido modificado, aminoácido cíclico, albúmina, polímero natural y sintético, tales como PEG, glicano, en donde o es 0 o al menos 1; A es un grupo de anclaje, preferentemente seleccionado de éster, éter, disulfuro, amida, tiol, tioéster, en donde p es 0 o al menos 1; en donde uno o más marcadores está/están acoplado(s) a uno o más aminoácidos de X, preferentemente a través de un enlazador o espaciador, y en donde el marcador se selecciona de un colorante fluorescente, un isótopo emisor de fluorescencia, un radioisótopo y un agente de contraste.

Description

DESCRIPCION

Peptidos hidrofobicos modificados para el diagnostico hepatico espedfico.

La presente invencion se refiere a peptidos hidrofobicos modificados derivados del dominio preS del virus de la hepatitis B (HBV) que son vehmulos versatiles para el suministro espedfico de un compuesto de marcado (agentes de diagnostico, en el siguiente " marcador") al tngado, preferentemente a hepatocitos, tanto in vitro como in vivo. Cualquier tipo de marcador puede dirigirse espedficamente al tngado y asf enriquecerse en el tngado. Esta seleccion hepatica puede usarse ademas para el diagnostico espedfico de enfermedades otrastornos hepaticos, tales como hepatitis, malaria, carcinoma hepatocelular (HCC), asf como infecciones por HAV, HBV, HCV y/o HDV. La presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden dicho(s) peptido(s) hidrofobico(s) y lo(s) marcador(es) que se suministraran espedficamente al tngado. La presente invencion se refiere ademas al uso de los peptidos hidrofobicos modificados de la invencion o composiciones farmaceuticas que comprenden dicho(s) peptido(s) hidrofobico(s) modificado(s) para el diagnostico y/o el monitoreo de un tratamiento de una enfermedad o trastorno hepatico; y el uso de los peptidos hidrofobicos modificados de la invencion para la fabricacion de un medicamento para el diagnostico y/o el monitoreo de un tratamiento de una enfermedad o trastorno hepatico; y a un metodo para el diagnostico de enfermedades o trastornos hepaticos o para el monitoreo de un tratamiento de una enfermedad o trastorno hepatico.

Antecedentes de la invencion

El tngado, un organo que esta presente en los vertebrados y otros animales, desempena un papel importante en el metabolismo y tiene varias funciones en el cuerpo, que incluyen el almacenamiento de glucogeno, la descomposicion de los globulos rojos, la smtesis de protemas plasmaticas y la desintoxicacion. El tngado ademas es la glandula mas grande del cuerpo humano. Se encuentra por debajo del diafragma en la region toracica del abdomen. Produce bilis, un compuesto alcalino que ayuda en la digestion, a traves de la emulsificacion de los lfpidos. Ademas realiza y regula una amplia variedad de reacciones bioqmmicas de alto volumen que requieren tejidos especializados.

Los hepatocitos constituyen del 70 al 80% de la masa citoplasmica del tngado. Los hepatocitos se involucran en la smtesis de protemas, el almacenamiento de protemas y latransformacion de carbohidratos, la smtesis de colesterol, sales biliares y fosfolfpidos, y la desintoxicacion, modificacion y excrecion de sustancias exogenas y endogenas. El hepatocito ademas inicia la formacion y secrecion de la bilis.

Existe una gran cantidad de enfermedades hepaticas conocidas, tales como:

- Hepatitis: inflamacion del tngado, causada principalmente por varios virus pero ademas por ciertos venenos, autoinmunidad o afecciones hereditarias;

- Cirrosis: la formacion de tejido fibroso en el tngado, que reemplaza a las celulas hepaticas muertas. La muerte de las celulas hepaticas puede ser causada, por ejemplo, por hepatitis viral, alcoholismo o contacto con otras sustancias qmmicas toxicas para el tngado;

- Hemocromatosis: una enfermedad hereditaria que causa la acumulacion de hierro en el cuerpo, que eventualmente conduce al dano hepatico;

- Cancer de tngado: carcinoma hepatocelular primario (HCC) o colangiocarcinoma y canceres metastasicos, por lo general de otras partes del tracto gastrointestinal;

- Enfermedad de Wilson: una enfermedad hereditaria que hace que el cuerpo retenga el cobre;

- Colangitis esclerosante primaria: una enfermedad inflamatoria del conducto biliar, de naturaleza autoinmune;

- Cirrosis biliar primaria: enfermedad autoinmune de los conductos biliares pequenos;

- Smdrome de Budd-Chiari: obstruccion de la vena hepatica;

- Smdrome de Gilbert: un trastorno genetico del metabolismo de la bilirrubina, que se encuentra en aproximadamente el 5% de la poblacion;

- Enfermedad de almacenamiento de glucogeno tipo II: la acumulacion de glucogeno causa debilidad muscular progresiva (miopatfa) en todo el cuerpo y afecta a varios tejidos corporales, particularmente en el corazon, los musculos esqueleticos, el tngado y el sistema nervioso.

Ademas existen muchas enfermedades hepaticas pediatricas, tales como la atresia biliar, la deficiencia de alfa- 1 antitripsina, el smdrome de alagille y la colestasis intrahepatica familiar progresiva; asf como las enfermedades metabolicas.

Ademas, varios patogenos y parasitos, especialmente de enfermedades tropicales, tienen una etapa hepatica durante su ciclo de vida. Por ejemplo la malaria, es una de las enfermedades infecciosas mas comunes y un enorme problema de salud publica. La malaria es causada por parasitos protozoarios del genero Plasmodium. Las formas mas graves de la enfermedad son causadas por Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax, pero otras especies relacionadas (Plasmodium ovale, Plasmodium malariae y algunas veces Plasmodium knowlesi) ademas pueden infectar a los humanos. Otro ejemplo es el virus de la hepatitis B (HBV), la causa de la hepatitis B. El HBV es el prototipo de una familia de pequenos virus de ADN envueltos de mamfferos y aves (11). La envoltura del HBV contiene tres protemas denominadas L-(grande), M-(media) y S-(pequena) (ver la Figura 1). Comparten el dominio S C-terminal con cuatro regiones transmembrana. Las protemas M y L portan extensiones N-terminal adicionales de 55 y, dependientes del genotipo, 107 o 118 aa (preS2- y preSI). En los viriones, la relacion estequiometrica de L, M y S es de aproximadamente 1 :1:4, mientras que las pardculas subvirales (SVP) no infecciosas secretadas de manera mas abundante contienen casi exclusivamente protema S y solo trazas de L (2). Durante la smtesis, el dominio preSI de L se miristoila y en algun punto del ciclo vital del HBV se traslada a traves de la membrana derivada del ER. Esta modificacion es esencial para la infectividad (13, 14). Una caractenstica pronunciada del HBV es su tropismo hepatico, es decir, el hngado es el tejido que apoya espedficamente el crecimiento del HBV.

Las infecciones cronicas por HBV y HCV (virus de la hepatitis C) ademas son causas importantes de alteraciones neoplasicas en el hngado. El carcinoma hepatocelular primario (HCC), por lo general, se desarrolla en el contexto de una enfermedad hepatica cronica, en particular de la hepatitis viral. El diagnostico de HCC puede ser diffcil, por lo general requiere el uso de marcadores sericos y modalidades de imagenes, asf como la confirmacion histologica despues de la biopsia.

Los resultados de HCC en aproximadamente un millon de muertes por ano en todo el mundo, la supervivencia media ^{despues del diagnostico es de aproximadamente} 6 ^{a 20 meses (11). Una razon para esto es la ausencia de smtomas}patogenicos y la gran reserva funcional del hngado (12). Como resultado, la mayona de los pacientes diagnosticados con carcinoma hepatocelular no son elegibles para la reseccion quirurgica, pero requieren otras modalidades de tratamiento, tales como trasplante de tngado, ablacion por radiofrecuencia, quimioembolizacion transarterial, crioablacion o radioterapia. Todas estas opciones alternativas tienen una eficacia limitada debido al tamano del tumor tfpicamente grande en el momento del diagnostico.(13) Como consecuencia, la FDA (Agencia Federal de Medicamentos) recomienda la obtencion de imagenes de diagnostico intenso en pacientes con una enfermedad hepatica subyacente (es decir, cirrosis, hepatitis viral) que desarrolla un aumento en el nivel de alfa fetoprotema serica.(12) Las imagenes diagnosticas por lo general se realiza mediante un escaneo CT del hngado y/o imagenes por resonancia magnetica (MRI). Sin embargo el diagnostico inicial incluso cuando se usan metodos de imagenes de alta resolucion, frecuentemente es diffcil ya que en la mayona de los pacientes se recomienda la imagen de "seguimiento". (14) Los nuevos agentes de contraste espedficos para el hngado, tales como los descritos en la invencion, pueden ayudar a resolver este problema.

Otra fuente de alteraciones neoplasicas en el hngado es la diseminacion metastasica de tumores primarios de otros organos, la diseminacion mas prominente metastasica del carcinoma colorrectal (CRC). Los CRC son la tercera causa mas comun de muerte relacionada con el cancer en todo el mundo. Aproximadamente 1,25 millones de pacientes desarrollan cancer colorrectal por ano; mas de 600,000 pacientes mueren por ano. (Fuente: GLOBOCAn 2008, globocan.iarc.fr). Si bien la patogenia de los CRC ya esta casi terminada y la FDA recomienda el examen medico regular para todas las personas a partir de los 50 anos, la tasa de incidencia disminuyo ligeramente de 1997 a 2008. (15, 16).

Despues del diagnostico primario, aproximadamente 80% detodos los pacientes se presentan sin metastasis detectables, para aquellos pacientes la reseccion quirurgica es la mejor opcion terapeutica. A pesar de la reseccion, mas del 40% de todos los pacientes diagnosticados con la clasificacion II/III en TMN desarrollan metastasis en el hngado (17-21). Se ha demostrado que las imagenes de alta resolucion intensivas despues de la reseccion primaria pueden mejorar significativamente el tiempo de supervivencia de los pacientes clasificados en TMN II/III. El diagnostico precoz de metastasis pequenas en el hngado puede mejorar el tiempo de supervivencia de 5 anos despues de la hepatectoirna parcial en 40% en comparacion con la atencion convencional. Sin embargo, debido a la estructura amorfa del hngado, frecuentemente no es posible el diagnostico en etapa temprana (22). Los agentes de contraste, tales como los descritos en la presente descripcion, pueden ayudar a diagnosticar metastasis hepaticas en una etapa temprana, permitiendo la intervencion quirurgica y, de este modo, ayudan a mejorar la supervivencia libre de enfermedad.

Idealmente, la seleccion de farmacos debe cumplir con los siguientes criterios: 1) transferencia exclusiva del farmaco (por ejemplo, un marcador) al sitio de accion requerido; 2) un mmimo de efectos para el organismo restante; 3) uso de un vector farmacologicamente inactivo.

Para llevar un marcador a un tejido espedfico se persiguen diferentes estrategias. Estas son, por ejemplo, el uso de profarmacos, a partir de los cuales se libera la parte farmacologicamente activa en el tejido objetivo mediante enzimas espedficas del tejido. Una posibilidad adicional es acoplar farmacos efectivos, no espedficos al tejido, a sistemas de portadores espedficos a tejidos, pero farmacologicamente inertes, como peptidos afines a receptores o partfculas coloidales.

Se han usado varios portadores de farmacos para mejorar la seleccion de farmacos en el hngado. Un enfoque directo se basa en la fagocitosis activa del sistema reticuloendotelial en el hngado mediante el suministro de farmacos en portadores particulares, tales como liposomas y microesferas. Por ejemplo, se ha demostrado que despues de la inyeccion i.v. (intravenosa), los portadores de partfculas que incorporan un farmaco se capturan principalmente por el sistema reticuloendotelial en el hngado, lo que resulta en el direccionamiento del farmaco al hngado (5). Por otro lado, el direccionamiento hepatico de los farmacos con polfmeros solubles en agua, cargados positivamente se basa en la extravasacion libre de la mayona de las sustancias solubles en agua del sistema vascular del hngado, asf como en las ^{cargas negativas en la superficie de las celulas hepaticas (} 6 ^{). Asf, se han usado polfmeros como portadores para permitir}que los farmacos se dirijan al hngado en funcion de tales caractensticas anatomicas y bioqmmicas del hngado. Se ha intentado el direccionamiento mas espedfico del farmaco en el hngado mediante el uso de receptores de asialoglicoprotemas de celulas hepaticas. El receptor de asialoglicoprotema (receptor de galactosa) esta presente en los hepatocitos con alta densidad. Ademas, una vez que un ligando se une al receptor de galactosa, el complejo ligando receptor se internaliza, lo que permite la absorcion celular de ligandos galactosilados (7). Ademas, los enfoques de ^{suministro que usan nanopartfculas se han realizado, por ejemplo, por polfmeros anfflicos y vectores virales (} 8 ^{). Ademas}se ha llevado a cabo el suministro de farmacos y material genetico mediante el uso de bionanocapsulas (BNC). Las BNC se describen como "capsulas de nanoescala que consisten en protemas producidas por tecnicas biotecnologicas" y pueden usarse como sistemas de suministro para la administracion de farmacos espedficos de organos (9).

El documento de patente num. US 7,001,760 B2 describe vectores recombinantes derivados del virus de la hepatitis B (HBV), que pueden usarse para la terapia genica, tales como el suministro de genes terapeuticos a las celulas hepaticas y la expresion de genes heterologos en las celulas hepaticas.

El documento de patente num. WO2009/092612 describe peptidos derivados de preS hidrofobicos del HBV y su uso como vehfculos para el suministro espedfico de compuestos al hugado. En este documento, los peptidos derivados de preS modificados hidrofobicos del h Bv pueden acoplarse con un agente activo de diagnostico o terapeutico a traves de un grupo de anclaje opcional (A) que es preferentemente "C-terminal" del peptido derivado de preS modificado hidrofobico.

La presente invencion proporciona peptidos hidrofobicos modificados conjugados a uno o mas marcadores cuyo marcador se acopla a la secuencia de aminoacidos N-terminal del peptido representado porX, lo que hace posible crear peptidos mas cortos mientras se mantiene la especificidad del hfgado. Sorprendentemente, se ha hecho posible acoplar porciones hidrofobicas a los peptidos sin anular el tropismo hepatico. Ademas, el acoplamiento de los marcadores al sitio N-terminal permite un mejor suministro de compuestos activos a traves de la membrana celular y ademas permite dirigir los marcadores, que estan activas en la membrana celular, directamente al sitio de accion. En la Figura 3, se ilustra esquematicamente el mecanismo molecular de la union de un peptido hidrofobico modificado a la superficie de un hepatocito.

Breve descripcion de la invencion

De acuerdo con la presente invencion, este objeto se resuelve proporcionando un peptido hidrofobico modificado. En la Figura 2, se ilustra esquematicamente la construccion de un peptido hidrofobico modificado de la invencion. Dicho peptido hidrofobico modificado tiene la formula general: [X - P - Y - Ro]Ap en donde P es un peptido que tiene la secuencia de aminoacidos NPLGFXaaP (codigo de una sola letra; en donde Xaa es un aminoacido arbitrario, preferentemente F o L, con mayor preferencia F). X es una secuencia de aminoacidos que comprende NX1SX2X3, que tiene una longitud de m ^{= 5,} 6 ^{, 7 u} 8 ^{aminoacidos, en donde X1, X2 y X3 es un aminoacido arbitrario y en donde uno o mas de los aminoacidos}de X portan uno o mas grupo para las modificaciones hidrofobicas seleccionadas de la acilacion, preferentemente con ^{acidos carboxflicos, acidos grasos saturados e insaturados, acidos grasos C} 8 ^{a C22, aminoacidos con cadenas laterales}lipofflicas y adicion de porciones hidrofobicas seleccionadas de colesterol, derivados del colesterol, fosfolfpidos, glicolfpidos, esteres de glicerol, esteroides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, farnesol, grupos alifaticos, compuestos poliaromaticos y m es al menos 4 (m es > 4). En una modalidad preferida, la modificacion hidrofobica se efectua por acilacion con porciones acilo, preferentemente seleccionados de miristoilo (C 14), palmitoilo (C 16) o estearoilo (C 18), con mayor preferencia por acilacion con miristoilo (C 14) o por acilacion con estearoilo (C 18). Y es una secuencia de aminoacidos que tiene una longitud de n aminoacidos, (n es 0 o al menos 1). En la formula general anterior, m n son ^{al menos} 11 ^{, es decir, el peptido hidrofobico modificado de la invencion tiene una longitud de al menos 18 aminoacidos}(aa) en total. R es una modificacion C-terminal de dicho peptido hidrofobico modificado, que es preferentemente una porcion que protege de la degradacion seleccionada de amida, D-aminoacido, aminoacido modificado, aminoacido dclico, albumina, polfmero natural y sintetico, tal como PEG, glicano (o es 0 o al menos 1). A es un grupo de anclaje, preferentemente seleccionado de ester, eter, disulfuro, amida, tiol, tioester, p es 0 o al menos 1. En una modalidad preferida, m es 4 a 19 y/o n es 0 a 78. Uno o mas marcador(es) se acopla(n) a uno o mas aminoacido(s) de X, en donde el marcador se selecciona a partir de un colorante fluorescente, un isotopo emisor de fluorescencia, un radioisotopo y un agente de contraste. El marcador puede estar compuesto de una sustancia o puede comprender dos o mas sustancias, que se enlazan entre sf por cualquier tipo de enlace qrnmico o ffsico, como el enlace covalente, el enlace ionico, etc. o el marcador esta en forma de un complejo.

Uno o mas marcador(es) esta(n) enlazado(s) a dicho peptido a traves de un enlazador o espaciador, en donde el enlazador o espaciador se corta preferentemente del peptido hidrofobico modificado por una protema hepatica, preferentemente una enzima proteolftica hepatocelular que puede seleccionarse de citocromos, tales como el citocromo P450, proteasas y liasas de la via endodtica (por ejemplo esterasas), matriz-metaloproteasas MMP1, MMP2, MMP7, MMP9 y MMP12, preferentemente MMP7. En este caso, el enlazador o espaciador comprende preferentemente las secuencias peptfdicas GCHAK o RPLALWRS.

En una modalidad preferida, uno o mas marcadores se acoplan a uno o mas aminoacidos de X que tienen un grupo amino en una cadena lateral, que se seleccionan preferentemente de lisina, a-aminoglicina, a,Y acido diaminobutmco, ornitina, acido a,p-diaminopropionico, con mayor preferencia lisina. El aminoacido(s) que tiene un grupo amino en una cadena lateral se localiza preferentemente en el extremo N de X, en donde preferentemente 1 a 11, con mayor preferencia 1 a 3, aminoacidos que tienen un grupo amino en una cadena lateral se ubican en el extremo N de X.

De acuerdo con la presente invencion, el objeto se resuelve ademas proporcionando una composition farmaceutica que comprende al menos un peptido hidrofobico modificado como se define en la presente description y al menos un marcador que se administra espetificamente al higado, preferentemente a hepatocitos, como se define en la presente descripcion y opcionalmente un portador y/o excipiente farmaceuticamente aceptable. En una modalidad preferida, el peptido hidrofobico modificado y/o la composicion farmaceutica se usan en el suministro espetifico de marcador(es) al higado, preferentemente para uso en el diagnostico o monitoreo del tratamiento de una enfermedad o trastorno hepatico, con mayor preferencia en la visualization intraoperatoria.

De acuerdo con la presente invencion, el objeto se resuelve ademas proporcionando un uso del peptido hidrofobico modificado o la composicion farmaceutica de la invencion y el uso del peptido hidrofobico modificado para la fabrication de un medicamento para el diagnostico y/o el monitoreo de un tratamiento de una enfermedad o trastorno hepatico.

De acuerdo con la presente invencion, el objeto se resuelve ademas proporcionando un metodo para el diagnostico de una enfermedad o trastorno hepatico o para la monitoreo de un tratamiento de una enfermedad o trastorno hepatico, que comprende administrar a un sujeto una cantidad diagnosticamente eficaz de un peptido hidrofobico modificado o una composicion farmaceutica de la invencion.

Ademas modalidades de la presente invencion se definen en las reivindicaciones dependientes.

Descripcion de las modalidades preferidas de la Invencion

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los terminos tecnicos y cientificos que se usan en la presente descripcion tienen el mismo significado que el que se entiende comunmente por un experto en la tecnica.

Peptidos hidrofobicos modificados

Como se describio anteriormente, la presente invencion proporciona peptidos hidrofobicos modificados que se derivan del dominio preS del virus de la hepatitis B (HBV) (ademas denominado "peptidos preS"). La envoltura de HBV contiene tres protemas denominadas L (grande), M (media) y S (pequena) (ver Figura 1). Comparten el dominio S C-terminal con cuatro regiones transmembrana. Las protemas M y L portan extensiones N-terminales adicionales de 55 y, genotipo dependiente, de 107 o 118 aminoacidos (preS2- y preSI).

Asi, el peptido de acuerdo con la presente invencion se refiere a un peptido con una secuencia de aminoacidos que corresponde o se basa en las extensiones N-terminal de la protema L del HBV, preS1, preferentemente de los genotipos A al H, asi como de virus de la hepatitis B de mono de lana (WMHBV), orangutan, chimpance y gorila, pero ademas se refiere a variantes de estos, preferentemente variantes truncadas en el extremo C, variantes de sustitucion de aminoacidos. Como una secuencia indispensable, los residuos de aminoacidos que son importantes para el tropismo hepatico de los peptidos derivados de preS derivados de hidrofobicos del HBV, como se establece en la sec. con num. de ident.: 1 (NPLGFXP) estan presentes en la secuencia de aminoacidos del peptido hidrofobico modificado de la invencion. En particular, los peptidos hidrofobicos modificados de la invencion se basan en las siguientes secuencias (aminoacidos en un codigo de una sola letra; dominio esencial subrayado).

Dominio esencial del peptido hidrofobico modificado (sec. con num. de ident.: 1):

NPLGFXP (en donde X es un aminoacido arbitrario, preferentemente F o L, con mayor preferencia F)

preS HBV-A (con num de: M57663; sec. con num. de ident.:2):

MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPOA NQVGVGAFGPGFTPPHGGVLGWSPQAQGILATVPAMPPPASTNRQSGRQPTPISPPLR DSHPQA

preS HBV-B (con num de: D00329, sec. con num. de ident.:3)

MGGW S SKPRKGMGTNL S VPNPLGFFPDHOLDP AFK AN SENPD WDLNPHKDNWPD A HKVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTSVPAAPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLR DTHPQA

preS HBV-C (con num de: AB048704, sec. con num. de ident.:4)

MGGW S SKPRKGMGTNLS VPNPLGFFPDHQLDP AFK AN SENPDWDLNPHKDNWPD A H K V GV GAF GPGFTPPHGGLLGW SPQ AQGILT S VP A APPP ASTNRQ S GRQPTPL SPPLR DTHPQA

preS HBV-Chimpance (con num de: AB032432, sec. con num. de ident.:5)

MGONL S T SNPLGFFPEHOLDP AFK ANTNNPD W DFNPKKD YWPE A N K V GAGAF GPGF TPPHGGLLGWSPQAQGILTTLPANPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPQA

^{preS HBV-D (con num de: AB048702, sec. con num. de ident.:} 6 ⁾

MGONL S T SNPLGFFPDHOLDPAFRANTNNPD WDFNPNKDT WPP A N K V GAGAF GL G FTPPHGGLLGWSPQAQGIMQTLPANPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRTTHPQA

preS HBV-E (con num de: X65657, sec. con num. de ident.:7)

M G L S W T VPLEW GKNISTTNPLGFFPDHQLDP AFRANTRNPD WDHNPNKDHW TE AN KVGVGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGMLKTLPADPPPASTNRQSGRQPTPITPPLRD THPQA

^{preS HBV-F (con num de: X69798@8, sec. con num. de ident.:} 8 ⁾MGAPLSTTRRGMGONLS VPNPLGFFPDHOLDPLFRAN S S SPDWDFNTNKD SWPMAN KYGYGGYGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGVLTTLPADPPPASTNRRSGRKPTPYSPPLR DTHPQA

preS HBV-G (con num de: AF160501, sec. con num. de ident.: 9)

MGLSWTVPLEWGKNLSASNPLGFLPDHOLDPAFRANTNNPDWDFNPKKDPWPEAN KVGVGAYGPGFTPPHGGLLGWSPQSQGTLTTLPADPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRD SHPQA

HBV de Gibbon (con num de: AJ131572, sec. con num. de ident.: 10) MGONHSVTNPLGFFPDHOLDPLFRANSNNPDWDFNPNKDTWPEATKVGVGAFGPGF TPPHGGLLGWSPQAQGILTTLPAAPPPASTNRQSGRKATPISPPLRD THPQA

^{HBV-H (con num de: Q} 8 ^JMY 6 ^{, sec. con num. de ident.: 11)}

M G APL S T ARRGMGQNL S VPNPLGFFPDHQLDPLFRAN S S SPD W DFNTNKDNW PM AN KVGVGGFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTSPPDPPPASTNRRSGRKPTPVSPPLRDT HPQA

HBV de Orangutan (con num de: AF193864, sec. con num. de ident.: 12)

MGONLS V SNPLGFFPEHQLDPLFRANTNNPD W DFNPNKDT W P EA TK VG V GAF GPGF TPPHGGLLGW SPQ AQGVTTILPAVPPP ASTNRQ SGRQPTPISPPLRDTHPQ A

HBV de Mono lanudo (con num de: NC_001896, sec. con num. de ident.: 13)

MGLNQSTFNPLGFFPSHQLDPLFKANAGSADWDKNPNKDPWPQAHDTAVGAFGPGL VPPHGGLLGWSSQAQGLSVTVPDTPPPPSTNRDKGRKPTPATPPLRDTHPQA

Las "variantes" son preferentemente variantes truncadas en el extremo N-terminal y/o C-terminal, variantes de sustitucion o delecion de aminoacidos, o variantes prolongadas de las secuencias de las sec. con nums. de ident.: 2-13, que portan una modification hidrofobica y en donde una o mas marcador(es) se acopla(n) a uno o mas aminoacido(s) N-terminal del dominio esencial del peptido hidrofobico modificado. Las variantes comprenden ademas una secuencia de aminoacidos que comprende aminoacido(s) modificado(s), aminoacido(s) no natural(es) o peptidomimetico(s) o compuestos adicionales que pueden imitar un esqueleto/estructura peptidica. Preferentemente, las variantes se seleccionan de variantes truncadas del extremo C-terminal de sec. con nums. de ident.: 2 a 13; sustitucion de aminoacidos o variantes de delecion; variantes que comprenden aminoacido(s) modificado(s), aminoacido(s) no natural(es) o peptidomimetico(s) o compuestos adicionales que pueden imitar una esqueleto/estructura peptidico.

De acuerdo con la invention, una variante de un peptido hidrofobico modificado comprende al menos los aminoacidos que tienen la secuencia de la sec. con num. de ident.: 1 y puede consistir en 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, ^{62, 63, 64, 65,} 66 ^{, 67,} 68 ^{, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,} 86 ^{, 87,} 88 ^{, 89, 90, 91, 92, 93, 94,}95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 o 119 aminoacidos de las anteriores sec. con nums. de ident.: 2 a 13, o variantes de estas.

Las variantes truncadas en el extremo N-terminal y/o en el extremo C-terminal comprenden preferentemente al menos 18 aminoacidos consecutivos, con mayor preferencia al menos 19 aminoacidos consecutivos, incluso con mayor preferencia ^{al menos} 20 ^{y solo incluso con mayor preferencia al menos} 21 ^{aminoacidos consecutivos de las sec. con nums. de ident.:}2 a 13 o variantes de estas.

La secuencia N-terminal (X) del peptido hidrofobico modificado que tiene una longitud de m aminoacidos puede consistir ^{en 5,} 6 ^{, 7 u} 8 ^aminoacidos.

En una modalidad preferida, uno o mas aminoacido(s) de X tienen un grupo amino en una cadena lateral, que se seleccionan preferentemente de entre lisina, a-amino glicina, acido a, Y-diaminobutrnco, ornitina, a, p acido diaminopropionico, con mayor preferencia lisina. El (los) aminoacido(s) de X que tiene(n) un grupo amino en una cadena lateral, preferentemente se encuentra(n) en el extremo N de X, en donde uno a once (1-11), preferentemente uno a tres (1 - 3), aminoacidos que tienen un grupo amino en una cadena lateral se encuentran en el extremo N de X.

En una modalidad preferida, la secuencia N-terminal (X) del peptido hidrofobico modificado comprende preferentemente la secuencia NX1SX2X3 (sec. con num. de ident.: 16), en donde X1, X2 y, X3 pueden ser aminoacidos arbitrarios. Preferentemente, X1 de la sec.con num. de ident.: 16 es L, I o Q, con mayor preferencia L. Preferentemente, X2 de la sec. con num. de ident.: 16 es T, V, A o no esta presente, preferentemente T o V, con mayor preferencia T. Preferentemente, X3 de la sec. con num. de ident.: 16 es P, S, T o F, con mayor preferencia P o S, incluso con mayor preferencia S. Preferentemente, la secuencia NX1SX2X3 (sec. con num. de ident.: 16) se une directamente al extremo N del peptido P (sec. con num. de ident.: 1; NPLGFXaaP), que resulta en un peptido que comprende la secuencia NX1SX2X3NPLGFXaaP, en donde X1, X2, X3 y Xaa se definen como anteriormente.

La secuencia C-terminal (Y) del peptido hidrofobico modificado que tiene una longitud de n aminoacidos comprende al menos 1 aminoacidos. Preferentemente, la secuencia terminal (Y) del peptido hidrofobico modificado puede consistir en ^{3, 4, 5,} 6 ^{, 7,} 8 ^{, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 1920, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65,} 66 ^{, 67,} 68 ^{, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85,} 86 ^{, 87,} 88 ^{, 89, 90, 91, 92 o 93 aminoacidos. Es decir, n puede}ser de 3 a 93.

En una modalidad preferida, la secuencia C-terminal (Y) del peptido hidrofobico modificado consiste en al menos 4 aminoacidos (n = 4), que preferentemente tiene la secuencia X4HQLDP (sec. con num. de ident.: 17), en donde X4 es un aminoacido arbitrario. Preferentemente, X4 de sec.con num. de ident.: 17 es D, E o S, con mayor preferencia D o E, incluso con mayor preferencia D. Preferentemente, la secuencia X4HQLDP (sec. con num. de ident.: 17) se une directamente al extremo C del peptido P (sec. con num. de ident.: 1; NPLGFXaaP), que resulta en un peptido que comprende la secuencia NPLGFXaaPX4HQLDP, en donde X4 y Xaa se definen como anteriormente.

En una modalidad preferida, el peptido hidrofobico modificado de la presente invencion comprende un peptido codificado por la secuencia de aminoacidos NX1SX2X3NPLGFXaaPX4HQLDP (sec. con num. de ident.: 18), en donde X1, X2, X3, X4 y Xaa se definen como anteriormente.

El termino "variante" ademas se refiere a las secuencias homologas encontradas en las diferentes especies, cepas o subtipos virales del genero hepadnavirus, tales como la cepa alfa del HBV, la cepa LSH del HBV (aislado del chimpance), el HBV del mono lanudo (WMHBV) o las cepas seleccionadas del grupo que consiste en los genotipos A y H del HBV (ver la sec. con num. de ident.: 2-13).

El termino "variante" ademas se refiere a secuencias homologas que muestran al menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoacidos que comprende el dominio invariante NPLGFXaaP y las secuencias adyacentes de la sec. con num. de ident.: 2-13 o cualquier otra secuencia de aminoacidos descrita en la presente descripcion, preferentemente 70%, con mayor preferencia 80%, incluso con mayor preferencia 90% o 95%.

Asf, un peptido hidrofobico modificado preferido de acuerdo con la invencion comprende una variante de las sec. con nums. de ident.: 2 a 13 con una secuencia de aminoacidos de las diferentes especies, cepas o subtipos virales, preferentemente de los genotipos de HBV o HBV de mono lanudo (WMHBV) o variantes de estos.

"Variantes" de las sec. con nums. de ident.: 2 a 13 ademas comprenden variantes o "analogos" que comprenden deleciones de aminoacidos, sustituciones de aminoacidos, tales como la sustitucion conservativa o no conservativa por otros aminoacidos o por isosteros (aminoacidos modificados que tienen una similitud estructural y espacial con los aminoacidos de protemas), adiciones de aminoacidos o adiciones de isosteros, siempre que la secuencia aun muestre ^{tropismo hepatico, preferentemente mas del} 10 ^{% de la dosis inyectada se acumula en el tejido hepatico despues de} 1 ^hdespues de la inyeccion intravenosa. El tropismo hepatico del peptido hidrofobico modificado o una "variante" de esta es preferentemente 80% o mas de la dosis inyectada/g de tejido hepatico despues de 1 h, mas preferido 90% o mas de la dosis inyectada/g de tejido hepatico despues de 1 h, incluso mas preferido 95% o mas de la dosis inyectada/g de tejido ^{hepatico despues de} 1 ^h.

Las sustituciones de aminoacidos conservativas tipicamente se relacionan con las sustituciones entre los aminoacidos de la misma clase. Estas clases incluyen, por ejemplo,

- aminoacidos que tienen cadenas laterales polares no cargadas, tales como asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina;

- aminoacidos que tienen cadenas laterales basicas, tales como lisina, arginina e histidina ;

- aminoacidos que tienen cadenas laterales acidas, tales como acido aspartico y acido glutamico; y

- aminoacidos que tienen cadenas laterales no polares, tales como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano y cistema.

"N-terminal" se refiere al extremo N de X, es decir, el primer residuo de aminoacido respectivo, pero comprende ademas la modificacion hidrofobica en proximidad cercana al extremo N, tales como los residuos de aminoacido respectivos (-4), (-3), (-2), (-1), 1, 2 o 3 o 4. Asf, el acoplamiento del marcador y la modificacion hidrofobica pueden obtenerse ademas mediante la union de un marcador y una porcion hidrofobica en un sitio cercano al extremo N de X.

La modificacion hidrofobica de dicho peptido hidrofobico modificado de acuerdo con la presente invencion anade una porcion hidrofobica al peptido.

X se modifica con al menos un grupo o porcion hidrofobica. En modalidades preferidas de esta invencion, X se modifica con 1, 2, 3, 4 o mas porcion/(es) o grupo(s) hidrofobico(s). Es decir, X puede modificarse con mas de una porcion o grupo ^{hidrofobico, tal como} 2 ^{. Las porciones o grupos hidrofobicos pueden ser iguales o diferentes entre sf. La modificacion}hidrofobica de dicho peptido de acuerdo con la presente invencion se selecciona de:

- acilacion;

- adicion de porciones hidrofobicas.

La acilacion se selecciona preferentemente de la acilacion con acidos carboxflicos, acidos grasos, aminoacidos con cadenas laterales lipofflicas. Los acidos grasos preferidos son acidos grasos saturados o insaturados, acidos grasos ^{ramificados o no ramificados, preferentemente con} 8 ^{a 22 atomos de carbono (C} 8 ^{a C 22). Con mayor preferencia, la}modificacion hidrofobica por acilacion se selecciona de la acilacion con miristoilo (C 14), palmitoilo (C 16) o estearoilo (C 18). La modificacion por miristoilacion se prefiere en aplicaciones in vivo y medicinales debido a su mayor seguridad, por ejemplo, que no muestra los efectos adversos del grupo estearoilo (respuesta inmune innata, etc.). La adicion de porciones hidrofobicas se selecciona preferentemente de la adicion de colesterol, derivados de colesterol, fosfolfpidos, glicolfpidos, esteres de glicerol, esteroides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, farnesol, grupos alifaticos, compuestos poliaromaticos. La union de las porciones hidrofobicas es preferentemente mediante union covalente, que puede lograrse mediante carbamato, amida, eter, disulfuro o cualquier otro enlace que este dentro de la experiencia de los expertos en la tecnica. Asf, los peptidos hidrofobicos modificados, preferentemente acilados de esta invencion son preferentemente lipopeptidos debido a su grupo/porcion lipofflico o hidrofobico N-terminal.

La modificacion (R) C-terminal de Y es preferentemente una modificacion con una porcion que protege de la degradacion, tal como la degradacion in vivo.

"C-terminal" se refiere a la modificacion en el extremo C, es dedr, el ultimo residuo de aminoacido respectivo, pero comprende ademas la modificacion en la proximidad cercana al extremo C, tal como el ultimo pero un residuo de aminoacido, el ultimo pero dos residuos de aminoacidos o mas residuos de aminoacidos (por ejemplo, la introduccion de un D-aminoacido que protege al portador de la degradacion enzimatica, por ejemplo, por la accion de las carboxipeptidasas). El experto en la tecnica podra seleccionar las respectivas porcion(es) adecuada(s) en dependencia de la aplicacion correspondiente. Las porciones preferidas que protegen de la degradacion se seleccionan de amidas, D-aminoacidos, aminoacidos modificados, aminoacidos dclicos, albumina, polfmeros naturales y sinteticos, tales como PEG, glicano. Ademas, o es 0 o al menos 1, es decir, la modificacion (R) C-terminal es opcional. Preferentemente, o es 1. En modalidades adicionales de esta invencion o es 1,2, 3, 4 o mas. Es decir, el extremo C del peptido hidrofobico modificado o su proximidad puede modificarse con mas de una porcion o grupo, tal como 2. Las porciones o grupos pueden ser iguales o diferentes entre sf.

En una modalidad de esta invencion, la modificacion hidrofobica y/o R se enlazan al peptido a traves de un enlazador o espaciador. El enlazador o espaciador son conocidos por los expertos en la tecnica, tales como polialanina, poliglicina, carbohidratos, grupos (CHa)n. El experto en la tecnica podra seleccionar, asf, el(los) enlazador(es) o espaciador(es) correspondiente(s) dependiendo de la aplicacion respectiva.

El grupo de anclaje opcional (A) sirve como un punto de union adicional para un compuesto, una etiqueta, un marcadory se ubica en un aminoacido de Y. Es decir, en caso de que al menos un grupo de anclaje (A) este presente (es decir, p > 1) Y tambien comprende al menos un aminoacido (es decir, n > 1). En una modalidad preferida, el grupo de anclaje es "C-terminal" de Y, en donde "C-terminal" se refiere a la modificacion en el extremo C, es decir, el ultimo residuo de aminoacido respectivo, pero comprende ademas la proximidad cercana del extremo C, tal como el ultimo pero un residuo de aminoacido, el ultimo pero dos residuos de aminoacido o mas residuos de aminoacido. En este caso o puede ser 0, asf, no existe otra modificacion R C-terminal. El grupo de anclaje A puede estar en una cadena lateral de aminoacido de Y o puede ser la cadena lateral de aminoacido de Y en sf, es decir, A puede ser una propia cadena lateral o una cadena lateral modificada. El grupo de anclaje ademas puede ser un residuo de aminoacido modificado que se introdujo en la secuencia de aminoacido de Y para servir como un grupo de anclaje. En otras modalidades de la invencion, el grupo de anclaje A se une a la modificacion hidrofobica de X y/o la modificacion R de C-terminal. Los grupos de anclaje preferidos se seleccionan de ester, eter, disulfuro, amida, tiol, tioester. El experto en la tecnica podra seleccionar el(los) grupo(s) de anclaje(s) adecuado(s) correspondiente(s) en dependencia del respectivo compuesto, etiqueta, marcador etc. que se adjunta. Ademas, el grupo de anclaje puede ser adecuado para unir un componente formador de complejos, tal como el complejo de biotina/avidina, poliarginina/oligonucleotido (por ejemplo, ARNip). Ademas, o es 0 o al menos 1, es decir, el grupo de anclaje (A) es opcional. Preferentemente, o es 1. En modalidades adicionales de esta invencion o es 1, 2, 3, 4 o mas. Es decir, existen mas de un grupo de anclaje, tal como 2. Los grupos de anclaje pueden ser iguales o diferentes entre sf, lo que permite la union de varios compuestos, tal como un marcador o marcadores diferentes.

Smtesis de los peptidos hidrofobicos modificados.

Los peptidos de la invencion pueden prepararse mediante una variedad de procedimientos facilmente conocidos por los expertos en la tecnica, en general mediante procedimientos qmmicos sinteticos y/o procedimientos de ingeniena genetica. Los procedimientos qmmicos sinteticos incluyen mas particularmente la smtesis secuencial y en bloques en fase solida (Erickson y Merrifield, 1976). Se pueden tomar mas detalles del documento de patente num. WO2009/092612.

El procedimiento secuencial en fase solida puede realizarse usando metodos automatizados establecidos, tal como el uso de un sintetizador de peptidos automatizado. En este procedimiento, un aminoacido [alfa]-amino protegido se une a un soporte de resina. El soporte de resina empleado puede ser cualquier resina adecuada empleada convencionalmente en la tecnica para la preparacion en fase solida de (poli)peptidos, preferentemente poliestireno que se ha copolimerizado con polioxietileno para proporcionar sitios para la formacion de esteres con el aminoacido o-amino protegido introducido inicialmente. Este metodo optimizado, aplicado por los inventores, se ha descrito explfcitamente (ver por ejemplo, 12). Los aminoacidos se introducen uno por uno (gradualmente). Cada ciclo de smtesis correspondiente a la introduccion de un aminoacido incluye una etapa de desproteccion, etapas de lavado sucesivos, una etapa de acoplamiento con la activacion del aminoacido, y etapas de lavado subsiguientes. Cada una de estas etapas es seguida por una filtracion. Los agentes reactivos para el acoplamiento son los agentes reactivos clasicos para la smtesis de (poli)peptidos, tales como ^{diciclohexilcarbodiimida, hidroxibenzotriazol, benzotriazil-} 1 ^{-il-oxitris (dimetilamino) fosfonio hexafluorofosfato y}difenilfosforocloruro. Despues de la smtesis del polipeptido en la resina, el polipeptido se separa de la resina por un tratamiento con un acido fuerte tal como acido trifluoroacetico en presencia de anisol, etanoditiol o 2- metilindol. El compuesto se purifica despues por las tecnicas clasicas de purificacion, en particular por medio de HPLC.

Los peptidos de la presente invencion ademas pueden obtenerse acoplando fragmentos de (poli)peptido que se protegen selectivamente, efectuandose este acoplamiento, por ejemplo, en una solucion. Los peptidos pueden producirse adicionalmente mediante tecnicas de ingeniena genetica como conocen los expertos en la tecnica. Un sistema de expresion eucariotico, tal como el sistema de baculovirus, es particularmente adecuado. De acuerdo con este procedimiento, las protemas se expresan en celulas de insecto infectadas con un baculovirus recombinante que contiene una secuencia de acido nucleico que codifica una protema heterologa y que regula las secuencias de acido nucleico, tal como un promotor. Hay varias lmeas celulares disponibles para la infeccion con baculovirus recombinante, tal como la lmea celular Sf-9, disponible en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (CRL 1711). La expresion en un sistema de expresion procariota, tal como E. coli, ademas es particularmente adecuada.

La introduccion de la porcion hidrofobica en el peptido puede lograrse mediante una variedad de procedimientos facilmente conocidos por los expertos en la tecnica, incluidos los enfoques de ingeniena genetica y sintetica.

Alternativamente, los peptidos y/o peptidos de fusion (es decir, peptidos hidrofobicos modificados) pueden producirse mediante lmeas celulares eucarioticas transfectadas de manera estable, como CHO y otras lmeas celulares que son conocidas en la tecnica y se usan por lo general para generar vacunas y similares. Debido a la propiedad intrmseca de que los aminoacidos N-terminal 47-preSl promueven la secrecion de una protema/peptido miristoilado, el peptido hidrofobico modificado biologicamente activo puede extraerse de los sobrenadantes de cultivos celulares.

Vectores y lanzaderas para direccionamiento al hngado.

Como se describio anteriormente, la presente invencion proporciona el uso de los peptidos hidrofobicos modificados como vehmulo o lanzadera para el suministro espedfico de un compuesto (marcador) al hngado, en donde el marcador se acopla a los peptidos hidrofobicos modificados como se describe en la presente descripcion.

"Vehmulo" o "lanzadera" para el suministro espedfico de un compuesto al hfgado de acuerdo con la presente invencion se refiere al tropismo hepatico o al hepatotropismo de los peptidos hidrofobicos modificados tal como fueron encontrados por los inventores y descritos en la presente descripcion, es decir, a su capacidad para acumular selectivamente en el hfgado, preferentemente para acumularse selectivamente en la membrana plasmatica de hepatocitos, asf como para entrar selectivamente en hepatocitos. La invencion se basa en el descubrimiento de una acumulacion hepatica altamente espedfica y en la identificacion de los determinantes del tropismo hepatico del HBV en la secuencia preS 1 del HBV por los inventores. Asf, la invencion usa el conocimiento acerca de los determinantes del tropismo hepatico para el diseno de vehmulos o lanzaderas universales para el direccionamiento o suministro espedfico al hfgado, respectivamente. Los peptidos hidrofobicos modificados de la presente invencion son vehmulos o lanzaderas versatiles para suministrar espedficamente compuesto(s) al hfgado.

Preferentemente, el suministro espedfico de un compuesto al hfgado es el suministro espedfico del compuesto a los hepatocitos. Ademas, el compuesto puede suministrarse espedficamente in vitro asf como in vivo a los hepatocitos. El compuesto preferentemente se suministra espedficamente al hngado de un animal, preferentemente de mairnfero o humano, o un ave.

Marcadores que se suministran

Los marcadores que se suministran espedficamente al hngado de acuerdo con la presente descripcion pueden ser cualquiertipo de compuesto que sea adecuado para propositos de diagnostico. Preferentemente, la etiqueta comprende un agente quelante que forma un complejo con cationes metalicos divalentes o trivalentes.

En la invencion, el marcador se selecciona a partir de un colorante fluorescente, un radioisotopo y un agente de contraste. De acuerdo con la presente invencion, un agente de contraste es un colorante u otra sustancia que ayuda a mostrar areas anormales dentro del cuerpo.

Los isotopos emisores de radioisotopos/fluorescencia preferidos se seleccionan del grupo que consiste en isotopos emisores de radiacion alfa, isotopos emisores de radiacion gamma, isotopos emisores de electrones Auger, isotopos ^{emisores de rayos X, isotopos emisores de fluorescencia, tales como 18F, 51Cr, 67Ga,} 68 ^{Ga, 11In, 99mTc , 140La, 175Yb, 153Sm, 166Ho,} 88 ^{Y, 90Y, 149Pm, 177Lu, 47Sc, 142Pr, 159Gd, 212Bi, 72As, 72Se, 97Ru, 109Pd, 105R}h, 101m15Rh, 119Sb, 128Ba, 123I, 124I, 131I, 197Hg, 211At, 169Eu, 203Pb, 212Pb, 64Cu, 67Cu, 188Re, 186Re, 198A u y 199Ag.

Los colorantes fluorescentes preferidos se seleccionan de las siguientes clases de colorantes: Xantenos (por ejemplo, Fluorescema), Acridinas (por ejemplo, Amarillo Acridina), Oxazinas (por ejemplo, Oxazina 1), Cininas (por ejemplo, Cy7 / Cy 3), colorantes estirilos (por ejemplo, Dye-28), Coumarinas (por ejemplo, Alexa Fluor 350), Porfinas (por ejemplo, Clorofila B), complejos de ligandos metalicos (por ejemplo, PtOEPK), protemas fluorescentes (por ejemplo, APC, ficoeritrina), nanocristales (por ejemplo, QuantumDot 705), perilenos (por ejemplo, Lumogen Red f 300) y ftalocianinas (por ejemplo, IRDYE™ 700DX) y conjugados y combinaciones de estas clases de colorantes. Los agentes de contraste preferidos se seleccionan entre agentes paramagneticos, por ejemplo, Gd, Eu, W y Mn, preferentemente complejados con un agente quelante. Otras opciones son complejos y partfculas supramagneticas de hierro (Fe), compuestos que contienen atomos de alto numero atomico, es decir, yodo para tomograffa computarizada (CT), microburbujas y portadores como los liposomas que contienen estos agentes de contraste.

Agente quelante

El marcador que se suministrara espedficamente a los hepatocitos puede unirse al peptido hidrofobico modificado en forma de un complejo con un agente quelante capaz de formar complejos con el marcador respectivo. En una modalidad preferida de la invencion, el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en el acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N, N',N,N'-tetraacetico (DOTA), acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido 1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacetico (NOTA), trietilentetramina (TETA), acido iminodiacetico, acido dietilentriamina-N,N,N',N',N"-pentaacetico (DTPA) y el acido 6-hidrazinopiridin-3-carboxflico (HYNIC), mientras que el acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N,N'-tetraacetico (DOTA) es particularmente preferido.

Acoplamiento de un marcador al peptido hidrofobico modificado.

El acoplamiento de lo(s) marcador(es) a los respectivos aminoacidos de X puede realizarse mediante cualquier metodo adecuado conocido porel experto en latecnica.

En una modalidad preferida de la presente invencion, el(los) marcador(es) se acopla(n) al aminoacido respectivo de X mediante el uso de un ester activado. En particular, este metodo puede usarse en el caso de un acoplamiento de marcador(es) a los aminoacidos de X que tienen un grupo amino en una cadena lateral. Alternativamente, pueden usarse los siguientes metodos de acoplamiento para acoplar una o mas marcadores a los respectivos aminoacidos de X, que se resumen brevemente. Las condiciones de reaccion espedficas para lograr un acoplamiento de un marcador a un aminoacido con o sin un enlazador pueden determinarse facilmente por un qrnmico:

- La formacion de amidas mediante la reaccion de una amina y acidos carboxflicos activados, preferentemente esteres de NHS o carbodiimidas; una carbodiimida es un agente de reticulacion completo que facilita la conjugacion directa de los carboxilos a la amina primaria. Los esteres de NHS son grupos reactivos formados por la activacion con carbodiimida de moleculas que contienen los grupos carboxilato

- El enlace disulfuro en con el uso de dos tioles o un tiol que reacciona espedficamente con disulfuros de piridilo; los disulfuros de piridilo reaccionan con los grupos sulfidrilo en un amplio intervalo de pH (el optimo es pH 4-5) para formar enlaces disulfuro. Durante la reaccion, se produce un intercambio de disulfuro entre el grupo SH de la molecula y el grupo 2-piridilditiol. Como resultado, se libera piridina-2-tiona.

- Formacion de tioeter con el uso de maleimidas o haloacetilos y un componente tiol; los haloacetilos reaccionan con grupos sulfidrilo a pH fisiologico. La reaccion del grupo yodoacetilo procede de la sustitucion nucleofila del yodo con un atomo de azufre a partir de un grupo sulfidrilo para dar como resultado un enlace tioeter estable. El grupo maleimida reacciona espedficamente con los grupos sulfidrilo cuando el pH de la mezcla de reaccion esta entre pH 6,5 y 7,5 y forma un enlace tioeter estable que no es reversible.

- La formacion de amidina con el uso un imidoester y una amina; los agentes de reticulacion de imidoester reaccionan rapidamente con aminas a pH alcalino pero tienen vidas medias cortas. A medida que el pH se vuelve mas alcalino, aumenta la vida media y la reactividad con las aminas; por lo tanto, la reticulacion es mas eficiente cuando se realiza ^{a pH 10 que a pH} 8 ^{. Las condiciones de reaccion por debajo del pH 10 pueden provocar reacciones secundarias,}aunque la formacion de amidina se ve favorecida entre el pH 8-10.

- El enlace hidrazida con el uso de carbonilos (por ejemplo, aldeddos) e hidrazidas; los carbonilos (aldeddos y cetonas) reaccionan con las hidrazidas y aminas a pH 5-7. Los carbonilos no existen facilmente en las protemas; sin embargo, la leve oxidacion de los glicoles de azucar con el uso de metaperyodato de sodio convierte a los hidroxilos vecinos en aldeddos o cetonas. La reaccion posterior con hidrazidas da como resultado la formacion de un enlace de hidrazona.

- El enlace amina con el uso de carbonilos y aminas en condiciones reductoras; la aminacion reductora (tambien conocida como alquilacion reductora) es una forma de aminacion que implica la conversion de un grupo carbonilo en una amina a traves de una imina intermedia. El grupo carbonilo es mas comunmente una cetona o un aldeddo.

- Formacion de triazol catalizado por cobre con el uso de nitrilos y azidas. La cicloadicion 1,3-dipolar de tipo Huisgen entre una azida y un alquino terminal o interno se usa para dar 1,2,3-triazoles estables.

- Formacion de isotiourea con el uso de isotiocianatos y aminas; la reaccion entre los isotiocianatos y las aminas, es decir, los grupos £-amino de la lisina conduce a un enlace de isotiourea estable.

- Formacion de esteres por reaccion de un alcohol y acidos carboxflicos activados, preferentemente cloruros de acido o carbodiimidas; la reaccion a altas temperaturas permite que la reaccion directa entre alcoholes y acidos carboxflicos forme esteres estables, alternativamente los acidos carboxflicos pueden activarse en condiciones cataltticas acidas o basicas.

- Formacion de eteres por la reaccion de un alcohol y haluros de alquilo. Los haloalcanos son reactivos frente a los nucleofilos. Son moleculas polares: el carbono que esta unido al halogeno es ligeramente electropositivo y el halogeno es ligeramente electronegativo. Esto resulta en un carbono deficiente en electrones (electrofilo) que, inevitablemente, atrae a los nucleofilos.

Enlazador/Espaciador para el marcador

El peptido hidrofobico modificado, en particular los conjugados de la presente invencion, se usan preferentemente para enriquecer un marcador que se transporta al hngado, en el hngado. Preferentemente, el marcador se escinde del peptido hidrofobico modificado por una protema hepatica, preferentemente una enzima proteolftica hepatocelular, en particular, in vivo en el tngado. El marcador y el peptido hidrofobico modificado forman un conjugado. Preferentemente, el conjugado del marcador y el peptido hidrofobico modificado se forma por la union covalente o por la formacion de complejos. La forma de fijacion depende del tipo de marcador.

El acoplamiento del(de los) marcador(es) a los respectivos aminoacidos de X puede realizarse con el uso de un espaciador o un enlazador. El enlazador o espaciador son conocidos por los expertos en la tecnica, tales como polialanina, poliglicina, carbohidratos, grupos (CH2)n o secuencias de aminoacidos. El experto en la tecnica podra seleccionar, asf, el(los) enlazador(es) o espaciador(es) correspondiente(s) dependiendo de la aplicacion respectiva. El espaciador o enlazador comprende preferentemente un sitio de reconocimiento para la activacion espedfica de los hepatocitos, que se reconoce preferentemente por una protema espedfica de hngado o tumor. El sitio de reconocimiento es preferentemente un sitio de escision proteolftica. La protema hepatica es preferentemente, por lo tanto, una protema hepatocelular, con mayor preferencia una enzima proteolftica hepatocelular o una enzima proteolftica que se sobreexpresa en un tumor, por ejemplo, MMP7. Asf, el conjugado puede administrarse a un sujeto y se transportara a traves del cuerpo, tal como en los fluidos corporales, sin que se escinda. Sin embargo, tan pronto como el conjugado alcanza su objetivo, el hngado o los hepatocitos, respectivamente, la protema hepatica, como una enzima proteolftica hepatocelular, escindira el sitio de escision proteolftica y liberara el marcador de su lanzadera, es decir, el peptido hidrofobico modificado.

Otras protemas del hngado preferidas son los citocromos, tales como el citocromo P450 o las liasas de la via endodtica. La tecnologfa HepDirect (R) (de Metabasis Technologies, Inc.) como se usa en Adefovir o Pradevofir, es adecuada tambien para la presente invencion.

De particular importancia para el diagnostico y pronostico de enfermedades tumorales como las alteraciones neoplasicas por metastasis de carcinomas, por ejemplo, carcinomas de colon, es el intercambio entre el tejido maligno y el tejido circundante. Existe la necesidad de la activacion de celulas epiteliales sanas o el reclutamiento de celulas inmunitarias, que es un requisito previo para la formacion de una metastasis distante de un tumor primario. El analisis de tejidos ha demostrado que los niveles de expresion de ARNm de las metaloproteasas espedficas detumores (MMP1, MMP2, MMP7, MMP9 y MMP12) se asocian con un mal pronostico de los pacientes con tumores (Gentner B. y otros, Anticancer Res.

2009 Jan; 29 (1): 67-74). De estas proteasas, especialmente, la MMP7 es de gran interes, ya que se expresa principalmente por las celulas tumorales. El acoplamiento del marcador a la secuencia peptfdica descrita a traves de una secuencia enlazadora que contiene un sitio de union proteolftico espedfico para MMP7 (por ejemplo, una secuencia de peptidos corta GCHAK o RPLALWRS) pero tambien todos los otros sustratos de MMP 7 (por ejemplo, fibronectina, elastina, casema u otros) pueden dejar administrar un marcador inactivo al hngado mediante la modificacion del peptido original por los medios descritos anteriormente. En el hngado, los peptidos modificados pueden escindirse despues preferentemente en el entorno directo del tejido tumoral y puede activarse el marcador inactivo. Este metodo de suministro de marcadores a carcinomas hepatocelulares primarios dirigidos al hngado o metastasis en el hngado que sobreexpresa una de las MMP enumeradas anteriormente (por ejemplo, metastasis de carcinoma de colon) presenta una nueva forma de direccionar los marcadores a los tejidos tumorales.

En una modalidad, el conjugado de marcador y peptido derivado modificado e hidrofobo se forma mediante la formacion de complejos. Los complejos preferidos utiles en la invencion son biotina/avidina, poliarginina/oligonucleotido (por ejemplo, ARNip). El experto en la tecnica podra determinar los componentes complejos adecuados y en consecuencia, disenar el compuesto y el peptido hidrofobico modificado.

Diagnostico de las enfermedades hepaticas

En una modalidad preferida de la invencion, los peptidos hidrofobicos modificados anteriores, en particular sus conjugados con marcadores, se proporcionan para el diagnostico de una enfermedad o trastorno hepatico.

En dependencia de la enfermedad o trastorno hepatico que se diagnosticara, se seleccionara el marcador respectivo y se suministrara espedficamente al hngado. Una "enfermedad hepatica" o un "trastorno hepatico" de acuerdo con la presente invencion se refiere a cualquier enfermedad o trastorno que tiene un efecto sobre o involucra el organo del hngado, tejido hepatico o hepatocitos.

Los ejemplos de enfermedades hepaticas son:

- Cancer de hngado: carcinoma hepatocelular primario (HCC) o colangiocarcinoma y canceres metastasicos, generalmente de otras partes del tracto gastrointestinal; preferentemente carcinoma colorrectal

- Hepatitis: inflamacion del hngado, causada principalmente por varios virus pero ademas por ciertos venenos, autoinmunidad o afecciones hereditarias;

- Cirrosis: la formacion de tejido fibroso en el hngado, que reemplaza a las celulas hepaticas muertas. La muerte de las celulas hepaticas puede ser causada, por ejemplo, por hepatitis viral, alcoholismo o contacto con otras sustancias qmmicas toxicas para el hngado;

- Smdrome de Budd-Chiari: obstruccion de la vena hepatica;

- Enfermedad de almacenamiento de glucogeno tipo II: la acumulacion de glucogeno causa una debilidad muscular progresiva (miopatfa) en todo el cuerpo y afecta a varios tejidos corporales, particularmente en el corazon, los musculos esqueleticos, el hngado y el sistema nervioso.;

^{- enfermedad pediatrica del tngado, como atresia biliar, deficiencia de alfa} -1 ^{-antitripsina, smdrome de alagille y}colestasis intrahepatica familiar progresiva;

- enfermedades metabolicas.

Ademas, se incluyen tambien las enfermedades hepaticas de los animales, como las mascotas o el ganado, en particular las enfermedades que pueden transmitirse a los seres humanos, tal como toxoplasmosis.

La enfermedad o trastorno hepatico a diagnosticar se selecciona preferentemente entre carcinoma hepatocelular primario, metastasis de otros tumores, hepatitis, cirrosis, hemocromatosis, preferentemente hepatitis causada por virus de hepatitis A, B, C, D, E, F, G y H. La enfermedad o trastorno hepatico a diagnosticar puede ser tambien una hepatitis concomitante causada por virus, tales como virus de la familia Herpesviridae, por ejemplo, el virus del herpes, el virus citomegalico (CMV) pero tambien el virus de la varicela zoster (VZV), el virus de Epstein Barr (EBV), virus coxsackie, virus de la fiebre amarilla, virus del dengue.

La enfermedad o trastorno hepatico a diagnosticar tambien puede ser una enfermedad que involucra un estadio hepatico de un virus o un patogeno no viral, tales como en muchas enfermedades tropicales. Dado que el estadio hepatico de algunos patogenos es un estadio temprano, la infeccion respectiva puede tratarse de forma selectiva, espedficamente en dicho estadio temprano. Tales virus son los virus de la hepatitis A, B, C, D, E, F, G y H, los virus del herpes.

Dichos patogenos no virales son bacterias, parasitos y/o gusanos. Los parasitos son, por ejemplo, parasitos protozoarios del genero Plasmodium que causan malaria, como Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax y especies relacionadas (por ejemplo, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowles[iota]). Tales gusanos son, por ejemplo, gusanos planos del genero Schistosoma que causan esquistosomiasis o bilharziosis, tales como Schistosoma mansoni, Schistosoma intercalatum, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum y Schistosoma mekongi. Dichos parasitos tambien son, por ejemplo, protozoos de Leishmania tripanosoma del genero Phlebotomus y Lutzomyia que son responsables de la enfermedad de la leishmaniasis. Por lo tanto, la malaria, la esquistosomiasis (bilharziosis) y/o la leishmaniasis pueden diagnosticarse por medio de esta invencion. Por lo tanto, ciertas enfermedades tropicales pueden diagnosticarse por medio de esta invencion.

Las enfermedades o trastornos hepaticos a diagnosticar son preferentemente tumores hepaticos, preferentemente carcinoma hepatocelular (HCC) o alteraciones neoplasicas por metastasis de tumores solidos, por ejemplo, carcinoma colorrectal.

En una modalidad preferida de la invencion, los peptidos hidrofobicos modificados descritos anteriormente se usan para el diagnostico y la clasificacion temprana de lesiones neoplasicas primarias del hngado, tales como, el carcinoma hepatocelular en estadio temprano.

Otra modalidad preferida de la invencion es el uso de los peptidos hidrofobicos modificados descritos anteriormente para el diagnostico temprano de lesiones metastasicas en el hngado, tales como metastasis de carcinoma colorrectal (CRC). La enfermedad o trastorno hepatico a diagnosticar puede ser tambien una enfermedad metabolica, como diabetes, hiperlipidemia, smdrome metabolico y obesidad, hiperglucemia cronica, smdrome metabolico, esteatohepatitis no alcoholica (NASH) (ver tambien (9)).

En una modalidad preferida de la invencion, los peptidos derivados hidrofobos modificados, preferentemente acilados, descritos anteriormente, en particular sus conjugados con marcadores, pueden usarse para la fabricacion de un medicamento para el diagnostico de una enfermedad o trastorno hepatico.

Imagenes medicas

Los peptidos hidrofobicos modificados de la presente invencion pueden usarse en imagenes medicas conocidas por los expertos en la tecnica. Los metodos adecuados son imagenes de rayos X, imagenes de resonancia magnetica (MRI), tomograffa por emision de positrones (PET), tomograffa computarizada por emision de foton unico (SPECT) tomograffa computarizada por rayos X (CT) y combinaciones de estos metodos (por ejemplo, PET CT, CT-MRI). Los expertos en la tecnica conocen las condiciones espedficas para llevar a cabo estos metodos de formacion de imagenes medicas. Composiciones farmaceuticas

Como se describio anteriormente, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende al menos un peptido hidrofobico modificado como se define en la presente y al menos un compuesto para ser administrado espedficamente al hngado como se define en la presente y opcionalmente un portadory/o excipiente farmaceuticamente aceptable.

La composicion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion comprende:

- al menos un peptido hidrofobico modificado como se definio en la presente descripcion anteriormente; y

- opcionalmente un portador y/o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Las composiciones farmaceuticas de acuerdo con la presente invencion son muy adecuadas para todos los usos y metodos descritos en la presente descripcion.

Un "portador o excipiente farmaceuticamente aceptable" se refiere a cualquier vehnculo en donde o con el cual se puede formular las composiciones farmaceuticas o de vacunas de acuerdo con la invencion. Incluye una solucion salina, tal como solucion salina con tampon fosfato, un tampon de citrato, NaCl, glucosido de octilo y/o un poloxamero. En general, un diluyente o portador se selecciona en funcion del modo y la via de administracion, y de la practica farmaceutica estandar. Metodo de diagnostico

Ademas, y como se describio anteriormente, la presente invencion proporciona metodos para el diagnostico de una enfermedad o trastorno hepatico utilizando el(los) peptido(s) hidrofobico(s) modificados descritos anteriormente o la(s) composicion(es) farmaceuticas de la invencion.

La presente invencion proporciona tambien un metodo para el diagnostico de una enfermedad o trastorno hepatico mediante la administracion a un sujeto de un peptido hidrofobico modificado derivado y un marcador, o una composicion farmaceutica como se define en la presente invencion. El metodo para el diagnostico de una enfermedad o trastorno hepatico de acuerdo con la presente invencion comprende administrar a un sujeto en una cantidad diagnosticamente eficaz

(a) un peptido hidrofobico modificado como se definio anteriormente y que comprende al menos un marcador como se definio anteriormente en la presente, o

(b) una composicion farmaceutica como se definio anteriormente en la presente.

Via de administracion

Preferentemente, la via de administracion de los peptidos hidrofobicos modificados o composiciones farmaceuticas de la presente invencion, en particular en el metodo de tratamiento, se selecciona de la via subcutanea, intravenosa, oral, nasal, intramuscular, transdermica, inhalativa, por supositorio. Una modalidad preferida para la administracion o aplicacion nasal es un aerosol nasal.

En una modalidad preferida adicional, el peptido hidrofobico modificado de la invencion que comprende un marcador se disuelve en el suero del paciente y se aplica a traves de la inyeccion.

Cantidad diagnosticamente eficaz

Una "cantidad diagnosticamente eficaz" de un peptido hidrofobico modificado o una composicion farmaceutica de esta invencion se refiere a la cantidad que es suficiente para diagnosticar la enfermedad o trastorno hepatico respectivo. La cantidad diagnosticamente eficaz preferida depende del compuesto respectivo que se va a administrar y su potencial de diagnostico respectivo. El experto en la tecnica sera capaz de determinar las cantidades adecuadas diagnosticamente eficaces. En una modalidad preferida, la cantidad diagnosticamente eficaz esta en el intervalo de 10 pmol por kg a 20 |jmol por kg de peso corporal. Para su uso como agente de diagnostico (es decir, un marcador se acopla al peptido ^{hidrofobico modificado), la cantidad que debe aplicarse a un paciente esta preferentemente en el intervalor de} 100 ^nmola 2 jmol, con mayor preferencia aproximadamente de 500 nmol por kg de peso corporal. Cuando se utiliza la MRI como metodo de obtencion de imagenes medicas, el peptido hidrofobico modificado respectivo se aplica preferentemente a un paciente en una cantidad que vana de 300 nmol a 800 nmol por kg de peso corporal, con mayor preferencia de 400 a 600 nmol por kg de peso corporal.

Peptidos hidrofobicos modificados preferidos de la invencion.

A continuation, se proporcionan los peptidos hidrofobicos modificados preferidos de la invention. Estos peptidos hidrofobicos modificados se basan en la secuencia de aminoacidos KKKNLSTSNPLGFFPDHQLPD (sec. con num. de ident. 14) o KKKNLSTSNPLGFFPDHQLDP (sec. con num. de ident. 15), en donde una o dos de las lisinas N-terminales (K) pueden eliminarse o sustituirse por otro aminoacido. Un peptido hidrofobico modificado preferido ilustrativo tiene la siguiente estructura qtimica:

La secuencia de aminoacidos del compuesto que tiene la estructura quimica ejemplificada anteriormente es:

Estearoil-K(DOTA[Gd])K(DOTA[Gd])K(DOTA[Gd])NLSTSNPGLGFFPDHQLDP-amida, en donde cada uno de los tres agentes quelantes acido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N,N'-tetraacetico (DOTA) se acompleja con un cation Gd y se une a una de las tres lisinas N-terminales (KKK), mientras que la primera lisina N-terminal se modifica aun mas con un grupo estearoilo hidrofobico. En este sentido, se debe tener en cuenta que las formulas de los peptidos hidrofobicos modificados de la invencion se simplifican en el texto, de manera que el peptido hidrofobico modificado ejemplificado ^{anteriormente puede denominarse tambien "estearoil -[K(DOTA[Gd])]} 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida"}

Se proporcionan los siguientes peptidos hidrofobicos modificados preferidos de la invencion, asi como su uso espedfico en el diagnostico de enfermedades o trastornos del higado:

^{- Estearoil-[K(DOTA[Gd])]} 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLDP}

^{- Estearoil-[K(DOTA[} 68 ^Ga])] 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLDP}

^{- Estearoil-[K(DOTA[} 111 ^In])] 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLDP}

^{- Estearoil-[K(DOTA[Gd])]} 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLPD}

^{- Estearoil-[K(DOTA[} 68 ^Ga])] 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLPD}

^{- Estearoil-[K(DOTA[} 111 ^In])] 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLPD}

^{- Estearoil-[K(DOTA[Gd])]} 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida}

^{- Estearoil-[K(DOTA[} 68 ^Ga])] 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida}

^{- Estearoil-[K(DOTA[} 111 ^In])] 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida}

^{- Estearoil-[K(DOTA[Gd])]} 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida}

^{- Estearoil-[K(DOTA[} 68 ^Ga])] 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida}

^{- Estearoil-[K(DOTA[} 111 ^In])] 3 ^{-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida}

Tabla 1 Peptidos hidrofobicos modificados preferidos

Peptido hidrofobico modificado Marcador / Aplicacion

Agente

acoplado

estearoil-[K(DOTA[Gd])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida Gd Diagnostico

estearoil-[K(DOTA[⁶⁸Ga])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida ⁶⁸Ga Diagnostico

estearoil-[K(DOTA[¹¹¹In])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida ¹¹¹In Diagnostico

estearoil-[K(DOTA[Gd])]^{3 -}NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida Gd Diagnostico

estearoil-[K(DOTA[⁶⁸Ga])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida ⁶⁸Ga Diagnostico

estearoil-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida ¹¹¹In Diagnostico

estearoilo se refiere a la esterificacion del extremo N-terminal

Los siguientes ejemplos y dibujos ilustran la presente invencion sin limitar, sin embargo, los mismos.

Breve descripcion de las figuras

Figura 1: Representacion esquematica de la partmula de HBV y de las protemas L-, M- y S- del VHB. El ADN parcialmente bicatenario esta covalentemente asociado con el complejo de la polimerasa viral, que consiste en la protema terminal, (TP), la transcriptasa inversa (RT) y la RNasaH. El genoma esta encapsulado por una cubierta icosaedrica, construida con 120 d ^e ro s de protemas nucleares. Las 3 protemas de superficie L-, M- y S- de HBV se integran en una bicapa lipfdica derivada del RE. Las protemas L- y M- contienen el dominio-S completo que sirve como anclaje de membrana. Representacion esquematica del genoma de ADN parcialmente bicatenario del h BV; C = protema del nucleo que forma la capside viral; X = protema X, un transactivador pleiotropico con funcion indefinida; P = polimerasa viral; combinaciones preSI / preS2 / S de estos forman la protema de superficie HBV grande (preS1/preS2/S) (protema L), la protema de superficie HBV media (preS2/S) y la protema de superficie HBV pequena (S).

Figura 2: Diagrama esquematico de la formula general del peptido hidrofobico modificado de la presente invencion y un ejemplo de un peptido hidrofobico modificado de la invencion.

Figura 3: Diagrama esquematico de la union de un peptido hidrofobico modificado de la invencion a la superficie de un hepatocito.

Figura 4. Imagen PET de una rata portadora de tumor. Figura 4A Enriquecimiento espedfico de 400 nmol/kg de estearoil-[K(DOTA [68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida en el hngado de una rata wAG/Rji cinco minutos despues de la inyeccion iv. Figura 4B Contraste con el uso de 18F-FDG 24 horas despues de la medicion inicial, 18F-FDG se enriquece en organos que consumen grandes cantidades de glucosa, en la imagen del corazon (masa gris en la parte superior) y el tumor rico en glucosa (18F-FDG enriquecido en el cerebro no se muestra por razones tecnicas). Figura 4C Union de ambas imagenes que demuestran la especificidad de los peptidos que tinen solo el tejido del fngado pero no el tejido tumoral.

La Figura 5 muestra una serie de imagenes representativas de MRI de una rata antes de la inyeccion de 600 nmol/kg de peso corporal de estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP (Figura 5A), asf como 20 (Figura 5B) y 30 minutos (Figura 5C) posterior a la inyeccion.

^{La Figura} 6 ^{muestra la mejora del contraste determinada por la medicion de MRI en el hngado, tejido muscular y corazon.}

Figura 7: Relajacion R1 del peptido estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP (Peptido X), Primovist™, Magnevist™ y Vasovist™ disueltos en PBS en cantidades equimolares (ImM).

^Figura 8 ^{: Relajacion R2 del peptido estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP (Peptido X), Primovist™,}Magnevist™ y Vasovist™ disueltos en PBS en cantidades equimolares (ImM).

Figura 9: Distribucion en los organos del peptido hidrofobico modificado marcado con 111In en ratones.

Figura 10: Estabilidad de estearoil-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida en suero humano no inactivado.

EJEMPLOS

En los siguientes ejemplos, los peptidos hidrofobicos que llevan Gd, 68Ga o 111In como marcadores acomplejados con ^{DOTA (estearoil-[K(DOTA[Gd])]a-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida, estearoil-[K(DOTA[} 68 ^{Ga])]a-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida o estearoil-[K(DOTA[} 111 ^{In])]a-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida) se usaron como} productos ejemplares de la presente invencion. Si no se indica lo contrario, los experimented in vivo con el uso de diferentes metodos de imagenes medicas se han realizado utilizando ratas WAG/Rij.

Ejemplo 1

Smtesis del peptido hidrofobico modificado

La smtesis de los peptidos se llevo a cabo con el uso del metodo Fmoc como se describe en (10) Gripon, P. y otros. J Virol 79, 1613-1622 (2005).

Smtesis DOTA-DFP

Se disolvio diisopropilcarbodiimida (5 mmol, 631 mg, 774 j l) en piridina (15 ml) y se adiciono gota a gota durante 10 minutos a una solucion de DOTA (5 mmol, 2,02 g) y difluorofenol (5 mmol, 650 mg) en agua (60 ml) mientras se agita. 30 min despues de la adicion, la mezcla de reaccion se extrajo tres veces con diclorometano y la fase acuosa se evaporo hasta la sequedad con el uso de un evaporador giratorio. El producto crudo se disolvio en una mezcla de agua (11 ml) y acetonitrilo (3 ml) y se purifico mediante RP-HPLC preparativa. Las fracciones de HPLC que conteman el producto se concentraron por liofilizacion. Rendimiento: 1,0633 g (41 %).

Acoplamiento al peptido

El peptido estearoil-KKKNLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida (140 mg, 0,055 mmol) se disolvio en 5 ml de DMF. Se anadio DOTA-DFP (129 mg, 0,25 mmol) y, ademas, se anadio DIPEA (410 jl, 2,5 mmol). La mezcla se agito durante una noche a 50 °C. Se anadio dietileter hasta la precipitacion; el precipitado se separo con el uso de una centrifuga y se lavo dos veces con dietileter. El producto bruto se purifico utilizando RP-HPLC. La purificacion se efectuo con el uso de un gradiente de agua y acetonitrilo, ambos comprenden acido trifluoroacetico al 0,1%. Las fracciones de HPLC que conteman el producto se concentraron por liofilizacion. Rendimiento: 112 mg (55%).

Complejamiento de Gd³⁺

El peptido estearoil-[K(DOTA)]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida (112 mg, 0,030 mmol) se disolvio en tampon de acetato de sodio 0,4 M (pH 5) y se anadio GdCl3*6 H2O (335 mg, 0,90 mmol). La mezcla se calento durante 1 h en un bano de agua mientras que se agita. La mezcla resultante de productos se purifico con el uso de RP-HPLC. La purificacion se efectuo con el uso de un gradiente de agua y acetonitrilo, ambos comprenden acido trifluoroacetico al 0,1%. Las fracciones de HPLC que conteman el producto (estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida) se concentraron por liofilizacion. Rendimiento: 94 mg (77%).

Ejemplo 2

Imagenes en PET

^{El peptido estearoil-[K(DOTA[} 68 ^{Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida se disolvio en tampon de citrato (pH 8,0) BSA}al 4% y se inyecto via i.v. en la vena de la cola de ratas portadoras de tumores. Las ratas se inyectaron ortopaticamente con 1x106 celulas de carcinoma de colon sintetico (celulas CC531) 10 dfas antes de las mediciones. En el dfa de la medicion, las ratas recibieron el peptido en una concentracion de 400 nmol/kg de peso corporal. Durante los experimentos, las ratas se anestesiaron con isoflurano y se mantuvieron a 37°C. Las imagenes de PET se realizaron con el uso de un PET de Inveon para animales pequenos de Siemens, las imagenes se iniciaron inmediatamente despues de la inyeccion del peptido via i.v. 24h despues de la medicion inicial con el uso de estearoil-[K(DOTA[⁶⁸Ga])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida, las ratas se inyectaron con ¹⁸F-FDG (Fluodeoxiglucosa (¹⁸F) en una concentracion de 5 milicuries como control. La Figura 4A-C muestra una imagen de PET representativa de una rata portadora de tumores. Figura 4A Enriquecimiento espedfico de 400 nmol / kg de estearoil-[K(DOTA[⁶⁸Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida en el Imgado de una rata WAG/Rji cinco minutos despues de la inyeccion por via i.v. Figura 4B Contraste con el uso de ¹⁸F-FDG 24 horas despues de la medicion inicial. 18F-FDG se enriquece en los organos que consumen grandes cantidades de glucosa, en la imagen del corazon (masa gris en la parte superior) y el tumor rico en glucosa (¹⁸F-FDG enriquecido en el cerebro no se muestra por razones tecnicas). Figura 4C Union de ambas imagenes que demuestran la especificidad de los peptidos que tinen solamente el tejido hepatico pero no el tejido tumoral.

Ejemplo 3

Imagenes en resonancia magnetica

El peptido estearoil-[K(DOTA[Gd])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida se disolvio en tampon de citrato (pH 8,0) BSA al 4% y se inyecto via i.v. en la vena de la cola de ratas portadoras de tumores en una concentracion de 600 nmol/kg de peso corporal. Durante los experimentos, las ratas se anestesiaron con isoflurano. Tras la aplicacion del peptido, las ratas se examinaron en MRI con secuencias sensibles al contraste T1 (Siemens ViBE ®). La medicion se realizo en un escaner de resonancia magnetica Siemens Avanto 1.5 T. La Figura 5 muestra una imagen representativa de una tasa saludable antes, as ^como 20 y 30 minutos despues de la inyeccion por via i.v.

Ejemplo 4

Escalada de dosis

Las ratas anestesiadas con isoflurano recibieron cantidades crecientes de estearoil-[K(DOTA[Gd])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida en inyecciones posteriores por via i.v. El intervalo entre las inyecciones posteriores fue de 20 minutos. En el tiempo entre dos inyecciones, se realizaron mediciones continuas de MRI del fngado con secuencias sensibles al contraste T1 (Siemens ViBE®) y se determino el aumento del contraste en el fngado, tejido muscular y corazon. En paralelo, se determinaron los valores de contraste de la dosis clmica relevante de Primovist™. El resultado ^{se muestra en la Figura} 6 ^.

Ejemplo 5

Determinacion de la relajacion de R1/R2 por NMR.

El peptido estearoil-[K(DOTA[Gd])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP ("Peptido X"; 1mM), Primovist™ (1mM), Magnevist™ (1mM) asf como Vasovist™ (ImM) se disolvieron en cantidades equimolares de PBS a temperatura ambiente y las relajaciones R1/r2 se midieron en una NMR Varian de 300MHz. Con el uso de la transformacion de Fourier, los valores de contraste unico se determinaron a partir de los datos resultantes del experimento. Los resultados se muestran en las ^{Figura 7 y Figura} 8 ^.

^Ejemplo 6

Estudios de distribucion de organos

Para examinar la distribucion de organos, el peptido marcado con 111In estearoil-[K(¹¹¹In DOTA)]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP se disolvio en tampon de citrato (pH 8,0) BSA al 4% y se inyecto via i.v. en la vena de la cola de ratones en una concentracion de 400 nmol/kg de peso corporal. Los ratones se sometieron a eutanasia en el intervalo de tiempo dado y se extrajeron la sangre y los organos. La senal radiactiva de cada organo se determino mediante un contador gamma. Los resultados se muestran en la Figura 9.

Ejemplo 7

Estabilidad en el suero

Estearoil-[K(DOTA[⁶⁸Ga]]]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida se incubo a 37°C en suero humano no inactivado de donantes voluntarios sanos durante el penodo indicado. La deteccion de productos de degradacion se realizo mediante la purificacion de los peptidos con el uso de cromatograffa de afinidad por HPLC y la determinacion de radioactividad posterior se realizo en un contador gamma en los intervalos de tiempo indicados. La masa correcta de las fracciones de los picos radiactivos eluidos de la columna se confirmo mediante espectrometna de masas (datos no mostrados). Los resultados se muestran en la Figura 10. Solo se observo desintegracion radioactiva pero no se observo escision.

Las caractensticas descritas en la descripcion anterior, en las reivindicaciones y/o en los dibujos acompanantes pueden ser material, tanto por separado como en cualquiera de sus combinaciones, para realizar la invencion en sus diversas formas.

Referencias

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2. Nassal, M. Virus de la Hepatitis B morphogenesis. Curr Top Microbiol Immunol 214, 297- 337 (1996).

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9. Yamada T, Iwasaki Y, Tada H, Iwabuki H, Chuah MK, VandenDriessche T, Fukuda H, Kondo A, Ueda M, Seno

Claims

Reivindicaciones

1. Peptido hidrofobico modificado de la formula

[X - P - Y - Ro]Ap

en donde

P es un peptido que tiene la secuencia de aminoacidos NPLGFXaaP, en donde Xaa es un aminoacido arbitrario; ^{X es una secuencia de aminoacidos que comprende NX1 SX2X3 , que tiene una longitud de m= 5,} 6 ^{, 7 u} 8 aminoacidos, en donde X ⁱ, X²y X³es un aminoacido arbitrario y

en donde uno o mas de los aminoacidos portan uno o mas grupos para la modificacion hidrofobica seleccionados de la acilacion, preferentemente con acidos carboxflicos, acidos grasos, acidos grasos de C^aa C²², aminoacidos con cadenas laterales lipofflicas, y la adicion de porciones hidrofobicas seleccionadas de colesterol, derivados de colesterol, fosfolfpidos, glicolfpidos, esteres de glicerol, esteroides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, farnesol, grupos alifaticos, compuestos poliaromaticos;

Y es una secuencia de aminoacidos que tiene una longitud de n aminoacidos, en donde n es al menos 1; m n ^> 11 ^;

R es una modificacion C-terminal de dicho peptido hidrofobico modificado, que es preferentemente una porcion que protege de la degradacion seleccionada de amida, D-aminoacido, aminoacido modificado, aminoacido dclico, albumina, polfmero natural y sintetico, tales como PEG, glicano, en donde o es 0 o al menos 1;

A es un grupo de anclaje, preferentemente seleccionado de ester, eter, disulfuro, amida, tiol, tioester, en donde ^{p es} 0 ^{o al menos} 1 ^;

en donde

uno o mas marcadores esta/estan acoplado(s) a uno o mas aminoacidos de X, preferentemente a traves de un enlazador o espaciador, y en donde el marcador se selecciona de un colorante fluorescente, un isotopo emisor de fluorescencia, un radioisotopo y un agente de contraste.

2. Peptido hidrofobico modificado de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde:

^{(a) m es 5,} 6 ^{, 7 u} 8 ^{y/o n es 3 a 78; o}

(b) Xaa es F o L, preferentemente F.

3. Peptido hidrofobico modificado de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el enlazador o espaciador se separa del peptido hidrofobico modificado por una protema hepatica, preferentemente una enzima proteolftica hepatocelular.

4. Peptido hidrofobico modificado de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde el enlazador o espaciador se escinde por enzimas seleccionadas a partir de citocromos, tales como el citocromo P450, proteasas y liasas de la via endodtica, matriz-metaloproteasas MMP1, MMP2, MMP7, MMP9 y MMP12, preferentemente MMP7.

5. Peptido hidrofobico modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde uno o mas marcadores se acopla(n) a uno o mas aminoacido(s) de X que tienen un grupo amino en una cadena lateral, que se selecciona preferentemente a partir de lisina, a-aminoglicina, acido a,Y-diaminobutmco, ornitina, acido a,pdiaminopropionico, en donde preferentemente el(los) aminoacido(s) que tiene(n) un grupo amino en una cadena lateral es/son lisina.

6 ^{. Peptido hidrofobico modificado de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el(los) aminoacido(s) que tiene(n)}un grupo amino en una cadena lateral se localizan en el N-terminal de X, en donde preferentemente 1 a 11 aminoacidos tienen un grupo amino en una cadena lateral se encuentran en el N-terminal de X.

^{7. Peptido hidrofobico modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a} 6 ^{, en donde la modificacion}hidrofobica es mediante acilacion seleccionada de la acilacion con miristoilo (C 14), palmitoilo (C 16) o estearoilo (C 18).

8 ^{. Peptido hidrofobico modificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho peptido comprende}una variante de la sec. con num. de ident.: 2 a 13 y en donde la variante tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la sec. con num. de ident.: 2 a 13.

9. El peptido hidrofobico modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seleccionado del grupo que consiste en

estearoil-[K(DOTA[Gd])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP,

estearoil-[K(DOTA[⁶⁸Ga])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP,

estearoil-[K](DOTA[¹¹¹In])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP,

estearoil-[K-(DOTA[Gd])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida,

estearoil-[K(DOTA[⁶⁸Ga])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida,

estearoil-[K(DOTA[¹¹¹In])]³-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida.

10. Composicion farmaceutica que comprende:

al menos un peptido hidrofobico modificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9; y, opcionalmente, un portador y/o excipiente farmaceuticamente aceptable.

11. Peptido hidrofobico modificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 9 o una composicion farmaceutica de ^{acuerdo con la reivindicacion} 10 ^{para uso en}

(i) el suministro espedfico de un marcador al hngado, y/o

(ii) imagenes medicas seleccionadas del grupo que consiste en rayos X, imagenes por resonancia magnetica (MRI), tomograffa por emision de positrones (PET), tomograffa computarizada por emision de foton unico (SPECT), tomograffa computarizada por rayos X (CT) y combinaciones de estos metodos, en donde el uso es preferentemente en la visualizacion intraoperatoria, y/o

(iii) el diagnostico o monitoreo del tratamiento de una enfermedad o trastorno hepatico.

12. Peptido hidrofobico modificado o composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en donde la enfermedad o trastorno hepatico:

(i) se selecciona de hepatitis, cirrosis, hemocromatosis, preferentemente hepatitis causada por virus de hepatitis A, B, C, D, E, F, G y H o hepatitis concomitante causada por virus,

^{(ii) es una enfermedad que involucra un estadio hepatico de un virus o un patogeno no viral,}

(iii) es una enfermedad tropical, malaria, esquistosomiasis, leishmaniasis,

(iv) es un tumor hepatico, preferentemente carcinoma hepatocelular (HCC),

(v) es metastasis hepatica, preferentemente de carcinoma colorrectal, o

(vi) es una enfermedad metabolica, preferentemente obesidad, smdrome metabolico, esteatohepatitis no alcoholica (NASH).

13. Peptido hidrofobico modificado o composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con cualquiera de las ^{reivindicaciones} 11 ^a 12 ^{, en donde el peptido hidrofobico modificado se aplica al paciente en una dosis que vana de} 10 ^{pmol por kg a} 20 ^{pmol por kg de peso corporal.}

14. Peptido hidrofobico modificado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde la via de administracion se selecciona a partir de la via subcutanea, intravenosa, oral, nasal, intramuscular, transdermica, inhalativa o por supositorio.