BR112013020369B1

BR112013020369B1 - Peptídeos modificados hidrofóbicos para diagnóstico específico do fígado

Info

Publication number: BR112013020369B1
Application number: BR112013020369-2A
Authority: BR
Inventors: Stefan Mehrle; Walter Mier; Stephan Urban; Uwe Haberkorn; Thomas Mueller; Vasileios Askoxylakis
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Desöffentlichen Rechts
Priority date: 2011-02-10
Filing date: 2012-02-10
Publication date: 2021-11-03
Also published as: BR112013020369A2; WO2012107577A1; CN103402546B; TR201901259T4; JP2014510050A; CN103402546A; JP6486003B2; ES2708662T3; JP2017081952A; US20140356284A1; EP2673003B1; US10363323B2; EP2673003A1; BR112013020369A8

Abstract

peptídeos modificados hidrofóbicos para diagnóstico específico do fígado. a presente invenção se refere a peptídeos modificados hidrófobos para o fornecimento específico de marcadores para o fígado, de preferência, a hepatócitos in vitro, bem como in vivo. a presente invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo o referido peptídeo modificado hidrofóbico (s) e marcador (es) a ser entregue especificamente para o fígado. a presente invenção além disso se refere ao uso em diagnóstico dos peptídeos modificados hidrofóbicos inventivos, bem como a um método para o diagnóstico de doenças ou distúrbio do fígado.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a peptideos modificadoshidrofóbicos derivados do dominio preS do virus da hepatite í B (HBV) , os quais são veiculos versáteis para a entrega especifica de um composto de marcação (agentes de diagnóstico, no seguinte "marcador") para o figado, de 10 preferência, a hepatócitos in vitro, bem como in vivo.

Qualquer tipo de marcador pode ser dirigido especificamente para o figado e para ser enriquecido no figado. Este direcionamento ao figado pode ainda ser usado para o diagnóstico de doenças hepáticas alvo ou distúrbios, como a 15 hepatite, a malária, o carcinoma hepatocelular (HCC), assim como infecção por HAV, HBV, HCV e / ou HDV. A presente invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo o referido peptideo modificado hidrofóbico (s) e ao marcador (s) a ser entregue especificamente para o 20 figado. A presente invenção ainda se refere à utilização dos peptideos hidrofóbicos modificados da invenção ou composições farmacêuticas compreendendo o referido peptideo hidrofóbico modificado (s) para o diagnóstico e / ou controle de um tratamento de uma doença ou desordem hepática, e a utilização dos peptideos modificados hidrofóbicos da invenção para a fabricação de um medicamento para o diagnóstico e / ou controle de um tratamento de uma doença ou desordem hepática, e a um método para o diagnóstico de doenças ou desordens hepáticas ou a monitoração de um tratamento de uma doença ou desordem-g hepática.

Antecedentes da Invenção

O figado, um órgão o qual se encontra presente em outros animais vertebrados e, desempenha um papel importante no metabolismo e tem um certo número de funções do organismo, incluindo o armazenamento de glicogênio, a decomposição das células vermelhas do sangue, a sintese de proteinas do plasma, e desintoxicação.

O figado é também a maior glândula do corpo humano. Encontra-se abaixo do diafragma na região torácica do abdômen. Produz bilis, um composto alcalino que auxilia na digestão, por meio da emulsão de lipidos. Também executa e regula uma ampla variedade de grandes volumes de reações bioquímicas que requerem tecidos especializados.

Os hepatócitos constituem 70 a 80% da massa citoplasmática do figado. Os hepatócitos estão envolvidos na sintese de proteinas, proteinas de armazenamento etransformação de carboidratos, a sintese de colesterol, fosfolipidos e sais biliares, e desintoxicação, modificação e excreção de substâncias exógenas e endógenas. Os hepatócitos também iniciam a formação e secreção da bilis.

Há uma grande número de doenças do figado conhecidos, tais como: Hepatite: inflamação do figado, causadaprincipalmente por vários virus, mas também por certos venenos, autoimunidade e condições hereditárias; Cirrose: formação de tecido fibroso no figado, substituindo células hepáticas mortas. A morte das células hepáticas, por exemplo, pode ser causada pelo virus da hepatite virai, alcoolismo ou o contato com outras substâncias tóxicas do figado; - Hemocromatose: uma doença hereditária que causa o acúmulo de ferro no organismo levando a danos no figado; - Câncer do figado: O carcinoma primário hepatocelular (HCC) ou colangiocarcinoma e cânceres metastáticos, geralmente a partir de outras partes do trato gastrointestinal; - Doença de Wilson: uma doença hereditária que faz com que o corpo retenha o cobre; Colangite esclerosante primária: uma doença inflamatória das vias biliares, autoimune na natureza; - Cirrose biliar primária: doença autoimune dos dutos biliares; - Sindrome de Budd-Chiari: obstrução da veia hepática; Sindrome de Gilbert: um distúrbio genético do metabolismo da bilirrubina, encontrado em cerca de 5% da população; - Doença de armazenamento de glicogênio tipo II: o ç acúmulo de glicogênio provoca fraqueza muscular progressiva (miopatia) em todo o corpo e afeta vários tecidos do corpo, particularmente no coração, músculos esqueléticos, figado e 10 sistema nervoso. Há também muitas doenças pediátricas no figado, tais como a atresia biliar, deficiência da alfa-l-antitripsina, sindroma de Alagille, colestase intra-hepática e progressiva familiar, bem como doenças metabólicas.

Além disso, vários agentes patogênicos e parasitas, especialmente, de doenças tropicais, têm uma fase de figado durante o seu ciclo de vida. Por exemplo, a malária é uma , das doenças infecciosas mais comuns e um enorme problema de saúde pública. A malária é causada por protozoários 20 parasitas do gênero Plasmodium. As formas mais graves da doença são causadas por Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax, mas outras espécies relacionadas (Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, e, algumas vezes, Plasmodium knowlesi) também podem infectar seres humanos.

Outro exemplo é o Vírus da Hepatite B (VHB) , a causa para a hepatite B é o protótipo de uma família de pequenos vírus de DNA com invólucro de mamíferos e aves (1) . 0 envelope de HBV engloba três proteínas denominadas L 5 (grande), M-(meio) e S-(pequenas) (ver Fig. 1.). Elas compartilham o C-terminal do domínio S com quatro regiões $ . transmembranares. A proteína L e M realizam extensões adicionais N-terminais de 55 e, genótipo-dependentes, 107 ou 118 aa (pré-S2 e Presl) . Em viriões, a razão 10 estequiométrica de L, M e S é de cerca de 1:1:4, enquanto que as partículas não ' infecciosas mais abundantemente segregadas subvirais (SVPs) contêm quase exclusivamente S- e apenas vestígios de proteína L (2). Durante a síntese, o domínio de PreSl de L é miristoilado e, em algum ponto do 15 ciclo de vida do HBV translocado através da membrana do ER- derivada. Esta modificação é essencial para a infectividade (13,14) . Uma característica do HBV pronunciado é o seu tropismo hepático, isto é, o fígado é o tecido que suporta especificamente o crescimento de HBV.

Infecções crónica por HBV e HCV (Vírus da Hepatite C)também são as principais causas de alterações neoplásicas no fígado. Carcinoma hepatocelular primário (HCC), geralmente se desenvolvem no contexto de doença hepáticacrônica, em particular, da hepatite virai. Diagnóstico de HCC pode ser difícil, geralmente exigindo a utilização de marcadores do soro e modalidades de imagem, bem como a confirmação histológica após biópsia.

HCC resulta em cerca de um milhão de mortes por ano no mundo, a sobrevida média após o diagnóstico é de aproximadamente 6 a 20 meses (11). Uma razão para isso é a , falta de sintomas patogênicos e a grande reserva funcional hepática (12). Como resultado, a maioria dos pacientes diagnosticados com carcinoma hepatocelular não são 10 elegíveis para ressecção cirúrgica, mas exigem outras modalidades de tratamento, como o transplante de fígado, a ablação por radiofrequência, quimioembolização transarterial, crioablação ou radioterapia. Todas estas alternativas são de eficácia limitada, devido ao tamanho 15 tipicamente grande do tumor na altura do diagnóstico. (13)

Como consequência, a FDA (Agência Federal de Medicamentos) recomenda diagnóstico por imagem intensa em pacientes com doença hepática subjacente (isto é, cirrose, hepatite virai), que desenvolve um crescente nível de alfa- 20 fetoproteína no soro (12) . Diagnóstico por imagemgeralmente é realizado por tomografia computadorizada do fígado e / ou ressonância magnética (MRI). No entanto, o diagnóstico inicial, mesmo quando se utilizam os métodos de imagem de alta resolução é muitas vezes difícil, tais como formação de imagem "continuação" é recomendada, na maioria dos pacientes (14). Novos agentes, de contraste específicos para o fígado, tais como o descrito na presente invenção pode ajudar a elevar este problema.

Outra fonte de alterações neoplásicas no fígado é apropagação metastática de tumores primários de outros órgãos, a dispersão mais proeminentemente metastático de carcinoma colorretal (OCR). CRCs são a terceira causa de morte mais comum de câncer relacionada em todo o mundo.

Cerca de 1,25 milhão de pacientes desenvolvem câncer colorretal por ano, mais de 600.000 pacientes morrem por ano. (Fonte: GLOBOCAN 2008 globocan.iarc.fr). Embora a patogênese da CRCs é mais esclarecida até agora e o FDA recomenda o exame médico regular para todos pessoas de 50 15 anos de idade a taxa de incidência apenas ligeiramente diminuiu 1997 - 2008. (15, 16).

Após diagnóstico primário de cerca de 80% de todos os pacientes que fazem presente sem metástase detectáveis, para aqueles pacientes a ressecção cirúrgica é a melhor 20 opção terapêutica. Apesar ressecção mais do que 40% de todos os pacientes diagnosticados com classificação TMN II / III desenvolvem metástases no fígado (17-21). Tem sido demonstrado que a intensa formação de eimagem de alta resolução seguinte a ressecção primária pode aumentar significativamente o tempo de sobrevivência dos pacientes que foram classificados como TMN II / III. O diagnóstico precoce de pequenas metástases no figado pode aumentar o tempo de sobrevida em 5 anos após a hepatectomia parcial de 40% quando comparado com o tratamento convencional. No entanto, devido à estrutura amorfa do diagnóstico de fase inicial do figado muitas vezes não é possivel (22). Os agentes de contraste, tais como o aqui descrito pode ajudar a diagnosticar a metástase do figado em fase precoce, permitindo a intervenção cirúrgica e por isso ajuda a aumentar a sobrevivência livre de doença.

Idealmente, a seleção de fármacos deve preencher os seguintes critérios: 1) a transferência exclusiva do fármaco para o local desejado da ação, 2) com um minimo de efeitos para o restante organismo, 3) a utilização de um vetor farmacologicamente inativo.

A fim de transportar um fármaco, ou seja, um agente ativo terapêutico a um tecido especifico, diferentes estratégias são exercidas. Estes são, por exemplo, a utilização de pró-fármacos, a partir do qual a parte farmacologicamente ativa é liberada no tecido alvo por enzimas especificas dos tecidos. Uma outra possibilidade é a de acoplar fármacos tecido não específicos eficazes ao tecido especifico, mas os sistemas de transporte farmacologicamente inertes como peptideos receptores afins ou partículas coloidais.

Vários transportadores de fármacos têm sido utilizados para melhorar a focalização do figado aos fármacos. Uma simples abordagem baseia-se na fagocitose ativa do sistema reticulo-endotelial no figado por administração de fármacos, em especial suportes, tais como lipossomas e microesferas. Por exemplo, demonstrou-se que, após injeção i.v. (intravenosa), transportadores em partículas incorporando um fármaco são capturados, principalmente, pelo sistema reticuloendotelial do figado resultando em fármaco de alvejamento hepático (5) . Por outro lado, o alvejamento hepático de fármacos com polímeros solúveis em água carregados positivamente baseia-se em extravasamento livres da maior parte das substâncias solúveis em água a partir do sistema vascular do figado, bem como sobre as cargas negativas na superfície das células hepáticas (6). Assim, os polímeros têm sido utilizados como o suporte para permitir aos fármacos alvejar o figado com base em tais características anatômicas e bioquímicas do figado. Alvejamento de fármacos mais especico ao figado tem sido experimentado usando receptores de asialoglicoproteina das células hepáticas. O receptor da asialoglicoproteina (receptor de galactose) está presente nos hepatócitos com alta densidade. Além disso, quando um ligante se liga ao receptor de galactose, o complexo ligante-receptor é internalizado, o que permite a absorção celular de ligantes galactosilasados (7). Além disso, as abordagens de entrega utilizando nanoparticulas tem sido realizadas, por exemplo, polimeros amfilicos e vetores virais (8). Também a entrega de fármacos e do material genético tem sido efetuada através da utilização de bionanocápsulas (BNC). BNC são descritas como "cápsulas de nano-escala consistindo de proteínas produzidas por meio de técnicas biotecnológicas" e podem ser utilizados como sistemas de entrega para a entrega da fármaco especifica do órgão (9).

O documento US 7,001,760 B2 divulga vetores recombinantes derivados do virus da hepatite B (HBV), os quais podem ser utilizados para terapia gênica, tais como a entrega de genes terapêuticos para células do figado e à expressão de genes heterólogos em células hepáticas.

O documento WO 2009/092612, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência na sua totalidade descreve peptideos preS-derivados hidrofóbicos modificados de HBV e a sua utilização em veiculos, como para o fornecimento especifico de compostos para o figado. Neste documento, peptideos preS-derivados hidrofóbicos modificados de HBV, podem ser acoplados com um agente ativo de diagnóstico ou terapêutico, através de um grupo de ancoragem opcional (D), o qual é de preferência "C-terminal" do peptideo preS- derivado hidrofóbico modificado.

A presente invenção fornece peptideos hidrofóbicos modificados conjugados com um ou mais compostos, preferencialmente, sendo fármaco (s), cujos compostos são acoplados com a sequência de aminoácidos N-terminal do peptideo representado pelo simbolo X, tornando possivel a criação de peptideos mais curtos, mantendo especificidade do figado. Surpreendentemente, tornou-se possivel acoplar porções hidrofóbicas aos peptideos sem anular o tropismo hepático. Os compostos de acoplamento como fármacos para o local N-terminal permite uma melhor prestação de compostos ativos, através da membrana celular e também permite direionar fármacos, que atuam sobre a membrana celular, diretamente para o local de ação. Além disso, o acoplamento de um fármaco para a região N-terminal do peptideo contribui para a estabilidade da referida substância ativa. Na Fig. 3, o mecanismo molecular da ligação de um peptideo modificado hidrofóbico para a superfície de um dos hepatócitos está esquematicamente ilustrado.

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção, este objetivo é alcançado, através do fornecimento de um peptide modificado hidrofóbico. Na fig. 2, a construção de um peptideo modificado hidrofóbico da invenção está ilustrado esquematicamente. 0 referido peptideo modificado hidrofóbico tem a fórmula geral: [X - P - Y - RO]AP , em 5 que P é um peptideo possuindo a sequência de aminoácidosNPLGFXaaP (código de uma única letra, em que Xaa é um aminoácido arbitrário, de preferência F ou L, mais preferencialmente F) . X é uma sequência de aminoácidos que tem um comprimento de aminoácidos m, em que um ou mais dos 10 aminoácidos de X transporta um ou mais grupos para a modificação hidrofóbica selecionado a partir de acilação, de preferência, com ácidos carboxilicos, ácidos graxos saturados e insaturados, ácidos graxos C8 e C22, aminoácidos com cadeias laterais lipofilicas e adição de 15 porções hidrofóbicas selecionados a partir de colesterol, derivados de colesterol, fosfolipideos, glicolipideos, ésteres de glicerol, esteróides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, farnesol, grupos alifáticos, compostos poliaromáticos e m é, pelo menos, 4 (m é á 4) .

Em uma concretização preferida, a modificação hidrofóbica é realizada por acilação com porções acil, de preferência, selecionados a partir de miristoil (C 14), palmitoil (C 16) ou estearoil (C 18), mais preferivelmente, por acilação com miristoil (C 14), ou por acilação com estearoil (C 18). Y é uma sequência de aminoácidos possuindo um comprimento de n aminoácidos, (n é 0 ou pelo menos 1) . Na fórmula geral acima m + n é pelo menos 11, isto é, o peptideo modificado hidrofóbico da invenção tem um comprimento de pelo menos 18 aminoácidos (aa) no total. R é uma modificação do C- terminal do referido peptideo modificado hidrofóbico, o qual é, de preferência, um radical que protege da degradação selecionado a partir de amida, D-aminoácido, aminoácido modificado, aminoácido ciclico, albumina, polimeros naturais e sintéticos, tais como PEG, glicano (o é 0 ou pelo menos 1) . A é um grupo de ancoragem, de preferência, selecionado a partir de éster, éter, dissulfeto, amida, tiol, tioéster, p é 0 ou pelo menos 1. Em uma concretização preferida m é de 4 a 19 e / ou n é de 0 a 78. Um ou mais marcador (s) é / são acoplados a um ou mais aminoácido (s) de X. O marcador pode ser composto por uma substância, ou pode compreender duas ou mais substâncias, as quais são ligadas entre si por qualquer tipo de ligação quimica ou fisica, como a ligação covalente, ligação iónica, etc., ou o marcador está na forma de um complexo.

Em uma concretização preferida da invenção, um ou mais marcador (s) é / são ligadas ao referido peptideo através de um ligante ou espaçador, em que o ligante ou espaçador é, de preferência, clivado fora do peptideo modificado por uma proteina hidrofóbica de figado, de preferência, uma enzima hepatocelular proteolitica que pode ser selecionada a partir de citocromos, como o citocromo P450, as proteases 5 e as liases da via endocitica (por exemplo, estrases), ■ matriz-metalo-proteases, MMP1, MMP2 e MMP9 MMP7, MMP12, preferencialmente, MMP7. Neste caso, o ligante ou espaçador Tcompreende, preferencialmente, o peptideo ou sequências GCHAK ou RPLALWRS.

Em uma outra concretização preferida, um ou maismarcador (s) é / são acoplados a um ou aminoácido (s) de X, possuindo um grupo amino em uma cadeia lateral, que é / são, de preferência, selecionados a partir de lisina, α amino glicina, a,Y-ácido diaminobutirico, ornitina, α, β- 15 ácido diaminopropiônico, mais preferencialmente, a lisina.

O aminoácido (s) possuindo um grupo amino em uma cadeia lateral é / são, preferencialmente, localizados na região N-terminal de X, em que de preferência, de 1 a 11, mais preferencialmente, 1 a 3, aminoácidos possuindo um grupo 20 amino em uma cadeia lateral está localizada na extremidadeN-terminal de X.

De acordo com a presente invenção, este objetivo é resolvido, portanto, através do fornecimento de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos umpeptideo modificado hidrofóbico, tal como aqui definido, e pelo menos um marcador a ser entregue especificamente para o figado,■ de preferência, aos hepatócitos, como aqui definido e, opcionalmente, um transportador 5 farmaceuticamente aceitável e / ou um excipiente. Em uma • concretização preferida, o peptideo modificado hidrofóbico e a composição farmacêutica são utilizados na entrega especifica de marcador (s) ao figado, de preferência, para uso no diagnostico ou monitoramento no tratamento de uma 10 doença ou distúrbio hepático, mais preferencialmente, na vizualização intraoperativa.

De acordo com a presente invenção, o objetivo é resolvido, portanto, proporcionando a utilização de um peptideo modificado hidrofóbico ou a composição 15 farmacêutica da invenção e o uso do peptideo modificado hidrofóbico para a fabricação de um medicamento para o diagnostico e/ou monitoramento de um tratamento de doenças ou desordens hepáticas.

De acordo com a presente invenção, o objetivo é 20 resolvido, portanto, pelo fornecimento de um método para o diagnóstico de uma doença ou distúrbio hepático ou para o controle de um tratamento de uma doença ou distúrbio hepático, o qual compreende a administração a um sujeito de uma quantidade diagnosticamente eficaz de um peptideo modificado hidrofóbico ou uma composição farmacêutica da invenção.

Outras concretizações preferidas da presente invenção estão definidas nas reivindicações dependentes.

Descrição das Concretizações Preferidas da Invenção

Antes da presente invenção ser descrita em maioresdetalhe abaixo, é para ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia particular, protocolos e reagentes descritos aqui, uma vez que estes podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui utilizada é para o propósito de descrever apenas concretizações particulares, e não se destina a limitar o escopoo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido ao contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que vulgarmente entendido por um técnico versado no assunto. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas são incorporadas por referência na sua totalidade.

Peptideos Modificados Hidrofóbicos

Como delineado acima, a presente invenção proporciona peptideos modificados hidrofóbicos que são derivados a partir do dominio preS de Virus da Hepatite B (VHB) (também designado "preS-peptideos"). O envelope de HBV engloba trêsproteínas denominadas L (grande), M (meio) e S (pequena) (ver Figura 1). Elas compartilham o C-terminal do domínio S com quatro regiões transmembranares. A proteína L e M realizar extensões adicionais N-terminais de 55 e, 5 genótipo-dependentes, 107 ou 118 aminoácidos (pre-S2 e5 Presl).

Assim, o peptideo, de acordo com a presente invenção se refere a um peptideo com uma sequência de aminoácidos que corresponde a, ou baseia-se nas extensões de N-terminal 10 da proteína L do HBV, PreSl, de preferência, genótipos de A a H, bem como de vírus da hepatite B do macaco barrigudo (WMHB V) , orangotango, gorila e chimpanzé, mas também se refere a suas variantes, de preferência, C-terminais variantes truncadas, variantes de substituição de 15 aminoácidos. Como uma sequência indispensável, os resíduos de aminoácidos sendo importante para o tropismo hepático dos peptideos modificados hidrofóbicos preS derivados de HBV, tal como estabelecido na SEQ ID NO: 1 (NPLGFXP) estão presentes na sequência de aminoácidos do peptideo modificado hidrofóbico da invenção. Em particular, os peptideos modificados hidrofóbicos da invenção baseiam-se nas seguintes sequências de aminoácidos (em código de letra única; domínio essencial sublinhado).

Domínio Essencial do peptideo modificado hidrofóbico (SEQ ID NO: 1): NPLGFXP (em que X é um aminoácido arbitrário, de preferência, F ou L, mais preferencialmente F) preS HBV-A (ID: M57663; SEQ ID N0:2): • MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFGANSNNPDWDFNPIKDHWPQANQVG VGAFGPGFTPPHGGVLGWSPQAQGILATVPAMPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPA preS HBV-B (ID: D00329, SEQ ID NO:3) MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNPHKDNWPDAHKVG VGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTSVPAAPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPA preS HBV-C (ID: AB048704, SEQ ID NO:4) MGGWSSKPRKGMGTNLSVPNPLGFFPDHQLDPAFKANSENPDWDLNPHKDNWPDAHKVG VGAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTSVPAAPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPA preS HBV-Chimpanzee (ID: AB032432, SEQ ID NO:5) MGQNLSTSNPLGFFPEHQLDPAFKANTNNPDWDFNPKKDYWPEANKVGAGAFGPGFTPP HGGLLGWSPQAQGILTTLPANPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRDTHPQA preS HBV-D (ID: AB048702, SEQ ID NO:6) MGQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRANTNNPDWDFNPNKDTWPDANKVGAGAFGLGFTPP HGGLLGWSPQAQGIMQTLPANPPPASTNRQSGRQPTPLSPPLRTTHPQA preS HBV-E (ID: X65657, SEQ ID NO:7) MGLSWTVPLEWGKNISTTNPLGFFPDHQLDPAFRANTRNPDWDHNPNKDHWTEANKVGV GAFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGMLKTLPADPPPASTNRQSGRQPTPITPPLRDTHPQA preS HBV-F (ID: X69798@8, SEQ ID NO:8) MGAPLSTTRRGMGQNLSVPNPLGFFPDHQLDPLFRANSSSPDWDFNTNKDSWPMANKVG VGGYGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGVLTTLPADPPPASTNRRSGRKPTPVSPPLRDTHPA preS HBV-G (ID: AF160501, SEQ ID NO: 9) - MGLSWTVPLEWGKNLSASNPLGFLPDHQLDPAFRANTNNPDWDFNPKKDPWPEANKVGV 5 GAYGPGFTPPHGGLLGWSPQSQGTLTTLPADPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHPQA HBV de Gibbon (ID: AJ131572, SEQ ID NO: 10) MGQNHSVTNPLGFFPDHQLDPLFRANSNNPDWDFNPNKDTWPEATKVGVGAFGPGFTPP e HGGLLGWSPQAQGILTTLPAAPPPASTNRQSGRKATPISPPLRDTHPQA HBV-H (ID: Q8JMY6, SEQ ID NO: 11) MGAPLSTARRGMGQNLSVPNPLGFFPDHQLDPLFRANSSSPDWDFNTNKDNWPMANKVG VGGFGPGFTPPHGGLLGWSPQAQGILTTSPPDPPPASTNRRSGRKPTPVSPPLRDTHPA HBV de Orangutango (ID: AF193864, SEQ ID NO: 12) MGQNLSVSNPLGFFPEHQLDPLFRANTNNPDWDFNPNKDTWPEATKVGVGAFGPGFTPP HGGLLGWSPQAQGVTTILPAVPPPASTNRQSGRQPTPISPPLRDTHPQA HBV de Woolly Monkey (ID: NC_001896, SEQ ID NO: 13) MGLNQSTFNPLGFFPSHQLDPLFKANAGSADWDKNPNKDPWPQAHDTAVGAFGPGLVPP HGGLLGWSSQAQGLSVTVPDTPPPPSTNRDKGRKPTPATPPLRDTHPQA "Variantes" são, preferivelmente, variantes truncadas no terminal-N e / ou C-terminal, variantes de substituições 20 de aminoácidos ou deleção ou variantes prolongada das sequências SEQ ID NOs: 2 - 13, realizando uma modificação hidrofóbica e em que um ou mais fármacos (s) é / são acoplados a um ou mais aminoácido (s) do terminal N do dominio essencial do peptideo modificado hidrofóbico. As variantes compreendem, portanto, uma sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos modificados (s), aminoácido não natural (is) ou peptidomimético (s) ou outros compostos que podem imitar uma cadeia principal / * 5 estrutura do peptideo. De preferência, as variantes são • selecionados a partir de C-terminalmente truncados variantes de SEQ ID. 2 a 13, de substituição ou deleção de < aminoácidos variantes, variantes de aminoácidos compreendendo modificado (s), ácido amino não natural (is) 10 ou peptidomimético (s) ou outros compostos que podem imitar uma espinha dorsal / estrutura do peptideo.

De acordo com a invenção, uma variante de um peptideo modificado hidrofóbico compreende, pelo menos, osaminoácidos com a sequência SEQ ID NO: 1 e pode ser 15 constituído por 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 , 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52 , 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78 , 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 20 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103 , 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118 ou 119 aminoácidos das SEQ ID NOs: 2 a 13 acima ou suas variantes.

Variantes truncadas no terminal-N e / ou C-terminal compreendem, de preferência, pelo menos 18 aminoácidos consecutivos, mais preferencialmente, pelo menos 19 aminoácidos consecutivos, ainda mais preferencialmente, pelo menos 20 e apenas até mais preferivelmente pelo menos 21 aminoácidos consecutivos da SEQ ID Nos. 2 a 13 ou as suas variantes.

A sequência N-terminal (X) do peptideo modificado hidrofóbico com um comprimento de aminoácidos m compreende pelo menos 4 aminoácidos (isto é, m = 4). De preferência, a sequência N-terminal (X) do peptideo modificado hidrofóbico pode consistir de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19 aminoácidos. Isto é, m pode ser de 4 a 19.

Em uma concretização preferida, um ou mais aminoácido (s) de X tem um grupo amino na cadeia lateral, o qual é / são, de preferência, selecionados a partir de lisina, α amino glicina, a,Y~ácido diaminobutirico, ornitina, ot, β- ácido diaminopropiónico, mais preferencialmente, a lisina. O aminoácido (s) de X, possuindo um grupo amino na cadeia lateral, é / são, de preferência, localizados na região N- terminal de X, em que um - onze (1-11), de preferência, um a três (1 - 3), aminoácidos possuindo um grupo amino em uma cadeia lateral está localizado no N-terminal de X.

Em uma concretização preferida, a sequência N-terminal (X) do peptideo modificado hidrofóbico compreende, preferencialmente, a sequência NX1SX2X3 (SEQ ID NO: 16), em que Xi, X2 e X3 podem ser aminoácidos arbitrários. De preferência, Xi da SEQ ID NO: 16 é L, I ou Q, mais ? 5 preferencialmente, L. Preferencialmente, X2 de SEQ ID NO: 16 é T, V, A, ou não está presente, de preferência, T ou V, £ mais preferencialmente, T. Preferencialmente, X3 da SEQ ID NO: 16 é P, S, T ou F, mais preferivelmente, P ou S, ainda mais preferencialmente, S. De preferência, a sequência de 10 NXISX2X3 (SEQ ID NO: 16) está ligada diretamente ao N- terminal do peptideo P (SEQ ID NO: 1; NPLGFXaaP) , resultando num peptideo compreendendo a sequência NXiSX2X3NPLGFXaaP, em que Xi, X2, X3 e Xaa são como definidos acima.

A sequência C-terminal (Y) do peptideo modificadohidrofóbico com um comprimento de n aminoácidos compreende 0 ou pelo menos 1 aminoácido (isto é, n 0). De preferência, a sequência C-terminal (Y) do peptideo modificado hidrofóbico pode consistir de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 20 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92 ou 93 aminoácidos. Ou seja, n pode ser de 0 a 93.

Em uma concretização preferida, a sequência C-terminal (Y) do peptideo modificado hidrofóbico consiste de pelo 5 menos 4 aminoácidos (n = 4), que tem de preferência a . sequência X4HQLDP (SEQ ID NO: 17), em que X4 é um aminoácido arbitrário. De preferência, X4 da SEQ ID NO: 17 é D, E ou S, mais preferencialmente, D ou E, ainda mais preferencialmente, D. De preferência, a sequência X4HQLDP 10 (SEQ ID NO: 17) está ligada diretamente ao C-terminal do peptideo P (SEQ ID NO: 1; NPLGFXaaP), resultando num peptideo compreendendo a sequência NPLGFXaaPX4HQLDP, em que X e Xaa são como definidos acima.

Em uma concretização preferida, o peptideo modificado 15 hidrofóbico da presente invenção, compreende um peptideo codificado pela sequência de aminoácidos NXiSX2X3NPLGFXaaPX4HQLDP (SEQ ID NO: 18), em que Xi, X2, X3, X e Xaa são definidos como acima.

O termo "variante" se refere também às sequências 20 homólogas encontradas em diferentes espécies virais, cepas ou subtipos do gênero hepadnavirus, tal como a cepa alfa de HBV, a cepa LSH de HBV (chimpanzé isolado), woolly monkey de HBV (WMHBV), ou de cepas selecionadas a partir do grupo consistindo dos genótipos A a H de HBV (ver SEQ ID NO: 2 - 13) .

O termo "variante" se refere também a sequências homólogas que mostram pelo menos 50% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos compreendendo 5 dominio invariante NPLGFXaaP e as sequências adjacentes da • SEQ ID 2-13 ou qualquer outra sequência de aminoácidos aqui descrita, de preferência 70%, mais preferivelmente 80%, ainda, mais preferencialmente, 90% ou 95%.

Assim, um peptideo hidrofóbico modificado preferido, 10 de acordo com a invenção compreende um variante da SEQ ID. 2 a 13 com uma sequência de aminoácidos das diferentes espécies virais, cepas ou subtipos, de preferência, dos genótipos de HBV ou HBV do macaco woolly (WMHBV) ou suas variantes. "Variantes" de SEQ ID Nos 2 a 13 também compreendem variantes ou "análogos" compreendendo deleções de aminoácidos, substituições de aminoácidos, tais como substituição conservativa ou não conservative por outros aminoácidos ou por isosteres (aminoácidos modificados que 20 comportam estrutura próxima ou similaridade espacial aos aminoácidos da proteina) adições de aminoácidos ou adições de isóstero, contanto que a sequência ainda mostra tropismos hepático, de preferência, mais do que 10% da dose injetada se acumula no tecido hepático após 1 h após a injeção intravenosa. O tropismo hepático do peptideo hidrofóbico modificado ou sua "variante" é, de preferência, 10% ou mais da dose injetada depois de 1 hora, mais preferivelmente, 25% ou mais da dose injetada depois de 1 h, ainda, mais preferido, 50% ou mais da dose injetada depois de 1 h.

Substituições conservatives de aminoácidos se referem tipicamente a substituições entre aminoácidos na mesma classe. Estas classes incluem, por exemplo, - Aminoácidos possuindo cadeias laterais polares não carregadas, tais como asparagina, glutamina, serina, treonina e tirosina; - aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas, tais como a lisina, arginina e histidina; - aminoácidos possuindo cadeias laterais ácidas, tais como ácido aspártico e ácido glutâmico, e - aminoácidos possuindo cadeias laterais não polares, tais como glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano e cisteina. "N-terminal" se refere ao terminal N de X, ou seja, o respectivo primeiro residue de aminoácido, mas também compreende a modificação hidrofóbica em estreita proximidade com os respectivos residues de aminoácidos N- terminal, tal como (-4), (- 3), (-2), (-1), 1, 2, 3 ou 4.

Assim, o acoplamento do composto (por exemplo, um fármaco), a modificação hidrofóbica pode, também, ser obtido por uma ligação de um fármaco e um grupo hidrofóbico a um local próximo da extremidade N-terminal de X.

A modificação hidrofóbica do referido peptideo hidrofóbico modificado, de acordo com a presente invenção acrescenta um grupo hidrofóbico ao peptideo. X é modificado com pelo menos um grupo ou porção hidrofóbica. Em concretizações preferidas da presente invenção, X é modificado com 1, 2, 3, 4 ou mais porção (ões) ou grupo (s) hidrofóbicos (s) . Isto é, X pode ser modificado com mais de um grupo hidrofóbico ou um grupo, tal como 2. As porções ou grupos hidrofóbicos podem ser iguais ou diferentes uns dos outros. A modificação hidrofóbica do referido peptideo, de acordo com a presente invenção é selecionado a partir de: - acilação; - adição de porções hidrofóbicas.

A acilação é, preferencialmente, selecionada a partir de acilação com ácidos carboxilicos, ácidos graxos, aminoácidos com cadeias laterais lipofilicas. Os ácidos graxos preferidos são os ácidos graxos saturados ou insaturados, ramificados ou não ramificados, ácidos graxos, de preferência, com 8 a 22 átomos de carbono (C8 a C22).

Mais preferencialmente, a modificação hidrofóbica por acilação é selecionada a partir de acilação com miristoil (C14), palmitoil (C16) ou estearoil (C18). Modificação por miristoilação é preferido in vivo e aplicações medicinais 5 devido à sua maior segurança, por exemplo, não exibir os - efeitos adversos do grupo estearoil (resposta imune inata, etc.) A adição de grupos hidrofóbicos é, preferencialmente, I selecionado a p'artir da adição de colesterol, derivados de colesterol, fosfolipideos, glicolipideos, ésteres de glicerol, esteróides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, farnesol, grupos alifáticos, compostos poli aromáticos. A fixação das partes hidrofóbicas é, de preferência, através de ligação covalente, a qual pode ser alcançada através de carbamato, amida, éter, dissulfeto ou 15 qualquer outra ligação que está dentro do conhecimento um técnico versado no assunto. Assim, a modificação hidrofóbica, preferencialmente, os peptideos acilados da presente invenção são, de preferência, devido ao seu N- terminal lipofilico ou porção/grupo hidrofóbico.

A modificação C-terminal (R) de Y é,preferencialmente, uma modificação com uma porção que protege contra a degradação, tal como degradação in vivo. "C-terminal" se refere à modificação no terminal C, ou seja, o respectivo último residue de aminoácido, mas compreende também a modificação, em estreita proximidade com o terminal C, tal como o penúltimo residuo de aminoácido, mas o último dois residues de aminoácidos ou ainda residues de aminoácido (por exemplo, introdução de um D-aminoácido, que protege o transportador de degradação enzimática, por exemplo, pela ação de carboxipeptidases). 0 técnico versado no assunto será capaz de selecionar o respectivo radical (s) adequado, dependendo da respectiva aplicação. Radicais preferidos que protegem contra a degradação são selecionados a partir de amidas, D- aminoácidos, aminoácidos modificados, aminoácidos ciclicos, albumina, polimeros naturais e sintéticos, tais como PEG, glicano. Além disso, o representa 0 ou pelo menos 1, isto é, a modificação do C-terminal (R) é opcional.

De preferência, o representa 1. Em outras concretizações da presente invenção o é 1, 2, 3, 4 ou mais. Isto é, o C- terminal do peptideo modificado hidrofóbico ou a sua proximidade pode ser modificado com mais do que uma porção ou um grupo, tal como 2. As porções ou grupos podem ser iguais ou diferentes uns dos outros.

Em uma concretização desta invenção, a modificação hidrofóbica e / ou R está ligada ao peptideo através de um ligante ou espaçador. O ligante ou espaçador são conhecidos pelos técnicos versados no assunto, tais como polialanina, poliglicina, carboidratos, grupos (CHa)n. O técnico versado no assunto, assim, é capaz de selecionar o respectivo ligante (s) apropriados ou um espaçador (es), dependendo da respectiva aplicação.

O grupo de ancoragem opcional (A) serve como um ponto de fixação adicional para um composto, uma tag, um marcador e está localizado em um aminoácido de Y. Isto é, no caso em que pelo menos um grupo âncora (A) está presente (i.e., p ú 1) Y compreende pelo menos um aminoácido, também (ou seja, n > 1). Em uma concretização preferida, o grupo de ancoragem é "C-terminal" de Y, em que "C-terminal" se refere à modificação no terminal C, ou seja, o respectivo residue de aminoácido anterior, mas inclui também a proximidade do C -terminal, tal como o penúltimo residue de aminoácido, mas o último residue de aminoácidos de dois ou mais residues de aminoácidos. Neste caso, o pode ser 0, e portanto, não há nenhuma outra modificação do terminal C em R. O grupo de ancoragem A pode ser a de uma cadeia lateral de aminoácido de Y ou pode ser a cadeia lateral de aminoácido em Y, por si só, isto é, A pode ser uma própria cadeia lateral da cadeia lateral modificada. O grupo de ancoragem pode também ser um residue de aminoácido modificado e que foi introduzido na sequência de aminoácidos de Y para servir como grupo âncora. Em outras concretizações da invenção, o grupo de ancoragem A está ligado à modificação hidrofóbica de X e / ou a modificação R C-terminal. Grupos de ancoragem preferidos são selecionados a partir de éster, éter, dissulfeto, amida, tiol, tioéster. O técnico versado no assunto será capaz de selecionar o respectivo grupo de ancoragem adequado, dependendo do respectivo composto, tag, marcador, etc. a ser anexado. O grupo de ancoragem pode ainda ser adequado para a fixação de um componente formador de complexo, tais como o complexo biotina / avidina, poliarginina / oligonucleotideo (por exemplo, siRNA). Além disso, o representa 0 ou pelo menos 1, isto é, o grupo de ancoragem (D) é opcional. De preferência, o representa 1. Em outras concretizações da presente invenção o é 1, 2, 3, 4 ou mais. Isto é, existe mais do que um grupo de ancoragem, tal como 2. Os grupos de ancoragem podem ser iguais ou diferentes uns dos outros, permitindo a ligação de diversos compostos, como, por exemplo, um fármaco e um marcador ou fármacos diferentes.

Síntese dos Peptideos Modificados Hidrofóbicos

Os peptideos da invenção podem ser preparados por uma variedade de procedimentos facilmente conhecidos dos técnicos versados no assunto, em geral, por meio de procedimentos quimicos sintéticos e / ou procedimentos de •engenharia genética. Procedimentos quimicos sintéticos incluem sintese, mais particularmente, o sequencial de fase sólida e de bloco (Erickson e Merrifield, 1976). Maiores detalhes podem ser feitos a partir do documento WO 2009/092612.

O procedimento sequencial de fase sólida pode ser realizado utilizando métodos automatizados estabelecidos, tais como pela utilização de um sintetizador de peptideos automatizado. Neste procedimento um [alfa] aminoácido amino-protegido é ligado a um suporte de resina. O suporte de resina utilizado pode ser qualquer resina adequada convencionalmènte empregado no estado da técnica para a preparação em fase sólida de (poli) peptideos, de preferência, poliestireno que tenha sido copolimerizados com polioxietileno para proporcionar locais para formação de éster com o aminoácido protegido no grupo o-amino inicialmente introduzido. Este método otimizado, aplicado pelos inventores foi explicitamente descrito (ver, por exemplo, 12). Os aminoácidos são introduzidos um a um (por etapas. Cada ciclo de sintese correspondendo à introdução de um aminoácido inclui uma etapa de desproteção, os etapa sucessivos de lavagem, uma etapao de acoplamento com ativação do aminoácido, e subsequentes etapas de lavagem. Cada uma destas etapas é seguida por uma filtração. Os agentes reativos para acoplamento são os agentes reativos clássicos de a sintese de (poli)peptideos, tais como diciclohexilcarbodiimida, hidroxibenzotriazol,benzotriazil-l-il-oxitris (dimetilamino) fosfônio, e difenilfosforilazida. Após a sintese do polipeptideo na resina, o polipeptideo é separado da resina por um tratamento com um ácido forte, tal como o ácidotrifluoroacético na presença de anisol, de etanoditiol ou de 2 - metilindol. 0 composto é, então, purificado por 10 técnicas clássicas de purificação, em especial, por meio de HPLC.

Os peptideos da presente invenção também pode ser obtidos por acoplamento de fragmentos (poli)peptidicos seletivamente protegidos, este acoplamento sendo efetuado, 15 por exemplo, em uma solução. Os peptideos podem ainda ser produzidos por técnicas de engenharia genética, como é conhecido pelos técnicos versado no assunto. Um sistema de expressão eucariota, tal como o sistema de baculovirus, é particularmente adequado. De acordo com este procedimento, 20 as proteinas são expressas em células de inseto infectadas com um baculovirus recombinante contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteina heteróloga e regulando as sequências de ácidos nucleicos, tais como um promotor. Várias linhagens de células estão disponíveis para a infecção com baculovirus recombinante, tal como a linhagem de células Sf-9, disponíveis a partir da American Type Culture Collection (CRL 1711). Expressão em sistema de expressão procariótico, tal como E. coli, é também particularmente, adequado.

A introdução do radical hidrofóbico para o peptideo pode ser realizada por uma variedade de processos facilmente conhecidos pelos técnicos versados no assunto, incluindo abordagens de engenharia genética e sintéticas.

Alternativamente, os peptideos e / ou peptideos de fusão (ou seja, os peptideos modificados hidrofóbicos) podem ser produzidos por linhagens de células eucarióticas transfectadas estavelmente, tal como as linhagens celulares CHO e outros que são conhecidos no estado da técnica e normalmente usados para a geração de vacinas e afins. Devido à propriedade intrínseca que os aminoácidos 47-Presl N-terminais promovem a secreção de um peptideo / proteína miristolatada, o peptideo modificado hidrofóbico biologicamente ativo pode ser extraído a partir de sobrenadantes de cultura de células.

Vetores e shuttles para alvejamento hepático

Como delineado acima, o presente invenção proporciona a utilização dos peptideos modificados hidrofóbicos como veiculo de transporte ou para o fornecimento especifico de 34um composto (por exemplo, um fármaco) para o figado, onde o fármaco é acoplado aos peptideos modificados hidrofóbicos como aqui descrito.

Por "veiculo" ou "shuttle", para a entrega de um 5 composto especifico para o figado, de acordo com a presente invenção se refere ao tropismo hepático ou hepatotropismo dos peptideos modificados hidrofóbicos como verificado 9 pelos inventores e aqui descrito, ou seja, a sua capacidade de se acumular seletivamente no figado, preferencialmente, 10 acumular seletivamente na membrana plasmática de hepatócitos como também para introduzir seletivamente aos hepatócitos. A invenção é baseada na descoberta de uma acumulação hepática altamente especifica e na identificação dos determinantes do tropismo hepático de HBV na sequencia 15 preSl de HBV pelos inventores. Assim, a invenção usa o conhecimento sobre os determinantes do tropismo hepático para a concepção de veiculos universais ou shuttles para aljevamento especifica do figado ou da entrega, respectivamente. Os peptideos modificados hidrofóbicos da 20 presente invenção são veiculos versáteis ou especificamente para o transporte para o fornecimento de composto (s) para o figado.

De preferência, a entrega de um composto especificopara o figado é a liberação especifica do composto para hepatócitos. Além disso, o composto pode ser entregue especificamente a hepatócitos in vitro, bem como in vivo. O composto é, de preferência, especificamente para o figado de um animal, de preferência, mamifero ou humano, ou uma ave.

Marcadores a serem entregues

Os marcadores para ser entregue especificamente para o figado, de acordo com esta invenção pode ser qualquer tipo de composto a ser adequado para fins de diagnóstico. De preferência, o marcador compreende um agente quelante que forma um complexo com cátions de metais divalentes ou trivalentes.

Em uma concretização preferida da invenção, o marcador é selecionado a partir de um corante fluorescente, um radioisótopo e um agente de contraste. De acordo com a presente invenção, um agente de contraste é uma substância corante ou outro que ajuda a mostrar áreas anormais no interior do corpo. Radioisótopos / isótopos emissores de fluorescência preferidos são selecionados do grupo consistindo de alfa- isótopos emissores de radiação gama, isótopos emissores de radiação de eletrons Auger,I emissores de isótopos, isótopos emissores de raios X, isótopos emissores de fluorescência, tais 18F, 51Cr, 67Ga, 68Ga, U1ln, "mTc, 140La, 175Yb, 153Sm, 16δHo,88Y, 9OY, 149Pm, 177Lu, 47SC, 142Pr, 159Gd, 212Bi, 72As, 72Se, 97Ru, 109Pd, 105Rh, 101ml5Rh, 119Sb, 128Ba, 123I, 124I, 131I, 197Hg, 211At, 169EU, 203Pb, 212Pb, 64Cu, 67Cu, 188Re, 186Re, 198Au e 199Ag.

Corantes fluorescentes preferidos são selecionados a partir das seguintes classes de corantes: Xanthens (por exemplo, Fluoresceina), Acridinas (por exemplo, acridina amarela), Oxazinas (por exemplo, Oxazine 1) , Cininas (por exemplo, Cy7 / Cy 3), corantes estirilo (por exemplo, Dye- 28), Coumarinas (por exemplo, Alexa Fluor 350), Porfinas B (por exemplo, clorofila) , Complexos de ligação a metal (por exemplo, PtOEPK), proteínas fluorescentes (por exemplo, APC, R-ficoeritrina) , nanocristais (por exemplo, QuantumDot 705), Perilenos (por exemplo, Lumogen vermelho F300) e fitalocianinas (por exemplo, IRDYE™ 700DX), bem como conjugados e combinações destas classes de corantes. Os agentes de contraste preferidos são selecionados a partir de agentes paramagnéticos, por exemplo, Gd, Eu, W, Mn, de preferência, complexado com um agente quelante. Outras opções são complexos de ferro supramagnético (Fe) e partículas, compostos contendo átomos de número atômico elevado, ou seja, iodo por tomografia computadorizada (TC), microbolhas e transportadores, tais como os lipossomas que contêm estes agentes de contraste.

Agente Quelante

O marcador a ser entregue especificamente a hepatócitos pode ser ligado ao peptideo modificado hidrofóbico sob a forma de um complexo com um agente quelante sendo capaz de formar complexos com o respectivo composto. Em uma concretização preferida da invenção, o agente quelante é selecionado de entre o grupo consistindo de 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N', N, N'-tetra-acético (DOTA), ácido enediaminetetracético (EDTA), ácido 1,4,7- triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), trietilenotetramina (TETA), ácido iminodiacético, ácido Dietilenotriamina-N,N,N',N',N-pentacético (DTPA) e ácido 6- hidrazinopiridina-3-carboxilico (HYNIC), enquanto 1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-N, N',N,N'-tetraacético (DOTA) é particularmente preferido.

Acoplamento de um marcador ao peptideo modificado hidrofóbico

O acoplamento do marcador (s) para os respectivos aminoácidos de X pode ser realizado por qualquer método adequado conhecido dos técnicos versados no assunto.

Em uma concretização preferida da presente invenção, o composto (s) é / são acoplados ao respectivo aminoácido de X usando um éster ativado. Em particular, no caso do acoplamento dos compostos (s) aos aminoácidos de X, possuindo um grupo amino em uma cadeia lateral, este método pode ser utilizado. Alternativamente, os seguintes métodos de acoplamento podem ser usados a fim de acoplar um ou mais composto para os respectivos aminoácidos de X, os quais são brevemente resumidos. As condições especificas de reação para a realização de um acoplamento de um composto a um aminoácido com ou sem um agente de ligação pode ser facilmente determinada por um quimico: - Formação de amidas pela reação de uma amina e os ácidos carboxilicos ativados, de preferência, NHS-ésteres ou carbodiimidas, uma carbodiimida é um agente de reticulação completo que facilita a conjugação direta de carboxilas a aminas primárias. Ésteres NHS são grupos reativos formados por carbodiimida-ativação de moléculas contendo grupos carboxilatos. - Ligação dissulfeto utilizando dois tióis ou um tiol, que reage especificamente com piridil dissulfeto; piridil dissulfeto reage com grupos sulfidrila sobre uma ampla faixa de pH (o ideal é pH 4 - 5) para formar pontes de dissulfeto. Durante a reação, ocorre uma troca de dissulfeto entre o grupo-SH da molécula e o grupo 2- piridilditiol. Como consequência, piridina-2-tiona é liberada.

Formação de tioéter utilizando maleimidas ou haloacetils e um componente tiol; Haloacetils reagir com grupos sulfidril a pH fisiológico. A reação do grupo iodoacetila prossegue por substituição nucleofilica de iodo por um átomo de enxofre a partir de um grupo sulfidrila para resultar uma ligação tioéter estável. O grupo maleimida reage especificamente com grupos sulfidrila quando o pH da mistura da reação está entre pH 6,5 e 7,5 e forma uma ligação tioéter estável que não é reversivel.

Formação de amidina usando um imidoéster e uma amina; agentes reticulan.tes imidoéster reagem rapidamente com aminas em pH alcalino, mas tem uma meia-vida curta. À medida que o pH se torna mais alcalino, a meia-vida aumenta a. reatividade com as aminas, por isso, a reticulação é mais eficaz quando realizado a um pH de 10 que a um pH 8. As condições de reação abaixo de pH 10 podem resultar em reações laterais, embora a formação de amidina é favorecida entre pH 8-10 - Hidrazida de ligação usando carbonilas (por exemplo, aldeidos) e hidrazidas; carbonilas (aldeidos e cetonas) reagem com hidrazidas e aminas a pH 5 - 7. Carbonilas prontamente não existem nas proteinas, no entanto, a oxidação suave de glicóis de açúcar utilizando meta- periodato de sódio converte hidroxilas vicinais em aldeidos ou cetonas. A subsequente reação com hidrazidas resulta na formação de uma ponte de hidrazona. - Amina de ligação usando carbonilas e aminas, em condições redutoras; aminação redutiva (também conhecida como alquilação redutiva) é uma forma de aminação que 5 envolve a conversão de um grupo carbonila a uma amina, através de uma imina intermediária. O grupo carbonila é mais geralmente uma cetona ou um aldeido. * - Formação de triazol cobre catalisado usando nitrilas e azidas. 0 Huisgen tipo 1,3 - dipolar entre uma azida e um 10 terminal ou alquino interno é usado para dar 1,2,3-triazóis estáveis. - Formação de isotiouréia utilizando isotiocianatos e aminas, a reação entre os isotiocianatos e aminas, ou seja, os grupos ε-amino de lisina conduz a uma ligação estável de 15 isotiouréia. - Formação de ésteres por reação de um álcool e de ácidos carboxilicos ativados, cloretos ácidos ou de preferência, carbodiimidas; reações de alta temperatura permite a reação direta entre álcoois e ácidos carboxilicos 20 para formar os ésteres estáveis, alternativamente, os ácidos carboxilicos a serem ativados sob condições de catalisadores ácidos ou base.

Formação de éter por reação de um álcool e de nucleófilos. São moléculas polares: o carbono ao qual está ligado ao halogênio é ligeiramente eletropositivo, onde o halogênio é ligeiramente eletronegativo. Isto resulta em um carbono deficiente em elétrons (eletrófilo) o que, inevitavelmente, atrai nucleófilos.

Ligante / espaçador para o composto (por exemplo, um fármaco)

O peptideo modificado hidrofóbico, em especial, os conjugados da presente invenção, são, preferencialmente, utilizados para o enriquecimento de um composto que é transportado para o figado, no figado. De preferência, o composto é clivado do conjugado com o peptideo modificado hidrofóbico por uma proteina hepática, de preferência, uma enzima proteolitica hepatocelular, em particular, in vivo no figado. O composto (por exemplo, fármaco) e o peptideo modificado hidrofóbico formam um conjugado.

De preferência, o conjugado do composto e o peptideo modificado hidrofóbico é formado por ligação covalente ou por formação de complexos. A forma de fixação depende do tipo de composto.

O acoplamento do composto (s) (por exemplo, fármaco (s)) para os respectivos aminoácidos de X pode ser conduzido pela utilização de um espaçador ou ligante. Ligante ou espaçador são conhecidos pelos técnicos versados no assunto, tais como polialanina, poliglicina, carboidratos ou grupos (CH2)n de sequências de aminoácidos. 0 técnico versado no assunto, então, é capaz de selecionar o respectivo ligante (s) ou um espaçador (s) apropriado » 5 (s), dependendo da respectiva aplicação. 0 espaçador ou ligante compreende, de preferência, um local de i *■ reconhecimento para a ativação especifica dos hepatócitos, o que é, preferencialmente, reconhecido por uma proteina especifica do figado ou do tumor. 0 local de reconhecimento 10 é, preferencialmente, um local de clivagem proteolitica. A proteina hepática é, assim, de preferência, uma proteina hepatocelular, mais preferencialmente, uma enzima proteolitica hepatocelular ou uma enzima proteolitica que é super-expressa num tumor, por exemplo, MMP7. Assim, o 15 peptideo modificado hidrofóbico pode ser administrado a um paciente e será transportado através do corpo, tal como nos fluidos do corpo, sem ser clivado. No entanto, logo que o peptideo modificado hidrofóbico atinge o seu destino, no figado ou nos hepatócitos, respectivamente, a proteína 20 hepática, tal como uma enzima proteolitica hepatocelular vai clivar o local de clivagem proteolítico e liberar o composto do seu transporte, isto é, o peptideo modificado hidrofóbico.

As proteínas hepáticas preferidas são os citocromos, como o citocromo P450 ou liases da via endocitica. 0 HepDirect (R) tecnologia (de Metabasis Technologies, Inc.) tal como utilizado no adefovir ou Pradevofir, também é adequado para a presente invenção.

De particular importância para as doenças tumorais,como alterações neoplásicas por metástases de carcinomas, -• 9por exemplo, os carcinomas do cólon, é o intercâmbio entre o tecido maligno e o tecido circundante. Existe uma necessidade para a ativação de células epiteliais saudáveis e ou o recrutamento das células imunes, o qual é um pré- requisito para a formação de uma metástase de um tumor primário. Análise de tecido mostraram que os niveis de expressão de mRNA específicos de tumores de matriz metalo- proteases (MMP1, MMP2, MMP7, MMP9 e MMP12) estão associados a um mau prognóstico de pacientes com tumor (Gentner B. et al, 2009 Res anticâncer janeiro; 29 (1) :67-74). A partir destas proteases, especialmente, MMP7 é de grande interesse, uma vez que é principalmente expressa por células tumorais. Acoplamento de um fármaco para a sequência peptidica descrita por meio de uma sequência ligante contendo um local de ligação especifico para o MMP7 proteolitico (por exemplo, uma sequência peptidica curta ou GCHAK ou RPLALWRS), mas também todas as outros substratos MMP7 (por exemplo, fibronectina, elastina, caseina ou outros) permitiria entregar um fármaco pró inativo para o figado por meio da modificação do peptideo original por meios descritos acima. No figado, os peptideos modificados poderiam ser, então, preferencialmente, clivado em torno 5 direto do tecido do tumor e o fármaco pró inativo seria ativado. Este método de administração de fármaco para o figado alveja carcinoma hepatocelular primário ou metástases no figado superexpressando uma das MMPs listadas acima (por exemplo, metástase de carcinoma do cólon), 10 apresenta uma nova forma de alvejamento de fármacos para células tumorais.

Em uma concretização, o conjugado do composto e o peptideo derivado modificado hidrofóbico é formado por formação de complexos. Os complexos preferidos úteis na 15 presente invenção são a biotina / avidina, poliarginina / oligonuçleótido (por exemplo, siRNA). O especialista na técnica será capaz de determinar os componentes do complexo adequados para conceber o composto e o peptideo modificado hidrofóbico em conformidade.

Diagnóstico de Doenças Hepáticas

Em uma concretização preferida da invenção, os peptideos modificados hidrofóbicos acima, em particular, os seus conjugados com compostos, são fornecidos para a prevenção e / ou tratamento de uma doença ou distúrbio do figado.

Dependendo da doença ou desordem hepática, a qual deve ser prevenida e / ou tratada, o respectivo composto é selecionado e seletivamente, especificamente para o figado. Uma "doença hepática" ou uma "desordem hepática", de acordo com a presente invenção se refere a qualquer doença ou desordem que tem um efeito sobre ou envolve o órgão figado, tecido do figado ou hepatócitos.

Exemplos de doenças do figado são:

Câncer do figado: 0 carcinoma primário hepatocelular (HCC) ou colangiocarcinoma e cânceres metastáticos, geralmente a partir de outras partes do trato gastrointestinal; preferencialmente, carcinoma colorretal; Hepatite: inflamação do figado causada, principalmente, por vários virus, mas também por certos venenos, autoimunidade e condições hereditárias; Cirrose: formação de tecido fibroso no figado, substituindo células hepáticas mortas. A morte das células hepáticas, por exemplo, pode ser causada pelo virus da hepatite virai, alcoolismo ou o contato com outras substâncias tóxicas do figado; - Hemocromatose: uma doença hereditária que causa o acúmulo de ferro no organismo levando a danos no figado; - Doença de Wilson: uma doença hereditária que faz com que o corpo para de reter cobre; Colangite esclerosante primária: uma doença inflamatória das vias biliares, de natureza autoimune; - Cirrose biliar primária: doença autoimune dos dutos 5 biliares; - Sindrome de Budd-Chiari: obstrução da veia hepática; Sindrome de Gilbert: um distúrbio genético doI. metabolismo da bilirrubina, encontrado em cerca de 5% da população; - Doença de armazenamento de glicogênio tipo II: o acúmulo de glicogênio provoca fraqueza muscular progressiva (miopatia) em todo o corpo e afeta vários tecidos do corpo, particularmente, no coração, músculos esqueléticos, figado e sistema nervoso; - Doença hepática pediátrica, como atresia biliar,deficiência de alfa-l-antitripsina, sindrome alagille e colestase progressiva intra-hepática familiar;

Doenças metabólicas.

Além disso, também as doenças hepáticas de animais, 20 tais como animais de estimação ou animais de pecuária, estão incluidos, em doenças particulares, que podem ser transmitidas aos seres humanos, como a toxoplasmose.

A doença ou desordem hepática a ser prevenida e / ou tratada é de preferência selecionado a partir de hepatite, cirrose, hemocromatose, preferencialmente, hepatite causada pelo virus da hepatite A, B, C, D, E, F, G e H. A doença ou desordem hepática a ser prevenida e / ou tratada também pode ser concomitante hepatite provocada por virus, tais 5 como virus da familia Herpesviridae, por exemplo, virus do herpes, virus citomegálico (CMV) , mas também o virus da varicela zoster (VZV), virus Epstein Barr (EBV), virus Coxsackie, virus da febre amarela, o virus da dengue.

A doença ou desordem hepática a ser prevenida e / ou 10 tratada também pode ser uma doença que envolve um estágio hepático de um virus ou de um patógeno não virai, tal como em diversas doenças tropicais. Uma vez que o estágio hepático de alguns patógenos é um estágio precoce, a respectiva infecção pode ser seletiva, especificamente, 15 tratada em um estágio tão precoce. Tais virus são a hepatite do virus A, B, C, D, E, F, G e H, virus da herpes.

Tais patógenos não virais são bactérias, parasitas e / ou vermes. Os parasitas são, por exemplo, protozoários parasitas do género Plasmodium que provocam a malária, tais 2 0 como o Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, e de espécies relacionadas (por exemplo, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium Knowles [iota]). Tais vermes são, por exemplo, platelmintos do gênero Schistosoma que causa a esquistossomose ou bilharziose, como o

Schistosoma mansoni, Schistosoma intercalation, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum e Schistosoma mekongi. Tais parasitas são também, por exemplo, os protozoários Leishmania tripanossoma do género Phlebotomus e Lutzomyia que são responsáveis pela doença leishmaniose. Assim, a malária, esquistossomiase (bilharziose) , e / ou leishmaniose podem ser prevenidas e / ou tratadas por meio da presente invenção. Por conseguinte, certas doenças tropicais podem ser prevenidas e / ou tratadas por meio da desta invenção.

As doenças ou desordens hepáticas a serem prevenidas e / ou tratadas são, de preferência, tumores hepáticos, de preferência, carcinoma hepatocelular (HCC) ou alterações neoplásicas por metástases de tumores sólidos, por exemplo, carcinomas colorretal.

Em uma concretização preferida da invenção, os peptideos modificados hidrófobos acima descritos são utilizados para o diagnóstico precoce e a classificação de lesões neoplásicas primárias do figado, tais como o carcinoma hepatocelular de fase precoce.

Outra concretização preferida da invenção é o uso dos peptideos modificados hidrofóbicos acima descritos para o diagnóstico precoce de lesões metastáticas no figado, tais como metástases de carcinoma colorretal (CRC).

As doenças ou desordens hepáticas a serem prevenidas e / ou tratadas também podem ser uma doença metabólica, tal como diabetes, hiperlipidemia, obesidade e sindrome metabólica, hiperglicemia crônica, sindrome metabólica, esteato-hepatite não alcoólica (NASH) (ver também (9)).

Em uma concretização preferida da invenção, os peptideos modificados hidrofóbicos acima, em particular, os seus conjugados com compostos são fornecidos para a regulação da função hepática (s).

Formação de Imagem Medical

Os peptideos modificados hidrofóbicos da presente invenção podem ser utilizados em imagiologia médica conhecidos dos técnicos versados no assunto. Métodos adequados são imagiologia por raios-X, imagiologia por ressonância magnética (MRI), tomografia por emissão de positrons (PET), tomografia computadorizada de emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada por raio - X (CT) e combinações destes métodos (por exemplo, PET- CT, CT-MRI). As condições especificas para realizar estes métodos de imagiologia médica são conhecidas dos técnicos versados no assunto.

Composições Farmacêuticas

Como delineado acima, a presente invenção fornece uma peptideo modificado hidrofóbico, tal como aqui definido e, pelo menos, um composto a ser entregue especificamente para o figado, tal como aqui definido e, opcionalmente, um transportador farmaceuticamente aceitável e / ou um 5 excipiente.

A composição farmacêutica, de acordo com a presente invenção compreende: pelo menos um peptideo hidrofóbico modificado, tal como aqui definido acima; opcionalmente, um veiculo farmaceuticamente aceitávele / ou um excipiente.

As composições farmacêuticas, de acordo com a presente invenção são muito adequadas para todos os usos e os métodos aqui descritos.

Um "veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável" se refere a qualquer veiculo no qual ou com os quais as composições farmacêuticas ou vacinas, de acordo com a invenção pode ser formulada. Ele inclui uma solução salina, tal como solução salina de tampão fosfato, um tampão citrato, NaCl, ocitl glucosideo e / ou um poloxâmero. Em geral, um diluente ou veiculo é selecionado com base no modo e via de administração e a prática farmacêuticapadrão.

Método de Diagnóstico

Adicionalmente, e tal como referido acima, a presente invenção fornece métodos para o diagnóstico de uma doença ou desordem hepática utilizando o peptideo hidrofóbico 5 modificado (s) acima descrito ou a composição farmacêutica (s) da invenção.

A presente invenção também proporciona um método para o diagnostico de uma doença ou desordem hepática, através da administração a um sujeito de um peptideo derivado 10 hidrofóbico modificado e um marcador ou uma composição farmacêutica como aqui definido. O método para o diagnóstico de uma doença ou desordem hepática, de acordo com a presente invenção compreende a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz (a) de um peptideo modificado hidrofóbico, tal como aqui definido anteriormente e compreendendo pelo menos um marcador, tal como aqui definido acima, ou (b) de uma composição farmacêutica como acima definida.

Via de administração

Preferivelmente, a via de administração dos conjugados ou das composições farmacêuticas da presente invenção, em particular, no método de tratamento, é selecionado a partir de injeção subcutânea, intravenosa, oral, nasal, intramuscular, transdérmica, por inalação, por supositório.

Uma concretização preferida para a administração nasal ou aplicação é um spray nasal.

Em uma outra concretização preferida, o peptideo modificado hidrofóbico da invenção, o qual compreende um composto (por exemplo, um fármaco) é dissolvido no soro do paciente e é aplicado por meio de injeção.

Quantidade Terapeuticamente Eficaz

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um peptideo modificado hidrofóbico ou uma composição farmacêutica da presente invenção se refere à quantidade que é suficiente para diagnosticar a respectiva doença ou desordem hepática. A quantidade terapeuticamente eficaz preferida depende do respectivo composto a ser entregue e o respectivo potencial terapêutico. O técnico versado no assunto será capaz de determinar quantidades terapeuticamente eficazes adequadas. Em uma concretização preferida, a quantidade terapeuticamente eficaz está na faixa de 10 pmol por kg a 20 μmol por kg de peso corporal. Para utilização como um agente terapêutico (isto é, um fármaco é acoplado ao peptideo modificado hidrofóbico) uma quantidade preferida a ser aplicada a um paciente está na faixa de 100 nmol por kg a 2 μmol por kg de peso corporal, peptideo modificado é de preferência aplicada a um paciente em uma quantidade que varia de 300 nmol a 800 nmol por kg de peso corporal, mais preferencialmente de 400 a 600 nmol por kg de peso corporal.

Peptideos Modificados Hidrofóbicos preferidos da Invenção

No que se segue, são determinados peptideos modificados hidrofóbicos preferidos da invenção. Estes peptideos modificados hidrofóbicos são baseados na sequência de aminoácidos KKKNLSTSNPLGFFPDHQLPD (SEQ ID NO 14) ou KKKNLSTSNPLGFFPDHQLDP (SEQ ID NO 15.), em que um ou dois de lisinas (K) N-terminal pode ser deletada ou substituída por um outro aminoácido. Um peptideo hidrofóbico modificado exemplificative tem a seguinte estrutura quimica:

A sequência de aminoácidos do composto com a estrutura quimica exemplificada acima é: estearoil-K(DOTA[Gd])K(DOTA[Gd])K(DOTA[Gd]) NLSTSNPGLGFFPDHQLDP-amida, em que cada um dos três agentes quelantes 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N,N'-tetra- acético (DOTA) complexa um cátio Gd e é ligado a uma das três lisinas terminal N (KKK), enquanto a primeira lisina N-terminal é ainda modificada com um grupo hidrofóbico estearoio. A este respeito deve ser observado que as fórmulas dos peptideos modificados hidrofóbicos da invençãosão simplificados no texto para que o peptideo modificado hidrofóbico acima exemplificado possa também ser designado "estearoil - [K(DOTA [Gd])]3 -NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida". Nos seguintes peptideos modificados hidrofóbicos preferidos da invenção, bem como a sua utilização t 5 especifica para o diagnóstico de doenças ou afecções do figado são dadas: - Estearoil-[K(DOTA[Gd] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP ’ - Estearoil-[K(DOTA[68Ga] )] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP - Estearoil- [K (DOTA [luIn] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP - Estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD - Estearoil-[K(DOTA[68Ga] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD - Estearoil- [K (DOTA [niIn] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD - Estearoil- [K (DOTA [Gd] )]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida - Estearoil-[K(DOTA[68Ga] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida - Estearoil-[K(DOTA[inIn])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida - Estearoil- [K (DOTA [Gd] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida - Estearoil-[K(DOTA[68Ga] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida - Estearoil- [K (DOTA [llxIn] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLPD-amida Tabela 1 - Peptideos modificados hidrofóbicos preferidos

estearoil se refere a estearoilação do N-terminal Os exemplos e desenhos que se seguem ilustram a presente invenção sem, no entanto, limitar a mesma.

Breve Descrição das Figuras

A FIG. 1 mostra uma representação esquemática daparticula de HBV e proteinas L-, M- e S- de HBV. 0 DNA parcialmente de cadeia dupla está covalentemente associado com o complexo da polimerase virai, que consiste da proteina de terminal, (TP), da transcriptase reversa (RT) e da RNaseH. O genoma é encapsulado por uma concha icosaédrica, construída de 120 dimeros de proteina do núcleo. As três proteinas de superfície L, M e S de HBV são incorporadas em uma bicamada lipidica ER-derivada. As proteínas L- e M- contém a porção do S-dominio completo como uma âncora na membrana. A representação esquemática do genoma parcialmente de dupla fita de DNA de HBV; C = proteína do núcleo formando o capsídeo viral; X = proteína 5 X, uma transativador pleiotrópico com função indefinida, p = polimerase virai; combinações destes forma Presl / preS2 a / S a grande ( preSl/preS2/S) proteína de superfície do HBV (proteína G) ao meio (pré-S2 / S), a proteína de superfície de HBV e a pequena proteína de superfície do HBV (S).

A FIG. 2 mostra um diagrama esquemático da fórmula geral do peptideo modificado hidrofóbico da presente invenção e um exemplo de um peptideo hidrofóbico modificado da invenção.

A FIG. 3 mostra uma representação esquemática da 15 ligação de um peptideo hidrofóbico modificado da invenção a superfície de um hepatócito.

A FIG. 4 mostra uma imagem PET de um rato com um tumor. A FIG. 4A mostra o enriquecimento específico de 400 nmol / kg de estearoil-[K(DOTA [68Ga] ) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP- 20 amida do fígado de um rato WAG / RJI cinco minutos após a injeção i.v. A FIG. 4B contrastante com 18F-FDG 24 horas após a mensuração inicial de 18F-FDG é enriquecido em órgãos consumindo quantidades elevadas de glicose, na imagem do coração (massa cinzenta na parte superior) e o tumor enriquece glicose (18F-FDG enriquecido no cérebro, não é mostrado por razões técnicas). A FIG. 4C fundi-se de duas imagens que demonstram a especificidade dos peptideos de coloração única no tecido do figado, mas não no tecido do 5 tumor.

A FIG. 5 mostra uma série de imagens de ressonância magnética representativas do rato antes da injecção de 600 nmol / kg de peso corporal de estearoil-[K [Gd (DOTA)]]3 ~ NLSTSNPLGFFPDHQLDP (Fig. 5A) , bem como 20 (Fig. 5B) e 30 10 minutos (Fig. 5C) pós injeção.

A FIG. 6 mostra o contraste enhacement igualmente determinada por medição de ressonância magnética no figado, músculo e tecido cardiaco.

A FIG. 7 mostra a relaxividade RI do peptideo 15 estearoil-[K (DOTA [Gd])]3 NL-STSNPLGFFPDHQLDP (Peptideo X), Primovist ™, Magnevist™ e Vasovist ™ dissolvido em PBS em quantidades equimolares (ImM).

A FIG. 8: mostra a relaxividade R2 do peptideo estearoil-[K (DOTA [Gd])]3 - TPFTSPLGFFPDHQLDP (Peptideo 20 X) , Primovist ™, Magnevist e Vasovist ™ dissolvido em PBS em quantidades equimolares (IMM).

A FIG. 9 mostra a distribuição de órgãos de i;ilIn marcado em peptideo modificado hidrofóbico em ratos.

A FIG. 10 mostra a estabilidade de estearoil-[K (DOTA[ 68Ga])]3 - TPFTSPLGFFPDHQLDP-amida no soro humano não- inativado.

Exemplos

Nos exemplos seguintes, peptideos hidrofóbicos 5 transportam Gd, 68Ga ou luln como marcadores complexados com DOTA (estearoil-[K (DOTA [Gd])]3 - TPFTSPLGFFPDHQLDP- amida, estearoil-[K (DOTA [68Ga])]3 - TPFTSPLGFFPDHQLDP- amida ou estearoil-[K(DOTA[inIn])]3 - TPFTSPLGFFPDHQLDP- amida) foram utilizados como produtos exemplificativos da 10 presente invenção. Se não for indicado o contrário, os experimentos in vivo, utilizando diferentes métodos de imagiologia médica foram realizados usando ratos WAG/Rij.

Exemplo 1 Síntese do peptideo modificado hidrofóbico

A síntese de peptideos foi realizada utilizando ométodo de Fmoc, tal como descrito em (10) Gripon, P. et al. J. Virol. 79, 1613-1622 (2005).

Síntese de DOTA-DFP

Diisopropilcarbodiimida (5 mmol,. 631 mg, 774 μ'l) foi 20 dissolvida em piridina (15 ml) e gotejada ao longo de 10 min a uma solução de de DOTA (5 mmol, 2,02 g) e diflúor fenol (5 mmol, 650 mg) em água (60 ml), enquanto se agitava. 30 min após a adição, a mistura de reação foi extraída três vezes com diclorometano e a fase aquosa foi evaporada até à secura utilizando um evaporador rotativo. O produto bruto foi dissolvido em uma mistura de água (11 ml) e acetonitrila (3 ml) e foi purificado através de RP-HPLC preparativo. As frações UPLC contendo o produto foram 5 concentradas por liofilização. Rendimento: 1,0633 g (41%).

Acoplamento com o peptideo

O peptideo estearoil-KKKTPFTSPLGFFPDHQLDP-amida (140 mg, 0,055 mmol) foi dissolvido em 5 mL de DMF. DOTA-DFP (129 mg, 0,25 mmol) foi adicionado e, além disso, foram 10 adicionados DIPEA (410μl, 2,5 mmol). A mistura foi agitada durante a noite a 50° C.

Éter dietilico foi adicionado até a precipitação, o precipitado foi separado por meio de uma centrifuga e lavado duas vezes com éter dietilico. O produto bruto foi 15 purificado por meio de RP-HPLC. A purificação foi efetuada utilizando um gradiente de água e acetonitrila, contendo ambos 0,1% de ácido trif luoroacético. As frações de HPLC contendo o produto foram concentradas por liofilização. Rendimento: 112 mg (55%).

Complexação de Gd3 +

O peptideo estearoil-[K(DOTA)]3 - TPFTSPLGFFPDHQLDP- amida (112 mg, 0,030 mmol) foi dissolvido em tampão acetato de sódio 0,4 M (pH 5) e GdCl3 * 6 H20 (335 mg, 0,90 mmol) foi adicionado. A mistura foi aquecida durante 1 hora num banho-maria enquanto se agitava. A mistura de produtos resultante foi purificada usando RP-ffPLC. A purificação foi efetuada utilizando um gradiente de água e acetonitrila, contendo ambos 0,1% de ácido 5 trifluoroacético. As frações contendo o produto FIPLC(estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-TPFTSPLGFFPDHQLDP-amida) foramconcentradas por liofilização. Rendimento: 94 mg (77%).

Exemplo 2 Imagiologia em PET

O peptideo estearoil-K(DOTA[68Ga] ) ] 3-TPFTSPLGFFPDHQLDPamida dissolvida em tampão citrato (pH 8,0) + 4% de BSA e injetado i.v. na veia da cauda de ratos portadores de tumor. Os ratos foram ortopicaliamente injetados com 1 x 106 células de carcinoma de cólon singênicos (CC531 células) 10 dias antes das medições. No dia da medição, os ratos receberam o peptideo em uma concentração de 400 nmol / kg de peso corporal. Durante as experiências, os ratosforam anestesiados com isoflurano e mantidos a 37° C. A imagiologia PET foi realizada, através de um pequeno Inveon PET animais da Siemens, a imagem foi iniciada imediatamente após a injeção i.v. do peptideo 24h após a medição inicial usando estearoil-K (DOTA [68Ga])]3 - TPFTSPLGFFPDHQLDP amida os ratos foram injetados com 18F-FDG (f ludeoxiglucose (18F) , em uma concentração de 5 milicuries como controle. A fig. 4A-C mostra uma imagem de um tumor de rato PET representativa. A fig. 4A mostra enriquecimento especifico de 400 nmol/kg de estearoil [K(DOTA[68Ga] ) ] 3-TPFTSPLGFFPDHQLDP-amida no figado ou um rato WAG / rji cinco 5 minutos após a injecção i.v. A Fig. 4B mostra o contrastante com 18 F-FDG 24 horas após a mensuração inicial de 18F-FDG enriquecido em órgãos em quantidades elevadas de consumo de glicose, na imagem do coração (massa cinzenta na parte superior) e o tumor enriqueça glicose 10 (18F-FDG enriquecido no cérebro não é mostrado por razões técnicas). A Fig. 4G funde de ambas as imagens que demonstram a especificidade dos peptideos de coloração única tecidual do figado, mas não o tecido do tumor.

Exemplo 3 Imagiologia em MRI

O peptideo estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-TPFTSPLGFFPDHQLDP-amida foi dissolvido em tampão citrato (pH 8,0) + 4% de BSA e injetado i.v. na veia da cauda dos ratos, em uma concentração de 600 nmol / kg de peso 20 corporal. Durante os experimentos, os ratos foramanestesiados com isoflurano. Após a aplicação do peptideo, os ratos foram examinados em IRM com sequências de contratses sensiveis TI (Siemens ViBE ®) . A medição foi realizada em um Avanto 1.5 T Máquina de Ressonância Magnética Siemens. A FIG. 5 mostra uma imagem representativa de uma taxa saudável antes, bem como 20 e 30 minutos após a injeção i.v.

Exemplo 4 Escalonamento da dose

Ratos submetidos à anestesia inalatória receberam quantidades crescentes de estearoil-[K (DOTA [D'us])]3 - TPFTSPLGFFPDHQLDP-amida em subsequentes injeções i.v. 0 intervalo entre as injeções subsequentes foi de 20 min. No tempo entre duas injeções, medidas de ressonância magnética continuas do figado com sequências sensiveis ao contraste T1 (Siemens ViBE ®) foram feitas e a valorização do contraste no figado, tecido muscular e cardiaca foi determinado. Em paralelo, os valores de contraste da dose clinica relevante de Primovist™ foi determinada. O resultado é mostrado na FIG. 6.

Exemplo 5 Determinando a relaxividade R1/R2 por RMN

O peptideo estearoil-[K(DOTA[Gd])]3 - TPFTS PLGFFPDHQLDP ("Peptideo X"; IMM), Primovist™ (ImM), Magnevist™ (IMM), bem como Vasovist™ (IMM) foram dissolvidos em PBS em quantidades equimolares, à temperatura ambiente e a relaxitividade R1/R2 foi medida em um Varian 300 MHz NMR. Utilizando a transformação de

Fourier, os valores de contraste individuais foram determinados a partir dos dados obtidos a partir do experimento. Os resultados são mostrados na FIG. 7 e a Fig. 8 .

Exemplo 6 Estudos de distribuição de órgãos

Para examinar a distribuição de órgãos de peptideo estearoil-[K(luIn DOTA) ] 3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP marcado com 11:LIn foi dissolvido em tampão citrato (pH 8,0) + 4% de BSA 10 e injetado i.v. na veia da cauda de ratos em umaconcentração de 400nmol/kg peso corporal. Os ratos foramsacrificados no momento pontoai e sangue e órgãos foramtomados. O sinal radioativo de cada órgão foi determinado utilizando um contador gama. Os resultados são mostrados na 15 Fig. 9.

Exemplo 7 Estabilidade no soro I

Estearoil-[K(DOTA [68Ga] ) ] 3-TPFTSPLGFFPDHQLDP-amida foi incubada a 37° C em soro humano não-inativado a partir de 20 doadores voluntários saudáveis durante o periodo indicado. A detecção de produtos de degradação foi realizada pela purificação dos peptideos usando a cromatografia de afinidade FIPLC e a determinação subsequente da radioatividade foi efetuada num contador gama nos pontos de tempo indicados. A massa correta das fracções do pico radioativo eluidas a partir da coluna foi confirmada por espectrometria de massa (dados não mostrados). Os resultados são mostrados na Fig. 10. Foi observado apenas 5 decaimento radioativo, mas não clivagem.

As características apresentadas na descrição anterior, nas reivindicações e / ou nos desenhos anexos podem, tanto ~ separadamente como em qualquer combinação ser material para realizar a invenção nas suas diversas formas. Referências 1. Seeger, C. & Mason, W.S. Hepatitis B virus biology. Microbiol Mol Biol Rev 64, 51- 68 (2000). 2. Nassal, M. Hepatitis B virus morphogenesis. Curr Top Microbiol Immunol 214, 297- 337 (1996). 3. Gripon, P., Le Seyec, J., Rumin, S. & Guguen-Guillouzo, C. Myristylation of the hepatitis B virus large surface protein is essential for viral infectivity. Virology 213, 292- 299 (1995). 4. Le Seyec, J., Chouteau, P., Cannie, L, Guguen- 20 Guillouzo, C. & Gripon, P. Infection process of the hepatitis B virus depends on the presence of a defined sequence in the pre- SI domain. J Virol 73, 2052-2057(1999). 5. Juliano RL (1988) Factors affecting the clearance kinetics and tissue distribution of liposomes, microspheres, and emulsions. Adv Drug Deliv Rev 2: 31 -54. 6. Hashida M and Takakura Y (1994) Pharmacokinetics in design of polymeric drug delivery systems. J Control 5 Release 31 : 163-171. 7. Lu., X. M., Fischman, A. J., Jyawook, S. L., Hendricks, K. , Tompkins, R.G. and Yarmush, M. L. (1994) Antisense DNA delivery in vivo: liver targeting by receptor- mediated uptake. J. Nucl. Med. 35, 269-275. 8. Kasuya T, Kuroda S. Nanoparticles for human liver specific drug and gene delivery systems: in vitro and in vivo advances. Expert Opin Drug Deliv. 2009 Jan; 6(1) :39-52 . Review. PubMed PMID: 19236207. 9. Yamada T, Iwasaki Y, Tada H, Iwabuki H, Chuah MK, VandenDriessche T, Fukuda H, Kondo A, Ueda M, Seno M, Tanizawa K, Kuroda S. Nanoparticles for the delivery of genes and drugs to human hepatocytes. Nat Biotechnol. 2003 Aug;21(8):885-90. Epub 2003 Jun 29. PubMed PMID: 12833071. Gripon, P., Cannie, I. & Urban, S. Efficient 20 inhibition of hepatitis B virus infection by acylated peptides derived from the large viral surface protein. J Virol 79, 1613-1622 (2005). 11. (1998). "A new prognostic system forhepatocellular carcinoma: a retrospective study of 435 patients: the Cancer of the Liver Italian Program (CLIP) investigators." Hepatology 28(3): 751-755. 12. Bruix, J. and M. Sherman (2005). "Management of hepatocellular carcinoma." Hepatology 42(5): 1208-1236. 13. Llovet, J. M., J. Bustamante, et al. (1999) ."Natural history of untreated nonsurgical hepatocellular i carcinoma: rationale for the design and evaluation of * therapeutic trials." Hepatology 29(1): 62-67. 14. Gogel, B. M., R. M. Goldstein, et al. (2000). "Diagnostic evaluation of hepatocellular carcinoma in a cirrhotic liver." Oncology (Willi ston Park) 14(6 Suppl 3): 15-20. 15. Fearon, E.R. & Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61, 759-767 (1990). 16. Winawer, S.J., et al. Colorectal cancer screening: clinical guidelines and rationale. Gastroenterology 112, 594-642 (1997). 17. Johnson, F.E., et al. How tumor stage affects surgeons' surveillance strategies after colon cancer surgery. Cancer 76, 1325-1329 (1995). 18. Johnson, F.E., et al. Geographic variation in patient surveillance after colon cancer surgery. J Clin Oncol 14, 183-187 (1996). 19. Johnson, F.E., et al. How practice patterns in colon cancer patient follow-up are affected by surgeon age. Surg Oncol 5, 127-131 (1996). 20. Vernava, A.M., 3rd, et al. Current follow-up strategies after resection of colon cancer. Results of a 5 survey of members of the American Society of Colon and Rectal Surgeons. Dis Colon Rectum 37, 573-583 (1994). 21. Virgo, K.S., et al. Surveillance after curative £ colon cancer resection: practice patterns of surgical subspecialists. Ann Surg Oncol 2, 472-482 (1995). 22. Khatri, V.P., Petrelli, N.J. & Belghiti, J.Extending the frontiers of surgical therapy for hepatic colorectal metastases: is there a limit? J Clin Oncol 23,8490-8499 (2005).

Claims

1. Peptídeo modificado hidrofóbico caracterizado pelo fato de ser da formula

em que P é um peptídeo possuindo a sequência de aminoácido NPLGFXaaP, em que Xaa é um aminoácido arbitrário; X é uma sequência de aminoácidos compreendendo NX1SX2X3, que tem um comprimento m = 5, 6, 7 ou 8 de aminoácidos, em que X1, X2 e X3 é um aminoácido arbitrário, em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 dos aminoácidos transportam um grupo para modificação hidrofóbica selecionado a partir de - acilação, e - adição de porções hidrofóbicas selecionados de colesterol, derivados de colesterol, fosfolipídios, glicolipídios, ésteres de glicerol, esteróides, ceramidas, derivados de isopreno, adamantano, farnesol, grupos alifáticos, compostos poliaromáticos; Y é uma sequência de aminoácidos possuindo um comprimento de n aminoácidos, em que n é 6 - 78; m + n > 11 R é uma modificação C-terminal do referido peptídeo modificado hidrofóbico, o qual é uma porção que protege da degradação, em que o representa 0,1, 2, 3, 4, A é um grupo de ancoragem selecionado a partir de éster, éter, dissulfeto, amida, tiol, tioéster, em que p é 0,1, 2, 3, 4, em que 1. 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 marcadores é / são acoplados a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácidos de X e, em que o marcador (s) é/são selecionado(s) a partir de um corante fluorescente, um isótopo emissor de fluorescência, um radioisótopo e um agente de contraste.

2. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o marcador(es) é / são acoplado(s) a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 aminoácido(s) de X por meio de um ligante ou espaçador.

3. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a acilação é selecionada a partir da acilação com ácidos carboxílicos, ácidos graxos, ácidos graxos C8 a C22 e aminoácidos com cadeias laterais lipofílicas.

4. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a porção que protege da degradação é selecionada a partir de amida, D-aminoácido, aminoácido modificado, aminoácido cíclico, albumina, polímero natural e sintético, tal como PEG, glicano.

5. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que Xaa é F ou L.

6. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que Xaa é F.

7. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ligante ou espaçador é clivado fora do peptídeo modificado hidrofóbico por uma proteína do fígado.

8. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o ligante ou espaçador é clivado por uma enzima proteolítica hepatocelular selecionada a partir de citocromos, tal como o citocromo P450, proteases e as liases da via endocítica, matriz-metalo-proteases, MMP1, MMP2, MMP9, MMP7 e MMP12.

9. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a enzima proteolítica hepatocelular é MMP7.

10. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que os marcadores é / são acoplado(s) a aminoácido (s) de X tendo um grupo amino na cadeia lateral, que é / são selecionado(s) a partir de lisina, α -aminoglicina, α,Y— ácido diaminobutírico, ornitina, a,e—ácido diaminopropiônico.

11. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o (s) aminoácido (s) possuindo um grupo amino numa cadeia lateral é / são a lisina.

12. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o (s) aminoácido (s) possuindo um grupo amino numa cadeia lateral está / estão localizados na região N-terminal de X.

13. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que 1 a 11 aminoácidos possuindo um grupo amino numa cadeia lateral está localizado no N-terminal de X.

14. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a modificação hidrofóbica é por acilação selecionado a partir de acilação com miristoíl (C14), palmitoíl (C16) ou estearoil (C18).

15. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o referido peptídeo compreende uma variante da SEQ ID. 2 a 13.

16. Peptídeo modificado hidrofóbico, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que selecionado a partir do grupo que consiste em estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP, estearoil-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP, estearoil-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP, estearoil-[K(DOTA[Gd])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida, estearoil-[K(DOTA[68Ga])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida, estearoil-[K(DOTA[111In])]3-NLSTSNPLGFFPDHQLDP-amida.

17. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um peptídeo hidrófobo modificado conforme definido nas reivindicações 1 a 16, e um veículo farmaceuticamente aceitável e / ou um excipiente.