KR101639216B1 - Ｂ형 간염 바이러스(ＨＢＶ)의 소수성 변형된 ｐｒｅＳ-유래 펩티드 및 이의 ＨＢＶ 및 ＨＤＶ 침입 억제제로서의 용도 - Google Patents

Ｂ형 간염 바이러스(ＨＢＶ)의 소수성 변형된 ｐｒｅＳ-유래 펩티드 및 이의 ＨＢＶ 및 ＨＤＶ 침입 억제제로서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HBV preS 공통 서열로부터 유래되고 바람직하게는 N 말단이 아실화되고 임의적으로 C 말단이 변형되는 B형 간염 바이러스(HBV)의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드에 관한 것이다. 이러한 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 매우 효과적인 HBV 침입 억제제일 뿐만 아니라, HDV 침입 억제제이기 때문에, HBV 및/또는 HDV 감염의 억제, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염의 예방 및 (만성) B형 및/또는 D형 간염의 치료를 위해 적당하다. 또한, 본 발명은 이러한 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드를 포함하는 약학적 조성물 및 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

Ｂ형 간염 바이러스(ＨＢＶ)의 소수성 변형된 ｐｒｅＳ-유래 펩티드 및 이의 ＨＢＶ 및 ＨＤＶ 침입 억제제로서의 용도{HYDROPHOBIC MODIFIED PRES-DERIVED PEPTIDES OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) AND THEIR USE AS HBV AND HDV ENTRY INHIBITORS}
본 발명은 HBV preS 공통 서열(consensus sequence)로부터 유래되고 바람직하게는 N-말단이 아실화되고 임의적으로 C-말단이 변형되는 B형 간염 바이러스(HBV)의 소수성 변형된(hydrophobic modified) preS-유래 펩티드에 관한 것이다. 이러한 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 매우 효과적인 HBV 침입 억제제일 뿐만 아니라, HDV 침입 억제제(entry inhibitor)이기 때문에, HBV 및/또는 HDV 감염의 억제, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염의 예방 및 (만성) B형 및/또는 D형 간염의 치료를 위해 적당하다. 또한, 본 발명은 이러한 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드를 포함하는 약학적 조성물 및 백신 조성물에 관한 것이다.
오늘날, 약 20억 명의 사람들이 HBV의 혈청학적 마커를 지니고 있다. 이들 중 약 4 억명은 HBV로 임상학적으로 감염되어 있다. 질병관리센터(CDC)에 따르면, 만성 HBV 감염자들 중 15-25%는 적절한 처리를 받지 않는 경우 10 년 내에 간세포암(HCC)을 발병하기 쉽다(1). HBV 관련 HCC는 예후가 나쁘기 때문에, HBV는 세계보건기구(WHO)에 의해 가장 중요한 자연발생 인간 발암물질로 분류되어 왔다. 예방 백신의 존재에도 불구하고, 감염자의 수는 세계인구의 증가 및 후진국에서 예방의 한계로 인해 다가올 수십 년 동안 증가할 것이다.
공업국가의 경우, HBV는 비경구 경로를 통해 일차적으로 전염된다. 실제 감염된 면역 적격 개체의 90-95%는 상기 바이러스가 지나감으로써, 평생 면역보호를 얻는다. 이들 중 약 5-10%는 만성 B형 간염을 발병한다(독일의 경우 300,000-500,000명). 이와 다르게, 고풍토성 지역, 특히 중앙아프리카 및 서아시아의 경우, 주된 전염 형태는 엄마로부터 아이에게 전염된다. 불운하게도, 완전한 면역 적격이 아닌 어린이의 감염은 상기 질병의 90-98% 만성 경과를 초래한다. 따라서, B형 간염 관련 HCC는 이러한 많은 국가에서 가장 일반적인 악성 질병이다.
만성 B형 간염(HBV) 감염의 치료를 위한 오늘날 승인된 치료약은 이미 감염된 후 바이러스 게놈의 복제 단계를 처리하거나(라미부딘(Lamivudine), 아데포비르(Adefovir), 엔테카비르(Entecavir)) 면역계의 조절제로서 작용한다(인터페론 알파). 불운하게도, 환자들중 10-25%만이 이러한 요법 시 지속적인 바이러스학적 반응을 보존하여, 뉴클레오티드 내성 변이의 신속한 선택을 가능하게 한다. 따라서, 예방 백신의 이용 가능성에도 불구하고, 지금까지 영향받지 않은 복제 단계, 예를 들어 바이러스 침입(virus entry)을 표적하는 신규한 치료제를 개발하는 것이 가장 중요하다.
바이러스 침입을 특별히 억제하는 것은 급성 및 만성 감염증을 억제하여 궁극적으로 제거하기 위한 매력적인 치료 개념이다. HIV의 경우, 바이러스 침입의 억제는 바이러스막과 세포막의 융합을 방지하는 36 개의 아미노산으로 이루어진 gp41 단백질 유래 펩티드(Fuzeon®)에 의하여 성공적으로 달성되어 왔다(2).
예방 백신 및 역전사효소(RT) 억제제의 이용 가능성에도 불구하고, HBV-감염자들의 수 및 세계적으로 HBV-관련 사망자들의 수(현재 해마다 약 500,000명)는 증가하고 있다. 원발성 간암의 약 2/3는 지속적인 HBV 감염에 원인이 있다(3).
오늘날의 치료법은 하기의 두 가지 방법을 따른다: (i) 인터페론(IFN 알파) 치료법은 HBV에 대한 면역 반응을 조절하고, 직접적인 항바이러스 효과를 나타내어 바이러스의 근절 없이 치료 환자의 약 30%에서 장기 임상 효과를 나타낸다. (ii) 바이러스 역전사효소 억제제를 투여하면, 바이러스 복제가 억제되고, 1 년 치료 후 생화학적 및 조직학적으로 상당히 호전된다. 그러나, 장기 치료는 내성 바이러스 균주의 출현과 관련이 있다(4).
HBV는 포유동물 및 조류의 작은 외피보유 바이러스류의 원형이다(5). 상기 HBV 외피는 L-(큰), M-(중간) 및 S-(작은) 단백질로 명명된 세 개의 단백질을 둘러싼다(도 1A 참조). 이들은 4개의 막관통(transmembrane) 도메인을 갖는 C-말단 S-도메인을 공유한다. M- 및 L-단백질은 55개 아미노산 (preS2) 및 유전형 의존성의 107개 또는 118개 아미노산(preSl)의 추가의 N-말단 연장부를 갖는다(도 1B 참조). 비리온(virion)의 경우, L, M 및 S의 화학양론적 비는 약 1:1:4이지만, 더욱 풍부하게 분비된 비감염성 준바이러스 입자(SVP)는 거의 배타적으로 S- 및 미량의 L-단백질만을 함유한다(6). 합성 동안, L 단백질의 preSl-도메인은 ER을 통해 미리스토일화(myristoylation) 및 전위된다. 이러한 변형은 HBV 감염성에 필수적인 것이다(7, 8).
세포배양계 또는 작은 동물 모델은 최근까지도 이용될 수 없었기 때문에, 초기 HBV 감염의 연구는 제한되어 왔다(9). HBV 감염성 세포주인 HepaRG의 개발은 HBV 침입의 체계적인 연구를 촉진했고 외피 단백질 유래 침입 억제제의 발견을 초래했다(10).
또한, 현재까지도 간세포내로의 침입을 위해 HBV 외피 단백질을 이용하는 위성 비루소이드(satellite virusoid)인 HDV 감염에 대한 효과적인 치료법은 존재하지 않는다(15, 17, 20). 당업계에서는 HDV 감염에 대한 효과적인 치료법을 제공할 필요성이 있다.
따라서, 본 발명은 HBV 감염 및 HBV 관련 질환의 억제, 예방 및/또는 치료를 위한 종래 방법 및 수단을 개선하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 HBV 감염 및 HBV 관련 질환의 효과적인 억제, 예방 및/또는 치료를 가능하게 하는 개선된 방법 및 수단을 제공함에 있다.
또한, 본 발명의 목적은 HDV 감염 및 HDV 관련 질환의 억제, 예방 및/또는 치료를 위한 방법 및 수단을 제공함에 있다.
본 발명에 따라, 상기의 목적은 HBV의 소수성 변형된(hydrophobic modified) preS-유래 펩티드를 제공함으로써 달성된다.
상기 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 하기 일반식을 갖는다:
H m -P- R n
상기 식에서,
P는 상기 preS-유래 펩티드이고 HBV preS 공통 서열(consensus sequence)의 아미노산 서열 또는 이의 변이체(variant)를 포함하고,
H는 상기 preS-유래 펩티드 P의 소수성 변형으로서, 상기 소수성 변형은 P의 N-말단이고 아실화 및 소수성 부분(hydrophobic moiety)의 부가로부터 선택되고,
m은 1 이상이고,
R은 상기 preS-유래 펩티드 P의 임의적인 C-말단 변형이고,
n은 0 또는 1 이상이다.
또한, 본 발명에 따라, 상기 목적은 본 발명에서 정의되는 HBV의 하나 이상의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 및, 임의적으로, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공함으로써 달성된다.
또한, 본 발명에 따라, 상기 목적은 질병의 진단, 예방 및/또는 치료를 위한 본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 및/또는 이를 함유하는 약학적 조성물(들)을 제공함으로써 달성된다.
또한, 본 발명에 따라, 상기 목적은 HBV 및/또는 HDV 감염의 억제, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염의 예방 및/또는 B형 및/또는 D형 간염의 치료를 위한 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)을 제공함으로써 달성된다.
또한, 본 발명에 따라, 상기 목적은 HBV 및/또는 HDV 감염의 억제, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염의 예방 및/또는 (만성) B형 및/또는 D형 간염의 치료용 의약의 제조를 위해 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)을 이용함으로써 달성된다.
또한, 본 발명에 따라, 상기 목적은 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)을 이용하여 HBV 및/또는 HDV 감염을 억제하고, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염을 예방하고 및/또는 (만성) B형 및/또는 D형 간염을 치료하는 방법에 의하여 달성된다.
또한, 본 발명에 따라, 상기 목적은 본 발명에서 정의된 바와 같은 HBV의 하나 이상의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 및, 임의적으로, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 백신 조성물을 제공함으로써 달성된다.
도 1은 HBV 입자 및 HBV L-, M- 및 S-단백질의 개략도이다.
도 1(A)에서, 부분적으로 이중 가닥인 DNA는 말단 단배질(TP), 역전사효소(RT) 및 RNaseH로 이루어진 중합효소 복합체와 공유 결합한다. 게놈은 120 개의 코어 단백질 이합체로 이루어진 정이십면체 쉘(icosahedral shell)에 의해 캡슐화되어 있다. 3 개의 HBV 표면 단백질인 L-, M- 및 S-단백질은 ER-유래 지질 이중막(lipid bilayer)에 삽입되어 있다. 상기 L- 및 M-단백질은 막 고정물(membrane anchor)로서 작용하는 완전 S-도메인을 함유한다.
도 1(B)는 3개의 HBV 표면 단백질인 L, M 및 S 단백질의 도메인 구조를 도시한다. 상기 L-단백질은 N-말단이 미리스토일화된 107개 아미노산 preSl-도메인, 55개 아미노산 preS2-도메인, 및 4 개의 막관통 분절(transmembrane segment; I-IV)을 함유하는 S-도메인을 함유한다.
도 2는 HBVpreSl 공통 서열을 도시한다.
도 2의 상부에서는 preSl, preS2 및 S-도메인을 갖는 HBV L-단백질이 도시되어 있다. 그 N-말단은 미리스토일화되어 있다. 그 아래의 정렬선(alignment)은 공통 서열(consensus) 및 8 개의 HBV 유전자형(A-H) 외에도, 아미노산 잔기 2 내지 50을 포함하는 양털 원숭이의 HBV (WMHBV) preS 서열을 도시하고 있다. 여기서, 유전자형 A, B, C, E, G 및 H는 이의 N-말단에서 11개의 추가의 아미노산을 갖고, 유전자형 F는 10개의 추가의 아미노산 잔기를 갖는다.
도 2의 바닥부에는 공지의 작용성 서브도메인이 도시되어 있다.
여기서, HBV 유전자형 C는 HBV 유전자형 C Q46K를 나타낸다.
도 3은 두 개의 유전자형 C 및 D의 미리스토일화 및 스테아로일화된 HBVpreS-유래 펩티드의 비교 감염 억제 분석 결과를 도시한다.
HepaRG 세포를 HBVpreS/2-48myr(D), HBVpreS/2-48myr(C), HBVpreS/(-l l)-48myr(C), HBVpreS/2-48stearoyl(C) 및 HBVpreS/(-l l)-48stearoyl(C)의 부재((0 nM) 또는 1, 5, 25, 100 및 2000 nM의 존재하에 감염시켰다. 감염 접종물(유전자형 D의 HBV) 및 상기 펩티드를 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 추가의 12일 동안 유지하여 바이러스 유전자를 발현시켰다. 8 내지 12 일에 세포 배양 상청액을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 정량적 ELISA를 이용하여 분비된 HBSAg를 분석했다. 각각의 불완전 감염으로부터의 HBsAg 값을 100%라 하고, 감염 억제의 정도를 불완전 감염의 %로 나타낸다. 여기서, (C) 또는 유전자형 C는 HBV 유전자형 C Q46K를 의미한다.
도 4는 공통 서열을 갖는 미리스토일화 및 스테아로일화된 HBVpreS-유래 펩티드의 감염 억제 분석 결과를 도시한다.
HepaRG 세포를 HBVpreS/2-48myr(컨센서스) 및 HBVpreS/2-48stearoyl(컨센서스)의 부재(0 nM) 또는 0.125, 0.25, 0.5, 0.75 및 1 nM의 존재하에 감염시켰다. 감염 접종물(유전자형 D의 HBV) 및 상기 펩티드를 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 추가의 12 일간 유지하여 바이러스 유전자를 발현시켰다. 8 내지 12일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 정량적 ELISA를 이용하여 분비된 HBSAg를 분석했다. 각각의 불완전 감염으로부터의 HBsAg 값을 100%라 하고, 감염 억제의 정도를 불완전 감염의 %로 나타낸다.
도 5는 유전자형 D의 C-말단이 결실된 스테아로일화된 HBVpreS 유래 펩티드의 비교 감염 억제 분석 결과를 도시한다.
HepaRG 세포를 HBVpreS/2-48stearoyl(D), HBVpreS/2-15stearoyl(D), HBVpreS/2-21stearoyl(D), HBVpreS/2-26stearoyl(D) 및 HBVpreS/2-33stearoyl(D)의 부재((0 nM) 또는 1, 5, 25, 100 및 1000 nM의 존재하에 감염시켰다. 감염 접종물(유전자형 D의 HBV) 및 상기 펩티드를 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 추가의 12 일간 유지하여 바이러스 유전자를 발현시켰다. 8 내지 12일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 정량적 ELISA를 이용하여 분비된 HBSAg를 분석했다. 각각의 불완전 감염으로부터의 HBsAg 값을 100%라 하고, 감염 억제의 정도를 불완전 감염의 %로 나타낸다.
도 6은 유전자형 D의 N-말단 및 C-말단이 결실된 스테아로일화된 HBVpreS 유래 펩티드의 비교 감염 억제 분석 결과를 도시한다.
HepaRG 세포를 HBVpreS/2-48stearoyl(D), HBVpreS/2-33stearoyl(D), HBVpreS/5-33stearoyl(D), HBVpreS/5-48stearoyl(D), HBVpreS/9-33stearoyl(D) 및 HBVpreS/9-48stearoyl(D)의 부재(0 nM) 또는 1, 5, 25, 100 및 1000 nM의 존재하에 접종시켰다. 감염 접종물(유전자형 D의 HBV) 및 상기 펩티드를 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 추가의 12일 동안 유지하여 바이러스 유전자를 발현시켰다. 8 내지 12일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 정량적 ELISA를 이용하여 분비된 HBSAg를 분석했다. 각각의 불완전 감염으로부터의 HBsAg 값을 100%라 하고, 감염 억제의 정도를 불완전 감염의 %로 나타낸다.
도 7은 유전자형 D의 내부가 결실된 스테아로일화된 HBVpreS/2-48의 비교 감염 억제 분석 결과를 도시한다.
HepaRG 세포를 HBVpreS/2-48stearoyl(D), HBVpreS/2-48stearoyl(D-AS11 -15)(D), HBVpreS/2-48stearoyi(Ala11-15)(D), HBVpreS/2-48stearoyl(Δ17-21)(D), HBVpreS/2-48stearoyl(Ala17-21)(D) 및 HBVpreS/2-48stearoyl(Ala2 -9)(D)의 부재 (0 nM) 또는 1, 5, 25, 100 및 1000 nM의 존재하에 감염시켰다. 감염 접종물(유전자형 D의 HBV) 및 상기 펩티드를 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 추가의 12일 동안 유지하여 바이러스 유전자를 발현시켰다. 8 내지 12일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 정량적 ELISA를 이용하여 분비된 HBSAg를 분석했다. 각각의 불완전 감염으로부터의 HBsAg 값을 100%라 하고, 감염 억제의 정도를 불완전 감염의 %로 나타낸다.
도 8은 유전자형 D의 내부가 변이된 스테아로일화된 HBVpreS/2-48 펩티드의 비교 감염 억제 분석 결과를 도시한다. HepaRG 세포를 HBVpreS/2-48stearoyl(레트로인버소)(D) 및 HBVpreS/2-48stearoyl(Ala21 ,23,29,30)(D)의 부재 (0 nM) 또는 1, 5, 25, 100 및 1000 nM의 존재하에 감염시켰다. 감염 접종물(유전자형 D의 HBV) 및 상기 펩티드를 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 추가의 12일 동안 유지하여 바이러스 유전자를 발현시켰다. 8 내지 12일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 정량적 ELISA를 이용하여 분비된 HBSAg를 분석했다. 각각의 불완전 감염으로부터의 HBsAg 값을 100%라 하고, 감염 억제의 정도를 불완전 감염의 %로 나타낸다.
도 9는 유전자형 D의 내부가 변이된 스테아로일화된 HBVpreS/2-48 펩티드의 추가의 비교 감염 억제 분석 결과를 도시한다.
HepaRG 세포를 HBVpreS/2-48stearoyl(Ala18)(D), HBVpreS/2-48stearoyl(Δ1l-15)(D), HBVpreS/2-48stearoyl(Ser13)(D) 및 HBVpreS/2-48stearoyl(Arg11)(D)의 부재(0 nM) 또는 1, 5, 25, 100 및 1000 nM의 존재하에 감염시켰다. 감염 접종물(유전자형 D의 HBV) 및 상기 펩티드를 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 추가의 12일 동안 유지하여 바이러스 유전자를 발현시켰다. 8 내지 12일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 상업적으로 이용가능한 정량적 ELISA를 이용하여 분비된 HBSAg를 분석했다. 각각의 불완전 감염으로부터의 HBsAg 값을 100%라 하고, 감염 억제의 정도를 불완전 감염의 %로 나타낸다.
도 10은 본 발명에서 사용된 유전자형 D의 스테아로일화된 HBVpreS 유래 펩티드를 도시한다.
도 11은 본 발명의 소수성 변형된 preS 펩티드가 생체내 간 지향성(in vivo liver tropism)을 나타낸다는 것을 도시한다.
A: 마우스에서 HBVpreS/2-48 Tyrstearoyl(D)의 생체내 분포(biodistribution).
B: 마우스에서 HBVpreS/5-48 D-Tyrstearoyl(D)의 생체내 분포.
C: 마우스에서 HBVpreS/2-33-D Tyrstearoyl(D)의 생체내 분포.
도 12는 아실화의 효과인 Myrcludex B에 의한 HepaRG 세포에 대한 HBV 감염 억제를 도시한다.
여기서, Myrcludex B는 HBVpreS/2-48(C)를 의미하고, (C)는 HBV 유전자형 C Q46K를 의미한다. 또한, 스테아로일화 및 미리스토일화된 HBVpreS/2-48(C), HBVpreS/2-48myr(C) 및 HBVpreS/2-48stearoyl(C)를 비교하는 경쟁적 분석 결과를 도시하고 있다. 시험 농도는 완전한 경쟁이 없도록 하기 위하여 1 nM 미만이었다. 또한, 7 내지 14 일 p.i.시 HBeAg 측정치를 도시한다. 반응 및 감염 조건은 도 3 내지 9에서 도시한 바와 같다.
아래에서 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 전에, 본 발명의 방법, 프로토콜(protocol) 및 시약은 변화할 수 있기 때문에 본 발명은 특정 방법, 프로토콜(protocol) 및 시약으로 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어는 특정 구현예만을 예시하기 위한 것으로서, 첨부한 특허청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 달리 정의하지 않는 경우, 본 발명에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 발명에서 인용된 모든 참조문헌은 그대로 본 발명에 포함된다.
HBV 의 소수성 변형된( hydrophobic modified ) preS -유래 펩티드
위에서 약술한 바와 같이, 본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)의 소수성 변형된 preS 유래 펩티드를 제공한다.
HBV의 외피(envelope)는 세 개의 명명된 L(큰), M(중간) 및 S(작은) 단백질을 둘러싼다(도 1A 참조). 이들 단배질은 네 개의 막관통 영역을 갖는 C-말단 S-도메인을 공유한다. 상기 M- 및 L-단백질은 55 개 아미노산 및 유전자형에 의존하는 107 개 또는 108 개 아미노산의 추가의 N-말단 연장부(preS2- 및 preSl)를 갖는다(도 1B 참조).
따라서, 본 발명에 따른 표현인 HBV의 "preS-유래" 펩티드는 HBV의 L-단백질의 L-말단 연장부(preS 1), 바람직하게는 종 및 유전자형 A 내지 H의 공통서열 외에도 양털 원숭이(WMHBV), 침팬지 및 고릴라 B형 간염 바이러스의 공통 서열에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 의미하는 외에도, 이의 변이체(variant), 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단이 절단된 변이체인 아미노산 치환 변이체를 의미한다.
SEQ ID NO. 1는 종 및 유전자형 A 내지 H외에도 양털 원숭이(WMHBV)의 HBV preS 공통 아미노산 서열을 나타낸다.
HBV preS 공통 서열(컨센서스) 및 8 개의 HBV 유전자형(A-H)을 나타내는 외에도, 아미노산 2-48을 포함하는 양털 원숭이 HBV (WMHBV) preS 서열을 나타내는 도 2의 정렬선(alignment)을 참조한다. 유전자형 A, B, C, E, F, G 및 H는 이들의 N 말단에서 11 개 이하의 추가의 아미노산을 갖는다는 점에 유의한다.
본 명세서에서 사용된 HBV "유전자형 C"의 아미노산 서열은 예를 들어 Genbank ABV02850.1에서 나타낸 바와 같은 HBV 유전자형 C에 해당 또는 동일한 인공 서열이지만, 하기의 넘버링(numbering)에 따른 위치 46이 Genbank 서열에서와 같이 GIn (Q) 대신에 본 발명의 유전자형 C에서 Lys (K)인 것이 예외인 인공 서열이며, 본 발명의 HBV 유전자형 C 서열은 "HBV 유전자형 C Q46K"로 나타낼 수도 있다. SEQ ID NOs. 4, 12, 21-27 참조.
도 2는 본 명세서의 전체에 걸쳐서 나타내어지는 HBV preS 공통 서열의 아미노산 잔기의 넘버링을 도시한다.
아미노산 잔기 번호 1은 유전자형 D의 메티오닌(Metl)(예전에 아형 ayw로 기재됨, 또한 SEQ ID NO. 5 참조)인 반면에, 아미노산 잔기 번호 (-11)은 유전자형 C의 메티오닌(Met(-ll))(SEQ ID NO. 4)이다. 생체내 Metl 또는 Met(-ll)은 각각, 세포내 메티오닐 아미노펩티다아제에 의해 절단되고, N-미리스토일 트랜스퍼라아제에 의한 미리스토일-CoA 로부터 아미노산 잔기 번호 2 글리신(Gly2) 또는 아미노산 잔기 번호(-10) 글리신(Gly(-lO))으로의 미리스토일 잔기의 차후 운반에 의하여 변형된다. 유전자형 D의 N-말단 아미노산 잔기는 천연 아미노산 글리신(Gly2)이고, 밑에 있는 L의 오픈 리딩 프레임의 코돈으로부터의 각각의 넘버링에 따라 2(또는 예를 들어 유전자형 C의 경우 Gly(-lO))로 번호 매겨진다.
또한, HBV preS 공통 서열은 유전자형 A, B, C, E, F, G 및 H의 추가의 N-말단 아미노산(위치 "-"에서 나타냄)을 포함한다. 따라서, 전체적으로 상기 HBV preS 공통 서열은 위치 (-11) 내지 48을 포함한다.
따라서, 전술한 넘버링과 SEQ ID NO. 1의 아미노산의 실제 목록 사이에는 차이가 있는데, 예를 들어,
잔기 번호 (-11)인 Met (-11)는 SEQ ID NO. 1에서 아미노산 잔기 1로 기입되어 있고,
잔기 번호 (-10)인 Gly (-10)은 SEQ ID NO. 1에서 아미노산 잔기 2로 기입되어 있고,
잔기 번호 1인 Met 1은 SEQ ID NO. 1에서 아미노산 잔기 12로 기입되어 있고,
잔기 번호 2인 GIy 2는 SEQ ID NO. 1에서 아미노산 잔기 13으로 기입되어 있고,
잔기 번호 48인 Gly 48은 SEQ ID NO. 1에서 아미노산 잔기 58로 기입되어 있다.
SEQ ID NO: 1 HBV preS 공통 서열(위치 (-11) 내지 48)
(-11)-M GGWSS TPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFRA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
SEQ ID NO: 2 HBV 유전자형 A
(-11)-M GGWSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PVKDD WPAAN QVG-48
SEQ ID NO: 3 HBV 유전자형 B
(-11)-M GGWSS KPRKG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFKA NSENP DWDLN PHKDN WPDAN KVG-48
SEQ ID NO: 4 위치 46이 GIn (Q); Q46K 대신에 Lys (K)라는 것을 제외하고 HBV 유전자형 C에 해당하는 인공 아미노산 서열
(-11)-M GGWSS KPRQG MGTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
SEQ ID NO: 5 HBV 유전자형 D
l-MGQNL STSNP LGFFP DHQLD PAFRA NTANP DWDFN PNKDT WPDAN KVG-48
SEQ ID NO: 6 HBV 유전자형 E
(-1O)-MGLSW TVPLE WGKNI STTNP LGFFP DHQLD PAFRA NTRNP DWDHN PNKDH WTEAN KVG-48
SEQ ID NO: 7 HBV 유전자형 F
(-11)-M GAPLS TTRRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP DWDFN TNKDS WPMAN KVG-48
SEQ ID NO: 8 HBV 유전자형 G
(-1O)-MGLSW TVPLE WGKNL SASNP LGFLP DHQLD PAFRA NTNNP DWDFN PKKDP WPEAN KVG-48
SEQ ID NO: 9 HBV 유전자형 H
(-11)-M GAPLS TARRG MGQNL SVPNP LGFFP DHQLD PLFRA NSSSP DWDFN TNKDN WPMAN KVG-48
SEQ ID NO:10 WMHBV
l-MGLNQ STFNP LGFFP SHQLD PLFKA NAGSA DWDKN PNKDP WPQAH DTA-48
For SEQ ID NOs. 2 내지 10의 경우, 하기의 Genbank Accession number를 또한 참조한다:
HBV 유전자형 A Genbank AAT28684.1
HBV 유전자형 B Genbank AAU01950.1
HBV 유전자형 C Genbank ABV02850.1 (여기서 위치 46은 ABV02850.1의 GIn (Q) 대신에 SEQ ID NO. 4에서와 같이 Lys (K)임)
HBV 유전자형 D Genbank AARl 9337.1
HBV 유전자형 E Genbank ABS31101.1
HBV 유전자형 F Genbank ABKl 9774.1
HBV 유전자형 G Genbank AAF34735.1/AF160501_3
HBV 유전자형 H Genbank AAM09052.1
WMHBV Genbank AAC16905.1
본 발명에 따른 HBV의 소수성 변형된 preS 유래 펩티드는 하기 일반식을 갖는다:
H m -P- R n
상기 식에서,
P는 상기 preS 유래 팹티드이고,
H 는 상기 P의 소수성 변형이고,
R은 P의 C-말단 변형이고,
m은 1 이상이고,
n은 0 또는 1 이상이다.
본 발명에 따른 HBV의 preS-유래 펩티드인 P는 하기의 것을 포함한다:
- SEQ ID NO. 1에서 나타낸 바와 같이 HBV preS 공통 서열의 아미노산 서열, 또는
- 이의 변이체.
"변이체"(variant)"는 N-말단 및/또는 C-말단이 절단된 변이체, 아미노산 치환 또는 결실 변이체, 또는 연장된 변이체인 것이 바람직하다. 또한 변이체는 변형 아미노산(들), 비천연 아미노산(들) 또는 펩티드 유사체(들)를 포함하거나 또는 펩티드 골격/구조를 의태할 수 있는 화합물들을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 변이체는 SEQ ID NO. 1의 N-말단 및/또는 C-말단이 절단된 변이체; 아미노산 치환 또는 결실 변이체; 변형 아미노산(들), 비천연 아미노산(들) 또는 펩티드유사체(들)을 포함하거나 펩티드 골격/구조를 의태할 수 있는 변이체로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명에 따라, 소수성 변형된 preS 유래 펩티드의 변이체는 SEQ ID NO. 1의 최소한 10 개 또는 20 개의 연속적인 아미노산들을 함유하고, SEQ ID NO. 1 또는 이의 변이체의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 또는 48 개 이상의 아미노산들로 이루어질 수 있다.
N-말단 및/또는 C-말단이 절단된 변이체는 바람직하게는 SEQ ID NO. 1의 48 개 이상의 연속적인 아미노산 (바람직하게는 잔기 2 내지 48), 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO. 1의 17개 이상의 연속적인 아미노산(바람직하게는 잔기 5 내지 21) 또는 SEQ ID NO. 1의 20 개 이상의 연속적인 아미노산(바람직하게는 잔기 2 내지 21)을 포함한다.
또한, 용어 "변이체"는 HBV 균주 알파 1, HBV 균주 LSH (침팬지 분리물), 양털 원숭이 HBV (WMHBV), 또는 HBV 유전자형 A 내지 H로 이루어진 군에서 선택된 균주, 또는 본 발명에서 정의된 바와 같이 HBV 유전자형 C 인 Q46K (예, SEQ ID NO. 4)에서 확인되는 상동 서열(homologous sequence)을 나타낸다.
또한, 용어 "변이체"는 SEQ ID NO. 1 또는 본 발명에서 개시한 어떠한 다른 아미노산 서열과 최소한 50%, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 80%, 더 더욱 바람직하게는 90% 또는 95%의 서열 동일성을 나타내는 상동 서열을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 바람직한 소수성 변형된 preS 유래 펩티드에서, P는 상이한 바이러스 종, 균주 또는 아형(subtype), 바람직하게는 HBV 또는 양털 원숭이 HBV (WMHBV) 또는 이의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 SEQ ID NO. 1의 변이체를 포함한다.
바람직하게, P는 SEQ ID NO. 2 내지 10 또는 이의 변이체로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다(도 2 참조).
본 발명에 따른 소수성 변형된 preS 유래 펩티드의 바람직한 구현예에서, P는 SEQ ID NO. 1에서 나타낸 바와 같은 HBV preS 공통 서열의
아미노산 잔기 2 내지 21,
아미노산 잔기 5 내지 21,
아미노산 잔기 5 내지 15, 또는
아미노산 잔기 9 내지 15 (SEQ ID NO. 15 참조)로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 SEQ ID NO. 1의 변이체를 포함한다.
더욱 바람직하게, P는 잔기 17 내지 21을 결실시키는 것과 같이, SEQ ID NO. 1의 잔기 9 내지 22에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하지 않는다.
더욱 바람직하게, P는 SEQ ID NO. 1의 잔기 9 내지 15에서 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하지 않는다.
더욱 바람직하게, 서열 모티프 NPLGFFP [SEQ ID NO. 15] (SEQ ID NO. 1의 잔기 9 내지 15에 해당)는, 예를 들어 SEQ ID NO. 1의 잔기 11 내지 15를 D-아미노산으로 치환하는 것에 의하여 변형 또는 차단되지 않는다.
더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 소수성 변형된 preS-유래 펩티드에 있어서, P는 공통서열의
아미노산 잔기 2 내지 48 [SEQ ID NO. 11];
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 48 [SEQ ID NO. 12];
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 21 [SEQ ID NO. 13];
유전자형 C의 아미노산 잔기 5 내지 21 [SEQ ID NO. 14];
유전자형 C의 아미노산 잔기 9 내지 15 [SEQ ID NO. 15];
유전자형 D의 아미노산 잔기 2 내지 48 [SEQ ID NO. 16];
유전자형 D의 아미노산 잔기 5 내지 48 [SEQ ID NO. 17];
유전자형 D의 아미노산 잔기 2 내지 33 [SEQ ID NO. 18];
유전자형 D의 아미노산 잔기 5 내지 33 [SEQ ID NO. 19];
유전자형 D의 아미노산 잔기 2 내지 21 [SEQ ID NO. 20]; 및
유전자형 D의 아미노산 잔기 9 내지 15 [SEQ ID NO. 15]로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 SEQ ID NO. 1의 변이체를 포함한다.
따라서, P는 SEQ ID NO. 11 내지 20 또는 이의 변이체로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
P의 바람직한 아미노산 서열에 대하여는 하기의 표 1 내지 7, 도면 및 실시예를 참조한다.
또한, SEQ ID NO. 1의 변이체는 그 서열이 10 μM 미만, 바람직하게는 1 μM 미만의 펩티드 농도에 의해 HBV 감염의 70% 억제를 유도하는 한, 아미노산 결실, 다른 아미노산 또는 이소스테르(isostere)(단백질 아미노산과 밀접한 구조적 및 공간적 유사성을 갖는 변형된 아미노산)에 의한 보존적 또는 비보존적 치환과 같은 아미노산 치환, 아미노산 부가 또는 이소스테르 부가를 포함하는 변이체 또는 "유사체"를 포함한다.
대표적으로 아미노산 치환은 동일 부류의 아미노산의 치환에 관한 것이다. 이러한 부류의 예로는 하기의 것들이 있다:
- 아스파리긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신과 같은 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산;
- 리신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄를 갖는 아미노산;
- 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄를 갖는 아미노산; 및
- 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 및 시스테인과 같은 비극성 측쇄를 갖는 아미노산.
바람직하게, 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 증가된 면역원성을 가지도록 변형될 수 있다. 이러한 증가된 면역원성은 예를 들어, 면역화 후에 유도된 항체의 범위를 증가시키는 것, 또는 여러 가지 바이러스 균주에 의한 감염을 증가시킬 수 있는 항체의 생성을 가능하게 하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 이들의 면역원성을 감소시키도록 변형될 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 부작용을 회피 또는 제한하면서 생체내 HBV 감염을 억제하기 위한 치료 용도로 특히 유용하다.
따라서, 치환 및/또는 결실에 의해 변형될 바람직한 서열 모티프는 B-세포 에피토프 및/또는 T-세포 에피토프와 같은, 면역원성에 기여하는 서열 외에도, 항체 항원 모티프이다.
HBV의 B-세포 에피토프는 SEQ ID NO. 1의 아미노산 잔기 20 내지 23인 모티프 DPAF, 공통 서열(SEQ ID NO. 1) 및 유전자형 C의 아미노산 잔기 26 내지 32인 모티프 NSNNPDW(SEQ ID NO. 4), 또는 유전자형 D의 NTANPDW(SEQ ID NO. 5)인 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, SEQ ID NO. 1의 아미노산 잔기 20 내지 23은 바람직하게는 아미노산 치환에 의해 변형되고, 및/또는 아미노산 잔기 26 내지 32는 바람직하게는 아미노산 치환 및/또는 결실에 의해 변형된다.
바람직하게, SEQ ID NO. 1의 아미노산 잔기 20 내지 23(모티프 DPAF)은 알라닌 아미노산 치환에 의해 바람직하게는 모티프 APAF로 변형된다.
바람직하게, SEQ ID NO. 1의 아미노산 잔기 26 내지 32는 알라닌 아미노산 치환에 의해 바람직하게는 모티프 NANAPDW 또는 NAAAPDW로 변형된다.
바람직한 구현예에서, P는 SEQ ID NO. 21 내지 28 또는 이의 변이체로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
하기의 표 2 및 7, 각각의 도면 및 실시예를 참조한다.
더욱 바람직한 구현예에서, P는
SEQ ID NO. 11 (공통 서열의 잔기 2 내지 48 ),
SEQ ID NO. 12 (유전자형 C의 잔기 2 내지 48),
SEQ ID NO. 13 (유전자형 C의 잔기 2 내지 21),
SEQ ID NO. 4 (유전자형 C의 잔기 (- 11 ) 내지 48), 및
SEQ ID NO. 20 (유전자형 D의 잔기 2 내지 21 )로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
preS-유래 펩티드 P의 소수성 변형 (H)는 P의 N-말단이다.
"N-말단"은 N-말단에서 소수성 변형, 즉, 각각의 제 1 아미노산 잔기(예를 들어, Gly 2)를 나타낼 뿐만 아니라, N-말단에 아주 근접하여 소수성 변형, 즉 개개의 아미노산 잔기 (-4), (-3), (-2), (-1), 1, 2, 3 또는 4를 포함한다. 따라서, 상기 소수성 변형은 P의 N 말단에 근접한 부위에 소수성 부분을 부착하여 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 HBV의 preS-유래 펩티드의 소수성 변형은 상기 펩티드에 소수성 부분을 부가한다.
또한, m은 1 이상이다. 즉, 변형은 하나 이상의 소수성 부분 또는 기에 의해 이루어진다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, m은 1, 2, 3, 또는 4 이상이다. 즉, P는 2와 같은 하나 이상의 소수성 부분 또는 기(group)에 의해 변형될 수 있다. 상기 소수성 부분들 또는 기들은 서로 동일 또는 상이할 수 있다.
본 발명에 따른 preS-유래 펩티드의 소수성 변형은 아실화 및 소수성 부분의 부가로부터 선택된다.
아실화는 친유성 측쇄를 갖는 아미노산, 지방산, 카르복시산에 의한 아실화로부터 선택되는 것이 바람직하다.
바람직한 지방산은 탄소수가 8 내지 22(C8 내지 C22)인 포화 또는 불포화 지방산, 직쇄 또는 측쇄 지방산이다.
더욱 바람직하게, 아실화에 의한 소수성 변형은 미리스토일(C14), 팔미토일 (C16) 또는 스테아로일(C18)에 의한 아실화로부터 선택된다.
소수성 부분의 부가는 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 인지질, 당지질, 글리세롤 에스테르, 스테로이드, 세라미드, 이소프렌 유도체, 아다만탄, 파네졸(farnesol), 지방족 기, 폴리방향족 화합물의 부가로부터 선택되는 것이 바람직하다.
상기 소수성 부분의 부착은 카바메이트, 아미드, 에테르, 디설파이드 또는 당업자의 기술의 범위 내에 있는 어떤 다른 결합을 통해 달성될 수 있는 공유 결합에 위한 부착인 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 소수성 변형된, 바람직하게는 아실화된 preS-유래 펩티드는 이들의 N-말단의 친유성 또는 소수성 기/또는 부분에 의한 리포펩티드(lipopeptide)인 것이 바람직하다.
바람직한 소수성 변형된 preS-유래 펩티드에 대하여는 표 1 및 2를 참조한다.
본 발명의 더욱 바람직한 소수성 변형 preS-유래 펩티드는 하기의 것들이다:
- P는 SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 4, 및 SEQ ID NO. 20로 부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
- H는 미리스토일(C14) 또는 스테아로일(C18), 바람직하게는 스테아로일(C18)에 의한 아실화에 따른 소수성 변형이다.
따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 하기의 것들이다:
Figure 112010048020098-pct00001
여기서 (C)는 HBV 유전자형 C Q46K를 나타낸다.
유전자형 C 서열의 바람직한 구현예
본 발명의 매우 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 P는 유전자형 C로부터 유래한 아미노산 서열을 포함한다.
유전자형 C로부터 유래한 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 상응하는 유전자형 D의 것들보다 더욱 강력하게 HBV 감염을 억제한다. 도 3 및 표 3 참조.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 사용된 HBV "유전자형 C"의 아미노산 서열은 예를 들어 Genbank ABV02850.1에서 나타낸 바와 같이 HBV 유전자형 C에 해당 또는 동일한 인공 서열이지만, 후술하는 넘버링에 따른 위치 46이 상기 Genbank 서열에서와 같은 GIn (Q) 대신에 본 발명의 유전자형 C에서 Lys (K)인 것이 예외인 인공 서열이며, 본 발명의 HBV 유전자형 C 서열은 "HBV 유전자형 C Q46K"으로 나타내어질 수도 있다. SEQ ID NO. 4, 12, 21 내지 27 참조.
HBV preS 공통 서열에 대하여 위에서 기재된 것과 동일한 넘버링이 유전자형 C의 아미노산 잔기의 넘버링에 사용되는데(도 2 참조), 예를 들어,
잔기 번호 (-11)인 Met (-11)는 SEQ ID NO. 4에서 아미노산 잔기 1로 기입되어 있고;
잔기 번호 (-10)인 Gly(-10)는 SEQ ID NO. 4에서 아미노산 잔기 2로 기입되어 있고;
잔기 번호 1인 Met 1은 SEQ ID NO. 4에서 아미노산 잔기 12로 기입되어 있고;
잔기 번호 2인 Gly 2는 SEQ ID NO. 4에서 아미노산 잔기 13으로 기입되어 있으며 SEQ ID NO. 12에서는 아미노산 잔기 1로 기입되어 있고;
잔기 번호 48인 Gly 48은 SEQ ID NO. 4 에서 아미노산 잔기 58로 기입되어 있고 SEQ ID NO. 12에서는 아미노산 잔기 47로 기입되어 있다.
위치 46이 GIn (Q); Q46K 대신에 Lys (K)라는 것을 제외하고 HBV 유전자형 C의 위치 2 내지 48에 해당하는 아미노산 서열인 SEQ ID NO: 12는 다음과 같다:
2-GTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48
P는
SEQ ID NO. 12 (유전자형 C의 잔기 2 내지 48),
SEQ ID NO. 4 (유전자형 C의 잔기 (-11) 내지 48),
SEQ ID NO. 13 (유전자형 C의 잔기 2 내지 21),
SEQ ID NO. 14 (유전자형 C의 잔기 5 내지 21) 및
SEQ ID NO. 15 (유전자형 C의 잔기 9 내지 15)로부터 선택되는 것이 바람직할 수 있다.
유전자형 C 서열의 바람직한 구현예에서, B형 간염 바이러스(HBV)의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 하기 일반식을 갖는다:
H m -P- R n
상기 식에서 바람직하게는,
P는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열, 또는 10 개 이상의 연속적인 아미노산들로 이루어진 상기 서열의 N-말단 및/또는 C-말단이 절단된 변이체, 또는 변형 아미노산(들), 비천연 아미노산(들) 또는 펩티드유사체(들)을 포함하는 이들의 유도체를 포함하는 preS-유래 펩티드이고,
H는 preS-유래 펩티드 P의 N-말단이고 아실화 및 소수성 잔기의 부가로부터 선택되는 P의 소수성 변형이고,
R은 preS-유래 펩티드 P의 C-말단 변형이고,
m은 1 이상이고,
n은 0 또는 1 이상이다.
본 발명의 바람직한 펩티드는 HBV 및/또는 HDV 감염의 억제, 급성 HBV 및/또는 HDV 감염의 예방 및/또는 B형 및/또는 D형 간염의 치료에 특히 효과적이다.
P는 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기(유전자형 C의 잔기 2 내지 48)를 포함하거나 이러한 잔기로 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, P는 SEQ ID NO. 12의 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 것이 바람직한데, 변이체는 SEQ ID NO. 12의 최소한 10 개의 연속적인 아미노산 잔기, 바람직하게는 잔기 9 내지 18, 더욱 바람직하게는 잔기 15 내지 20을 함유하고, SEQ ID NO. 12의 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48개 이상의 아미노산 잔기로 이루어질 수 있다.
P에 함유되는 SEQ ID NO. 12의 연속적인 아미노산 잔기는
유전자형 C의 아미노산 잔기 9 내지 15 [= SEQ ID NO. 15],
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 15,
유전자형 C의 아미노산 잔기 9 내지 18,
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 18,
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 20,
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 21 [= SEQ ID NO. 13],
유전자형 C의 아미노산 잔기 5 내지 21 [= SEQ ID NO. 14],
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 25,
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 30,
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 35,
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 40,
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 45,
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 46, 또는
유전자형 C의 아미노산 잔기 2 내지 48[=SEQ ID NO: 12]로부터 선택되는 것이 바람직하다.
바람직한 구현예에서, P는 SEQ ID NO. 12의 각각의 잔여 아미노산, 즉
유전자형 C의 아미노산 잔기 16 내지 48,
유전자형 C의 아미노산 잔기 19 내지 48,
유전자형 C의 아미노산 잔기 21 내지 48,
유전자형 C의 아미노산 잔기 22 내지 48,
유전자형 C의 아미노산 잔기 26 내지 48,
유전자형 C의 아미노산 잔기 31 내지 48,
유전자형 C의 아미노산 잔기 36 내지 48,
유전자형 C의 아미노산 잔기 41 내지 48,
유전자형 C의 아미노산 잔기 46 내지 48, 또는
유전자형 C의 아미노산 잔기 47 내지 48을 함유하며,
상기 잔기들은 SEQ ID NO. 12의 각각의 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 이들의 유도체이고, 상기 유도체는 아미노산 치환, 아미노산 결실, 변형 아미노산, 비천연 아미노산 또는 펩티드유사체(peptidomimetic)로부터 선택된 하나 이상의 변형이고, 상기 하나 이상의 변형은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 변형이다.
바람직한 아미노산 치환이 본 발명에서 기재되어 있다.
바람직하게, P는
- SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 15를 함유하고 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 16 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열;
- SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 20를 함유하고 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 21 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열;
- SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 25를 함유하고 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 26 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열;
- SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 30을 함유하고 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 31 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열;
- SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 35를 함유하고 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 36 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열;
- SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 40을 함유하고 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 41 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열,
- SEQ ID NO. 12의 아미노산 서열을 함유하는 아미노산 서열
로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
상기 유도체는 아미노산 치환, 아미노산 결실, 변형된 아미노산, 비천연 아미노산, 또는 펩티드 유사체로부터 선택된 한 이상의 변형을 포함하고, 상기 하나 이상의 변형은 1, 2, 3, 4, 또는 5개 이상의 변형이다.
유전자형 C의 바람직한 구현예에서,
- P는 SEQ ID NO. 12 또는 상기에 각각 기재된 변이체/유도체/변형체로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
- H는 미리스토일(C14) 또는 스테아로일(C18), 바람직하게는 미리스토일(C14)에 의한 아실화에 따른 소수성 변형이다.
미리스토일화에 의한 변형은 안전성이 높기 때문에, 즉 스테아로일기의 부작용(선천성 면역 반응)이 없기 때문에 생체내 및 의료용도로 바람직하다.
따라서, 본 발명의 더욱 바람직한 소수성 변형된 preS-유래 팹티드는
HB VpreS/(-11 )-48myr (C) [SEQ ID NO. 4],
HB VpreS/2-48myr (C) [SEQ ID NO. 12],
HBVpreS/2-21myr(C) [SEQ ID NO. 13],
HBVpreS/5-21myr (C) [SEQ ID NO. 14], 또는
HBVpreS/9-15myr(C) [SEQ ID NO. 15]이고,
가장 바람직하게는 HBVpreS/2-48myr(C) [SEQ ID NO. 12] 이다.
상기 preS 유래 펩티드 P의 C-말단 변형(R)은 생체내 분해와 같은 분해로부터 보호하는 부분(moiety)에 의한 변형인 것이 바람직하다.
"C-말단"은 C-말단에서의 변형, 즉 각각의 마지막 아미노산 잔기를 의미하는 외에도, 마지막이지만 하나의 아미노산 잔기, 마지막이지만 두 개 이상의 아미노산 잔기와 같은, C-말단에 아주 근접한 변형(예를 들어, 카르복시펩티다아제의 작용에 의한 효소적 분해로부터 매개체(carrier)를 보호하는 하나의 D-아미노산의 도입)도 포함한다.
당업자는 각각의 용도에 따라 각각의 적당한 부분(들)을 선택할 수 있다.
분해로부터 보호하는 바람직한 부분은 아미드, D-아미노산, 변형된 아미노산, 고리형 아미노산, PEG 및 글리칸과 천연 및 합성 중합체로부터 선택된다.
구현예에서, P는 알부민, 인간 IgG의 Fc 도메인으로부터 바람직하게 선택되는 펩티드 또는 단백질에 융합된다.
상기 융합은 P의 C-말단인 것이 바람직하다.
또한, n은 0 또는 1 이상이다. 즉, C-말단 변형(R)은 임의적이다.
n은 1인 것이 바람직하다.
본 발명의 추가의 구현예에서, n은 1, 2, 3 또는 4 이상이다. 즉, P의 C-말단 또는 이의 근접부는 둘 이상과 같은 하나 이상의 부분 또는 기를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 부분들 또는 기들은 서로 동일 또는 상이할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, H 및/또는 R은 링커 또는 스페이서(spacer)를 통해 P에 결합된다.
링커 또는 스페이서는 당업지에게 알려져 있고, 이의 예로는 폴리알라닌, 폴리글리신, 탄수화물, (CH2)n기가 있다.
따라서, 당업자는 각각의 용도에 따라 각각의 적당한 링커(들) 또는 스페이서(들)를 선택할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 형광 염료, 방사성 동위원소 및 조영제(contrast agent)로부터 바람직하게 선택되는 라벨(label) 또는 태그(tag)를 갖는다.
바람직한 방사성 동위원소는 131I, 125I, 99 mTc, 18F, 68Ga, 111In, 90Y, 177Lu 이다.
바람직한 형광 염료는 Alexa 염료, 로다민 및 플로오레세인의 유도체, Cy-염료이다.
바람직한 조영제는 가돌리늄(Gd) 복합체, 초상자성 철(Fe) 복합체 및 입자, 고원자가의 원자를 함유하는 화합물, 즉 컴퓨터 단층촬영(CT)용 요오드, 이러한 조영제를 함유하는 리소좀과 같은 마이크로버블 및 담체가 있다.
본 발명의 펩티드는 당업자에게 알려진 여러 가지 과정, 일반적으로는 화학적 합성 과정 및/또는 유전자 조작 과정에 따라 쉽게 제조할 수 있다.
화학적 합성 과정의 특별한 예로는 고체상 연속 및 블록 합성이 있다(11). 고체상 연속 합성 과정은 자동화 펩티드 합성기를 이용하는 것과 같은 확립된 자동화 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 과정에서, α-아미노 보호된 아미노산은 수지 지지체에 결합된다. 상기 이용되는 수지 지지체는 (폴리)펩티드의 고체상 합성을 위해 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떤 적당한 수지일 수 있고, 바람직하게는 초기에 도입된 o-아미노 보호 아미노산에 의한 에스테르 형성을 위한 부위를 제공하기 위해 폴리옥시에틸렌과 공중합된 폴리스티렌일 일 수 있다. 본 발명자들이 적용하는 이러한 최적화된 방법은 명백히 설명되어 왔다(예를 들어 (12) 참조). 상기 아미노산은 하나씩(단계적으로) 도입된다. 하나의 아미노산의 도입에 해당하는 각각의 합성 사이클은 보호기 제거 단계, 연속적인 세척 단계, 아미노산의 활성화에 의한 결합 단계, 및 후속 세척 단계를 포함한다. 이러한 각각의 단계 이후마다 여과 단계가 수행된다. 결합을 위한 반응 시약(reactive agent)은 디시클로헥실카보디이미드, 히드록시벤조트리아졸, 벤조트리아질-일-옥시트리스(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트, 및 디페닐포스포릴아지드와 같은 (폴리)펩티드 합성용의 통상적인 반응 시약이다. 수지상에서 폴리펩티드의 합성 후, 상기 폴리펩티드는 아니졸, 에탄디티올 또는 2-메틸인돌의 존재하에서 트리플루오로아세트산과 같은 강산으로 처리하여 상기 수지로부터 분리된다. 다음에, 상기 화합물은 통상적인 정제 방법, 특히 HPLC에 의해 정제된다.
또한, 본 발명의 펩티드는 선택적으로 보호되는 (폴리)펩티드 단편을 결합함으로써 얻어질 수도 있는데, 이러한 결합은 예를 들어 용액에서 수행된다.
또한, 본 발명의 펩티드는 당업자에게 알려진 유전 공학적 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 바큘로바이러스계와 같은 진핵세포 발현계가 특히 적당하다. 이러한 과정에 따라, 단백질은 이종 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 프로모터와 같은 조절 핵산 서열을 함유하는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 곤충 세포에서 발현된다. 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection)(CRL 1711)로부터 입수가능한 세포주 Sf-9와 같은 재조합 바큘로바이러스를 이용한 감염을 위해 몇 가지 세포주를 이용할 수 있다. 또한, 대장균과 같은 원핵세포 발현계에서의 발현이 특히 적당하다.
상기 펩티드에 소수성 부분의 도입은 합성 및 유전 공학적 방법을 포함한 당업자에 잘 알려진 여러 가지 과정을 이용하여 쉽게 달성할 수 있다.
택일적으로, 상기 펩티드 및/또는 융합 펩티드(즉, 소수성 변성 펩티드)는, 당업자에게 알려져 있고 백신 등을 발생하기 위해 사용되는 CHO 및 기타 세포주와 같은 안정적으로 형질감염된 진핵 세포주에 의해 생성될 수 있다. N-말단 47-preSl 아미노산이 미리스토일화 단백질/펩티드의 분비를 촉진하는 고유의 특성 때문에, 상기 생물학적 활성의 소수성 변형된 펩티드는 세포 배양 상청액으로부터 추출할 수 있다.
본 발명의 소수성 변형된 preS -유래 펩티드의 특성
본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 다재다능한 간염 바이러스 침입 억제제이고, 간 지향성(hepatotropism)을 나타낸다. 즉, 간을 표적한다. 간 지향성이 특히 도 11에서 보여진다.
상기 간 지향성은 동일자로 출원되었고 본 발명에 그대로 참조로 포함되는 "B형 간염 바이러스(HBV)의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 및 이들의 간으로 화합물의 특이적 전달을 위한 운반체(vehicle)로서의 용도"라는 명칭의 본 발명자들의 대응하는 미합중국 특허 가출원서에 더 개시되어 있다.
본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들)은 생체외(예를 들어, 간세포에 대한 HBV 입자의 결합 및/또는 내재화를 방지함으로써) 또는 시험관내에서 HBV뿐만 아니라 HDV의 매우 적당하고 효과적인 침입 억제제이다.
도면 및 실시예에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들)는 높은 억제 활성을 갖는다. 즉, 매우 낮은 투여량(dose)에서 HBV 및/또는 HDV 감염을 효과적으로 억제한다. 더욱 바람직한 구현예들의 IC50 값은 0.01 내지 500 nM, 바람직하게는 0.025 내지 50 nM, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 25 nM의 범위이다. 표 1 참조.
유전자형 C로부터 유래된 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들)은 상응하는 유전자형 D의 것들보다 더욱 강력하게 HBV를 억제한다.
또한, 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드는 면역원성 에피토프를 포함하지 않지만 강한 억제 활성을 나타내도록 만들어질 수 있다. 예들 들어, HBVpreS/2-21stearoyl 는 그 서열 내에 면역원성 에피토프를 포함하지 않지만 약 8 nM의 IC50을 갖는다.
또한, 본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들)는 HBV 유전자형 C 및 D를 예방할 수 있는데, HBVpreS/2-21stearoyl(C) 또는 HBVpreS/2-48myr(C)과 같은 유전자형 C 유래의 펩티드는 HBV 유전자형 D의 침입을 억제할 수 있기 때문이다.
약학적 조성물 및 백신 조성물
위에서 약술한 바와 같이, 본 발명은 본 발명에서 정의한 바와 같은 HBV의 하나 이상의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 및, 임의적으로, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은
- 본 발명에서 정의한 바와 같은 HBV의 하나 이상의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드;
- 본 발명에서 정의한 바와 같은 접합체(conjugate); 및
- 임의적으로, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에서 기재한 모든 용도 및 방법에 아주 적합하다.
위에서 약술한 바와 같이, 본 발명은 본 발명에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 및 임의적으로, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 본 발명에서 기재한 모든 용도 및 방법에 아주 적합하다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제"는 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 백신 조성물이 그 안에서 또는 그와 함께 제형화될 수 있는 어떠한 운반체(vehicle)를 말한다. 이의 예로는 인산염 완충액(PBS)과 같은 식염 용액이 있다. 일반적으로, 희석제 또는 담체는 투여 방식 및 경로, 표준 제약 과정에 근거하여 선택된다.
의학적 용도
위에서 약술한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 팹티드(들) 및 이를 함유한 약학적 조성물(들)의 의학적 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명에 따른 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)은 질병의 진단, 예방 및/또는 치료를 위해 적당하므로, 이를 위해 제공된다.
또한, 위에서 약술한 바와 같이, 본 발명은 특정 질병의 진단, 예방 및/또는 치료를 위한 본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 및 이를 함유하는 약학적 조성물(들)을 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)은 HBV 및/또는 HDV 감염의 억제, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염의 예방 및/또는 B형 및 D형 간염, 바람직하게는 만성 B형 및/또는 D형 간염의 치료를 위해 제공된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)은 HBV 및/또는 HDV 감염의 억제, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염의 예방 및/또는 B형 및 D형 간염의 치료를 위한 의약의 제조를 위해 사용된다.
본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)은 HBV 및/또는 HDV 감염의 억제를 위해 제공되는 것이 바람직하다.
본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)은 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염의 예방을 위해 제공되는 것이 바람직하다.
HBV의 어떠한 유전자형의 HBV 감염을 억제 또는 예방하는 것이 바람직하다.
본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들)는 HBV 유전자형 C 및 D 모두를 예방할 수 있는데, HBVpreS/2-21stearoyl(C) 또는 HBVpreS/2-48myr(C)와 같은유전자형 C 유래의 펩티드는 HBV 유전자형 D의 침입을 억제할 수 있기 때문이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들)또는 조성물(들)은 HBV 및/또는 HDV 침입 억제제로서 사용/제공된다.
바람직하게, 본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들)또는 조성물(들)은 B형 및/또는 D형 간염, 특히 만성 B형 및/또는 D형 간염의 치료를 위해 제공된다.
본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들)는 생체외(간세포에 대한 HBV 입자의 결합 및/또는 내재화를 예방함으로써) 또는 생체내에서 HBV뿐만 아니라 HDV의 아주 적당하고 효과적인 침입 억제제이다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 또는 약학적 조성물을 이용하는 것을 포함하는 HBV에 의한 간세포 감염의 생체외 억제 방법을 제공한다.
적당한 간세포로는 인간 원발성 간세포, 또는 HBV로 감염되기 쉬운 간암 유래 세포주인 HepaRG (22) (프랑스 특허 출원 FR 0109044호에 기재됨), Tupaia belangeri 유래 간세포(23)가 있다.
또한, 위에서 약술한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 HBV의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드(들) 또는 약학적 조성물(들)을 이용하여 HBV 및/또는 HDV 감염을 억제하는 방법, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염을 예방하는 방법 및/또는 (만성) B형 및/또는 D형 간염을 치료하는 방법을 제공한다.
투여 경로
바람직하게, 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 또는 약학적 조성물의 투여 경로는 피하, 정맥내, 경우, 비강내, 근육내, 경피, 흡입, 또는 좌약 경로로부터 선택된다.
비강내 투여 또는 적용을 위한 바람직한 구현예는 비강 분무이다.
치료적 유효량
본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 또는 약학적 조성물은 상기 약학적 조성물(들)이 치료적 유효량의 상기 소수성 변형 preS-유래 펩티드(들)을 포함하도록 제공된다.
본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 또는 약학적 조성물의 "치료적 유효량"은 HBV 및/또는 HDV 감염을 억제, 원발성 HBV 및/또는 HDV 감염을 예방, B형 및/또는 D형 간염을 치료 및/또는 HBV 및/또는 HDV의 생체내 침입을 예방 및/또는 억제하는데 효과적인 양을 말한다.
바람직한 치료적 유효량은 체중 1 kg당 10 μg 내지 1 mg의 범위, 바람직하게는 10 μg 내지 100 μg의 범위이다.
본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드를 백신으로 사용하기 위하여, 바람직한 치료적 유효량은 체중 1 kg 당 10 μg 내지 1 mg 이다.
사용된 소수성 변형된 preS-유래 펩티드의 IC50 값이 약 10 nM 인 경우, 바람직한 치료적 유효량은 체중 1 kg 당 약 100 μg 또는 환자당 1 내지 5 mg의 범위이다. 환자당 1 내지 5 mg의 범위의 바람직한 치료적 유효량은 하루에 한번 또는 다른 구현예의 경우 2-3일에 한번 투여될 수 있다.
바람직한 치료적 유효량은 억제, 치료 또는 백신접종의 각각의 적용 및 원하는 결과에 의존한다.
당업자는 적당한 치료적 유효량을 결정할 수 있다.
HBV 수용체의 확인
또한, 본 발명은 HBV의 부착 및/또는 침투에 관여하는 간세포 수용체의 생체외 및/또는 생체내 확인 및 상기 수용체의 발현의 정량 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 전술한 바와 같은 소수성 변형된 preS-유래 펩티드를 사용하는 것을 포함한다.
상기 간세포 수용체는 포유동물 또는 각각의 동물 모델, 바람직하게는 마우스 또는 인간에서 확인될 수 있다.
특히, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
- 간세포의 표면에 발현된 수용체에 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드를 특이적으로 결합시키기에 충분한 조건하에서 및 시간 동안 간조직 또는 간세포를 상기 펩티드와 접촉시키는 단계;
- 수용체에 대한 상기 펩티드의 결합을 검출하는 단계; 및
- 상기 수용체를 확인하는 단계.
이러한 수용체 확인은 당업자에게 알려진 통상적인 과정에 따라 달성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 수용체 확인 방법은 본 발명의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드를 방사성 표지, 효소 표지 또는 형광 표지한 후, 적절한 방법으로 검출하는 것을 포함할 수 있다. 다수의 형광 물질이 알려져 있고 라벨로서 사용될 수 있다. 이의 예로는 플루오레세인, 로다민, 아우라민, Texas Red, Cy3, Cy5, DIGE-라벨 등이 있다. 표소 라벨은 관련 분자, 예를 들어 폴리펩티드에 효소를 접합하는 것을 포함하고, 색도 측정, 분광분석, 또는 형광분광분석중 어떤 방법을 이용하여 검출할 수 있다.
본 발명자들은 HBV의 생체내 또는 생체외 침입을 효율적으로 차단하는 HBV-preSl-표면 단백질 유래-리포펩티드를 확인했다. 이러한 억제 펩티드에 관한 본 발명의 생체내 분포(biodistribution) 연구 결과, 상기 펩티드는 간 내에서 선택적으로 축적되어 간세포에 결합하고 아마도 유입되는 것으로 확인되었다. 이러한 간 지향성(hepatotropism)은 상기 펩티드의 N-말단 아실화를 필요로 하고, N-말단의 47 개 preSl 아미노산, 즉 아미노산 잔기 2 내지 21(또는 바람직하게는 9 내지 15) 내의 특정 HBV preS-서열 모티프에 의존한다. 본 발명자들의 관찰 결과, 이러한 펩티드 서열은, 혈장막을 통한 완전 융합 단백질의 수송을 촉진하고(결과 미도시) 간세포의 혈장막에 어떤 종류의 약물을 특이적으로 전달하거나 심지어는 이러한 세포 내로 특이적으로 전달하는 가능성을 열어주는 막 전위 신호(membrane translocation signal)를 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명자들은 HBV preS1-유래 리포펩티드가 이식된 uPA-RAG-I 마우스 모델에서 매우 낮은 투여량으로 HBV 감염을 완전히 예방할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 이러한 HBVpreS-유래 침입 억제제에 대한 약동학적 연구 결과, 표적 장기에서 긴 반감기(t1 /2 약 24 시간) 및 예외적으로 높은 혈청 안정성(t1 /2 약 60 시간)과 함께 두드러진 간 지향성이 나타났다. 상기 펩티드의 N-말단 아실화뿐만 아니라, 특정 아미노산 서열의 보전성(integrity)이 필요하다. 따라서, 상기 펩티드는 신세포의 감염을 억제하거나 간세포암을 치료하기 위한 간 특이적 약물 표적화를 위한 다재다능한 벡터로서 이용될 수 있다.
또한, 동일자로 출원된 "B형 간염 바이러스(HBV)의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 및 이들의 간으로 화합물의 특이적 전달을 위한 운반체(vehicle)로서의 용도"라는 명칭의 본 발명자들의 대응하는 미합중국 특허 가출원서를 참조한다.
또한, 본 발명자들은 체내에서 HBV 외피 단백질 유래 펩티드의 피하 적용을 통해 WMHBV 감염이 효율적으로 차단될 수 있는 원리를 입증했다. 이는 급성 HBV 감염의 예방 및 만성 B형 간염의 치료를 위한 새로운 가능성을 열어준다. 본 발명에서 사용되는 uPA/RAG-2/Pfp 마우스는 B 세포, T 세포 및 NK 세포가 부족하기 때문에, 감염가능한 간세포에 대한 상기 펩티드의 직접 억제 효과가 추정된다. 이러한 추정은 아실화된 preS-유래 펩티드가 간에 효율적으로 축적된 다음, 아마도 담즙을 통해 서서히 제거된다는 것에 의해 지지된다. 이러한 양자의 특성으로 인해, 매우 낮은 투여량 및 낮은 빈도수로 피하 적용하는 것이 가능하다. 0.2 mg/kg HBV/preS2-48myr를 5일 내에 5회 주사한 결과, WMHBV 감염이 예방되었다는 것을 감안하면, 활성이 약 10 배 더 높은 펩티드인 HBV/preS2-48stearoyl의 연속적인 투여는 매일 또는 2일 간격으로 투여시 7 μg/kg 내지 13 nmol/kg 미만의 투여량에서 효과적일 것이다. 마우스에서 얻은 체중당 효율적인 약리학적 투여량이 인간의 경우 약 10배 만큼 보정되어야 한다는 사실(13)을 고려하면, 인간에 대한 효율적인 투여량은 lOOμg/day 미만인 것으로 예상된다.
만성 HBV 감염의 치료를 위한 뉴클레오시드- 또는 뉴클레오티드-기반 섭생법은 흔히 내성 변이체의 선택을 초래한다(4, 14). 이로써, 상이한 단계들의 HBV 복제 사이클을 초래하는 대안의 방법 및 새로운 약물이 필요하다. HBV 리포펩티드에 의한 침입 억제가 이러한 접근방법을 대표한다. 작용 방식으로 인해, 본 발명자들은 어떤 종류의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 내성 변이체에 대한 효능을 가정한다. 또한, 상기 펩티드의 활성은 preSl 도메인에서 보존된 서열을 필요로 하기 때문에(15), 상기 펩티드는 모든 HBV-유전자형에 대하여 활성이 있다. HIV gp41 단백질을 표적하여 분자 내 보상 변이를 출현시키는 Fuzeon®과 대조적으로, 예전의 연구 결과는 아실화된 HBV-리포펩티드가 HBV와 이의 수용체의 상호작용을 방지하는 세포 내 성분을 제기한다는 것을 나타낸다(16, 17). 따라서, 내성 변이의 출현은 없을 것으로 보인다.
HBVpreS-유래 리포펩티드의 임상 적용에 대한 명백한 표시는 아직 확립되지 않은 HBV 감염의 예방이다(예를 들어, 노출 후 예방, 간 이식편의 수직 전염 또는 재감염 예방). 그러나, 침입 억제제는 예를 들어 인터페론 알파 또는 바이러스 RT의 억제제와 병용시 임상적으로 감염된 환자에서도 효과적이다. HBV 만성 감염의 유지는 한편으로는 면역계에 의해 제거된 감염 간세포의 동적 전환에 의존하고 다른 한편으로는 치유/비감작(naive) 세포의 (재)감염에 의존하기 때문에(18), 항바이러스 치료하에서 내성 균주의 출현 및 감염의 확산을 억제하기 위한 uPA 키메라계(chimeric system)에서의 이러한 치료 방법의 효능을 평가하는 것이 중요하게 된다(19).
또한, HBVpreS-유래 리포펩티드는 간세포내로의 침입을 위해 HBV 외피 단백질을 이용하는 위성 비루소이드(satellite virusoid)인 HDV의 세포 외 감염을 억제한다(15, 17, 20). 현재까지 HDV 감염에 대한 효과적인 치료법은 존재하지 않기 때문에, preS-유래 리포펩티드는 이러한 흔한 난치성 간질환에 대하여 첫 번째로 선택되는 치료법이다.
면역 적격 환자에 HBVpreS-유래 리포펩티드를 적용하면, 세포 및 체액 면역 반응이 유도된다. 이는 치료 결과에 유익한데, HBVpreS/2-48의 에피토프를 인식하는 항체는 생체외에서 HBV 감염을 중화하기 때문이다(21). 또한, 자연 감염시 바이러스를 제거하기 위하여는 HBVpreS-특이 면역성을 성공적으로 설정할 필요가 있는 것으로 추측되어 왔다. 따라서, 바이러스 침입을 직접 억제하는 외에도, 상기 펩티드를 이용하여 preS-특이 면역 반응을 촉진하는 것은 특히 IFNα와 병용시 세포용해 또는 비세포용해 면역 반응을 통한 바이러스 제거에 기여할 수 있다.
표 1
바람직한 소수성 변형된 preS-유래 펩티드
Figure 112010048020098-pct00002
Figure 112010048020098-pct00003
상기 표 1에서,
myr은 N-말단의 미리스토일화를 의미하고;
palm은 N-말단의 팔미토일화를 의미하고;
stearoyl은 N-말단의 스테아로일화를 의미하고;
(C)는 SEQ ID NO. 4에서와 같이 Q46K를 갖는 유전자형 C를 의미하고,
(D)는 유전자형 D를 의미하고;
* 펩티드는 도면에서 도시되어 있고,
** 최소 서열.
표 2
면역원성 에피토프의 변화를 갖는 바람직한 소수성 변형된 preS-유래 펩티드
Figure 112010048020098-pct00004
상기 표 2에서,
myr은 N-말단의 미리스토일화를 의미하고;
stearoyl은 N-말단의 스테아로일화를 의미하고;
(C)는 SEQ ID NO. 4에서와 같이 Q46K를 갖는 유전자형 C를 의미하고,
(D)는 유전자형 D를 의미한다.
표 3
유전자형 C 및 D의 소수성 변형된 preS-펩티드를 이용한 비교 억제 연구
Figure 112010048020098-pct00005
도 3 참조.
상기 표 3에서, (C)는 HBV 유전자형 C Q46K를 의미한다.
표 4
공통 서열을 갖는 소수성 변형된 preS-펩티드를 이용한 감염 억제 연구
Figure 112010048020098-pct00006
도 4 참조.
표 5
C-말단 변이체를 이용한 비교 억제 연구
Figure 112010048020098-pct00007
도 5 참조.
표 6
N-말단 및 C-말단 결실 변이체를 이용한 비교 억제 연구
Figure 112010048020098-pct00008
도 6 참조.
표 7
아미노산 잔기 9 내지 15(최소 서열)의 필요성을 입증하는 소수성 변형된 preS-펩티드를 이용한 비교 억제 연구
Figure 112010048020098-pct00009
도 7 참조.
표 8
소수성 변형된 preS-펩티드를 이용한 비교 억제 연구
Figure 112010048020098-pct00010
도 8 참조.
retroinverso: C에서 N 방향으로 SEQ ID NO. 16의 아미노산 서열.
표 9
아미노산 잔기 9 내지 15(최소 서열)의 필요성을 입증하는 소수성 변형된 preS-펩티드를 이용한 비교 억제 연구
Figure 112010048020098-pct00011
도 9 참조.
하기의 실시예 및 첨부 도면은 본 발명을 예시하지만, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
실시예
방법
HBV 의 소수성 변형된 preS -유래 펩티드의 합성
예를 들어 참조문헌(16)에서 설명한 바와 같이 합성을 수행했다.
세포주 및 일차 세포 배양
10% 우태혈청(FCS), 100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 5 μg/ml 인슐린 및 5×lO-5 M 히드로코르티손 헤미숙시네이트를 함유하는 William's E 배지(16)에서 HepaRG 세포를 성장시켰다. 세포를 2주 간격으로 트립신화하여 1/5씩 계대했다. 접종하기 2 내지 3주 전에, 유지 배지 내로 2% DMSO를 첨가하여 세포 분화를 유도했다. 상기 배지는 2-3일 간격으로 교환했다.
감염 경합 분석
감염 접종물(infectious inoculum)로서, HepG2 클론 2.2.15 (23) 세포의 50배 진한 배양 상청액을 사용하였는데, 공급량이 제한되지 않고 일정하기 때문이다. 상기 상청액은 6% 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 8000의 존재하에 바이러스 입자를 침전시킴으로써 새로이 수득한 상청액으로부터 제조했다. 그 펠릿을 25% FCS를 함유하는 인산염 완충액(PBS)에 다시 현탁했다. 얻어지는 분획(aliquot)들을 -80 ℃에서 보관했다. 분화한 HepaRG 세포 또는 PHH를, 4% PEG 8000 (Sigma)이 첨가된 배지에 10배 희석한 진한 감염원과 함께 37 ℃에서 20 시간 배양했다. 배양의 종료시, 세포를 배지로 3회 세척하고, 2% DMSO 및 5×lO-5 M 히드로코르티손 헤미숙시네이트의 존재하에 유지하고, 지정된 시기에 회수했다.
경합 실험을 12-웰 플레이트에서 수행했다. 우선, 약 1×106 개의 세포를 화학적으로 합성된 HBV 유래 펩티드와 함께 30 분간 예비 배양한 다음, 바이러스 및 펩티드와 함께 20시간 배양했다. 모든 경합 실험은 최소한 2회 수행했고, 하나의 대표적인 실험의 결과를 각각의 경우마다 나타낸다 (도 3 내지 도 7 참조).
HepaRG 세포를 하기의 펩티드들의 부재(0 nM) 또는 존재하에 감염시켰다:
- 1, 5, 25, 100 및 200O nM의
оHBVpreS/2-48myr(D),
оHBVpreS/2-48myr(C),
оHBVpreS/(-ll)-48myr(C),
оHBVpreS/2-48stearoyl(C) 및
оHBVpreS/(-ll)-48stearoyl(C); 또는
- 0.125; 0.25; 0.5; 0.75 및 1 nM의
оHBVpreS/2-48myr(컨센서스),
оHBVpreS/2-48 stearoyl(컨센서스),
- 1, 5, 25, 100 및 100O nM의
оHBVpreS/2-48stearoyl(D),
оHBVpreS/2-15stearoyl(D),
оHBVpreS/2-21stearoyl(D),
оHBVpreS/2-26stearoyl(D) 및
оHBVpreS/2-33stearoyl(D); 또는
- 1, 5, 25, 100 및 100O nM의
оHBVpreS/2-48stearoyl(D),
оHBVpreS/2-33stearoyl(D),
оHBVpreS/5-33stearoyl(D),
оHBVpreS/5-48stearoyl(D),
оHBVpreS/9-33stearoyl(D) 및
оHBVpreS/9-48stearoyl(D); 또는
- 1 , 5, 25, 100 및 100O nM 의
оHBVpreS/2-48stearoyl(D),
оHBVpreS/2-48stearoyl(D-AS11 -15)(D),
оHBVpreS/2-48stearoyl(Ala11 -15)(D),
оHBVpreS/2-48stearoyl(Δ17-21)(D),
оHBVpreS/2-48stearoyl(Ala17 -21)(D); 또는
- 1, 5, 25, 100 및 100O nM의
оHBVpreS/2-48stearoyl(레트로인버소)(D) 및
оHBVpreS/2-48stearoyl(Ala21 ,23,29,30)(D); 또는
- 1, 5, 25, 100 및 100O nM의
оHBVpreS/2-48stearoyl(Ala18)(D),
оHBVpreS/2-48stearoyl(Δl1 -15)(D),
оHBVpreS/2-48stearoyl(Ser13)(D),
оHBVpreS/2-48stearoyl(Arg11)(D); 또는
- 50, 100, 150, 250 및 1000 pM (0.05, 0.1, 0.25 및 1 nM)의
оHBVpreS/2-48myr(C) 및
оHBVpreS/2-48stearoyl(C). 여기서 (C)는 HBV 유전자형 C Q46K을 의미한다.
상기 감염 접종물(유전자형 D의 HDV) 및 펩티드를 밤새 배양했다. 세척 후, 세포를 추가의 12 일간 유지시켜서 바이러스 유전자를 발현시켰다. 8 일 내지 12일에, 세포 배양 상청액을 수집하고, 통상적으로 이용가능한 정량적 ELISA를 이용하여 분비된 HBSAg를 분석했다. 각각의 불완전 감염으로부터 얻은 HBsAg 값을 100%라 하고, 감염 억제의 정도를 불완전 감염의 %로 나타낸다.
결과는 도 3 내지 도 9 및 도 12 및 표 3 내지 표 9에서 보여진다.
소수성 변형된 preS -유래 펩티드의 생체내 분포( biodistribution )
소수성 변형된 preS-유래 펩티드의 생체내 분포를 수컷 NMRI 마우스에서 연구했다. 모든 실험은 독일법(German laws)에 따라 수행했다. C-말단에서 추가의 Tyr 잔기를 함유하는 펩티드를 클로라민 T 방법을 이용하여 131I (Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)로 표지하고 HPLC로 정제했다. 상기 표지된 펩티드를 50% DMSO에 용해된 형태로 피하 주사하여 투여했다. 선택된 시기에, 마우스를 희생시키고, 혈액, 심장, 비장, 간, 신장, 근육 및 뇌에 함유된 방사능을 γ-카운터(Canberra Packard, Russelsheim, Germany)로 측정하고 조직 1g 당 주사량의 % (%ID/g)로 나타냈다.
간으로부터의 추출 후 소수성 변형된 preS -유래 펩티드의 안정성 평가
간에서 펩티드 안정성을 확인하기 위하여, 131I 표지된 HBVpreS/2-48myr (D)를, 피하 주사 후 24 시간 후 하나의 간엽(liver lobe)으로부터 추출했다. 이를 위하여, 냉동 간 조직 1 g 당 1 ml 물을 시료에 첨가했다. 균질화한 후, 각 체적의 아세토니트릴을 첨가하고 균질화를 반복했다. 원심분리(4000×g에서 2×10 분)후, 그 용액을 역상 HPLC 걸럼상에서 분리하고, 각 분획의 방사능을 감마 카운터로 정량했다.
상기의 설명, 특허청구범위 및/또는 첨부도면에 개시된 특징들은 단독으로 그리고 이들의 어떤 조합으로 본 발명을 여러 가지 형태로 구현하는데 필수적인 것 일 수 있다.
참조문헌
Figure 112010048020098-pct00012
Figure 112010048020098-pct00013
<110> Universitatsklinikum Heidelberg <120> Hydrophobic modified preS-derived peptides of hepatitis B virus (HBV) and their use as HBV and HDV entry inhibitors <130> U30234PCT <150> PCT/EP2008/000591 <151> 2008-01-25 <160> 28 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 consensus sequence (positions (-11) to 48) <400> 1 Met Gly Gly Trp Ser Ser Thr Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Ala Phe Arg Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn 35 40 45 Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 2 <211> 59 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 2 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Val 35 40 45 Lys Asp Asp Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly 50 55 <210> 3 <211> 59 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 3 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Ala Phe Lys Ala Asn Ser Glu Asn Pro Asp Trp Asp Leu Asn Pro His 35 40 45 Lys Asp Asn Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 4 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preSl sequence positions (-11) to 48, corresponding to HBV genotype C, but Q46K <400> 4 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn 35 40 45 Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 5 <211> 48 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 5 Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp 20 25 30 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 <210> 6 <211> 58 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 6 Met Gly Leu Ser Trp Thr Val Pro Leu Glu Trp Gly Lys Asn Ile Ser 1 5 10 15 Thr Thr Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Thr Arg Asn Pro Asp Trp Asp His Asn Pro Asn Lys 35 40 45 Asp His Trp Thr Glu Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 7 <211> 59 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 7 Met Gly Ala Pro Leu Ser Thr Thr Arg Arg Gly Met Gly Gln Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Leu Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp Phe Asn Thr Asn 35 40 45 Lys Asp Ser Trp Pro Met Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 8 <211> 58 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 8 Met Gly Leu Ser Trp Thr Val Pro Leu Glu Trp Gly Lys Asn Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ser Asn Pro Leu Gly Phe Leu Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala 20 25 30 Phe Arg Ala Asn Thr Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Lys Lys 35 40 45 Asp Pro Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 9 <211> 59 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 9 Met Gly Ala Pro Leu Ser Thr Ala Arg Arg Gly Met Gly Gln Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Leu Phe Arg Ala Asn Ser Ser Ser Pro Asp Trp Asp Phe Asn Thr Asn 35 40 45 Lys Asp Asn Trp Pro Met Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 10 <211> 48 <212> PRT <213> Woolly Monkey Hepatitis B virus <400> 10 Met Gly Leu Asn Gln Ser Thr Phe Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Ser 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Leu Phe Lys Ala Asn Ala Gly Ser Ala Asp Trp 20 25 30 Asp Lys Asn Pro Asn Lys Asp Pro Trp Pro Gln Ala His Asp Thr Ala 35 40 45 <210> 11 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 consensus sequence (positions 2 to 48) <400> 11 Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 <210> 12 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions 2 to 48, corresponding to HBV genotype C, but Q46K <400> 12 Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gin Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus (positions 2 to 21, genotype C) <400> 13 Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Pro 20 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Hepatitis B virus (positions 5 to 21, genotype C) <400> 14 Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gin Leu Asp 1 5 10 15 Pro <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Hepatitis B virus (positions 9 to 15) <400> 15 Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro 1 5 <210> 16 <211> 47 <212> PRT <213> Hepatitis B virus (positions 2 to 48, genotype D) <400> 16 Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 <210> 17 <211> 44 <212> PRT <213> Hepatitis B virus (positions 5 to 48, genotype D) <400> 17 Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp 1 5 10 15 Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro 20 25 30 Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 35 40 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Hepatitis B virus (positions 2 to 33, genoytpe D) <400> 18 Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp 20 25 30 <210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Hepatitis B virus (positions 5 to 33, genotype D) <400> 19 Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp 1 5 10 15 Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp Asp 20 25 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Hepatitis B virus (positions 2 to 21, genotype D) <400> 20 Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Pro 20 <210> 21 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions 2 to 48, corresponding to genoytpe C (but Q46K), with Ala substitution in positions 21, 23, 29, 30 <400> 21 Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Ala Ala Ala Gly Ala Asn Ser Asn Ala Ala Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 <210> 22 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions (-11) to 48, corresponding to genoytpe C (but Q46K), D20A <400> 22 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Ala Pro 20 25 30 Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn 35 40 45 Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 23 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions 2 to 48, corresponding to genoytpe C (but Q46K), D20A <400> 23 Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Ala Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 <210> 24 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions (-11) to 48, corresponding to genoytpe C (but Q46K), S27A, N29A <400> 24 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Ala Phe Gly Ala Asn Ala Asn Ala Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn 35 40 45 Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 25 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions 2 to 48, corresponding to genoytpe C (but Q46K), S27A, N29A <400> 25 Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ala Asn Ala Pro Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 <210> 26 <211> 59 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions (-11) to 48, corresponding to genoytpe C (but Q46K), D20A, S27A, N29A <400> 26 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Ala Pro 20 25 30 Ala Phe Gly Ala Asn Ala Asn Ala Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn 35 40 45 Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 50 55 <210> 27 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions 2 to 48, corresponding to genoytpe C (but Q46K), D20A, S27A, N29A <400> 27 Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Ala Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ala Asn Ala Pro Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45 <210> 28 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> HBV preS1 sequence positions 2 to 48, genoytpe D, with Ala substitution in positions 21, 23, 29, 30 <400> 28 Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His 1 5 10 15 Gln Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Asn Thr Ala Ala Ala Asp Trp Asp 20 25 30 Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly 35 40 45

Claims (34)

  1. 하기 일반식을 갖는 B형 간염 바이러스(HBV)의 소수성 변형된 preS-유래 펩티드:
    Hm-P-Rn
    상기 식에서,
    P는 SEQ ID NO. 11 또는 SEQ ID NO. 12의 아미노산 서열, 20 개 이상의 연속적인 아미노산들의 SEQ ID NO. 11 또는 SEQ ID NO. 12의 절단된 부분, 또는 상기 펩티드의 유도체를 포함하는 preS-유래 펩티드이고, 여기서, 상기 유도체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하거나 또는 상기 유도체는 펩티드유사체(peptidomimetic)이고,
    H는 상기 preS-유래 펩티드 P의 소수성 변형으로서, 상기 소수성 변형은 P의 N-말단이고, 아실화 및 소수성 부분의 부가 중에서 선택되고,
    R은 상기 preS-유래 펩티드 P의 C-말단 변형으로서, 분해로부터 상기 preS-유래 펩티드를 보호하고, 또한 상기 R은 아미드, D-아미노산, 변형 아미노산, 고리형 아미노산, 천연 중합체 또는 합성 중합체로부터 선택된 것에 의한 변형이며,
    m은 1 이상이고,
    n은 0 또는 1 이상이다.
  2. 제 1 항에 있어서, H, R, 또는 H 및 R은 링커 또는 스페이서를 통해 P에 결합되는 것인, 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  3. 제 1 항에 있어서, P에 포함되는 SEQ ID NO. 12의 연속적인 아미노산 잔기는 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 9 내지 15, 아미노산 잔기 2 내지 15, 아미노산 잔기 9 내지 18, 아미노산 잔기 2 내지 18, 아미노산 잔기 2 내지 20, 아미노산 잔기 2 내지 21, 아미노산 잔기 5 내지 21, 아미노산 잔기 2 내지 25, 아미노산 잔기 2 내지 30, 아미노산 잔기 2 내지 35, 아미노산 잔기 2 내지 40, 아미노산 잔기 2 내지 45, 및 아미노산 잔기 2 내지 46으로부터 선택되고,
    P에 포함되는 SEQ ID NO. 11의 연속적인 아미노산 잔기는 SEQ ID NO. 11의 아미노산 잔기 2 내지 21, 아미노산 잔기 5 내지 21, 아미노산 잔기 5 내지 15, 및 아미노산 잔기 9 내지 15로부터 선택되며, 또한
    SEQ ID NO. 11 및 SEQ ID NO. 12의 첫번째 아미노산은 아미노산 잔기 2인 것인, 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  4. 제1항에 있어서, P는
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 21 (SEQ ID NO. 13),
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 5 내지 21 (SEQ ID NO. 14),
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 9 내지 15 (SEQ ID NO. 15),
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 15 및 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 16 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열,
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 20 및 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 21 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열,
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 25 및 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 26 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열,
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 30 및 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 31 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열,
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 35 및 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 36 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열 및
    - SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 2 내지 40 및 이에 인접한 SEQ ID NO. 12의 아미노산 잔기 41 내지 48의 유도체를 함유하는 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고,
    여기서, 상기 유도체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하거나 또는 상기 유도체는 펩티드유사체(peptidomimetic)이며,
    SEQ ID NO. 11 및 SEQ ID NO. 12의 첫번째 아미노산은 아미노산 잔기 2인 것인, 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  5. 제1항에 있어서, H는 친유성 측쇄를 갖는 아미노산, 카르복시산, 지방산, 또는 C8 내지 C22 지방산에 의한 아실화에 의한 소수성 변형인 것인, 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  6. 제 5 항에 있어서, H는 미리스토일(C14), 팔미토일(C16) 또는 스테아로일(C18)에 의한 아실화에 의한 소수성 변형인 것인, 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  7. 제1항에 있어서, H는 콜레스테롤, 콜레스테롤의 유도체, 인지질, 당지질, 글리세롤 에스테르, 스테로이드, 세라미드, 이소프렌 유도체, 아다만탄, 파네졸, 지방족 기, 및 폴리방향족 화합물로부터 선택된 소수성 부분의 부가에 의한 소수성 변형인, 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  8. 제1항에 있어서, R은 PEG 또는 글리칸에 의한 변형인 것인, 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 라벨을 더 포함하는 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 라벨은 형광 염료, 방사성 동위원소 및 조영제로부터 선택되는 것인 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 펩티드 또는 단백질에 융합되는 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 펩티드 또는 단백질은 알부민 및 인간 IgG의 Fc 도메인으로부터 선택되는 것인 소수성 변형된 preS-유래 펩티드.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 치료적 유효량으로 포함하며,
    HBV 감염, HDV 감염, 원발성 HBV 감염, 원발성 HDV 감염, B형 간염, D형 간염, 만성 B형 간염, 또는 만성 D형 감염의 치료를 위한 것인 약학적 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 체중 1 kg 당 10 μg 내지 1mg의 범위인 약학적 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 치료적 유효량은 체중 1 kg 당 10 μg 내지 100 μg의 범위인 약학적 조성물.
  16. 제 13 항에 있어서, 피하, 정맥내, 경구, 비강내, 근육 내, 경피, 흡입, 또는 좌약 경로로부터 선택된 투여 경로를 통한 투여용으로 제조되는 것인 약학적 조성물.
  17. 삭제
  18. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 소수성 변형된 preS-유래 펩티드 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하며,
    HBV 감염, HDV 감염, 원발성 HBV 감염, 원발성 HDV 감염, B형 간염, D형 간염, 만성 B형 간염, 또는 만성 D형 감염의 치료를 위한 것인 백신 조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
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