KR20200027033A - 멜라닌을 포함하는 조성물, 및 이를 제조하는 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

멜라닌을 포함하는 조성물, 및 이를 제조하는 방법 및 용도

본 발명은 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물의 제조 및 사용하는 방법에 관한 것이다.

멜라닌은 식물, 동물 및 원생생물 (protista)과 같은 살아있는 유기체의 많은 부분에 널리 분포되어 있고, 일반적으로 흑갈색 (black-brown)의 유멜라닌 (eumelanin) 및 황적색의 (yellow-reddish) 페오멜라닌 (pheomelanins)으로 카테고리화되는 생체거대분자 (biomacromolecule)이다. 유멜라닌은 3,4-디히드록시-L-페닐알라닌 (L-DOPA) 또는 2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아민 (도파민)에서 유래하고, 페오멜라닌은 시스테인 및 글루타티온과 같은 티올기 (-SH) 함유 화합물의 존재 하에 L-DOPA 또는 도파민으로부터 유래한다.

멜라닌은 천연 공급원으로부터, 또는 효소 또는 산화제를 사용하는 인공 합성 방법에 의해 수득될 수 있다.

다양한 생물학적 기능뿐만 아니라 색소 (pigment)로서 UV 복사를 차단하는 기능 때문에 멜라닌, 및 이의 합성 및 응용 방법에 대한 많은 연구가 활발히 수행되고 있다.

멜라닌은 광범위한 전자기 복사선 (electromagnetic radiation)을 흡수하는 광보호 (photoprotection), 감광성 (photosensitization), 금속 이온 킬레이트화 (metal ion chelation), 항생제 (antibiotic), 열조절 (thermoregulation) 및 자유 라디칼 ?칭 (free radical quenching)을 포함하는, 다양한 생물학적 기능을 갖는 것으로 보고되었다. 멜라닌은 광전지 (photovoltaic cell), 센서 (sensors), 광전기(optoelectric) 및 에너지 저장, 광활성 (photoactive) 및 광보호 (photoprotective) 물질, 항산화 물질 (antioxidant material), 생의학 적용 (biomedical applications) 및 화장품 (cosmetics)과 같은 다양한 분야에서 널리 사용된다.

개선된 특성을 갖는 개선된 멜라닌에 대한 필요성이 지속적으로 존재한다.

발명의 간단한 요약

본원에서는 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 분해된 (disassembled) 적층 (stacked) 멜라닌 (melanin) 올리고머 (oligomer)를 포함하는 조성물을 개시한다. 일부 구체예에서, 상기 분해된 적층 올리고머는 피롤-2,3-디카르복실산 (pyrrole-2,3-dicarboxylic acid: PDCA)을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 MelNP의 분해에 의해 생성된다.

일부 구체예에서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 2 내지 약 30 개의 층을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 약 0.3 nm 내지 약 16 nm의 두께를 갖는다.

일부 구체예에서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)에 공유 결합된다. PEG는 예를 들어, 약 0.3 KDa 내지 약 40 KDa의 중량 평균 분자량 (weight average molecular weight)을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 상자성 (paramagnetic) 금속 이온과 복합체화된다. 상기 상자성 금속 이온은 예를 들어, 가돌리늄 (Gd), 철 (Fe), 망간 (Mn), 니켈 (Ni), 구리 (Cu), 에르븀 (Er), 유로퓸 (Eu), 홀뮴 (Ho), 및/또는 크로뮴 (Cr)일 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 조성물은 자기 공명 영상 (MRI) 조영제를 추가로 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 상기 조성물은 약학적 조성물이다.

본원에서는 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 멜라닌-유사 나노입자 (melanin-like nanoparticles: MelNP)에 염기를 첨가하여 MelNP를 분해된 적층 멜라닌 올리고머로 분해하는 단계; 및 산을 첨가하여 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 중화시키는 단계를 포함하는, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 개시한다. 일부 구체예에서, 상기 분해는 pH 9 이상에서 발생한다.

또한, 본원에서는 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 멜라닌-유사 나노입자 (MelNP)에 염기를 첨가하여 10.5 초과의 pH를 수득하는 단계 및 MelNP를 분해된 적층 멜라닌 올리고머로 분해하는 단계를 포함하는, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 개시한다.

일부 구체예에서, 상기 MelNP는 피롤-2,3-디카르복실산 (PDCA)을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 MelNP는 멜라닌 전구체인 도파민으로부터 합성된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 탈산소화 및/또는 질소 퍼지 (purged) 조건 하에서 수행된다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 산소화 조건 하에서 수행된다.

일부 구체예에서, 상기 조성물은 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)의 존재 하에 제조된다. PEG는 예를 들어, 약 0.3 KDa 내지 약 40 KDa의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다.

일부 구체예에서, 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 2 내지 약 30 개의 층을 포함한다. 일부 구체예에서, 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 약 0.3 nm 내지 약 16 nm의 두께를 갖는다.

일부 구체예에서, 상기 방법은 상자성 금속 이온을 분해된 적층 멜라닌 올리고머에 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상자성 금속 이온은 예를 들어, 가돌리늄 (Gd), 철 (Fe), 망간 (Mn), 니켈 (Ni), 구리 (Cu), 에르븀 (Er), 유로퓸 (Eu), 홀뮴 (Ho), 및/또는 크로뮴 (Cr)일 수 있다.

또한, 본원에는 본원에 개시된 상기 조성물을 개체에 도입하여, 개체 (subject)를 영상화 장치에 노출시키는 단계; 및 일 부위 (an area)에 선택적으로 축적된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 검출하는 단계를 포함하는, 개체를 영상화하는 방법이 개시된다. 또한, 본원에는 본원에 개시된 상기 조성물을 개체에 도입하여, 개체를 영상화 장치에 노출시키는 단계; 및 질환 부위에 선택적으로 축적된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환을 영상화하는 방법이 개시된다. 일부 구체예에서, 상기 질환은 종양이다. 일부 구체예에서, 상기 영상화 장치는 MRI이다.

발명의 상세한 설명

조성물, 및 그 제조 및 사용 방법

본원에 사용된, 용어 "멜라닌 (melanin)"은 식물, 동물 및 원생생물과 같은 살아있는 유기체의 많은 부분에 분포하고, 일반적으로 흑갈색의 유멜라닌 및 황적색의 페오멜라닌으로 카테고리화되는 생체거대분자를 의미한다. 유멜라닌은 3,4-디히드록시-L-페닐알라닌 (L-DOPA) 또는 2-(3,4-디히드록시페닐)에틸아민 (도파민)으로부터 유래하고, 페오멜라닌은 시스테인 및 글루타티온과 같은 티올기 (-SH) 함유 화합물의 존재 하에 L-DOPA 또는 도파민으로부터 유래한다. 유멜라닌은 포유동물에서 주로 발견되는 흑색 색소이다.

멜라닌 나노입자는 천연 공급원으로부터 또는 화학적 합성 방법 (멜라닌-유사 나노입자 또는 MelNP)으로 수득될 수 있다. 천연 자원으로부터 수득되는 경우, 이들은 예를 들어, 원심분리 (centrifugation)에 의해 오징어 먹물 (ink of cuttlefish)로부터 회수될 수 있다. 화학적 방법으로 합성되는 경우, 이들은 멜라닌 전구체, 예를 들어 도파민, DOPA, 시스테인 또는 티로신으로부터 합성될 수 있다.

본원에 사용된, 용어 "멜라닌 나노입자 (melanin nanoparticle)" 또는 "멜라닌-유사 나노입자 (melanin-like nanoparticle)"는 나노 규모 직경을 갖는 매우 작은 멜라닌 입자를 지칭한다. 예를 들어, 크기는 약 30 nm 내지 약 600 nm, 약 30 nm 내지 약 400 nm, 약 30 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 100 nm 범위의 평균 또는 중간값 직경일 수 있다. 멜라닌 또는 멜라닌-유사 나노입자를 제조하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 그 방법은 응집된 멜라닌 나노입자 또는 멜라닌 나노입자 폴리머 (polymer)를 생성시킨다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,937,149, US2015/0139914, 및 US2014/0356284를 참조하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 통합된다.

본 개시는 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구체예에서, 올리고머는 피롤-2,3-디카르복실산 (PDCA)을 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, DHI를 포함하는 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물은 MelNP의 분해에 의해 생성된다. MelNP는 DHI, 또는 DHI 및 PDCA의 조합을 포함할 수 있다.

또한, 본원에서는 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 MelNP의 분해에 의해 생성된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 멜라닌-유사 나노입자 (MelNP)에 염기를 첨가하여 MelNP를 적층된 올리고머로 분해하는 단계; 및 산을 첨가하여 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 중화시키는 단계를 포함한다. 또한, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 멜라닌-유사 나노입자 (MelNP)에 염기를 첨가하여 10.5 초과의 pH를 수득하는 단계 및 MelNP를 적층된 멜라닌 올리고머로 분해하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, MelNP는 피롤-2,3-디카르복실산 (PDCA)을 추가로 포함한다.

본원에 사용된, 용어 "분해된 (disassembled)" 또는 "분해 (disassembly)"는 멜라닌 나노입자 또는 MelNP의 집합된 (assembled) 또는 집합 구조 (assembly structure)가 "적층 멜라닌 올리고머 (stacked melanin oligomer)"로 붕해 (disintegrated)되거나 크키가 축소되는 것을 의미한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 비중합 (nonpolymeric) 또는 탈응집 (deaggregated)된다. 5,6-디히드록시인돌 (DHI)의 산화로 생성된 멜라닌 생성물은 평면 (planar) 올리고머로 구성되고, 이들은 평면 구조로 인해 적층되기 쉽고; 적층된 올리고머는 응집되어 본원에 개시된 멜라닌의 입자 특성을 형성한다는 것으로 발견되었다. 대조적으로, 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산 (DHICA)의 산화로 생성된 멜라닌 생성물은 비평면 올리고머로 구성되며며, 이들은 응집되기가 쉬워서 멜라닌의 입자 특성을 형성하도록 적층되지 않는다. 본원에 개시된 MelNP는 도파민의 자발적 (spontaneous) 산화에 의해 합성되기 때문에, MelNP의 기본 올리고머 유닛은 DHI이고, 선택적으로 피롤-2,3-디카르복실산 (PDCA)과 같은, DHI의 산화된 형태이다. 따라서, 도파민의 산화로 생성된 MelNP는 고도로 적층된 올리고머로 구성된다. Panzella et al., Angew. Chem. Int. Ed. 52:12684-12687 (2013), 및 Yu et al., Langmuir 30:5497-5505 (2014)를 참조하고, 이들 각각은 본원에 참조로 통합된다. 일부 구체예에서, 적층된 멜라닌 올리고머는 주로 DHI, 또는 DHI 및 PDCA의 조합이며, 예를 들어 70 % 이상, 80 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상, 또는 99 % 이상이다.

본원에 사용된, "폴리머 (polymer)"는 다수 반복된 모노머 유닛을 포함하는 고분자량의 분자이다. 본원에 사용된, "올리고머 (oligomer)"는 약 3 내지 약 13 개의 모노머 유닛을 포함하는 분자이다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 실질적으로 비중합 또는 탈응집된다.

일부 구체예에서, 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 2 내지 약 30 개의 올리고머 층, 2 내지 약 20 개의 올리고머 층, 또는 2 내지 약 15 개의 올리고머 층을 포함한다.

하나의 올리고머의 두께는 약 0.15 내지 약 0.2 nm이다. 2 개의 올리고머 사이의 적층간 (inter-stacking) 거리는 약 0.34 nm이다. 일부 구체예에서, 적층된 올리고머의 두께는 약 0.3 내지 약 16 nm, 약 0.3 내지 약 10 nm, 또는 약 0.3 내지 약 8 nm, 약 0.3 내지 약 6 nm, 또는 약 0.3 내지 약 5 nm이다.

일부 구체예에서, 염기는 염기성 조건, 예를 들어 약 9 이상의 pH, 약 10 이상의 pH, 10 초과의 pH, 10.5 초과의 pH, 또는 10.5 초과 내지 약 14의 pH를 달성하기 위해 첨가될 수 있다.

염기의 비제한적인 예는 알칼리 금속 히드록시드 (alkali metal hydroxide), 알칼리 토금속 히드록시드 (alkaline earth metal hydroxide), 알칼리 금속 카보네이트 (carbonate), 알칼리 토금속 카보네이트, 알칼리 금속 비카보네이트 (bicarbonate), 알칼리 토금속 비카보네이트, 알칼리 금속 아세테이트 (acetate), 알칼리 금속 포스페이트 (phosphate), 알칼리 금속 알콕시드 (alkoxide)(1 내지 20 개의 탄소 원자), 암모니아 (NH₃), 암모늄 히드록시드 (NH₄OH), 아민 등이다. 일부 구체예에서, 염기는 NaOH, NH₄OH, KOH, Ca(OH)₂, LiOH, K₂CO₃, 메틸아민, 에틸아민 및/또는 디에틸아민일 수 있다.

일부 구체예에서, 산은 염기성 조건을 중화시키기 위해, 예를 들어 분해 반응을 중지시키기 위해 첨가될 수 있다.

산의 비제한적인 예는 할로겐화 수소 (hydrogen halide) 및 이들의 용액과 같은 무기산(예: 불화수소산 (HF), 염산 (HC1), 브롬화수소산 (HBr), 요오드화수소산 (HI); 황산 (H₂SO₄); 질산 (HNO₃); 인산 (H₃PO₄)); 및 카르복실산 (예: 아세트산 (CH₃COOH), 시트르산 (C₆H₈O₇), 포름산 (HCOOH), 글루콘산 (HOCH_2-(CHOH)₄-COOH), 락트산 (CH₃-CHOH-COOH), 옥살산 (HOOC-COOH) 및 타르타르산 (HOOC-CHOH-CHOH-COOH))이다. 일부 구체예에서, 상기 산은 KH₂PO₄이다.

일부 구체예에서, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물은 산소화 조건 하에서 제조된다. 대안적으로, 상기 조성물은 탈산소화 및/또는 질소 퍼지 조건 하에서 제조된다.

일부 구체예에서, 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 카보닐, 아민, 이민, 페놀 및 O-디페놀과 같은 이들의 작용기로 금속과 배위될 수 있다.

일부 구체예에서, 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 예를 들어, 티올 (-SH)-말단 (terminated) 알콕시 폴리에틸렌 글리콜을 첨가함으로써 표면이 개질될 (modified) 수 있다. 구체적으로, 분해된 적층 멜라닌 올리고머가 티올-말단 알콕시 폴리에틸렌 글리콜로 표면-개질되는 경우, 알콕시 폴리에틸렌 글리콜은 친 핵성 (nucleophilic) 티올기와 올리고머의 퀴논 (quinone)과의 1,4-첨가 반응에 의해 분해된 적층 멜라닌 올리고머에 결합하여, 분해된 적층 멜라닌 올리고머의 표면 개질을 초래한다.

또한, 티올-말단 알콕시 폴리에틸렌 글리콜은 대략 300-40000 Da의 중량 평균 분자량을 가질 수 있다.

표면-개질된 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 생물학적 매질 (media)에 용이하게 분산되어 다양한 분야, 특히 생물학적 분야에 응용될 수 있다. 생물학적 매질의 비제한적인 예는 포스페이트 완충 용액 (PBS), 태아 소 혈청 (FBS) 등이다.

본원에는 DHI를 포함하는 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 개체에 도입하여, 개체를 영상화 장치에 노출시키는 단계; 및 일 부위에 선택적으로 축적된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 검출하는 단계를 포함하는, 개체를 영상화하는 방법이 제공된다. 또한, DHI를 포함하는 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 개체에 도입하여, 개체를 영상화 장치에 노출시키는 단계; 및 질환 부위에 선택적으로 축적된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 검출하는 단계를 포함하는, 개체에서 질환을 영상화하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 PDCA를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 질환은 종양이다. 일부 구체예에서, 상기 영상화 장치는 MRI이다.

일부 구체예에서, 본 개시는 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 포함하는, 자기 공명 영상화 (MRI 또는 MR)용 조영제를 제공하며, 상기 조성물은 물에 안정한 분산능 (dispersibility)을 갖는다. 일부 구체예에서, 상자성 금속 이온은 분해된 적층 멜라닌 올리고머에 배위된다. 일부 구체예에서, PEG는 분해된 적층 멜라닌 올리고머에 부착된다.

본원에 사용된, 용어 "자기 공명 영상 (magnetic resonance image)" 또는 "핵 자기 공명 영상 (nuclear magnetic resonance image)"는 자기장 (magnetic field)에서 원자핵 (atomic nucleus)의 자기 모멘트 (magnetic moment)에 대한 특정 외부 에너지의 작용으로 다른 에너지 준위 (energy level)로 전이하는 동안 에너지의 흡수로 인해 발생하는 핵 자기 공명 현상에 기초한 영상화를 의미한다.

본원의 자기 공명 영상화용 조영제를 제공하며, 이는 표적 특이적 영상화할 수 있는 임의의 표면 개질 없이, 본원에 기재된 분해된 적층 멜라닌 올리고머가 상자성 금속 이온과 복합체화되는 경우 표적 특이적 조영제로 사용되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 자기 공명 영상용 조영제는 상자성 금속 이온이 분해된 적층 멜라닌 올리고머와 배위 결합을 형성하는 것을 특징으로 한다.

본원에 사용된, 용어 "상자성 금속 이온 (paramagnetic metal ion)"은 자기 공명 영상을 나타내는 물질을 의미하며, 여기서 내부의 짝을 이루지 않은 스핀은 열 운동으로 인해 무작위로 배향되지만, 자기장에서는 스핀이 미리 결정된 방향으로 정렬될 수 있다. 즉, 평소에는 어떠한 자성 (magnetism)도 보유하지 않지만 외부 자기장이 가해지면 자기장을 향해 자화되는 물질을 의미한다. 이의 예는 가돌리늄 (Gd), 철 (Fe), 망간 (Mn), 니켈 (Ni), 구리 (Cu), 에르븀 (Er), 유로퓸 (Eu), 홀뮴 (Ho) 및 크로뮴 (Cr)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 금속 이온을 포함할 수 있다.

상자성 금속 이온은 분해된 적층 멜라닌 올리고머와 배위 결합을 형성할 수 있다. 상자성 금속 이온이 분해된 적층 멜라닌 올리고머에 배위되는 경우, 상자성 금속 이온과 복합체화된 MelNP보다 강한 T1 단축 효과 (T1 shortening effect)를 나타내므로, T1-강조 영상에서 핵 자기 공명 영상화의 우수한 대비 효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 자기 공명 영상화용 조영제는 산소 존재 하에서 MelNP의 분해로 생성된 분해된 적층 멜라닌 올리고머가 제2철 이온 (ferric ion)과 같은 상자성 금속 이온과 복합체화할 때 T1 대조 향상 능력을 나타내는 것을 특징으로 한다. 용존 산소 (dissolved oxygen)의 존재 하에서 MelNP의 분해로 생성된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머의 경우, 이들은 MelNP (100 nm)보다 높은 T1 대조 향상 능력을 나타내었다. 이들이 꼬리 정맥을 통해 간 종양을 지니는 마우스로 주사되는 경우, 종양에서 주사 24 시간 후 선택적 대조 향상을 나타내었다. 간 종양에서의 선택적 T1 대조 향상을 통해, 간에서 종양의 존재가 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 상자성 금속 이온을 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물에 첨가하여 상자성 금속 이온 및 분해된 적층 멜라닌 올리고머 간에 배위 결합을 형성하는 단계; PEG를 상자성 금속 이온 및 분해된 적층 멜라닌 올리고머의 혼합물에 첨가하는 단계; 및 제조된 조영제를 회수하는 단계를 포함하는, 자기 공명 영상화용 조영제를 제조하는 방법을 제공한다. 분해된 적층 멜라닌 올리고머, 상자성 금속 이온 및 PEG는 상기 기재된 바와 동일하다.

예를 들어, 상자성 금속 이온을 함유하는 용액을 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물에 첨가한 다음, 대략 3 내지 10 분 동안 교반하여 배위 결합을 형성할 수 있다. 상자성 금속 이온으로 제조된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 원심분리로 회수된 후 물에 분산될 수 있다.

본 발명에 따른 자기 공명 영상화용 조영제는 종래의 핵 자기 공명 영상화용 조영제에 비해, 세포독성이 없고 인 비보 (in vivo) 체류 시간이 길어서, MRI 조영제로서 유용하게 적용된다. 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 핵 자기 공명 영상화용 조영제는 Fe₂O₃, MnO, Hollow Mn₃O₄ 와 비교하여 우수한 r₂/r₁을 나타내었고, Gd-DTPA의 그것과 유사한 r₂/r₁을 나타내었다. 또한, Gd-BTPA는 snort 대조 효과를 나타내지만 본 발명에 따른 핵 자기 공명 영상화용 조영제는 인 비보 체류 시간이 길므로, 특정 조직 또는 세포에 대한 부착에 걸리는 시간을 확보하는데 더 효과적이다.

조영제는 혈관, 종양 또는 염증의 외양 (appearance)을 향상시키기 위해 정맥내 주사될 수 있다. MRI는 신체의 모든 부분을 영상화하는데 사용되지만, 종양을 평가하고 심장 및 혈관의 이상을 나타내기 위한, 신경학적 병태, 근육 및 관절 장애에 특히 유용하다.

용어 "샘플 (sample)"은 조직 샘플, 세포 샘플, 유체 샘플 등을 지칭할 수 있다. 개체로부터 샘플을 채취할 수 있다. 상기 조직 샘플은 뇌, 모발 (뿌리 포함), 협측 스왑 (buccal swab), 혈액, 타액 (saliva), 정액 (semen), 근육, 또는 임의의 내부 기관으로부터, 또는 이들 중 임의의 하나와 연관된 암, 전암 (precancerous) 또는 종양 세포를 포함할 수 있다. 유체는 소변, 혈액, 복수 (ascite), 흉막액 (pleural fluid), 척추액 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 신체 조직은 뇌, 피부, 근육, 자궁내막 (endometrial), 자궁 (uterine) 및 경부 (cervical) 조직 또는 이들 중 임의의 하나와 연관된 암, 전암, 또는 종양 세포를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 신체 조직은 뇌 조직 또는 뇌 종양 또는 암이다.

용어 "투여 (administration)"는 본 개시의 조성물을 개체에 도입하는 것을 지칭한다. 일부 구체예에서, 조성물의 투여 경로는 경구 투여이다. 일부 구체예에서, 투여 경로는 정맥내 투여이다. 그러나, 국소 (topical), 피하 (subcutaneous), 복막 (peritoneal), 동맥내 (intraarterial), 흡입 (inhalation), 질 (vaginal), 직장 (rectal), 비강 (nasal), 뇌척수액 (cerebrospinal fluid)으로의 도입 또는 신체 구획으로의 주입 (instillation)과 같은, 임의의 투여 경로가 사용될 수 있다.

본원에 사용된, 용어 "호스트 (host)", "개체 (subject)" 또는 "환자 (patient)"는 인간, 포유동물 (예: 마우스, 래트, 돼지, 고양이, 개 및 말) 및 가금류 (poultry)를 포함한다.

본 개시의 조성물이 투여될 수 있는 전형적인 호스트는 포유 동물, 특히 영장류 (primates), 비인간 또는 인간이다. 수의학 적용의 경우, 광범위한 개체, 예를 들어 축우 (cattle), 양, 염소, 소, 돼지 (swine) 등과 같은 가축 (livestock); 닭, 오리, 거위, 칠면조 등과 같은 가금류; 및 사육된 동물, 특히 개 및 고양이와 같은 애완 동물이 적합할 것이다. 진단 또는 연구 적용을 위해, 설치류 (예: 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류 및 돼지 (예: 교배된 (inbred) 돼지) 등을 포함하는, 광범위한 포유동물이 적합한 개체일 것이다. 용어 "살아있는 개체 (living subject)"는 상기 언급된 개체 또는 살아있는 다른 유기체를 지칭한다. 용어 "살아있는 개체"는 살아있는 개체로부터 절제된 부분 (예: 간 또는 다른 기관)만이 아니라 전체 개체 또는 유기체를 지칭한다.

폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-분해된 적층 멜라닌 올리고머는 각 멜라닌 올리고머에 부착된 PEG를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, PEG는 멜라닌 올리고머에 (예를 들어, 직접 또는 간접적으로) 결합될 수 있다. 예를 들어, PEG는 PEG 상의 티올 또는 아민기를 통해 멜라닌 올리고머에 결합될 수 있다. 일부 구체예에서, PEG-멜라닌 나노입자는 5 내지 50 개의 PEG를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, PEG는 선형 PEG, 다중팔(multi-arm) PEG, 분지형 (branched) PEG 및 이들의 조합일 수 있다. PEG의 중량 평균 분자량은 약 0.3 kDa 내지 약 40 kDa, 약 1 kDa 내지 40 kDa, 약 1 kDa 내지 30 kDa, 약 1 kDa 내지 20 kDa, 약 1 kDa 내지 12 kDa, 약 1 kDa 내지 10 kDa, 또는 약 1 kDa 내지 8 kDa일 수 있다. PEG 모이어티와 관련하여 사용되는 경우, 단어 "약 (about)"은 대략적인 평균 분자량을 나타내며 주어진 폴리머 제조물에서 일반적으로 특정 분자량 분포가 있을 것이라는 사실을 반영한다.

대안적으로, 하나 이상의 PEG는 n-MEG, 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리(프로필렌 푸마레이트-코-에틸렌 글리콜)(P(PF-co-EG)), 폴리아크릴아미드, 폴리펩티드, 폴리-N-치환된 글리신 올리고머 (폴리펩토이드 (polypeptoids)) 등을 비롯하여 일반적으로 히알우론산 (HA), 알기네이트, 키토산, 아가로오스, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 덱스트란, 및 이들의 임의의 조합에 더하여 이들 각각의 유도체 (derivative)를 포함하는 천연 유래 폴리머로 대체될 수 있다.

일부 구체예에서, PEG-분해된 적층 멜라닌R 올리고머는 검출 가능한 MRI 신호 (signal)를 갖는 MRI 작용제 (agent)를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머 상에 배치된 (예를 들어, 직접 또는 간접적으로) MRI 작용제의 양 또는 수는 약 1 내지 50 개의 MRI 작용제일 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 MRI 작용제의 전부 또는 일부는 PEG 또는 PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머 상에 직접 배치될 수 있다. 다시 말해서, MRI 작용제가 Gd인 경우, Gd는 PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머에 직접 부착될 수 있고 및/또는 DOTA와 같은 링커 화합물 (예: 킬레이터)을 통해 PEG에 부착될 수 있다 (예: 말레이미드 (maleimide) 연결을 통해 (하기 참조)). 일부 구체예에서, 모든 MRI 작용제는 DOTA와 같은, 하나 이상의 링커를 통해 PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머 표면에 간접적으로 부착된다.

MRI 작용제는 Gd, 산화철 (iron oxide), 상자성 화학 교환 포화 전이 (paramagnetic chemical exchange saturation transfer: CEST) 작용제, ¹⁹F 활성 물질, 망간 또는 T1 또는 T2를 단축 또는 연장시키는 물질, 및 이들의 조합일 수 있다. Gd MRI 작용제는 폴리머 킬레이터 내의 DOTA-Gd, DTPA-Gd, Gd와 같은 화합물일 수 있다. 산화철 MRI 작용제는 덱스트란 또는 다른 안정화 층을 갖거나 갖지 않는, 소형 상자성 산화철 (small paramagnetic iron oxide: SPIO) 또는 초소형 (ultrasmall) SPIO와 같은 화합물일 수 있다. 상자성 CEST MRI 작용제는 란타미드 (lanthamide) 복합체와 같은 화합물일 수 있다.

MRI 작용제는 말레이미드 연결, NHS 에스테르, 클릭 화학 (click chemistry), 또는 다른 공유 또는 비공유 접근법 (approach), 또는 이들의 조합과 같은 연결을 통해 PEG 표면에 연결될 수 있다.

일부 구체예에서, PEG-멜라닌 올리고머는 영상화를 위해 방사성표지 (radiolabel)를 필요로 하지 않는다. 대안적인 구체예에서, PEG-멜라닌 나노입자는 이미지화를 위한 방사성표지를 포함할 수 있다. 예시적인 구체예에서, 방사성 표지는 ⁶⁴Cu, ¹²⁴I, ^76/77Br, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ⁶⁸Ga, ¹⁸F, ¹¹C, ¹²⁵I, ¹²⁴I, ¹³¹I, ¹²³I, ³²Cl, ³³Cl, ³⁴Cl, ⁶⁸Ga, ⁷⁴Br, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ⁷⁸Br, ⁸⁹Zr, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁹⁰Y, ⁸⁶Y, ¹⁷⁷Lu, 또는 ¹⁵³Sm 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 또한, PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머는 다른 작용제 (예를 들어, 화학적 또는 생물학적 작용제)를 포함할 수 있으며, 상기 작용제는 PEG-멜라닌 올리고머 상에 간접적으로 또는 직접적으로 배치될 수 있다. 특히, 프로브는 표적에 상응하는 질환, 병태 또는 관련 생물학적 사건을 영상, 검출, 연구, 모니터링, 평가, 치료 및/또는 스크리닝하는데 사용할 수 있는, 약물, 치료제, 방사능 작용제 (radiological agent), 화학성 작용제 (chemological agent), 소분자 약물, 생물학적 작용제 (예: 펩티드, 단백질, 항체, 항원 등) 및 이들의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, 상기 작용제는 이의 목적을 성취하기 위해 유효한 양 (예를 들어, 치료학적으로 유효한 양)으로 포함된다.

일부 구체예에서, 상기 방법의 단계는 결정된 간격으로 반복될 수 있으므로 질환의 위치 및/또는 크기가 시간 및/또는 치료의 함수로서 모니터링될 수 있다. 특히, PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머는 화학요법 또는 다른 치료 (예를 들어, 약물 사용)를 겪고 있는 호스트에서 사용하여 치료에 대한 질환 또는 종양의 반응을 시각화하는데 도움을 줄 수 있다. PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머는 전형적으로 치료 전에, 및 화학요법, 방사선요법 등 동안 주기적으로 (예: 매일, 매주, 매월, 이들 사이의 간격 등) 종양 크기를 모니터링하기 위해 시각화되고 크기화된다. 다른 표지된 프로브는 유사한 방식으로 사용될 수 있다.

분해된 적층 멜라닌 올리고머 또는 이의 PEG-개질된 조성물을 포함하는 조성물을 관심 있는 세포 또는 조직으로 흡수시키기 위한 유효한 양은, 예를 들어 호스트의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 이용된 특정 프로브의 배설 속도; 치료 기간; 이용된 특정 조성물과 복합적으로 또는 동시에 (coincidental) 사용되는 다른 약물의 존재; 및 의학 기술분야에서 잘 알려진 요인을 포함하는, 다양한 요인에 의존할 수 있음을 유의해야 한다.

제형(Dosage Forms)

본 개시의 구체예는 본원에 언급된 하나 이상의 제형에 포함될 수 있다. 약학적 조성물의 유닛 제형 ("조성물"은 예를 들어 PEG로 표지된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 적어도 포함함)는 환자에게 경구, 점막 (예: 비강, 설하, 질, 협측 또는 직장), 비경구 (예: 근육내, 피하, 정맥내, 동맥내 또는 볼루스 (bolus) 주사), 국소 또는 경피 투여용으로 적합할 수 있다. 제형의 예는 정제; 당의정 (caplet); 캡슐제(예: 경질 젤라틴 캡슐 및 연질 탄성 젤라틴 캡슐); 약포 (cachet); 트로키제; 로젠지제 (lozenges); 분산제; 좌제; 연고제 (ointment); 카타플라즈마제 (cataplasm)(습포제 (poultice)); 페이스트제; 산제; 드레싱; 크림; 플라스타 (plaster); 용액; 패치; 에어로졸 (예: 비강 스프레이 또는 흡입기); 겔; 현탁액 (예: 수성 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 액상 에멀젼), 용액, 및 엘릭서제를 포함하는, 환자에게 경구 또는 점막 투여용으로 적합한 액상 제형; 환자에게 비경구 투여용으로 적합한 액상 제형; 및 환자에게 비경구 투여용으로 적합한 액체 제형을 제공하도록 재구성될 (reconstituted) 수 있는 멸균 고체 (예: 결정형 (crystalline) 또는 무정형(amorphous) 고체)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 개시 조성물 제형의 조성물, 형상 (shape) 및 유형은 전형적으로 이들의 용도에 따라 변한다. 예를 들어, 비경구 제형은 동일한 병태 또는 장애를 치료하는데 사용되는 경구 제형보다 적은 양의 활성 성분을 함유할 수 있다. 본 개시에 포함되는 특정 제형이 서로 상이한, 이들 및 다른 방식은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton, Pa. (1990) 참조).

본 개시 조성물의 전형적인 조성물 및 제형은 하나 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 부형제는 약학 (pharmacy) 또는 약료 (pharmaceutics) 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 적합한 부형제의 비제한적인 예가 본원에 제공된다. 특정 부형제가 조성물 또는 제형으로 혼입되기에 적합한지의 여부는 제형이 환자에게 투여되는 방식을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 당해 기술분야에 잘 알려진 다양한 요인에 의존한다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제와 같은 경구 제형은 비경구 제형으로 사용하기에 적합하지 않은 부형제를 함유할 수 있다. 특정 부형제의 적합성은 또한 제형의 특정 활성 성분에 의존할 수 있다. 예를 들어, 일부 활성 성분의 분해 (decomposition)는 락토오스와 같은 일부 부형제에 의해, 또는 물의 노출에 의해 가속화될 수 있다. 1 차 또는 2 차 아민을 포함하는 활성 성분은 이러한 가속화된 분해에 특히 민감하다.

본 개시는 활성 성분이 분해되는 속도를 감소시키는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있는, 본원 개시의 조성물 및 제형을 포함한다. 본원에서 "안정화제 (stabilizer)"로 지칭되는 이러한 화합물은 항산화제 (예: 아스코르브산, pH 완충제 또는 염 완충제)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 개시의 약학적 조성물 또는 제형은 하나 이상의 용해도 조절제 (solubility modulator), 예를 들어 소듐 클로리드, 소듐 술페이트, 소듐 또는 포타슘 포스페이트, 또는 유기산을 함유할 수 있다. 예시적인 용해도 조절제는 타르타르산이다.

본원에 사용된, "약학적 조성물 (pharmaceutical composition)"은 이에 제한되지는 않으나, 담체, 안정화제, 희석제 (diluent), 붕해제 (disintegrant), 현탁화제 (suspending agent), 증점제 (thickening agent), 결합제 (binder), 항균제 (antimicrobial agent), 항균 보존제 (antimicrobial preservative), 항산화제 (antioxidant) 및/또는 완충제 (buffering agent)와 같은, 약학적으로 허용가능한 다른 화학 성분을 갖는, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 지칭한다. 약학적 조성물은 개체에게 칼슘 락테이트 (calcium lactate)의 투여를 용이하게 한다.

"약학적으로 허용가능한 염 (Pharmaceutically acceptable salt)"은 유리 염기의 생물학적 효과 및 특성을 보유하고 염산 (hydrochloric acid), 브롬화수소산 (hydrobromic acid), 황산 (sulfuric acid), 질산 (nitric acid), 인산 (phosphoric acid), 메탄술폰산 (methanesulfonic acid), 에탄술폰산 (ethanesulfonic acid), p-톨루엔술폰산 (p-toluenesulfonic acid), 살리실산 (salicylic acid), 말산 (malic acid), 말레산 (maleic acid), 숙신산 (succinic acid), 타르타르산 (tartaric acid), 시트르산 (citric acid) 등과 같은 무기 또는 유기산과의 반응으로 수득되는 염을 지칭한다.

본 개시의 구체예는 표지된 프로브 (예를 들어, PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머), 이의 약학적으로 허용가능한 염을 생리학적으로 허용가능한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학적 성분과 함께 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 약학적 조성물의 하나의 목적은 개체 (예를 들어, 인간)에게 표지된 프로브 (예를 들어, PEG-분해된 적층 멜라닌 올리고머)의 투여를 용이하게 하는 것이다.

본 개시의 구체예는 염일 수 있고 이들 염은 본 개시의 범위 내에 있다. 본원에서 임의의 화학식 화합물에 대한 참조는 달리 지시되지 않는 한 이의 염에 대한 참조를 포함하는 것으로 이해된다. 본원에 이용된, 용어 "염(들) (salt(s))"은 무기 및/또는 유기 산 및 염기로 형성된 산성 및/또는 염기성 염을 나타낸다. 또한, 본 개시의 구체예가 염기성 모이어티 및 산성 모이어티를 둘 모두 함유하는 경우, 양쪽성 이온 (zwitterion)("분자내 염 (inner salt)")이 형성될 수 있고 본원에 사용된 용어 "염(들)"에 포함된다. 다른 염이 또한 예를 들어 제조 동안 이용될 수 있는 단리 (isolation) 또는 정제 단계에서 유용하지만, 약학적으로 허용가능한 (예를 들어, 비독성, 생리학적으로 허용가능한) 염이 바람직하다. 활성 화합물의 화합물 염은 예를 들어, 염이 석출되는 것과 같은 매질 (medium) 또는 수성 매질에서 활성 화합물을 산 또는 염기의 양 (예: 등가량 (equivalent amount))과 반응시킨 후 동결건조하여 형성될 수 있다.

염기성 모이어티를 함유하는 본 개시의 구체예는 다양한 유기 및 무기산과의 염을 형성할 수 있다. 예시적인 산부가염 (acid addition salt)은 아세테이트 (예: 아세트산 또는 트리할로아세트산 (trihaloacetic acid), 예를 들어 트리플루오로아세트산으로 형성되는 것), 아디페이트 (adipate), 알기네이트 (alginate), 아스코르베이트 (ascorbate), 아스파르테이트 (aspartate), 벤조에이트 (benzoate), 벤젠술포네이트 (benzenesulfonate), 비술페이트 (bisulfate), 보레이트 (borate), 부티레이트 (butyrate), 시트레이트 (citrate), 캄포레이트 (camphorate), 캄포술포네이트 (camphorsulfonate), 시클로펜탄프로피오네이트 (cyclopentanepropionate), 디글루코네이트 (digluconate), 도데실술페이트 (dodecylsulfate), 에탄술포네이트 (ethanesulfonate), 푸마레이트 (fumarate), 글루코헵타노에이트 (glucoheptanoate), 글리세로포스페이트 (glycerophosphate), 헤미술페이트 (hemisulfate), 헵타노에이트 (heptanoate), 헥사노에이트 (hexanoate), 히드로클로리드 (hydrochloride)(염산으로 형성), 히드로브로미드 (hydrobromide)(브롬화수소로 형성), 히드로요오디드 (hydroiodide), 2-히드록시에탄술포네이트 (2-hydroxyethanesulfonate), 락테이트 (lactate), 말레에이트 (maleate)(말레산으로 형성), 메탄술포네이트 (methanesulfonate)(메탄술폰산으로 형성), 2-나프탈렌술포네이트 (2-naphthalenesulfonate), 니코티네이트 (nicotinate), 니트레이트 (nitrate), 옥살레이트 (oxalate), 펙티네이트 (pectinate), 퍼술페이트 (persulfate), 3-페닐프로피오네이트 (3-phenylpropionate), 포스페이트 (phosphate), 피크레이트 (picrate), 피발레이트 (pivalate), 프로피오네이트 (propionate), 살리실레이트 (salicylate), 숙시네이트 (succinate), 술페이트 (sulfate)(예: 황산으로 형성된 것), 술포네이트 (sulfonate)(예: 본원에 언급된 것), 타르트레이트 (tartrate), 티오시아네이트 (thiocyanate), 톨루엔술포네이트 (toluenesulfonates)(예: 토실레이트 (tosylate)), 운데카노에이트 (undecanoate) 등을 포함한다.

산성 모이어티를 함유하는 본 개시의 구체예는 다양한 유기 및 무기 염기와의 염을 형성할 수 있다. 예시적인 염기성 염은 암모늄 염, 알칼리 금속염 (예: 소듐, 리튬, 및 포타슘 염), 알칼리 토금속염(예: 칼슘 및 마그네슘 염), 벤자틴 (benzathine), 디시클로헥실아민 (dicyclohexylamine), 히드라바민 (hydrabamine)(N,N-비스(디히드로아비에틸)에틸렌디아민으로 형성), N-메틸-D-글루카민 (N-methyl-D-glucamine), N-메틸-D-글루카미드 (N-methyl-D-glucamide), t-부틸 아민과 같은 유기 염기와의 염 (예: 유기 아민), 및 아르기닌 (arginine), 리신 (lysine) 등과 같은 아미노산과의 염을 포함한다.

염기성 질소-함유 기는 저급 알킬 할라이드 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로리드, 브로미드 및 요오디드), 디알킬 술페이트 (예를 들어, 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트), 장쇄 할라이드 (예를 들어, 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로리드, 브로미드 및 요오디드), 아르알킬 할라이드 (예를 들어, 벤질 및 페네틸 브로미드), 및 기타와 같은 작용제로 4 차화될 (quaternized) 수 있다.

본 개시 화합물의 용매화물 (Solvate)이 또한 본원에서 고려된다. 화합물의 용매화물은 바람직하게는 수화물 (hydrate)이다.

제형에서 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물의 양은 다양한 요인에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 본 개시의 조성물의 일일 총 사용량은 담당의 (attending physician) 또는 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 다른 담당 전문가에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다. 임의의 특정 호스트에 대한 소정의 유효 투여량 수준은 예를 들어, 이용된 특정 조성물의 활성; 이용된 특정 조성물; 호스트의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시간; 투여 경로; 이용된 특정 화합물의 배출 속도; 치료 기간; 이용된 특정 조성물과 복합적으로 또는 동시에 사용되는 다른 약물의 존재; 및 의학 분야에서 잘 알려진 요인들을 포함하는, 다양한 요인에 의존할 것이다. 예를 들어, 바람직한 효과를 달성하고 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시키는데 필요한 수준보다 낮은 수준으로 조성물의 투여량을 시작하는 것은 당해 기술분야의 통상의 기술 내에 있다.

키트

본 개시는 또한 약학적으로 허용가능한 담체 및 본 개시의 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 포함하는 포장된 (packaged) 조성물 또는 약학적 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, 상기 포장된 조성물 또는 약학적 조성물은 본 개시에 따라 표지된 프로브를 생성하는데 사용되는 반응 전구체 (precursor)를 포함한다. 본 개시에 의해 제공되는 다른 포장된 조성물 또는 약학적 조성물은 표지된 프로브를 사용하여 호스트, 또는 호스트 샘플 (예를 들어, 세포 또는 조직)을 영상화하기 위한 지시사항 (instructions) 중 하나 이상을 포함하는 표시 (indicia)를 추가로 포함하며, 이는 암, 멜라닌 관련 질환, 및 생물학적 관련 병태를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 병태의 지표 (indicator)로 사용될 수 있다.

본 개시의 구체예는 이에 제한되지 않지만, 분해된 적층 멜라닌 올리고머 및 안내 (direction)(이의 사용을 위한 서면 설명서)를 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 상기 열거된 성분은 본원에 기재된 바와 같이 모니터링되는 특정 생물학적 병태에 맞추어 질 수 있다. 키트는 상기 열거된 성분의 다양한 조합을 호스트 세포 또는 호스트 유기체에 투여하기 위해 당해 기술 분야에 알려진 적절한 완충제 및 시약 (reagent)을 추가로 포함할 수 있다. 영상화제 및 담체는 용액 또는 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 키트의 영상화제 및 담체가 동결건조된 형태인 경우, 키트는 선택적으로 멸균되고 생리학적으로 허용가능한 재구성 매질, 예를 들어 물, 식염수, 완충 식염수 등을 함유할 수 있다.

도 1. 실험 스킴 (scheme) 1. 멜라닌-유사 나노입자 (MelNP)에 대한 pH-조절된 분해 과정.
도 2. MelNP의 분해로 인한 프로토분자 (protomolecule) 및 (B) 산소의 존재 하에서 pH-조절된 분해 과정에 의해 생성된 산화된 프로토분자의 TEM 영상; (C) (A) MelNP의 분해로 인한 프로토분자 및 (B) 산소의 존재 하에 분해 과정에 의해 생성된 산화형 프로토분자의 AFM 영상; (E) 프로토분자 및 (F) MelNP의 분해로부터 생성된 산화형 프로토분자의 높이 분석.
도 3. 실험 스킴 2.
도 4. (A) PBS에서 PEG-프로토분자-Fe³⁺의 분산 안정성. Fe³⁺ 이온으로 킬레이트화한 후, PEG-프로토분자-Fe³⁺ 및 PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺는 PBS에서 안정한 분산 거동을 나타내었다. (B) PEG-프로토분자-Fe³⁺ 및 PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺의 유체역학적 반경.
도 5. 다양한 농도를 갖는 (A) Fe³⁺-MelNP (~100 nm 반경)-PEG, (B) PEG-프로토분자-Fe³⁺, (C) PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺의 T1 MR 영상.
도 6. PEG-MelNPs-Fe³⁺, PEG-프로토분자-Fe³⁺ 및 PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺의 주사 후 간 종양을 지닌 마우스의 T1 강조 MRI.
도 7. PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺의 주사 후 간 종양을 지닌 마우스의 T1 강조 MRI.
도 8. 계층적으로 집합된 세피아 유멜라닌의 pH-조절된 분해 및 동시 분해/산화의 개략도 (Schematic illustration).
도 9. (a) 세피아 유멜라닌에 대한 pH-조절된 분해 (흑색 경로) 및 동시 분해/산화 과정 (청색 경로)의 실험 스킴, (b) 세피아 유멜라닌, (c) 부분적으로 분해된 세피아 입자, (d) 세피아 입자로부터 분해된 서브유닛 및 (e) 산화형 서브유닛의 TEM 영상. 투석에 의해 MW < 2000의 용해된 염 및 올리고머 종을 제거한 후 세피아 유멜라닌의 비산화형 서브유닛의 (f) 태핑 모드 AFM 높이 영상 및 (g) 높이 히스토그램. (h) 모 세피아 및 그의 비산화 서브유닛과 비교한 산화형 서브유닛의 CP-MAS ¹³C 고체-상태 NMR 스펙트럼. 하단 컬럼은 150-220 ppm 범위의 확대 스펙트럼 (magnified spectra)을 나타낸다. 화살표는 세피아 서브유닛의 산화적 부분 분해로 인한 피롤 카르복실산의 카보닐 공명에 상응하는 180 내지 185 ppm 범위의 특징적인 피크를 나타낸다. MW < 2000의 용해된 염 및 올리고머 종을 제거한 후 산화형 서브유닛의 (i) 태핑 모드 AFM 높이 영상 및 (j) 높이 히스토그램.
도 10. (a) 합성 멜라닌-유사 나노입자 (MelNP), (b) 부분적으로 분해된 MelNP, 및 (c) MelNP로부터 분해된 서브유닛의 TEM 영상.
도 11. 구조적 변경의 함수로서 세피아 유멜라닌의 UV-vis 흡수 특성. (a) 모 입자에 대한 세피아 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 UV-vis 흡수 스펙트럼; 각 용액의 중량 농도는 등가적이다. (b) 투석을 통해 올리고머 유닛 분획 (MW < 2000)을 제거하기 전후 세피아의 pH-조절된 분해로 인한 서브유닛의 UV-vis 흡수 스펙트럼. (c) 투석을 통해 산화형 올리고머 유닛 분획 (MW < 2000)을 제거하기 전후 세피아의 동시 분해/산화로 인한 산화형 서브유닛의 UV-vis 흡수 스펙트럼.
도 12. 구조적 변경의 함수로서 세피아 유멜라닌의 방출 스펙트럼. 세피아 서브유닛 (서브유닛), 산화형 서브유닛 (Ox-서브유닛) 및 모 입자 (세피아)의 (a) UV-vis 흡수 및 (b) 방출 스펙트럼. 서브유닛은 세피아의 분해로 수득하였고, Ox-서브유닛은 세피아의 동시 분해/산화에 의해 수집되었다. 방출 스펙트럼에 대해, 314 nm에서 모든 샘플의 흡광도는 (a)에 나타낸 바와 같이 농도를 조절하여 동등 (equivalent)하도록 조정되었다. 314 nm에서 여기 (excitation)로 방출 스펙트럼을 보정하였다. 형광 재흡수 (fluorescence reabsorption)를 최소화하기 위해 샘플의 방출 피크와 일치하는 파장에서의 흡광도가 0.1 미만이 될 때까지 각 샘플의 농도를 고도로 희석시켰다. 삽도 (inset)는 등가 중량 농도에서 세피아 및 그 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 방출 스펙트럼을 나타낸다. 또한 구조적 변경의 함수로서 방출 강도를 나타내었다. 크기-선택된 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 (c) UV-vis 흡수 및 (d) 방출 스펙트럼. 유사한 방식으로, 314 nm의 여기에서 방출 스펙트럼을 수집하기 위한 농도를 조절함으로써 314 nm에서 모든 샘플의 흡광도를 동등하도록 조정하였다. 형광 재흡수를 최소화하기 위해 샘플의 방출 피크와 일치하는 파장에서의 흡광도가 0.1 미만이 될 때까지 각 샘플의 농도를 고도로 희석시켰다. (e) (c)에 나타낸 방출 스펙트럼에 상응하는 표준화된 (Normalized) 여기 스펙트럼. 크기-선택된 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 여기 스펙트럼을 각 방출 피크의 최대 파장에서 취하였다. 여기 스펙트럼은 314 내지 355 nm 범위의 특징적인 피크를 나타낸다. 스펙트럼은 약 314-355 nm의 피크에서 표준화된다. f) 산화 전후 올리고머 세피아 서브유닛 분획의 표준화된 방출 스펙트럼. 단리된 올리고머 유닛 분획은 산소가 용해된 물에서 pH를 증가시킴으로써 선택적으로 산화됨을 주목한다. 올리고머 분획 및 산화된 생산물에 대한 314 nm에서의 흡광도는 농도를 조절함으로써 동등하도록 조정되었다. 314 nm에서의 여기로 스펙트럼을 보정하였다. 삽도는 표준화되지 않은 방출 스펙트럼을 나타내며, 이는 올리고머 서브유닛 분획의 방출 강도가 산화에 의해 약간 감소됨을 나타낸다. (g) 올리고머 서브유닛 분획 및 산화된 생산물의 표준화된 여기 스펙트럼. 각 방출 피크의 최대 파장에서 스펙트럼을 취하였다. 스펙트럼은 314 nm 부근의 피크에서 표준화된다.
도 13. (a) 적층된 올리고머를 포함하는 모 입자, 비산화형 서브유닛 및 산화형 서브유닛 분획 (MW > 2000)과 비교하여 산화된 세피아 서브유닛에 의해 광생성된 수퍼옥시드 라디칼의 상대적 양에 대한 시간 프로파일 및 (b) 비방사성 조건 하에서 이들의 비교 결과. (c) 적층된 올리고머를 포함하는 이들의 모 입자, 비산화성 서브유닛 및 산화성 서브유닛 분획 (MW > 2000)과 비교하여 산화된 세피아 서브유닛에 의해 광생성된 히드록실 라디칼의 상대적인 양에 대한 시간 프로파일 및 (d) 비방사성 조건 하에서 이들의 대조군 실험 결과.
도 14. 유멜라닌의 야누스 거동의 제안된 메커니즘.
도 15. (a) pH 9.5 및 (b) pH 12.5를 갖는 pH-조절된 분해 동안 부분적으로 분해된 세피아 유멜라닌의 TEM 영상.

실시예

실시예 1

실험 세부 사항

MelNP의 합성. 180 mg의 도파민 히드로클로리드 (Aldrich Chemical)를 45 mL의 탈이온수 (deionized water)에 용해시켰다. NaOH (670 μL, 1 N) 용액을 50 ℃에서 격렬히 교반하면서 도파민 히드로클로리드 용액에 첨가하였다. 5 시간 후, MelNP를 단리하고 수 회 원심분리 (centrifugation) (10 분 동안 4000 rpm)/ 탈이온수에서 재분산 (redispersion )하여 정제하였다.

MelNP로부터 분해된 적층 멜라닌 올리고머 (프로토분자 (protomolecule)) 및 산화형 (oxidized) 프로토분자의 제조. 3.5 mL의 NaOH 용액 (1 M)을 N₂ 퍼지 하에서 1 mL의 MelNP 현탁액 (1 mg/mL)에 첨가하였다. 용존 O₂를 제거하기 위해 MelNP 현탁액 및 NaOH 용액을 20 분 동안 N₂ 로 사전-퍼지하였다. 12 시간 후, 5 mL의 탈산소화된 KH₂PO₄ 용액 (1 M)을 현탁액에 첨가하여 용액 pH를 중화시키고 주위 환경 하에서 생성된 생산물의 추가적인 pH-유도 산화를 방지하였다. N₂ 퍼지를 제외하고 상기 기재한 바와 동일한 방식으로 MelNP의 산화 과정을 5 일 동안 진행하였다.

PEG-프로토분자-Fe ³⁺ 의 제조. 산소를 제거하기 위해 5 mL의 MelNP (4 mg/mL)를 질소 가스로 20 분 동안 사전-퍼지하였다. 26 mg의 mPEG-SH (M.W. 2000)를 MelNP 현탁액에 첨가한 후, 2 mL의 탈산소화된 NaOH 용액 (1 M)을 현탁액에 첨가하였다. 1 시간 후, 2.8 mL의 탈산소화된 KH₂PO₄ 용액 (1 M)을 현탁액에 첨가하였다. 12 시간 동안의 투석 (MWCO 2000)을 통해, 현탁액에 용해된 염을 제거하였다. 염화철 (Iron chloride) 용액을 페길화된 (PEGylated) 서브유닛에 첨가하였다. Fe³⁺ 및 멜라닌 서브유닛 간의 중량비는 0.1:1 내지 10:1의 범위였다. 염화철 용액에 노출시킨 후, 페길화된 프로토분자 현탁액을 원심분리 튜브 (MWCO = 3 KDa)로 수 회 원심분리하였다.

PEG-산화형 프로토분자-Fe의 제조. 5 mL의 MelNP 현탁액 (4 mg/Ml)에 26 mg의 mPEG-SH (M.W. 2000)를 첨가한 후, 2 mL의 NaOH 용액 (1 M)을 추가로 첨가하였다. 1 시간 후, 2.8 mL의 KH₂PO₄ 용액 (1 M)을 현탁액에 첨가하였다. 12 시간 동안의 투석 (MWCO 2000)을 통해, 현탁액에 용해된 염을 제거하였다. 염화철 용액을 페길화된 산화형 서브유닛에 첨가하였다. Fe³⁺ 및 멜라닌 산화형 서브유닛 간의 중량비는 0.1:1 내지 10:1의 범위였다. 염화철 용액에 노출시킨 후, 페길화된 산화형 서브유닛 현탁액을 원심분리 튜브 (MWCO = 3 KDa)로 수 회 원심분리하였다.

PEG-프로토분자-Fe 및 PEG-산화형 프로토분자-Fe의 특성 규명(Characterization). PBS에 24 시간 동안 분산시킨 후, PEG-서브유닛-Fe 및 PEG-산화형 서브유닛-Fe의 분산 안정성을 측정하였다. 이들은 7 일 이내에 PBS에서 어떠한 응집 (aggregation)도 나타내지 않았다. PEG-서브유닛-Fe 및 PEG-산화형 서브유닛-Fe의 크기 분포를 입자 크기 분석기 (Mavern, Zetasizer Nano ZS90)를 통한 동적 광산란 (dynamic light scattering: DLS)으로 결정하였다.

동물 모델의 제조. 6 주령의 수컷 BALB/C 누드 마우스를 Orient Bio (Seoul, Korea)로부터 구매하였다. 모든 동물 연구는 Samsung Biomedical Research Institute (Seoul, Korea)의 동물 관리 및 사용위원회 (institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인 받았다. 인간 HCC 간 종양 세포주 (HepG2, ATCC)를 사용하여 동소이식 (Orthotopic) 간 종양 모델을 생성하였다. HepG2 이들 세포는 10 % 태아 소 혈청 (Invitrogen) 및 1 % 항생제 (ThermoFisher)를 갖는 최소 필수 배지 (Minimum Essential Medium)로 유지하였다. 세포를 37 ℃ 및 5 % CO₂에서 배양하고, 0.25 % 트립신/EDTA (ThermoFisher)로 수확하였다. 수확된 세포 (1x10⁶ HepG2 세포)를 마트리겔 (matrigel)을 갖는 10 μl HBSS에 현탁하였다(1:1). 세포를 샘플링한 후, 안면 마스크와 함께 0₂/공기 가스 (3:7 비율)의 혼합물에서 2 % 이소플루란 (isoflurane)을 호흡시켜 마우스를 완전히 마취시키고 마우스를 간에 노출시켰다. 마트리겔을 갖는 혼합 세포를 천천히 간으로 주사하였다. 4-6 주 후, MR을 사용하여 종양 크기를 확인하였다.

인 비보 MR 이미지. MR 영상은 하기 방법으로 수득하였다. 마우스를 5 % 이소플루란을 사용하여 먼저 마취시킨 후, 안면 마스크를 사용하여 0₂/공기 가스 (3:7)의 혼합물에서 1.5-2 % 이소플루란으로 마취를 유지시켰다. 순환수 온난 패드 (circulating water warming pad)를 사용하여 체온을 36±1 ℃로 유지시키고 전체 스캔 시간 동안 호흡 속도를 일관되게 모니터링하였다. 주사 전 MR 영상을 수득한 후, 꼬리 정맥을 통해 샘플 (체중 kg 당 20 mg의 샘플, 체중 kg 당 80 mg의 PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺)을 정맥주사한 후 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 4 시간 및 24 시간에 주사 후 MR 영상화를 수행하였다.

100 μs 라이즈-타임 (rise-time)으로 400 mT/m까지 공급할 수 있는 20 cm 그라디언트 세트가 장착된 7T/20 MR 시스템 (Bruker-Biospin, Fallanden, Switzerland) 상에서 모든 인 비보 MR 영상화를 수행하였다. 신호를 여기 (excitation)시키고 수신하기 위해 직교 부피 코일 (quadrature volume coil)(35 mm i.d.)을 사용하였다. 호흡 게이팅 (respiratory gating)을 갖는 고속 스핀-에코 T1-강조 MRI 시퀀스 (TR/TE = 380/7.7 ms, NEX = 6, 에코 트레인 길이 = 2, 슬라이스 두께 1 mm 및 14 개의 슬라이스를 갖는 100X100 mm² 평면내 해상도) 및 T2-강조 MRI 시퀀스 (TR/TE = 2000/45 ms, NEX = 3, 슬라이스 두께 1 mm 및 14 개의 슬라이스를 갖는 133X133 mm² 평면내 해상도)를 사용하여 각각의 마우스 간으로부터 MR 영상을 수득하였다.

결과

도 1 (실험 스킴 1)은 멜라닌-유사 나노입자 (MelNP)에 대한 pH-조절된 분해 과정을 나타낸다. 탈산소화 조건 하에서, pH의 상승은 MelNP를 적층된 올리고머 (프로토분자)를 포함하는 집합 서브유닛 (assembling subunit)으로 분해시킨다. 산소의 존재 하에서, pH의 상승은 프로토분자의 부분 화학적 산화를 초래하여 적층 구조의 디스태킹 (de-stacking) 및 MelNP의 프로토분자로의 분해를 유발한다.

도 2는 (A) MelNP의 분해로 인한 프로토분자 및 (B) 산소의 존재 하에 pH-조절된 분해 과정에 의해 생성된 산화형 프로토분자의 TEM 영상을 제공한다. 도 2(C) 및 2(D)는 (A) MelNP의 분해로 인한 프로토분자 및 (B) 산소의 존재 하에 분해 과정에 의해 생성된 산화형 프로토분자의 AFM 영상이다. 도 2(E)는 프로토분자의 높이 분석을 나타내며 도 2(F)는 MelNP의 분해로부터 생성된 산화형 프로토분자를 나타낸다. 이들이 각각 운모 기판 (mica substrate) 상에 침착된 후 프로토분자 및 산화형 서브유닛의 AFM 높이 분석을 수행하였다. MelNP의 분해로 생성된 프로토분자 및 산화형 프로토분자는 각각 2.2 nm 내지 6 nm 및 0.34 nm 내지 2.3 nm의 범위인 것으로 나타났다. 적층 구조에서 멜라닌 올리고머의 시트 간 거리가 약 0.34 nm인 경우, 두께 범위는 프로토분자 및 산화형 프로토분자가 각각 4 내지 12 개의 올리고머 시트 및 1 내지 5 개의 올리고머 시트를 포함함을 반영한다.

도 3 (실험 스킴 2)은 MelNP의 분해로 생성된 자기 공명 활성 프로토분자를 나타낸다. 산소가 없는 경우, NaOH 및 mPEG-SH에 노출되면 MelNP가 프로토분자로 분해되며 페길화된다. 산소가 존재하는 경우, NaOH 및 mPEG-SH에 노출되면 MelNP가 산화형 프로토분자로 분해되고 생성된 프로토분자 상에서 페길화가 초래된다. 프로토분자의 생성 후, Fe³⁺ 킬레이트화는 T1 MRI 활성 프로토분자로 유도한다.

도 4(A)는 PBS에서 PEG-프로토분자-Fe³⁺의 분산 안정성 (dispersion stability)을 나타낸다. Fe³⁺ 이온으로 킬레이트화한 후, PEG-프로토분자-Fe³⁺ 및 PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺는 PBS에서 안정한 분산 거동을 나타내었다. 도 4(B)는 PEG-프로토분자-Fe³⁺ 및 PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺의 유체역학적 반경 (hydrodynamic radius)을 나타낸다.

도 5는 다양한 농도를 갖는 (A) Fe³⁺-MelNP (~100 nm 반경)-PEG, (B) PEG-프로토분자-Fe³⁺, (C) PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺의 T1 MR 영상을 나타낸다. 3T MRI 하에서 모든 이미지를 수득하였다. 프로토분자 및 산화형 프로토분자는 Fe³⁺-MelNP (~100 nm 반경)-PEG 보다 높은 대비 향상 능력을 나타내었다.

도 6은 PEG-MelNPs-Fe³⁺, PEG-프로토분자-Fe³⁺ 및 PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺의 주사 후 간 종양을 지닌 마우스의 T1 강조 MRI를 나타낸다. PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺는 주사 24 시간 후 종양 영역에서 선택적 대조 향상을 나타내었다 (주사된 투여량은 체중 kg 당 20 mg의 샘플이었다).

도 7은 PEG-산화형 프로토분자-Fe³⁺의 주사 후 간 종양을 지닌 마우스의 T1 강조 MRI를 나타낸다 (주사된 투여량은 체중 kg 당 80 mg의 샘플이었다).

실시예 2

인간 색소에서 주된 유형의 멜라닌인, 유멜라닌은 이의 생물학적 기능의 관점에서 가장 불가사의한 (enigmatic) 생체거대분자 중 하나였다. 유멜라닌은 독특한 광학적 특성, UV-vis 광의 넓은 단색 (monotonic) 흡수 및 흡수된 광자의 강한 비방사성 이완 (non-radiative relaxation)의 결과로 UV 광으로부터의 보호를 제공하는 유익한 생체분자로 여겨진다^1-3. 그러나, 유멜라닌은 또한 UV 조사 (irradiation) 하에서 활성산소종 (reactive oxygen specie: ROS)을 생성하는 능력을 나타낸다^4-6. 유멜라닌의 광생물학적 (photobiological) 양상을 둘러싼 논란은 광생성 ROS의 강력한 독성뿐만 아니라 악성 흑색종 (malignant melanoma)과 같은 질병 관련 사건에 대한 이들 ROS의 관련성에서 비롯된다. UV 조사 하에서 ROS를 생성하는 유멜라닌의 능력은 악성 흑색종 진행과 관련이 있을 수 있다. 피부 색소 세포에서, 유멜라닌의 생산은 악성 흑색종의 발달에 따라 상당히 증가한다⁷. 더욱이, 멜라닌-생성 ROS는 종양형성 (tumorigenesis)을 촉진하고 흑색종의 진행을 유도한다는 것을 시사한다^{8, 9}.

유멜라닌의 상이한 광생물학적 양상을 이해하기 위해, 유멜라닌의 복잡한 구조를 결정하고 유멜라닌의 구조적 조직 (structural organization)이 어떻게 이의 광물리학적 (photophysical) 특성을 좌우하는지를 밝혀내는 것이 필수적이다. 유멜라닌은 2 개의 주요 모노머인, 5,6-디히드록시인돌 (DHI) 및 5,6-디히드록시인돌-2-카르복실산 (DHICA)으로부터 유래된 올리고머의 적층된 층을 포함하는, 계층적으로 (hierarchically) 집합된 입자 구조를 갖는다¹⁰. 진보된 분광 (spectroscopic) 및 영상화 기술은 순차적으로 집합된 유멜라닌의 구조를 보여주었으며, 여기서 기본 올리고머는 3.4 Å 간격으로 π-π 상호작용을 통해 적층되고, 적층된 유닛 사이의 수소 결합 및 소수성 상호작용이 3 차원적으로 응집된 입자를 대략 수 백 나노미터 규모로 만들었다^11-15. 몇 가지 실험 결과는 이러한 구조적 조직이 어떻게 유멜라닌의 광물리학적 특성에 영향을 미치는지 설명하는데 도움이 되는 중요한 단서를 제공하였다. 기본 올리고머의 응집은 유멜라닌의 광학적 특성뿐만 아니라 UV 조사 시 광화학적 반응성에도 영향을 미치며, ROS 생성을 유도하는 것으로 나타났다^16-18. 이러한 결과는 계층적으로 집합된 구조의 작은 올리고머 유닛이 ROS의 광생성을 책임진다는 것을 시사한다. 이러한 관찰에 기초하여, 화학적 산화는 유멜라닌의 광화학 반응성을 향상시키는데 중요한 요소일 수 있다. 작은 각 X 선 산란 (Small angle x-ray scattering) 및 STM 연구에 따르면 합성 유멜라닌 모델의 크기는 이의 화학적 산화를 감소시키며^{19, 20}, 이는 유멜라닌의 화학적 산화가 이의 구조를 더 작은 서브유닛으로 붕해시켜 이의 강력한 광화학적 반응성을 증가시킬 수 있음을 시사한다.

흥미롭게도, 천연 유멜라닌의 잘 조직된 구조는 특별한 경우 구조적 변경 (alteration)을 겪는다²¹. 피부 색소 세포에서, 유멜라닌은 멜라노좀 (melanosome)으로 알려진 구조에서 특정 단백질 및 지질과 함께 존재한다²². 투과 전자 현미경 연구는 정상 피부 색소 세포의 잘 조직된 입자 성질을 명확하게 나타내었다²³. 그러나, 표면 확산 흑색종은 정상 색소 세포에 비해 불규칙한 내부 구조, 부분적으로 누락된 영역 및 붕해된 과립을 갖는 더 많은 수의 비정상적 멜라노좀 구조를 나타낸다^24-26. 유멜라닌의 기본 올리고머 유닛이 ROS를 생성하는 광화학적 반응성을 책임진다는 실험적 발견을 고려하면, 더 작은 서브유닛의 생성을 유도하는 잘 조직된 유멜라닌 구조의 변형은 이의 상이한 광생물학적 기능을 자극하기 위한 중요한 생물학적 과정인 것으로 추정될 수 있다. 따라서, 이의 광물리학적 특성에 따라, 유멜라닌의 생물학적으로 관련된 구조적 변경의 효과를 결정하는 것은 유멜라닌 생물학적 기능의 전체 스펙트럼을 이해하기 위해서 필요하다. 그러나, 천연 유멜라닌 시스템의 생물학적으로 관련된 구조적 변경을 평가하는 실험적 연구는, 3 차원적으로 집합된 유멜라닌의 구조물 (architecture)을 제어하기 위한 실용적 접근법의 부재로 인해 제한되어 왔다. 흑색종 생성 과정 동안 두 가지 가능한 구조적 변형인, 기본 올리고머 수준에서 화학 구조의 산화적 파괴가 있거나 없이 이의 조직 구조를 더 작은 서브유닛으로 단편화하는 것이 유멜라닌에서 발생할 수 있다²⁷. 이러한 경우에, 유멜라닌의 계층적 구조로부터 분해된 서브유닛 또는 산화형 서브유닛은 이의 광물리학적 특성에 기초하지만, 천연 유멜라닌의 잘 조직된 계층적 구조는 이의 서브유닛의 특성을 조사하기 어렵게 만들었다. 따라서, 천연 유멜라닌에서 생물학적으로 관련된 구조적 변경의 서브유닛 생산물 및 이들의 광물리학적 및 광생물학적 양상 간의 관계에 대한 체계적인 조사는 결코 달성되지 못하였다.

유멜라닌의 모순적인 생물학적 기능 (광보호 대 감광성)은 화학, 물리학 및 생물학과 같은 광범위한 학문에서 오랫동안 논쟁의 주제였다. 유멜라닌 광생물학적 양상의 전체 스펙트럼을 이해하기 위해, 유멜라닌의 복잡한 구조적 조직이 어떻게 이의 광물리학적 특성을 좌우하는지를 밝히는 것은 중요한 단계이다. 여기서, 본 발명자들은 천연 유멜라닌의 계층적으로 집합된 구조를 조절하는 실용적 접근법을 기록하였고, 이는 구조를 서브유닛 및 산화형 서브유닛 각각으로 분해하는 것을 유도한다. 잘 특성화된 모델 시스템에 기초하여, 유멜라닌의 광물리학적 특성이 어떻게 이의 계층적 집합 조직을 지배하는지 체계적으로 결정하는 것이 가능하다. 특히, 본 발명자들의 실험에 따르면, 적층된 층 구조의 층간 박리 (delamination)를 유도하는, 유멜라닌 서브유닛의 화학적 산화가 UV 조사 하에서 ROS를 생성하기 위해 그들의 광화학적 반응성을 상당히 증가시키는데 중요하다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는 흑색종 발생 과정에서 식균 (phagosomal) 효소 활성에 의해 유도될 수 있는 유멜라닌의 산화적 분해가 악성 흑색종의 발달에 필요한 ROS 공급과 같은, 유멜라닌의 부정적인 광생물학적 역할을 촉발시키는 것에 대한 명백한 실험적 증거를 제공한다.

본 연구에서, 본 발명자들은 유멜라닌을 작은 서브유닛 또는 산화형 서브유닛으로 분해하기 위해 천연 유멜라닌의 계층적으로 집합된 입자 구조를 조절하는 신규한 접근법을 제시하였으며, 이는 유멜라닌의 생물학적으로 관련된 구조적 변경과 유사하다. 본 실용적 접근법은 탈산소화된 용액에서 pH 수준을 증가시켜 유멜라닌 서브유닛의 3 차원 응집을 지지하는 수소 결합을 방해하는 것을 포함한다. 대표적인 유멜라닌 모델에서 이러한 접근법에 기초하여, 100 nm 내지 300 nm 범위의 세피아 (Sepia) 유멜라닌 입자는 주로 대략 1 nm의 평균 적층 크기를 갖는 적층된 층을 포함하는 더 작은 서브유닛으로 분해될 수 있다. 또한, 서브유닛은 호기성 알칼리 조건 하에서 산화적 분해로 더 작은 서브유닛으로 추가로 층간 박리될 수 있다. 이러한 잘 특성화된 모델 시스템을 사용하여, 천연 유멜라닌의 2 가지 주요 광물리학적 특성이 생물학적으로 관련된 구조적 변형의 함수로서 변경될 수 있음을 체계적으로 결정할 수 있었다. 특히, 본 발명자들의 실험에 따르면, 적층된 층 구조의 층간 박리를 유도하는 유멜라닌 서브유닛의 화학적 산화가 UV 조사 하에서 ROS를 생성하기 위해 그들의 광화학적 반응성을 상당히 증가시키는데 중요하다는 것이 밝혀졌다. 본 발명자들의 결과는 흑색종 발생 과정에서 식균 (phagosomal) 효소 활성에 의해 유도될 수 있는 유멜라닌의 산화적 분해가 악성 흑색종의 진행에 필요한 ROS 생산과 같은, 유멜라닌의 부정적인 광화학적 양상 및 생물학적 역할을 촉발시키는 것에 대한 명백한 실험적 증거를 제공한다.

세피아 유멜라닌의 제조. 신선하게 해부된 ³³먹물 주머니로부터 시린지를 사용하여 세피아를 추출하고, 이전 연구에 기재된 바와 같이 원심분리 (18000 rpm)하여 수집하였다. 한국의 오징어를 해부하여 먹물 주머니를 수득하였다. 세피아 유멜라닌의 분해 및 산화 과정을 조사하기 위해, 세피아 유멜라닌을 10 회 이상 원심분리 및 물에 재분산하는 세척 과정으로 정제하였다.

MelNP의 합성. 이전에 기록된 방법을 약간 변형하여 MelNP를 합성하였다²⁹. 합성 조건의 설명은 하기와 같이 제공된다; 180 mg의 도파민 히드로클로리드 (Aldrich Chemical)를 45 mL의 탈이온수에 용해시켰다. 670 μL의 NaOH (1 N) 용액을 50 ℃에서 격렬히 교반하면서 도파민 히드로클로리드 용액에 첨가하였다. 5 시간 후, MelNP를 단리하고 수 회 원심분리 (10 분 동안 4000 rpm)/탈이온수에 재분산하여 정제하였다.

세피아 유멜라닌에 대한 분해 및 동시 분해/산화 과정. 세피아 유멜라닌의 분해 양상을 조사하기 위해, 세피아 유멜라닌 (1 mg/mL)의 용액을 N₂ 퍼지 하에 완충 용액 (pH 9.5)에 첨가하였다. 용액에 용존 O₂를 제거하기 위해 모든 용액을 20 분 동안 N₂ 로 사전-퍼지하였다. 10 분 후, 부분적으로 분해된 세피아 입자를 원심분리 (13500 rpm, 10 분) 및 물에 재분산하여 방출된 서브유닛으로부터 분리할 수 있었다. pH-조절된 분해 하에서 세피아의 형태학적 변화 (change)를 조사하기 위해, 부분적으로 분해된 세피아를 TEM 조사를 위한 탄소 코팅 TEM 그리드로 직접 옮겼다. 완전히 분해된 세피아에 대해, 3.5 mL의 NaOH 용액 (1 M)을 N₂ 퍼지 하에서 1 mL의 세피아 용액 (1 mg/mL)에 첨가하였다. 용액으로부터 용존 O₂를 제거하기 위해 모든 용액을 20 분 동안 N₂로 사전-퍼지하였다. 12 시간 후, 5 mL의 KH₂PO₄ 용액 (0.1 M)을 완전히 분해된 세피아의 용액에 첨가하여 용액 pH를 중화시키고 주변 환경 하에서 서브유닛의 추가적인 pH-유도 산화를 방지하였다. 세피아 유멜라닌으로부터 생성된 서브유닛은 1 주 후 응집 거동을 나타내었기 때문에, 새롭게 생성된 서브유닛을 사용하여 광학 특성 및 광화학적 반응성을 조사하였다. 세피아 유멜라닌의 산화 과정을 N₂ 퍼지를 제외하고 상기 기재한 것과 동일한 방식으로 5 일 동안 진행하였다. 생성된 산화형 서브유닛은 1 개월 이상 동안 중화된 완충 용액에서 매우 안정한 분산 안정성을 나타내었다.

세피아 유멜라닌으로부터 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 특성 규명. pH-조절된 분해 및 산화 과정 하에서 세피아의 형태학적 변화를 조사하기 위해, 세피아로부터 분해된 서브유닛 및 산화형 서브유닛을 TEM으로 특성 규명하였다. 분해 및 동시 분해/산화 과정 후, 동등한 농도의 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 흡광도를 UV-vis 분광계 (SINCO S-3100)를 통해 특성 규명하였다. 각 샘플의 방출 스펙트럼을 314 nm의 여기 파장에서 Jasco FP-6500 분광형광계 (spectrofluorometer)로 측정하였다. 방출 스펙트럼의 각 방출 최대 파장에 대한 여기 스펙트럼을 동일한 실험 설정 하에서 수득하였다. 비산화 서브유닛 및 및 이들의 모 세피아 (parental Sepia)와 비교하여 산화형 서브유닛의 ¹³C NMR 스펙트럼을 Bruker 400 MHz 고체/마이크로-영상화 고해상도 NMR 분광계 상에서 수집하였다.

AFM 분석을 위해, 세피아 유멜라닌으로부터 생성된 서브유닛 및 산화형 서브유닛을 1 일 동안 투석 키트 (Thermo Scientific Slide-A-Lyzer Dialysis, 2 K MWCO)를 사용하여 각각 투석시켰다. 전체 서브유닛 혼합물로부터 염을 제거하고 올리고머 종 (MW < 2000)을 배제하기 위해 수행하였다. 투석 후, AFM 조사를 위해 희석된 서브유닛 용액을 운모 기판 (4000 rpm, 30 초) 상에 스핀 코팅하였다. 주위 온도로 대기에서 Nanoscope IIIa microscope (Veeco Instruments, Santa Barbara, CA)을 사용하여 AFM 실험을 수행하였다. 스프링 상수 (spring constant)가 40 Nm^-1이고 팁 반경 (tip radius)이 <12 nm인 BRUKER의 비접촉 모드 팁 (non-contact mode tip)을 사용하여 태핑 (tapping) 모드 상에서 모든 영상을 수득하였다. 투석을 통해 서브유닛 또는 산화형 서브유닛의 전체 혼합물로부터 올리고머 유닛 분획 (MW < 2000)을 분리할 수 있으며 이들을 물의 증발을 통해 농축시켰다. 농축된 올리고머 유닛 분획 (MW < 2000)을 상기 언급된 방법과 같이 UV-vis 분광계 및 분광형광계를 통해 특성 규명하였다.

구조적 변경에 따른 세피아 유멜라닌에 의한 활성산소종 (ROS)의 광생성. 수퍼옥시드 (superoxide) 라디칼의 생성을 광조사 (photoirradiation) 동안 수퍼옥시드 라디칼에 의한 NBT의 감소에 기인하는, 560 nm에서 디포르마잔 (diformazan) 흡수의 변화를 측정하는, 니트로 블루 테트라졸리움 (nitro blue tetrazolium: NBT) 방법으로 모니터링하였다.^{28, 29}

200 μL의 새로 제조된 NBT 용액 (1 mM)을 석영 큐벳 (quartz cuvette)에서 2 mL의 포스페이트 완충 용액 (1 M)에 용해시키고, 적절한 양의 세피아 샘플 (투석 전후 세피아 입자, 서브유닛, 및 산화형 서브유닛)을 큐벳에 개별적으로 첨가하였다. 서브유닛의 총량은 투석 후 산화형 서브유닛을 제외하고 30 μg로 변하였다. 용액을 혼합 한 후, 석영 큐벳을 10 cm 거리에서 제논 (xenon) 램프 (100 W)의 조사에 노출시켰다. 560 nm에서 디포르마잔으로부터의 흡수를 조사 동안 시간의 함수로서 수득하였다.

히드록실 라디칼의 생성을 모니터링하기 위해, 히드록시 라디칼과 반응하여 7-히드록시쿠마린-3-카르복실산 (7-OHCCA)을 생성할 때 446 nm에서 특성 방출하는 쿠마린-3-카르복실산 (coumarin-3-carboxylic acid: CCA)을 사용하였다.^{30, 31}

20 μL의 암모니아 용액 (28-30 %)을 첨가하여 CCA를 탈이온수에 용해시키고 이의 농도를 5 mM로 조정하였다. 새롭게 제조된 CCA 용액 200 μl를 석영 큐벳에서 2 mL의 포스페이트 완충 용액 (1 M)에 첨가하고, 적절한 양의 세피아 샘플을 큐벳에 개별적으로 첨가하였다. 투석 후 산화형 서브유닛을 제외하고 서브유닛의 총량은 30 μg이었다. 용액을 혼합한 후, 석영 큐벳을 10 cm 거리에서 제논 램프 (100 W)의 조사에 노출시켰다. 조사 동안 시간의 함수로서 7-OHCCA (λ_ex = 380 nm)로부터의 방출 스펙트럼을 수득하였다.

결과 및 토론

세피아 유멜라닌에 대한 pH-조절된 분해 및 동시 분해/산화 과정. 세피아 유멜라닌 입자를 계층적으로 집합된 입자 구조를 갖는 유멜라닌 모델로서 이용하였다. 잘 특성화된 천연 유멜라닌인, 세피아를 이의 고순도 및 비교적 간단한 정제 방법으로 인해, 유멜라닌의 물리화학적 특성을 연구하기 위한 유멜라닌 모델로 사용하였다^16-18,32. 적층 올리고머의 응집체 (aggregate)를 포함하는 계층적 구조의 세피아 유멜라닌을 SEM³³, AFM¹⁵ 및 광각 (wide-angle) X-선 회절 측정¹²으로 잘 특성화하였다. 도 8 및 9-b에 나타낸 바와 같이, 오징어의 먹물 자루 (sack)로부터 추출된 세피아 유멜라닌은 100 내지 300 nm 범위의 넓은 크기 분포를 갖는 잘 조직화된 입자의 특성을 나타내었다. 유멜라닌의 응집된 입자 성질은 퀸히드론 (quinhydrone) 형성에서 수소 결합을 통해 적층된 올리고머의 에지-투-에지 (edge-to-edge) 결합으로 결국 강제되기 때문에 (도 8), 용매 (물)의 pH를 증가시킴으로써 수소 결합을 붕괴 (disruption)시키면 단백질 2차 구조의 변성을 연상시키는 방식으로 세피아 유멜라닌 입자의 분해를 유도할 수 있다. 용매 pH를 증가시키는 것 외에도, 용매의 탈산소화는 생성된 서브유닛의 화학적 산화를 방지하는데 중요하다. 유멜라닌 모노머의 1 차 디히드로퀴논 (dihydroquinone) 모이어티는 알칼리성 pH 조건에서 용존 산소에 의해 쉽게 산화될 수 있으며, 디히드로퀴논 모이어티를 산화시키면 사슬 자동산화 (autoxidation) 과정을 통해 디히드로퀴논의 산화된 형태 및 용존 산소 사이에 활성산소종 (ROS)의 생성을 초래한다³⁴.

따라서, 산소 존재 하에서 분해 과정으로 생성된 세피아 서브유닛은 생성된 ROS, 예를 들어 수퍼옥시드 라디칼 및 과산화수소에 의해 추가적인 화학적 산화를 겪을 수 있다. 따라서, 생성된 서브유닛의 산화를 방지하기 위해 세피아 용액을 분해 과정 동안 N₂로 퍼지하였다. 탈산소화된 염기성 pH 용액 (pH 9.5)에 노출시킨 후 방출된 서브유닛을 분리하기 위해 원심분리하여 세피아 유멜라닌의 형태학적 변화를 TEM으로 모니터링하였다 (도 9-c). 몇몇 세피아 입자는 분해 과정으로 인해 입자 내부로부터 방출된 서브유닛 때문에 팽창된 노른자 껍질 (yolk-shell) 구조를 나타내었다. 서브유닛의 방출을 유도하는 세피아 입자의 분해는 동등한 노출 시간에 대해 높은 pH 조건에서 증가하며 (도 15), 분해 과정이 세피아의 계층적 구조에서 수소 결합의 향상된 붕괴를 통해 더 높은 pH 수준 하에서 더 효과적으로 진행됨을 나타내었다. 세피아 유멜라닌 입자를 탈산소화된 NaOH 용액 (0.5 M)에 12 시간 동안 노출한 후 소형 서브유닛으로 완전히 전환될 수 있었고 (도 9-d); 이들 더 작은 서브유닛을 포타슘 이수소 포스페이트 (potassium dihydrogen phosphate) 용액을 첨가한 후 중화된 완충 용액에 안정적으로 저장할 수 있었다. 이들이 1 주 후 응집 거동을 나타내기 때문에, 새롭게 생성된 서브유닛을 이들의 광물리학적 특성의 특성 규명을 위해 이용하였다.

세피아 입자로부터 분해된 서브유닛의 산화는 분해 과정 동안 NaOH 용액에 용해된 산소를 허용함으로써 유도될 수 있다. 상기 기재한 바와 같이, 산소-용해된 알칼리성 용액에서 디히드로퀴논 모이어티의 자동산화는 수퍼옥시드 라디칼 및 과산화수소와 같은 ROS의 생성을 초래한다.³⁴ 따라서, 용존 산소의 존재 하에 용액 pH를 증가시키는 것은 세피아 유멜라닌 입자를 서브유닛으로 분해시킬 뿐만 아니라 생성된 ROS에 의한 이들의 화학적 산화를 유도하고, 이는 알칼리성 퍼옥시드 용액 처리를 통한 유멜라닌에 대한 산화 표백 (bleaching) 과정과 매우 유사하다²⁰. 용존 산소를 함유한 NaOH 용액 (0.5 M)에 5 일 동안 노출시켜 화학적 산화형 서브유닛을 수득하고 포타슘 이수소 포스페이트 용액을 첨가하여 중화된 용액에서 저장하였다 (도 9-e). 이들은 1 개월 이상 동안 중화된 완충 용액에서 매우 안정한 분산 안정성을 나타내었다.

세피아 유멜라닌의 분해 및 동시 분해/산화로 인한 서브유닛 생산물의 특성 규명. 이전의 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 (matrix-assisted laser desorption/ionization: MALDI) 질량 분석 연구에 따르면, 세피아 프로토분자의 질량이 1200 미만이고 고분자량의 폴리머는 관찰되지 않았다³⁷. 주사 터널링 현미경 (Scanning tunneling microscopic) 연구에 따르면, 유멜라닌 프로토분자의 측면 크기는 대략 2 nm였다.^21,38 이러한 결과는 공유적으로 연결된 DHI 또는 DHICA을 포함하는 올리고머 유닛이 유멜라닌의 기본 유닛일 수 있음을 시사한다.

고급 영상화 기술 (advanced imaging technique) ^{12, 21, 38, 39} 및 이론적 계산^40-42에 기초한 많은 연구에서 세피아 유멜라닌을 계층적 분해 시스템으로 설명하였으며, 여기서 기본 올리고머 유닛은 π-π 상호작용을 통해 적층되고, 올리고머 유닛 (프로토분자)의 적층된 층은 소수성 상호작용 및 수소 결합과 같은 비공유 상호작용에 의해 구동되는, 3 차원적으로 응집된 입자 구조를 형성한다 (도 8). pH-조절된 분해 과정은 세피아의 3 차원적으로 응집된 입자 구조를 작은 서브유닛으로 완전히 붕해시키기 때문에, 유멜라닌, 기본 올리고머 유닛, 적층 올리고머 및 적층 올리고머 클러스터의 계층적 분해도 (assembly picture)를 고려하는 것이 생성된 서브유닛의 가능한 구성성분 (constituent)일 수 있다.

세피아 서브유닛의 구조적 특성 규명을 위해, pH-조절된 분해 과정으로부터 생성된 서브유닛을 분자량으로 분할하였다. 2000에서 분자량 컷오프를 갖는 투석을 통해, 분자량이 2000 미만인 서브유닛 분획을 전체 서브유닛으로부터 분리시켰다. 이전 질량 분석 연구에 의해 관찰된 세피아 기본 올리고머 종의 분자량 범위를 고려하여, 올리고머 유닛을 투석 후 전체 서브유닛으로부터 분리하였다. 투석 과정 전후에 UV-vis 흡수 스펙트럼을 비교함으로써, 전체 세피아 서브유닛 혼합물에 대한 2000 미만의 MW를 갖는 서브유닛 분획의 대략적인 비율을 예측할 수 있다. 도 11-b에 나타낸 바와 같이, 투석 과정 후에 UV 및 청색 영역에 기여하는 약간 감소된 흡수가 관찰되었다. 두 서브유닛 분획 모두에 대한 명백한 분자 흡수 계수 (molar absorption coefficient)의 부재로 인해 투석 전후의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 비교함으로써 각 서브유닛 분획의 정확한 비율을 예측하기는 어렵지만, 투석 과정 후 UV-vis 흡수의 매우 작은 감소는 분자량이 2000 미만인 서브유닛 분획이 전체 서브유닛 혼합물에서 매우 작은 반면, 분자량이 2000을 초과하는 또 다른 서브유닛 분획은 세피아 유멜라닌의 pH-조절된 분해로 인한 주 생성물이라는 것을 나타내었다.

세피아의 분해 결과로서 주 서브유닛 분획 (MW > 2000)의 두께를 회전 운모 기판 상에 희석된 서브유닛 용액을 적하하여 서브유닛을 운모 기판 상에 침착시킨 후 원자 힘 현미경(atomic force microscope: AFM)으로 분석하였다. 서브유닛의 응집은 샘플 제조 과정 동안 x-y 방향으로 발생할 수 있기 때문에 서브유닛의 측면 크기를 추정하는 것은 어렵다. 그러나, 운모 기판 상의 서브유닛의 높이 분석은 서브유닛의 두께에 대한 정보를 제공한다.²¹ 서브유닛 분획 (MW > 2000)의 평균 높이는 1.0±0.1 nm인 것으로 나타났다 (그림 9-f 및 g). 세피아 유멜라닌의 적층 올리고머의 시트 간 거리가 0.34 nm임을 고려하면¹², 평균 높이는 서브유닛 분획 (MW > 2000)이 3 내지 4 시트를 갖는 다층 올리고머임을 나타낸다. 한편, 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 작은 부분은 단일 올리고머, 및 투석막을 통과하기에 충분히 작은 박층 (thin-layered)의 올리고머를 포함할 것이다.

주 서브유닛 분획의 두께는 STM에 의해 이전에 관찰된 유멜라닌 프로토분자의 높이 치수와 잘 일치한다. 흑연 결정 (graphite crystal)에 침착된 합성 멜라닌은 1-1.5 nm의 높이를 나타내었으며, 이는 적층 올리고머의 유멜라닌 프로토분자로 제안되었다.^21,38 따라서, 3 내지 4 시트를 갖는 다층 올리고머인 세피아 유멜라닌 프로토분자는 세피아의 pH-조절된 분해로부터 생성된 주 생산물이라고 기대하는 것이 합리적이다. 세피아 유멜라닌의 계층적 구조도 (structural picture)에 비추어 보면, 세피아 프로토분자의 생성은, 세피아 유멜라닌이 완전히 붕해되는, 탈산소화된 알칼리성 조건 하에서 응집된 유멜라닌 프로토분자를 강제하는 비공유 상호작용이 상당히 약화될 것임을 반영한다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 폴리퀸히드론

(polyquinhydrone) 복합체를 일으키는, 프로토분자 간의 수소 결합은,^43,44 유멜라닌 프로토분자의 에지-투-에지 결합을 책임지는 중요한 2 차적 상호작용으로 간주된다.^19,45 유멜라닌의 산화환원 평형 (redox equilibrium)이 pH의 함수로서 변화할 수 있기 때문에,⁴⁶ 수소 결합의 붕괴가 탈산소화된 알칼리 조건 하에서 세피아유멜라닌의 분해를 유도하는 가능한 요인일 것이다. pH 수준의 증가는 평형을 폴리퀸히드론 복합체로부터 폴리퀴논으로 쉬프트시킬(shift) 것이며, 이는 아마도 프로토분자 간 수소 결합의 붕괴에 관한 것이다.

세피아 유멜라닌은 약 5-10 % 중량 부분을 갖는 단백질을 함유하기 때문에,⁴⁷ 단백질은 세피아의 pH-조절된 분해를 유도하는 또 다른 가능한 요인일 수 있다. 그러나, 단백질 분해 효소를 사용하여 천연 유멜라닌을 둘러싼 단백질을 선택적으로 소화시켜도 이의 입자 구조에는 영향이 없는 것으로 나타났다.^48,49 이러한 결과는 유멜라닌 입자를 둘러싸는 단백질 부분이 유멜라닌의 3 차원적으로 응집된 입자 형상을 유지시키는 결정적인 요인이 아님을 나타낸다. 단백질의 효과와 관련하여 pH-유도된 분해 현상을 더 이해하기 위해, 합성 멜라닌-유사 나노입자 (MelNP)의 pH-조절된 분해를 조사하였다. 본 발명자가 이전에 개발한 (developed) MelNP은 도파민의 자발적 산화로부터 생성된 합성 멜라닌 모델이다.²⁹ 입자 구조를 한정하는 생물학적 분자의 관여없이, 물에서 도파민의 간단한 자동산화는 특정 형상의 멜라닌을 초래하였다. 최근의 구조 연구는 도파민의 자동산화로부터 생성된 생산물의 구조가 천연 유멜라닌의 계층적 집합과 매우 유사하다는 것을 시사하였다.^45,50 합성 모델에서는 생물학적 분자의 어떠한 개입도 없으므로, MelNPs는 단백질과 같은 생물학적 분자와 관련하여 세피아 유멜라닌의 pH-유도된 분해를 조사하기에 적절한 모델이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 탈산소화된 염기성 용액에 노출된 후 MelNP의 잘 조직된 입자 구조는 또한 작은 서브유닛으로 분해되었다. pH 증가에 따라 합성 멜라닌 모델의 분해는 세피아 유멜라닌에 침착된 생물학적 분자가 pH-조절된 분해 과정과 관련하여 결정적인 요소가 아님을 나타내었다.

세피아의 동시 pH-조절된 분해/산화에 의해 생성된 서브유닛을 비산화 서브유닛과 동일한 방식으로 특성 규명하였다. 투석 과정을 통해, 서브유닛 분획 (MW < 2000)을 전체 산화형 서브유닛으로부터 분리하였다. 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 제거는 또한 UV-vis 흡수 스펙트럼의 감소를 초래하였다 (도 11-c). 이러한 경우, 서브유닛 분획을 제거한 결과로서 비산화 서브유닛과 비교하여 UV 영역에서의 흡수 비율이 훨씬 더 감소하였다. 투석막을 통과할 수 있는 증가된 양의 작은 서브유닛은 이러한 결과에 대한 가능한 설명이다. 세피아 유멜라닌의 산화에 대한 이전의 NMR 연구는 화학적 산화가 유멜라닌 올리고머의 부분적 분해를 야기하여 올리고머 구조에서 피롤 카복실산 (pyrrole carboxylic acid)기가 생성된다는 것을 나타내었다.⁵¹ 따라서, 기본 올리고머의 산화적 부분 분해로 유도된 적층 올리고머 간의 π-π 상호 작용 감쇠 (attenuation)는 적층된 층의 층간 박리를 초래할 수 있다. 이러한 기대는 화학적 산화에 따라 합성 유멜라닌 모델의 크기가 감소됨을 나타내는 실험 결과에 의해 뒷받침될 수 있다.^19,21 알칼리 퍼옥시드 용액으로 유멜라닌 모델을 화학적으로 산화시키면 그 입자 크기가 감소한다는 것이 입증되었다.^19,21 유사한 방식으로, pH-조절된 분해/산화 과정으로부터 생성된 적층 올리고머 분획이 생성된 ROS에 의해 산화적 부분 파괴를 통해 층간 박리될 수 있고, 결과적으로 작은 서브유닛의 수는 증가할 것이다. 이러한 기대는 AFM 측정에 의한 산화형 서브유닛의 크기 분석으로 확인할 수 있다. 산화형 서브유닛 분획 (MW > 2000)의 평균 두께는 1.0±0.1 nm의 크기를 갖는 상응하는 비산화 서브유닛 분획 (MW > 2000)과 비교하여 0.6±0.2 nm로 감소하였다 (도 9-f, g, i 및 j). 서브유닛 분획 (MW > 2000)의 감소된 두께는 이들이 단일 및 박층 올리고머 종의 비율을 증가시키는, pH-조절된 산화 과정 하에서 층간 박리를 겪음을 나타낸다. CP-MAS ¹³C 고체 상태 NMR 연구는 pH-조절된 산화 과정이 세피아 유멜라닌 서브유닛의 구조적 변형에 미치는 영향에 대한 추가적인 통찰력을 제공하였다. 도 9h에 나타낸 바와 같이, 생성된 피롤 카르복실산의 카보닐 공명에 상응하는 180 내지 185 ppm 범위의 특성 스펙트럼이 산화형 서브유닛에서 명확하게 관찰되는 반면, 모 세피아 및 비산화형 서브유닛은 그 범위에서 어떠한 신호도 나타내지 않았다. 서브유닛의 이러한 산화적 부분 파괴는 적층된 올리고머 유닛 사이의 π-π 상호작용의 감쇠를 통해 세피아 서브유닛 구조의 산화-유도된 층간 박리를 촉진시키는 데 결정적인 요인일 것이다.

세피아 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 흡수 스펙트럼. 광보호 기능에 관한 유멜라닌의 핵심 광학적 특성인, UV 영역을 향해 이동하면서 단색적으로 (monotonically) 증가하는 넓은 UV-vis 흡수^52,53는 구조적 변형의 함수로 변화된다. 모 세피아의 흡수 패턴과 비교하여, 분해 및 동시 분해/산화 과정을 통해 광범위한 가시 흡광도가 감소되었다 (도 11-a).

적층된 올리고머의 탈응집 (de-aggregation)은 세피아 유멜라닌의 분해 의존적 흡수 스펙트럼에 기여하는 가능한 요인이다. 여러 이론적 계산 및 펄스 방사성 연구 (pulse radiolytic studie)는 유멜라닌의 광학적 특성이 유멜라닌의 기본 구성성분인 올리고머 유닛 내에서 π 전자의 비편재화 (delocalization) 정도에 의해서만 지배된다는 것을 제안하였다.^52,54,55 이러한 모델에 기초하여, 유멜라닌의 넓은 흡수는 다양한 흡수 밴드를 갖는 화학적으로 분별된 종의 총체 (ensemble)인 것으로 해석되며, 여기서 다양한 입체형태 (conformation), 배위 (configuration) 및 산화환원 상태를 갖는 모노머 단위의 올리고머화는 이들 흡수 밴드의 적색 쉬프트 (redshifted), 확장 및 다양화를 유발한다. 그러나, 최근의 이론적 및 실험적 노력은 이러한 그림을 2 차 구조 수준으로 추가로 조명하였으며, 적층 및 응집과 같은 비공유 상호작용이 또한 유멜라닌의 광학적 특성에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사하였다.^40,42,56,57 이러한 추가적인 정보는 서브유닛이 가까이 근접하면 이들의 전자 커플링 (electronic coupling)이 유도되어, 기본 유닛의 HOMO-LUMO 갭 에너지를 저에너지로 추가로 쉬프트시키도록 한다는 것을 나타낸다. 수소 결합은 연결된 적층 올리고머를 응집시키는 역할을 하기 때문에, 수소 결합의 붕괴는 적층된 서브유닛 간의 전자 커플링을 상당히 감소시킬 수 있다. 따라서, 적층된 올리고머의 응집으로부터 발생하는, 특히 가시 및 근적외선 (near IR)의 광학적 밀도 (optical density) 비율은 응집된 입자 구조의 분해를 통해 감소될 수 있다.

서브유닛의 산화적 분해는 세피아 입자의 분해 이외에도 광학적 밀도의 추가적인 감소를 초래하였다. 이러한 결과는 두 가지 분별된 효과로 설명할 수 있다. 우선, 세피아 유멜라닌의 산화적 부분 분해는 이들의 올리고머 내에서 피롤 카복시기를 생산하므로,⁵¹ 올리고머 유닛의 π 전자 비편재화 시스템을 단축시킬 것이다. 결과적으로, 기본 올리고머에서 피롤 카르복실산 기의 생성은 올리고머 유닛의 HOMO-LUMO 갭의 청색 쉬프트 (blue-shifting)를 유발할 수 있다. 흡수 감소의 다른 가능한 원인은 서브유닛의 산화적 부분 분해에 의해 유도된 적층된 층 구조의 디스태킹 (de-stacking)이다. 이러한 경우에, 적층된 종 내 올리고머 간의 감소된 전자 커플링은 가시 및 근적외선 영역 주위의 흡수 감소에 추가적으로 기여할 것이다.

세피아 UV-vis 흡수 스펙트럼에서 단백질의 관여를 무시할 수 있다는 점은 주목할 만하다. 크기-선택된 세피아 유멜라닌의 UV-vis 흡수 스펙트럼에 대한 이전 연구에서, 단백질의 명확한 흡수 피크가 270 nm 주위에서 관찰되는 것으로 밝혀졌다.¹⁸ 단백질로부터 유래된 흡수 피크는 1000 미만의 분자량을 갖는 크기-선택된 세피아 분획에서 더욱 명확하게 관찰되며, 이는 세피아에서 단백질 분획의 대부분이 1000 미만의 분자량을 가짐을 나타낸다. 한편, 단색적으로 증가하는 세피아의 흡수에서 270 nm 주변의 임의의 뚜렷한 피크는 본 연구에서 관찰되지 않았다. 또한, 세피아 입자로부터 분해된 크기-선택된 서브유닛 분획은 270 nm 부근에서 어떠한 흡수 피크도 나타내지 않았다. 이러한 관찰은 세피아 유멜라닌 입자에서 단백질 부분의 대부분이 제거되고, 따라서 이의 흡수 기여는 무시할 만하다는 것을 반영한다. 물 중 세피아 입자의 10 회 이상의 순차적인 원심분리/재분산은 세피아 입자에서 단백질 부분의 효과적인 제거를 초래할 것이라고 기대된다.

세피아 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 형광 방출 스펙트럼. 자외선 노출이 피부 손상 및 피부암에 대한 주요 원인이 된다는 점을 고려할 때, 강한 비방사성 이완 과정을 통한 효율적인 UV 소산 (dissipation)이 이의 광보호 기능성과 관련하여 유멜라닌의 다른 핵심적인 광학적 특성이다.^1,3 따라서, 유멜라닌은 UV 광에 의해 여기될 때 매우 낮은 세기의 형광 방출을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나, 세피아 유멜라닌의 극히 낮은 형광 방출 강도는 작은 유닛으로의 구조적 분해 및 추가 산화와 함께 증가한다. 각 샘플의 등가 중량 농도에서, 세피아 입자로부터 분해된 서브유닛은 모 세피아와 비교하여 314 nm (UV-B)에서의 여기로 350 내지 550 nm 사이에서 향상된 형광 방출을 생산하였다 (도 12-b). 또한, 산화형 서브유닛은 비산화형 서브유닛과 비교하여 더욱 증가된 형광 강도를 나타내었다. 여기 빔 (excitation beam)의 감쇠 및 발광의 재흡수와 같은 문제적 현상을 최소화하기 위해, 여기 파장에서 각 샘플의 흡광도를 동등하게 조정하고 농도를 매우 희석하였다 (도 12-a). 이러한 경우, 이들은 매우 유사한 구조 의존적 형광 방출을 나타내었다 (도 12-b). 이러한 결과는 세피아 프로토분자의 탈응집 및 프로토분자의 산화가, 강한 비방사성 관련 과정의 감소와 밀접한 관련이 있음을 나타낸다.

구조적 변경의 함수로서 세피아 유멜라닌의 형광 방출을 보다 잘 이해하기 위해 크기-선택된 서브유닛의 방출, 여기 및 흡수 스펙트럼을 비교하였다. 상기 기재한 바와 같이, pH-조절된 분해 과정 또는 동시 분해/산화 과정으로부터 생성된 서브유닛 생산물은 투석 과정을 통해 분자량의 측면에서 분리할 수 있다. 서브유닛 분획 (MW < 2000)이 314 nm에서 현저한 흡수 피크를 나타내었다는 점은 주목할 만하다. 서브유닛 분획 (MW < 2000)이 314 nm에서 여기될 때, 가시광선에서 넓은 방출 피크를 나타내었다 (도 12-d). 방출 최대 파장에서 보정된 여기 스펙트럼은 314 nm 부근에서 특징적인 피크를 나타내었다 (도 12-f). 314 nm 부근의 서브유닛 분획의 특징적인 흡수 밴드는 단일 기본 올리고머 유닛에 기인할 것이다. 유멜라닌의 기본 올리고머 성분의 S₀-S₁ 트랜지션은 이들의 흡수 밴드를 314 nm 부근에서 관찰되도록 만든다는 것이 밝혀졌다.^56,58 따라서, 314 nm에서 여기되는 경우, 단일의 올리고머 유닛이 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 강한 형광 방출을 책임지는 주성분인 것으로 예상된다.

한편, 적층 올리고머를 포함하는 서브유닛 분획 (MW > 2000)은 다른 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 올리고머 유닛보다 약한 형광 방출 강도를 나타내었다 (도 12-d). 2 개의 서브유닛 분획 사이의 구조적 차이에 비추어 볼 때, 서브유닛 분획 (MW > 2000)의 적층 구조는 적색 쉬프트 및 약한 형광 방출에 영향을 미치는 가능한 구조적 요인이다. 상기 기재한 바와 같이, 이론적 계산 연구는 기본 올리고머 유닛이 가까이 접근하면 이들 사이의 전자 커플링을 초래하고 이들 HOMO-LUMO 갭의 적색 쉬프트가 유도된다고 예측하였다^40,57. 2 개의 서브유닛 분획 사이의 흡수 스펙트럼의 비교는 적층 구조로 한정된 기본 올리고머 종 사이의 전자 커플링에 대한 통찰력을 제공한다. 도 12-c에 나타낸 바와 같이, 적층된 올리고머 유닛 분율은 분자량이 2000 미만인 서브유닛 분획보다 가시 및 근적외선 영역에서 더 많은 흡수 기여를 나타내었다. 적층된 구조에서 기본 올리고머 유닛 간의 전자 커플링은 또한 방출 스펙트럼에서 발견된다. 적층된 올리고머 유닛 분획의 방출 스펙트럼은 서브유닛 분획 (MW < 2000)에서 적층되지 않은 올리고머 유닛보다 더 넓고 적색 쉬프트된 방출 피크를 나타낸다 (도 12-e). 또한, 적층된 올리고머 유닛 분획의 상응하는 여기 스펙트럼은 또한 314 nm 부근에서 특징적인 피크의 적색 쉬프트를 나타내었다 (도 12-f). 적층된 올리고머 간의 전자 커플링은 적층-매개 형광 ?칭 (quenching)에 기인할 수 있다. 광범위하고 적색 쉬프트된 방출은 방향족 발색단 (chromophore)의 자체 집합 (self-assembled) 시스템의 특징이다. 발색단 중 하나가 집합된 시스템에서 전자적으로 여기될 때, 분자는 여기 상태에서 엑시머 (excimer) 복합체를 형성하고 넓고 적색 쉬프트된 방출을 나타낸다.^59,60 유사한 방식으로, 세피아 올리고머의 적층된 층은 여기된 상태에서 전자 커플링을 겪을 것이고 엑시머 형성으로 생성된 새로운 에너지 상태는 전체 적층된 올리고머 시스템의 강한 비이완 과정에 관여할 수 있다. 그러나, 적층 구조와 연관된 정확한 이완 과정은 현재 명확하지 않다. 세피아 서브유닛의 적층 매개 형광 ?칭 메커니즘에 대한 더 상세한 연구가 진행 중이다.

적층된 올리고머 유닛을 포함하는 서브유닛이 pH-조절된 산화의 결과로 디스택킹되기 쉽기 때문에, 세피아 서브유닛의 적층-매개 형광 ?칭 거동은 세피아 유멜라닌의 산화-유도된 형광 향상과 연결될 수 있다. 따라서, 본 발명자는 산화에 의해 유도된 적층 올리고머 분획 (MW > 2000)의 감소된 적층 크기는 가시 영역에서의 흡수 기여를 감소시키고 강한 비방사성 관련 과정을 감쇠시킬 것으로 예측하였다. 예상된 바와 같이, 적층된 층을 포함하는 산화형 서브유닛 분획 (MW > 2000)의 표준화된 흡수 스펙트럼은 상응하는 비산화형 서브유닛 분획과 비교하여 가시 영역에서 감소된 흡수 기여를 나타내었다 (도 12-c). 또한, 산화형 서브유닛 분획은 상응하는 비산화형 서브유닛 분획과 비교하여 향상된 형광 강도를 나타내었다. 이러한 결과는 비산화되고 적층되지 않은 및 적층된 올리고머 분획 사이의 비교에서, 예상된 적층 효과와 일치한다.

분자량이 2000 미만인 산화형 서브유닛 분획은 또한 상응하는 비산화 서브유닛 분획 (MW < 2000)과 비교하여 증가된 형광 강도를 나타내었다. 산화에 의해 유도된 적층 올리고머의 층간 박리는 투석막을 통과할 수 있는 고형광성 (highly florescent) 단일 및 박층 올리고머의 생성을 초래할 수 있다. 따라서, 새롭게 생성된 작은 서브유닛은 산화된 올리고머 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 향상된 형광 강도에 기여할 것이다. 비산화 서브유닛 분획 (MW < 2000)과 비교하여 산화형 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 비교적 높은 형광 강도를 이해하기 위해, 단리된 서브유닛 분획 (MW < 2000)을 pH-조절된 산화 과정으로 선택적으로 산화시키고 이들의 형광 방출 거동을 동시 pH-조절된 분해/산화 과정으로부터 생성된 산화형 서브유닛 분획 (MW < 2000)과 비교하였다. 314 nm에서 여기를 갖는 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 형광 방출이 주로 기본 올리고머 유닛으로부터 생성된다는 사실을 고려하면, 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 선택적 산화는 ROS-매개 산화에 따른 기본 올리고머 유닛의 형광 방출 거동을 이해하는 것에 대한 통찰력을 제공한다. 도 12-g에 나타낸 바와 같이, 단리된 서브유닛 분획 (MW < 2000)은 pH 조절된 산화 후 약간 감소된 형광 방출 강도를 나타내었다. 또한, 저에너지 영역에서의 방출 기여는 산화 후 감소하였으며 (도 12-g) 314 nm에서 특징적인 피크를 나타내는 상응하는 여기 스펙트럼은 산화의 함수로서 약간 청색 쉬프트된 거동을 나타내었다 (도 12-e). 한편, 동시 분해/산화의 결과로서 산화형 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 형광 방출 스펙트럼은 상응하는 크기-선택된 비산화 서브유닛과 비교하여 적색 쉬프트된 방출 스펙트럼을 나타내었다 (도 12-e). 이러한 결과는 유멜라닌 올리고머 유닛의 화학적 산화가 형광 방출 강도를 향상시키지 않는다는 것을 나타낸다. 약간 감소된 형광 방출은 아마도 그들의 π 컨쥬게이션 (conjugation) 시스템의 변화를 수반하는, 이들의 산화적 부분 분해로부터 유래되었을 것이다. 이러한 결과에 기초하여, 본 발명자는 적층된 올리고머 유닛의 산화-유도된 층간 박리에 의해 생성된, 단일 또는 박층 올리고머가 2 개의 서브유닛 분획의 형광 강도 향상에 기여한다고 결론지었다.

세피아 서브유닛 및 산화형 서브유닛의 광화학적 반응성. 마지막으로, 호기성 조건에서 ROS를 생성하기 위한 세피아 유멜라닌 모델의 광화학적 반응성을 조사하여 이의 계층적 구조, 광학적 특성 및 광생물학적 양상 사이의 관계를 탐구하였다. 호기성 수용액에서 광조사된 생성된 세피아 유멜라닌으로부터 생성된 주요 ROS 생산물인, 수퍼옥시드 및 히드록실 라디칼을 유멜라닌의 구조적 변경의 함수로서 모니터링하였다. 세피아 유멜라닌 모델로부터의 광생성 라디칼 종을 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT)^28,29 및 쿠마린-3-카르복실산 (CCA)^30,31과 같은 ROS 프로브로 관찰하였다. 상기 방법은 각각 수퍼옥시드 라디칼로 환원된 NBT의 환원형으로부터의 흡수 및 CCA 히드록시화 형태로부터의 방출의 진행 (evolution)에 기초한다. 도 12-a 및 c에서 나타낸 바와 같이, 모 세피아로부터 분해된 서브유닛은 광조사 동안 모 세피아 입자와 비교하여 수퍼옥시드 및 히드록실 라디칼의 무시할 만한 신호 향상을 나타내었다. 그러나, 산화형 서브유닛은 ROS를 생성하기 위해 향상된 광화학적 반응성을 나타내었다. 산화형 서브유닛에 대해 ROS를 생성하는 능력은 광조사의 부재 시 모 세피아 입자 및 비산화 서브유닛의 수준에 필적하는 정도로 감소되었다 (도 12-b 및 d). 이는 검출된 ROS가 산화형 서브유닛 및 용존 산소 간의 화학 반응에 의해 생성되는 것이 아니라, 산화형 서브유닛과 산소 분자의 광화학적 반응의 결과라는 것을 나타낸다.

이들의 모 세피아 입자 및 비산화형 서브유닛과 비교하여, 산화형 서브유닛의 향상된 광화학적 반응성은 여러 구조적 요인과 연관되어 있을 수 있다. 유멜라닌에서 광-유도 전자의 비방사성 이완 경로는 산소를 활성화시키고 ROS를 생성하는 과정과 경쟁할 것이다. 따라서, 비교적 높은 형광 서브유닛 종은 낮은 형광 적층 올리고머보다 더 광반응성인 것으로 예상될 수 있다. 따라서, 세피아 서브유닛의 pH-조절된 산화의 결과로서 새로 생성된 형광 종은 산화형 서브유닛의 광화학적 반응성을 증가시킬 것이다. 도 12-a 및 c에 나타낸 바와 같이, 산화형 서브유닛은 서브유닛 분획 (MW < 2000)의 제거 후 여전히 뚜렷한 ROS 생성 능력을 나타내었고, 이는 서브유닛 분획 (MW > 2000)에서 적층 크기가 감소된 적층 올리고머를 포함하는 새로 생성된 형광 서브유닛 종뿐만 아니라, 다른 서브유닛 분획 (MW < 2000)에서의 단일 및 매우 얇은 층 올리고머가 산화형 서브유닛의 향상된 광화학적 반응성을 책임진다는 것을 반영한다. 또한, 유멜라닌은 ROS를 생산하는 감광제 (photosensitizer)뿐만 아니라, 생성된 ROS를 ?칭시킬 수 있는 항산화제로서 작용한다^4,50-52. 이에 따라, 화학적 프로브에 의해 결정된 광생성된 ROS의 양은 두 가지 분별된 기능을 조합한 결과이다. 세피아 서브유닛의 산화는 ROS ?칭 능력을 책임지는 디히드로퀴논 모이어티의 부분적 분해를 유도하기 때문에, 이들의 증가된 광화학적 반응성에 따라 산화형 서브유닛의 감소된 ROS ?칭 능력은 화학적 프로브에 의해 검출되는 광생성된 ROS의 양을 증가시킬 것으로 기대하는 것이 합리적이다. 비산화형 서브유닛 분획의 경우, 단일 올리고머 종의 매우 작은 부분 (MW < 2000)이 조사될 때 ROS를 생성할 수 있지만, 광반응성 종의 양은 대부분의 적층된 서브유닛의 ROS ?칭 능력을 압도하기에 충분하지 않으며, 이는 아마도 화학적 프로브로 결정된 광화학적 반응성을 무시할 만하도록 만들 것이다. ROS의 광생성에서 이러한 구조적 암시로부터, 모 세피아 입자는 작은 부분의 광반응성 단일 올리고머 종조차도 3 차원적으로 응집된 입자 구조에 의해 한정되기 때문에 그의 광화학적 안정성을 유지하는데 큰 이점을 갖는다. 이렇게 계층적으로 집합된 세피아의 구조는 이의 광화학적 반응성을 비활성화하면서 광보호 기능을 유지하기 위해 이용되는 구조적 전략일 수 있다.

유멜라닌의 야누스 거동 ( Janus behavior) 의 제안된 메커니즘. 생물학적으로 관련된 구조적 변경에 따른 세피아 유멜라닌의 광물리학적 특성의 실질적이고 체계적인 변경은 잘 조직된 모델 시스템, pH-조절된 분해 및 동시 분해/산화 과정을 사용하여 명확하게 관찰되었다. 이러한 결과는 유멜라닌의 모순된 생물학적 기능 (광보호 대 감광성)이 서브유닛의 산화와 밀접하게 관련됨을 시사한다. 유멜라닌의 서브유닛 구조 산화의 중요성을 강조하는 유멜라닌의 제안된 구조-특성-기능 (structure-property-function) 관계는 도 14에 개략적으로 요약되어 있다.

형광성 단일 올리고머 종이 유멜라닌의 광반응성을 크게 책임진다는 것을 고려하면, 본 발명자는 적층된 올리고머 유닛의 응집 및 기본 올리고머 유닛의 적층 구조를 포함하는 유멜라닌의 계층적으로 집합된 구조는 유멜라닌이 광보호 기능을 제공하면서 올리고머 서브유닛 종의 광화학적 반응성을 비활성화시키기 위해 채택하는 중요한 구조적 전략일 수 있다고 결론지었다. 이러한 가설에 따르면, 유멜라닌은 넓은 단색 흡수 및 강력한 비방사성 이완 과정을 통해 자외선에 대항하는 효율적인 광보호 기능을 제공할 것이다. 유멜라닌의 응집된 입자 구조가 특정 생물학적 요인에 의해 붕괴되고 서브유닛으로 붕해되더라도, 이들의 적층된 구조는 조사 시 비방사성 이완 과정을 선호하기 때문에 적층된 서브유닛의 대부분은 여전히 광보호 생체분자로 작용할 것이다. 그러나, 바이오시스템에서 과부하된 산화 스트레스에 의해 적층된 올리고머의 디스태킹을 수반하는 구조적 변경은 유멜라닌의 광생물학적 양상을 상당히 변화시키고 상이한 생물학적 역할을 수행하게 할 것이다. 유멜라닌의 구조-생물학적 기능 관계를 가리키는 이러한 관점은 흑색종 생성과 관련하여 유멜라닌의 다양한 광생물학적 양상을 예측하는데 대한 통찰력을 제공한다. 입자 구조의 붕해를 나타내는 멜라노좀의 비정상적인 구조 변경은 정상 색소 세포보다 악성 흑색종 세포에서 더 빈번하게 관찰된다.^24-26 이러한 관찰은 흑색종 생성 과정에서 식균 효소 활성에 의해 생산된 산화적 스트레스를 통해 유멜라닌의 계층적으로 집합된 구조가 변경될 수 있으며, 이의 생물학적 기능이 악성 흑색종의 발달 및 진행에 기여하도록 변화할 수 있음을 반영한다.

결론

유멜라닌의 야누스 생물학적 거동을 이해하기 위해, 생물학적으로 관련된 구조적 변경과 관련하여 유멜라닌의 광물리학적 및 광생물학적 양상을 잘 특성화된 모델 시스템, pH-조절된 분해 및 천연 세피아 유멜라닌의 산화를 통해 탐구하였다. pH 조절된 분해 및 산화 과정에 의해 구조적으로 조절되는 세피아 유멜라닌 모델은, UV 영역에 대해 UV-vis 흡수를 단색적으로 증가시키는 이의 광보호 기능 및 극도로 강한 비산화성 이완 과정을 제공하는, 유멜라닌의 두 가지 핵심적인 광학 특성이 두 가지 특징적인 비공유적 상호작용인, 기본 올리고머 유닛의 적층 및 올리고머의 적층된 층의 응집에 의해 지배된다는 것을 밝혔다. 특히, 그 구조를 서브유닛으로 분해시킬 뿐만 아니라 적층된 서브유닛의 디스태킹을 유발하는, 유멜라닌 서브유닛의 산화는 유멜라닌의 광생물학적 기능을 광보호로부터 ROS를 생성하는 광반응성 종으로 쉬프트시키는 결정적인 요인이다. 이러한 결과는, 계층적으로 집합된 유멜라닌 구조를 올리고머 종으로 붕해시키는 것이 아마도 흑색종 생성 과정에서 식균 효소 활성에 의해 유도될 수 있으며, 상기 붕해가 악성 흑색종의 진행을 자극하는 ROS 생산과 같은, 이의 생물학적 역할에서의 전환을 야기할 수 있다는 가설을 뒷받침하는 명백한 증거를 제공한다.

본 발명자는 본 연구가 유멜라닌의 생물학적 양상의 전체 스펙트럼을 이해하는데 중요한 단서를 제공할 것으로 믿는다. 또한, pH 조절된 분해 및 산화 과정을 통해 유멜라닌의 물리적 특성 및 생물학적 양상을 조작하는 실용적 접근법은, 다양한 영역에서 멜라닌의 노화 관련 구조적 붕괴가 항산화 효율 및 금속 결합 능력과 같은 이의 다른 유익한 물리화학적 특성에 대해 미치는 영향을 조사하고, 안구 질환 (ocular disease) 및 파킨슨 질환 (Parkinson's disease)과 같은 질환 관련 사건에 대한 이의 관련성을 결정하기 위한 신규한 플랫폼을 제공한다.

Ju et al., Biomacromolecules 17:2860-2872 (2016)는 그 전체가 참조로 본원에 통합된다.

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특정 구체예들의 전술한 설명은 당해 기술 분야의 통상의 기술 내에서 지식을 적용함으로써, 당업자가 그러한 특정 구체예들와 같은 다양한 적용들에 대해 과도한 실험없이 및 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어남 없이 용이하게 변형 및/또는 적응시킬 수 있는 본 발명의 일반적인 본질을 충분히 드러낼 것이다. 그러므로, 이러한 적응 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 안내에 기초하여, 개시된 구체예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있도록 의도된다. 본원의 문구 또는 용어는 설명을 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아니며, 본 명세서의 용어 또는 문구는 교시 및 안내에 비추어 통상의 기술자에 의해 해석될 것으로 이해할 것이다.

본 발명의 폭 및 범위는 상기 기재한 예시적인 구체예들 중 어느 것에 의해서도 제한되지 않아야하고, 하기 청구범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.

본원에 기재된 모든 다양한 양상, 구체예 및 옵션은 임의의 및 모든 변형으로 조합될 수 있다.

본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각 개별의 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 통합된 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 통합된다.

Claims (28)

1. 5,6-디히드록실인돌 (5,6-dihydroxylindole: DHI)을 포함하는 분해된 (disassembled) 적층 (stacked) 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 피롤-2,3-디카르복실산 (pyrrole-2,3-dicarboxylic acid: PDCA)을 추가로 포함하는 것인 조성물.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 MelNP의 분해에 의해 생성되는 것인 조성물.
4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 2 내지 약 30 올리고머 층을 포함하는 것인 조성물.
5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 약 0.3 nm 내지 약 16 nm의 두께를 갖는 것인 조성물.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)에 공유결합된 것인 조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 PEG는 약 0.3 KDa 내지 약 40 KDa의 중량 평균 분자량 (weight average molecular weight)을 갖는 것인 조성물.
8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 상자성 (paramagnetic) 금속 이온과 복합체화된 것인 조성물.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 가돌리늄 (Gd), 철 (Fe), 망간 (Mn), 니켈 (Ni), 구리 (Cu), 에르븀 (Er), 유로퓸 (Eu), 홀뮴 (Ho), 및/또는 크로뮴 (Cr)인 것인 조성물.
10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 자기 공명 영상 (magnetic resonance imaging: MRI) 조영제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약학적 조성물.
12. 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 멜라닌-유사 나노입자 (melanin-like nanoparticle: MelNP)에 염기를 첨가여 MelNP를 분해된 적층 멜라닌 올리고머로 분해하는 단계; 및
    산을 첨가하여 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 중화시키는 단계를 포함하는,
    분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 분해는 pH 9 이상에서 발생하는 것인 방법.
14. 5,6-디히드록실인돌 (DHI)을 포함하는 멜라닌-유사 나노입자 (MelNP)에 염기를 첨가하여 10.5 초과의 pH를 수득하는 단계, 및
    MelNP를 분해된 적층 멜라닌 올리고머로 분해하는 단계를 포함하는,
    분해된 적층 멜라닌 올리고머를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
15. 청구항 12 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MelNP는 피롤-2,3-디카르복실산 (PDCA)를 추가로 포함하는 것인 방법.
16. 청구항 12 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MelNP는 멜라닌 전구체인 도파민으로부터 합성된 것인 방법.
17. 청구항 12 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 탈산소화 및/또는 질소 퍼지 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
18. 청구항 12 내지 16 중 어느 한 항에 있어서, 산소화 조건 하에서 수행되는 것인 방법.
19. 청구항 12 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)의 존재 하에 제조되는 것인 방법.
20. 청구항 18에 있어서, 상기 PEG는 약 0.3 KDa 내지 약 40 KDa의 중량 평균 분자량을 갖는 것인 방법.
21. 청구항 12 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 2 내지 약 30 개의 층을 포함하는 것인 방법.
22. 청구항 12 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해된 적층 멜라닌 올리고머는 약 0.3 nm 내지 약 16 nm의 두께를 갖는 것인 방법.
23. 청구항 12 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상자성 금속 이온을 분해된 적층 멜라닌 올리고머에 추가로 첨가하는 것인 방법.
24. 청구항 23에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 가돌리늄 (Gd), 철 (Fe), 망간 (Mn), 니켈 (Ni), 구리 (Cu), 에르븀 (Er), 유로퓸 (Eu), 홀뮴 (Ho), 및/또는 크로뮴 (Cr)인 것인 방법.
25. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 조성물을 개체(subject)에 도입하여, 개체를 영상화 장치에 노출시키는 단계; 및
    일 부위 (an area)에 선택적으로 축적된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 검출하는 단계를 포함하는,
    개체를 영상화하는 방법.
26. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항의 조성물을 개체에 도입하여, 개체를 영상화 장치에 노출시키는 단계; 및
    질환 부위 (area)에 선택적으로 축적된, 분해된 적층 멜라닌 올리고머를 검출하는 단계를 포함하는,
    개체에서 질환을 영상화하는 방법.
27. 청구항 26에 있어서, 상기 질환은 종양인 것인 방법.
28. 청구항 25 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영상화 장치는 MRI인 것인 방법.
    
    
    

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