CN118475372A

CN118475372A - 具有半胱氨酸突变抗体的tlr激动剂免疫缀合物及其用途

Info

Publication number: CN118475372A
Application number: CN202280086855.3A
Authority: CN
Inventors: S·E·阿克曼; M·N·阿朗索; J·格鲁尼沃尔德; R·库迪尔卡; B·萨芬娜; G·萨尔马
Original assignee: Bolt Biotherapeutics Inc
Current assignee: Bolt Biotherapeutics Inc
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2024-08-09
Also published as: JP2024539993A; CA3234604A1; EP4422697A1; WO2023076599A1

Abstract

本发明提供包含通过接头与一个或多个TLR激动剂部分共价连接的半胱氨酸突变抗体的免疫缀合物。本发明进一步提供用免疫缀合物治疗癌症的方法。

Description

具有半胱氨酸突变抗体的TLR激动剂免疫缀合物及其用途

相关申请的交叉引用

本非临时申请要求2021年10月29日提交的美国临时申请第63/273,379号的优先权的权益，该临时申请以引用的方式整体并入。

序列表

本申请含有序列表，其经由专利中心以XML格式提交，并且特此以引用的方式整体并入。所述XML副本创建于2022年10月28日，名称为ST26-17019.019WO1.xml，且大小为40,668字节。

技术领域

本发明通常涉及包含与一个或多个toll样受体(TLR)激动剂部分缀合的半胱氨酸突变抗体的免疫缀合物。

背景技术

需要用于递送抗体和免疫佐剂的新组合物和方法，以便到达难以接近的肿瘤和/或扩展癌症患者及其他受试者的治疗选择。本发明提供这类组合物和方法。

发明内容

本发明通常涉及包含经由接头与一个或多个TLR激动剂部分共价连接的半胱氨酸突变抗体的免疫缀合物。

本发明的另一方面是通过使一种或多种TLR激动剂-接头化合物与半胱氨酸突变抗体缀合来制备免疫缀合物的方法。

本发明的另一方面是包含治疗有效量的免疫缀合物和一种或多种药学上可接受的稀释剂、媒介物、载体或赋形剂的药物组合物，所述免疫缀合物包含经由接头与一个或多个TLR激动剂部分连接的半胱氨酸突变抗体。

本发明的另一方面是治疗癌症的方法，包括施用治疗有效量的免疫缀合物，所述免疫缀合物包含经由接头与一个或多个TLR激动剂部分共价连接的半胱氨酸突变抗体。

本发明的另一方面是免疫缀合物在治疗疾病(特别是癌症)中的用途，所述免疫缀合物包含经由接头与一个或多个TLR激动剂部分共价连接的半胱氨酸突变抗体。

附图说明

图1显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与HCC1954肿瘤细胞以及半胱氨酸突变免疫缀合物Lys IC-1(表11)、IC-2、IC-3、IC-4、IC-8、IC-10、IC-13、IC-16、IC-17和IC-18(表10)及未缀合抗体曲妥珠单抗一起共培养之后的IL-12p70分泌。按浓度增加的免疫缀合物和曲妥珠单抗对IL-12p70的对数产生进行作图

图2显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与HCC1954肿瘤细胞以及半胱氨酸突变免疫缀合物IC-1、IC-12、IC-6、IC-11、IC-5、IC-9、IC-7、IC-14和IC-15(表10)、Lys IC-1(表11)及未缀合抗体曲妥珠单抗一起共培养之后的IL-12p70分泌。按浓度增加的免疫缀合物和曲妥珠单抗对IL-12p70的对数产生进行作图。

图3显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与HCC1954肿瘤细胞以及半胱氨酸突变抗HER2免疫缀合物IC-8、IC-13、IC-17和IC-10及对照酰胺连接的抗HER2缀合物Lys IC-1一起共培养之后的IL-12p70分泌。

图4显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与过表达PD-L1的修饰的HCC1954细胞系以及半胱氨酸突变抗PD-L1免疫缀合物IC-30、IC-31及对照酰胺连接的抗PD-L1缀合物Lys IC-3一起共培养之后的IL-12p70分泌。

图5显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与HPAF II胰腺癌肿瘤细胞以及半胱氨酸突变抗TROP2免疫缀合物IC-27、IC-28、IC-29、IC-32和对照酰胺连接的抗TROP2缀合物Lys IC-2一起共培养之后的IL-12p70分泌。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的某些实施方案，其实施例在所附的结构和化学式中说明。虽然将结合列举的实施方案描述本发明，但将要理解的是，它们并不旨在将本发明限于这些实施方案。相反，本发明旨在涵盖所有的替代、修改和等同方案，这些可以被包括在如权利要求所限定的本发明的范围内。

本领域技术人员将会认识到，许多方法和材料类似或等同于本文描述的那些，它们可用于实施本发明。本发明决不限于所描述的方法和材料。

定义

术语“Toll样受体”和“TLR”是指高度保守的哺乳动物蛋白质家族的任何成员，其识别病原体相关的分子模式，并且充当先天免疫中的关键信号传导元件。TLR多肽共享特征结构，所述特征结构包括具有富亮氨酸重复序列的细胞外结构域、跨膜结构域和参与TLR信号传导的细胞内结构域。

术语“Toll样受体7”和“TLR7”是指与公众可获得的TLR7序列(例如，人TLR7多肽的GenBank登录号AAZ99026或鼠TLR7多肽的GenBank登录号AAK62676)共享至少约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的核酸或多肽。

术语“Toll样受体8”和“TLR8”是指与公众可获得的TLR7序列(例如，人TLR8多肽的GenBank登录号AAZ95441或鼠TLR8多肽的GenBank登录号AAK62677)共享至少约70％、约80％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性的核酸或多肽。

“TLR激动剂”是直接或间接与TLR(例如，TLR7和/或TLR8)结合以诱导TLR信号传导的化合物。TLR信号传导的任何可检测到的差异可指示激动剂刺激或激活TLR。信号传导差异可被表现为例如靶基因表达、信号转导组分的磷酸化、下游元件如核因子-κB(NF-κB)的细胞内定位、某些组分(如IL-1受体相关激酶(IRAK))与其它蛋白质或细胞内结构的缔合或诸如激酶(如丝裂原激活蛋白激酶(MAPK))的组分的生物化学活性的变化。

“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因或其片段的抗原结合区(包括互补决定区(CDR))的多肽。术语“抗体”具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和表现出所需生物活性的抗体片段。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有通过二硫键连接的一条“轻”(约25kDa)链和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链由被称为免疫球蛋白结构域的结构域组成。这些结构域按大小和功能分为不同的类别，例如轻链和重链上的可变结构域或区域(分别为V_L和V_H)以及轻链和重链上的恒定结构域或区域(分别为C_L和C_H)。每条链的N-末端界定了具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区，被称为互补位，主要负责抗原识别，即抗原结合结构域。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们分别又定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。IgG抗体是由四条肽链组成的约150kDa的大分子。IgG抗体含有约50kDa的两条相同的γ类重链和约25kDa的两条相同的轻链，因此具有四聚体四级结构。两条重链彼此连接，并通各自通过二硫键与轻链连接。所得四聚体具有两个相同的半体，它们一起形成Y样形状。叉的每一端含有相同的抗原结合结构域。人有四个IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)，它们按在血清中的丰度顺序命名(即，IgG1是最丰度的)。通常，抗体的抗原结合结构域在与癌细胞结合的特异性和亲和力方面将最为关键。

“双特异性”抗体(bsAb)是将两个不同的表位与癌症结合的抗体(Suurs F.V.等人(2019)Pharmacology&Therapeutics 201:103-119)。双特异性抗体可接合免疫细胞以破坏肿瘤细胞，将有效载荷递送至肿瘤，和/或阻断肿瘤信号传导途径。靶向特定抗原的抗体包括具有至少一个靶向特定抗原的抗原结合区的双特异性或多特异性抗体。在一些实施方案中，靶向单克隆抗体是具有至少一个靶向肿瘤细胞的抗原结合区的双特异性抗体。这类抗原包括但不限于：间皮素、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、HER2、TROP2、CEA、EGFR、5T4、Nectin4、CD19、CD20、CD22、CD30、CD70、B7H3、B7H4(也称为08E)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、RG1、岩藻糖基-GMl、CTLA-4和CD44(WO 2017/196598)。

“抗体构建体”是指包含(i)抗原结合结构域和(ii)Fc结构域的抗体或融合蛋白。

术语“免疫缀合物”是指经由接头与佐剂部分共价键合的抗体构建体。免疫缀合物允许在结合靶抗原时靶向递送活性佐剂部分。

“佐剂”是指能够在暴露于所述佐剂的受试者中引发免疫反应的物质。短语“佐剂部分”是指如本文所述例如通过接头与抗体构建体共价键合的佐剂。佐剂部分可以在与抗体构建体键合时或在对受试者施用免疫缀合物之后自抗体构建体切割(例如，酶促切割)后引发免疫反应。

在一些实施方案中，抗体构建体是抗原结合抗体“片段”，其包含抗体的至少抗原结合区，单独或与其它组件一起构成抗体构建体。许多不同类型的抗体“片段”是本领域中已知的，包括例如(i)Fab片段，其是由V_L、V_H、C_L和CH₁结构域组成的单价片段，(ii)F(ab’)₂片段，其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段，(iv)Fab’片段，其是采用温和还原条件破坏F(ab’)₂片段的二硫桥产生的，(v)二硫化物稳定的Fv片段(dsFv)，和(vi)单链Fv(scFv)，其是通过合成接头连接的Fv片段的两个结构域(即，V_L和V_H)组成的单价分子，所述合成接头使得两个结构域能够作为单个多肽链合成。

抗体或抗体片段可以是更大构建体的一部分，例如抗体片段与另外的区域的缀合物或融合构建体。例如，在一些实施方案中，抗体片段可以与如本文所述的Fc区融合。在其它实施方案中，抗体片段(例如，Fab或scFv)可以是嵌合抗原受体或嵌合T细胞受体的一部分，例如通过与跨膜结构域(任选具有居间接头或“茎”(例如，铰链区))和任选的细胞间信号传导结构域融合。例如，抗体片段可以与t细胞受体的γ和/或δ链融合，以提供结合PD-L1的T细胞受体样构建体。在又一实施方案中，抗体片段是包含CD1或CD3结合结构域和接头的双特异性T细胞接合物(BiTE)的一部分。

“半胱氨酸突变抗体”是其中抗体的一个或多个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的抗体。可以通过抗体工程化方法由亲本抗体制备半胱氨酸突变抗体(Junutula等人，(2008b)Nature Biotech.，26(8):925-932；Dornan等人，(2009)Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；US2012/0121615；WO 2009/052249)。半胱氨酸残基通过工程化半胱氨酸位点处的反应性半胱氨酸硫醇基团提供佐剂如TLR激动剂与抗体的位点特异性缀合，但不干扰免疫球蛋白折叠和组装或改变抗原结合及效应功能。半胱氨酸突变抗体可以与TLR激动剂-接头化合物缀合，并且免疫缀合物的化学计量均匀(例如，在具有单个工程化的突变半胱氨酸位点的抗体中，每个抗体最多有两个TLR激动剂部分)。TLR激动剂-接头化合物具有反应性亲电基团，以与半胱氨酸突变抗体的游离半胱氨酸硫醇基团特异性反应。

“表位”意指与抗原结合结构域结合的抗原的任何抗原决定簇或表位决定簇(即，在抗原结合结构域的互补位)。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面组群组成，如氨基酸或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。

术语“Fc受体”或“FcR”是指与抗体的Fc区结合的受体。Fc受体主要有三类：(1)与IgG结合的FcγR，(2)与IgA结合的FcαR，和(3)与IgE结合的FcεR。FcγR家族包括若干成员，如FcγI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16A)和FcγRIIIB(CD16B)。Fcγ受体在对IgG的亲和力方面不同，并且对IgG亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)也具有不同的亲和力。

如本文所提到的核酸或氨基酸序列“同一性”可通过将所关注的核酸或氨基酸序列与参考核酸或氨基酸序列进行比较来确定。同一性百分比是与所关注的最佳比对的序列与参考序列之间相同(即，是同一)的核苷酸或氨基酸残基数除以最长序列的长度(即，所关注的序列或参考序列任一者的长度，以较长者为准)。可以使用可获得的软件程序进行序列的比对和同一性百分比的计算。此类程序的实例包括CLUSTAL-W、T-Coffee和ALIGN(用于核酸和氨基酸序列的比对)、BLAST程序(例如BLAST 2.1、BL2SEQ、BLASTp、BLASTn等)和FASTA程序(例如、FASTA3x、FASTM和SSEARCH)(用于序列比对和序列相似性搜索)。序列比对算法还公开于例如以下文献中：Altschul等人，J.Molecular Biol.,215(3):403-410(1990)；Beigert等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,106(10):3770-3775(2009)；Durbin等人编著，Biological Sequence Analysis:Probalistic Models of Proteins and NucleicAcids,Cambridge University Press,Cambridge,UK(2009)；Soding，Bioinformatics,21(7):951-960(2005)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.,25(17):3389-3402(1997)；和Gusfield，Algorithms on Strings,Trees and Sequences,Cambridge UniversityPress,Cambridge UK(1997))。序列的同一性百分比(％)也可以例如计算为100x[(同一的位置)/min(TG_A,TG_B)]，其中TG_A和TG_B是在使TG_A和TG_B最小化的比对中肽序列A和B中的残基数和内部缺口位置的总和(Russell等人，J.Mol Biol.,244:332-350(1994))。

“抗体构建体”或“结合剂”包含一起形成抗原结合位点的Ig重链和轻链可变区多肽。重链和轻链可变区中的每一者为包含通过框架区连接的三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)。抗体构建体可以是本领域中已知的包含Ig重链和轻链的多种类型的结合剂中的任一种。例如，结合剂可以是抗体、抗原结合抗体“片段”或T细胞受体。

“生物仿制药”是指已获批准的抗体构建体，其具有的活性特性类似于例如先前批准的靶向PD-L1的抗体构建体，如阿特珠单抗(TECENTRIQ^TM，Genentech,Inc.)、德瓦鲁单抗(IMFINZI^TM，AstraZeneca)和阿维鲁单抗(BAVENCIO^TM，EMD Serono,Pfizer)；先前批准的靶向HER2的抗体构建体，如曲妥珠单抗(HERCEPTIN^TM，Genentech,Inc.)和帕妥珠单抗(PERJETA^TM，Genentech,Inc.)；或靶向CEA的抗体，如拉贝珠单抗(CEA-CIDE^TM、MN-14、hMN14、Immunomedics)CAS登记号219649-07-7)。

“生物改良药”是指经批准的抗体构建体，其改善先前批准的抗体构建体，如阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和拉贝珠单抗。生物改良药可具有优于先前批准的抗体构建体的一种或多种修饰(例如，改变的聚糖谱或独特的表位)。

“氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白质中的任何单体单元。氨基酸包括天然存在的α-氨基酸及其立体异构体以及非天然(非天然存在的)氨基酸及其立体异构体。给定氨基酸的“立体异构体”是指具有相同分子式和分子内键但键和原子的三维排列不同的异构体(例如，L-氨基酸和相应的D-氨基酸)。氨基酸可以被糖基化(例如，N-连接的聚糖、O-连接的聚糖、磷酸聚糖、C-连接的聚糖或糖基磷脂酰肌醇化)或去糖基化。氨基酸在本文中可以用通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。

天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些以及后来经修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷氨酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)及其组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷氨酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)及其组合。

天然存在的氨基酸包括通过翻译后修饰在蛋白质中形成的那些，如瓜氨酸(Cit)。

非天然(非天然存在的)氨基酸包括但不限于以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的L-或D-构型的氨基酸类似物、氨基酸模拟物、合成氨基酸、N-取代的甘氨酸和N-甲基氨基酸。例如，“氨基酸类似物”可以是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢键合的碳、羧基、氨基)但具有修饰的侧链基团或修饰的肽主链的非天然氨基酸，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜和甲硫氨酸甲基锍。“氨基酸模拟物”是指结构不同于氨基酸的一般化学结构、但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化学化合物。

“接头”是指将化合物或材料中的两个或更多个部分共价键合的官能团。例如，连接部分可用来将免疫缀合物中的佐剂部分与抗体构建体共价键合。

“连接部分”是指将化合物或材料中的两个或更多个部分共价键合的官能团。例如，连接部分可用来将免疫缀合物中的佐剂部分与抗体共价键合。用于将连接部分连接到蛋白质和其他材料的有用键包括但不限于酰胺、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸酯、硫代碳酸酯和硫脲。

“二价”是指含有用于连接两个官能团的两个连接点的化学部分；多价连接部分可具有用于连接进一步的官能团的另外的连接点。二价基团可以用后缀“二基”表示。例如，二价连接部分包括二价聚合物部分如二价聚(乙二醇)、二价环烷基、二价杂环烷基、二价芳基和二价杂芳基。“二价环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基”是指具有用于共价连接分子或材料中的两个部分的两个连接点的环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可以是取代的或未取代的。环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基可以被一个或多个选自卤代、羟基、氨基、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的基团取代。

波浪线表示特定化学部分的连接点。如果指定的化学部分存在有两条波浪线则应理解该化学部分可以双向使用，即从左到右或从右到左阅读。在一些实施方案中，存在有两条波浪线的特定部分被认为用作从左到右阅读。

“烷基”是指具有所示碳原子数的直链(straight/linear)或支链饱和脂肪族基团。烷基可包括任何数目的碳，例如一至十二个。烷基的实例包括但不限于甲基(Me，-CH₃)、乙基(Et，-CH₂CH₃)、1-丙基(n-Pr，正丙基，-CH₂CH₂CH₃)、2-丙基(i-Pr，异丙基，-CH(CH₃)₂)、1-丁基(n-Bu，正丁基，-CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-甲基-1-丙基(i-Bu，异丁基，-CH₂CH(CH₃)₂)、2-丁基(s-Bu，仲丁基，-CH(CH₃)CH₂CH₃)、2-甲基-2-丙基(t-Bu，叔丁基，-C(CH₃)₃)、1-戊基(正戊基，-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₃)、3-戊基(-CH(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-2-丁基(-C(CH₃)₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH₃)CH(CH₃)₂)、3-甲基-1-丁基(-CH₂CH₂CH(CH₃)₂)、2-甲基-1-丁基(-CH₂CH(CH₃)CH₂CH₃)、1-己基(-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₃)、2-己基(-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂CH₃)、3-己基(-CH(CH₂CH₃)(CH₂CH₂CH₃))、2-甲基-2-戊基(-C(CH₃)₂CH₂CH₂CH₃)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH₃)CH(CH₃)CH₂CH₃)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH₃)CH₂CH(CH₃)₂)、3-甲基-3-戊基(-C(CH₃)(CH₂CH₃)₂)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH₂CH₃)CH(CH₃)₂)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH₃)₂CH(CH₃)₂)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH₃)C(CH₃)₃、1-庚基、1-辛基等。烷基可以是取代的或未取代的。“取代的烷基”可以被一个或多个选自卤代、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的基团取代。

术语“烷基二基”是指二价烷基。烷基二基的实例包括但不限于亚甲基(-CH₂-)、亚乙基(-CH₂CH₂-)、亚丙基(-CH₂CH₂CH₂-)等。烷基二基也可以被称为“亚烷基”。

“烯基”是指具有指示的碳原子数和至少一个碳-碳双键sp2的直链(线性)或支链不饱和脂族基团。烯基可包括两个至约12个或更多的碳原子。烯基是具有“顺式”和“反式”取向或替代而言“E”和“Z”取向的基团。实例包括但不限于乙烯基或乙烯基(-CH＝CH₂)、烯丙基(-CH₂CH＝CH₂)、丁烯基、戊烯基及其异构体。烯基可以是取代的或未取代的。“取代的烯基”可以被一个或多个选自卤代、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的基团取代。

术语“亚烯基”或“烯基二基”是指直链或支链二价烃基。实例包括但不限于亚乙烯基或亚乙烯基(-CH＝CH-)、烯丙基(-CH₂CH＝CH-)等。

“炔基”是指具有指示的碳原子数和至少一个碳-碳三键sp的直链(线性)或支链不饱和脂族基团。炔基可包括两个至约12个或更多的碳原子。例如，C₂-C₆炔基包括但不限于乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基，-CH₂C≡CH)、丁炔基、戊炔基、己炔基及其异构体炔基可以是取代的或未取代的。“取代的炔基”可以被一个或多个选自卤代、羟基、氨基、氧代(＝O)、烷基氨基、酰氨基、酰基、硝基、氰基和烷氧基的基团取代。

术语“亚炔基”或“炔基二基”是指二价炔基。

术语“碳环”、“碳环基”、“碳环状环”和“环烷基”是指饱和或部分不饱和的单环、稠合双环或桥接多环状环体系，其含有3至12个环原子，或所示原子数。饱和单环碳环状环包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环辛基。饱和双环和多环碳环状环包括例如降冰片烷、[2.2.2]双环辛烷、十氢萘和金刚烷。碳环基团也可以是部分不饱和的，在环中具有一个或多个双键或三键。部分不饱和的代表性碳环基团包括但不限于环丁烯、环戊烯、环己烯、环己二烯(1,3-和1,4-异构体)、环庚烯、环庚二烯、环辛烯、环辛二烯(1,3-、1,4-和1,5-异构体)、降冰片烯和降冰片二烯。

术语“环烷基二基”是指二价环烷基。

“芳基”是指通过从母体芳族环体系的单个碳原子上移除一个氢原子得到的6-20个碳原子(C₆-C₂₀)的一价芳族烃基。芳基可以是单环的，稠合以形成双环或三环基团，或通过键连接以形成联芳基。代表性的芳基包括苯基、萘基和联苯基。其它芳基包括具有亚甲基连接基团的苄基。一些芳基具有6至12个环成员，如苯基、萘基或联苯基。其它芳基具有6至10个环成员，如苯基或萘基。

术语“亚芳基”或“芳基二基”意指通过从母体芳族环体系的两个碳原子上移除两个氢原子得到的6-20个碳原子(C₆-C₂₀)的二价芳族烃基。一些芳基二基在示例性结构中表示为“Ar”。芳基二基包括包含与饱和、部分不饱和的环或芳族碳环状环稠合的芳族环的双环基团。典型的芳基二基包括但不限于衍生自苯(苯基二基)、取代的苯、萘、蒽、亚联苯基、亚茚基、亚茚满基、1,2-二氢萘、1,2,3,4-四氢萘基等的基团。芳基二基基团也称为“亚芳基”，并且任选地被一个或多个本文所述的取代基取代。

术语“杂环”、“杂环基”和“杂环状环”在本文中可互换使用，并且是指饱和或部分不饱和(即，在环内具有一个或多个双键和/或三键)的3至约20个环原子的碳环基团，其中至少一个环原子是选自氮、氧、磷和硫的杂原子，其余环原子是C，其中一个或多个环原子任选地被一个或多个下述取代基独立地取代。杂环可以是具有3至7个环成员(2至6个碳原子和1至4个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7至10个环成员(4至9个碳原子和1至6个选自N、O、P和S的杂原子)的双环，例如：双环[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]体系。杂环描述于Paquette,Leo A.；“Principles of Modern Heterocyclic Chemistry”(W.A.Benjamin,New York,1968)，特别是第1章、第3章、第4章、第6章、第7章和第9章；“The Chemistry ofHeterocyclic Compounds,A series of Monographs”(John Wiley&Sons,New York,1950至今)，特别是第13卷、第14卷、第16卷、第19卷和第28卷；和J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566中。“杂环基”还包括其中杂环基团与饱和的、部分不饱和的环或芳族碳环或杂环状环稠合的基团。杂环状环的示例包括但不限于吗啉-4-基、哌啶-1-基、哌嗪基、哌嗪-4-基-2-酮、哌嗪-4-基-3-酮、吡咯烷-1-基、硫代吗啉-4-基、S-二氧代硫吗啉-4-基、氮杂环辛烷-1-基、氮杂环丁烷-1-基、八氢吡啶并[1,2-a]吡嗪-2-基、[1,4]二氮杂环庚烷-1-基、吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶子基、吗啉代、硫代吗啉代、噻噁烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂基、二氮杂基、硫氮杂基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氢吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己烷基、3-氮杂双环[4.1.0]庚烷基、氮杂双环[2.2.2]己烷基、3H-吲哚基喹嗪基和N-吡啶基脲。螺杂环基部分也包括在此定义的范围内。螺杂环基部分的实例包括氮杂螺[2.5]辛基和氮杂螺[2.4]庚基。其中2个环原子被氧代(＝O)部分取代的杂环基团的实例是嘧啶酮基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。本文的杂环基团任选独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。

术语“杂环基二基”是指3至约20个环原子的二价饱和或部分不饱和(即，在环内具有一个或多个双键和/或三键)碳环基团，其中至少一个环原子是选自氮、氧、磷和硫的杂原子，剩余的环原子是C，其中一个或多个环原子任选独立地被一个或多个如所述的取代基取代。5元和6元杂环基二基的实例包括吗啉基二基、哌啶基二基、哌嗪基二基、吡咯烷基二基、二噁烷基二基、硫代吗啉基二基和S-二氧代硫代吗啉基二基。

术语“杂芳基”是指5、6或7元环的单价芳族基团，并且包括5-20个原子的稠环体系(其中的至少一个是芳族的)，含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。杂芳基基团的示例是吡啶基(包括例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(包括例如4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁二唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、四氢异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋呫基、苯并呋呫基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。杂芳基任选独立地被一个或多个本文所述的取代基取代。

术语“杂芳基二基”是指5、6或7元环的二价芳族基团，并且包括5-20个原子的稠环体系(其中的至少一个是芳族的)，所述稠环体系含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。5元和6元杂芳基二基的实例包括吡啶基二基、咪唑基二基、嘧啶基二基、吡唑基二基、三唑基二基、吡嗪基二基、四唑基二基、呋喃基二基、噻吩基二基、异噁唑基二基二基、噻唑基二基、噁二唑基二基、噁唑基二基、异噻唑基二基和吡咯基二基。

杂环或杂芳基在可能的情况下可以是碳(碳连接)或氮(氮连接)键合的。举例而非限制，碳键合的杂环或杂芳基键合在吡啶的2、3、4、5或6位；哒嗪的3、4、5或6位；嘧啶的2、4、5或6位；吡嗪的2、3、5或6位；呋喃、四氢呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位；噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位；异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位；氮丙啶的2或3位；氮杂环丁烷的2、3或4位；喹啉的2、3、4、5、6、7或8位；或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。

举例而非限制，氮键合的杂环或杂芳基键合在氮丙啶、氮杂环丁烷、吡咯、吡咯烷、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑烷、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑的1位；异吲哚或异吲哚啉的2位；吗啉的4位；和咔唑或β-咔啉的9位。

术语“卤代”和“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴或碘原子。

术语“羰基”本身或作为另一取代基的一部分，是指C(＝O)或-C(＝O)-，即与氧双键结合并与具有羰基的部分中的两个其他基团结合的碳原子。

如本文所用，短语“季铵盐”是指已被烷基取代基(例如，C₁-C₄烷基，如甲基、乙基、丙基或丁基)季铵化的叔胺。

术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指成功治疗或改善损伤、病理、疾患(例如，癌症)或症状(例如，认知障碍)的任何标志，包括任何客观或主观参数，如减轻；缓解；减少症状或使患者更容易忍受症状、损伤、病理或疾患；降低症状进展的速率；减少症状或疾患的频率或持续时间；或者在一些情况下预防症状发作。症状的治疗或改善可基于任何客观或主观参数，包括例如身体检查的结果。

术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”在本文中用于指这样的细胞，其表现出自主的、不受调控的生长，使得细胞表现出以细胞增殖显著失控为特征的异常生长表型。在本发明的上下文中用于检测、分析和/或治疗的所关注的细胞包括癌细胞(例如，来自患有癌症的个体的癌细胞)、恶性癌细胞、转移前癌细胞、转移性癌细胞和非转移性癌细胞。几乎每种组织的癌症都是已知的。短语“癌症负担”是指受试者体内的癌细胞数量或癌症体积。减少癌症负担相应地是指减少受试者体内的癌细胞数量或癌细胞体积。本文使用的术语“癌细胞”是指作为癌细胞的任何细胞(例如，来自个体可被治疗的任何癌症，例如，从患有癌症的个体中分离)或来源于癌细胞，例如癌细胞的克隆。例如，癌细胞可来自已确立的癌细胞系，可以是分离自患有癌症的个体的原代细胞，可以是来自分离自患有癌症的个体的原代细胞的子代细胞等。在一些实施方案中，该术语也可以指癌细胞的一部分，如癌细胞的亚细胞部分、细胞膜部分或细胞裂解物。许多类型的癌症是本领域技术人员已知的，包括实体瘤如癌、肉瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、淋巴瘤和骨髓瘤，以及循环癌如白血病。

如本文所用，术语“癌症”包括任何形式的癌症，包括但不限于实体瘤癌症(例如，皮肤癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、平滑肌肉瘤、头颈部鳞状细胞癌、黑素瘤和神经内分泌癌)和液体癌(例如，血液癌)；癌；软组织肿瘤；肉瘤；畸胎瘤；黑素瘤；白血病；淋巴瘤；和脑癌，包括微小残留病，并且包括原发性肿瘤和转移性肿瘤两者。

“PD-L1表达”是指在细胞表面上具有PD-L1受体的细胞。如本文所用，“PD-L1过表达”是指与对应的非癌细胞相比具有更多PD-L1受体的细胞。

“HER2”是指蛋白质人表皮生长因子受体2。

“HER2表达”是指在细胞表面上具有HER2受体的细胞。例如，细胞可以具有在细胞表面上的约20,000至约50,000个HER2受体。如本文所用，“HER2过表达”是指具有大于约50,000个HER2受体的细胞。例如，与对应的非癌细胞(例如，约1百万个或2百万个HER2受体)相比，细胞的HER2受体数量为2、5、10、100、1,000、10,000、100,000或1,000,000倍。估计HER2在约25％至约30％的乳腺癌中过表达。

癌症的“病理学”包括损害患者健康的所有现象。这包括但不限于异常或不可控的细胞生长、转移、干扰邻近细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其它分泌产物、抑制或加重炎症或免疫反应、瘤形成、癌前病变、恶性肿瘤，以及侵袭周围或远处的组织或器官，如淋巴结。

如本文所用，短语“癌症复发”和“肿瘤复发”及其语法变型是指肿瘤或癌细胞在癌症诊断后的进一步生长。特别地，当癌组织中发生进一步的癌细胞生长时，可能会发生复发。类似地，“肿瘤扩散”发生在肿瘤细胞散布到局部或远处组织和器官时，因此，肿瘤扩散涵盖肿瘤转移。当肿瘤生长局部扩散以通过压迫、破坏或阻止正常器官功能损害受累组织的功能时，就会发生“肿瘤侵袭”。

如本文所用，术语“转移”是指癌性肿瘤在器官或身体部位中的生长，其与原始癌性肿瘤的器官没有直接联系。转移将被理解为包括微转移，其是在与原始癌性肿瘤的器官没有直接联系的器官或身体部位中存在不可检测量的癌细胞。转移也可以被定义为过程的若干步骤，如癌细胞从原始肿瘤部位离开，以及癌细胞迁移和/或侵入身体的其它部位。

短语“有效量”和“治疗有效量”是指诸如免疫缀合物的物质产生施用的治疗效果的剂量或量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员采用已知的技术确定(参见例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd，TheArt,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，DosageCalculations(1999)；Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第11版(McGraw-Hill，2006)；和Remington:The Science and Practice ofPharmacy，第22版，(Pharmaceutical Press，London，2012))。在癌症的情况下，治疗有效量的免疫缀合物可减少癌细胞的数量；缩小肿瘤尺寸；抑制(即，在一定程度上减缓且优选停止)癌细胞向外周器官的浸润；抑制(即，在一定程度上减缓且优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。就免疫缀合物可以阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度而言，其可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，功效可以例如通过评定疾病进展时间(time to diseaseprogression,TTP)和/或确定反应率(response rate,RR)来测量

“接受者”、“个体”、“受试者”、“宿主”和“患者”可互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者(例如，人)。用于治疗目的的“哺乳动物”是指被归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物以及动物园动物、赛场动物或宠物动物，如狗、马、猫、母牛、绵羊、山羊、猪、骆驼等。在某些实施方案中，哺乳动物是人。

本发明的上下文中的短语“协同佐剂”或“协同组合”包括两种免疫调节剂的组合，如受体激动剂、细胞因子和佐剂多肽，其组合相对于任一者的单独施用引发免疫的协同效应。特别地，本文公开的免疫缀合物包含要求保护的佐剂和抗体构建体的协同组合。这些协同组合在施用后引发更大的免疫效应，例如相对于不存在其它部分的情况下施用抗体构建体或佐剂。进一步地，与单独施用抗体构建体或佐剂时相比，可以施用的免疫缀合物的量减少(如通过作为免疫缀合物的一部分施用的抗体构建体的总数量或佐剂的总数量来测量)。

如本文所用，术语“施用”是指对受试者进行肠胃外、静脉内、腹膜内、肌内、肿瘤内、病灶内、鼻内或皮下施用、口服施用、作为栓剂施用、局部接触、鞘内施用或植入缓释装置，例如微型渗透泵。

如本文用于修饰数值的术语“约”和“大约”表示围绕该数值的紧密范围。因此，如果“X”是所述值，则“约X”或“大约X”表示0.9X至1.1X的值，例如0.95X至1.05X或0.99X至1.01X。提到“约X”或“大约X”具体表示至少值X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X。因此，“约X”和“大约X”旨在教导和提供对例如“0.98X”的权利要求限制的书面描述支持。

抗体靶标

在一些实施方案中，免疫缀合物的抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标(例如，与选自以下的靶标特异性结合)：5T4、ABL、ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADORA2A、聚集蛋白聚糖、AGR2、AICDA、AIF1、AIGI、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、AR、芳香酶、ATX、AX1、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、B7.1、B7.2、B7-H1、BAD、BAFF、BAG1、BAI1、BCR、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLR1(MDR15)、BIyS、BMP1、BMP2、BMP3B(GDFIO)、BMP4、BMP6、BMP8、BMPRTA、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(网蛋白)、BRCA1、C19orflO(IL27w)、C3、C4A、C5、C5R1、CANT1、CAPRIN-1、CASP1、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCLI(1-309)、CCLI1(嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin))、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-Id)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MEP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-I)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CCL3(MIP-Ia)、CCL4(MIPIb)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-IRB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TERI/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CD19、CDIC、CD2、CD20、CD21、CD200、CD-22、CD24、CD27、CD28、CD3、CD33、CD35、CD37、CD38、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45RB、CD47、CD52、CD69、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CD8、CD80、CD81、CD83、CD86、CD137、CD152、CD274、CDH1(E钙粘蛋白)、CDH1O、CDH12、CDH13、CDH18、CDH19、CDH2O、CDH5、CDH7、CDH8、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CERI、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST1O、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、CLDN3、CLDN7(闭合蛋白(claudin)-7)、CLDN18.2(闭合蛋白18.2)、CLN3、CLU(簇蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COL18A1、COLIA1、COL4A3、COL6A1、CR2、Cripto、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTL8、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CL1(SCYD1)、CX3CR1(V28)、CXCL1(GRO1)、CXCL1O(IP-IO)、CXCLI1(1-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR4、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYB5、CYC1、CYSLTR1、DAB2IP、DES、DKFZp451J0118、DNCL1、DPP4、E2F1、Engel、Edge、Fennel、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、Enola、ENO2、ENO3、EPHA1、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHA9、EPRA10、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB5、EPHB6、EPHRIN-A1、EPHRIN-A2、EPHRINA3、EPHRIN-A4、EPHRIN-A5、EPHRIN-A6、EPHRIN-B1、EPHRIN-B2、EPHRIN-B3、EPHB4、EPG、ERBB2(Her-2)、EREG、ERK8、雌激素受体、Earl、ESR2、F3(TF)、FADD、法尼基转移酶、FasL、FASNf、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF8、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FILI(EPSILON)、FBL1(ZETA)、FLJ12584、FLJ25530、FLRT1(纤连蛋白)、FLT1、FLT-3、FOS、FOSL1(FRA-1)、FY(DARC)、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GD2、GDF5、GFI1、GGT1、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPR81(FKSG80)、GRCC1O(C1O)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、Hedgehog、HGF、HIF1A、HIP1、组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HLA-E、HM74、HMOXI、HSP90、HUMCYT2A、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、EFNA6、BFNA7、IFNB1、IFNγ、IFNW1、IGBP1、IGF1、IGFIR、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、DL-1、ILIO、ILIORA、ILIORB、IL-1、IL1R1(CD121a)、IL1R2(CD121b)、IL-IRA、IL-2、IL2RA(CD25)、IL2RB(CD122)、IL2RG(CD132)、IL-4、IL-4R(CD123)、IL-5、IL5RA(CD125)、IL3RB(CD131)、IL-6、IL6RA、(CD126)、IR6RB(CD130)、IL-7、IL7RA(CD127)、IL-8、CXCR1(IL8RA)、CXCR2(IL8RB/CD128)、IL-9、IL9R(CD129))、IL-10、IL10RA(CD210)、IL10RB(CDW210B)、IL-11、IL11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL13RA1、IL13RA2、IL14、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17A、IL17B、IL17C、IL17R、IL18、IL18BP、IL18R1、IL18RAP、IL19、ILIA、ILIB、ILIF10、ILIF5、IL1F6、ILIF7、IL1F8、DL1F9、ILIHYI、ILIR1、ILIR2、ILIRAP、ILIRAPLI、ILIRAPL2、ILIRL1、IL1RL2、ILIRN、IL2、IL20、IL20RA、IL21R、IL22、IL22R、IL22RA2、IL23、DL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL30、IL3RA、IL4、IL4、IL6ST(糖蛋白130)、ILK、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(α6整合素)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(β4整合素)、JAG1、JAK1、JAK3、JTB、JUN、K6HF、KAI1、KDR、KITLG、KLF5(GC BoxBP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、LAMA5、LEP(瘦素)、Lingo-p75、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b))、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或OMgp、MAP2K7(c-Jun)、MCP-1、MDK、MIB1、中期因子(midkine)、MIF、MISRII、MJP-2、MK、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫连接素-UI)、mTOR、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、NCK2、神经蛋白聚糖、Nectin-4、NFKBI、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgRNogo66(Nogo)、NgR-p75、NgR-Troy、NMEI(NM23A)、NOTCH、NOTCH1、NOX5、NPPB、NROB1、NROB2、NRID1、NR1D2、NR1H2、NR1H3、NR1H4、NR112、NR113、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NR5A1、NR5A2、NR6A1、NRP1、NRP2、NT5E、NTN4、ODZI、OPRDI、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCDGF、PCNA、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PECAMI、peg-天冬酰胺酶、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷酸聚糖、PIAS2、PI3激酶、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDCI、PKC、PKC-β、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PIN、RAC2(P21Rac2)、RANK、RANK配体、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFI1O(ZNF144)、Ron、ROBO2、RXR、S100A2、SCGB 1D2(亲脂蛋白B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞激活细胞因子)、SDF2、SERPENA1、SERPINA3、SERPINB5(maspin)、SERPINEI(PAI-I)、SERPINFI、SHIP-1、SHIP-2、SHB1、SHB2、SHBG、SfcAZ、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Spr1)、ST6GAL1、STAB1、STATE、STEAP、STEAP2、TB4R2、TBX21、TCP1O、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGEBR1、TGFBR2、TGFBR3、THIL、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TLR11、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSF5、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFSF1O(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNSF14(HVEM-L)、TNFRSF14(HVEM)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TOLLIP、Toll样受体、TOP2A(拓扑异构酶1ia)、TP53、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、TRKA、TREM1、TREM2、TROP2、TRPC6、TSLP、TWEAK、酪氨酸酶、uPAR、VEGF、VEGFB、VEGFC、多能蛋白聚糖、VHL C5、VLA-4、Wnt-1、XCL1(tymphotactin)、XCL2(SCM-Ib)、XCRI(GPR5/CCXCR1)、YYI、ZFPM2、CLEC4C(BDCA-2、DLEC、CD303、CLECSF7)、CLEC4D(MCL、CLECSF8)、CLEC4E(Mincle)、CLEC6A(Dectin-2)、CLEC5A(MDL-1、CLECSF5)、CLEC1B(CLEC-2)、CLEC9A(DNGR-1)、CLEC7A(Dectin-1)、PDGFRa、SLAMF7、GP6(GPVI)、LILRA1(CD85I)、LILRA2(CD85H、ILT1)、LILRA4(CD85G、ILT7)、LILRA5(CD85F、ILT11)、LILRA6(CD85b、ILT8)、NCR1(CD335、LY94、NKp46)、NCR3(CD335、LY94、NKp46)、NCR3(CD337、NKp30)、OSCAR、TARM1、CD300C、CD300E、CD300LB(CD300B)、CD300LD(CD300D)、KIR2DL4(CD158D)、KIR2DS、KLRC2(CD159C、NKG2C)、KLRK1(CD314、NKG2D)、NCR2(CD336、NKp44)、PILRB、SIGLEC1(CD169，SN)、SIGLEC14、SIGLEC15(CD33L3)、SIGLEC16、SIRPB1(CD172B)、TREM1(CD354)、TREM2和KLRF1(NKp80)。

在一些实施方案中，抗体与FcRγ偶联受体结合。在一些实施方案中，FcRγ偶联受体选自由以下组成的组：GP6(GPVI)、LILRA1(CD85I)、LILRA2(CD85H、ILT1)、LILRA4(CD85G、ILT7)、LILRA5(CD85F、ILT11)、LILRA6(CD85b、ILT8)、NCR1(CD335、LY94、NKp46)、NCR3(CD335、LY94、NKp46)、NCR3(CD337、NKp30)、OSCAR和TARM1。

在一些实施方案中，抗体与DAP12偶联受体结合。在一些实施方案中，DAP12偶联受体选自由以下组成的组：CD300C、CD300E、CD300LB(CD300B)、CD300LD(CD300D)、KIR2DL4(CD158D)、KIR2DS、KLRC2(CD159C、NKG2C)、KLRK1(CD314、NKG2D)、NCR2(CD336、NKp44)、PILRB、SIGLEC1(CD169、SN)、SIGLEC14、SIGLEC15(CD33L3)、SIGLEC16、SIRPB1(CD172B)、TREM1(CD354)和TREM2。

在一些实施方案中，抗体与携带hemITAM的受体结合。在一些实施方案中，携带hemITAM的受体是KLRF1(NKp80)。

在一些实施方案中，抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标：CLEC4C(BDCA-2、DLEC、CD303、CLECSF7)、CLEC4D(MCL、CLECSF8)、CLEC4E(Mincle)、CLEC6A(Dectin-2)、CLEC5A(MDL-1、CLECSF5)、CLEC1B(CLEC-2)、CLEC9A(DNGR-1)和CLEC7A(Dectin-1)。在一些实施方案中，抗体能够结合CLEC6A(Dectin-2)或CLEC5A。在一些实施方案中，抗体能够结合CLEC6A(Dectin-2)。

在一些实施方案中，抗体能够结合选自以下的一种或多种靶标(例如，与选自以下的靶标特异性结合)：ATP5I(Q06185)、OAT(P29758)、AIFM1(Q9Z0X1)、AOFA(Q64133)、MTDC(P18155)、CMC1(Q8BH59)、PREP(Q8K411)、YMEL1(O88967)、LPPRC(Q6PB66)、LONM(Q8CGK3)、ACON(Q99KI0)、ODO1(Q60597)、IDHP(P54071)、ALDH2(P47738)、ATPB(P56480)、AATM(P05202)、TMM93(Q9CQW0)、ERGI3(Q9CQE7)、RTN4(Q99P72)、CL041(Q8BQR4)、ERLN2(Q8BFZ9)、TERA(Q01853)、DAD1(P61804)、CALX(P35564)、CALU(O35887)、VAPA(Q9WV55)、MOGS(Q80UM7)、GANAB(Q8BHN3)、ERO1A(Q8R180)、UGGG1(Q6P5E4)、P4HA1(Q60715)、HYEP(Q9D379)、CALR(P14211)、AT2A2(O55143)、PDIA4(P08003)、PDIA1(P09103)、PDIA3(P27773)、PDIA6(Q922R8)、CLH(Q68FD5)、PPIB(P24369)、TCPG(P80318)、MOT4(P57787)、NICA(P57716)、BASI(P18572)、VAPA(Q9WV55)、ENV2(P11370)、VAT1(Q62465)、4F2(P10852)、ENOA(P17182)、ILK(O55222)、GPNMB(Q99P91)、ENV1(P10404)、ERO1A(Q8R180)、CLH、(Q68FD5)、DSG1A(Q61495)、AT1A1(Q8VDN2)、HYOU1(Q9JKR6)、TRAP1(Q9CQN1)、GRP75(P38647)、ENPL(P08113)、CH60(P63038)和CH10(Q64433)。在前面的列表中，登录号在括号中示出。

在一些实施方案中，抗体与选自CDH1、CD19、CD20、CD29、CD30、CD38、CD40、CD47、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR、Her2、SLAMF7和gp75的抗原结合。在一些实施方案中，抗原选自CD19、CD20、CD47、EpCAM、MUC1、MUC16、EGFR和Her2。在一些实施方案中，抗体与选自Tn抗原和Thomsen-Friedenreich抗原的抗原结合。

在一些实施方案中，抗体或Fc融合蛋白选自：阿巴伏单抗(abagovomab)、阿巴西普(abatacept)(也称为)、阿昔单抗(abciximab)(也称为c7E3Fab)、阿达木单抗(adalimumab)(也称为)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)(也称为MabCampath或Campath-1H)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿非莫单抗(afelimomab)、马安那莫单抗(anatumomab mafenatox)、阿尼莫单抗(anetumumab)、安如珠单抗(anrukizumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、阿塞珠单抗(aselizumab)、阿利珠单抗(atlizumab)、阿托木单抗(atorolimumab)、巴匹组单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)(也称为)、巴维昔单抗(bavituximab)、贝妥莫单抗(bectumomab)(也称为)、贝利木单抗(belimumab)(也称为)、柏替木单抗(bertilimumab)、贝索单抗(besilesomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(也称为)、巴比西单抗(biciromab brallobarbital)、莫比伐珠单抗(bivatuzumabmertansine)、坎帕斯(campath)、康纳单抗(canakinumab)(也称为ACZ885)、莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine)、卡罗单抗(capromab)(也称为)、卡妥索单抗(catumaxomab)(也称为)、西利珠单抗(cedelizumab)(也称为)、培塞利珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)(也称为)、克立昔单抗(clenoliximab)、达西组单抗(dacetuzumab)、达昔单抗(dacliximab)、达克珠单抗(daclizumab)(也称为)、地诺单抗(denosumab)(也称为AMG 162)、地莫单抗(detumomab)、阿托度单抗(dorlimomab aritox)、达匹利珠单抗(dorlixizumab)、度妥木单抗(duntumumab)、德里姆单抗(durimulumab)、德木鲁单抗(durmulumab)、依美昔单抗(ecromeximab)、依库珠单抗(eculizumab)(也称为)、埃巴单抗(edobacomab)、依决洛单抗(edrecolomab)(也称为Mab17-1A、)、依法珠单抗(efalizumab)(也称为)、依芬古单抗(efungumab)(也称为)、艾西莫单抗(elsilimomab)、培恩莫单抗(enlimomab pegol)、西依匹莫单抗(epitumomab cituxetan)、依法珠单抗(efalizumab)、依匹莫单抗(epitumomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、厄利珠单抗(erlizumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)(也称为)、依那西普(etanercept)(也称为)、埃达组单抗(etaracizumab)(也称为埃妥珠单抗(etaratuzumab)、 )、艾韦单抗(exbivirumab)、法索单抗(fanolesomab)(也称为)、法拉莫单抗(faralimomab)、泛维珠单抗(felvizumab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)(也称为)、加利昔单抗(galiximab)、更汀芦单抗(gantenerumab)、加维莫单抗(gavilimomab)(也称为)、奥吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)(也称为)、戈利木单抗(golimumab)(也称为CNTO 148)、戈利昔单抗(gomiliximab)、伊巴组单抗(ibalizumab)(也称为TNX-355)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)(也称为)、伊戈伏单抗(igovomab)、英西单抗(imciromab)、英夫利昔单抗(infliximab)(也称为)、伊诺莫单抗(inolimomab)、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗(ipilimumab)(也称为MDX-010、MDX-101)、伊妥木单抗(iratumumab)、凯利昔单抗(keliximab)、拉贝妥珠单抗(labetuzumab)、来马索单抗(lemalesomab)、莱布利珠单抗(lebrilizumab)、乐德木单抗(lerdelimumab)、来沙木单抗(lexatumumab)(也称为HGS-ETR2、ETR2-ST01)、雷妥木单抗(lexitumumab)、利韦单抗(libivirumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、马帕木单抗(mapatumumab)(也称为HGSETR1、TRM-1)、马司莫单抗(maslimomab)、马妥珠单抗(matuzumab)(也称为EMD72000)、美泊利单抗(mepolizumab)(也称为)、美替木单抗(metelimumab)、米拉组单抗(milatuzumab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫罗木单抗(morolimumab)、莫维珠单抗(motavizwnab)(也称为)、莫罗单抗(muromonab)(也称为OKT3)、他那可单抗(nacolomab tafenatox)、埃托那普妥莫单抗(naptumomab estafenatox)、那他珠单抗(natalizumab)(也称为)、奈巴库单抗(nebacumab)、奈瑞莫单抗(nerelimomab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)(也称为)、诺非妥莫单抗(nofetumomab merpentan)(也称为)、奥克立珠单抗(ocrelizumab)、奥度莫单抗(odulimomab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)(也称为)、奥戈伏单抗(oregovomab)(也称为)、奥昔珠单抗(otelixizumab)、帕吉昔单抗(pagibaximab)、帕利珠单抗(palivizumab)(也称为)、帕尼单抗(panitumumab)(也称为ABX-EGF、)、帕考珠单抗(pascolizumab)、派姆单抗(pemtumomab)(也称为)、帕妥珠单抗(也称为2C4、)、培克珠单抗(pexelizumab)、平妥莫单抗(pintumomab)、普立昔单抗(priliximab)、普托木单抗(pritumumab)、雷珠单抗(ranibizumab)(也称为)、雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞加韦单抗(regavirumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗(rituximab)(也称为 )、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、沙妥莫单抗(satumomab)、司韦单抗(sevirumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、西利珠单抗(siplizumab)(也称为MEDI-507)、索土珠单抗(sontuzumab)、司他芦单抗(stamulumab)(也称为MYO-029)、硫索单抗(sulesomab)(也称为)、替他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(tadocizumab)、他利珠单抗(talizumab)、帕他莫单抗(taplitumomab paptox)、替非组单抗(tefibazumab)(也称为)、阿替莫单抗(telimomab aritox)、替奈昔单抗(teneliximab)、替利组单抗(teplizumab)、替西木单抗(ticilimumab)、托珠单抗(tocilizumab)(也称为)、托拉珠单抗(toralizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(也称为)、曲美木单抗(tremelimumab)(也称为CP-675,206)、西莫白介素单抗(tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(tuvirumab)、乌珠单抗(urtoxazumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)(也称为CNTO1275)、伐利昔单抗(vapaliximab)、维妥组单抗(veltuzumab)、维帕莫单抗(vepalimomab)、维西珠单抗(visilizumab)(也称为)、伏洛昔单抗(volociximab)(也称为M200)、伏妥莫单抗(votumumab)(也称为)、扎芦木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)(也称为HuMAX-CD4)、齐拉木单抗(ziralimumab)、阿佐莫单抗(zolimomab aritox)、达雷木单抗(daratumumab)、埃罗妥昔单抗(elotuxumab)、奥比托珠单抗(obintunzumab)、奥拉单抗(olaratumab)、维布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、阿波西普(afibercept)、阿巴西普、贝拉西普(belatacept)、阿波西普、依那西普、罗米司亭(romiplostim)、SBT-040(序列在US2017/0158772中列出)。在一些实施方案中，抗体是利妥昔单抗。

半胱氨酸突变抗体

本发明的免疫缀合物包含半胱氨酸突变抗体。

免疫缀合物的示例性实施方案包括具有选自由以下组成的组的半胱氨酸突变的半胱氨酸突变抗体：根据EU格式编号的K145C、S114C、E105C、S157C、L174C、G178C、S159C、V191C、L201C、S119C、V167C、I199C、T129C、Q196C、A378C、K149C、K188C和A140C。

在一些实施方案中，半胱氨酸突变抗体包含用选自抗体或抗体片段的重链的某些位置(包括但不限于表3、4、7中的那些位置)的半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，且其中所述位置是根据EU格式编号的。

在一些实施方案中，半胱氨酸突变抗体包含在其恒定区上用选自抗体或抗体片段的轻链的某些位置(包括但不限于表1、2、5、6中的那些位置)的半胱氨酸对一个或多个氨基酸的取代，其中所述位置是根据EU系统编号的，且其中所述轻链是人κ轻链。

在一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基数目发生改变：增加或减少(US 5677425)。可以改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目，例如以促进轻链和重链的组装，或者提高或降低抗体的稳定性。选择半胱氨酸取代的位点以提供稳定且均质的缀合物。修饰的抗体或片段可具有两个或更多个半胱氨酸取代，并且这些取代可以与如本文所述的其它抗体修饰和缀合方法组合使用。在抗体的特定位置插入半胱氨酸的方法是本领域中已知的，参见例如Lyons等人，(1990)Protein Eng.,3:703-708、WO2011/005481、WO2014/124316、WO 2015/138615。

本发明的实施方案的范围内包括本文所述的半胱氨酸突变抗体构建体或抗原结合结构域的功能变体。如本文所用的术语“功能变体”是指具有与亲本抗体构建体或抗原结合结构域具有实质或显著序列同一性或相似性的抗原结合结构域的抗体构建体，所述功能变体保留了其为变体的抗体构建体或抗原结合结构域的生物活性。功能变体涵盖例如本文所述的抗体构建体或抗原结合结构域(亲本抗体构建体或抗原结合结构域)的那些变体，其以与亲本抗体构建体或抗原结合结构域相似的程度、相同的程度或更高的程度保留了识别表达例如但不限于PD-L1、HER2、CEA或TROP2的靶细胞的能力。

关于抗体构建体或抗原结合结构域，功能变体与所述抗体构建体或抗原结合结构域在氨基酸序列上可以例如是至少约30％、约50％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多同一的。

功能变体可例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本抗体构建体或抗原结合结构域的氨基酸序列。替代地或另外地，功能变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本抗体构建体或抗原结合结构域的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守氨基酸取代可增强功能变体的生物活性，使得功能变体的生物活性与亲本抗体构建体或抗原结合结构域相比增加。

包含本发明的免疫缀合物的抗体包括Fc工程化变体。在一些实施方案中，Fc区中导致与一种或多种Fc受体的结合受到调节的突变可包括以下突变中的一者或多者：SD(S239D)、SDIE(S239D/I332E)、SE(S267E)、SELF(S267E/L328F)、SDIE(S239D/I332E)、SDIEAL(S239D/I332E/A330L)、GA(G236A)、ALIE(A330L/I332E)、GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)、V9(G237D/P238D/P271G/A330R)和V11(G237D/P238D/H268D/P271G/A330R)，和/或在以下氨基酸处的一个或多个突变：E345R、E233、G237、P238、H268、P271、L328和A330。用于调节Fc受体结合的另外的Fc区修饰描述于例如US2016/0145350、US 7416726和US 5624821中，上述专利文献特此以全文引用的方式并入本文。

包含本发明的免疫缀合物的抗体包括聚糖变体，如无岩藻糖基化。在一些实施方案中，结合剂的Fc区被修饰成与天然未修饰的Fc区相比具有改变的Fc区糖基化模式。

本发明的抗体构建体或抗原结合结构域的氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域中已知的，并且包括这样的氨基酸取代，其中具有某些物理和/或化学特性的氨基酸被交换为具有相同或相似化学或物理特性的另一种氨基酸。例如，保守氨基酸取代可以是酸性/带负电荷的极性氨基酸取代为另一种酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如，Asp或Glu)、具有非极性侧链的氨基酸取代为另一种具有非极性侧链的氨基酸(例如，Ala、Gly、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Cys、Val等)、碱性/带正电荷的极性氨基酸取代为另一种碱性/带正电荷的极性氨基酸(例如，Lys、His、Arg等)、具有极性侧链的不带电荷的氨基酸取代为另一种具有极性侧链的不带电荷的氨基酸(例如，Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr等)、具有β-支链侧链的氨基酸取代为另一种具有β-支链侧链的氨基酸(例如，Ile、Thr和Val)、具有芳族侧链的氨基酸取代为另一种具有芳族侧链的氨基酸(例如，His、Phe、Trp和Tyr)等。

抗体构建体或抗原结合结构域可基本上由本文所述的一个或多个指定氨基酸序列组成，使得其它组分(例如，其它氨基酸)不实质性改变抗体构建体或抗原结合结构域功能变体的生物活性。

在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体含有修饰的Fc区，其中所述修饰调节Fc区与一种或多种Fc受体的结合。

在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体(例如，与至少两个佐剂部分缀合的抗体)在Fc区含有一个或多个修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)，与Fc区中缺乏突变的天然抗体相比，所述一个或多个修饰导致与一种或多种Fc受体(例如，FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和/或FcγRIIIB(CD16b))的结合受到调节(例如，增加的结合或减少的结合)。在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体在Fc区含有减少抗体的Fc区与FcγRIIB的结合的一个或多个修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)。在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体在抗体的Fc区中含有一个或多个修饰(例如，氨基酸插入、缺失和/或取代)，其减少抗体与FcγRIIB的结合，同时与在Fc区中缺乏突变的天然抗体相比维持与FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)和/或FcRγIIIA(CD16a)相同的结合或与之结合增加。在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体在Fc区中含有增加抗体的Fc区与FcγRIIB的结合的一个或多个修饰。

在一些实施方案中，通过抗体的Fc区中相对于抗体的天然Fc区的突变提供受调节的结合。突变可以在CH2结构域、CH3结构域或其组合中。“天然Fc区”与“野生型Fc区”同义，并且包含与见于自然界中的Fc区的氨基酸序列同一或与见于天然抗体(例如，西妥昔单抗)中的Fc区的氨基酸序列同一的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区和天然序列人IgG4 Fc区以及其天然存在的变体。天然序列Fc包括Fc的各种同种异型(Jefferis等人，(2009)mAbs,1(4):332-338)。

在一些实施方案中，免疫缀合物的抗体的Fc区被修饰以具有与天然未修饰的Fc区相比改变的Fc区糖基化模式。人免疫球蛋白在每条重链的Cγ2结构域中的Asn297残基处被糖基化。这种N-连接的寡糖由核心七糖N-乙酰葡糖胺4甘露糖3(GlcNAc4Man3)组成。已知用内切糖苷酶或PNG酶F移除七糖导致抗体Fc区的构象变化，这可显著降低与激活FcγR的抗体结合亲和力，并导致效应功能降低。核心七糖通常用半乳糖、二等分GlcNAc、岩藻糖或唾液酸修饰，这会有差别地影响Fc与激活和抑制性FcγR的结合。另外，已证明α2,6-唾液酸化增强体内抗炎活性，而无岩藻糖基化(afucosylation)导致FcγRIIIa结合改善，并使抗体依赖性细胞毒性和抗体依赖性吞噬作用增加10倍。特定的糖基化模式因此可用于控制炎症效应功能。

在一些实施方案中，改变糖基化模式的修饰是突变。例如，在Asn297处的取代。在一些实施方案中，Asn297突变为谷氨酰胺(N297Q)。在例如US 7416726、US2007/0014795以及US2008/0286819中描述了用调节FcγR调控的信号传导的抗体来控制免疫反应的方法，上述专利文献特此以引用的方式整体并入。

在一些实施方案中，免疫缀合物的抗体被修饰成以非天然存在的糖基化模式含有工程化Fab区。例如，可以对杂交瘤进行基因工程化以分泌具有特定突变的无岩藻糖基化mAb、去唾液酸化mAb或去糖基化Fc，所述特定突变使得能够增加FcRγIIIa结合和效应功能。在一些实施方案中，免疫缀合物的抗体被工程化为无岩藻糖基化。

在一些实施方案中，免疫缀合物中的抗体的整个Fc区与不同的Fc区交换，从而使抗体的Fab区与非天然Fc区缀合。例如，西妥昔单抗的Fab区通常包含IgG1 Fc区，可以与IgG2、IgG3、IgG4或IgA缀合，或者纳武单抗的Fab区通常包含IgG4 Fc区，可以与IgG1、IgG2、IgG3、IgA1或IgG2缀合。在一些实施方案中，具有非天然Fc结构域的Fc修饰的抗体还包含一个或多个氨基酸修饰，如IgG4 Fc内的S228P突变，其调节所述Fc结构域的稳定性。在一些实施方案中，具有非天然Fc结构域的Fc修饰的抗体还包含一个或多个本文所述的调节Fc与FcR结合的氨基酸修饰。

在一些实施方案中，当与天然未修饰的抗体相比时，调节Fc区与FcR结合的修饰不改变抗体的Fab区与其抗原的结合。在其他实施方案中，与天然未修饰的抗体相比，调节Fc区与FcR结合的修饰还增加抗体的Fab区与其抗原的结合。

在示例性实施方案中，本发明的免疫缀合物包含抗体构建体，所述抗体构建体包含特异性识别和结合PD-L1的抗原结合结构域。

程序性死亡配体1(PD-L1、分化簇274、CD274、B7-同源物1或B7-H1)属于B7蛋白超家族，并且是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1、PDCD1、分化簇279或CD279)的配体。PD-L1还可以与B7.1(CD80)相互作用，并且这种相互作用被认为抑制T细胞启动。PD-L1/PD-1轴在抑制适应性免疫反应中发挥着重要作用。更具体地说，据信PD-L1与其受体PD-1的接合会递送抑制T细胞的激活和增殖的信号。与PD-L1结合并阻止配体与PD-1受体结合的剂防止这种免疫抑制，并且因此可以在需要时增强免疫反应，例如用于治疗癌症或感染。PD-L1/PD-1途径也有助于预防自身免疫，因此针对PD-L1的激动剂或递送免疫抑制有效载荷的剂可能有助于治疗自身免疫性病症。

几种靶向PD-L1的抗体已被开发用于治疗癌症，包括阿特朱单抗(TECENTRIQ^TM)、德瓦鲁单抗(IMFINZI^TM)和阿维鲁单抗(BAVENCIO^TM)。尽管如此，仍然需要新的PD-L1抗体构建体，包括以高亲和力结合PD-L1并有效阻止PD-L1/PD-1信号传导的剂，以及可以将治疗有效载荷递送至表达PD-L1的细胞的剂。此外，需要新的PD-L1结合剂来治疗自身免疫性病症和感染。

本发明提供将TLR激动剂有效载荷递送至表达PD-L1的细胞的方法，包括对所述细胞或包含所述细胞的哺乳动物施用免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与接头共价连接的半胱氨酸突变抗PD-L1抗体，所述接头与一个或多个TLR激动剂部分共价连接。

还提供了增强或降低或抑制哺乳动物中的免疫反应的方法以及治疗哺乳动物的对PD-L1抑制有反应的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括对哺乳动物施用其PD-L1免疫缀合物。

本发明提供包含免疫球蛋白重链可变区多肽和免疫球蛋白轻链可变区多肽的PD-L1抗体。PD-L1抗体特异性结合PD-L1。抗体的结合特异性允许靶向表达PD-L1的细胞，例如将治疗有效载荷递送至这类细胞。在一些实施方案中，PD-L1抗体与人PD-L1结合。然而，也涵盖与任何PD-L1片段、同源物或旁系同源物结合的抗体。

在一些实施方案中，PD-L1抗体结合PD-L1，而基本上不抑制或阻止PD-L1与其受体PD-1的结合。然而，在其它实施方案中，PD-L1抗体可完全或部分阻断(抑制或阻止)PD-L1与其受体PD-1的结合，使得所述抗体可用于抑制PD-L1/PD-1信号传导(例如，用于治疗目的)。所述抗体或抗原结合抗体片段可以对PD-L1是单特异性的，或者可以是双特异性的或多特异性的。例如，在二价或多价抗体或抗体片段中，结合结构域可以是不同的，靶向相同抗原的不同表位或靶向不同的抗原。构建多价结合构建体的方法是本领域中已知的。双特异性和多特异性抗体是本领域中已知的。此外，可以提供双抗体、三抗体或四抗体，它们是多肽链的二聚体、三聚体或四聚体，每条多肽链包含通过肽接头与V_L连接的V_H，该肽接头太短而无法使同一条多肽链上的V_H与V_L之间配对，从而驱动不同的V_H-V_L多肽链上的互补结构域之间的配对以产生具有两个、三个或四个功能性抗原结合位点的多聚体分子。另外，可以产生双scFv片段，即具有两个不同可变结构域的小scFv片段，以产生能够结合两个不同表位的双特异性双scFv片段。可以采用基因工程方法产生Fab二聚体(Fab2)和Fab三聚体(Fab3)，以创建基于Fab片段的多特异性构建体。

PD-L1抗体可以是或可得自人抗体、非人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或相应的抗体片段。“嵌合”抗体是通常包含人恒定区和非人可变区的抗体或其片段。“人源化”抗体是通常包含人抗体支架但在至少一个CDR(例如，1、2、3、4、5或所有六个CDR)中具有非人来源氨基酸或序列的单克隆抗体。

PD-L1抗体可以是内化的，如WO 2021/150701中所述并以引用的方式并入本文，或者PD-L1抗体可以是非内化的，如WO 2021/150702中所述并以引用的方式并入本文。

在示例性实施方案中，本发明的免疫缀合物包含抗体构建体，所述抗体构建体包含特异性识别和结合HER2的抗原结合结构域。

在某些实施方案中，本发明的免疫缀合物包含半胱氨酸突变抗HER2抗体，如通过实施例201的方法制备的抗体。在本发明的一个实施方案中，本发明的免疫缀合物的抗HER2抗体包含人源化抗HER2抗体的半胱氨酸突变形式，例如huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8，如在US5821337的表3中所述，该专利以引用的方式具体并入本文。这些抗体含有人框架区以及与HER2结合的鼠抗体(4D5)的互补决定区。人源化抗体huMAb4D5-8也称为曲妥珠单抗，其以商品名HERCEPTIN^TM(Genentech,Inc.)商购可得。

曲妥珠单抗(CAS180288-69-1,huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，Genentech)是一种重组DNA来源的IgG1κ单克隆抗体，其是鼠抗HER2抗体(4D5)的人源化形式，在基于细胞的测定中以高亲和力(Kd＝5nM)与HER2的细胞外结构域选择性结合(US5677171；US 5821337；US 6054297；US 6165464；US 6339142；US 6407213；US 6639055；US6719971；US 6800738；US 7074404；Coussens等人，(1985)Science 230:1132-9；Slamon等人，(1989)Science244:707-12；Slamon等人，(2001)New Engl.J.Med.344:783-792)。

在本发明的实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含曲妥珠单抗的CDR区。在本发明的实施方案中，抗HER2抗体还包含曲妥珠单抗的框架区。在本发明的实施方案中，抗HER2抗体还包含曲妥珠单抗的一个或两个可变区。

在本发明的另一实施方案中，本发明的免疫缀合物的抗HER2抗体包括人源化抗HER2抗体，例如人源化2C4，如US 7862817中所述。示例性人源化2C4抗体有帕妥珠单抗(CAS登记号380610-27-5)、PERJETA^TM(Genentech,Inc.)。帕妥珠单抗是一种HER二聚化抑制剂(HDI)，并且用于抑制HER2与其它HER受体(如EGFR/HER1、HER2、HER3和HER4)形成活性异二聚体或同二聚体的能力。参见例如Harari和Yarden，Oncogene 19:6102-14(2000)；Yarden和Sliwkowski.Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37(2001)；Sliwkowski Nat StructBiol10:158-9(2003)；Cho等人，Nature 421:756-60(2003)；和Malik等人，Pro Am SocCancer Res 44:176-7(2003)。PERJETA^TM被批准用于治疗乳腺癌。

在本发明的实施方案中，抗体构建体或抗原结合结构域包含帕妥珠单抗的CDR区。在本发明的实施方案中，抗HER2抗体还包含帕妥珠单抗的框架区。在本发明的一个实施方案中，抗HER2抗体还包含帕妥珠单抗的一个或两个可变区。

玛格妥昔单抗(Margetuximab，也称为MGAH22)是另一种抗HER2单克隆抗体。玛格妥昔单抗的Fc区被优化，用于增加与激活FcγR的结合，但减少与免疫效应细胞上的抑制性Fc.γ.R的结合。玛格妥昔单抗已被FDA批准用于治疗复发或难治性晚期乳腺癌患者，通过免疫组织化学检测，这些患者的肿瘤以2+水平表达HER2，并且通过FISH检测缺乏HER2基因扩增的证据。

HT-19是另一种抗HER2单克隆抗体，其与人HER2中与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的表位不同的表位结合。HT-19显示出与曲妥珠单抗相当地抑制HER2信号传导，并与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组合增强HER2降解(Bergstrom D.A.等人，(2015)Cancer Res.；75:LB-231)。

在本发明的实施方案中，免疫缀合物包含具有选自表1的轻链序列的半胱氨酸突变抗体。

表1半胱氨酸突变轻链序列

序列：	突变位点	SEQ ID NO:
			YPREACVQWKV	LC K145C	1
TVAAPCVFIFP	LC S114C	2
			QGTKVCIKRTV	LC E105C	3
LQSGNCQESVT	LC S159C	7
			YEKHKCYACEV	LC V191C	8
VTHQGCSSPVT	LC L201C	9
			QLKSGCASVVC	LC T129C	13
AKVQWCVDNAL	LC K149C	16
			KADYECHKVYA	LC K188C	17

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变HER2靶向抗体包含SEQ ID NO:20的重链(HC)。

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.20

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变HER2靶向抗体的轻链(LC)选自表2的SEQID NO:24、25、26、27、28、29、30、31和32。

表2抗HER2半胱氨酸突变轻链(LC)序列

在本发明的实施方案中，免疫缀合物包含具有选自表3的重链序列的半胱氨酸突变抗体。

表3半胱氨酸突变重链序列

EPVTVCWNSGA	HC S157C	4
			TFPAVCQSSGL	HC L174C	5
VLQSSCLYSLS	HC G178C	6
			TVSSACTKGPS	HC S119C	10
ALTSGCHTFPA	HC V167C	11
			GTQTYCCNVNH	HC I199C	12
SSLGTCTYICN	HC Q196C	14
			YPSDICVEWES	HC A378C	15
TSGGTCALGCL	HC A140C	18

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变HER2靶向抗体的轻链具有SEQ ID NO:21的序列。

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.21

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变HER2靶向抗体的重链(HC)选自表4的SEQID NO:33、34、35、36、37、38、39、40和41。

表4抗HER2半胱氨酸突变重链(HC)序列

在示例性实施方案中，本发明的免疫缀合物包含半胱氨酸突变抗体构建体，所述构建体包含特异性识别和结合Caprin-1的抗原结合结构域(Ellis JA,Luzio JP(1995)JBiol Chem.270(35):20717–23；Wang B等人，(2005)J Immunol.175(7):4274–82；SolomonS等人，(2007)Mol Cell Biol.27(6):2324–42)。Caprin-1也称为GPIAP1、GPIP137、GRIP137、M11S1、RNG105、p137GPI和细胞周期相关蛋白1。

细胞质激活/增殖相关蛋白-1(caprin-1)是一种参与细胞周期控制相关基因的调控的RNA结合蛋白。Caprin-1选择性地结合c-Myc和细胞周期蛋白D2 mRNA，这加速细胞从G₁期进展到S期，增强细胞活力并促进细胞生长，表明它可能在肿瘤发生中发挥重要作用(Wang B,等人(2005)J Immunol.175:4274–4282)。Caprin-1单独作用或与其他RNA结合蛋白(例如RasGAP SH3结构域结合蛋白1和脆性X智力迟钝蛋白)组合作用。在肿瘤发生过程中，caprin-1主要通过激活细胞增殖和上调免疫检查点蛋白的表达发挥作用。通过应激颗粒的形成，caprin-1还参与肿瘤细胞适应不利条件的过程，从而导致放疗和化疗抗性。鉴于其在各种临床恶性肿瘤中的作用，caprin-1有潜力用作生物标志物和开发新型治疗剂的靶标(Yang,Z-S,等人(2019)Oncology Letters 18:15-21)。

已经描述了用于治疗和检测的靶向caprin-1的抗体(WO 2011/096519；WO 2013/125654；WO 2013/125636；WO 2013/125640；WO 2013/125630；WO 2013/018889；WO 2013/018891；WO 2013/018883；WO 2013/018892；WO 2014/014082；WO 2014/014086；WO 2015/020212；WO 2018/079740)。

在示例性实施方案中，本发明的免疫缀合物包含半胱氨酸突变抗体构建体，所述抗体构建体包含特异性识别和结合CEA的抗原结合结构域。癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(CEACAM5)也称为CD66e(分化簇66e)，是癌胚抗原(CEA)基因家族的成员。

癌胚抗原(CEA、CD66e、CEACAM5)的表达升高牵涉到肿瘤形成的各种生物学方面，特别是肿瘤细胞粘附、转移、细胞免疫机制的阻断，并具有抗细胞凋亡功能。CEA也被用作许多癌症的血液标志物。拉贝珠单抗(CEA-CIDE^TM，Immunomedics，CAS登记号219649-07-7)，也称为MN-14和hMN14，是一种人源化IgG1单克隆抗体并且已被研究用于治疗结直肠癌(Blumenthal,R.等人(2005)Cancer Immunology Immunotherapy 54(4):315-327)。与喜树碱类似物缀合的拉贝珠单抗(戈维替康拉贝珠单抗，IMMU-130)靶向癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(CEACAM5)，并且正被在患有复发或难治性转移性结直肠癌的患者中进行研究(Sharkey,R.等人，(2018)，Molecular Cancer Therapeutics 17(1):196-203；Cardillo,T.等人，(2018)Molecular Cancer Therapeutics 17(1):150-160)。在本发明的实施方案中，CEA靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含如US 6676924中公开的hMN-14/拉贝珠单抗的可变轻链(VLκ)，该专利文献出于此目的以引用的方式并入本文。

在示例性实施方案中，本发明的免疫缀合物包含半胱氨酸突变抗体构建体，所述抗体构建体包含特异性识别和结合TROP2的抗原结合结构域。肿瘤相关钙信号转导子2(TROP-2)是一种由TACSTD2基因编码的跨膜糖蛋白(Linnenbach AJ等人，(1993)Mol CellBiol.13(3):1507–15；Calabrese G等人，(2001)Cytogenet Cell Genet.92(1–2):164–5)。TROP2是一种细胞内钙信号转导子，在许多癌症中差异表达，并向细胞发出自我更新、增殖、侵袭和存活的信号。TROP2被认为是干细胞标志物，并在许多正常组织中表达，但相比之下，其在许多癌症中过表达(Ohmachi T等人，(2006)Clin.Cancer Res.,12(10),3057-3063；Muhlmann G等人，(2009)J.Clin.Pathol.,62(2),152-158；Fong D等人，(2008)Br.J.Cancer,99(8),1290-1295；Fong D等人，(2008)Mod.Pathol.,21(2),186-191；Ning S等人，(2013)Neurol.Sci.,34(10),1745-1750)。TROP2的过表达具有预后意义。已经提出了与TROP2相互作用的几种配体。TROP2经由不同的途径向细胞发出信号，并受若干转录因子的复杂网络的转录调控。

人TROP2(TACSTD2：肿瘤相关钙信号转导子2、GA733-1、EGP-1、M1S1；以下称为hTROP2)是由323个氨基酸残基组成的单次跨膜1型细胞膜蛋白。虽然先前已经提出了参与对于人滋养层细胞和癌细胞来说常见的免疫抵抗的细胞膜蛋白的存在(Faulk W P等人，Proc.Natl.Acad.Sci.75(4):1947-1951(1978))，但是在人绒毛膜癌细胞系中由针对细胞膜蛋白的单克隆抗体所识别的抗原分子被鉴定并指定为TROP2，作为在人滋养层细胞中表达的分子之一(Lipinski M等人，Proc.Natl.Acad.Sci.78(8),5147-5150(1981))。这种分子也被指定为由小鼠单克隆抗体GA733识别的肿瘤抗原GA733-1(Linnenbach A J等人，Proc.Natl.Acad.Sci.86(1),27-31(1989))，所述小鼠单克隆抗体GA733是通过用由小鼠单克隆抗体RS7-3G11识别的胃癌细胞系或上皮糖蛋白(EGP-1；Basu A等人，Int.J.Cancer,62(4),472-479(1995))进行免疫获得的，所述小鼠单克隆抗体RS7-3G11是通过用非小细胞肺癌细胞进行免疫获得的。然而，在1995年，TROP2基因被克隆，并且所有这些分子被证实是相同的分子(Fornaro M等人，Int.J.Cancer,62(5),610-618(1995))。hTROP2的DNA序列和氨基酸序列可在公共数据库上获得，并且可以例如以登录号NM_002353和NP_002344(NCBI)查阅。

响应于提示与癌症相关的这类信息，迄今为止已经建立了多种抗hTROP2抗体，并研究了它们的抗肿瘤作用。在这些抗体中，公开了例如在裸小鼠异种移植模型中本身表现出抗肿瘤活性的未缀合抗体(WO 2008/144891；WO 2011/145744；WO 2011/155579；WO2013/077458)以及作为ADC与细胞毒性药物一起表现出抗肿瘤活性的抗体(WO 2003/074566；WO 2011/068845；WO 2013/068946；US 7999083)。然而，其活性的强度或覆盖范围仍然不足，并且对hTROP2作为治疗靶标的医学需求尚未得到满足。

癌细胞中的TROP2表达与耐药性相关。若干种策略靶向癌细胞上的TROP2，包括抗体、抗体融合蛋白、化学抑制剂、纳米颗粒等。采用这些各种治疗性治疗进行的体外研究和临床前研究已导致了对小鼠体外和体内肿瘤细胞生长的显著抑制。临床研究已经探索了TROP2作为预后生物标志物和逆转耐药性的治疗靶标两者的潜在应用。

戈沙妥珠单抗(Immunomedics，IMMU-132)是包含与拓扑异构酶抑制剂药物连接的TROP2定向抗体的抗体-药物缀合物，适用于治疗已经接受过至少两种先前疗法的成年患者的转移性三阴性乳腺癌(mTNBC)。戈沙妥珠单抗中的TROP2抗体与伊立替康的活性代谢物SN-38缀合(US2016/0297890；WO 2015/098099)。

在本发明的实施方案中，TROP2靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含hRS7(人源化RS7)的轻链CDR(互补决定区)(US 7238785，以引用的方式并入本文)。

在本发明的实施方案中，免疫缀合物包含具有选自表5的轻链序列的半胱氨酸突变抗体。

表5半胱氨酸突变轻链序列

序列：	突变位点	SEQ ID NO:
			KADYECHKVYA	LC K188C	17
YEKHKCYACEV	LC V191C	8
			QLKSGCASVVC	LC T129C	13

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变TROP2靶向抗体包含SEQ ID NO:22的重链(HC)。

QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO.22

在本发明的实施方案中，TROP2靶向抗体的轻链(LC)选自表6的SEQ ID NO:42、43和44。

表6抗TROP2半胱氨酸突变轻链(LC)序列

在本发明的实施方案中，免疫缀合物包含具有选自表7的重链序列的半胱氨酸突变抗体。

表7半胱氨酸突变重链序列

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变TROP2靶向抗体的轻链(LC)具有SEQ IDNO:23的序列。

DIQLTQSPSSLSASVGDRVSITCKASQDVSIAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGAGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:23

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变TROP2靶向抗体的重链(HC)具有SEQ IDNO:45的序列。

QVQLQQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLKWMGWINTYTGEPTYTDDFKGRFAFSLDTSVSTAYLQISSLKADDTAVYFCARGGFGSSYWYFDVWGQGSLVTVSSACTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO:45

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变HER2靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.46-52的轻链CDR(互补决定区)或轻链框架(LFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变HER2靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.53-59的重链CDR(互补决定区)或重链框架(HFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变TROP2靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.60-66的轻链CDR(互补决定区)或轻链框架(LFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变TROP2靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.67-73的重链CDR(互补决定区)或重链框架(HFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变TROP2靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.74-80的轻链CDR(互补决定区)或轻链框架(LFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变TROP2靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.81-87的重链CDR(互补决定区)或重链框架(HFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变PD-L1靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.88-94的轻链CDR(互补决定区)或轻链框架(LFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变PD-L1靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.95-101的重链CDR(互补决定区)或重链框架(HFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变CEA靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.102-108的轻链CDR(互补决定区)或轻链框架(LFR)序列。

在本发明的实施方案中，半胱氨酸突变CEA靶向抗体构建体或抗原结合结构域包含选自SEQ ID NO.109-115的重链CDR(互补决定区)或重链框架(HFR)序列。

TLR激动剂佐剂化合物

本发明的免疫缀合物包含免疫刺激性TLR激动剂佐剂部分。本文所述的佐剂部分是引发免疫反应的化合物(即，免疫刺激剂)。通常，本文所述的佐剂部分是TLR激动剂。TLR是负责启动脊椎动物的先天免疫反应的I型跨膜蛋白。TLR识别来自细菌、病毒和真菌的多种病原体相关分子模式，并作为抵御入侵病原体的第一道防线。由于细胞表达以及它们启动的信号传导途径的差异，TLR引发重叠但不同的生物反应。一旦接合(例如，通过天然刺激物或合成的TLR激动剂)，TLR就启动信号转导级联，导致经由衔接蛋白骨髓分化初级反应基因88(MyD88)激活核因子-κB(NF-κB)和募集IL-1受体相关激酶(IRAK)。IRAK的磷酸化然后导致TNF受体相关因子6(TRAF6)的募集，这导致NF-κB抑制剂I-κB的磷酸化。结果，NF-κB进入细胞核并引发启动子含有NF-κB结合位点的基因(如细胞因子)的转录。调控TLR信号传导的另外模式包括含有TIR结构域的衔接子诱导干扰素-β(TRIF)依赖性诱导TNF-受体相关因子6(TRAF6)和经由TRIF和TRAF3激活MyD88非依赖性途径，导致干扰素反应因子三(IRF3)的磷酸化。类似地，MyD88依赖性途径也激活若干IRF家族成员，包括IRF5和IRF7，而TRIF依赖性途径也激活NF-κB途径。

通常，本文所述的佐剂部分是TLR7和/或TLR8激动剂。TLR7和TLR8均在单核细胞和树突细胞中表达。在人中，TLR7也在浆细胞样树突细胞(pDC)和B细胞中表达。TLR8主要在骨髓来源的细胞中表达，即单核细胞、粒细胞和髓样树突细胞。TLR7和TLR8能够检测细胞内“外来”单链RNA的存在，作为应对病毒入侵的手段。用TLR8激动剂处理表达TLR8的细胞可导致产生高水平的IL-12、IFN-γ、IL-1、TNF-α、IL-6及其它炎性细胞因子。类似地，用TLR7激动剂刺激表达TLR7的细胞如pDC可导致产生高水平的IFN-α及其它炎性细胞因子。TLR7/TLR8接合及由此所致的细胞因子产生可激活树突细胞及其它抗原呈递细胞，从而驱动多种先天和获得性免疫反应机制，导致肿瘤破坏。

TLR激动剂佐剂部分包括但不限于化合物：(a)咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺(WO2020/190762、WO 2020/190725、WO 2019/222676、WO 2018/112108、WO 2018/009916)；(b)喹啉-2-胺(WO 2021/046112)；(c)2-氨基-3H-苯并[b]氮杂-4-甲酰胺(WO 2020/252254、WO 2020/252294)；(d)5-氨基-6H-噻吩并[3,2-b]氮杂-7-甲酰胺(WO 2021/081407、WO2021/081402)；(e)5-氨基-1,6-二氢吡唑并[4,3-b]氮杂-7-甲酰胺；和(f)5-氨基-2,6-二氢吡唑并[4,3-b]氮杂-7-甲酰胺，具有式a-f：

其中R^1-4和X^1-4取代基如本文所述。

TLR激动剂-接头化合物

通过使半胱氨酸突变抗体与TLR激动剂-接头(TLR-L)化合物缀合来制备本发明的免疫缀合物。TLR-L化合物包含与接头单元共价连接的TLR激动剂部分。接头单元包含影响免疫缀合物的稳定性、渗透性、溶解度及其它药代动力学、安全性和功效特性的官能团和亚基。接头单元包括反应性亲电官能团，如马来酰亚胺或溴乙酰胺，其与半胱氨酸突变抗体的反应性半胱氨酸硫醇基团反应(即缀合)以形成免疫缀合物。

在反应性亲电官能团是马来酰亚胺的情况下，接头中产生的琥珀酰亚胺环容易经由水解发生开环反应，特别是在高pH和升高的温度下。一旦琥珀酰亚胺环打开，就可以调节体内稳定性和治疗活性(Zheng,K.等人，(2019)J Pharm Sci,108(1):133-141)。

适用于TLR-L化合物的亲电反应性官能团包括但不限于马来酰亚胺(硫醇反应性)；卤代乙酰胺，如碘乙酰胺、溴乙酰胺和氯乙酰胺(硫醇反应性)；乙烯基砜(硫醇、胺和羟基反应性)；和吡啶基二硫化物(硫醇反应性)。进一步的试剂包括但不限于Hermanson，Bioconjugate Techniques第2版，Academic Press，2008中描述的那些。

本发明为免疫缀合物的设计、制备和使用方面的限制和挑战提供了解决方案。一些接头在血流中可能不稳定，从而在于靶细胞中内化之前释放不可接受量的佐剂/药物(Khot,A.等人，(2015)Bioanalysis7(13):1633–1648)。其它接头可提供在血流中的稳定性，但细胞内释放的有效性可能会受到负面影响。提供所需细胞内释放的接头通常在血流中稳定性差。或者说，血流稳定性和细胞内释放通常是逆相关的。此外，在标准缀合过程中，抗体上加载的佐剂/药物部分的量(即载药量)、缀合反应中形成的聚集物的量和可以获得的最终纯化缀合物的产量是相互关联的。例如，聚集物形成通常与同抗体缀合的佐剂/药物部分及其衍生物的当量数正相关。在高载药量的情况下，必须去除所形成的聚集体以用于治疗应用。因此，载药量介导的聚集物形成会降低免疫缀合物产率，并且可能使过程按比例放大变得困难。

本发明的免疫缀合物的设计考虑包括：(1)防止TLR激动剂部分在体内循环期间过早释放，和(2)确保TLR激动剂部分的生物活性形式在所需作用位点以足够的速率释放。免疫缀合物的复杂结构及其功能特性需要仔细设计和选择分子的每个组分，包括抗体、缀合位点、接头结构和吡唑并氮杂化合物。接头决定佐剂释放的机制和速率。

一般而言，接头单元(L)可以是可切割的或不可切割的。可切割的接头单元可包括作为某些蛋白酶(如组织蛋白酶)的底物的肽序列，这些蛋白酶识别并切割肽接头单元，从而将TLR激动剂与抗体分离(Caculitan NG等人，(2017)Cancer Res.77(24):7027-7037)。

可切割的接头单元可能包括不稳定的官能团，例如酸敏感的二硫基团(Kellogg,BA等人(2011)Bioconjugate Chem.22,717-727；Ricart,A.D.等人，(2011)Clin.CancerRes.17,6417-6427；Pillow,T.等人，(2017)Chem.Sci.8,366-370；Zhang D等人，(2016)ACSMed Chem Lett.7(11):988-993)。

在一些实施方案中，接头在生理条件下是不可切割的。如本文所用，术语“生理条件”是指20-40摄氏度的温度范围、大气压(即1atm)、约6至约8的pH以及一种或多种生理酶、蛋白酶、酸和碱。免疫缀合物中抗体与TLR激动剂部分之间的不可切割接头的一个优点是最大限度地减少过早的有效载荷释放和相应的毒性。

在一个实施方案中，本发明包括细胞结合剂与免疫刺激TLR激动剂部分之间的肽连接单元PEP，其包含基于可以被蛋白酶(如组织蛋白酶、肿瘤相关弹性蛋白酶或具有蛋白酶样或弹性蛋白酶样活性的酶)选择性切割的特定氨基酸残基的线性序列的肽基团。肽基团可以是约二至约十二个氨基酸。肽接头内的键的酶促切割释放免疫刺激性TLR激动剂部分的活性形式。这导致根据本发明的缀合物的组织特异性的增加，并因此导致根据本发明的缀合物在其它组织类型中的毒性的额外降低。

在示例性实施方案中，PEP由选自由以下组成的组的氨基酸的氨基酸残基(AA)组成：

在示例性实施方案中，PEP选自由Ala-Pro-Val、Asn-Pro-Val、Ala-Ala-Val、Ala-Ala-Pro-Ala、Ala-Ala-Pro-Val和Ala-Ala-Pro-Nva组成的组。

在示例性实施方案中，PEP具有下式：

在示例性实施方案中，PEP选自下式：

接头为生物培养基(例如培养基或血清)中的免疫缀合物提供足够的稳定性，同时由于其特定的酶促或水解切割性并释放免疫刺激性TLR激动剂部分(即“有效载荷”)而在肿瘤组织内提供所需的细胞内作用。

蛋白酶、组织蛋白酶或弹性蛋白酶的酶活性可以在生理条件下催化免疫缀合物的共价键的切割。酶活性是与肿瘤组织相关的细胞的表达产物。作用于靶向肽的切割位点上的酶活性将免疫缀合物转化为不含靶向肽和连接基团的活性免疫刺激药物。切割位点可以被酶特异性识别。组织蛋白酶或弹性蛋白酶可催化特定肽的C末端氨基酸残基与免疫缀合物的免疫刺激性TLR激动剂部分之间的特定肽基键的切割。

在一个实施方案中，TLR激动剂-接头(TLR-L)化合物包括细胞结合剂与TLR激动剂部分之间的连接单元，即L或接头，其包含葡糖醛酸酶(Jeffrey SC等人，(2006)Bioconjug.Chem.17(3):831-40)或硫酸酯酶(Bargh JD等人，(2020)Chem Sci.11(9):2375-2380)切割的底物。

特别地，L包括Gluc单元，并且包含选自以下的化学式：

本发明的免疫缀合物的特异性切割利用免疫系统的肿瘤浸润细胞和白细胞分泌的酶的存在，以促进抗癌药物在肿瘤部位的激活。

TLR激动剂-接头(TLR-L)化合物的示例性实施方案选自式a-f：

其中X¹、X²、X³和X⁴独立地选自由键、C(＝O)、C(＝O)N(R⁵)、O、N(R⁵)、S、S(O)₂和S(O)₂N(R⁵)组成的组；

R¹、R²、R³和R⁴独立地选自由H、C₁-C₁₂烷基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、C₃-C₁₂碳环基、C₆-C₂₀芳基、C₂-C₉杂环基和C₁-C₂₀杂芳基组成的组，其中烷基、烯基、炔基、碳环基、芳基、杂环基和杂芳基独立且任选被一个或多个选自以下的基团取代：

-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-OR⁵；

-(C₃-C₁₂碳环基)；

-(C₃-C₁₂碳环基)-*；

-(C₃-C₁₂碳环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-(C₃-C₁₂碳环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₃-C₁₂碳环基)-NR⁵-C(＝NR⁵)NR⁵-*；

-(C₆-C₂₀芳基)；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-(C₂-C₂₀杂环基)；

-(C₂-C₂₀杂环基)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₂-C₉杂环基)-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-NR⁵-C(＝NR^5a)NR⁵-*；

-(C₂-C₉杂环基)-NR⁵-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₆-C₂₀芳基二基)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基)；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-NR⁵-C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-N(R⁵)C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)-*；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-C(＝O)N(R⁵)₂；

-C(＝O)N(R⁵)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)N(R⁵)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝O)R⁵；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)CO₂R⁵；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝NR^5a)N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵C(＝NR^5a)R⁵；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₈烷基二基)-NR⁵(C₂-C₅杂芳基)；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-*；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₂-C₂₀杂环基二基)-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-N(R⁵)₂；

-N(R⁵)-*；

-N(R⁵)C(＝O)R⁵；

-N(R⁵)C(＝O)-*；

-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)₂；

-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)-*；

-N(R⁵)CO₂R⁵；

-N(R⁵)CO₂(R⁵)-*；

-NR⁵C(＝NR^5a)N(R⁵)₂；

-NR⁵C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-NR⁵C(＝NR^5a)R⁵；

-N(R⁵)C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-N(R⁵)-(C₂-C₅杂芳基)；

-N(R⁵)-S(＝O)₂-(C₁-C₁₂烷基)；

-O-(C₁-C₁₂烷基)；

-O-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-O-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-OC(＝O)N(R⁵)₂；

-OC(＝O)N(R⁵)-*；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；和

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-OH；

或者R²和R³一起形成5或6元杂环基环；

R⁵选自由H、C₆-C₂₀芳基、C₃-C₁₂碳环基、C₂-C₂₀杂环基、C₆-C₂₀芳基二基、C₁-C₁₂烷基和C₁-C₁₂烷基二基组成的组，或者两个R⁵基团一起形成5或6元杂环基环；

R^5a选自由C₆-C₂₀芳基和C₁-C₂₀杂芳基组成的组；

其中星号*指示L的连接位点，且其中R¹、R²、R³和R⁴中的一者连接于L；

L是选自由以下组成的组的接头：

Q-C(＝O)-PEG-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-Gluc-；

Q-C(＝O)-PEG-O-；

Q-C(＝O)-PEG-O-C(＝O)-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-；

Q-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-；

Q-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-C(＝O)-；

Q-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-PEG-C(＝O)-PEP-；

Q-C(＝O)-PEG-N⁺(R⁶)₂-PEG-C(＝O)-PEP-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)N(R⁶)C(＝O)-(C₂-C₅单杂环基二基)-；

Q-C(＝O)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-OC(＝O)-；

Q-C(＝O)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-；

Q-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-；

Q-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

Q-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-C(＝O)；

Q-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁶)C(＝O)-(C₂-C₅单杂环基二基)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-Gluc-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-O-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-O-C(＝O)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-N(R⁵)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-N(R⁵)-C(＝O)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)-PEP-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-OC(＝O)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)N(R⁶)C(＝O)-；和

Q-(CH₂)_m-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)N(R⁶)C(＝O)-(C₂-C₅单杂环基二基)-；

R⁶独立地为H或C₁-C₆烷基；

PEG具有下式：-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-；m是1至5的整数，且n是2至50的整数；

Gluc具有下式：

PEP具有下式：

其中AA独立地选自天然或非天然氨基酸侧链，或者AA中的一者或多者和相邻的氮原子形成五元环脯氨酸氨基酸，且波浪线指示连接点；

Cyc选自C₆-C₂₀芳基二基和C₁-C₂₀杂芳基二基，其任选地被一个或多个选自F、Cl、NO₂、-OH、-OCH₃和具有如下结构的葡糖醛酸的基团取代：

R⁷选自由-CH(R⁸)O-、-CH₂-、-CH₂N(R⁸)-和-CH(R⁸)O-C(＝O)-组成的组，其中R⁸选自H、C₁-C₆烷基、C(＝O)-C₁-C₆烷基和-C(＝O)N(R⁹)₂，其中R⁹独立地选自由H、C₁-C₁₂烷基和-(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_m-OH组成的组，其中m是1至5的整数，且n是2至50的整数，或者两个R⁹基团一起形成5或6元杂环基环；

y是2至12的整数；

z是0或1；且

Q选自由马来酰亚胺、溴乙酰胺和吡啶基二硫化物组成的组；

其中烷基、烷基二基、烯基、烯基二基、炔基、炔基二基、芳基、芳基二基、碳环基、碳环基二基、杂环基、杂环基二基、杂芳基和杂芳基二基任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH＝CH₂、-C≡CH、-C≡CCH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂OH、-CH₂OCH₃、-CH₂CH₂OH、-C(CH₃)₂OH、-CH(OH)CH(CH₃)₂、-C(CH₃)₂CH₂OH、-CH₂CH₂SO₂CH₃、-CH₂OP(O)(OH)₂、-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-CH₂CF₃、-CH₂CHF₂、-CH(CH₃)CN、-C(CH₃)₂CN、-CH₂CN、-CH₂NH₂、-CH₂NHSO₂CH₃、-CH₂NHCH₃、-CH₂N(CH₃)₂、-CO₂H、-COCH₃、-CO₂CH₃、-CO₂C(CH₃)₃、-COCH(OH)CH₃、-CONH₂、-CONHCH₃、-CON(CH₃)₂、-C(CH₃)₂CONH₂、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-NHCOCH₃、-N(CH₃)COCH₃、-NHS(O)₂CH₃、-N(CH₃)C(CH₃)₂CONH₂、-N(CH₃)CH₂CH₂S(O)₂CH₃、-NHC(＝NH)H、-NHC(＝NH)CH₃、-NHC(＝NH)NH₂、-NHC(＝O)NH₂、-NO₂、＝O、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂OCH₃、-OCH₂CH₂OH、-OCH₂CH₂N(CH₃)₂、-O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_mCO₂H、-O(CH₂CH₂O)_nH、-OP(O)(OH)₂、-S(O)₂N(CH₃)₂、-SCH₃、-S(O)₂CH₃和-S(O)₃H。

TLR激动剂-接头(TLR-L)化合物的示例性实施方案包括其中Q是马来酰亚胺。

TLR激动剂-接头(TLR-L)化合物的示例性实施方案选自表8。每种TLR-L化合物通过质谱法进行表征，并显示具有所指示的质量。表8和9的TLR-L化合物展示出意外和出乎意料的TLR8激动剂选择性特性，这可能预示有可用于治疗癌症及其它病症的治疗活性。

来自表9的比较化合物具有活化酯、四氟苯基或磺基四氟苯基，其与抗体的赖氨酸残基反应以形成免疫缀合物，其中根据实施例203，酰胺键在抗体与TLR-激动剂-接头部分之间。

表8 TLR激动剂-接头(TLR-L)化合物

表9 TLR激动剂-接头比较化合物

免疫缀合物

本发明的免疫缀合物包含通过接头与一个或多个TLR激动剂部分共价连接的半胱氨酸突变抗体。

免疫缀合物的示例性实施方案包括在铰链区中具有半胱氨酸突变的半胱氨酸突变抗体。

免疫缀合物的示例性实施方案具有式I：

Ab-[L-D]_p I

或其药学上可接受的盐，

其中：

Ab是半胱氨酸突变抗体；

p是1至8的整数；

L是接头；

D是选自式a-f的TLR激动剂部分：

X¹、X²、X³和X⁴独立地选自由键、C(＝O)、C(＝O)N(R⁵)、O、N(R⁵)、S、S(O)₂和S(O)₂N(R⁵)组成的组；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-OR⁵；

-(C₃-C₁₂碳环基)；

-(C₃-C₁₂碳环基)-*；

-(C₃-C₁₂碳环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-(C₃-C₁₂碳环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₃-C₁₂碳环基)-NR⁵-C(＝NR⁵)NR⁵-*；

-(C₆-C₂₀芳基)；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₂-C₂₀杂环基)；

-(C₂-C₂₀杂环基)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₂-C₉杂环基)-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-NR⁵-C(＝NR^5a)NR⁵-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₆-C₂₀芳基二基)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基)；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-NR⁵-C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-C(＝O)-*；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-C(＝O)N(R⁵)₂；

-C(＝O)N(R⁵)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)N(R⁵)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝O)R⁵；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)CO₂R⁵；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝NR^5a)N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵C(＝NR^5a)R⁵；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₈烷基二基)-NR⁵(C₂-C₅杂芳基)；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-*；

-N(R⁵)₂；

-N(R⁵)-*；

-N(R⁵)C(＝O)R⁵；

-N(R⁵)C(＝O)-*；

-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)₂；

-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)-*；

-N(R⁵)CO₂R⁵；

-N(R⁵)CO₂(R⁵)-*；

-NR⁵C(＝NR^5a)N(R⁵)₂；

-NR⁵C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-NR⁵C(＝NR^5a)R⁵；

-N(R⁵)C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-N(R⁵)-(C₂-C₅杂芳基)；

-N(R⁵)-S(＝O)₂-(C₁-C₁₂烷基)；

-O-(C₁-C₁₂烷基)；

-O-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-O-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-OC(＝O)N(R⁵)₂；

-OC(＝O)N(R⁵)-*；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-OH；

或者R²和R³一起形成5或6元杂环基环；

R^5a选自由C₆-C₂₀芳基和C₁-C₂₀杂芳基组成的组；

L是选自由以下组成的组的接头：

-C(＝O)-PEG-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-Gluc-；

-C(＝O)-PEG-O-；

-C(＝O)-PEG-O-C(＝O)-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-；

-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-；

-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-C(＝O)-；

-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-PEG-C(＝O)-PEP-；

-C(＝O)-PEG-N⁺(R⁶)₂-PEG-C(＝O)-PEP-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)N(R⁶)C(＝O)-(C₂-C₅单杂环基二基)-；

-C(＝O)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-OC(＝O)-；

-C(＝O)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-C(＝O)；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁶)C(＝O)-(C₂-C₅单杂环基二基)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-Gluc-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-O-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-O-C(＝O)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-N(R⁵)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-N(R⁵)-C(＝O)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)-PEP-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-OC(＝O)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)N(R⁶)C(＝O)-；和

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)N(R⁶)C(＝O)-(C₂-C₅单杂环基二基)-；

R⁶独立地为H或C₁-C₆烷基；

Gluc具有下式：

PEP具有下式：

y是2至12的整数；

z是0或1；且

烷基、烷基二基、烯基、烯基二基、炔基、炔基二基、芳基、芳基二基、碳环基、碳环基二基、杂环基、杂环基二基、杂芳基和杂芳基二基独立且任选被一个或多个独立地选自以下的基团取代：F、Cl、Br、I、-CN、-CH₃、-CH₂CH₃、-CH＝CH₂、-C≡CH、-C≡CCH₃、-CH₂CH₂CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH₂OH、-CH₂OCH₃、-CH₂CH₂OH、-C(CH₃)₂OH、-CH(OH)CH(CH₃)₂、-C(CH₃)₂CH₂OH、-CH₂CH₂SO₂CH₃、-CH₂OP(O)(OH)₂、-CH₂F、-CHF₂、-CF₃、-CH₂CF₃、-CH₂CHF₂、-CH(CH₃)CN、-C(CH₃)₂CN、-CH₂CN、-CH₂NH₂、-CH₂NHSO₂CH₃、-CH₂NHCH₃、-CH₂N(CH₃)₂、-CO₂H、-COCH₃、-CO₂CH₃、-CO₂C(CH₃)₃、-COCH(OH)CH₃、-CONH₂、-CONHCH₃、-CON(CH₃)₂、-C(CH₃)₂CONH₂、-NH₂、-NHCH₃、-N(CH₃)₂、-NHCOCH₃、-N(CH₃)COCH₃、-NHS(O)₂CH₃、-N(CH₃)C(CH₃)₂CONH₂、-N(CH₃)CH₂CH₂S(O)₂CH₃、-NHC(＝NH)H、-NHC(＝NH)CH₃、-NHC(＝NH)NH₂、-NHC(＝O)NH₂、-NO₂、＝O、-OH、-OCH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂OCH₃、-OCH₂CH₂OH、-OCH₂CH₂N(CH₃)₂、-O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)_mCO₂H、-O(CH₂CH₂O)_nH、-OP(O)(OH)₂、-S(O)₂N(CH₃)₂、-SCH₃、-S(O)₂CH₃和-S(O)₃H。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中X¹是键，且R¹是H。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中X²是键，且R²是C₁-C₈烷基。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中X²和X³各自是键，且R²和R³独立地选自C₁-C₈烷基、-O-(C₁-C₁₂烷基)、-(C₁-C₁₂烷基二基)-OR⁵、-(C₁-C₈烷基二基)-N(R⁵)CO₂R⁵、-(C₁-C₁₂烷基)-OC(O)N(R⁵)₂、-O-(C₁-C₁₂烷基)-N(R⁵)CO₂R⁵和-O-(C₁-C₁₂烷基)-OC(O)N(R⁵)₂。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中R²是C₁-C₈烷基，且R³是-(C₁-C₈烷基二基)-N(R⁵)CO₂R⁴。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中R²是-CH₂CH₂CH₃，且R³选自-CH₂CH₂CH₂NHCO₂(t-Bu)、-OCH₂CH₂NHCO₂(环丁基)和-CH₂CH₂CH₂NHCO₂(环丁基)。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中R²和R³各自独立地选自-CH₂CH₂CH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CF₃、-CH₂CH₂CF₃、-OCH₂CH₂OH和-CH₂CH₂CH₂OH。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中R²和R³各自为-CH₂CH₂CH₃。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中R²是-CH₂CH₂CH₃，且R³是-OCH₂CH₃。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中X³-R³选自由以下组成的组：

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中R²或R³与L连接。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中X³-R³-L选自由以下组成的组：

其中波浪线指示与N的连接点。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中R⁴是C₁-C₁₂烷基。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中R⁴是-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；其中星号*指示L的连接位点。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中L是-C(＝O)-PEG-或-C(＝O)-PEG-C(＝O)-。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中L与抗体的半胱氨酸硫醇连接。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中对于PEG，m是1或2，且n是2至10的整数。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中n是10。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中L包含PEP，且PEP是二肽并具有下式：

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中PEP具有下式：

其中AA₁和AA₂独立地选自天然存在的氨基酸的侧链。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中AA₁和AA₂独立地选自H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂(C₆H₅)、-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂CH₂NHC(NH)NH₂、-CHCH(CH₃)CH₃、-CH₂SO₃H和-CH₂CH₂CH₂NHC(O)NH₂；或者AA₁和AA₂形成5元环脯氨酸氨基酸。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中AA₁是-CH(CH₃)₂，并且AA₂是-CH₂CH₂CH₂NHC(O)NH₂。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中AA₁和AA₂独立地选自GlcNAc天冬氨酸、-CH₂SO₃H和-CH₂OPO₃H。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中L包含PEP，且PEP是三肽并具有下式：

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中L包含PEP，且PEP是四肽并具有下式：

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中PEP四肽选自：

AA₁选自由Abu、Ala和Val组成的组；

AA₂选自由Nle(O-Bzl)、Oic和Pro组成的组；

AA₃选自由Ala和Met(O)₂组成的组；且

AA₄选自由Oic、Arg(NO₂)、Bpa和Nle(O-Bzl)组成的组。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中L包含PEP，且PEP选自由以下组成的组：Ala-Pro-Val、Asn-Pro-Val、Ala-Ala-Val、Ala-Ala-Pro-Ala、Ala-Ala-Pro-Val和Ala-Ala-Pro-Nva。

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中L包含PEP，且PEP选自以下结构：

免疫缀合物的示例性实施方案包括其中L选自以下结构：

其中波浪线指示与R⁵的连接。

表10的本发明的免疫缀合物的示例性实施方案是通过使半胱氨酸突变抗体与表8中的TLR激动剂-接头化合物缀合制备的。

表11中的比较酰胺连接的免疫缀合物Lys IC-1是通过使曲妥珠单抗与表9中的TLR激动剂-接头比较化合物C-1缀合制备的。

表10a、10b和11的每一种免疫缀合物分别根据实施例202和203的方法制备，通过HPLC纯化，并通过质谱法表征。

表10a半胱氨酸突变TLR免疫缀合物(IC)

表10b半胱氨酸突变TLR免疫缀合物(IC)

表11比较免疫缀合物(IC)

免疫缀合物的生物活性

通过实施例204的测定法测试表10a、10b和11中的免疫缀合物的活性。基于树突细胞的测定法可用于评估癌症免疫疗法。树突细胞(DC)是桥接先天免疫系统和适应性免疫系统的专门的抗原呈递细胞，并且介导免疫和耐受性。通过实施例204中描述的常规/经典树突细胞(cDC)测定法测定免疫缀合物。

图1显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与HCC1954肿瘤细胞以及免疫缀合物Lys IC-1(表11)、IC-2、IC-3、IC-4、IC-8、IC-10、IC-13、IC-16、IC-17和IC-18(表10)及未缀合抗体曲妥珠单抗一起共培养之后的IL-12p70分泌。按浓度增加的免疫缀合物和曲妥珠单抗对IL-12p70的对数产生进行作图

图2显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与HCC1954肿瘤细胞以及免疫缀合物IC-1、IC-12、IC-6、IC-11、IC-5、IC-9、IC-7、IC-14和IC-15(表10)、Lys IC-1(表11)及未缀合抗体曲妥珠单抗一起共培养之后的IL-12p70分泌。按浓度增加的免疫缀合物和曲妥珠单抗对IL-12p70的对数产生进行作图。

图1和2中的结果显示，表10a中的某些半胱氨酸突变免疫缀合物在cDC测定中诱导更高水平的IL-12p70，并且因此引发比表11中的比较酰胺连接的免疫缀合物Lys IC-1和未缀合抗体曲妥珠单抗更强的髓样作用。

图3显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与HCC1954乳腺癌肿瘤细胞以及半胱氨酸突变抗HER2免疫缀合物IC-8、IC-13、IC-17和IC-10及对照酰胺连接的抗HER2缀合物Lys IC-1一起共培养之后的IL-12p70分泌。图3中的结果显示，表10b中的某些半胱氨酸突变免疫缀合物在乳腺癌测定中诱导更高水平的IL-12p70，并且因此引发比表11中的比较酰胺连接的免疫缀合物Lys IC-1更强的髓样作用。K188C突变IC-17诱导最高水平的IL-12p70。

图4显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与过表达PD-L1的修饰的HCC1954细胞系以及半胱氨酸突变抗PD-L1免疫缀合物IC-30、IC-31及对照酰胺连接的抗PD-L1缀合物Lys IC-3一起共培养之后的IL-12p70分泌。图4中的结果显示，表10b中的某些半胱氨酸突变免疫缀合物在乳腺癌测定中诱导更高水平的IL-12p70，并且因此引发比表11中的比较酰胺连接的免疫缀合物Lys IC-3更强的髓样作用。K188C突变IC-31诱导最高水平的IL-12p70。

图5显示的图形展示在激活从人血中新鲜分离的富集人cDC(常规树突细胞)并与HPAF II胰腺癌肿瘤细胞以及半胱氨酸突变抗TROP2免疫缀合物IC-27、IC-28、IC-29、IC-32和对照酰胺连接的抗TROP2缀合物Lys IC-2一起共培养之后的IL-12p70分泌。在这种情况下，对照酰胺连接的抗TROP2缀合物Lys IC-2在乳腺癌测定中诱导更高水平的IL-12p70，并且因此引发比表10b中的某些半胱氨酸突变免疫缀合物更强的髓样作用。

图1-5中的结果显示，本发明的免疫缀合物可有效引发髓样激活，并且因此可用于治疗癌症。

免疫缀合物的组合物

本发明提供了一种组合物，例如药学上或药理学上可接受的组合物或制剂，其包含多种如本文所述的免疫缀合物和任选用于其的载体，例如药学上或药理学上可接受的载体。组合物中的免疫缀合物可以是相同的或不同的，即组合物可包含具有与抗体构建体上的相同位置连接的相同数目的佐剂的免疫缀合物和/或具有与半胱氨酸突变抗体构建体上的不同位置连接的相同数目的TLR激动剂佐剂、具有与抗体构建体上的相同位置连接的不同数目的佐剂或具有与抗体构建体上的不同位置连接的不同数目的佐剂的免疫缀合物。

在示例性实施方案中，包含免疫缀合物化合物的组合物包含免疫缀合物化合物的混合物，其中免疫缀合物化合物的混合物中每个半胱氨酸突变抗体的平均载药(TLR激动剂)量为约2。

本发明的免疫缀合物的组合物可具有约0.4至约10的平均佐剂与抗体构建体比率(DAR)，这取决于半胱氨酸突变位点的数目以及制备用于缀合的半胱氨酸突变抗体的条件和缀合条件。技术人员将认识到，在包含多种本发明的免疫缀合物的组合物中，与半胱氨酸突变抗体构建体缀合的TLR激动剂佐剂的数目可根据免疫缀合物而变化，因此佐剂与抗体构建体(例如，抗体)比率可测量为平均值，其可以被称为药物与抗体比率(DAR)。可通过任意合适的方法评估佐剂与抗体构建体(例如，抗体)比率，其中的许多方法是本领域中已知的。

来自缀合反应的免疫缀合物的制剂中的每个抗体的佐剂部分的平均数(DAR)可以通过常规方法来表征，如质谱法、ELISA测定和HPLC。也可以确定以p表示的免疫缀合物在组合物中的定量分布。在一些情形下，可以通过诸如反相HPLC或电泳的方法实现均质免疫缀合物的分离、纯化和表征，其中p是来自具有其它载药量的免疫缀合物的某一值。

在一些实施方案中，组合物还包含一种或多种药学上或药理学上可接受的赋形剂。例如，本发明的免疫缀合物可以被配制成用于肠胃外施用，如IV施用或施用到体腔或器官的内腔中。或者，可以肿瘤内注射免疫缀合物。注射用组合物将通常包含免疫缀合物溶解在药学上可接受的载体中的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶剂当中有水和一种或多种盐如氯化钠的等渗溶液，例如林格氏溶液。此外，无菌不挥发油可常规用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸同样可用于制备注射剂。这些组合物理想地是无菌的，并且通常不含不期望的物质。可以通过常规的熟知灭菌技术对这些组合物进行灭菌。组合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。

组合物可含有任意合适浓度的免疫缀合物。组合物中免疫缀合物的浓度可以广泛变化，并且将根据选择的特定施用模式和患者的需要，主要基于流体体积、粘度、体重等来选择。在某些实施方案中，注射用溶液制剂中的免疫缀合物的浓度范围将是约0.1％(w/w)至约10％(w/w)。

用免疫缀合物治疗癌症的方法

本发明提供了治疗癌症的方法。所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的免疫缀合物(例如，作为如本文所述的组合物)，所述有需要的受试者例如为患有癌症并需要治疗所述癌症的受试者。所述方法包括施用治疗有效量的选自表9的免疫缀合物(IC)。

预期本发明的免疫缀合物可用于治疗各种过度增殖性疾病或病症，例如以肿瘤抗原的过表达为特征的过度增殖性疾病或病症。示例性的过度增殖性病症包括良性或恶性实体瘤和血液学病症，如白血病和淋巴样恶性肿瘤。

另一方面，提供了用作药物的免疫缀合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗个体的方法的免疫缀合物，所述方法包括向所述个体施用有效量的所述免疫缀合物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如本文所述。

在进一步的方面中，本发明提供免疫缀合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗癌症，所述方法包括向患有癌症的个体施用有效量的所述药物。在一个这样的实施方案中，所述方法还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如本文所述。

癌是起源于上皮组织的恶性肿瘤。上皮细胞覆盖身体的外表面，内衬于内腔，并形成腺体组织的衬里。癌的实例包括但不限于腺癌(始于腺(分泌)细胞的癌症，例如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌、胃食管连接部癌和结肠癌)、肾上腺皮质癌；肝细胞癌；肾细胞癌；卵巢癌；原位癌；导管癌；乳腺癌；基底细胞癌；鳞状细胞癌；移行细胞癌；结肠癌；鼻咽癌；多房囊性肾细胞癌；燕麦细胞癌；大细胞肺癌；小细胞肺癌；非小细胞肺癌；等等。前列腺、胰腺、结肠、脑(通常作为继发性转移)、肺、乳腺和皮肤中均可发现癌。在一些实施方案中，治疗非小细胞肺癌的方法包括施用含有能够结合PD-L1的抗体构建体的免疫缀合物(例如，阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗的半胱氨酸突变类似物、其生物仿制药或其生物改良药)。在一些实施方案中，治疗乳腺癌的方法包括施用含有能够结合PD-L1的抗体构建体的免疫缀合物(例如，阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗的半胱氨酸突变类似物、其生物仿制药或其生物改良药)。在一些实施方案中，治疗三阴性乳腺癌的方法包括施用含有能够结合PD-L1的抗体构建体(例如，阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗的半胱氨酸突变类似物、其生物仿制药或其生物改良药)的免疫缀合物。

软组织肿瘤是一组来源于结缔组织的高度多样化的罕见肿瘤。软组织肿瘤的示例包括但不限于腺泡状软组织肉瘤；血管瘤样纤维组织细胞瘤；软骨粘液样纤维瘤；骨骼软骨肉瘤；骨外粘液样软骨肉瘤；透明细胞肉瘤；促结缔组织增生性小圆细胞瘤；隆突性皮肤纤维肉瘤；子宫内膜间质肿瘤；尤因肉瘤；纤维瘤病(硬纤维瘤)；婴儿型纤维肉瘤；胃肠道间质瘤；骨巨细胞瘤；腱鞘巨细胞瘤；炎性肌纤维母细胞瘤；子宫平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；脂肪母细胞瘤；典型脂肪瘤；梭形细胞或多形性脂肪瘤；非典型脂肪瘤；软骨样脂肪瘤；高分化脂肪肉瘤；粘液样/圆细胞脂肪肉瘤；多形性脂肪肉瘤；粘液样恶性纤维组织细胞瘤；高度恶性纤维组织细胞瘤；粘液纤维肉瘤；恶性周围神经鞘瘤；间皮瘤；神经母细胞瘤；骨软骨瘤；骨肉瘤；原始神经外胚层肿瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；胚胎型横纹肌肉瘤；良性或恶性神经鞘瘤；滑膜肉瘤；埃文氏瘤(Evan’s tumor)；结节性筋膜炎；韧带样型纤维瘤病；孤立性纤维瘤；隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)；血管肉瘤；上皮样血管内皮瘤；腱鞘巨细胞瘤(TGCT)；色素沉着绒毛结节性滑膜炎(PVNS)；纤维发育不良；粘液纤维肉瘤；纤维肉瘤；滑膜肉瘤；恶性周围神经鞘瘤；神经纤维瘤；软组织多形性腺瘤；以及来源于成纤维细胞、肌成纤维细胞、组织细胞、血管细胞/内皮细胞和神经鞘细胞的瘤形成。

肉瘤是一种罕见类型的癌症，其起源于间充质来源的细胞，例如身体的骨骼或软组织，包括软骨、脂肪、肌肉、血管、纤维组织或其他结缔或支持组织。不同类型的肉瘤基于癌症形成的位置。例如，骨肉瘤在骨骼中形成，脂肪肉瘤在脂肪中形成，且横纹肌肉瘤在肌肉中形成。肉瘤的实例包括但不限于阿斯金瘤；葡萄状肉瘤；软骨肉瘤；尤因氏肉瘤；恶性血管内皮瘤；恶性神经鞘瘤；骨肉瘤；和软组织肉瘤(例如，肺泡样软组织肉瘤；血管肉瘤；叶状囊肉瘤隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)；硬纤维瘤；促结缔组织增生性小圆细胞瘤；上皮样肉瘤；骨骼外软骨肉瘤；骨骼外骨肉瘤；纤维肉瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；血管外皮细胞瘤；血管内皮瘤(更通常称为“血管肉瘤”)；卡波西肉瘤；平滑肌肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；恶性周围神经鞘瘤(MPNST)；神经纤维肉瘤；滑膜肉瘤；和未分化多形性肉瘤)。

畸胎瘤是一种类型的生殖细胞肿瘤，其可含有若干不同类型的组织(例如，可包括源自任何和/或所有三个胚层的组织：内胚层、中胚层和外胚层)，包括例如毛发、肌肉和骨骼。畸胎瘤最常发生在女性的卵巢、男性的睾丸和儿童的尾椎骨中。

黑素瘤是一种始于黑素细胞(产生黑色素的细胞)的癌症形式。黑素瘤可始于痣(皮肤黑素瘤)，但也可始于其它有色素组织，如眼睛或肠。

默克尔细胞癌是一种罕见的皮肤癌，其通常表现为面部、头部或颈部的肉色或蓝红色结节。默克尔细胞癌也称为皮肤的神经内分泌癌。在一些实施方案中，治疗默克尔细胞癌的方法包括施用含有能够结合PD-L1的抗体构建体(例如，阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、其生物仿制药或其生物改良药)的免疫缀合物。在一些实施方案中，当施用发生时，默克尔细胞癌已经转移。

白血病是在形成血液的组织如骨髓中开始的癌症，并且导致产生大量异常的血细胞并进入血流。例如，白血病可起源于通常在血流中成熟的骨髓源性细胞。白血病针对疾病发展和进展的有多快速(例如，急性与慢性)以及受影响的白细胞类型(例如，骨髓与淋巴)来命名。髓样白血病也称为骨髓性或成髓细胞白血病。淋巴样白血病也称为淋巴母细胞或淋巴细胞白血病。淋巴样白血病细胞可聚集在淋巴结中，所述淋巴结会肿胀。白血病的示例包括但不限于急性髓样白血病(AML)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性髓样白血病(CML)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。

淋巴瘤是始于免疫系统的细胞的癌症。例如，淋巴瘤可起源于通常在淋巴系统中成熟的骨髓源性细胞。有两种基本类别的淋巴瘤。一种类别的淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤(HL)，其特征是存在被称为里德-斯德伯格氏细胞的细胞类型。HL目前有6种公认的类型。霍奇金淋巴瘤的实例包括结节硬化典型霍奇金淋巴瘤(CHL)、混合细胞性CHL、淋巴细胞耗竭型CHL、富淋巴细胞型CHL和结节性淋巴细胞为主型HL。

另一种类别的淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其包括大量不同的免疫系统细胞的癌症。非霍奇金淋巴瘤可进一步分成具有惰性(缓慢生长)病程的癌症和具有侵袭性(快速生长)病程的癌症。NHL目前有61种公认的类型。非霍奇金淋巴瘤的示例包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴瘤、母细胞性NK细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、伯基特样淋巴瘤(小非裂细胞淋巴瘤)、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、肝脾γ-δT细胞淋巴瘤、T细胞白血病、淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、鼻T细胞淋巴瘤、小儿淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、转化淋巴瘤、治疗相关的T细胞淋巴瘤和华氏巨球蛋白血症。

脑癌包括脑组织的任何癌症。脑癌的示例包括但不限于神经胶质瘤(例如，成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤等)、脑膜瘤、垂体腺瘤和前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤(髓母细胞瘤)。

本发明的免疫缀合物可以单独使用或与疗法中的其它剂组合使用。例如，免疫缀合物可以与至少一种另外的治疗剂如化学治疗剂共同施用。这类组合疗法涵盖组合施用(其中在同一或分开的制剂中包括两种或更多种治疗剂)和单独施用，在后一种情况下，免疫缀合物的施用可以在另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前、同时和/或之后进行。免疫缀合物也可以与放射疗法组合使用。

可以通过任意合适的方式施用本发明的免疫缀合物(和任何另外的治疗剂)，包括肠胃外、肺内和鼻内施用，并且如果需要局部治疗，则进行病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。可以通过任意合适的途径给药，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分地取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑包括但不限于在各种时间点单次或多次施用、推注施用和脉冲输注的各种给药方案。在一个实施方案中，对患者静脉内、肿瘤内或皮下施用免疫缀合物。

本发明的免疫缀合物可用于治疗癌症，特别是乳腺癌，尤其是三阴性(雌激素受体、孕酮受体和过量HER2蛋白测试呈阴性)乳腺癌、膀胱癌和默克尔细胞癌。本文所述的免疫缀合物可用于治疗与批准用于治疗的裸抗体(如阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗、其生物仿制药及其生物改良药)治疗的相同类型的癌症，特别是乳腺癌，尤其是三阴性(雌激素受体、孕酮受体和过量HER2蛋白测试呈阴性)乳腺癌、膀胱癌和默克尔细胞癌。

采用任意合适的给药方案，对有需要的受试者施用任何治疗有效量的免疫缀合物。例如，所述方法可包括施用免疫缀合物以向受试者提供约100ng/kg至约50mg/kg的剂量。免疫缀合物剂量的范围可以是约5mg/kg至约50mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg或约100μg/kg至约1mg/kg。免疫缀合物剂量可以为约100、200、300、400或500μg/kg。免疫缀合物剂量可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。免疫缀合物剂量也可以在这些范围之外，这取决于特定的缀合物以及所治疗的癌症的类型和严重程度。施用的频率范围可以从每周单剂量至多剂量，或更频繁。在一些实施方案中，约每月一次至约每周五次施用免疫缀合物。在一些实施方案中，每周一次施用免疫缀合物。

另一方面，本发明提供预防癌症的方法。所述方法包括对受试者施用治疗有效量的免疫缀合物(例如，如上所述的组合物的形式)。在某些实施方案中，受试者易患某种要预防的癌症。例如，所述方法可包括施用免疫缀合物以向受试者提供约100ng/kg至约50mg/kg的剂量。免疫缀合物剂量的范围可以是约5mg/kg至约50mg/kg、约10μg/kg至约5mg/kg或约100μg/kg至约1mg/kg。免疫缀合物剂量可以为约100、200、300、400或500μg/kg。免疫缀合物剂量可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。在一个实施方案中，以每kg体重约0.01-20mg的剂量对患者施用免疫缀合物。免疫缀合物剂量也可以在这些范围之外，这取决于特定的缀合物以及所治疗的癌症的类型和严重程度。施用的频率范围可以从每周单剂量至多剂量，或更频繁。在一些实施方案中，在治疗方案或疗程中按约每月一次至约每周五次施用免疫缀合物。在一些实施方案中，每周一次施用免疫缀合物。

本发明的一些实施方案提供治疗如上所述的癌症的方法，其中所述癌症是乳腺癌。乳腺癌可起源于乳房的不同区域，并且已经表征了许多不同类型的乳腺癌。例如，本发明的免疫缀合物可用于治疗导管原位癌；浸润性导管癌(例如，管状癌；髓样癌；粘液癌；乳头状癌；或乳腺筛状癌)；小叶原位癌；侵袭性小叶癌；炎症性乳腺癌；及其它形式的乳腺癌，如三阴性(雌激素受体、孕酮受体和过量HER2蛋白测试呈阴性)乳腺癌。在一些实施方案中，治疗乳腺癌的方法包括施用含有能够结合HER2(例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗的半胱氨酸突变类似物、其生物仿制药或生物改良药)、PD-L1(例如，阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、阿维鲁单抗的半胱氨酸突变类似物、其生物仿制药或生物改良药)或TROP2(例如赛妥珠单抗、戈沙妥珠单抗(Immunomedics，IMMU-132)的半胱氨酸突变类似物、其生物仿制药或生物改良药)的抗体构建体的免疫缀合物。在一些实施方案中，治疗结肠癌肺癌、肾癌、胰腺癌、胃癌和食道癌的方法包括施用含有能够结合CEA或过表达CEA的肿瘤的抗体构建体(例如，拉贝珠单抗、其生物仿制药或生物改良药)的免疫缀合物。

在一些实施方案中，所述癌症对由TLR7和/或TLR8诱导的促炎反应敏感。

在一些实施方案中，对需要治疗癌症的患者施用治疗有效量的免疫缀合物，其中所述癌症表达PD-L1、HER2、CEA或TROP2。

在一些实施方案中，对需要治疗宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、食管癌、膀胱癌、泌尿道癌、尿路上皮癌、肺癌、非小细胞肺癌、默克尔细胞癌、结肠癌、结直肠癌、胃癌或乳腺癌的患者施用治疗有效量的免疫缀合物。默克尔细胞癌可以是转移性默克尔细胞癌。乳腺癌可以是三阴性乳腺癌。食管癌可以是胃食管连接部腺癌。

实施例

实施例C-1 4-((1-(5-(2-氨基-4-(乙氧基(丙基)氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂-8-基)嘧啶-2-基)-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧杂-2-氮杂三十六烷-36-酰基)氧基)-2,3,5,6-四氟苯磺酸，C-1

5-溴-2-(溴甲基)嘧啶，C-1b的制备

在0℃和N₂下向(5-溴嘧啶-2-基)甲醇，C-1a(300mg，1.59mmol，1.0当量)在THF(10mL)中的溶液中一次性添加PPh₃(499mg，1.90mmol，1.2当量)和CBr₄(631mg，1.90mmol，1.2当量)。将混合物在20℃下搅拌10小时。添加水(10mL)，并将水相用乙酸乙酯(10mL*3)萃取，将合并的有机相用盐水(10mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(柱高：250mm，直径：100mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝1/0，8/1)纯化残留物，得到C-1b(290mg，1.15mmol，72.4％收率)，为白色固体。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.81(s,2H),4.59(s,2H)。

N-[(5-溴嘧啶-2-基)甲基]-N-叔丁氧羰基-氨基甲酸叔丁酯，C-1c的制备

在20℃和N₂下向C-1b(290mg，1.15mmol，1.0当量)和N-叔丁氧羰基氨基甲酸叔丁酯(250mg，1.15mmol，1.0当量)在DMF(3mL)中的混合物中分次添加Cs₂CO₃(562mg，1.73mmol，1.5当量)，将混合物在20℃下搅拌2.5小时。添加水(5mL)，并将水相用乙酸乙酯(5mL*3)萃取，将合并的有机相用盐水(5mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(柱高：250mm，直径：100mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝1/0，5/1)纯化残留物，得到C-1c(350mg，901umol，78.3％收率)，为白色固体。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.74(s,2H),5.01(s,2H),1.48(s,18H)。

N-[[5-[2-氨基-4-[乙氧基(丙基)氨基甲酰基]-3H-1-苯并氮杂-8-基]嘧啶-2-基]甲基]-N-叔丁氧羰基-氨基甲酸叔丁酯，C-1d的制备

在N₂下向C-1c(184mg，473umol，1.0当量)和2-氨基-N-乙氧基-N-丙基-8-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)-3H-1-苯并氮杂-4-甲酰胺(195mg，474umol，1.0当量)在二噁烷(10mL)和H₂O(2mL)中的混合物中一次性添加Pd(dppf)Cl₂·CH₂Cl₂(19.3mg，23.7umol，0.05当量)和K₂CO₃(163mg，1.18mmol，2.5当量)，将混合物脱气，并在N₂下加热到90℃持续2小时。真空移除二噁烷(10mL)并添加水(20mL)，并将水相用乙酸乙酯(10mL*3)萃取，将合并的有机相用盐水(10mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(柱高：250mm，直径：100mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯＝10/1，0/1至乙酸乙酯/甲醇＝10/1)纯化残留物，得到C-1d(280mg，470.83umol，99.35％收率)，为灰色固体。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ9.08(s,2H),7.61(s,1H),7.59(d,J＝2.8Hz,2H),7.38(s,1H),5.08(s,2H),3.98(q,J＝7.2Hz,2H),3.76(t,J＝7.2Hz,2H),1.83-1.75(m,2H),1.47(s,18H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),1.02(t,J＝7.2Hz,3H)。

2-氨基-8-[2-(氨甲基)嘧啶-5-基]-N-乙氧基-N-丙基-3H-1-苯并氮杂-4-甲酰胺，C-1e的制备

在20℃和N₂下向C-1d(20.0mg，33.6umol，1.0当量)在EtOAc(5mL)中的溶液中一次性添加HCl/EtOAc(4M，8.41uL，1.0当量)，将混合物在20℃下搅拌1小时。将反应混合物真空浓缩。通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：1％-30％，8分钟)纯化残留物，得到C-1e(6.2mg，9.84umol，29.2％收率，98.8％纯度，2TFA)，为白色固体。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ9.22(s,2H),7.82(d,J＝2.0Hz,1H),7.79-7.75(m,2H),7.47(s,1H),4.49(s,2H),4.00(q,J＝7.2Hz,2H),3.78(t,J＝7.2Hz,2H),3.46(s,2H),1.85-1.77(m,2H),1.22(t,J＝7.2Hz,3H),1.03(t,J＝7.2Hz,3H)。LC/MS[M+H]395.2(计算值)；LC/MS[M+H]395.1(实测值)。

3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-氨基-4-[乙氧基(丙基)氨基甲酰基]-3H-1-苯并氮杂-8-基]嘧啶-2-基]甲氨基]-3-氧代-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸，C-1f的制备

在25℃和N₂下向C-1e(70mg，149umol，1.0当量，2HCl)和3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-氧代-3-(2,3,5,6-四氟苯氧基)丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(127mg，179umol，1.2当量)在DMF(0.5mL)中的混合物中一次性添加二异丙基乙胺DIEA(77.4mg，599umol，104uL，4.0当量)，将混合物在25℃下搅拌0.5小时。将反应混合物过滤，并通过制备型HPLC(柱：Phenomenex luna C18 80*40mm*3微米(μm)；流动相：[水(0.04％HCl)-ACN]；B％：12％-39％，5.5分钟)纯化滤液，得到C-1f(50.0mg，53.4umol，35.7％收率)，为黄色油状物。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ9.14(s,2H),7.86-7.81(m,1H),7.78-7.74(m,2H),7.48(s,1H),4.72(s,2H),4.00(q,J＝7.2Hz,2H),3.85-3.71(m,8H),3.69-3.58(m,38H),3.47(s,2H),2.62(t,J＝6.0Hz,2H),2.55(t,J＝6.4Hz,2H),1.85-1.76(m,2H),1.23(t,J＝7.2Hz,3H),1.03(t,J＝7.2Hz,3H)。

C-1的制备

在25℃和N₂下向C-1f(60mg，61.7umol，1.0当量，HCl)和(2,3,5,6-四氟-4-羟基-苯基)磺酰氧基钠(99.3mg，370umol，6.0当量)在二氯甲烷DCM(2mL)和二甲基乙酰胺DMA(0.5mL)中的混合物中一次性添加1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺EDCI，CAS登记号1892-57-5(71.0mg，370umol，6.0当量)，将混合物在25℃下搅拌1小时。将反应混合物过滤，并通过制备型HPLC(柱：Phenomenex Synergi C18 150*25*10um；流动相：[水(0.1％TFA)-ACN]；B％：20％-45％，8分钟)纯化滤液，得到C-1(38.0mg，30.5umol，49.3％收率，93.3％纯度)，为黄色油状物。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ9.11(s,2H),7.83-7.79(m,1H),7.77(s,1H),7.76-7.71(m,1H),7.47(s,1H),4.71(s,2H),4.00(q,J＝7.2Hz,2H),3.88(t,J＝5.6Hz,2H),3.85-3.75(m,5H),3.70-3.57(m,38H),3.47(s,2H),2.99(t,J＝6.0Hz,2H),2.62(t,J＝4Hz,2H),1.85-1.75(m,2H),1.23(t,J＝7.2Hz,3H),1.02(t,J＝7.2Hz,3H)。LC/MS[M+H]1163.3(计算值)；LC/MS[M+H]1163.3(实测值)。

实施例C-2 1-(5-(2-氨基-4-(乙氧基(丙基)氨基甲酰基)-3H-苯并[b]氮杂-8-基)嘧啶-2-基)-3-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧杂-2-氮杂三十六碳-36-烷酸2,3,5,6-四氟苯酯，C-2

按照实施例C-1的程序，向3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-[[5-[2-氨基-4-[乙氧基(丙基)氨基甲酰基]-3H-1-苯并氮杂-8-基]嘧啶-2-基]甲氨基]-3-氧代-丙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸，C-1f(5.00g，5.35mmol，1.00当量)在50ml DCM中的溶液中依次添加2,3,5,6-四氟苯酚(1.77g，10.7mmol，2.00当量)、丙烷膦酸酐(PPAA，T3P)，CAS登记号68957-94-8(在MeCN中的50重量％溶液，17.0g溶液，26.8mmol，5.00当量)和N-甲基咪唑，NMI(2.15mL，26.8mmol，5.00当量)。将混合物在20℃下搅拌2h，然后用20％的NaCl水溶液(50mL)稀释。将水层用DCM(25mL)萃取，并将合并的有机层用水(25mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩，得到深棕色油状物形式的粗C-2。将材料加载到Biotage柱上(在MeCN/水2:8，v/v中250mL 7.5mM HCl)，并采用梯度步骤纯化(20柱体积MeCN/水2:8，然后是15柱体积MeCN/水3:7)。将所需级份合并，然后萃取(2x300mL DCM)并真空浓缩，得到深黄色油状物形式的纯C-2(5.34g，通过qNMR测得纯度为55.6重量％，56％收率)，将其在-20℃和氮气下储存，之后用DMA稀释制成C-2的20mM溶液。LC/MS[M+H]1083.1(计算值)；LC/MS[M+H]1083.1(实测值)。

实施例TLR-L-1 2-氨基-8-(2-(38-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-3,37-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧杂-2,36-二氮杂三十八烷基)嘧啶-5-基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮杂-4-甲酰胺，TLR-L-1

将2-氨基-8-(2-(氨甲基)嘧啶-5-基)-N-乙氧基-N-丙基-3H-苯并[b]氮杂-4-甲酰胺，C-1e(0.0283g，0.072mmol，1当量)和1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十氧杂-3-氮杂三十六碳-36-烷酸，TLR-L-1a(0.0478g，0.072mmol，1当量)溶解在二甲基甲酰胺，DMF中。添加二异丙基乙胺，DIPEA(0.075mol，0.43mmol，6当量)，接着添加((7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐)，PyAOP，CAS登记号156311-83-0(0.091g，0.18mmol，2.4当量)。在室温下搅拌反应，然后浓缩，并通过RP-HPLC纯化，得到TLR-L-1(0.0346g，0.033mmol，46％)。LC/MS[M+H]1043.53(计算值)；LC/MS[M+H]1043.84(实测值)。

实施例201具有特异性半胱氨酸(Cys)突变的抗HER2抗体的制备

具有位点特异性半胱氨酸突变的抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗)的制备描述于US10,973,826、WO 2014/124316和WO 2015/138615中，上述专利文献中的每一者以引用的方式并入本文。化学合成编码抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗)的重链和轻链的可变区的DNA并克隆到含有人IgG1和人κ轻链的恒定区的两个哺乳动物表达载体pOG-HC和pOG-LC中。载体含有CMV启动子和信号序列。采用寡核苷酸定向诱变技术来制备抗HER2抗体的Cys突变构建体，并通过DNA测序确认Cys突变构建体的序列。例如，可以在抗HER2抗体中的一个或多个以下位置(所有位置均按EU编号)引入半胱氨酸：(a)抗体重链的位置S157、L174、G178、S119、V167、I199、Q196、A378和A140，和(b)抗体轻链的位置K145、S114、E105、S159、V191、L201、T129、K149和K188。例如，可以在重链的位置S157(表3)引入半胱氨酸，产生抗HER2mAb，其具有SEQ ID NO:21的轻链序列和SEQ ID NO:33的重链序列(表4)。

抗HER2抗体的Cys突变体可通过采用如所描述的瞬时转染方法共转染重链和轻链质粒在293Freestyle^TM细胞中表达(Meissner等人，(2001)Biotechnol Bioeng.75:197-203)。通过标准蛋白A亲和色谱法从细胞上清液中纯化所表达的抗体。

采用类似的方法将曲妥珠单抗的重链和轻链的可变区克隆到两个载体中，用于在CHO细胞中表达。重链载体编码人IgG1抗体的恒定区，包括信号肽、用以驱动重链的表达的CMV启动子以及用于稳定转染到CHO细胞中的适当信号和选择序列。轻链载体编码人κ轻链的恒定区，并且包括信号肽、用以驱动轻链的表达的CMV启动子以及用于稳定转染到CHO细胞中的适当信号和选择序列。为了产生抗体，将重链载体和轻链载体共转染到CHO细胞系中。细胞经历选择，然后在优化抗体产生的条件下培养稳定转染的细胞。通过标准蛋白A亲和色谱法从细胞上清液中纯化抗体。

Cys突变抗HER2抗体的还原、再氧化和与TLR7激动剂的缀合

采用Junutula J R等人，Nature Biotechnology 26:925-932(2008)和实施例202中描述的方法使本发明的包含接头如(TLR-L)的TLR激动剂与工程化到抗体中的半胱氨酸(Cys)残基缀合。因为在哺乳动物细胞中表达的抗体中的工程化Cys残基在生物合成期间被加合物(二硫化物)如谷胱甘肽(GSH)和/或半胱氨酸修饰，所以最初表达的修饰的Cys对硫醇反应试剂(如马来酰亚胺基或溴乙酰胺或碘乙酰胺基团)不具有反应性。为了缀合工程化Cys残基，通过还原二硫化物来移除谷胱甘肽或半胱氨酸加合物，这通常需要还原表达的抗体中的所有二硫化物。还原是通过如下方式实现的：首先使抗体暴露于还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP，接着再氧化抗体的所有天然二硫键以恢复和/或稳定功能性抗体结构。因此，为了减少天然二硫键和工程化Cys残基的半胱氨酸或GSH加合物之间的二硫键，将新鲜制备的DTT添加到先前纯化的曲妥珠单抗的Cys突变体中，至最终浓度为10mM或20mM。抗体与DTT在37℃下温育1小时后，将混合物对PBS进行透析三天，每天更换缓冲液以移除还原剂和副产物如DTT，并再氧化天然二硫键。通过反相HPLC监测再氧化过程，反相HPLC能够将抗体四聚体与单个的重链和轻链分子分离。在加热到80℃的PRLP-S 4000A柱(50mm x 2.1mm，Agilent)上分析反应物，并通过在含有0.1％ TFA的水中30-60％乙腈的线性梯度以1.5ml/min的流速进行柱洗脱。在280nm下监测蛋白质从柱中的洗脱。继续进行透析，直到再氧化完成。再氧化恢复了链内和链间二硫化物，而透析使与新引入的Cys残基连接的半胱氨酸和谷胱甘肽透析掉。

再氧化完成或接近完成后，将含有TLR激动剂接头马来酰亚胺的中间体化合物(TLR-L)添加到PBS缓冲液(pH 7.2)中的再氧化抗体中，与工程化Cys的比率通常为1.5:1、2:1或5:1，并进行温育约1小时。通常，通过标准方法在蛋白A树脂上进行纯化，接着将缓冲液交换到PBS中，由此移除过量的游离TLR-L。

或者，采用树脂上方法还原并再氧化抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗)的Cys突变体。将蛋白A琼脂糖珠(每10mg抗体为1ml)在PBS(没有钙或镁盐)中平衡，然后以分批模式添加到抗体样品中。通过将850mg半胱氨酸HCl溶解在10ml溶液中来制备0.5M半胱氨酸储备液，所述10ml溶液是通过将3.4g NaOH添加到250ml的0.5M磷酸钠(pH 8.0)中制备的，然后将20mM半胱氨酸添加到抗体/珠粒浆料中，并在室温下轻轻混合30-60分钟。将珠粒装载到重力柱中，并在小于30分钟内用50个床体积的PBS洗涤，然后用重悬于一个床体积的PBS柱中的珠粒覆盖柱。为了调节再氧化的速率，任选添加50nM至1μM(微摩尔)氯化铜。通过取出树脂的少量测试样品，在IgG洗脱缓冲液(Thermo)中洗脱，并如上所述通过RP-HPLC分析来监测再氧化过程。一旦再氧化进展到所需的完全程度，立即通过添加超过工程化半胱氨酸2-3摩尔过量的TLR-L化合物来启动缀合，并使混合物在室温下反应5-10分钟，之后用至少20个柱体积的PBS洗涤柱。用IgG洗脱缓冲液洗脱抗体缀合物，用0.1体积的0.5M磷酸钠(pH8.0)中和，并将缓冲液交换为PBS。或者，不是在树脂上启动与抗体的缀合，而是用至少20个柱体积的PBS洗涤柱，用IgG洗脱缓冲液洗脱抗体，并用pH 8.0的缓冲液中和。然后将抗体用于缀合反应，或快速冷冻以备将来使用。

实施例202半胱氨酸突变免疫缀合物(IC)的制备

为了进行基于半胱氨酸突变体的缀合的制备，使用Zeba^TM旋转脱盐柱(ThermoFisher Scientific)将抗体用缓冲液交换到含有2mM乙二胺四乙酸(EDTA)的pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将缓冲液交换的抗体的浓度调节到大约5至25mg/ml，并进行无菌过滤。作为第一步，将20至40倍摩尔过量的还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或三-(2-羧乙基)膦(TCEP)添加到抗体中，以还原所有的二硫键并移除谷胱甘肽和/或半胱氨酸加合物。还原在30℃或37℃下进行30分钟至2小时。使用Zeba旋转脱盐柱移除过量的还原试剂。通过在室温下使用20-40倍摩尔过量的脱氢抗坏血酸(dhAA)将Ab再氧化60分钟至2小时来恢复天然二硫化物。再氧化完成后，在室温下将含有接头-有效载荷的马来酰亚胺以5-12倍摩尔过量添加到再氧化的抗体中持续1小时。通过使用Zeba旋转脱盐柱将缓冲液交换到适当的制剂缓冲液中来移除过量的接头-有效载荷。缀合后，IC所产生的琥珀酰亚胺环可水解以赋予更大的稳定性(Zheng,K.等人，(2019)J Pharm Sci,108(1):133-141)

在缀合之后，为了潜在地移除未反应的TLR-L和/或较高分子量的聚集体，可以采用尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、色谱聚焦、超滤、离心超滤、切向流过滤及其组合进一步纯化IC。

为了缀合，可以将抗体溶解在本领域中已知将不会对抗体的稳定性或抗原结合特异性产生不利影响的水性缓冲系统中。可以使用磷酸盐缓冲盐水。将TLR-L溶解在包含至少一种如本文别处所述的极性非质子溶剂的溶剂体系中。在一些这样的方面中，将TLR-L在pH8的Tris缓冲液(例如，50mM Tris)中溶解至浓度为约5mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM或约50mM及其范围，如约5mM至约50mM或约10mM至约30mM。在一些方面，将TLR-L溶解在DMSO(二甲亚砜)、DMA(二甲基乙酰胺)或乙腈或另一种合适的偶极非质子溶剂中。

或者在缀合反应中，可以稀释等量过量的TLR-L溶液，并与抗体溶液合并。TLR-L溶液可以合适地用至少一种极性非质子溶剂和至少一种极性质子溶剂稀释，其实例包括水、甲醇、乙醇、正丙醇和乙酸。TLR-L与抗体的摩尔当量可以为约1.5:1、约3:1、约5:1、约10:1、约15:1或约20:1及其范围，如约1.5:1至约20:1、约1.5:1至约15:1、约1.5:1至约10:1、约3:1至约15:1、约3:1至约10:1、约5:1至约15:1或约5:1至约10:1。可以通过本领域中已知的方法如LC-MS合适地监测反应的完成。缀合反应通常在约1小时至约16小时的范围内完成。反应完成后，可以向反应混合物中添加试剂以淬灭反应。如果抗体硫醇基团与硫醇反应性基团(如TLR-L的马来酰亚胺)反应，则未反应的抗体硫醇基团可与封端试剂反应。合适的封端试剂的一个示例是乙基马来酰亚胺。

在缀合之后，可以通过本领域中已知的纯化方法将免疫缀合物纯化并与未缀合的反应物和/或缀合物聚集体分离，所述纯化方法例如但不限于尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、色谱聚焦、超滤、离心超滤、切向流过滤及其组合。例如，纯化之前可以稀释免疫缀合物，如在pH 5的20mM琥珀酸钠中稀释。将经稀释的溶液施加到阳离子交换柱上，接着用例如至少10个柱体积的pH5的20mM琥珀酸钠洗涤。可以合适地用缓冲液如PBS洗脱缀合物。

实施例203比较酰胺连接的免疫缀合物的制备

为了制备赖氨酸缀合的免疫缀合物，如表11中的比较Lys IC-1，使用G-25SEPHADEX^TM脱盐柱(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或Zeba^TM旋转脱盐柱(Thermo FisherScientific)将抗体以缓冲液交换到含有100mM硼酸、50mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸(pH8.3)的缀合缓冲液中。然后使用缓冲液将洗脱液各自调节至约1-10mg/ml缓冲液交换的抗体的浓度，然后进行无菌过滤。将抗体预热至20-30℃，并快速地与2-20(例如，7-10)摩尔当量的具有活性酯(如表9中的2,3,5,6-四氟苯基酯或4-磺基、2,3,5,6-四氟苯基酯)的TLR激动剂-接头比较化合物混合，以形成与抗体的酰胺键。使反应在30℃下进行约16小时，并通过在pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中平衡的两个连续G-25脱盐柱上运行将免疫缀合物(IC)与反应物分离，以提供表2的免疫缀合物(IC)。佐剂-抗体比率(DAR)是通过使用连接到XEVO^TM G2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)的ACQUITY^TM UPLC H类(WatersCorporation,Milford,MA)上的C4反相柱进行液相色谱质谱分析来确定的。

或者，将式a-f的活性酯TLR激动剂-接头(TLR-L)化合物溶解在二甲基亚砜(DMSO)或二甲基乙酰胺(DMA)中至浓度为5至20mM。为了缀合，使抗体与4至20摩尔当量的TLR-L混合。在一些情况下，添加多达20％(v/v)的另外的DMA或DMSO以提高TLR-L在缀合缓冲液中的溶解度。使反应在20℃或30℃或37℃下进行约30分钟至4小时。使用两个连续的Zeba^TM旋转脱盐柱将所得缀合物从未反应的BBI-L中纯化出来。将柱用pH 7.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)预平衡。使用与XEVO^TM G2-XS TOF质谱仪(Waters Corporation)连接的H级ACQUITY^TM UPLC(Waters Corporation，Milford，MA)上的C4反相柱，通过液相色谱质谱分析来估计佐剂与抗体比率(DAR)。

实施例204免疫缀合物体外活性的评估

本实施例显示，本发明的免疫缀合物有效引发髓样激活，如在树突细胞中，因此可用于治疗癌症。

人常规树突细胞的分离：通过密度梯度离心从获自健康献血者的人外周血(Stanford Blood Center，Palo Alto，California)中负向选择人常规树突细胞(cDC)。简言之，首先通过使用ROSETTESEP^TM人CD3耗竭混合物(Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)从细胞制剂中移除T细胞来富集细胞。然后使用EASYSEP^TM人髓样DC富集试剂盒(Stem Cell Technologies)经由负向选择进一步富集cDC。

cDC激活测定：将8x10⁴个APC与表达ISAC靶抗原的肿瘤细胞以10:1的效应物(cDC)与靶标(肿瘤细胞)比率共培养。将细胞在含有RPMI-1640培养基的96孔板(Corning，Corning，NY)中温育，所述培养基补充有10％ FBS和(在指出的情况下)各种浓度的本发明指示的免疫缀合物(如根据上述实施例制备)。过夜温育约18小时之后，收集无细胞上清液，并使用BioLegend LEGENDPLEX细胞因子珠粒阵列分析细胞因子分泌(包括TNFα和/或IL-12p70)。

除了所描述的利用不同的髓样群体的测定之外，还可以采用各种筛选测定法来测量髓样细胞类型的激活。这些可包括以下：分离自健康供体血液的单核细胞、M-CSF分化的巨噬细胞、GM-CSF分化的巨噬细胞、GM-CSF+IL-4单核细胞源性树突细胞、分离自健康供体血液的常规树突细胞(cDC)和极化至免疫抑制状态的髓样细胞(也称为髓样源性抑制细胞或MDSC)。MDSC极化细胞的实例包括向免疫抑制状态分化的单核细胞，如M2a MΦ(IL4/IL13)、M2c MΦ(IL10/TGFb)、GM-CSF/IL6 MDSC和肿瘤培养的单核细胞(TEM)。可以使用肿瘤条件培养基(例如786.O、MDA-MB-231、HCC1954)进行TEM分化。原发性肿瘤相关髓样细胞还可以包括存在于解离的肿瘤细胞悬浮液中的原发性细胞(Discovery Life Sciences)。

对所述髓样细胞群体的激活的评估可以作为单一培养物或作为与表达所关注的抗原的细胞的共培养物进行，ISAC可经由抗体的CDR区与所关注的抗原结合。温育18-48小时之后，可通过采用流式细胞术上调细胞表面共刺激分子或通过测量分泌的促炎细胞因子来评估激活。对于细胞因子测量，收获无细胞上清液，并采用流式细胞术通过细胞因子珠粒阵列(例如来自Biolegend的LegendPlex)进行分析。

本文引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)以引用的方式特此并入，其程度如同指示每个参考文献单独且具体地以引用的方式并入，并且在本文中全文阐述。

Claims

1.一种免疫缀合物，其包含通过接头与一个或多个TLR激动剂部分共价连接的半胱氨酸突变抗体。

2.如权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体在铰链区中包含半胱氨酸突变。

3.如权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体包含选自由以下组成的组的半胱氨酸突变：根据EU格式编号的K145C、S114C、E105C、S157C、L174C、G178C、S159C、V191C、L201C、S119C、V167C、I199C、T129C、Q196C、A378C、K149C、K188C和A140C。

4.如权利要求3所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体在选自由以下组成的组的序列中包含轻链半胱氨酸突变：

序列：突变位点 SEQ ID NO: YPREACVQWKV LC K145C 1 TVAAPCVFIFP LC S114C 2 QGTKVCIKRTV LC E105C 3 LQSGNCQESVT LC S159C 7 YEKHKCYACEV LC V191C 8 VTHQGCSSPVT LC L201C 9 QLKSGCASVVC LC T129C 13 AKVQWCVDNAL LC K149C 16 KADYECHKVYA LC K188C 17

。

5.如权利要求4所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体的重链具有SEQ IDNO:20的序列。

6.如权利要求4所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体的轻链选自SEQ IDNO:24、25、26、27、28、29、30、31和32。

7.如权利要求3所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体在选自由以下组成的组的序列中包含重链半胱氨酸突变：

序列：突变位点 SEQ ID NO: EPVTVCWNSGA HC S157C 4 TFPAVCQSSGL HC L174C 5 VLQSSCLYSLS HC G178C 6 TVSSACTKGPS HC S119C 10 ALTSGCHTFPA HC V167C 11 GTQTYCCNVNH HC I199C 12 SSLGTCTYICN HC Q196C 14 YPSDICVEWES HC A378C 15 TSGGTCALGCL HC A140C 18

。

8.如权利要求7所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体的轻链具有SEQ IDNO:21的序列。

9.如权利要求7所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体的重链选自SEQ IDNO:33、34、35、36、37、38、39、40和41。

10.如权利要求3所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体在选自由以下组成的组的序列中包含轻链半胱氨酸突变：

序列：突变位点 SEQ ID NO: KADYECHKVYA LC K188C 17 YEKHKCYACEV LC V191C 8 QLKSGCASVVC LC T129C 13

。

11.如权利要求10所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体的重链具有SEQ IDNO:22的序列。

12.如权利要求10所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体的轻链选自SEQ IDNO:42、43和44。

13.如权利要求3所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体在以下序列中包含重链半胱氨酸突变：

序列：突变位点 SEQ ID NO: TVSSACTKGPS HC S119C 19

。

14.如权利要求13所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体的轻链具有SEQ IDNO:23的序列。

15.如权利要求13所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体的重链具有SEQ IDNO:45的序列。

16.如权利要求1所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体与选自PD-L1、HER2、CEA和TROP2的抗原结合。

17.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体与HER2结合并且包含：

包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的CDR-L3、包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列的CDR-H3。

18.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体与TROP2结合并且包含：

a)包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:63的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的CDR-L3、包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的CDR-H3；或

b)包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列的CDR-L3、包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的CDR-H3。

19.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体与PD-L1结合并且包含：

包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列的CDR-L3、包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的CDR-H3。

20.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中所述半胱氨酸突变抗体与CEA结合并且包含：

包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-L2、包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L3、包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR-H2和包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR-H3。

21.如权利要求1-20中任一项所述的免疫缀合物，其具有式I：

Ab-[L-D]_p I

或其药学上可接受的盐，

其中：

Ab是半胱氨酸突变抗体；

p是1至8的整数；

L是接头；

D是选自式a-f的TLR激动剂部分：

-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-OR⁵；

-(C₃-C₁₂碳环基)；

-(C₃-C₁₂碳环基)-*；

-(C₃-C₁₂碳环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-(C₃-C₁₂碳环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₃-C₁₂碳环基)-NR⁵-C(＝NR⁵)NR⁵-*；

-(C₆-C₂₀芳基)；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₂-C₂₀杂环基)；

-(C₂-C₂₀杂环基)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₂-C₉杂环基)-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-NR⁵-C(＝NR^5a)NR⁵-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₆-C₂₀芳基二基)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基)；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-NR⁵-C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-C(＝O)-*；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-C(＝O)N(R⁵)₂；

-C(＝O)N(R⁵)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)N(R⁵)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝O)R⁵；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)CO₂R⁵；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝NR^5a)N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵C(＝NR^5a)R⁵；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₈烷基二基)-NR⁵(C₂-C₅杂芳基)；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-*；

-N(R⁵)₂；

-N(R⁵)-*；

-N(R⁵)C(＝O)R⁵；

-N(R⁵)C(＝O)-*；

-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)₂；

-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)-*；

-N(R⁵)CO₂R⁵；

-N(R⁵)CO₂(R⁵)-*；

-NR⁵C(＝NR^5a)N(R⁵)₂；

-NR⁵C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-NR⁵C(＝NR^5a)R⁵；

-N(R⁵)C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-N(R⁵)-(C₂-C₅杂芳基)；

-N(R⁵)-S(＝O)₂-(C₁-C₁₂烷基)；

-O-(C₁-C₁₂烷基)；

-O-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-O-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-OC(＝O)N(R⁵)₂；

-OC(＝O)N(R⁵)-*；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-OH；

或者R²和R³一起形成5或6元杂环基环；

R^5a选自由C₆-C₂₀芳基和C₁-C₂₀杂芳基组成的组；

L是选自由以下组成的组的接头：

-C(＝O)-PEG-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-Gluc-；

-C(＝O)-PEG-O-；

-C(＝O)-PEG-O-C(＝O)-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-；

-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-；

-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-C(＝O)-；

-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-PEG-C(＝O)-PEP-；

-C(＝O)-PEG-N⁺(R⁶)₂-PEG-C(＝O)-PEP-；

-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

-C(＝O)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-OC(＝O)-；

-C(＝O)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-O-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-O-C(＝O)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-N(R⁵)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-N(R⁵)-C(＝O)-；

-琥珀酰亚胺基-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)-PEP-；

R⁶独立地为H或C₁-C₆烷基；

Gluc具有下式：

PEP具有下式：

y是2至12的整数；

z是0或1；且

22.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述TLR激动剂部分具有式a：

23.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述TLR激动剂部分具有式b：

24.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述TLR激动剂部分具有式c：

25.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述TLR激动剂部分具有式d：

26.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述TLR激动剂部分具有式e：

27.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中所述TLR激动剂部分具有式f：

28.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中X¹是键，且R¹是H。

29.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中X²是键，且R²是C₁-C₈烷基。

30.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中X²和X³各自是键，且R²和R³独立地选自C₁-C₈烷基、-O-(C₁-C₁₂烷基)、-(C₁-C₁₂烷基二基)-OR⁵、-(C₁-C₈烷基二基)-N(R⁵)CO₂R⁵、-(C₁-C₁₂烷基)-OC(O)N(R⁵)₂、-O-(C₁-C₁₂烷基)-N(R⁵)CO₂R⁵和-O-(C₁-C₁₂烷基)-OC(O)N(R⁵)₂。

31.如权利要求30所述的免疫缀合物，其中R²是C₁-C₈烷基，且R³是-(C₁-C₈烷基二基)-N(R⁵)CO₂R⁴。

32.如权利要求30所述的免疫缀合物，其中R²是-CH₂CH₂CH₃，且R³选自-CH₂CH₂CH₂NHCO₂(t-Bu)、-OCH₂CH₂NHCO₂(环丁基)和-CH₂CH₂CH₂NHCO₂(环丁基)。

33.如权利要求30所述的免疫缀合物，其中R²和R³各自独立地选自-CH₂CH₂CH₃、-OCH₂CH₃、-OCH₂CF₃、-CH₂CH₂CF₃、-OCH₂CH₂OH和-CH₂CH₂CH₂OH。

34.如权利要求30所述的免疫缀合物，其中R²和R³各自是-CH₂CH₂CH₃。

35.如权利要求30所述的免疫缀合物，其中R²是-CH₂CH₂CH₃，且R³是-OCH₂CH₃。

36.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中X³-R³选自由以下组成的组：

37.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中R²或R³与L连接。

38.如权利要求37所述的免疫缀合物，其中X³-R³-L选自由以下组成的组：

其中波浪线指示与N的连接点。

39.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中R⁴是C₁-C₁₂烷基。

40.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中R⁴是-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；其中所述星号*指示L的连接位点。

41.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中L是-C(＝O)-PEG-或-C(＝O)-PEG-C(＝O)-。

42.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中L与所述抗体的半胱氨酸硫醇连接。

43.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中对于所述PEG，m是1或2，且n是2至10的整数。

44.如权利要求43所述的免疫缀合物，其中n是10。

45.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中L包含PEP，并且PEP是二肽且具有下式：

46.如权利要求45所述的免疫缀合物，其中AA₁和AA₂独立地选自H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂(C₆H₅)、-CH₂CH₂CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂CH₂NHC(NH)NH₂、-CHCH(CH₃)CH₃、-CH₂SO₃H和-CH₂CH₂CH₂NHC(O)NH₂；或者AA₁和AA₂形成5元环脯氨酸氨基酸。

47.如权利要求45所述的免疫缀合物，其中AA₁是-CH(CH₃)₂，且AA₂是-CH₂CH₂CH₂NHC(O)NH₂。

48.如权利要求45所述的免疫缀合物，其中AA₁和AA₂独立地选自GlcNAc天冬氨酸、-CH₂SO₃H和-CH₂OPO₃H。

49.如权利要求45所述的免疫缀合物，其中PEP具有下式：

其中AA₁和AA₂独立地选自天然存在的氨基酸的侧链。

50.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中L包含PEP，并且PEP是三肽且具有下式：

51.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中L包含PEP，并且PEP是四肽且具有下式：

52.如权利要求51所述的免疫缀合物，其中

AA₁选自由Abu、Ala和Val组成的组；

AA₂选自由Nle(O-Bzl)、Oic和Pro组成的组；

AA₃选自由Ala和Met(O)₂组成的组；且

AA₄选自由Oic、Arg(NO₂)、Bpa和Nle(O-Bzl)组成的组。

53.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中L包含PEP，且PEP选自由以下组成的组：Ala-Pro-Val、Asn-Pro-Val、Ala-Ala-Val、Ala-Ala-Pro-Ala、Ala-Ala-Pro-Val和Ala-Ala-Pro-Nva。

54.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中L包含PEP，且PEP选自以下结构：

55.如权利要求21所述的免疫缀合物，其中L选自以下结构：

其中波浪线指示与R⁵的连接。

56.一种免疫缀合物，其是通过使半胱氨酸突变抗体与TLR激动剂-接头化合物缀合制备的。

57.如权利要求56所述的免疫缀合物，其中所述TLR激动剂-接头化合物选自式a-f：

-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₁-C₁₂烷基二基)-OR⁵；

-(C₃-C₁₂碳环基)；

-(C₃-C₁₂碳环基)-*；

-(C₃-C₁₂碳环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-(C₃-C₁₂碳环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₃-C₁₂碳环基)-NR⁵-C(＝NR⁵)NR⁵-*；

-(C₆-C₂₀芳基)；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₆-C₂₀芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₂-C₂₀杂环基)；

-(C₂-C₂₀杂环基)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₂-C₉杂环基)-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₂-C₉杂环基)-NR⁵-C(＝NR^5a)NR⁵-*；

-(C₂-C₉杂环基)-(C₆-C₂₀芳基二基)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基)；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-NR⁵-C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-C(＝O)-*；

-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-C(＝O)N(R⁵)₂；

-C(＝O)N(R⁵)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)N(R⁵)-*；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝O)R⁵；

-C(＝O)N(R⁵)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)CO₂R⁵；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)C(＝NR^5a)N(R⁵)₂；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₁₂烷基二基)-NR⁵C(＝NR^5a)R⁵；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₈烷基二基)-NR⁵(C₂-C₅杂芳基)；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-N(R⁵)-*；

-C(＝O)NR⁵-(C₁-C₂₀杂芳基二基)-*；

-N(R⁵)₂；

-N(R⁵)-*；

-N(R⁵)C(＝O)R⁵；

-N(R⁵)C(＝O)-*；

-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)₂；

-N(R⁵)C(＝O)N(R⁵)-*；

-N(R⁵)CO₂R⁵；

-N(R⁵)CO₂(R⁵)-*；

-NR⁵C(＝NR^5a)N(R⁵)₂；

-NR⁵C(＝NR^5a)N(R⁵)-*；

-NR⁵C(＝NR^5a)R⁵；

-N(R⁵)C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-N(R⁵)-(C₂-C₅杂芳基)；

-N(R⁵)-S(＝O)₂-(C₁-C₁₂烷基)；

-O-(C₁-C₁₂烷基)；

-O-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)₂；

-O-(C₁-C₁₂烷基二基)-N(R⁵)-*；

-OC(＝O)N(R⁵)₂；

-OC(＝O)N(R⁵)-*；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-*；

-S(＝O)₂-(C₂-C₂₀杂环基二基)-(C₁-C₁₂烷基二基)-OH；

或者R²和R³一起形成5或6元杂环基环；

R^5a选自由C₆-C₂₀芳基和C₁-C₂₀杂芳基组成的组；

L是选自由以下组成的组的接头：

Q-C(＝O)-PEG-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-Gluc-；

Q-C(＝O)-PEG-O-；

Q-C(＝O)-PEG-O-C(＝O)-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-；

Q-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-；

Q-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-C(＝O)-；

Q-C(＝O)-PEG-N(R⁶)-PEG-C(＝O)-PEP-；

Q-C(＝O)-PEG-N⁺(R⁶)₂-PEG-C(＝O)-PEP-；

Q-C(＝O)-PEG-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

Q-C(＝O)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-OC(＝O)-；

Q-C(＝O)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-；

Q-C(＝O)-(C₁-C₁₂烷基二基)-C(＝O)-PEP-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-O-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-O-C(＝O)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-N(R⁵)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-N(R⁵)-C(＝O)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-C(＝O)-PEP-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)N(R⁶)-PEG-SS-(C₁-C₁₂烷基二基)-OC(＝O)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)-；

Q-(CH₂)_m-C(＝O)-PEP-N(R⁶)-(C₁-C₁₂烷基二基)N(R⁶)C(＝O)-；和

R⁶独立地为H或C₁-C₆烷基；

Gluc具有下式：

PEP具有下式：

y是2至12的整数；

z是0或1；且

Q选自由马来酰亚胺、溴乙酰胺和吡啶基二硫化物组成的组；

58.如权利要求57所述的免疫缀合物，其中Q是马来酰亚胺。

59.一种制备如权利要求1所述的免疫缀合物的方法，其中使TLR激动剂-接头化合物与所述半胱氨酸突变抗体缀合。

60.如权利要求59所述的方法，其中所述TLR激动剂-接头化合物是如权利要求57所述的TLR激动剂-接头化合物。

61.一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求1至58中任一项所述的免疫缀合物和一种或多种药学上可接受的稀释剂、媒介物、载体或赋形剂。

62.一种治疗癌症的方法，其包括对有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至58中任一项所述的免疫缀合物。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症对由TLR7和/或TLR8激动所诱导的促炎反应敏感。

64.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症是表达PD-L1的癌症。

65.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症是表达HER2的癌症。

66.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症是表达CEA的癌症。

67.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症是表达TROP2的癌症。

68.如权利要求62-67中任一项所述的方法，其中所述癌症选自宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、食管癌、膀胱癌、泌尿道癌、尿路上皮癌、肺癌、非小细胞肺癌、默克尔细胞癌、结肠癌、结直肠癌、胃癌和乳腺癌。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。

70.如权利要求68所述的方法，其中所述默克尔细胞癌癌症是转移性默克尔细胞癌。

71.如权利要求68所述的方法，其中所述胃癌是过表达HER2的胃癌。

72.如权利要求68所述的方法，其中所述癌症是胃食管连接部腺癌。

73.如权利要求62所述的方法，其中对所述患者静脉内、肿瘤内或皮下施用所述免疫缀合物。

74.如权利要求62所述的方法，其中以每kg体重约0.01-20mg的剂量对所述患者施用所述免疫缀合物。

75.根据权利要求1至58中任一项所述的免疫缀合物用于治疗癌症的用途。