JP2015212278A - 改良された抗ｃｄ１９抗体 - Google Patents

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Abstract

【課題】ヒトＢ細胞マーカーと結合するヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ１９抗体融合タンパク質ならびにそれらのフラグメント、及び、その医薬、診断薬の提供。
【解決手段】第一のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合フラグメント、及び、特定の配列を含むキメラ抗ＣＤ１９抗体と競合する、キメラ抗ＣＤ１９抗体と競合する、ヒト化抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合フラグメントと、ＣＤ３に結合する第二のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントとを含む、二重特異性抗体、及び、該抗体を含むＢ細胞疾患の治療薬、診断薬。
【選択図】なし

Description

配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２００９年１０月２１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、IＭＭ１６７ＷＯ３．ｔｘｔという名称で、２４，１６６バイトのサイズである。
関連出願
本願は、２００３年７月３１日に出願された米国特許仮出願第６０／４９１，２８２号に対する優先権を主張する、２００４年８月２２日に出願された米国特許出願第１０／９０３，８５８号（現在、米国特許第７，１０９，３０４号として発行）の分割出願であった、２００６年６月１日に出願された米国特許出願第１１／４４５，４１０号（現在、米国特許第７，４６２，３５２号として発行）の一部継続出願である、２００８年１１月７日に出願された米国特許出願第１２／２６６，９９９号に対する優先権を主張するものであり、上記各明細書はその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、裸のまたは少なくとも１つの治療薬および／もしくは診断薬とコンジュゲートされた、抗ＣＤ１９抗体、特にヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９抗体、特にモノクローナル抗体（ＭＡｂ）およびそのフラグメントならびにそれらの使用法に関する。具体的には、抗ＣＤ１９抗体を、例えば悪性腫瘍、炎症性の疾患もしくは障害または自己免疫疾患のようなＢ細胞疾患の治療に使用することができる。より具体的な実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、抗体の物理的および／または生理的特性を最適化するために設計された、１つまたは複数の置換アミノ酸を含み得る。
脊椎動物の免疫系は、外来抗原を正確に認識して、そのような外来抗原と特異的に結合し、それを排除／破壊するように進化した数多くの器官および細胞種からなる。細胞種の中でも、リンパ細胞は免疫系にとって重要である。リンパ細胞はＴ細胞およびＢ細胞という２つの大きな亜群に分類される。これらは相互依存的であるが、Ｔ細胞は主として細胞性免疫に関与し、Ｂ細胞は主として抗体産生（体液性免疫）に関与する。
ヒトでは、各Ｂ細胞が膨大な数の抗体分子を産生することができる。通常このような抗体産生は、外来抗原が中和されたときに終わる（または大幅に減少する）。しかし時には、特定のＢ細胞の増殖が衰えることなく継続し、その結果、Ｂ細胞リンパ腫または白血病として知られる癌を生じ得る。Ｂ細胞サブタイプの非ホジキンリンパ腫のようなＢ細胞リンパ腫は癌死亡率の大きな要因である。
種々の形態の治療に対するＢ細胞悪性腫瘍の応答は様々である。例えば、適切な非ホジキンリンパ腫の臨床病期分類が可能な場合、領域照射療法が十分な治療をもたらし得る。それでも患者の約半数はこの疾患により死亡する。Ｄｅｖｅｓａら，Ｊ．Ｎａｔ'ｌ Ｃａｎｃｅｒ Iｎｓｔ．７９：７０１（１９８７）。
慢性リンパ球性白血病の大部分はＢ細胞系である。Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．４：４０５（１９９０）。このタイプのＢ細胞悪性腫瘍は、西欧諸国で最も一般的な白血病である。Ｇｏｏｄｍａｎら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｍａ ２２：１（１９９６）。慢性リンパ球性白血病の自然経過はいくつかの段階に区分される。初期段階では、慢性リンパ球性白血病は緩徐進行型の疾患であり、寿命の長い、小型の、成熟した機能不全の悪性Ｂ細胞の蓄積を特徴とする。最終的には、悪性Ｂ細胞の倍増時間が短くなり、患者は次第に症状を現すようになる。治療により症状緩和をもたらすことができるが、患者の全生存期間への影響はごくわずかである。慢性リンパ球性白血病の後期は、重篤な貧血症および／または血小板減少症を特徴とする。この時点での平均生存期間は２年未満である。Ｆｏｏｎら，Ａｎｎａｌｓ Iｎｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１３：５２５（１９９０）。細胞増殖速度が非常に低速なため、慢性リンパ球性白血病は細胞傷害性薬剤の治療に対して耐性である。化学療法および放射線療法を含めた従来のＢ細胞悪性腫瘍の治療法には、有害な副作用により有用性に限界がある。
Ｂ細胞は、区別および同定のためのマーカーとして利用可能な細胞表面タンパク質を含む。このようなヒトＢ細胞マーカーの１つがＣＤ１９抗原であり、これは成熟Ｂ細胞上には見られるが、形質細胞上には見られない。ＣＤ１９は初期プレＢ細胞発生中に発現され、形質細胞分化まで残る。ＣＤ１９は、正常Ｂ細胞上およびその異常な増殖がＢ細胞リンパ腫を引き起こし得る悪性Ｂ細胞上の両方で発現される。例えば、ＣＤ１９は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病および急性リンパ芽球性白血病を非限定的に含めたＢ細胞系悪性腫瘍上で発現される。
非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウスモノクローナル抗体）の使用による潜在的問題は、典型的にはヒトエフェクター機能の欠如である。つまり、このような抗体は、補体依存性溶解の仲介または抗体依存性細胞傷害性もしくはＦｃ受容体介在性食作用によるヒト標的細胞の溶解が不可能であり得る。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は外来タンパク質としてヒト宿主に認識され得るため、このような抗体を繰り返し注入すれば、有害な過敏性反応を引き起こす免疫応答を誘発し得る。マウスベースのモノクローナル抗体では、これはヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と呼ばれることが多い。
キメラ抗体の使用は、それがマウス抗体ほど強いＨＡＭＡ応答を誘発しないため好ましい。キメラ抗体は２つ以上の異なる種由来の部分を含む抗体である。例えば、Ｌｉｕ，Ａ．Ｙ．ら，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｏｕｓｅ−Ｈｕｍａｎ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＣＤ２０ ｗｉｔｈ Ｐｏｔｅｎｔ Ｆｃ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ” Ｊ．Iｍｍｕｎ．１３９／１０：３５２１−３５２６（１９８７）は、ＣＤ２０抗原に対するマウス／ヒトキメラ抗体を記載している。またＰＣＴ出願国際公開第８８／０４９３６号も参照されたい。しかし、参照文献には、Ｂ細胞障害の治療でのこのようなキメラ抗体使用の効力、有効性または実用性に関する情報は提供されていない。インビトロ機能アッセイ（例えば、補体依存性溶解（ＣＤＣ）；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）では、特異的抗原を発現する標的細胞をキメラ抗体が破壊するまたは枯渇させるインビボでの能力は、本質的に予測不可能であることが注目される。例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．ら，“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，” Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ２：８４−９３（１９９１）（検出不可能なＡＤＣＣ活性を有するマウス−ヒトキメラ抗体）を参照されたい。したがって、キメラ抗体の潜在的な治療効果は、好ましくは特定の治療法が対象とする種におけるインビボ実験によってのみ、正確に評価することができる。
Ｂ細胞障害の治療において有効なマウスモノクローナル抗体の能力を改良してきた１つのアプローチは、放射性標識または化学療法薬を抗体とコンジュゲートして、標識または薬剤を腫瘍部位に局在させることである。例えば、９０Ｙ標識抗ＣＤ１９抗体を用いてマウスにおけるリンパ腫を減少させ得ること（ＭｃＤｅｖｉｔｔら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ １６：６０，２００２）、イダルビシンとコンジュゲートされた抗ＣＤ１９抗体により実験モデルにおける腫瘍退縮が生じること（Ｒｏｗｌａｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ Iｍｍｕｎｏｌ．Iｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３７：１９５，１９９３）ならびに１２５Iおよび１１１Iｎ放射標識抗ＣＤ１９が腫瘍を有する器官に特異的に取り込まれること（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４４：１１０５，２００３）が研究により示されている。また抗ＣＤ１９抗体との併用療法も、Ｅｋら，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ ３１：１４３（１９９８）およびＵｃｋｕｎら，Ｂｌｏｏｄ，７９：３１１６（１９９２）に開示されている。抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ３×抗ＣＤ１９ダイアボディでのヒトＢ細胞リンパ腫治療が、Ｈｅｋｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Iｍｍｕｎｏｌ．Iｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３２：３６４（１９９１）およびＣｏｃｈｌｏｖｉｕｓら，Ｊ．Iｍｍｕｎｏｌ．，１６５：８８８（２０００）にそれぞれ開示されている。
しかし、以前に積極的な細胞傷害性化学療法を受けた多くのリンパ腫罹患者では免疫が抑制されているため、強力な治療を前もって受けていないリンパ腫患者よりもＨＡＭＡ率が低いという事実にもかかわらず、これらのアプローチでは、マウス抗体の使用に付随する障害は解消されていない。
自己免疫疾患を含めた炎症性疾患もまた、Ｂ細胞障害に関連する疾患の一種である。最も一般的な治療法は、非常に有害となり得る副腎皮質ステロイド剤および細胞毒性薬剤である。これらの薬物は免疫系全体も抑制し、重篤な感染症を引き起こす可能性があり、さらに骨髄、肝臓および腎臓に対する副作用を有する。ＩＩＩ型自己免疫疾患を治療するために使用されてきたその他の治療薬は、Ｔ細胞およびマクロファージに対するものであった。自己免疫疾患、特にＩＩＩ型自己免疫疾患のより有効な治療法が必要とされている。
本発明は、ヒトおよびその他の哺乳動物におけるＢ細胞リンパ腫および白血病および自己免疫障害の治療のための、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントならびに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントを提供する。抗体、融合タンパク質およびそれらのフラグメントを、単独で、少なくとも１つの診断薬および／または治療薬とコンジュゲートして、あるいは他の治療法と組み合わせて使用することができる。
特許請求される抗体の使用法は、１つまたは複数のヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９抗体を、単独で、抗体融合タンパク質として、治療用コンジュゲートとして単独で、あるいは他の抗体、他の治療薬または免疫調節薬と組み合わせて抗体融合タンパク質の一部として、あるいはこれらと共に集学的治療として、あるいは少なくとも１つの治療薬、治療用放射性核種または免疫調節薬と連結されたイムノコンジュゲートとして用いて、ヒトまたは家畜のような哺乳動物対象を治療することを含む。また、これらのヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９抗体を、診断造影剤として単独で、他の診断造影剤と組み合わせて、および／または治療への応用と共に使用することもできる。治療され得る病的状態としては、新生物、好ましくはＢ細胞関連のリンパ腫および白血病、例えば非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病または多発性骨髄腫などが挙げられる。治療され得るその他の病的状態としては、自己免疫疾患、例えば急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬および線維性肺胞炎などが挙げられる。これらは限定的なものではなく、ＣＤ１９発現細胞が関与する任意の病的状態が、特許請求される抗ＣＤ１９抗体を単独または組合せて用いることにより潜在的に治療され得ることを当業者は理解するであろう。
様々な実施形態が、少なくとも２つの抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または少なくとも１つの抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメントおよびその抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメント以外の少なくとも１つの第二のＭＡｂもしくはそのフラグメントを含む、抗体融合タンパク質およびそのフラグメントに関する。使用される第二の抗体は、他のＢ細胞関連またはＢ細胞特異的抗原、例えばＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ８０またはＨＬＡ−ＤＲなどに対する抗体を含み得る。多重特異性および／または融合タンパク質は裸であるか、あるいは少なくとも１つの治療薬および／または診断薬とコンジュゲートされ得る。
ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂおよびそれらのフラグメントならびに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントを、裸でまたは治療薬もしくは診断薬とコンジュゲートして単独で、あるいは別の裸の抗体、フラグメントまたはイムノコンジュゲートと組み合わせて投与し得る。また、裸のまたはコンジュゲートされた抗ＣＤ１９抗体およびそのフラグメントならびに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントを、抗ＣＤ１９抗体もしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質もしくはそのフラグメントとコンジュゲートされていない、少なくとも１つの治療薬または診断薬と組み合わせて投与し得る。
他の実施形態は、ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９抗体およびそのフラグメントならびに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列に関する。同様に、そのＤＮＡ配列を含むベクターおよび宿主細胞も意図される。また特許請求される方法は、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９抗体およびそれらのフラグメントならびに融合タンパク質およびそのフラグメントの作製法も含む。
特定の実施形態は、ＣＤ１９特異性を有する特定のマウスＣＤＲを含む、抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントに関する。このＭＡｂは、ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂであり得る。好適な実施形態では、抗体は１つまたは複数の置換されたアミノ酸残基、例えば、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域配列における対応するマウスフレームワーク領域アミノ酸残基の置換などを含み得る。置換の候補である好適なフレームワーク領域アミノ酸としては、１つまたは複数のＣＤＲアミノ酸側鎖と近接したまたは隣接した位置にあるアミノ酸あるいは別の方法でコードされたタンパク質の安定性および／または発現レベルに影響を与えるアミノ酸が挙げられる。最も好適な実施形態では、置換は、ヒト化Ａ１９（ｈＡ１９）抗体のＶＨ配列のＫａｂａｔ残基９１においてセリン残基をフェニルアラニン残基と置換することを含む。
キメラ抗ＣＤ１９抗体であるｃＡ１９の可変軽鎖Ｖｋおよび可変重鎖ＶＨ配 列を開示する図である。ＣＤＲ領域配列を太字および下線で示す。ヌクレオチドには 通し番号が付してある。アミノ酸残基に対してＫａｂａｔのIｇ分子ナンバリングを 使用し、これをアミノ酸残基上方に番号を付して示す。文字で番号を付したアミノ酸 残基は、Ｋａｂａｔナンバリング法により定義される挿入残基である。挿入残基は前 の残基と前番号が同じである。例えば、図１Ｂの残基８２、８２Ａ、８２Ｂおよび８ ２Ｃは、それぞれ８２、Ａ、ＢおよびＣで表される。軽鎖可変領域を図１Ａに示し（ 配列番号：１および配列番号：２）、重鎖可変領域を図１Ｂに示す（配列番号：３お よび配列番号：４）。 ｃＡ１９抗体の結合特異性を他の抗ＣＤ１９抗体ＢＵ１２およびＢ４と比較 するための細胞表面競合結合アッセイの結果を示す図である。ｃＡ１９の濃度増加に より、非標識ＢＵ１２およびＢ４と同様に標識ＢＵ１２とＲａｊｉ細胞との結合が阻 害されたが、このことは、これらの抗体がＣＤ１９分子の同様のまたは重複するエピ トープを認識することを示している。 ヒト抗体、キメラおよびヒト化抗ＣＤ１９抗体の可変軽鎖（Ｖｋ）および可 変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列を比較した図である。図３Ａは、ヒト抗体（ＲＥIＶ ｋ、配列番号：５）、キメラ抗体（ｃＡ１９Ｖｋ、配列番号：６）およびヒト化抗体 （ｈＡ１９Ｖｋ、配列番号：７）の可変軽鎖（Ｖｋ）のアミノ酸配列を比較したもの であり、図３Ｂは、ヒト抗体ＥＵ（配列番号：８）およびＮＥＷＭ（ＦＲ４のみ、配 列番号：１１）、キメラ抗体（ｃＡ１９ＶＨ、配列番号：９）およびヒト化抗体（ｈ Ａ１９ＶＨ、配列番号：１０）の可変重鎖（ＶＨ）のアミノ酸配列を比較したもので ある。 ヒト化抗ＣＤ１９抗体ｈＡ１９の軽鎖Ｖ遺伝子（ｈＡ１９Ｖｋ）（図４Ａ、 配列番号：１２および配列番号：１３）および重鎖Ｖ遺伝子ｈＡ１９ＶＨ（図４Ｂ、 配列番号：１４および配列番号：１５）のアミノ酸配列を開示する図である。ヌクレ オチド配列を小字で示す。ＶｋおよびＶＨアミノ酸残基のナンバリングは図１のもの と同じである。 ヒト化Ａ１９抗体ｈＡ１９の結合特異性および活性をｃＡ１９のものと比較 するための細胞表面競合結合アッセイの結果を示す図である。図５Ａは、非コンジュ ゲートｈＡ１９（黒三角）およびｃＡ１９（黒丸）が共に１２５I−ｈＡ１９とＲａｊ ｉ細胞との結合を阻害したことを示す。図５Ｂは、ｈＡ１９（黒三角）およびｃｌ９ （黒四角）が１２５I−ｃＡ１９とＲａｊｉ細胞との結合に関して同様によく競合した ことを示す。ｃＡ１９またはｈＡ１９の濃度増加により、それぞれ標識ｈＡ１９また はｃＡ１９とＲａｊｉ細胞との結合が阻害された。 直接的細胞表面結合およびスキャッチャードプロット解析による抗ＣＤ１９ ＡｂのＡｇ結合親和性（結合力）の測定を示す図である。様々な濃度の１２５I−ｈＡ １９（菱形）または１１２Iｎ−ｃＡ１９（四角）をＲａｊｉ細胞と４℃で１時間イン キュベートした。総放射活性および結合放射活性をカウントし、スキャッチャードプ ロットにより解析したものを挿入図に示す。ｈＡ１９はｃＡ１９と実質的に同じ結合 親和性を示した。図のように、ｈＡ１９およびｃＡ１９の見かけの解離定数値は、そ れぞれ１．１および１．２ｎＭと算出された。
定義
別途明記されない限り、本明細書で使用される「１つの」（「ａ」または「ａｎ」）は、「１つまたは複数の」という意味である。
別途明記されない限り、用語はその平易で一般的な意味に基づいて使用される。
本明細書に記載の「抗体」は、完全長の（すなわち、天然に存在するか、または正常な免疫グロブリン遺伝子フラグメントの組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えば、IｇＧ抗体）または抗体フラグメントのような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的に結合する）部分を指す。
「抗体フラグメント」は抗体の一部分、例えばＦ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆｖ、ｓＦｖなどである。構造に関係なく、抗体フラグメントはインタクトな抗体により認識される抗原と同じ抗原とに結合する。例えば、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体フラグメントはＣＤ１９のエピトープと結合する。抗体フラグメントとしては、重および軽鎖の可変領域を含む「Ｆｖ」フラグメントまたは軽および重可変領域がペプチドリンカーにより結合している組換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）のような、可変領域を含む単離フラグメントが挙げられる。
「裸の抗体」は、一般に治療薬とコンジュゲートされていない完全抗体である。これは、抗体分子のＦｃ部分が、細胞溶解を生じ得る機構を作動させる補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）のようなエフェクター機能を提供するからである。しかし、治療作用にＦｃ部分を必要とせず、アポトーシスのような他の機構が関与する可能性がある。「裸の抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル両抗体のみならず、キメラ、ヒト化またはヒト抗体のような特定の組換え抗体を包含する。
「キメラ抗体」は、１つの種に由来する抗体、好ましくはげっ歯類抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んだ可変ドメインを含む組換えタンパク質であり、一方、抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメインに由来する。獣医学上の適用に関しては、キメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他の種の定常ドメインに由来し得る。
「ヒト化抗体」は、１種由来の抗体、例えば、げっ歯類抗体由来のＣＤＲが、げっ歯類抗体の重および軽可変鎖からヒト重および軽可変ドメイン内に導入された組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常ドメイン由来である。
「ヒト抗体」は、ヒト可変および定常領域配列を含む抗体である。例えば、ヒト抗体は、抗原投与に応答してヒト抗体を産生するよう操作されたトランスジェニックマウスから入手し得る。この技術では、マウス内在性の重鎖および軽鎖遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞系列由来のマウス株内に、ヒト重および軽鎖遺伝子座のエレメントを導入する。トランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体分泌ハイブリドーマを作製することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を入手するための方法は、Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．７：１３（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６（１９９４）およびＴａｙｌｏｒら，Iｎｔ．Iｍｍｕｎ．６：５７９（１９９４）に記載されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法の他、ファージディスプレイ技術によっても構築することができ、これらはすべて当該分野で公知である。例えば、未免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのヒト抗体およびそのフラグメントのインビトロ産生に関しては、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３（１９９０）を参照されたい。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子が糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子内にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子表面上の機能的抗体フラグメントとしてディスプレイされる。糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能的特性に基づく選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択も生じる。このようにして、ファージがＢ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは様々なフォーマットで行うことが可能であり、その概説に関しては、例えばＪｏｈｎｓｏｎおよびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：５５６４−５７１（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によっても作製し得る。その内容全体が参照により組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照されたい。
「治療薬」は、単独で、抗体部分と共に同時または順次に、あるいは抗体部分、すなわち抗体または抗体フラグメントもしくはサブフラグメントとコンジュゲートされて投与され、かつ疾患の治療に有用である分子または原子である。治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、酵素、オリゴヌクレオチド、アンチセンスおよびＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節薬、キレート剤、ホウ素化合物、光活性化剤または色素ならびに放射性同位元素が挙げられる。
「診断薬」は、抗体部分、すなわち抗体または抗体フラグメントもしくはサブフラグメントとコンジュゲートして投与してもよく、かつ標的抗原を含む細胞の所在特定による疾患診断に有用な分子または原子である。有用な診断薬としては、放射性同位元素、色素、造影剤、超音波造影剤、光学的造影剤、蛍光化合物もしくは分子および磁気共鳴映像法（ＭＲI）のための造影剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第６，３３１，１７５号では、ＭＲI技術およびＭＲI造影剤とコンジュゲートされた抗体の調製が記載されており、その内容全体が参照により組み込まれる。好ましくは、診断薬は、放射性同位元素、磁気共鳴映像法および超音波に使用するための造影剤、並びに蛍光化合物からなる群より選択される。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを付加するために、イオンと結合するためのキレート基が多数結合した長い尾部を有する試薬と抗体成分を反応させる必要があり得る。このような尾部はポリマー、例えば、ポリリジン、多糖または例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリオキシムなど、この目的に有用であることが知られているキレート基が結合可能なペンダント基を有するその他の誘導体化されたもしくは誘導体化可能な鎖などであり得る。キレートは、標準的な化学作用を用いてペプチドまたはタンパク質と結合させる。キレートは通常、最小限の免疫反応性喪失ならびに最小限の凝集および／または内部架橋で分子との結合形成を可能にする基により、抗体と連結させる。キレートを抗体とコンジュゲートさせる他のより特殊な方法および試薬は、１９８９年４月２５日に発行された「抗体コンジュゲート」と題する、Ｈａｗｔｈｏｒｎｅに対する米国特許第４，８２４，６５９号に開示されており、この開示はその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に有用な金属−キレートの組合せとしては、一般的エネルギー範囲が６０〜４０００ｋｅＶの診断用アイソトープ、例えば１２５I、１３１I、１２３I、１２４I、６２Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Iｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒなどと共に放射性イメージングに使用される、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。本発明の抗体と共に使用する場合、同じキレートをマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯体化すればＭＲIに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡおよびＴＥＴＡのような大環状キレートは、様々な金属および放射性金属と共に、最も具体的には、それぞれガリウム、イットリウムおよび銅の放射性核種と共に使用される。このような金属キレート化合物は、対象とする金属に環のサイズを合わせることにより、非常に安定させることができる。ＲＡIＴに対する２２３Ｒａのような安定に結合する核種を対象とする、大環状ポリエーテルのような他の環型キレートが包含される。
「イムノコンジュゲート」は、抗体成分と治療薬または診断薬とのコンジュゲートである。
「発現ベクター」は、宿主細胞内で発現される遺伝子を含む核酸分子、好ましくは二本鎖ＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーを含めた特定の調節エレメントの制御下に置かれている。このような遺伝子は、調節エレメントと「作動可能に連結されている」という。
「組換え宿主細胞」は、クローニングベクターまたは発現ベクターを含む任意の原核または真核細胞であり得る。この用語はまた、原核または真核細胞のみならず、宿主細胞または宿主動物細胞の染色体またはゲノム中にクローン遺伝子（１つまたは複数）を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物も包含する。適切な哺乳動物宿主細胞としては、ＳＰ２／０細胞およびＮＳＯ細胞のようなミエローマ細胞の他、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ハイブリドーマ細胞系およびその他の抗体発現に有用な哺乳動物宿主細胞が挙げられる。国際公開第００６３４０３（Ａ２）号に開示されているヒト細胞系ＰＥＲ．Ｃ６もＭＡｂおよびその他の融合タンパク質を発現するのに有用である。最も好適な宿主細胞は、無血清または低血清培地での増殖およびトランスフェクションに前適応させた、Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子またはその他のアポトーシスインヒビターを含むように操作された細胞である。このような宿主細胞の例は、２００５年７月２５日に出願された米国特許出願第１１／１８７，８６３号および２００６年７月１４日に出願された同第１１／４８７，２１５号に開示されており、これらの各本文は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。完全ヒト抗体の作製には、改変された免疫系を有する特殊なトランスジェニック動物が特に有用である。
本明細書で使用される「抗体融合タンパク質」という用語は、同じまたは異なる特異性を有する同じまたは異なる一本鎖の抗体または抗体フラグメントのセグメントを１つまたは複数含む、組換えにより作製された抗原結合分子を指す。抗体融合タンパク質は、別のタンパク質またはペプチド、例えば治療薬、毒素、サイトカイン、ホルモンまたはその他のタンパク質もしくはペプチドと結合した、抗体またはそのフラグメントを含み得る。他の実施形態では、抗体融合タンパク質は、少なくとも第一と第二の抗体または抗体フラグメントを含み得る。融合タンパク質が２つ以上の抗体またはフラグメントを含む場合、その融合タンパク質の結合価は、単一の抗原またはエピトープに対してその融合タンパク質が有する、結合アームまたは部位の数；すなわち、一価、二価、三価または多価を示す。特異性は、抗体融合タンパク質が結合できる抗原またはエピトープの数；すなわち単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を示す。これらの定義を用いれば、天然の抗体、例えばIｇＧは、結合アームが２つなので二価であるが、１つのエプトープと結合するので単一特異性である。
多重特異性抗体は、構造が異なる少なくとも２つの標的、例えば、２つの異なる抗原、同じ抗原上の２つの異なるエピトープあるいはハプテンおよび／または抗原もしくはエピトープと同時に結合することができる抗体である。１つの特異性は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞およびマスト細胞の抗原またはエピトープに対するものであり得る。別の特異性は、同じ細胞種上の異なる抗原、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４およびＣＤ２２などであり得る。多重特異性の多価抗体は、２つ以上の結合部位を有する構築物であり、それらの結合部位は特異性が異なる。例えば、二重特異性抗体の場合、一方の結合部位が１つの抗原と反応し、もう一方の結合部位が別の抗原と反応する。
二重特異性抗体は、構造が異なる２つの標的と同時に結合することができる抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞およびマスト細胞の抗原またはエピトープと結合する少なくとも１つのアームならびに治療薬または診断薬を有する標的化可能なコンジュゲートと特異的に結合する少なくとも１つの別のアームを有する。分子工学を用いて様々な二重特異性融合タンパク質を作製することができる。
家畜は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、アルパカおよびブタの他、伴侶動物も包含する。好適な一実施形態では、家畜はウマである。伴侶動物はペットとして飼育される動物を包含する。これらは主としてイヌおよびネコであるが、モルモット、ハムスター、ラットおよびフェレットのような小型のげっ歯類も包含され、同様にサルのような類人霊長類も包含される。好適な一実施形態では、伴侶動物はイヌまたはネコである。
概要
上述のように、コンジュゲートされていないまたは治療用放射性核種で標識された抗ＣＤ１９抗体では、中悪性度または高悪性度の形態のＢ細胞リンパ腫を有する患者において、高率の客観的かつ持続的な応答をもたらすことができなかった。本発明は、単独で、コンジュゲートとして、または他の裸の抗体および抗体治療用コンジュゲートを含めた他の治療薬との併用投与で哺乳動物対象、ヒトおよび家畜の治療に有用な、ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９抗体および抗体融合タンパク質を提供する。
抗ＣＤ１９ＭＡｂは、好ましくは、ＣＤ１９抗原に対して特異性を有する１つまたは複数のマウスまたはキメラ抗ＣＤ１９ＭＡｂ由来の特定のマウスＣＤＲを含む。抗ＣＤ１９ＭＡｂは、ヒト化、キメラまたはヒトＭＡｂである。抗ＣＤ１９ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、好ましくは、アミノ酸ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号：１６）を含むＣＤＲ１；アミノ酸ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号：１７）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号：１８）を含むＣＤＲ３；ならびにアミノ酸ＳＹＷＭＮ（配列番号：１９）を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；アミノ酸ＱIＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号：２０）を含むＣＤＲ２およびアミノ酸ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：２１）を含むＣＤＲ３を含む。
好適な一実施形態では、ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントは、マウス抗ＣＤ１９ＭＡｂのＣＤＲならびにヒト抗体の軽および重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域ならびにヒト抗体の軽および重鎖定常領域を含むと同時に、実質的に親マウス抗ＣＤ１９ＭＡｂのＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫および白血病細胞標的性を保持し、ここで、抗ＣＤ１９ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号：１６）を含むＣＤＲ１；アミノ酸ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号：１７）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号：１８）を含むＣＤＲ３を含み；かつ抗ＣＤ１９ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＳＹＷＭＮ（配列番号：１９）を含むＣＤＲ１；アミノ酸ＱIＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号：２０）を含むＣＤＲ２およびアミノ酸ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：２１）を含むＣＤＲ３を含む。ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントは、抗体の軽および重鎖可変領域のＦＲ内に、マウスＭＡｂの対応するＦＲ由来の少なくとも１つのアミノ酸をさらに含み得る。具体的には、ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントは、図４Ａのマウス重鎖可変領域のアミノ酸残基５、２７、２８、４０、４８、９１、９４、１０７および１０８から選択される少なくとも１つの残基ならびに図４Ｂのマウス軽鎖可変領域のアミノ酸残基４、３９、５８、６０、８７、１００および１０７から選択される少なくとも１つの残基を含み得る。より好適な実施形態では、ヒト化Ａ１９抗体（ｈＡ１９）は、置換された上記各マウスＦＲアミノ酸残基を含む。ＣＤ１９抗原との適切な結合の維持または結合の増強が必要であれば、１つまたは複数のマウスアミノ酸配列をヒト軽および重可変鎖のＦＲ領域内に維持してもよい。より好ましくは、ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントは、図３ＡのｈＡ１９Ｖｋ（配列番号：７）および図３ＢのｈＡ１９ＶＨ（配列番号：１０）を含む。最も好ましくは、ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂは、ｈＡ１９ＶＨ（配列番号：１０）配列のＫａｂａｔ残基９１におけるセリン残基のフェニルアラニン残基とのＦＲ置換をさらに含む。
好適なキメラ抗ＣＤ１９（ｃＡ１９）ＭＡｂまたはそのフラグメントは、マウス抗ＣＤ１９ＭＡｂのＣＤＲならびにマウス抗ＣＤ１９ＭＡｂの軽および重鎖可変領域のＦＲ領域（すなわち親マウスＭＡｂのＦｖ）ならびにヒト抗体の軽および重鎖定常領域を含み、ここで、キメラ抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントは、実質的にマウス抗ＣＤ１９ＭＡｂのＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫および白血病細胞標的性を保持し、抗ＣＤ１９ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号：１６）を含むＣＤＲ１；アミノ酸ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号：１７）を含むＣＤＲ２；およびアミノ酸ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号：１８）を含むＣＤＲ３を含み；かつ抗ＣＤ１９ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸ＳＹＷＭＮ（配列番号：１９）を含むＣＤＲ１；アミノ酸ＱIＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号：２０）を含むＣＤＲ２およびアミノ酸ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：２１）を含むＣＤＲ３を含む。より好ましくは、キメラ抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントは、図１Ａおよび１Ｂで示される、それぞれｃＡ１９Ｖｋ（配列番号：６）およびｃＡ１９ＶＨ（配列番号：９）と称されるキメラ抗ＣＤ１９ＭＡｂの軽および重鎖可変領域配列を含む。
様々な実施形態では、ヒト抗体の軽および重鎖可変ならびに定常領域を含むヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントも包含され、ここで、上記ヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂは、実質的にマウス抗ＣＤ１９ＭＡｂのＢ細胞およびＢ細胞リンパ腫および白血病細胞標的性ならびにマウス抗ＣＤ１９ＭＡｂの細胞結合特性を保持し、ヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲは、キメラおよびヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂに関して上述したものならびにそれぞれ図１Ａと１Ｂおよび３Ａと３Ｂで示されるものと同じＣＤＲ（配列番号：１６〜２１）を含む。
特定の実施形態では、上記の抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントを少なくとも２つ含む抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを包含することも意図される。この抗体融合タンパク質またはそのフラグメントは、少なくとも１つの第一の上記抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントならびに上記抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはフラグメント以外の少なくとも１つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含む、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントも包含することが意図される。より好ましくは、この第二のＭＡｂは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ−１、Iａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、血管新生因子、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Iｉ、IＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、IＬ−６、ＴＲＡIＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡIＬ−Ｒ２（ＤＲ５）またはそれらの組合せと反応するＭＡｂ、そして本明細書に記載の抗ＣＤ１９ＭＡｂと異なるエピトープに対する抗ＣＤ１９ＭＡｂでさえある。抗体融合タンパク質は、異なる抗原に対する特異性をもたらすために１つの抗ＣＤ１９ＭＡｂおよび１つまたは複数の第二のＭＡｂから構成されていてもよく、以下でより詳細に説明される。
ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９抗体は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病および自己免疫疾患を含めたＢ細胞障害治療の優れた治療薬を得るための、可変領域におけるアミノ酸変異および配列操作の結果として、増強されたエピトープ親和性結合だけでなく、抗腫瘍および抗Ｂ細胞活性をも有し得る。抗体の結合特異性、親和性または結合力に対する改変は既知であり、親和性成熟として国際公開第９８／４４００１号に記載されており、この出願は改変方法を要約し、かつその内容全体が参照により組み込まれる。
例えば、抗体を改変してエフェクター機能を向上させ、アンタゴニストの抗原依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強することが望ましい場合もある。Ｆｃ領域内で１つまたは複数のアミノ酸置換またはシステイン導入を行ってもよく、これにより、内部移行能が向上し、ならびに／または補体仲介細胞傷害作用およびＡＤＣＣが増加する。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃａｒｏｎら，Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９１）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Iｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２０２２（１９９２）を参照されたい。増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能の両方をもつ、二重のＦｃ領域を有する抗体融合タンパク質を調製してもよい。
特定の実施形態は、以下のものからなる群より選択されるＭＡｂまたはそのフラグメントをコードする核酸を含む、ＤＮＡ配列にも関する：（ａ）本明細書に記載の抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメント、（ｂ）少なくとも２つの抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントを含む、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント、（ｃ）本明細書に記載の抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメントを含む少なくとも１つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメントおよび抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメント以外の少なくとも１つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含む抗体融合タンパク質またはそのフラグメントならびに（ｄ）抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメントを含む少なくとも１つの第一のＭＡｂまたはそのフラグメントおよび少なくとも１つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含み、ここで、第二のＭＡｂがＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ１、Iａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、IＬ−６、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＴＲＡIＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡIＬ−Ｒ２（ＤＲ５）またはそれらの組合せと反応するＭＡｂである、融合タンパク質またはそのフラグメント。
また当該ＤＮＡ配列を含む発現ベクターも包含される。これらのベクターは、ヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそれらの抗体融合タンパク質またはそれらのフラグメントの調製に用いるベクターの場合、ヒト免疫グロブリンの軽および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域を含む。これらのベクターは、必要であれば、選択された宿主細胞内でＭＡｂを発現するプロモーター、免疫グロブリンエンハンサーおよびシグナルもしくはリーダー配列をさらに含む。本発明において特に有用なベクターは、特にIｇＧのようなキメラ、ヒト化またはヒト抗体を発現するために使用する場合、ｐｄＨＬ２またはＧＳであり、この場合、ベクターはIｇＧ１の重および軽鎖定常領域ならびにヒンジ領域をコードする。より好ましくは、軽および重鎖定常領域ならびにヒンジ領域は、ヒトＥＤ骨髄腫免疫グロブリン由来であり、この場合、任意でアロタイプ位置の少なくとも１つのアミノ酸が、異なるIｇＧ１アロタイプに見られるアミノ酸に変化しており、ＥＵ番号システムに基づくＥＵの重鎖のアミノ酸２５３が、任意でアラニンと置換されていてもよい。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃI ＵＳＡ ６３：７８−８５（１９６９）を参照されたい。
本発明は、抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞あるいはこれらのＤＮＡ配列を含むベクターを含む宿主細胞を包含する。特に有用な細胞は、哺乳動物細胞、より具体的には、以下でより詳細に述べる骨髄腫細胞のようなリンパ球細胞である。
抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントあるいは抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを発現するための、以下のものを含む方法も包含される：（ａ）抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントあるいは抗体融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を哺乳動物細胞にトランスフェクトすること、および（ｂ）このＤＮＡ配列をトランスフェクトされた、抗ＣＤ１９またはそのフラグメントあるいは抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを分泌する細胞を培養すること。ＭＡｂおよびマーカーを発現する宿主細胞を容易に選択できるようにベクター上に選択可能なマーカーを含む、既知の技術を使用してもよい。
本発明は、具体的には、Ｂリンパ腫細胞、白血病細胞および／または自己免疫細胞を標的とした診断用または治療用コンジュゲートを包含し、このコンジュゲートは、少なくとも１つの診断薬または少なくとも１つの治療薬とコンジュゲートされているかまたは結合している、標的細胞と結合する抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントあるいは抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを含む抗体成分を含む。
診断用コンジュゲートは、抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントあるいは抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを含む抗体成分を含み、ここで、診断薬は少なくとも１つの光活性診断薬を含み、より好ましくは、標識が６０〜４，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性標識または非放射性標識である。放射性標識は、好ましくはガンマ、ベータまたは陽電子放出アイソトープであり、かつ１２５I、１３１I、１２３I、１２４I、８６Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Iｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７６Ｂｒおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
診断用コンジュゲートは、例えばマンガン、鉄またはガドリニウムなどの造影剤のようなあるいは超音波造影剤を含めた、診断薬を用いてもよい。一実施形態では、超音波造影剤は、キメラ化もしくはヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメントを含むリポソームである。また好ましくは、超音波造影剤は、ガスが封入されたリポソームである。同様に、二重特異性抗体を造影剤とコンジュゲートさせることができる。例えば、二重特異性抗体は、超音波造影法で使用する画像造影剤を２つ以上含んでもよい。超音波造影剤はリポソームであってもよく、好ましくは、リポソームはリポソーム外表面に共有結合した二価ＤＴＰＡペプチドを含む。また好ましくは、リポソームにはガスが封入されている。
治療用コンジュゲートは、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントのような抗体成分を含み、ここで、各上記ＭＡｂまたはそのフラグメントは、少なくとも１つの治療薬と結合している。治療用コンジュゲートは、好ましくは、放射性標識、免疫調節薬、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療薬、薬物もしくは毒素であってよい細胞毒性薬およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。有用な薬物としては、抗有糸分裂薬、アルキル化剤、抗代謝薬、抗生物質、アルカロイド、抗血管新生薬、アポトーシス薬およびそれらの組合せからなる群より選択される、薬学的特性を有する薬物の他、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ干渉経路を活性化する低分子二本鎖ＲＮＡ分子のようなＲＮＡ分子が挙げられる。より具体的には、薬物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、サリドマイドおよびその誘導体、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトセシン、アントラサイクリン、タキサンおよびその類似体、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。毒素は、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、オンコナーゼ（すなわち、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ））、ＤＮアーゼI、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシンおよびシュードモナスエンドトキシンからなる群より選択され得る。
使用に適したその他の治療薬としては、抗血管新生薬（または血管新生阻害剤）が挙げられる。これらの薬剤は、併用療法での使用または例えば、アンジオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン、カンスタチンおよびマスピンと抗体とのコンジュゲーションの他、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＥＤ−Ｂフィブロネクチンのような血管新生因子に対するおよびその他の血管増殖因子に対する抗体の使用にも適する。一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドは新しい種類の治療薬であり、例えば、ＲＮＡ干渉経路を活性化して、ｂｃｌ−２阻害のような極めて特異的な遺伝子発現阻害を引き起こす、アンチセンスｂｃｌ−２のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖ＲＮＡ分子のような分子が挙げられる。細胞内でのｂｃｌ−２（および関連するｂｃｌファミリー分子）の阻害は、ｂｃｌ−２の抗アポトーシス活性を阻害して細胞のアポトーシスを促進する。Ｚａｎｇｅｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１００２：９０−４（２００３）を参照されたい。
有用な治療用コンジュゲートは、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（IＦＮ）、エリスロポエチン、トロンボポエチンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫調節薬である。特に有用なのは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン、インターロイキン（IＬ）のような造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子、インターフェロン−アルファ、−ベータまたは−ガンマのようなインターフェロンおよび「Ｓ１因子」のような幹細胞増殖因子である。より具体的には、IＬ−１、IＬ−２、IＬ−３、IＬ−６、IＬ−１０、IＬ−１２、IＬ−１８、IＬ−２１、インターフェロン、ＴＮＦ−アルファもしくは−ベータまたはそれらの組み合わせが有用であり得る。
特に有用な治療用コンジュゲートは、６０〜７００ｋｅＶの間のエネルギーを有する１つまたは複数の放射性標識を含む。このような放射性標識は、２２５Ａｃ、６７Ｇａ、９０Ｙ、１１１Iｎ、１３１I、１２５I、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、３２Ｐ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔおよびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。他の有用な治療用コンジュゲートは、色素原または色素のような光活性治療薬である。
特許請求される方法は、ヒトを含めた哺乳動物、家畜あるいはイヌおよびネコのような伴侶ペットなどの対象におけるＢ細胞疾患の治療法を包含する。この方法により治療可能なＢ細胞疾患としては、不必要なまたは望ましくないＢ細胞増殖または活性を伴い、リンパ腫または白血病のような悪性腫瘍あるいは自己免疫疾患を含む、任意の疾患が挙げられる。この方法は、薬学的に許容される媒体中で製剤化された治療有効量の抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントを対象に投与することを含む。この治療法では、治療薬が結合していない「裸の抗体」を用いてもよい。「裸の抗ＣＤ１９抗体」の投与は、治療有効量の別の治療薬、例えば、標的細胞表面上の別の抗原と結合または反応するか、またはＭＡｂのＦｃ部分のエフェクター機能のような他の機能を有する、本明細書で述べられる治療用の第二の「裸の抗体」などを対象に同時または順次投与することにより補完することができる。好適な追加のＭＡｂは、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、血管新生因子、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Iｉ、IＬ−２、ＭＵＣ−１、ＴＯ１、ＴＡＣ、IＬ−６、ＴＲＡIＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡIＬ−Ｒ２（ＤＲ５）と反応するＭＡｂからなる群より選択される、薬学的に許容される媒体中で製剤化された少なくとも１つのヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（非ヒト動物の場合）ＭＡｂである。他の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体を１つまたは複数の治療薬または診断薬とコンジュゲートし得る。
上述した裸の抗ＣＤ１９単独でのまたは他の裸のＭＡｂとの併用での治療法は共に、薬学的に許容される媒体中で製剤化された、少なくとも１つの治療有効量の治療薬の同時または順次投与によりさらに補完することができる。本明細書で述べられているように、治療薬は、薬学的に許容される媒体中で製剤化された細胞毒性薬、放射性標識、免疫調節薬、ホルモン、オリゴヌクレオチド（アンチセンスまたはＲＮＡｉオリゴヌクレオチドなど）、酵素、光活性治療薬またはそれらの組み合わせを含み得る。
別の治療法では、上述した裸の抗ＣＤ１９単独でのまたは他の裸のＭＡｂとの併用での治療法は共に、本明細書に記載され薬学的に許容される媒体中で製剤化された、少なくとも１つの治療有効量の治療用コンジュゲートの同時または順次投与によりさらに補完することができる。治療用コンジュゲートの抗体成分は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、血管新生因子、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Iｉ、IＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、IＬ−６、ＭＵＣ−１、ＴＲＡIＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡIＬ−Ｒ２（ＤＲ５）と反応するＭＡｂからなる群より選択される、薬学的に許容される媒体中で製剤化された少なくとも１つのヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（非ヒト動物対象に対して）ＭＡｂを含む。本明細書で述べられているように、治療薬は、薬学的に許容される媒体中で製剤化された細胞毒性薬、放射性標識、免疫調節薬、ホルモン、光活性治療薬またはそれらの組み合わせを含み得る。
他の実施形態は、対象におけるＢ細胞リンパ腫または白血病または自己免疫疾患の治療法に関するものであり、少なくとも２つの抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントを含むか、あるいは少なくとも１つの抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントと、好ましくはＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Iｉ、IＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、IＬ−６、ＴＲＡIＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡIＬ−Ｒ２（ＤＲ５）と反応するＭＡｂからなる群より選択される、薬学的に許容される媒体中で製剤化された少なくとも１つの追加のＭＡｂとを含む、治療有効量の抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを対象に投与することを含む。
プレターゲティング技術に基づく他の方法では、多重特異性抗体または融合タンパク質は、ＨＳＧハプテンのようなハプテンと結合する少なくとも１つの他の抗体またはフラグメントと結合した、本明細書に記載の抗ＣＤ１９抗体を含み得る。ハプテンは、１つまたは複数の治療薬および／または診断薬を含む標的化可能なコンジュゲートに組み込まれ得る。多重特異性抗体または融合タンパク質を対象に投与し、Ｂ細胞のような標的細胞上で発現されたＣＤ１９のような標的抗原と結合させ得る。十分な時間をかけて血中の未結合抗体が血流から除去された後、標的化可能なコンジュゲートを投与してもよく、次いで、これが標的細胞または組織に局在する多重特異性抗体または融合タンパク質と結合する。このようなプレターゲティング法は、治療薬を標的細胞または組織に、正常な細胞または組織よりも優先的に送達させることにより、治療指数を向上させる。プレターゲティングの方法は当該分野で公知である（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３６１，７７４号；第６，９６２，７０２号；第７，０７４，４０３号；第７，２０１，８９０号；第７，２３０，０８４号；第７，２３０，０８５号および第７，４２９，３８１号を参照されたい。）
この治療法は、薬学的に許容される媒体中で製剤化された少なくとも１つの治療有効量の治療薬を、対象に同時または順次投与することによりさらに補完することができ、ここで、治療薬は、好ましくは、薬学的に許容される媒体中で製剤化された細胞毒性薬、放射性標識、免疫調節薬、ホルモン、光活性治療薬またはそれらの組み合わせである。
さらに、抗体融合タンパク質を、少なくとも１つの治療薬と結合した少なくとも１つのＭＡｂを含む治療有効量の治療用コンジュゲートと共に、対象に同時または順次投与することができ、ここで、上記コンジュゲートのＭＡｂ成分は、好ましくはＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ１、Iａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Iｉ、IＬ−２、IＬ−６、Ｔ１０１、ＴＡＣ、IＬ−６、ＴＲＡIＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡIＬ−Ｒ２（ＤＲ５）と反応するＭＡｂからなる群より選択される、薬学的に許容される媒体中で製剤化された少なくとも１つのヒト化、キメラ、ヒトまたはマウス（非ヒト対象に対して）ＭＡｂを含む。抗体融合タンパク質自体を治療薬とコンジュゲートさせることができため、２つ以上の治療薬を抗体成分と結合させるための媒体が提供され、これらの治療薬は異なる上記薬剤の組合せまたは同じ薬剤の組合せ、例えば、異なる２つの治療用放射性標識などであり得る。
対象におけるＢ細胞リンパ腫または白血病または自己免疫疾患の診断法または検出法も包含され、この方法は、リンパ腫、白血病または自己免疫細胞と結合する抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含む診断用コンジュゲートを、ヒトを含めた哺乳動物および家畜およびイヌ、ネコ、ウサギ、モルモットのような伴侶ペットなどの対象に投与することを含み、ここで、抗ＣＤ１９ＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは、薬学的に許容される媒体中で製剤化された少なくとも１つの診断薬と結合している。有用な診断薬は本明細書に記載されている。
抗体の調製
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、特定抗原に対する均一な抗体の集団であり、抗体は１種のみの抗原結合部位を含み、抗原決定基上の１つのエピトープのみと結合する。特定抗原に対するげっ歯類モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法により入手し得る。例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）ならびにＣｏｌｉｇａｎら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ IＮ IＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１，ｐ．２．５．１−２．６．７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９１）［以下「Ｃｏｌｉｇａｎ」］を参照されたい。簡潔に述べれば、抗原を含む組成物をマウスに注射し、血清試料を採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を取り出してＢリンパ球を得、このＢリンパ球をミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマをクローニングし、抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択して、抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、このハイブリドーマ培養液から抗体を単離することにより、モノクローナル抗体を得ることができる。
ＭＡｂは、十分に確立された様々な技術によりハイブリドーマ培養液から単離および精製することができる。このような単離技術としては、プロテインＡセファロースを用いたアフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎのｐ．２．７．１−２．７．１２およびｐ．２．９．１−２．９．３を参照されたい。また、Ｂａｉｎｅｓら，「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Iｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ（IｇＧ）」，ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ IＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢIＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１０，ｐ．７９−１０４（Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Iｎｃ．１９９２）も参照されたい。
免疫原に対する抗体の初回産生の後、抗体の配列を決定し、次いで組換え技術により調製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化およびキメラ化は、当業者に公知である。例えば、マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖由来のマウス相補性決定領域を、ヒト定常領域配列と結合したヒト可変ドメイン内に移し、次いで、フレームワーク領域内の選択されたヒト残基をそのマウス対応物と置換することにより、ヒト化モノクローナル抗体を作製する。置換に好適なＦＲ残基としては、ＣＤＲ残基と近接または隣接しているＦＲ残基の他、抗体の安定性および／または発現レベルに影響を与える残基が挙げられる。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用により、マウス定常領域の免疫原性に関連した潜在的問題が未然に防止される。
マウス免疫グロブリン可変ドメインの一般的なクローニング技術は、例えば、その内容全体が参照により組み込まれる、Ｏｒｌａｎｄｉらの刊行物、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９）により開示されている。キメラ抗体の構築技術は当業者に公知である。一例として、Ｌｅｕｎｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４）では、抗ＣＤ２２抗体であるＬＬ２モノクローナル抗体のＶｋおよびＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を、それぞれヒトおよびIｇＧ１定常領域ドメインと組み合わせることにより、ＬＬ２キメラが作製された。この刊行物では、それぞれＶｋおよびＶＨである、ＬＬ２軽および重鎖可変領域のヌクレオチド配列も提供されている。ヒト化ＭＡｂの作製技術は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８），Ｃａｒｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ'ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２），Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）およびＳｉｎｇｅｒら，Ｊ．Iｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３）により記載されている。
キメラ抗体は、げっ歯類の抗体のような１種類の動物に由来するＣＤＲを含む可変領域を含むと同時に、抗体分子の残りの部分、すなわち定常領域はヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。したがって、キメラＭＡｂの可変ドメイン内のマウスＦＲ配列を１つまたは複数の異なるヒトＦＲで置換することにより、キメラモノクローナル抗体をヒト化することもできる。具体的には、マウスＣＤＲを、マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト抗体の対応する可変ドメイン内に移す。単にマウスＣＤＲをヒトＦＲ内に移すだけでは抗体親和性の減少または喪失さえも生じることが多いため、マウス抗体の元の親和性を復元するためにさらなる改変が必要とされる場合がある。これは、ＦＲ領域内の１つまたは複数のヒト残基をそのマウス対応物で置換して、そのエピトープに対する良好な結合親和性を有する抗体を得ることにより達成される。例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６（１９９１）およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）を参照されたい。
抗体を作製する別の方法は、トランスジェニック家畜の乳中での産生によるものである。例えば、共にその内容全体が参照により組み込まれる、Ｃｏｌｍａｎ，Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．，６３：１４１−１４７，１９９８；米国特許第５，８２７，６９０号を参照されたい。対になった免疫グロブリンの重および軽鎖をコードするＤＮＡセグメントをそれぞれ含む、２つのＤＮＡ構築物を調製する。ＤＮＡセグメントを、乳腺上皮細胞内で優先的に発現されるプロモーター配列を含む発現ベクター内にクローニングする。例としては、ウサギ、ウシおよびヒツジカゼイン遺伝子、ウシラクトグロブリン遺伝子、ヒツジラクトグロブリン遺伝子ならびにマウスホエイ酸タンパク質遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、挿入されたフラグメントの３'側に乳腺特異的遺伝子由来の同族ゲノム配列が隣接する。これにより、ポリアデニル化部位および転写物安定化配列が得られる。発現カセットを哺乳動物受精卵の前核内に同時注入し、次いで、これをレシピエント雌の子宮内に移植し、妊娠させる。出生後、仔をサザンブロット解析により両導入遺伝子の存在に関してスクリーニングする。抗体が存在するためには、重および軽鎖の両遺伝子が同一細胞内で同時に発現されなければならない。トランスジェニック雌由来の乳を、当該分野で公知の標準的な免疫学的方法を用いて抗体または抗体フラグメントの存在および機能性に関して解析する。当該分野で公知の標準的な方法を用いて、抗体を乳から精製することができる。
完全ヒト抗体、すなわちヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはその他のヒト抗体、例えば抗ＣＤ２２、抗ＣＤ２３、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ７４もしくは抗ＣＤ２１ＭＡｂなどをトランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、その内容全体が参照により組み込まれる、Ｍｅｎｄｅｚら，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）；米国特許第５，６３３，４２５号を参照されたい。例えば、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。このマウス体液性免疫系は、内在性免疫グロブリン遺伝子を不活性化しヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより、ヒト化されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は非常に複雑であり、全体でヒトゲノムのほぼ０．２％を占める多数の分離したセグメントを含む。トランスジェニックマウスが適切な抗体レパートリーを確実に産生できるように、ヒト重および軽鎖遺伝子座の大部分をマウスゲノム内に導入しなくてはならない。これは、生殖系列配置内ヒト重または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成から始まる段階的な工程において達成される。各挿入断片は約１Ｍｂのサイズであるため、ＹＡＣ構築物は免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同組換えを必要とする。１つが重鎖遺伝子座を含み、１つが軽鎖遺伝子座を含む２つのＹＡＣを、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとマウス胚性幹細胞とを融合させることにより、マウス内に別々に導入する。次いで、胚性幹細胞クローンをマウス胚盤胞内に微量注入する。得られたキメラ雄動物を、生殖系列を介したＹＡＣ伝達能に関してスクリーニングし、マウス抗体産生が欠損したマウスと交配させる。一方がヒト重鎖遺伝子座を含み、もう一方がヒト軽鎖遺伝子座を含む２つのトランスジェニック系統を交配することにより、免疫化に応答してヒト抗体を産生する子孫が作出される。
二重特異性ＭＡｂを作製するさらなる最新の方法は、追加のシスチン残基を有するためより一般的な免疫グロブリンアイソタイプよりも強く架橋する、操作された組換えＭＡｂを含む。例えば、ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１０（１０）：１２２１−１２２５，１９９７を参照されたい。別のアプローチは、必要とされる二重特異性を有する２つ以上の異なる一本鎖抗体または抗体フラグメントセグメントを連結する組換え融合タンパク質の設計である。例えば、Ｃｏｌｏｍａら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１５９−１６３，１９９７を参照されたい。分子工学を用いて様々な二重特異性融合タンパク質を作製することができる。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５４：９０−４（１９９９）を参照されたい。一形態では、二重特異性融合タンパク質は、例えば、１つの抗原に対する単一の結合部位を有するｓｃＦｖと、第二の抗原に対する単一の結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。別の形態では、二重特異性融合タンパク質は、例えば、１つの抗原に対する２つの結合部位を有するIｇＧと、第二の抗原に対する２つの結合部位を有するｓｃＦｖからなる。
２つ以上の異なる一本鎖抗体または抗体フラグメントを連結する二重特異性融合タンパク質が同様の方法で作製される。組換え法を用いて様々な融合タンパク質を作製することができる。例えば、ヒト化モノクローナル抗ＣＤ１９抗体由来のＦａｂフラグメントとマウス抗ｄｉＤＴＰＡ由来のｓｃＦｖとを含む融合タンパク質を作製することができる。ＧＧＧＳ（配列番号：２２）のような柔軟なリンカーは、ｓｃＦｖを抗ＣＤ１９抗体の重鎖定常領域と連結させる。あるいは、ｓｃＦｖを別のヒト化抗体の軽鎖定常領域と連結させることができる。重鎖ＦｄとｓｃＦｖのインフレーム連結に必要な適当なリンカー配列を、ＰＣＲ反応によりＶＬおよびＶｋドメイン内に導入する。次いで、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントを、ＣＨ１ドメインをコードするＤＮＡ配列を含むステージングベクター内に連結する。得られたｓｃＦｖ−ＣＨ１構築物を切り出し、抗ＣＤ１９抗体のＶＨ領域をコードするＤＮＡ配列を含むベクター内に連結する。得られたベクターを用いて、二重特異性融合タンパク質発現のための哺乳動物細胞のような適当な宿主細胞をトランスフェクトすることができる。
より最近では、ペプチドまたはタンパク質エフェクターの実質的に任意の組合せを含む非常に効率的な構築物形成を提供するために、ドック・アンド・ロック（ｄｏｃｋ−ａｎｄ−ｌｏｃｋ）（ＤＮＬ）として知られる新規な技術が開発されている（例えば、それぞれその内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６０２２８３５７号；第２００６０２２８３００号；第２００７００８６９４２号；第２００７０１４０９６６号および第２００７０２６４２６５号を参照されたい）。様々な組合せにより、構築物はタンパク質またはペプチドエフェクターに限定されず、タンパク質またはペプチドと結合させ得る化学療法薬のような他の種類のエフェクター物質を含み得る。この技術では、アンカリングドメインと呼ばれる相補的タンパク質結合ドメインおよび二量体化／ドッキングドメインを利用し、これらは互いに結合して、二量体から、三量体、四量体、五量体および六量体に及ぶ複合体構造を会合させる。これらは、大規模な精製を必要とせずに安定な複合体を高収率で形成する。ＤＮＬ技術により、裸の抗体部分としてまたは様々な他のエフェクター分子、例えば免疫調節薬、酵素、化学療法薬、ケモカイン、サイトカイン、診断薬、治療薬、放射性核種、造影剤、抗血管新生薬、増殖因子、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ペプチド、毒素、アポトーシス促進剤またはそれらの組み合わせなどと組み合わさった、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体の会合が可能となる。二重特異性または多重特異性抗体を作製するための当該分野で公知の任意の技術を、本願で特許請求される方法の実施において利用し得る。
既知の抗体
特定の実施形態、例えば、異なる抗原標的に対する抗ＣＤ１９抗体および別の抗体を組み込んだ二重特異性または多重特異性抗体を含む実施形態では、新たに抗体を作製するよりも、市販または公知の抗体を用いるほうが好ましい場合がある。様々な既知の販売元から有用な抗体を購入し得る。例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から様々な抗体分泌ハイブリドーマ系が入手可能である。腫瘍関連抗原を非限定的に含めた様々な疾患標的に対する数多くの抗体がＡＴＣＣに寄託され、および／または可変領域配列が公開されており、特許請求される方法および組成物での使用のために入手可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；第７，２８２，５６７号；第７，１５１，１６４号；第７，０７４，４０３号；第７，０６０，８０２号；第７，０５６，５０９号；第７，０４９，０６０号；第７，０４５，１３２号；第７，０４１，８０３号；第７，０４１，８０２号；第７，０４１，２９３号；第７，０３８，０１８号；第７，０３７，４９８号；第７，０１２，１３３号；第７，００１，５９８号；第６，９９８，４６８号；第６，９９４，９７６号；第６，９９４，８５２号；第６，９８９，２４１号；第６，９７４，８６３号；第６，９６５，０１８号；第６，９６４，８５４号；第６，９６２，９８１号；第６，９６２，８１３号；第６，９５６，１０７号；第６，９５１，９２４号；第６，９４９，２４４号；第６，９４６，１２９号；第６，９４３，０２０号；第６，９３９，５４７号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，５３３号；第６，９１９，４３３号；第６，９１９，０７８号；第６，９１６，４７５号；第６，９０５，６８１号；第６，８９９，８７９号；第６，８９３，６２５号；第６，８８７，４６８号；第６，８８７，４６６号；第６，８８４，５９４号；第６，８８１，４０５号；第６，８７８，８１２号；第６，８７５，５８０号；第６，８７２，５６８号；第６，８６７，００６号；第６，８６４，０６２号；第６，８６１，５１１号；第６，８６１，２２７号；第６，８６１，２２６号；第６，８３８，２８２号；第６，８３５，５４９号；第６，８３５，３７０号；第６，８２４，７８０号；第６，８２４，７７８号；第６，８１２，２０６号；第６，７９３，９２４号；第６，７８３，７５８号；第６，７７０，４５０号；第６，７６７，７１１号；第６，７６４，６８８号；第６，７６４，６８１号；第６，７６４，６７９号；第６，７４３，８９８号；第６，７３３，９８１号；第６，７３０，３０７号；第６，７２０，１５号；第６，７１６，９６６号；第６，７０９，６５３号；第６，６９３，１７６号；第６，６９２，９０８号；第６，６８９，６０７号；第６，６８９，３６２号；第６，６８９，３５５号；第６，６８２，７３７号；第６，６８２，７３６号；第６，６８２，７３４号；第６，６７３，３４４号；第６，６５３，１０４号；第６，６５２，８５２号；第６，６３５，４８２号；第６，６３０，１４４号；第６，６１０，８３３号；第６，６１０，２９４号；第６，６０５，４４１号；第６，６０５，２７９号；第６，５９６，８５２号；第６，５９２，８６８号；第６，５７６，７４５号；第６，５７２；８５６号；第６，５６６，０７６号；第６，５６２，６１８号；第６，５４５，１３０号；第６，５４４，７４９号；第６，５３４，０５８号；第６，５２８，６２５号；第６，５２８，２６９号；第６，５２１，２２７号；第６，５１８，４０４号；第６，５１１，６６５号；第６，４９１，９１５号；第６，４８８，９３０号；第６，４８２，５９８号；第６，４８２，４０８号；第６，４７９，２４７号；第６，４６８，５３１号；第６，４６８，５２９号；第６，４６５，１７３号；第６，４６１，８２３号；第６，４５８，３５６号；第６，４５５，０４４号；第６，４５５，０４０号；第６，４５１，３１０号；第６，４４４，２０６号；第６，４４１，１４３号；第６，４３２，４０４号；第６，４３２，４０２号；第６，４１９，９２８号；第６，４１３，７２６号；第６，４０６，６９４号；第６，４０３，７７０号；第６，４０３，０９１号；第６，３９５，２７６号；第６，３９５，２７４号；第６，３８７，３５０号；第６，３８３，７５９号；第６，３８３，４８４号；第６，３７６，６５４号；第６，３７２，２１５号；第６，３５９，１２６号；第６，３５５，４８１号；第６，３５５，４４４号；第６，３５５，２４５号；第６，３５５，２４４号；第６，３４６，２４６号；第６，３４４，１９８号；第６，３４０，５７１号；第６，３４０，４５９号；第６，３３１，１７５号；第６，３０６，３９３号；第６，２５４，８６８号；第６，１８７，２８７号；第６，１８３，７４４号；第６，１２９，９１４号；第６，１２０，７６７号；第６，０９６，２８９号；第６，０７７，４９９号；第５，９２２，３０２号；第５，８７４，５４０号；第５，８１４，４４０号；第５，７９８，２２９号；第５，７８９，５５４号；第５，７７６，４５６号；第５，７３６，１１９号；第５，７１６，５９５号；第５，６７７，１３６号；第５，５８７，４５９号；第５，４４３，９５３号；第５，５２５，３３８号（抗体可変領域および／またはＣＤＲ配列および／または抗体産生ハイブリドーマ細胞系のＡＴＣＣアクセッション番号に関して、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらは単なる例に過ぎず、他にも様々な抗体およびそのハイブリドーマが当該分野で公知である。当業者は、目的とする選択された疾患関連標的に対する抗体をＡＴＣＣ、ＮＣＢIおよび／またはＵＳＰＴＯデータベースで検索するだけで、ほぼあらゆる疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマも入手し得ることを理解するであろう。クローン抗体の抗原結合ドメインを当該分野で公知の標準的技術を用いて、増幅し、切り出して、発現ベクター内に連結し、適合する宿主細胞内にトランスフェクトして、タンパク質産生に使用し得る。
抗体フラグメントの産生
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを既知の方法により作製することができる。抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどのような、抗体の抗原結合部分のことである。その他の抗体フラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により作製することができるＦ（ａｂ'）２フラグメントおよびＦ（ａｂ'）２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により作製することができるＦａｂ’フラグメント挙げられるが、これらに限定されない。あるいはＦａｂ'発現ライブラリーを構築して（Ｈｕｓｅら，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７４−１２８１）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ'フラグメントを迅速かつ簡便に同定することが可能である。
一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。ＶＬおよびＶＨドメインが会合して標的結合部位を形成する。これら２つのドメインは、ペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合する。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分であればＶＬ−Ｌ−ＶＨ、またはＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部分であればＶＨ−Ｌ−ＶＬと表される。ｓｃＦｖ分子の作製および適切なペプチドリンカーの設計方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，７０４，６９２号、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｒ．ＲａａｇおよびＭ．Ｗｈｉｔｌｏｗ，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｆｖ．” ＦＡＳＥＢ Ｖｏｌ９：７３−８０（１９９５）ならびにＲ．Ｅ．ＢｉｒｄおよびＢ．Ｗ．Ｗａｌｋｅｒ，“Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ，” ＴIＢＴＥＣＨ，Ｖｏｌ９：１３２−１３７（１９９１）に記載されている。
抗体フラグメントは、完全長抗体のタンパク質分解性加水分解あるいはそのフラグメントをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または別のＤＮＡ宿主により調製することができる。抗体フラグメントは、従来の方法により、完全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例えば、抗体をペプシンで酵素切断して、Ｆ（ａｂ）２と表される５Ｓフラグメントを得ることにより、抗体フラグメントを作製することができる。このフラグメントを、チオール還元剤および任意でジスルフィド結合の切断により生じるスルフィドリル基の保護基を用いてさらに切断し、一価の３．５ＳＦａｂフラグメントを得ることができる。あるいは、パパインを用いた酵素切断により２つの一価Ｆａｂフラグメントおよび１つのＦｃフラグメントを直接得る。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇにより、米国特許第４，０３６，９４５号および第４，３３１，６４７号およびそれらに含まれる参考文献（その内容全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０（１９６０）；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９（１９５９），Ｅｄｅｌｍａｎら，ｉｎ ＭＥＴＨＯＤＳ IＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ ＶＯＬ．１，ｐ．４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９６７）およびＣｏｌｉｇａｎのｐ．２．８．１−２．８．１０および２．１０．−２．１０．４を参照されたい。
抗体フラグメントの別の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは、抗体が結合するエピトープに対して構造的に相補的な抗体可変領域のセグメントであり、他の可変領域よりも変化が大きい。したがって、ＣＤＲは超可変領域と呼ばれることがある。可変領域は３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲペプチドは、目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得ることができる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製される。例えば、Ｌａｒｒｉｃｋら，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６（１９９１）；Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ−Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴIＢＯＤIＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴIＯＮ，ＥＮＧIＮＥＥＲIＮＧ ＡＮＤ ＣＬIＮIＣＡＬ ＡＰＰＬIＣＡＴIＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒら（編），ｐ．１６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）；およびＷａｒｄら，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴIＢＯＤIＥＳ：ＰＲIＮＣIＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬIＣＡＴIＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈら，（編），ｐ．１３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Iｎｃ．１９９５）を参照されたい。
フラグメントがインタクトな抗体により認識されるものと同じ抗体と結合する限り、抗体を切断するその他の方法、例えば、重鎖の分離による一価の軽−重鎖フラグメントの形成、フラグメントのさらなる切断あるいはその他の酵素的、化学的または遺伝的技術なども使用し得る。
多重特異性抗体および多価抗体
抗ＣＤ１９抗体の他、併用療法に使用するための異なる特異性を有するその他の抗体を、ＣＤ１９エピトープもしくは抗原に対する少なくとも１つの結合部位およびＣＤ１９上の別のエピトープもしくは別の抗原に対する少なくとも１つの結合部位を含む多重特異性抗体、あるいは同じエピトープまたは抗原に対する複数の結合部位を含む多価抗体として作製することもできる。
二重特異性の抗体または抗体フラグメントは、標的細胞マーカーと特異的に結合する少なくとも１つの結合領域および標的化可能なコンジュゲートと特異的に結合する少なくとも１つの他の結合領域を有し得る。標的化可能なコンジュゲートは、二重特異性の抗体または抗体フラグメントの少なくとも１つの結合領域により認識される少なくとも１つのエピトープを含むかまたはそれを有する担体部分を含む。様々な組換え法を用いて上述の二重特異性の抗体および抗体フラグメントを作製することができる。
抗ＣＤ１９多価抗体も意図される。この多価の標的結合タンパク質は、第一と第二のポリペプチドの会合により構築される。第一のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリン軽鎖可変領域ドメインである第一の免疫グロブリン様ドメインと共有結合した第一の一本鎖Ｆｖ分子を含む。第二のポリペプチドは、好ましくは免疫グロブリン重鎖可変領域ドメインである第二の免疫グロブリン様ドメインと共有結合した第二の一本鎖Ｆｖ分子を含む。第一および第二の各一本鎖Ｆｖ分子が標的結合部位を形成し、第一と第二の免疫グロブリン様ドメインが会合して第三の標的結合部位を形成する。
ＬをリンカーとするＶＬ−Ｌ−ＶＨ配置の一本鎖Ｆｖ分子は、ＶＨ−Ｌ−ＶＬ配置の別の一本鎖Ｆｖ分子と会合して二価二量体を形成し得る。この場合、第一ｓｃＦｖのＶＬドメインと第二ｓｃＦｖのＶＨドメインが会合して１つの標的結合部位を形成すると同時に、第一ｓｃＦｖのＶＨドメインと第二ｓｃＦｖのＶＬドメインが会合して別の標的結合部位を形成する。
別の実施形態は、非共有結合で会合して３つの結合部位を形成する２つの異種ポリペプチド鎖を含む三価の抗ＣＤ１９二重特異性標的化タンパク質であり、３つの結合部位うち２つが１つの標的に対する親和性を有し、第三の結合部位が、診断薬および／または治療薬の担体と結合するように作製することができるハプテンに対する親和性を有する。好ましくは、この結合タンパク質は、２つのＣＤ１９結合部位と１つのＣＤ２２結合部位を有する。この二重特異性三価標的化薬剤は２つの異なるｓｃＦｖを有し、１つのｓｃＦｖが、別の抗体のＶＬドメインと短いリンカーで連結された１つの抗体由来のＶＨドメインを２つ含み、かつ第二のｓｃＦｖが、もう一方の抗体のＶＨドメインと短いリンカーで連結された第一抗体由来のＶＬドメインを２つ含む。ＶＨおよびＶＬドメインから多重特異性多価薬剤を作製するための方法では、多価かつ多重特異性の任意の薬剤を１つのＶＨ鎖と１つのＶＬ鎖の会合により作製できるように、宿主内のＤＮＡプラスミドから合成される各鎖がＶＨドメインだけからなる（ＶＨ鎖）か、またはＶＬドメインだけからなる（ＶＬ鎖）。例えば、三価の三重特異性薬剤を形成する場合、ＶＨ鎖は、可変長のペプチドリンカーにより連結された、それぞれ異なる特異性の抗体由来の３つのＶＨドメインのアミノ酸配列からなり、ＶＬ鎖は、ＶＨ鎖に使用されるものと同様のペプチドリンカーにより連結された相補的なＶＬドメインからなる。抗体のＶＨおよびＶＬドメインは逆平行型で会合するため、本発明の好適な方法では、ＶＬ鎖中のＶＬドメインはＶＨ鎖中のＶＨドメインと逆の順序で配置されている。
ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）
抗ＣＤ１９抗体を用いて機能的な二重特異性一本鎖抗体（ｂｓＡｂ）を調製することができ、これはダイアボディとも呼ばれ、組換え法を用いて哺乳動物細胞内で作製することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｃｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，９２：７０２１−７０２５，１９９５を参照されたい。例えば、組換え法を用いて、グリシン−セリンリンカーにより２つの一本鎖Ｆｖフラグメントを連結することによりｂｓＡｂを作製する。標準的なＰＣＲ法を用いて、目的の２つの抗体のＶ軽鎖（ＶＬ）およびＶ重鎖（ＶＨ）ドメインを単離する。次いで、各ハイブリドーマから得られたＶＬおよびＶＨのｃＤＮＡを二段階の融合ＰＣＲで連結して一本鎖フラグメントを形成する。第一のＰＣＲ段階では（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒｌ）３（配列番号：２３）リンカーを導入し、第二の段階ではＶＬアンプリコンとＶＨアンプリコンを連結する。次いで、各一本鎖分子を細菌発現ベクター中にクローニングする。増幅後、一方の一本鎖分子を切り出して、目的の第二の一本鎖分子を含む別のベクター中にサブクローニングする。得られたｂｓＡｂフラグメントを真核発現ベクター中にサブクローニングする。このベクターをＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞またはＳｐ−ＥＥＥ細胞内にトランスフェクトすることにより、機能性タンパク質の発現が得られる。同様の方法で二重特異性融合タンパク質を調製する。
例えば、ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９モノクローナル抗体を用いて、抗原特異的ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディを作製することができる。単一特異性ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディは、標的抗原と選択的に結合し、分子上の結合部位の数が増加するほど、所望の位置において標的細胞に対する親和性が増大し、より長い滞留時間が観測される。ダイアボディには、５つのアミノ酸残基リンカーによりヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂのＶＫポリペプチドと連結されたヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂのＶＨポリペプチドを含む２つの鎖が利用される。各鎖はヒト化抗ＣＤ１９ダイアボディの半分を形成する。トリアボディの場合、リンカーを用いずにヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂのＶＫポリペプチドと連結されたヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂのＶＨポリペプチドを含む３つの鎖が利用される。各鎖はｈＣＤ１９トリアボディの三分の一を形成する。
本明細書に記載の二重特異性ダイアボディは、最終的には、後に続く診断薬または治療薬の特異的送達のためのＣＤ１９陽性腫瘍プレターゲティングに使用される。これらのダイアボディは、標的抗原と選択的に結合し、所望の位置での親和性増大および滞留時間増加を可能にする。さらに、非抗原結合ダイアボディが体内から迅速に除去され、正常組織の曝露が最小限となる。クリアランス速度を増大させるための二重特異性抗体点突然変異は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６０／３６１，０３７号に見られる。親和性増大のための二重特異性ダイアボディは、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１０／２７０，０７１号、第１０／２７０，０７３号および第１０／３２８，１９０号に開示されている。
診断薬および治療薬は、アイソトープ、薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、増殖因子、コンジュゲート、放射性核種および金属を含み得る。例えば、ガドリニウム金属は磁気共鳴映像法（ＭＲI）に使用される。放射線核種の例は、２２５Ａｃ、１８Ｆ、６８Ｇａ、６７Ｇａ、９０Ｙ、８６Ｙ、１１１Iｎ、１３１１、１２５１、１２３I、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１７７Ｌｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５０、７６Ｂｒおよび２１１Ａｔである。他の放射性核種、特に６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲の放射性核種も診断薬および治療薬として利用可能である。
ごく最近では、二重特異性を有する四価タンデムダイアボディ（ｔａｎｄａｂと呼ぶ）が報告されている（Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）６０：４３３６−４３４１）。二重特異性ｔａｎｄａｂは２つの同一ポリペプチドの二量体であり、それぞれが、自己会合の際に２つの異なる特異性それぞれに対する２つの潜在的な結合部位の形成を促進する配向で連結された、２つの異なる抗体の４つの可変ドメイン（ＶＨ１、ＶＬ１、ＶＨ２、ＶＬ２）を含む。
コンジュゲートされた抗ＣＤ１９抗体
別の実施形態は、コンジュゲートされた抗ＣＤ１９抗体に関する。多価多重特異性薬剤のための組成物および方法は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００２年１２月２４日に出願された米国特許出願第６０／４３６，３５９号および２００３年４月２３日に出願された米国特許出願第６０／４６４，５３２号に記載されている。
追加のアミノ酸残基をポリペプチドのＮまたはＣ末端に付加し得る。追加のアミノ酸残基は、ペプチドタグ、シグナルペプチド、サイトカイン、酵素（例えば、プロドラッグ活性化酵素）、ホルモン、シュードモナスエキソトキシンのようなペプチド毒素、ペプチド薬物、細胞毒性タンパク質またはその他の機能性タンパク質を含み得る。本明細書で使用される場合、機能性タンパク質とは生物学的機能を有するタンパク質のことである。
一実施形態では、薬物、毒素、放射性化合物、酵素、ホルモン、オリゴヌクレオチド、細胞毒性タンパク質、キレート、サイトカインおよびその他の機能性薬剤を、好ましくは標的結合タンパク質のアミノ酸残基の側鎖、例えば、アミン、カルボキシル、フェニル、チオールまたはヒドロキシル基との共有結合により、標的結合タンパク質とコンジュゲートし得る。従来の様々なリンカー、例えば、ジイソシアナート、ジイソチオシアナート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミド−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒドなどをこの目的に使用し得る。薬剤と結合タンパク質とのコンジュゲーションは、好ましくは、タンパク質のその標的との結合特異性または親和性に大きな影響を与えない。本明細書で使用される場合、機能性薬剤とは生物学的機能を有する薬剤のことである。好適な機能性薬剤は細胞毒性薬である。
上述のように、酵素も有用な治療薬である。例えば、リン酸含有プロドラッグと併用されるアルカリホスファターゼ（米国特許第４，９７５，２７８号）；硫酸含有プロドラッグと併用されるアリールスルファターゼ（米国特許第５，２７０，１９６号）；ペプチドベースのプロドラッグと併用されるペプチダーゼおよびプロテアーゼ、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ（米国特許第５，６６０，８２９号；第５，５８７，１６１号；第５，４０５，９９０号）およびカテプシン（カテプシンＢおよびＬを含む）など；Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグと併用されるＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグ（米国特許第５，５６１，１１９号；第５，６４６，２９８号）と併用されるβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物切断酵素；ベータラクタム含有プロドラッグと併用されるベータラクタマーゼ；アミノ窒素においてフェノキシアセトアミドまたはフェニルアセトアミド基で誘導体化された薬物と併用されるペニシリン−Ｖ−アミダーゼ（米国特許第４，９７５，２７８号）のようなペニシリンアミダーゼ；および５−フルオロシトシンベースのプロドラッグ（米国特許第４，９７５，２７８号）と併用されるシトシンデアミナーゼ（米国特許第５，３３８，６７８号；第５，５４５，５４８号）が適切な治療薬である。
さらに他の実施形態では、治療薬またはプロドラッグポリマーのインビボ標的への二重特異性抗体介在性の送達を放射性核種の二重特異性抗体送達と組み合わせて、併用化学療法および放射免疫療法を達成することができる。各治療法を標的化可能なコンジュゲートとコンジュゲートして同時に投与することができ、または核種を第一の標的化可能なコンジュゲートの一部として投与し、薬物を第二の標的化可能なコンジュゲートの一部として後の段階で投与することができる。
別の実施形態では、細胞毒性薬をポリマー担体とコンジュゲートしてもよく、次いで、ポリマー担体を多価標的結合タンパク質とコンジュゲートしてもよい。この方法に関しては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｙｓｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３８６７−３８７０，１９７８、米国特許第４，６９９，７８４号および米国特許第４，０４６，７２２号を参照されたい。コンジュゲーションは、好ましくは、結合タンパク質の結合特異性または親和性に大きな影響を与えない。
治療および診断のためのヒト化、キメラおよびヒト抗体
本明細書に記載のヒト化、キメラおよびヒトモノクローナル抗体、すなわち、抗ＣＤ１９ＭＡｂおよびその他のＭＡｂは、治療法および診断法での使用に適している。したがって、本発明では、裸の抗体として単独で、または投与計画に一時的に従うが治療薬とコンジュゲートせずに集学的治療として投与される、ヒト化、キメラおよびヒト抗体の投与が意図される。裸の抗ＣＤ１９ＭＡｂの効力は、１つまたは複数の他の裸の抗体、すなわち特定抗原、例えばＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ１、Iａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Iｉ、IＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、IＬ−６、ＴＲＡIＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡIＬ−Ｒ２（ＤＲ５）などに対するＭａｂで、薬物、毒素、免疫調節薬、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、治療用放射性核種などを含めた治療薬とコンジュゲートされた、抗ＣＤ１９または上記抗原に対する抗体の１つまたは複数のイムノコンジュゲートで、ＭＡｂと同時または順次または所定の投与計画に従って投与される、薬物、毒素、酵素、オリゴヌクレオチド、免疫調節薬、ホルモン、治療用放射性核種などを含めた１つまたは複数の治療薬で、裸の抗体を補完することにより増強することができる。
好適なＢ細胞抗原としては、ヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ＣＤ８０およびＣＤ５抗原と同等の抗原が挙げられる。好適なＴ細胞抗原としては、ヒトＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５（IＬ−２受容体）抗原と同等の抗原が挙げられる。ＨＬＡ−ＤＲ抗原の同等物は、Ｂ細胞およびＴ細胞両障害の治療に使用することができる。特に好適なＢ細胞抗原は、ヒトＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ７４、ＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲ抗原と同等の抗原である。特に好適なＴ細胞抗原は、ヒトＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ２５抗原と同等の抗原である。ＣＤ４６は、補体依存性溶解（ＣＤＣ）を阻止する癌細胞表面上の抗原である。
さらに本発明では、Ｂ細胞リンパ腫およびその他の疾患もしくは障害における診断的および治療的使用のためのイムノコンジュゲートの投与が意図される。本明細書に記載のイムノコンジュゲートは、抗体成分と、診断薬または治療薬を有し得るペプチドを含めた治療薬または診断薬とを含む分子である。イムノコンジュゲートは抗体成分の免疫応答性を保持している、すなわち、同種の抗原との抗体部分の結合能が、コンジュゲーション後にコンジュゲーション前と比べてほぼ同じかまたはわずかに減少している。
様々な診断用および治療用試薬を特許請求される抗体と都合よくコンジュゲートさせることができる。ここで挙げられる治療薬は、上記裸の抗体と別々に投与するのにも有用な薬剤である。治療薬としては、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、抗代謝薬、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２阻害剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生薬ならびにアポトーシス薬、具体的にはドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、プロテオソーム阻害剤およびこれらおよびその他の種類の抗癌剤由来のもの、サリドマイドおよび誘導体、オリゴヌクレオチド、具体的にはアンチセンスおよびＲＮＡｉオリゴヌクレオチド（例えば、ｂｃｌ−２に対する）などが挙げられる。イムノコンジュゲートおよび抗体融合タンパク質の調製に有用なその他の癌化学療法薬剤としては、ナイトロジェンマスタード、アルキルスルホナート、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、酵素、ホルモンなどが挙げられる。適切な化学療法薬は、ＲＥＭIＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴIＣＡＬ ＳＣIＥＮＣＥＳ，第１９版，（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９９５）およびＧＯＯＤＭＡＮ ＡＮＤ ＧIＬＭＡＮ’Ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧIＣＡＬ ＢＡＳIＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴIＣＳ，第７版，（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．１９８５）ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。実験薬のようなその他の適切な化学療法薬は当業者に公知である。
さらに、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡもしくはＮＯＴＡのようなキレート剤または適切なペプチドに対して蛍光分子または重金属もしくは放射性核種のような細胞毒性薬などの検出可能な標識を、特許請求される抗体とコンジュゲートすることができる。例えば、光活性剤または色素を抗体複合体とコンジュゲートすることにより、治療に有用なイムノコンジュゲートを得ることができる。蛍光色素のような蛍光組成物およびその他の色素原もしくは可視光に高感度なポルフィリンのような色素が、病変に適切な光を当てて病変を治療するために使用されてきた。治療では、これは光線照射法、光線療法または光線力学療法と呼ばれている（Ｊｏｒｉら（編），ＰＨＯＴＯＤＹＮＡＭIＣ ＴＨＥＲＡＰＹ ＯＦ ＴＵＭＯＲＳ ＡＮＤ ＯＴＨＥＲ ＤIＳＥＡＳＥＳ（Ｌｉｂｒｅｒｉａ Ｐｒｏｇｅｔｔｏ １９８５）；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇｈ，Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔａｉｎ ２２：４３０（１９８６）。
さらに、光線療法を達成するためにモノクローナル抗体を光活性色素と結合させてきた。Ｍｅｗら，Ｊ．Iｍｍｕｎｏｌ．１３０：１４７３（１９８３）；同，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５：４３８０（１９８５）；Ｏｓｅｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８７４４（１９８６）；同，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．４６：８３（１９８７）；Ｈａｓａｎら，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．２８８：４７１（１９８９）；Ｔａｔｓｕｔａら，Ｌａｓｅｒｓ Ｓｕｒｇ Ｍｅｄ．９：４２２（１９８９）；Ｐｅｌｅｇｒｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ ６７：２５２９（１９９１）。しかし、こうした以前の研究には、特に抗体フラグメントまたはサブフラグメントを使用した内視鏡治療応用の使用が含まれていなかった。したがって、本発明では、光活性薬剤または色素を含むイムノコンジュゲートの治療的使用が意図される。
また、診断薬として放射性および非放射性薬剤の使用も本発明により意図される。適切な非放射性診断薬は、磁気共鳴映像法、コンピュータ断層撮影法または超音波に適した造影剤である。磁気造影剤としては、本発明の抗体と共に使用する場合、例えば、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含めた金属キレート化合物と錯体化した、マンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属が挙げられる。その内容全体が参照により組み込まれる、２００１年１０月１０日に出願された米国特許出願第０９／９２１，２９０号を参照されたい。
さらに、放射標識された抗体またはイムノコンジュゲートは、画像診断法に有用なガンマ放射する放射性同位元素または陽電子放射体を含み得る。特に６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲にある適切な放射性同位元素としては、１３１I、１２３I、１２４I、８６Ｙ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１１１Iｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１８Ｆ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、７５Ｂｒなどが挙げられる。例えば、造影の目的で１８Ｆ，６８Ｇａ，９４ｍＴｃなどのような陽電子放射体を開示し、その内容全体が参照により組み込まれる、米国特許仮出願第６０／３４２，１０４号を参照されたい。
シュードモナスエキソトキシンのような毒素も、抗ＣＤ１９抗体の抗体融合タンパク質と複合体形成するか、またはその治療薬部分を形成し得る。このようなコンジュゲートまたはその他の融合タンパク質の調製に適切に使用される他の毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼI、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナスエキソトキシンおよびシュードモナスエンドトキシンが挙げられる。例えば、Ｐａｓｔａｎら，Ｃｅｌｌ ４７：６４１（１９８６）およびＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｃ Ａ−Ａ ＣａｎｃｅｒＪｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ ４４：４３（１９９４）を参照されたい。本発明での使用に適したさらなる毒素は当業者に既知であり、その内容全体が参照により組み込まれる、米国特許第６，０７７，４９９号に開示されている。
サイトカインのような免疫調節薬も、抗体融合タンパク質とコンジュゲートされるか、またはその治療薬部分を形成するか、またはヒト化抗ＣＤ１９抗体と共に投与され得る。本発明に適したサイトカインとしては、以下に記載されているインターフェロンおよびインターロイキンが挙げられるが、これらに限定されない。
イムノコンジュゲートの調製
任意の抗体または抗体融合タンパク質を１つまたは複数の治療薬または診断薬とコンジュゲートすることができる。一般的には、１つの治療薬または診断薬を各抗体または抗体フラグメントと結合させるが、同じ抗体または抗体フラグメントに２つ以上の治療薬または診断薬を結合させることができる。抗体融合タンパク質は２つ以上の抗体またはそのフラグメントを含んでもよく、この融合タンパク質を構成する各抗体は治療薬または診断薬を含み得る。さらに、抗体融合タンパク質の１つまたは複数の抗体は、結合した治療薬または診断薬を２つ以上有し得る。さらに、これらの治療薬は同じである必要はなく、異なる治療薬であってもよい。例えば、同じ融合タンパク質に薬物と放射性同位元素を結合させることができる。具体的には、IｇＧを１３１Iで放射標識し、さらに薬物と結合させることができる。１３１IをIｇＧのチロシン内に組み込み、薬物をIｇＧリジンのイプシロンアミノ基と結合させることができる。治療薬および診断薬は共に、還元ＳＨ基および炭水化物側鎖と結合させることもできる。
二重特異性抗体はプレターゲティング法に有用であり、対象に治療薬または診断薬を送達するための好適な方法を提供する。米国特許出願第０９／３８２，１８６号では、二重特異性抗体を用いたプレターゲティングの方法が開示されており、ここでは、二重特異性抗体が１２５Iで標識されて対象に送達され、次いで、９９ｍＴｃで標識された二価ペプチドが送達される。その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第０９／８２３，７４６号（Ｈａｎｓｅｎら）および第１０／１５０，６５４号（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら）にもプレターゲティング法が記載されている。送達の結果、１２５Iおよび９９ｍＴｃの優れた腫瘍／正常組織比が得られる。既知の治療薬または診断薬の任意の組合せを用いて、抗体および抗体融合タンパク質を標識することができる。ＭＡｂコンジュゲートの抗体成分の結合特異性、治療薬もしくは診断薬の効力および抗体Ｆｃ部分のエフェクター活性は、コンジュゲートの標準的な試験により測定することができる。
治療薬または診断薬をジスルフィド結合形成により、還元抗体成分のヒンジ領域に結合させることができる。別の方法として、このようなペプチドをＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロプリオナート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて、抗体成分と結合させることができる。Ｙｕら，Iｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６：２４４（１９９４）。このようなコンジュゲーションの一般的技術は当該分野で公知である。例えば、Ｗｏｎｇ，ＣＨＥＭIＳＴＲＹ ＯＦ ＰＲＯＴＥIＮ ＣＯＮＪＵＧＡＴIＯＮ ＡＮＤ ＣＲＯＳＳ−ＬIＮＫIＮＧ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ １９９１）；Ｕｐｅｓｌａｃｉｓら，“Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，” ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴIＢＯＤIＥＳ：ＰＲIＮＣIＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬIＣＡＴIＯＮＳ，Ｂｉｒｃｈら（編），ｐ．１８７−２３０（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Iｎｃ．１９９５）；Ｐｒｉｃｅ，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，” ｉｎ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴIＢＯＤIＥＳ：ＰＲＯＤＵＣＴIＯＮ，ＥＮＧIＮＥＥＲIＮＧ ＡＮＤ ＣＬIＮIＣＡＬ ＡＰＰＬIＣＡＴIＯＮ，Ｒｉｔｔｅｒら（編），ｐ．６０−８４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）を参照されたい。
あるいは、治療薬または診断薬を抗体Ｆｃ領域の炭水化物部分を介して結合させることができる。炭水化物基を用いて、チオール基と結合する同じペプチドの付加量を増加させることができ、または炭水化物部分を用いて異なるペプチドを結合させることができる。
抗体の炭水化物部分を介してペプチドと抗体成分をコンジュゲートする方法は、当業者に公知である。例えば、すべてその内容全体が参照により組み込まれる、Ｓｈｉｈら，Iｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４１：８３２（１９８８）；Ｓｈｉｈら，Iｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：１１０１（１９９０）；およびＳｈｉｈら，米国特許第５，０５７，３１３号を参照されたい。一般的な方法では、酸化された炭水化物部分を有する抗体成分を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、かつ複数のペプチドが付加された担体ポリマーと反応させる。この反応により最初にＳｃｈｉｆｆ塩基（イミン）結合が生じ、これが還元により第二級アミンに安定化されて、最終的なコンジュゲートを形成する。
イムノコンジュゲートの抗体成分として使用される抗体が抗体フラグメントである場合、Ｆｃ領域が存在しない。しかし、完全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域内に炭水化物部分を導入することが可能である。例えば、すべてその内容全体が参照により組み込まれる、Ｌｅｕｎｇら，Ｊ．Iｍｍｕｎｏｌ．１５４：５９１９（１９９５）；Ｈａｎｓｅｎら，米国特許第５，４４３，９５３号（１９９５），Ｌｅｕｎｇら，米国特許第６，２５４，８６８号を参照されたい。設計された炭水化物部分を使用して治療薬または診断薬を結合させる。
薬学的に許容される賦形剤
対象に送達されるヒト化、キメラおよびヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂは、ＭＡｂのみ、イムノコンジュゲート、融合タンパク質から構成され得るか、あるいは１つもしくは複数の薬学的に適切な賦形剤、１つもしくは複数の追加成分またはこれらの組合せを含み得る。
イムノコンジュゲートまたは裸の抗体を既知の方法に従い製剤化して薬学的に有用な組成物を調製し、これにより、イムノコンジュゲートまたは裸の抗体を混合物中で薬学的に適切な賦形剤と組み合わせることができる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水が薬学的に適切な賦形剤の一例である。その他の適切な賦形剤は当業者に公知である。例えば、Ａｎｓｅｌら，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴIＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬIＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，第５版（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）およびＧｅｎｎａｒｏ（編），ＲＥＭIＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴIＣＡＬ ＳＣIＥＮＣＥＳ，第１８版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）ならびにこれらの改訂版を参照されたい。
イムノコンジュゲートまたは裸の抗体を、例えば、ボーラス注入または持続注入による静脈内投与用に製剤化することができる。注入用の製剤は、単位投与剤形、例えば、保存剤を添加したアンプルまたは複数回投与容器で提供される。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁剤、液剤または乳剤としての形態をとることができ、懸濁化、安定化および／または分散剤のような製剤化剤を含有し得る。あるいは、有効成分は、使用前に適切な媒体、例えば、滅菌無発熱物質水との組成のために粉末形態であり得る。
さらなる薬学的方法を用いて、治療用もしくは診断用コンジュゲートまたは裸の抗体の作用持続時間を制御し得る。イムノコンジュゲートまたは裸の抗体と複合体形成するまたはこれを吸収するポリマーの使用により、放出制御製剤を調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−ｃｏ−ビニル酢酸）のマトリックスおよびステアリン酸二量体とセバシン酸のポリ酸無水物コポリマーのマトリックスが挙げられる。Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４４６（１９９２）。このようなマトリックスからのイムノコンジュゲートまたは抗体の放出速度は、イムノコンジュゲートまたは抗体の分子量、マトリックス内のイムノコンジュゲート、抗体の量および分散された粒子のサイズに依存する。Ｓａｌｔｚｍａｎら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．５５：１６３（１９８９）；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら，上記。その他の固形剤形は、Ａｎｓｅｌら，ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴIＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬIＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ，第５版，（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９０）およびＧｅｎｎａｒｏ（編），ＲＥＭIＮＧＴＯＮ'Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴIＣＡＬ ＳＣIＥＮＣＥＳ，第１８版，（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）ならびにこれらの改訂版に記載されている。
イムノコンジュゲート、抗体融合タンパク質または裸の抗体を哺乳動物の皮下にまたは他の非経口経路によっても投与し得る。さらに投与は、持続投与によるものでも、あるいは単回または複数回ボーラス投与によるものであり得る。一般に、ヒトに対して投与されるイムノコンジュゲート、融合タンパク質または裸の抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態および既往歴のような因子により異なる。通常、単回静脈内注入として約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量のイムノコンジュゲート、抗体融合タンパク質または裸の抗体を受容者に提供することが望ましいが、状況により、これよりも低いまたは高い用量も投与し得る。この投与量を必要に応じて、例えば、週１回で４〜１０週間、好ましくは週１回で８週間、より好ましくは週１回で４週間繰り返し得る。隔週で数ヶ月間のような、より低頻度でも投与し得る。投与量および計画を適当に調節して様々な非経口経路で投薬を行い得る。
治療目的で、イムノコンジュゲート、融合タンパク質または裸の抗体を哺乳動物に治療有効量投与する。適する対象は通常、ヒトであるが、非ヒトの動物対象も意図される。抗体製剤は、投与される量が生理学的に意味のある場合、「治療有効量」投与されるという。薬剤は、その存在が受容哺乳動物の生理に検出可能な変化をもたらす場合、生理学的に意味がある。具体的には、抗体製剤は、その存在が抗腫瘍応答を引き起こすか、あるいは自己免疫疾患状態の徴候または症状を軽減する場合、生理学的に意味がある。生理学的に意味のある作用は、受容哺乳動物における体液性および／または細胞性免疫応答の誘起でもあり得る。
治療法
本発明では、Ｂ細胞障害および他の疾患治療用の主要組成物としての裸のまたはコンジュゲートされた抗ＣＤ１９抗体の使用が意図される。具体的には、本発明に記載の組成物は、様々な自己免疫疾患のみならず、緩徐進行型のＢ細胞リンパ腫、高悪性度型のＢ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症にも特に有用である。例えば、ヒト化抗ＣＤ１９抗体成分およびイムノコンジュゲートを用いて、緩徐進行および高悪性度両型の非ホジキンリンパ腫を治療することができる。
上述のように、抗体は様々な自己免疫疾患の診断および治療にも適する。このような疾患としては、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬および線維性肺胞炎が挙げられる。このような疾患に対する最も一般的な治療法は、非常に有害となり得る副腎皮質ステロイド剤および細胞毒性薬剤である。これらの薬物は免疫系全体も抑制し、重篤な感染症を引き起こす可能性があり、さらに骨髄、肝臓および腎臓に対する副作用を有する。ＩＩＩ型自己免疫疾患を治療するために使用されてきたその他の治療薬は、Ｔ細胞およびマクロファージに対するものであった。
治療用組成物は、少なくとも１つのヒト化、キメラまたはヒトモノクローナル抗ＣＤ１９抗体を単独で、あるいは他のヒト化、キメラもしくはヒト抗体のような他の抗体、治療薬または免疫調節薬と共に含有する。特に完全ヒト抗体との併用療法が意図される。
同じまたは異なるエピトープまたは抗原に対する裸のまたはコンジュゲートされた抗体も組み合わせ得る。例えば、裸のヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９抗体を別の裸のヒト化、キメラもしくはヒト抗ＣＤ１９と、または裸の抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２もしくは他のＢ細胞系列抗体と組み合わせ得る。裸のヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９抗体を抗ＣＤ１９イムノコンジュゲートまたは抗ＣＤ２２放射性コンジュゲートと組み合わせ得る。裸の抗ＣＤ２２抗体を、アイソトープ、１つもしくは複数の化学療法薬、サイトカイン、毒素またはそれらの組み合わせとコンジュゲートされた、ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９抗体と組み合わせ得る。ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９抗体と毒素または免疫調節薬との融合タンパク質あるいは少なくとも２つの異なるＢ細胞抗体の融合タンパク質（例えば、抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２２ＭＡｂまたは抗ＣＤ１９／抗ＣＤ２０ＭＡｂ）も使用し得る。上に列挙したＢ細胞障害と関連する少なくとも２つの異なる抗原を標的とする、多くの異なる抗体の組み合わせを、裸の抗体として、あるいは治療薬または免疫調節薬とコンジュゲートして、あるいは細胞毒性薬剤、サイトカインまたは放射性核種のような別の治療薬と単に組み合わせて構築し得る。
本明細書で使用される「免疫調節薬」という用語は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリンホトキシン、およびインターロイキン（例えば、インターロイキン−１（IＬ−１）、IＬ−２、IＬ−３、IＬ−６、IＬ−１０、IＬ−１２、IＬ−２１およびIＬ−１８）のような造血因子、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンを包含する。適する免疫調節薬部分の例としては、IＬ−２、IＬ−６、IＬ−１０、IＬ−１２、IＬ−１８、IＬ−２１、インターフェロン、ＴＮＦなどが挙げられる。あるいは、対象は、裸の抗ＣＤ１９抗体を受け、さらにサイトカインを別に投与され得るが、サイトカインは裸の抗ＣＤ１９抗体投与の前、同時または後に投与され得る。上述のように、抗ＣＤ１９抗体を免疫調節薬とコンジュゲートし得る。また免疫調節薬を異なる抗原と結合する１つまたは複数の抗体からなるハイブリッド抗体とコンジュゲートし得る。
集学的治療は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ１、Iａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ（可変鎖を含む）、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Iｉ、IＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、IＬ−６、ＴＲＡIＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡIＬ−Ｒ２（ＤＲ５）と結合する抗体を裸の抗体、融合タンパク質の形態であるいはイムノコンジュゲートとして投与することで補完される、裸の抗ＣＤ１９抗体による免疫療法をさらに包含する。これらの抗体は、これら抗原決定基上の少なくとも１つのエピトープを認識するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒトまたはヒト化抗体を包含する。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２２抗体は当業者に既知である。例えば、その内容全体が参照により組み込まれる、Ｇｈｅｔｉｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：２６１０（１９８８）；Ｈｅｋｍａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Iｍｍｕｎｏｌ．Iｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３２：３６４（１９９１）；Ｌｏｎｇｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：３５３（１９９６）および米国特許第５，７９８，５５４号および第６，１８７，２８７号を参照されたい。Ｂ細胞抗体による自己免疫障害の免疫療法は当該技術分野において記載されている。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第００７４７１８Ａ１号を参照されたい。
別の形態の集学的治療では、対象は裸の抗ＣＤ１９抗体および／またはイムノコンジュゲートを標準的な癌化学療法と併用して受ける。例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ２シクロホスファミド、２００〜４００ｍｇ／ｍ２エトポシドおよび１５０〜２００ｍｇ／ｍ２カルムスチン）が非ホジキンリンパ腫の治療に使用されるレジメンである。Ｐａｔｔｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．５１：１８（１９９３）。他の適切な併用化学療法レジメンは当業者に公知である。例えば、Ｆｒｅｅｄｍａｎら，“Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ'ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，” ｉｎ ＣＡＮＣＥＲ ＭＥＤIＣIＮＥ，ＶＯＬＵＭＥ２，第３版，Ｈｏｌｌａｎｄら（編），ｐ．２０２７−２０６８（Ｌｅａ ＆ Ｆｅｂｉｇｅｒ １９９３）を参照されたい。例として、中悪性度非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）治療の第一世代の化学療法レジメンは、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）およびＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）を含む。有用な第二世代の化学療法レジメンは、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン）であり、一方、適切な第三世代レジメンは、ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）である。さらなる有用な薬剤としては、フェニルブチレートおよびブリオシタチン−１が挙げられる。Ｂ細胞腫瘍を含めた特定の悪性腫瘍に対する治療薬として、アンチセンスｂｃｌ−２オリゴヌクレオチドも臨床試験中である。好適な集学的治療では、化学療法薬とサイトカインの両方を抗体、イムノコンジュゲートまたは融合タンパク質と共投与する。サイトカイン、化学療法薬および抗体もしくはイムノコンジュゲートは、任意の順序でまたは同時に投与し得る。
好適な一実施形態では、週に１回２００〜４００ｍｇ／ｍ２の用量で連続４週間のヒト化抗ＣＤ１９抗体注入（２〜８時間にわたる静注）によりＮＨＬを治療し、必要に応じて翌月／年も繰り返す。また、上記のように４週間の注入によりＮＨＬを治療するが、同じ日にエピラツズマブ（抗−ＣＤ２２ヒト化抗体）を３６０ｍｇ／ｍ２の用量で、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体注入の前、間または後に１時間にわたる静注投与により併用するのも好ましい。また、イットリウム９０（数週間または数ヶ月間にわたる１回または複数回の注射として５〜３５ｍＣｉ／ｍ２の間のＹ９０の用量で）のような治療用アイソトープで放射標識された抗−ＣＤ２２ＭＡｂの１回または複数回の注射と併用して、上記のように４週間の抗ＣＤ１９抗体注入によりＮＨＬを治療するのもさらに好ましい。抗ＣＤ１９ＭＡｂを同様のレジメンで、ｈＡ２０ヒト化ＭＡｂのような抗ＣＤ２０ＭＡｂ（２００３年２月１４日に出願された米国特許出願第１０／３６６，７０９号）と併用してもよく、これにより、１サイクル当たり週１回用量を４週、任意でサイクルを繰り返して、それぞれ２５０ｍｇ／ｍ２の用量の各抗体が静注で一緒に投与される。特に自己免疫疾患を有する患者の治療のために、抗体の一方または両方を皮下注射により投与することができ、これにより、同様の用量が隔週で投与される。
さらに治療用組成物は、異なる非遮断ＣＤ１９エピトープに対する裸のモノクローナル抗ＣＤ１９抗体の混合物またはハイブリッド分子を含有し得る。したがって、本発明では、少なくとも２つのＣＤ１９エピトープと結合するモノクローナル抗ＣＤ１９抗体の混合物を含む治療用組成物が意図される。
抗ＣＤ１９抗体はＢ細胞リンパ腫および自己免疫疾患治療のための主要な治療用組成物であるが、補助的薬剤、例えば、IＦＮ−アルファ、IＦＮ−ベータおよびIＦＮ−ガンマを含めたインターフェロン、IＬ−１、IＬ−２、IＬ−６、IＬ−１２、IＬ−１５、IＬ−１８、IＬ−２１を含めたインターロイキンならびにＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦを含めたサイトカインのような免疫調節薬などで裸の抗体を補完することにより、このような抗体療法の効力を増強することができる。したがって、抗ＣＤ１９抗体は、（別々にまたは所定の投与計画で投与される）混合物としてまたは抗ＣＤ１９抗体とのコンジュゲートもしくは融合タンパク質として、抗体およびサイトカインと組み合わせ得るだけでなく、薬物との組合わせとして投与することもできる。例えば、抗ＣＤ１９抗体を４剤化学療法レジメンとしてＣＨＯＰと組み合わせ得る。さらに、裸の抗ＣＤ１９抗体を、ＮＨＬ治療のための合剤として、裸の抗ＣＤ２２抗体および／または裸の抗ＣＤ２０抗体ならびにＣＨＯＰまたはフルダラビンと組み合わせ得る。補完用の治療用組成物は、抗ＣＤ１９抗体投与の前、同時または後に投与し得る。
上述のように、抗体をＢ細胞リンパ腫および白血病およびその他のＢ細胞疾患もしくは障害の治療に使用することができる。抗体を不必要なまたは望ましくないＢ細胞活性または増殖を伴う任意の疾患または症候群の治療に使用し得る。例えば、抗ＣＤ１９抗体を用いて、ＩＩＩ型自己免疫疾患を含めたＢ細胞関連の自己免疫疾患を治療することができる。抗体を移植片対宿主病のようなＢ細胞疾患の治療または移植免疫抑制療法のために使用することもできる。
抗ＣＤ１９抗体はまた、ＣＤ１９抗原を発現する細胞内でアポトーシスを誘導し得る。この誘導の証拠は文献において裏付けられている。例えば、架橋した抗ＣＤ１９ＭＡｂのIｇＧ１−Ｆｃと反応するＦｃ受容体を有するリンパ球細胞を用いて、アポトーシスが誘導され得ることが示された。Ｓｈａｎら，Ｃａｎｃｅｒ Iｍｍｕｎｏｌ．Iｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４８（１２）：６７３−６８３（２０００）を参照されたい。さらに、キメラ抗ＣＤ１９ＭＡｂの凝集体、すなわちホモポリマーがアポトーシスを誘導することが報告された。Ｇｈｅｔｉｅら，Ｂｌｏｏｄ ９７（５）：１３９２−１３９８（２０００）およびＧｈｅｔｉｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４（１４）：７５０９−７５１４（１９９７）を参照されたい。抗アポトーシス遺伝子ファミリーｂｃｌ−２の１つまたは複数のメンバーの活性を阻害する薬剤のようなアポトーシス促進剤の同時使用により、抗体のアポトーシス促進活性の増強を達成し得る。アンチセンスおよびＲＮＡｉ薬剤はこの点で特に有用であり、本明細書に記載の抗ＣＤ１９抗体とのコンジュゲーションによりＢ細胞に向けることができる。
Ｂ細胞のＣＤ１９表面抗原に特異的な抗体を哺乳動物対象に注射し、次いでこれを正常および悪性の両Ｂ細胞と結合させることができる。哺乳動物対象は、ヒトならびにイヌおよびネコのようなペットを含めた家畜を包含する。ＣＤ１９抗原に対する種交差反応性が存在する場合、抗ＣＤ１９ＭＡｂ、すなわち、ヒト化、キメラ、ヒトさらにはマウスの抗ＣＤ１９ＭＡｂを用いて、非ヒト哺乳動物対象を治療することができる。以下の実施例１０および１１を参照されたい。ヒトにおいて免疫原性であるマウスＭＡｂは通常、非ヒト哺乳動物対象においては免疫原性が弱い。ＣＤ１９表面抗原と結合する抗ＣＤ１９抗体は、腫瘍性Ｂ細胞の破壊および枯渇をもたらす。正常および悪性Ｂ細胞は共にＣＤ１９抗原を発現し、抗ＣＤ１９抗体がＢ細胞の死をもたらす。しかし、正常なＢ細胞のみが再増殖し、悪性Ｂ細胞は根絶されるかまたは著しく減少する。さらに、腫瘍を破壊する可能性のある化学薬剤または放射性標識を、薬剤が腫瘍性Ｂ細胞に特異的に標的化されるように抗ＣＤ１９抗体とコンジュゲートすることができる。
発現ベクター
ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂをコードするＤＮＡ配列を、核酸の複製をもたらす様々な既知の宿主ベクター内に組換え操作することができる。これらのベクターは、既知の方法を用いて、それが送達される細胞中の核酸の転写、翻訳またはその両方を指令するのに必要なエレメントを含むよう設計することができる。既知の方法論を用いて、適切な転写／翻訳制御シグナルと作動可能に連結されたタンパク質コード配列を有する発現構築物を作製することができる。これらの方法は、インビトロの組換えＤＮＡ技術および合成技術を含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮIＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ａｕｓｕｂｅｌら，１９９７，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ IＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢIＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
使用に適するベクターは、ウイルスまたは非ウイルスであり得る。ウイルスベクターの具体例としては、アデノウイルス、ＡＡＶ、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスのベクターが挙げられる。非ウイルスベクターの例はプラスミドである。好適な一実施形態では、ベクターはプラスミドである。
本発明に記載の発現ベクターは、宿主細胞内で発現される遺伝子を含むポリヌクレオチドである。通常、遺伝子発現は、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーを含めた特定の調節エレメントの制御下に置かれている。このような遺伝子は、調節エレメントと「作動可能に連結されている」という。
好ましくは、発現ベクターは、重および軽鎖の可変および定常領域を含むヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂをコードするＤＮＡ配列を含む。しかし、一方が重鎖の可変および定常領域を含み、もう一方が軽鎖の可変および定常領域を含む、２つの発現ベクターを使用し得る。さらに好ましくは、発現ベクターは、プロモーター、分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、ヒトIｇＧ１重鎖定常領域をコードする遺伝子配列、Iｇエンハンサーエレメントおよび選択可能なマーカーをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列をさらに含む。
また、ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂを発現する方法も本明細書において意図され、この方法は、（ｉ）ヒト化、キメラまたはヒト抗ＣＤ１９ＭＡｂをコードするＤＮＡ配列を含む少なくとも１つの発現ベクターの直線化、（ｉｉ）少なくとも１つの上記直線化ベクターによる哺乳動物細胞のトランスフェクション、（ｉｉｉ）マーカー遺伝子を発現するトランスフェクト細胞の選択および（ｉｖ）ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂを分泌する細胞のトランスフェクト細胞からの同定を含む。
抗ＣＤ１９抗体の作製法
一般に、抗ＣＤ１９ＭＡｂをコードするＶｋおよびＶＨ配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５'−ＲＡＣＥおよびｃＤＮＡライブラリースクリーニングのような様々な分子クローニング法により得ることができる。具体的には、マウスまたはキメラ抗ＣＤ１９ＭＡｂを発現する細胞から、ＰＣＲ増幅により抗ＣＤ１９ＭＡｂのＶ遺伝子をクローニングし、次いで配列決定することができる。その信頼性を確認するために、クローニングされたＶＬおよびＶＨ遺伝子を、参照により組み込まれるＯｒｌａｎｄiら，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃi．，ＵＳＡ，８６：３８３３（１９８９））による記載のようにキメラＡｂとして細胞培養中で発現させることができる。次いで、Ｖ遺伝子配列に基づき、ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂを、参照により本明細書に組み込まれるＬｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））による記載のように設計および構築することができる。一般的なクローニング技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９））により、マウスまたはキメラ抗ＣＤ１９ＭＡｂを産生する任意の既知のハイブリドーマ系またはトランスフェクト細胞系からｃＤＮＡを調製することができる。プライマーＶｋ１ＢＡＣＫおよびＶｋ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら，１９８９）または参照により本明細書に組み込まれるＬｅｕｎｇら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１５：２８６（１９９３））により記載されている伸長プライマーセットを用いて、ＭＡｂのＶＫ配列を増幅し得るのに対し、ＶＨ配列は、プライマーペアＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Ｏｒｌａｎｄｉら，１９８９）または参照により本明細書に組み込まれるＬｅｕｎｇら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））により記載されているマウスＩｇＧ定常領域とアニールするプライマーを用いて増幅し得る。
第一鎖ｃＤＮＡ産物１０μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液［５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）１０μｌ、ｄＮＴＰ各２５０μＭ、プライマー２００ｎＭおよびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）５単位を含むＰＣＲ反応混合物を３０サイクルのＰＣＲに供することができる。各ＰＣＲサイクルは、好ましくは、９４℃で１分間の変性、５０℃で１．５分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間のポリメライゼーションからなる。増幅されたＶＫおよびＶＨフラグメントを２％アガロース（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）で精製することができる。同様に、ヒト化Ｖ遺伝子を、Ｌｅｕｎｇら（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：１４１３（１９９５））による記載のように、長いオリゴヌクレオチド鋳型合成とＰＣＲ増幅の組み合わせにより構築することができる。ヒト化Ｖ遺伝子構築で使用する自動ＲＮＡ／ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）でのオリゴＡおよびオリゴＢの合成に関しては、実施例３を参照されたい。
ＶＫに対するＰＣＲ産物を、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列およびＶＫのＰＣＲ産物のインフレーム連結促進に好都合な制限部位を含む、ｐＢＲ３２７ベースのステージングベクターであるＶｋｐＢＲのようなステージングベクター中にサブクローニングすることができる。ＶＨに対するＰＣＲ産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのＶＨｐＢＳのような同様のステージングベクター中にサブクローニングすることができる。各ＰＣＲ産物を含むそれぞれのクローンを、例えば、Ｓａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，ＵＳＡ，７４：５４６３（１９７７））の方法により配列決定し得る。
プロモーターおよびシグナルペプチド配列と共にＶＫおよびＶＨを含む発現カセットをそれぞれＶＫｐＢＲおよびＶＨｐＢＳから、二重制限消化によりＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出すことができる。次いで、ＶＫおよびＶＨ発現カセットをそれぞれｐＫｈおよびｐＧｌｇのような適当な発現ベクター内に連結することができる（Ｌｅｕｎｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））。発現ベクターを適当な細胞、例えば、骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４またはＳｐ−ＥＥＥ内にコトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性のコロニーを選択し、上清液を、例えばＥＬＩＳＡアッセイにより、キメラまたはヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂ産生に関して測定することができる。あるいは、ＶＫおよびＶＨ発現カセットを改変ステージングベクターであるＹＫｐＢＲ２およびＶＨｐＢＳ２内に構築し、それぞれＸｂａI／ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして切り出し、Ｇｉｌｌｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１（１９８９））により記載され、また細胞内での発現に関してＬｏｓｍａｎら（Ｃａｎｃｅｒ，８０：２６６０（１９９７））でも示されている、ｐｄＨＬ２のような単一発現ベクター中にサブクローニングする。有用な別のベクターは、Ｂａｒｎｅｓら，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：１０９−１２３（２０００）に記載されているＧＳベクターであり、好ましくはＮＳＯ細胞系およびＣＨＯ細胞で発現される。その他の適当な哺乳動物発現系が、Ｗｅｒｎｅｒら，Ａｒｚｎｅｉｍ．−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（ＩＩ），Ｎｒ．８，８７０−８８０（１９９８）に記載されている。
コトランスフェクションおよびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンのアッセイを以下のように行うことができる。Ｃｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１１４９（１９９２）に従い、約１０μｇのＶｋｐＫｈ（軽鎖発現ベクター）および約２０μｇのＶＨｐＧ１ｇ（重鎖発現ベクター）を用いて、エレクトロポレーション（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．）により５×１０６個のＳＰ２／０骨髄腫細胞のトランスフェクションを行うことができる。トランスフェクション後、細胞を９６ウェルマイクロタイタープレート内でＨＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）中、３７℃、５％ＣＯ２で増殖させ得る。２日後に、ハイグロマイシン選択培地（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）をハイグロマイシンの最終濃度５００単位／ｍｌで添加することにより、選択工程を開始することができる。コロニーは通常、エレクトロポレーション後２〜３週間で出現する。次いで、さらなる分析のために培養を拡大することができる。
キメラまたはヒト化重鎖分泌に関して陽性であるトランスフェクトーマをＥＬＩＳＡアッセイにより同定することができる。簡潔には、トランスフェクトーマ培養上清試料（約１００μｌ）を、ヤギ抗ヒト（ＧＡＨ）−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，Ｐａ．）でプレコートしたＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートに３連で添加する。プレートを室温で１時間インキュベートする。緩衝液（０．０５％ポリソルベート２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄して未結合タンパク質を除去する。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートしたＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をウェル（最終濃度１．０μｇ／ｍｌまで非コンジュゲート抗体を補充した、１０４倍希釈の抗体ストック１００μｌ）に添加する。１時間のインキュベーション後、プレートを通常は３回洗浄する。反応溶液［ＰＢＳ中、オルトフェニレン−ジアミン（ＯＰＤ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）１６７μｇ、過酸化水素０．０２５％を含む、１００μｌ］をウェルに添加する。３０分間暗所で発色させる。各ウェルに４Ｎ ＨＣｌ ５０μｌを添加することにより反応を停止させた後、自動ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，Ｖｔ．）で４９０ｎｍでの吸光度を測定する。次いで、結合したキメラ抗体を無関係キメラ抗体標準品（Ｓｃｏｔｇｅｎ，Ｌｔｄ．，Ｅｄｉｎｂｕｒｇ，Ｓｃｏｔｌａｎｄから入手可能）と比較して判定する。
抗体は、以下のように細胞培地から単離することができる。トランスフェクトーマ培養物を無血清培地に適応させる。キメラ抗体産生用に、ＨＳＦＭを用いたローラーボトル中で５００ｍｌの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分離し、上清を０．２μｍ膜でろ過する。ろ過した培地を流速１ｍｌ／分でプロテインＡカラム（１×３ｃｍ）に通す。次いで、樹脂を約１０カラム容量のＰＢＣで洗浄し、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）でプロテインＡ結合抗体をカラムから溶出する。１．０ｍｌの画分を３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）１０μｌを含むチューブに回収し、２８０／２６０ｎｍでの吸光度からタンパク質濃度を測定する。ピーク画分をプールし、ＰＢＳに対して透析し、抗体を、例えばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）で濃縮する。抗体濃度を上記のようにＥＬＩＳＡで測定し、その濃度をＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍｌに調整する。０．０１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウムを保存剤として適宜添加する。
抗ＣＤ１９抗体を調製するために使用されるプライマーのヌクレオチド配列を以下に挙げる：
ｈＡ１９ＶｋＡ ５'−ＡＴＣＡＣＴＴＧＴＡ ＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡ ＡＡＧＴＧＴＴＧＡＴ ＴＡＴＧＡＴＧＧＴＧ ＡＴＡＧＴＴＡＴＴＴ ＧＡＡＣＴＧＧＴＡＣ ＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣ ＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣ ＡＣＣＴＡＡＡＴＴＧ ＴＴＧＡＴＣＴＡＣＧ ＡＴＧＣＴＴＣＧＡＡ ＴＣＴＡＧＴＴＴＣＴ ＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号：２４）
ｈＡ１９ＶｋＢ ５'−ＴＧＣＴＧＡＣＡＧＴ ＧＡＴＡＴＧＴＴＧＣ ＡＡＴＧＴＣＴＴＣＴ ＧＧＴＴＧＡＡＧＡＧ ＡＧＣＴＧＡＴＧＧＴ ＧＡＡＡＧＴＧＴＡＡ ＴＣＴＧＴＣＣＣＡＧ ＡＴＣＣＧＣＴＧＣＣ ＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡ ＧＧＡＧＧＧＡＴＡＣ ＣＡＧＡＡＡＣＴＡＧ ＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡ ＴＣＧＴＡ−３'（配列番号：２５）
ｈＡ１９ＶｋＢａｃｋ ５'−ＴＣＣＧＡＣＡＴＣＣ ＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡ ＧＴＣＴＣＣＡＴＣＡ ＴＣＴＣＴＧＡＧＣＧ ＣＡＴＣＴＧＴＴＧＧ ＡＧＡＴＡＧＧＧＴＣ ＡＣＴＡＴＣＡＣＴＴ ＧＴＡＡＧＧＣＣＡＧ ＣＣＡＡＡＧ−３'（配列番号：２６）
ｈＡ１９ＶｋＦｏｒ ５'−ＧＣＴＣＣＴＴＧＡＧ ＡＴＣＴＧＴＡＧＣＴ ＴＧＧＴＣＣＣＴＣＣ ＡＣＣＧＡＡＣＧＴＣ ＣＡＣＧＧＡＴＣＴＴ ＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧ ＣＴＧＡＣＡＧＴＧＡ ＴＡＴＧＴＴＧＣＡＡ Ｔ−３'（配列番号：２７）
ｈＡ１９ＶＨＡ ５'−ＣＴＧＧＣＴＡＣＧＣ ＴＴＴＣＡＧＴＡＧＣ ＴＡＣＴＧＧＡＴＧＡ ＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧ ＧＣＡＧＡＧＧＣＣＴ ＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣ ＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴ ＴＧＧＡＣＡＧＡＴＴ ＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧ ＡＴＧＧＴＧＡＴＡＣ ＴＡＡＣＴＡＣＡＡＴ ＧＧＡＡＡＧＴＴＣＡ ＡＧＧＧＧＣＧＣＧＣ ＣＡＣＴＡＴＴ−３'（配列番号：２８）
ｈＡ１９ＶＨＢ ５'−ＣＧＴＡＧＴＣＴＣＣ ＣＧＴＣＴＴＧＣＡＣ ＡＡＧＡＡＴＡＧＡＡ ＣＧＣＴＧＴＧＴＣＣ ＴＣＡＧＡＴＣＧＴＡ ＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧ ＴＴＣＣＡＴＧＴＡＧ ＧＣＴＧＴＡＴＴＡＧ ＴＧＧＡＴＴＣＧＴＣ ＧＧＣＡＧＴＡＡＴＡ ＧＴＧＧＣＧＣＧＣＣ ＣＣＴＴＧＡＡＣＴＴ ＴＣＣＡＴＴＧＴＡ−３'（配列番号：２９）
ｈＡ１９ＶＨＢａｃｋ ５'−ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣ ＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣ ＡＧＧ
ＧＧＣＴＧＡＡ ＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣ ＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧ ＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣ ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴ ＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧ ＣＴＴＴＣＡＧＴＡＧ Ｃ−３’（配列番号：３０）
ｈＡ１９ＶＨＦｏｒ ５'−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧ ＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧ ＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣ ＣＣＡＧＴＡＧＴＣＣ ＡＴＡＧＣＡＴＡＧＴ ＡＡＴＡＡＣＧＧＣＣ ＴＡＣＣＧＴＣＧＴＡ ＧＴＣＴＣＣＣＧＴＣ ＴＴＧＣＡＣＡＡＧ−３'（配列番号：３１）
本発明は、例示のためのみに提供される以下の実施例を参照することにより、さらに説明される。本発明は実施例に限定されるのではなく、本明細書で提供される教示から明らかなすべての変更を包含する。
実施例１．ヒト化抗ＣＤ１９抗体の構築
キメラＡ１９（ｃＡ１９）抗体を作製し、Ｓｐ２／０細胞内で発現させた。ｃＡ１９のＶｋ（配列番号：１および配列番号：３）およびＶＨ（配列番号：３および配列番号：４）配列を図１に示す。ｃＡ１９抗体は、Ｒａｊｉ、ＤａｕｄｉおよびＲａｍｏｓのようなＣＤ１９＋ヒトリンパ腫細胞系と結合することが示された。他の抗ＣＤ１９抗体、例えば、Ｂ４（Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＢＵ１２（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ）に対する細胞表面競合結合アッセイにより、精製ｃＡ１９のＡｇ結合特異性を評価した。簡潔には、様々な濃度のｃＡ１９を、一定量のＩ−１２５放射標識抗ＣＤ１９抗体の存在下でＲａｊｉ細胞と１時間インキュベートした。洗浄して未結合抗体を除去した後、細胞表面に結合した放射標識抗体を、ガンマカウンターで細胞ペレットを計数することにより定量化した。図２に示されるように、ｃＡ１９は細胞表面結合に関してＢＵ１２（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ）と競合したが、このことは、この抗体がＣＤ１９分子と同様のまたは重複するエピトープを共有することを示している。
ヒト化抗ｈＣＤ１９抗体（ｈＡ１９）をコードする軽鎖および重鎖可変領域配列を設計し構築した。ｃＡ１９の可変（Ｖ）領域フレームワーク（ＦＲ）配列（図１Ａおよび１Ｂ）をＫａｂａｔデータベース内の登録ヒト抗体と比較したところ、ｃＡ１９ＶＫのＦＲがヒト抗体ＲＥＩ（ＶＫ）のＦＲと高度の配列相同性を示すのに対し、ＶＨ配列はヒト抗体ＥＵ（ＶＨ）のＦＲと最も密接に関連していることが示された。しかし、ヒト抗体ＮＥＷＭのＶＨ ＦＲ４配列はｃＡ１９のＦＲとよりよくアラインされ、Ａ１９重鎖ヒト化のためのＥＵ ＦＲ４配列と置き換えるために使用した（図３Ｂ）。したがって、ヒトＲＥＩフレームワーク配列をＶｋのために使用し（図３Ａ）、ＥＵおよびＮＥＷＭフレームワーク配列の組合せをＶＨのために使用した（図３Ｂ）。最初のヒト抗体フレームワークと比べた場合、ＣＤＲ領域外の各鎖には数多くのアミノ酸変化が存在する。これらの残基は、ＶＫの４Ｌ、３９Ｉ、５８Ｉ、６ＯＰ、８７Ｈ、１０ＯＧおよび１０７Ｋ（図３Ａ）ならびにＶＨの１０８Ｔ（図３Ｂ）である。ｈＡ１９ＶＫおよびＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列をそれぞれ図４Ａおよび４Ｂに示す。
実施例２．ｈＡ１９抗体の構築法
ＣＤＲ結合ｈＡ１９ＶＨおよびＶＫの遺伝子を操作するために、Ｌｅｕｎｇら（１９９５）の記載による方法の変法を用いて、長いオリゴヌクレオチド合成とＰＣＲの組合せを使用して、ｈＡ１９の設計されたＶＫおよびＶＨ遺伝子を構築した。簡潔には、Ｖ配列の５'−（センス鎖、Ａと称する）および３'−ハーフ（アンチセンス鎖、Ｂと称する）に相当する２つの長い合成オリゴヌクレオチド（長さ約１３０ｍｅｒ）をＰＣＲ反応の鋳型として使用する。長いオリゴヌクレオチドＡおよびＢの３'−末端配列を、互いが重複し、かつ相補的になるように設計する。ＡおよびＢの３'−末端をアニーリングして、残りの長いオリゴヌクレオチド（一本鎖）が隣接する短い二本鎖ＤＮＡを形成することによりＰＣＲを開始した。各アニール末端が一本鎖ＤＮＡ複製のためのプライマーとして働く結果、ＡおよびＢが伸長して二本鎖ＤＮＡを形成する。２つの短いオリゴヌクレオチドプライマーの存在下、二本鎖ＤＮＡのＰＣＲ増幅によりＶ遺伝子セグメントを生成する。
重鎖
ｈＡ１９ＶＨドメイン構築のために、長いオリゴヌクレオチドｈＡ１９ＶＨＡ（配列番号：２８、１２６ｍｅｒ）およびｈＡ１９ＶＨＢ（配列番号：２９、１２８ｍｅｒ）を自動ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ）で合成した。ｈＡ１９ＶＨＡはｈＡ１９ＶＨドメインのヌクレオチド７４〜１２６に相当し、ｈＡ１９ＶＨＢはヌクレオチド１７８〜３０６に相補的なｈＡ１９ＶＨドメインのマイナス鎖に相当する。ｈＡ１９ＶＨＡとＶＨＢの３'−末端配列（３３ヌクレオチド残基）は互いに相補的である。最小量のｈＡ１９ＶＨＡおよびＶＨＢ（実験的に決定）を、１０μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ８．３、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２μｍｏｌのｈＡ１９ＶＨＢａｃｋ（５’−ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣ ＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣ ＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡ ＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣ ＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧ ＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣ ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴ ＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧ ＣＴＴＴＣＡＧＴＡＧ Ｃ−３' 配列番号：３０）およびｈＡ１９ＶＨＦｏｒ（５'−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧ ＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧ ＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣ ＣＣＡＧＴＡＧＴＣＣ ＡＴＡＧＣＡＴＡＧＴ ＡＡＴＡＡＣＧＧＣＣ ＴＡＣＣＧＴＣＧＴＡ ＧＴＣＴＣＣＣＧＴＣ ＴＴＧＣＡＣＡＡＧ−３' 配列番号：３１）ならびに２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）の存在下で増幅した。図４Ｂで示されるように、下線部はサブクローニングのための制限部位である。この反応混合物を、９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１．５分間のポリメライゼーションからなるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）３サイクルに供した。この処置の後に、９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリングおよび７２℃で１分間のポリメライゼーションからなるＰＣＲ反応を２７サイクル行った。得られたＤＮＡフラグメントは、予想された分子サイズをアガロースゲル電気泳動において示した。ｈＡ１９ＶＨの二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＰｓｔIおよびＢｓｔＥＩＩ制限酵素で制限消化し、重鎖ステージングベクターＶＨｐＢＳ２の相補的ＰｓｔI／ＢｓｔＥＩＩ制限部位中にクローニングし、ここで翻訳開始コドンおよび分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が５'末端にインフレームで連結され、イントロン配列が３’末端で連結されて、ＶＨ配列が完全に組み立てられた。ＶＨｐＢＳ２は、ＶＨｐＢＳ（Ｌｅｕｎｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））の改変ステージングベクターであり、この中にＸｈｏI制限部位を翻訳開始コドンの１６塩基上流に導入して、次のサブクローニングの段階を容易にした。ＩｇＨエンハンサーおよびＭＴ１プロモーターの制御下で、ヒトＩｇＧの重および軽両鎖の発現カセットの他に選択および増幅のためのマーカーとしてマウスｄｈｆｒ遺伝子を含む発現ベクターｐｄＨＬ２中に、組み立てられたＶＨ遺伝子をＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素フラグメントとしてサブクローニングした（図４Ｂ）。ｐｄＨＬ２の重鎖領域はＢａｍＨＩ制限部位を欠くため、この連結には、可変鎖のＢａｍＨＩ部位とｐｄＨＬ２ベクター内に存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に架橋を施すためにリンカーを使用する必要がある。得られた発現ベクターをｈＡＩ９ＶＨｐｄＨＬ２と命名した。
ヒト化ＶＫ配列の完全長ＤＮＡ構築のために、ｈＡ１９ＶｋＡ（配列番号：２４、１２６ｍｅｒ、ｈＡ１９ＶＫドメインのヌクレオチド６１〜１８６に相当する）およびｈＡ１９ＶｋＢ（配列番号：２５、１２４ｍｅｒ、ヌクレオチド１５７〜２８１に相補的なｈＡ１９ＶＫドメインのマイナス鎖に相当する）を上記のように合成した。ｈＡ１９ＶｋＡおよびＶｋＢを上記のように、２つの短いオリゴヌクレオチドｈＡ１９ＶｋＢａｃｋ（５'−ＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣ ＴＧＣＡＧＣＡＡＴＣ ＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡ ＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣ ＣＴＧＧＧＴＣＡＴＣＧ ＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣ ＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴ ＴＣＴＧＧＣＴＡＣＧ ＣＴＴＴＣＡＧＴＡＧ Ｃ−３’ 配列番号：３０）およびｈＡ１９ＶｋＦｏｒ（５'−ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧ ＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧ ＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣ ＣＣＡＧＴＡＧＴＣＣ ＡＴＡＧＣＡＴＡＧＴ ＡＡＴＡＡＣＧＧＣＣ ＴＡＣＣＧＴＣＧＴＡ ＧＴＣＴＣＣＣＧＴＣ ＴＴＧＣＡＣＡＡＧ−３' 配列番号：３１）により増幅した。以下に記載のように、下線部はサブクローニングのための制限部位である。ゲル精製したｈＡ１９ＶＫのＰＣＲ産物をＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで制限消化し、軽鎖ステージングベクターＶｋｐＢＲ２の相補的ＰｖｕＩＩ／ＢｃｌＩ部位中にクローニングした。ＶｋｐＢＲ２は、ＶｋｐＢＲ（Ｌｅｕｎｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３：４６９（１９９４））の改変ステージングベクターであり、この中にＸｈｏI制限部位を翻訳開始コドンの１６塩基上流に導入した。組み立てられたＶＫ遺伝子を、ＶＨ配列を含む発現ベクターｈＡ１９ＶＨｐｄＨＬ２中にＸｂａI−ＢａｍＨＩ制限酵素フラグメントとしてサブクローニングした。得られた発現ベクターをｈＡ１９ｐｄＨＬ２と命名した。
実施例３．トランスフェクションおよびｈＡ１９抗体発現
ｈＡ１９用の発現ベクター約３０μｇをＳａｌIでの消化により直線化し、エレクトロポレーション（４５０Ｖおよび２５Ｊ−μＦ）によりＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を９６ウェルプレート内に２日間播き、次いで、培地にＭＴＸを最終濃度０．０７５μＭで添加することにより薬剤耐性に関して選択した。２〜３週間後にＭＴＸ耐性コロニーがウェル内に出現した。選択で生き残ったコロニーの上清を、ヒトＭＡｂ分泌に関してＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングした。簡潔には、ＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント特異的Ａｂをプレコートしたマイクロタイタープレートのウェルに上清１００μｌを添加し、室温で１時間インキュベートした。緩衝液（０．０５％ポリソルベート２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄して未結合タンパク質を除去した。ＨＲＰとコンジュゲートしたＧＡＨ−ＩｇＧ、Ｆｃフラグメント特異的Ａｂをウェルに添加した。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄した。４ｍＭ ＯＰＤおよび０．０４％Ｈ２０２を含む基質溶液を添加した後、Ａ４９０ｎｍを読み取ることにより、結合したＨＲＰコンジュゲートＡｂを明らかにした。陽性細胞クローンを拡張し、ｈＢ４３をプロテインＡカラムでのアフィニティクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。
実施例４．抗ＣＤ１９抗体の抗原結合特異性および親和性の測定
プロテインＡカラムでのアフィニティクロマトグラフィーにより精製したｃＡ１９およびｈＡ１９のＡｇ結合特異性を、細胞表面競合結合アッセイにより評価および比較した。簡潔には、一定量（１００，０００ｃｐｍ、〜１０μＣｉ／μｇ）の１２５Ｉ標識ｃＡ１９またはｈＡ１９を様々な濃度（０．２〜７００ｎＭ）のｃＡ１９またはｈＡ１９の存在下、Ｒａｊｉ細胞と４℃で１〜２時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄することにより未結合Ａｂｓを除去した。洗浄後、細胞に付随する放射活性を測定した。図２に示されるように、精製ｈＡ１９は細胞表面結合に関して１２５Ｉ標識ｃＡ１９と競合し、その逆も同じであったが、このことは、見かけの結合親和力がこれら２つのＡｂ間で比較可能であることを示している。
ｈＡ１９の抗原結合親和性（結合力）定数を、放射標識Ａｂの直接的細胞表面結合アッセイおよびスキャッチャードプロット解析により決定し、ｃＡ１９のものと比較した。簡潔には、ｈＡ１９およびｃＡ１９をクロラミンＴ法により１２５Ｉで標識した。様々な量の１２５Ｉ−ｈＡ１９または１２５Ｉ−ｃＡ１９を２×１０５個のＲａｊｉ細胞と４℃で２時間インキュベートし、未結合抗体を洗浄により除去した。細胞付随の放射活性をカウントし、スキャッチャードプロットを行って、細胞当たりのｈＡ１９およびｃＡ１９結合部位の最大数および平衡結合の見かけの解離定数を測定した。図５に示されるように、ｈＡ１９はｃＡ１９と実質的に同じ結合親和性を示した。これら２抗体の見かけの解離定数値はそれぞれ、１．１および１．２ｎＭと算出された。
実施例５．ｈＡ１９の配列バリアント
上記実施例２に記載のヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂ（ｈＡ１９）は、Ｓｐ２／０細胞内で発現されたが、得られたクローンの生産性は低かった。数多くのトランスフェクション（総数１５）を行い、何百ものクローンをスクリーニングした。陽性クローンの生産性は、０．５〜３μｇ／ｍｌにとどまり、メトトレキサートによる増幅は対象クローンの生産性を向上させなかった。
ＡＴ含有量低下のためのＶｋ遺伝子配列改変
より生産性の高いｈＡ１９クローンを作製するために２つのアプローチを用いた。第一のアプローチ（ｈＡ１９ＶｋｐｄＨＬ２）は、Ａｂ遺伝子発現に負の影響を及ぼすと推定されるＡＴ含有量を低下させるために、ｈＡ１９Ｖｋ遺伝子配列を再設計することであった。新たなｈＡ１９Ｖｋ遺伝子を合成し、組み立て、ｈＡ１９用の発現ベクターの再構築に使用した。
ｈＡ１９ＶｋｐｄＨＬ２構築を完了し、ＤＮＡ配列決定により配列が正しいことを確認した後、マキシプレップを行ってトランスフェクション用のプラスミドを調製した。３つのトランスフェクションを行った：＃７３９（ｈＡ１９ＶｋｐｄＨＬ２＃１）、＃７４０（ｈＡ１９ＶｋｐｄＨＬ２＃５）および＃７４１（ｈＢ４３ｐｄＨＬ２＃ｌ）。ＳＰ−Ｅ２６細胞および１０μｇのＳａｌI直線化ＤＮＡを用いた。ＭＴＸ選択（０．０７５μＭ）をエレクトロポレーションの４８時間後に開始した。ＥＬＩＳＡを用いて陽性クローンに関してトランスフェクションをスクリーニングした。トランスフェクション＃７３９により３１個の陽性クローンが生じ（１３個が選択された）、＃７４０により４９個の陽性クローンが生じ（１３個が選択された）、＃７４１により４１個の陽性クローンが生じた（１９個が選択された）。ＥＬＩＳＡにより生産性の測定および観測を行い、生産性は０．５〜３μｇ／ｍｌの範囲であったが、これは元のｈＡ１９構築物で見られたものと同じであった。
２つの無血清トランスフェクションを行った：＃７４６（ｈＡ１９ＶｋｐｄＨＬ２＃１）および＃７４７（ｈＢ４３ｐｄＨＬ２＃１）。ＳＰ−ＥＳＦ細胞および１０μｇのＳａｌI直線化ＤＮＡを両トランスフェクションに使用した。ＭＴＸ選択（０．０７５μＭ）をエレクトロポレーションの４８時間後に開始した。トランスフェクション＃７４６により９個の陽性クローンが生じ、＃７４７により６個の陽性クローンが生じた。陽性クローンを４８ウェルプレートに拡張し、０．２μＭ ＭＴＸまで増幅した。トランスフェクション＃７３９、＃７４０および＃７４１由来の４５個のクローンを１２個にまで絞り（１．０μｇ／ｍｌ超のＥＬＩＳＡ読取りに基づく）、ＭＴＸを０．１５μＭまで増加させた。無血清クローンの初期ｐｍａｘを測定し、生産性は血清培地中のクローンと同様であった（０．５〜１．５μｇ／ｍｌ）。
さらに２つの血清トランスフェクションを行った：＃７５６（ｈＡ１９ＶｋｐｄＨＬ２＃５）および＃７５７（ｈＢ４３ｐｄＨＬ２＃１）。トランスフェクションの条件は上記と同じであったが、増殖の遅いクローンでは、ｐｍａｘが上昇するか否かが明らかになる
ように時間を設けた。トランスフェクション＃７５６では１９個の陽性クローンが生じ、＃７５７では８個の陽性クローンが生じた。トランスフェクション＃７５６および＃７５７のｐｍａｘをトランスフェクション＃７３９、＃７４０、＃７４１、＃７４６および＃７４７と比較した。生産性にはあまり差がなかった（約０．５〜３μｇ／ｍｌ）。最も生産性の高いものを選択し（７３９．１Ａ９、７４０．１Ｂ１および７５６．２Ｇ７）、０．２μＭ ＭＴＸまで増幅した。表２に報告されている結果は、２〜３μｇ／ｍｌの間の平均抗体生産性を示す。
Figure 2015212278
Figure 2015212278
細胞ベースの抗体依存性細胞傷害性アッセイ
再設計されたベクターが活性な抗体を産生するか否かを判定するために、プロテインＡ精製により２リットルのクローン７５６．２Ｇ７を精製した。精製により７．３ｍｇの抗ＣＤ１９Ａｂが得られた。ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製タンパク質が純粋であることが示された（未掲載）。この精製タンパク質を用いて、細胞の増殖および死に対する抗体治療の効果を調べた。細胞ベースの抗体依存性細胞傷害性アッセイを行い、ｈＡ１９、ｈＡ２０およびｈＬＬ２をＧＡＨ ＩｇＧおよびＦｃフラグメント有りおよび無しで比較した。Ｄａｕｄｉ Ｄ１−１およびＳＰ−Ｅ２６細胞を２つの４８ウェルプレートに最終密度１５０，０００細胞／ｍｌで蒔いた。ｈＡ１９、ｈＡ２０およびｈＬＬ２をＧＡＨ有り（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）および無し両方の完全培地（Ｄ１−１ではＲＰＭＩおよびＳＰ−Ｅ２６ではＳＦＭ）で希釈した（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）。Ａｂ混合物をプレートに添加し、振とう器上に数分間置き、次いで、インキュベーター内に置いた。３および４日目にＭＴＴを行った。３日目の結果では、ＳＰ−Ｅ２６細胞における細胞増殖の違いはなかった。Ｄ１−１細胞では、ｈＡ１９＋ＧＡＨおよびｈＡ２０＋ＧＡＨにおいて細胞増殖の阻害が見られた。これらの結果は、再設計されたｈＡ１９が活性であることを示している。
ｈＡ１９ＦｐｄＨＬ２
第二のアプローチ（ｈＡ１９ＦｐｄＨＬ２）は、ｈＡ１９ＶＨ遺伝子を再設計して重鎖（ＶＨ）フレームワーク領域のアミノ酸残基セリン９１をコンセンサスフェニルアラニン残基で置換することであった。ｈＡ１９ＶＨｐｄＨＬ２中のＳ９１に対するＴＣＴコドンをｈＡ１９ＦＶＨｐｄＨＬ２中のＦ９１に対するＴＴＣコドンに変えた。新たなｈＡ１９Ｆ遺伝子を合成し、組み立て、ｈＡ１９用の発現ベクターの再構築に使用した。
ｈＡ１９ＦｐｄＨＬ２構築を完了し、ＤＮＡ配列決定により配列が正確であることを確認した後、マキシプレップを行ってトランスフェクション用のプラスミドを調製した。２つのトランスフェクションを行った：＃７６２（ｈＡ１９ＦｐｄＨＬ２＃２）および＃７６３（ｈＡ１９ＦｐｄＨＬ２＃３）。トランスフェクションの条件は、トランスフェクション＃７３９、＃７４０および＃７４１と同じであった。両トランスフェクションを、ＥＬＩＳＡを用いて陽性クローンに関してスクリーニングした。トランスフェクション＃７６２により１３個の陽性クローンが生じ（８個が選択された）、＃７４３により１８個の陽性クローンが生じた（１６個が選択された）。初期生産性をＥＬＩＳＡにより測定し、表３に示した。
Figure 2015212278
宿主細胞を新たなベクターでトランスフェクションすることにより、１００個を超える陽性クローンが得られた。発明者らは評価用に３０個のクローンを無作為に選択した。これらのクローンの大部分は、細胞培養中において５〜２５ｍｇ／ＬのＩｇＧの抗体産生量であると推定された。これは、先に作製されたクローンの１〜２ｍｇ／Ｌの範囲にあった細胞培養生産性とは対照的である。したがって、Ｓｅｒ９１Ｐｈｅの置換の結果、抗体産生が約１０倍増加するというｈＡ１９抗体発現レベルの著しい増加が得られたと発明者らは結論する。この驚くべき予想外の結果により、哺乳動物細胞株での発現を用いて、実質的にかなり多量の抗体タンパク質の産生が細胞培養において可能となる。
実施例６．非ホジキンリンパ腫の治療
緩徐進行性の濾胞細胞性ＮＨＬを有する患者は、デキサメタゾンを含めた化学療法後に再発し、胸部（大動脈傍リンパ節）疾患、腫大し侵襲された脾臓および腫大頸部リンパ節を有する。患者には、週１回で４週間、ヒト化抗ＣＤ２０ＭＡｂ（ｈＡ２０）と組み合わせて、各３００ｍｇ／ｍ２の治療単位のｈＡ１９ＭＡｂを連続して同一日に静脈内注入で投与し、毎回、注入に付随する反応抑制のためにＴＹＬＥＮＯＬ（登録商標）およびＢＥＮＡＤＲＹＬ（登録商標）を標準的な公表されている用量に従って前投与する。４週間後、患者は最初のフォローアップ検査のために戻り、触知可能なリンパ節が一部軟化していることが診察されるだけである。最初の治療サイクルの３ヵ月後に戻った際に、患者の胸部疾患が４０％減少したことがＣＴスキャンで見てとれ、脾臓が治療前の約半分のサイズであり、頸部リンパ節はほとんどなくなっている。次いで、患者は再治療サイクルを受け、さらに３ヵ月後、膵臓サイズは正常、触知可能なまたはＣＴスキャンで測定可能な頸部リンパ節は無く、胸部には１．５ｃｍの小さい病変のみであることが見てとれる。患者は、疾患がほぼ無いと見てとれるまでさらに４ヶ月続ける。
上述のものは特定の好適な実施形態を述べたものであり、本発明はそのように限定されないことが理解されるであろう。本開示の実施形態に対して様々な改変が施され得ること、そしてそのような改変は、以下の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内にあるものとすることを、当業者は想起するであろう。
本明細書に引用されているすべての刊行物および特許出願および特許は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の好適な実施形態は以下の通りである。
［１］ヒト化抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記ヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメントが、ＣＤ１９との結合に関して、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１ ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号：１６）；ＣＤＲ２ ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号：１７）；およびＣＤＲ３ ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号：１８）ならびに重鎖ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１ ＳＹＷＭＮ（配列番号：１９）；ＣＤＲ２ ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号：２０）およびＣＤＲ３ ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：２１）を含むキメラ抗ＣＤ１９抗体と競合する、ヒト化抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合フラグメント。
［２］前記ヒト化抗ＣＤ１９抗体が、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１ ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号：１６）；ＣＤＲ２ ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号：１７）；およびＣＤＲ３ ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号：１８）ならびに重鎖ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１ ＳＹＷＭＮ（配列番号：１９）；ＣＤＲ２ ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号：２０）およびＣＤＲ３ ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：２１）を含む、［１］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント
。
［３］前記抗体またはフラグメントが、ｈＡ１９ＶＫ（配列番号：７）およびｈＡ１９ＶＨ（配列番号：１０）の配列を含む、［１］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント。
［４］前記抗体またはフラグメントが、ヒト抗体フレームワーク（ＦＲ）および定常領域配列を含む、［２］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント。
［５］前記ヒト化抗体が、親マウス抗体の対応するフレームワーク領域配列から置換された１つまたは複数のフレームワーク領域アミノ酸残基を含む、［４］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント。
［６］前記置換ＦＲアミノ酸残基が、重鎖可変領域のアミノ酸残基５、２７、２８、４０、４８、９１、９４、１０７および１０８ならびに軽鎖可変領域の残基４、３９、５８、６０、８７、１００および１０７からなる群より選択される、［５］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント。
［７］前記置換ＦＲアミノ酸残基がＳｅｒ９１Ｐｈｅ置換である、［５］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント。
［８］前記ＶＨ残基９１におけるセリンのフェニルアラニンへの置換により、細胞培養中の抗ＣＤ１９抗体の発現レベルが増加する、［７］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント。
［９］前記ＶＨ残基９１におけるセリンのフェニルアラニンへの置換により、細胞培養中の抗ＣＤ１９抗体の発現レベルが１０倍増加する、［７］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント。
［１０］Ｂ細胞リンパ腫、白血病および自己免疫疾患からなる群より選択されるＢ細胞疾患を有する対象に、［１］に記載のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメントを投与することを含む、Ｂ細胞疾患の治療法。
［１１］前記ヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメントが、裸の抗体またはフラグメントである、［１０］に記載の方法。
［１２］ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６６（ａ〜ｄ）、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Ｉｉ、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＩＬ−６、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）と反応する少なくとも１つの治療有効量のヒト化、キメラ、ヒトまたはマウスＭＡｂを、前記対象に同時または順次投与することをさらに含む、［１１］に記載の方法。
［１３］少なくとも１つの治療有効量の治療薬を、前記対象に同時または順次投与することをさらに含む、［１１］に記載の方法。
［１４］前記ヒト化抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメントが、少なくとも１つの治療薬または診断薬とコンジュゲートされている、［１０］に記載の方法。
［１５］前記治療薬または診断薬が、細胞毒性薬、放射性核種、免疫調節薬、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチドおよび光活性治療薬からなる群より選択される、［１４］に記載の方法。
［１６］前記細胞毒性薬が薬物または毒素である、［１５］に記載の方法。
［１７］前記免疫調節薬が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンからなる群より選択される、［１５］に記載の方法。
［１８］前記リンホトキシンが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）であり、前記造血因子がインターロイキン（ＩＬ）であり、前記コロニー刺激因子が顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であり、前記インターフェロンがインターフェロン−アルファ、−ベータまたは−ガンマであり、かつ前記幹細胞増殖因子がＳ１因子である、［１７］に記載の方法。
［１９］前記ヒト化抗ＣＤ１９ＭＡｂまたはそのフラグメントが、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６６（ａ〜ｄ）、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Ｉｉ、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＩＬ−６、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）もしくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）と結合するその他の抗体またはそのフラグメントを少なくとも１つ含む、二重特異性もしくは多重特異性抗体またはそのフラグメントの一部として投与される、［１０］に記載の方法。
［２０］対象におけるＢ細胞疾患の診断法であって、
ａ）前記抗体またはそのフラグメントが少なくとも１つの診断薬とコンジュゲートされている［１］に記載の抗体またはそのフラグメントを、前記対象に投与することと、
ｂ）前記抗体またはフラグメントと１つまたは複数のＢ細胞との結合を検出し、結合が前記対象におけるＢ細胞疾患の存在を示すことと
を含む診断法。
［２１］前記疾患がリンパ腫または白血病または自己免疫疾患である、［２０］に記載の方法。
［２２］前記診断薬が、放射性標識、光活性診断薬、超音波造影剤または非放射性標識である、［２０］に記載の方法。

Claims (9)

  1. ａ）軽鎖可変領域のｈＡ１９ＶＫ（配列番号：７）のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域（ＶＨ）のｈＡ１９ＶＨ（配列番号：１０）のアミノ酸配列において、配列番号：１０の９５位におけるフェニルアラニンがセリンへ置換されたアミノ酸配列を含む、第一のヒト化抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
    ＣＤ１９との結合に関して、軽鎖相補性決定領域ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１ ＫＡＳＱＳＶＤＹＤＧＤＳＹＬＮ（配列番号：１６）；ＣＤＲ２ ＤＡＳＮＬＶＳ（配列番号：１７）；およびＣＤＲ３ ＱＱＳＴＥＤＰＷＴ（配列番号：１８）ならびに重鎖ＣＤＲ配列であるＣＤＲ１ ＳＹＷＭＮ（配列番号：１９）；ＣＤＲ２ ＱＩＷＰＧＤＧＤＴＮＹＮＧＫＦＫＧ（配列番号：２０）およびＣＤＲ３ ＲＥＴＴＴＶＧＲＹＹＹＡＭＤＹ（配列番号：２１）を含むキメラ抗ＣＤ１９抗体と競合する、ヒト化抗ＣＤ１９抗体またはその抗原結合フラグメントと、
    ｂ）第二のヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント
    とを含む、二重特異性抗体。
  2. 第二の抗体が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６６（ａ〜ｄ）、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Ｉｉ、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＩＬ−６、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）からなる群から選択される抗体に結合する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 第二の抗体がＣＤ３に結合する、請求項１に記載の二重特異性抗体。
  4. Ｂ細胞疾患の治療薬であって、
    請求項１に記載の二重特異性抗体を含み、
    Ｂ細胞リンパ腫、白血病および自己免疫疾患からなる群より選択されるＢ細胞疾患を有する対象に投与される、治療薬。
  5. ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６６（ａ〜ｄ）、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ〜ｄ、壊死抗原、Ｉｉ、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＣ、ＩＬ−６、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）またはＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）と反応する、治療有効量の少なくとも１つのヒト化、キメラ、ヒトまたはマウスモノクローナル抗体を前記対象に同時または順次投与される、請求項４に記載の治療薬。
  6. 細胞毒性薬、免疫調節薬、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチドおよび光活性治療薬からなる群より選択される少なくとも１つの治療有効量のその他の治療薬が、前記対象に同時または順次投与される、請求項４に記載の治療薬。
  7. 二重特異性抗体が、細胞毒性薬、放射性核種、免疫調節薬、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチドおよび光活性治療薬のうち少なくとも１つとコンジュゲートされている、請求項４に記載の治療薬。
  8. 前記細胞毒性薬が薬物または毒素であり、前記免疫調節薬が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンからなる群より選択される、請求項６または７に記載の治療薬。
  9. 対象におけるＢ細胞疾患の診断に用いるための診断薬であって、
    放射性標識、光活性診断薬、超音波造影剤または非放射性標識からなる群から選ばれる少なくとも１つとコンジュゲートされている請求項１に記載の二重特異性抗体を含み、
    該診断薬が対象に投与され、前記抗体またはその抗原結合フラグメントと１つまたは複数のＢ細胞との結合が検出された場合、前記結合により前記対象におけるＢ細胞疾患の存在が示される、診断薬。
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