KR20180058186A

KR20180058186A - 포크머리상자 o 3 단백질의 용도

Info

Publication number: KR20180058186A
Application number: KR1020170143493A
Authority: KR
Inventors: 백융기; 신헌
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2018-05-31
Also published as: KR101994821B1

Abstract

본 발명에 따르면 포크머리상자 O 3 단백질(FOXO3), 특히 FOXO3 단백질의 당화여부를 이용하여, 항암제 스크리닝, 항암 치료 및 항암 치료 후 예후 예측에 이용하여, 항암 치료효과를 높이고, 나아가 우수한 항암제를 스크리닝하는데 활용할 수 있다.

Description

포크머리상자 O 3 단백질의 용도{USE OF FORKHEAD BOX O 3 PROTEIN}

본 발명은 포크머리상자 O 3 단백질(FOXO3), 특히 FOXO3 단백질의 당화여부를 이용하여, 항암제 스크리닝, 항암 치료 및 항암 치료 후 예후 예측에 이용하는 그 용도에 관한 것이다.

미국 암 학회에 따르면 매년 166만 명의 새로운 환자가 발생되고 연간 58만명이 암 관련 요인으로 사망하게 된다. 이 중 췌장암은 세계적에서 9번째로 많이 발병되는 암으로 사망률 4위를 차지할 만큼 위험률이 높은 악성 종양이다(American Cancer Society, Cancer facts and figures, 2016). 췌장암은 5년 생존율이 5% 미만으로 초기 진단이 어려워 80% 이상의 환자가 종양이 진행된 단계에서 발견된다(Lahoud MJ, et al., World J Gastrointest Oncol., 599-606, 2016).

췌장암은 한국에서도 사망률이 5번째로 높은 암으로 5년 생존율이 7~8% 정도에 불가한 데다, 다른 암들과 비교 시 생존율이 매우 낮아지는 경향을 보인다. 췌장암은 정확한 조기진단 마커가 없어, 상당히 진행되기 전까지는 증상조차 없어 일단 췌장암이 진단되면 수술이 불가능한 경우가 많다. 또한 수술이 가능한 경우에도 수술한 환자의 80~90%가 재발하고 사망에 이르게 된다.

간암은 주로 아프리카와 아시아 등에서 많이 발병하는 암으로 세계적으로 6번째로 발병되며 사망률 4번째로 높다. 암 진단 후 환자의 95% 이상이 5년이내에 사망하는 것으로 알려져 있다 간암은 통증 황달, 식욕부진, 체중감소 등을 동반한다.

위암은 위장 점막 조직에서 발생한 세포가 선암성 변화를 보이면서 악성 궤양을 만드는 암으로 선진국에서는 그 발생이 꾸준히 감소하고 있으나 여전히 발생률 2위이며, 세계적으로 암 관련 사망의 일반적 원인 중의 하나로 알려져 있다.

한편, 포크머리상자 O 3(Forkhead box O 3: FOXO3)은, 인슐린 유사 생장 인자 경로(Insulin-like growth factor signaling pathway)의 최하위에서 작용하는 전사 인자(Transcription factor)이다. 인슐린 수용체(Insulin receptor)에 인슐린이 결합하면 AKT에 의해 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 세린(serine)/트레오닌(threonine) 잔기가 인산화(Phosphorylation) 된다. AKT에 의한 FOXO3의 인산화는 세포핵으로의 진입을 막고 이에 의해 포크머리상자 O 3(FOXO3) 의존적인 하위 유전자의 발현을 막는다. 반대로 성장 인자의 부제 혹은 세포의 스트레스 조건에서는 포크머리상자 O 3(FOXO3)가 탈인산화되어 핵 안으로 들어가서 하위 유전자를 발현 시킨다(Martins R, et al., Aging Cell, 196-207, 2016).

포크머리상자 O 3(FOXO3)는 유방암(Lin H, et al., PLoS One, 2010), 흑색종(Segura MF, et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1814-1819, 2009), 전립선암(Shukla S, et al., Int J Oncol., 1613-20, 2009), 폐암(Liu H. et. al., Anticancer Drugs., 898-907, 2014), 신장암(Lee J et al., Biosci Biotechnol Biochem, 1947-53, 2016) 등 다양한 종양에 영향을 미친다고 알려져 있으며, 암에서는 종양억제자(Tumor suppressor)로써 작용을 한다(Coomans de Brachene A., Cell Mol Life Sci., 1159-72, 2016).

O-GlcNAc 당화는 세포내의 단백질의 세린/트레오닌 잔기에 작용하는 전사 후 번역 변이(post translational modification: PTM)의 한 종류이다. 이는 OGT(O-GlcNAc transferase)에 의해 일어나며 OGT가 단백질의 세린/트레오닌 잔기에 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine)을 붙여 당쇄화 하는 작용이다. O-GlcNAc 당화는 세포 내 단백질의 인산화 지점을 공유 할 수 있으며 경쟁적으로 작용할 수 있다. 이는 세포 내 다양한 신호전달, 단백질 발현, 단백질 분해, 단백질 수송 등에 영향을 미친다(Hart GW, et al., Nature, 1017-22, 2007)고 알려져 있지만, 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 O-GlcNAc 당화를 일으키는지, 그리고 이와 악성암과의 상관관계에 대하여는 알려진 바 없다.

암을 치료하기 위하여 수술요법 외에도 방사선 요법, 화학 요법 등이 시행되고 있지만 환자의 생존 기간에는 제한된 효과를 나타내는 경우가 대부분이다. 특히 치료제라고 불리는 약물의 경우, 여러 가지 연구 단계를 거친 후에도 임상이라는 사람을 대상으로 하는 연구를 통해서만 그 효능을 확인할 수 있다. 따라서 암 치료제의 효능 정도를 측정할 수 있는 분석 시스템의 개발은 매우 중요하다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 하는 것으로, 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하여 항암물질 스크리닝, 치료 예후를 예측, 및 개체의 항암제 감수성 확인할 수 있는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 항암물질을 스크리닝 할 수 있는 조성물 및 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 물질을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은, 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 여부를 조사하는 것을 포함하는 FOXO3 단백질의 수준을 분석하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것;을 포함하는 항암물질 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 항암물질 스크리닝용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것;을 포함하는 치료 예후를 예측하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 시료의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것;을 포함하는 개체의 항암제에 대한 감수성을 확인하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 물질을 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 측정하는 것을 포함하는 췌장암의 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에서는 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준은 암, 특히 간암, 위암 및 췌장암을 포함하는 악성암에 있어서 치료의 지표 및 타겟이 될 수 있음을 신규 하게 밝혔는바, 본 발명에 따르면 상기 당화 수준을 측정하여 항암제에 대한 감수성, 치료의 예후를 예측할 수 있고, 더 나아가 항암 활성을 갖는 물질을 스크리닝 할 수 있다. 또한, 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하거나 상기 당화를 특이적으로 저해할 수 있는 물질을 항암치료 예후 예측 이나 항암제로 활용할 수 있다.

도 1a는 췌장암 환자의 췌장 조직 중 비종양 부위(N : Non-tumor region)와 종양 부위(T : Tumor region)을 분리하여 전체 단백질의 O-GlcNAc수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과 및 그래프를 보여준다.
도 1b는 FOXO3 면역조직화학염색에 의한 췌장 조직의 일부 및 췌장암 환자의 조직에서 O-GlcNAc 당화 수준에 대한 H-점수 평가에 의한 분석결과를 나타낸다.
도 2a는 췌장암 환자의 췌장 조직 중 비종양 부위(N)와 종양 위(T)를 분리한 후 항-FOXO3 항체를 이용하여 면역 침전을 진행한 후, 각 시료에서 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 단백질의 발현 수준 및 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 과정을 나타내는 흐름도이다. 도 3a는 췌장암 환자 각각의 조직에서 O-GlcNAc 당화 수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다(n=12).
도 3b는 여러 조직에서의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 발현과 O-GlcNAc 당화 수준을 면역침강 및 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다(n=12).
도 4a 및 4b는 췌장암 세포주(HPDE, PANC-1, BxPC-3, HPAC)에서 포크머리상자 O 3(FOXO3) O-GlcNAc 당화 수준을 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 FOX-OV 세포주 형성 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 pH 분획 및 면역침강을 통해 FOX-OV 세포로부터 FOXO3를 정제하는 과정을 나타내는 흐름도이다.
도 6b는 PANC-1 세포주를 이용하여 포크머리상자 O 3(FOXO3) 과발현 세포를 제작하고 그 결과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 보여준다.
도 6c는 포크머리상자 O 3(FOXO3) 과발현 세포주에서 항-FOXO3 항체를 이용하여 면역 침전을 진행 한 후, OFFGEL 분류장치를 이용해서 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 분리를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 보여준다.
도 6d는 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 O 연결 당화 지점에 관한 모식도를 나타낸다.
도 7a는 PANC-1 세포주를 이용하여 포크머리상자 O 3(FOXO3) 당화 지점별 당화 불가 과발현 세포를 제작하고 그 결과를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다.
도 7b는 포크머리상자 O 3(FOXO3) 표적 유전자(FasL , MnSod , Nib , p27 및 p21)의 발현을 당화 지점별 당화 불가 과발현 세포 내에서 qRT-PCR로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7c는 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 S284지점의 당화 돌연변이 (FOX-S284A) 또는 인산화 돌연변이(FOX-S284D)를 포함한 세포주에서 p21의 발현 수준을 측정한 결과를 보여준다.
도 8a는 췌장암 세포주(PANC-1)에서 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 S284지점의 전사 후 변형에 따른 전체 세포의 수를 시간대별로 측정한 결과를 보여준다.
도 8b는 췌장암 세포주(PANC-1)에서 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 S284지점의 전사 후 변형에 따른 세포의 증식 비율을 WST-1 분석결과로 확인한 그래프이다.
도 8c는 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 S284지점의 전사 후 번역 변형에 따른 전체 세포의 수의 변화를 염색 및 570 nm에서 형광분석을 통해 확인한 결과를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 FOXO3 변이체(FOX-OV, FOX-S284A 또는 FOX-S284D)에 대한 FACS 세포 주기 분석의 결과를 나타낸다.
도 10a는 본 발명의 각 항암제(젬시타빈(Gem), 독소루비신(Dox), 악티노마이신 디(Act D), 파클리탁셀(Pac), 살리노마이신(Sal) 그리고 BG(benzyl-2-acetamido-2-deoxy-α-D-galactopyranoside, OGT 저해제))의 약물의 50 % 억제 효과가 관찰되는 IC₅₀값 농도를 확인한 결과이다: Gem, 92 μM; Dox, 68.5 μM; ActD, 380 nM; Pac, 104 μM; 및 Sal, 830 nM.
도 10b, 10c 및 10d는 췌장암치료제를 투여한 췌장암 세포의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질을 면역 침전 시킨 후, 항-O-GlcNAc 항체를 이용하여 FOXO3, p21, 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준의 변화를 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다.

포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하여 항암물질 스크리닝, 치료 예후를 예측, 개체의 항암제 감수성 확인 및 암 진단을 위한 정보의 제공을 할 수 있는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 항암물질을 스크리닝 할 수 있는 조성물 및 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 물질을 포함하는 항암용 조성물, 그리고 암 진단용 조성물 및 키트에 관한 것이다.

이하에서, 본 발명의 에 대하여 상세히 설명한다.

다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하여 증감여부를 이용해 항암 활성 평가, 항암제 감수성 및 항암 치료의 예후를 예측하는 것이 가능함을 확인 하였는바, 이러한 측면에서 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 여부를 조사하는 것을 포함하는 FOXO3 단백질의 수준을 분석하는 방법에 관한 것이다.

상기 O-GlcNAc 당화 여부는 공지의 기술을 이용하여 조사할 수 있고, 구체적으로 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 FOXO3 단백질에 특이적인 항체로 anti-FOXO3 : 75D8, D19A7(Cell signaling technology) 그리고 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체로 anti-O-GlcNAc(RL2) : ab2739(abcam)를 이용하여, FOXO3 단백질의 발현 및 O-GlcNAc 당화 여부를 확인 한 결과, 췌장암 환자의 종양조직 에서만 FOXO3 단백질의 발현이 높았고, O-GlcNAc 당화가 검출되는 것을 확인 하였다.

본 발명에서 포크머리상자 O 3(Forkhead box O 3; FOXO3) 단백질은 인슐린 유사 생장 인자 경로(Insulin-like growth factor signaling pathway)의 최하위에서 작용하는 전사 인자(Transcription factor)이다. 본 발명의 발명자들은 FOXO3 단백질이 췌장암, 위암, 간암 등의 고형암세포에서 과발현 함을 밝혔고, 이를 통해서 치료 타겟으로서 FOXO3 단백질에 대한 연구를 거듭한 결과, 암세포에서는 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화가 일어나는 것을 확인하여, 상기 당화 수준의 증감을 통해 암의 치료를 예측하거나 항암제를 스크리닝 할 수 있고, 나아가 암세포를 사멸시키는 치료 타겟이 될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화는 암세포주에서만 나타나는 것을 확인 하였는바, 본 발명은 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화의 유무 및 증감을 평가하여 암의 치료 효과를 예측할 수 있다.

본 발명에 따른 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것 일 수 있다.

[서열번호 1]

MAEAPASPAPLSPLEVELDPEFEPQSRPRSCTWPLQRPELQASPAKPSGETAADSMIPEEEDDEDDEDGGGRAGSAMAIGGGGGSGTLGSGLLLEDSARVLAPGGQDPGSGPATAAGGLSGGTQALLQPQQPLPPPQPGAAGGSGQPRKCSSRRNAWGNLSYADLITRAIESSPDKRLTLSQIYEWMVRCVPYFKDKGDSNSSAGWKNSIRHNLSLHSRFMRVQNEGTGKSSWWIINPDGGKSGKAPRRRAVSMDNSNKYTKSRGRAAKKKAALQTAPESADDSPSQLSKWPGSPTSRSSDELDAWTDFRSRTNSNASTVSGRLSPIMASTELDEVQDDDAPLSPMLYSSSASLSPSVSKPCTVELPRLTDMAGTMNLNDGLTENLMDDLLDNITLPPSQPSPTGGLMQRSSSFPYTTKGSGLGSPTSSFNSTVFGPSSLNSLRQSPMQTIQENKPATFSSMSHYGNQTLQDLLTSDSLSHSDVMMTQSDPLMSQASTAVSAQNSRRNVMLRNDPMMSFAAQPNQGSLVNQNLLHHQHQTQGALGGSRALSNSVSNMGLSESSSLGSAKHQQQSPVSQSMQTLSDSLSGSSLYSTSANLPVMGHEKFPSDLDLDMFNGSLECDMESIIRSELMDADGLDFNFDSLISTQNVVGLNVGNFTGAKQASSQSWVPG

상기 FOXO3 단백질에서 당화가 일어나는 부위는 서열번호 1의 염기서열에서 S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위 일 수 있다. 상기 당화는 상기 부위에서 동시에 일어나거나, 또는 일부나 어느 한 부위에서만 일어날 수도 있다. 따라서 상기 부위에서 일어나는 당화의 유무 및 증감을 평가하여 항암물질 스크리닝, 항암 치료 예후 예측 또는 항암제 감수성을 확인할 수 있다.

특히, FOXO3 단백질의 S284 부위에서 당화가 일어나지 않는 경우, 암세포주의 성장이 불가능함을 실시예에서 확인 하였는바, 상기 S284 부위의 당화 여부, 당화의 증감을 평가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "개체"는 종양이 있는 것으로 의심되는 환자이거나, 또는 암의 진단이 확정된 환자일 수 있다.

본 발명에서 "암"이란 고형암 및 혈액암을 모두 포함하는 의미로, 구체적인 예로, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 유방암, 폐암, 담관암으로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 바람직하게는 간암, 췌장암, 위암 등을 포함하는 소화기암 일 수 있다.

본 발명에서 "항암물질"이란 "항암제"와 혼용하여 사용될 수 있는 것으로, 암세포를 사멸, 감소시키거나, 또는 암세포의 성장을 저해할 수 있는 물질로, 화합물, 핵산분자, 항체 등을 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 "시료(sample)"란 특정 목적으로 가지고 시험, 검사 또는 분석에 제공되는 물질 또는 생물을 의미하는 것으로, 구체적으로 본 발명에서 암을 가진 것으로 의심되는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 혈액 등의 물질과 본 발명에서 항암물질의 스크리닝을 위하여 상기 암을 갖도록 조작된 인간을 제외한 동물을 모두 포함한다. 상기 시료는 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질을 발현하는 세포 또는 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질을 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명에서 "종양세포"란 정상적인 조직세포에서 무제한 증식하여, 조직상태나 환경에 관계없이 급속한 성장을 지속하는 암세포로, 통상적인 암세포의 특성을 갖는 세포를 모두 포함하는 의미이다, 상기 종양세포는 개체로부터 분리된 종양 조직으로부터 얻은 것이거나, 또는 상업적으로 판매하는 암세포주 일 수 있으며, 상기 시료에 포함된 형태로 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명에선 바람직하게는 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질을 발현하는 암세포주 일 수 있다. 구체적인 예로 췌장암 세포주, 간암 세포주 또는 위암세포주 일 수 있고, PANC-1(췌장암세포주), HPAC(췌장암세포주), BxPC-3(췌장암세포주), AGS(위암세포주) 및 Hep3B2.1-7(간암 세포주)로 이루어진 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 " 단백질의 수준 분석", "단백질의 발현 수준 측정" 또는 "단백질의 당화 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 일 예로 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯팅(western blotting), 면역 침전 분석법(Immunoprecipitation assay), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 조직 면역 염색, 방사 면역 확산법(radio immunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 췌장암 세포주에 처리한 췌장암 치료제의 효능 정도를 측정하는 과정으로, 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질을 농축한 후, O-GlcNAc에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 O-GlcNAc 당화여부의 변화를 확인하였다.

상기 항암물질 스크리닝하는 방법은 구체적으로 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 시료와 후보물질을 접촉시키는 것; 상기 시료의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것; 및 상기 후보물질과 접촉 후 시료의 O-GlcNAc 당화 수준이 후보물질과 접촉 전 시료의 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준과 비교해서 더 낮아진 경우 상기 후보물질은 항암활성이 있는 것으로 판단하는 것;을 포함할 수 이다. 본 발명의 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화는 단백질 수준에서 발현하는 것인바 유전자 수준에서 발현여부를 확인 하는 경우보다 더욱 높은 정확도를 가진다. 특히 유전자 수준의 발현의 변화가 검출되지 않더라도 단백질 수준에서는 발현의 변화를 검출할 수 있는바, 더욱 높은 민감도로 물질의 항암활성을 확인할 수 있다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 항암물질 스크리닝용 조성물 또는 항암물질 스크리닝용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 "특이적으로 결합"또는 "특이적으로 인식"이란 타겟 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로, 다른 물질에 비하여 타겟 물질에 대한 결합 또는 인식능이 뛰어나거나, 타겟 물질에 대해서만 반응하는 특성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명에서 "항체"는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이것의 단편으로부터 유래되거나 이를 본떠서 만든 실질적으로 이에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 나타낸다. 본 출원에서 항체는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하며 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 항체 구조를 포함한다. 항체 단편은 전체 길이의 항체의 일부분, 항체의 가변 도메인, 또는 적어도 항체의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 다이아바디(diabody), 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다.

한 구체 예에서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질 및 O-GlcNAc에 대한 항체는 당 업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow E. and Lane D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

상기 키트는 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질에 특이적인 항체와 O-GlcNAc당화에 특이적인 항체를 각각 독립적으로 포함할 수 있다.

일 예로, 상기 키트는 상기 FOXO3 단백질에 대한 항체를 이용하여 대상 단백질을 검출하여 농축한 후, O-GlcNAc에 특이적으로 결합하는 대한 항체를 이용하여 당화된 단백질을 분리검출하는 방법으로 본 발명을 수행할 수 있다.

상기 조성물 또는 키트는 대상 물질의 검출을 위하여 통상적으로 포함할 수 있는 부가성분을 더 포함할 수 있다. 일 예로 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있으나 그 종류는 본 발명의 기술분야의 통상의 조성물 및 키트에 포함되는 것이면 제한이 없다.

본 발명의 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 개체로부터 수득한 시료의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것;을 포함하는 치료 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다.

포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화의 경우 한 개체의 조직에서 종양 부위와 비종양 부위에 있어서도 종양부위에서만 당화가 검출되는 특성을 가지며, O-GlcNAc 당화가 일어나지 않는 경우 암세포의 성장이 저해됨을 본 발명의 일 실시예를 통해서 밝혔다.

따라서, 상기 개체에 항암 치료 전 개체로부터 분리된 시료에서 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준과 항암 치료 후 개체로부터 분리된 시료에서 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 비교하여, 치료 후 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준이 더 낮은 경우, 치료효과가 있다고 판단 할 수 있다. 또한, 이러한 예후 예측은 항암제를 이용한 화학적 치료, 방사선 치료 등의 통상의 항암치료 방법에 대하여 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 개체로부터 수득한 시료에 항암제를 처리하는 것; 상기 항암제 처리된 시료에서 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것;을 포함하는 개체의 항암제에 대한 감수성을 확인하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 상기 시료에 항암제 처리 전 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준과 항암제 처리 후 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 비교하여, 항암제 처리 후 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준이 더 낮은 경우, 항암제에 대한 감수성이 있다고 판단하는 것;을 더 포함할 수 있다.

본 발명을 이용하는 경우, 각 개체의 항암제에 대한 감수성을 항암제 투여 전에 확인하여 치료효과를 높일 수 있고, 특히 단백질 수준에서 감수성을 확인할 수 있는바, 유전자를 이용하는 경우보다 더욱 정밀한 측정이 가능하고, 다양한 항암제 중 감수성이 높은 항암제의 선택이 가능하여, 궁극적으로 암의 치료에 대한 효과를 현저히 향상시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 물질을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

상기 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 물질은 O-GlcNAc 당화를 저해할 수 있는 것이라면, 화합물, 항체, 핵산분자 등 그 종류에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 억제하는 경우, 암세포의 성장이 정상적으로 일어나지 않음을 확인 하였는바, 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화의 저해는 항암 치료에서 중요한 타겟이 될 수 있다.

상기 물질은 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열에서 S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위 중 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 것 일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열에서 S284 부위의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 것 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, S284 부위의 당화가 일어나지 않는 경우, 암세포의 성장이 일어나지 못함을 확인하였는바, S284의 당화를 억제함으로써 우수한 항암활성을 가질 수 있다.

상기 O-GlcNAc 당화의 저해물질은 통상적으로 항암제로서 기능성을 지닌 물질로, 핵산, 단백질, 천연물, 천연유래 추출물 또는 화합물 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 개체로부터 분리된 조직의 종양부위의 시료의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화여부를 측정하는 것;을 포함하는 췌장암의 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 상기 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 경우 한 개체의 조직에서 종양 부위와 비종양 부위에 있어서도 종양부위에서만 당화가 검출되는 특성을 가짐을 본 발명의 일 실시예에서 확인 하였다. 따라서, 개체로부터 분리된 시료에서 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화여부를 측정한 결과, 당화가 일어났거나, 대조군과 비교해서 당화 수준이 더 높은 경우 췌장암이라고 진단할 수 있다.

상기 대조군은 췌장암을 갖지 않은 건강한 개체(정상인)이거나, 또는 췌장암을 가지고 있을 것으로 예상되는 개체의 비종양 조직 일 수 있다. 특히, 본 발명의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화는 동일 개체 내에서도 종양 부위와 비종양 부위가 당화가 다르게 나타나는 야상이 확연하게 차이가 나는바, 동일 개체 내의 두 부위를 비교하여 췌장암 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다는데 그 특징이 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 일 측면에 있어서, 본 발명은 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 FOXO3 단백질의 경우 종양 부위에서만 O-GlcNAc 당화를 하는 특징이 있는바, 이에 따라 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하면, 종양을 갖는 것으로 의심되는 개체에 대하여 암에 대한 진단을 위하여 상기 FOXO3 단백질의 당화여부를 검출할 수 있다.

상기 항체는 서열번호 1의 염기서열에서 S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 위치에서 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 것 일 수 있다.

상기 항체, 단백질의 당화 등에 대하여 중복되는 내용의 기재를 피하기 위하여, 상기에 기재된 바가 암 진단용 조성물에도 적용된다.

이하, 본 발명을 제조예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 췌장암에서 포크머리상자 O 3( FOXO3 )의 단백질 발현 및 O- GlcNAc 당화 수준 분석

[ 실시예 1-1] 췌장암 환자의 비종양 vs 종양 조직 내 FOXO3 O- GlcNAc 당화 여부 및 수준 확인

췌장암 환자 조직의 비종양 부위 대비 종양 부위에서 전체 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 확인하고자, 전기영동 및 면역 블롯을 수행하였다.

조직의 수득은 세브란스 병원 유전자 은행과 소화기 내과로부터 공급받았고, 임상시험위원회(IRB) 규정에 따랐다. 분주 되어 공급 받은 조직 시료는 -70℃에서 실험 전까지 보관하여 사용하였다.

면역 블롯 및 면역 침전 분석을 위하여 췌장암(Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) 환자 12명의 조직을 각각 종양 부위와 비종양 부위(췌장암 부위와 인접한 비 종양 부위)로 나누고 RIPA 용해 용액(lysis buffer) [150 mM 염화-나트륨, 50 mM 트리스 pH 7.4, 1 % NP-40, 나트륨-데옥시콜산, 나트륨-바나듐산염]을 첨가하여 음파처리(Sonication)를 진행했다. 14,000 rpm에서 30분 동안 침전 시킨 후, 상층액을 회수하여 다시 14000 rpm에서 20분 동안 침전 시켜 상층액을 회수했다.

동일한 단백질 양으로부터 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 단백질 20 ㎍을 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충 용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화-나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-O-GlcNAc(RL2, Abcam)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충 용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-마우스(mouse) IgG-HRP(Santa Cruz)를 1:5000배를 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.

그 결과, 도 1a에 도시한 바와 같이, 췌장암 환자의 종양부위에서만 O-GlcNAc 당화의 수준이 증가함을 알 수 있었다(9.2±0.52 배, n = 3).

또한, 면역조직염색(IHC)를 이용하여 췌장암(PDAC) 환자의 16쌍의 종양 조직 세트에서 종양부위 및 인접한 비 종양부위의 핵 모두에서 FOXO3 단백질 수준을 확인하였다. 모든 데이터는 H-점수 평가와 16 개의 케이스 실험의 평균값으로 계산되었다.

도 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이, 종양부위에서 비종양 부위보다 더 FOXO3 발현이 꾸준히 지속됨을 확인하였다.

췌장암 환자의 조직 중 췌장암과 인접한 비종양 부위와 종양부위에서 FOXO3의 존재 및 발현양, 그리고 FOXO3의 O-GlcNAc 당화 수준을 분석하기 위하여, 면역 침전 및 면역 블롯 분석 및 전기영동을 수행하였다.

조직 용해물(lysate) 1mg을 사용하여 항-포크머리상자 O 3(FOXO3) 항체(75D8, Cell Signaling Technology) 2 ug, 단백질 G 아가로즈 10㎕ 를 함께 1ml 튜브에서 4 ℃ 에서 하룻밤 동안 면역 침강 시킨 후, 10% SDS-PAGE 전기영동으로 분리하였다.

면역 침강 결과물을 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충 용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화-나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-FOXO3(75D8, Cell Signaling Technology)을 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충 용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고, 항-마우스(mouse) IgG-HRP(Santa Cruz)를 1:5000배로 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.

또한, 종양 부위와 비종양부위로 나뉜 10명의 조직을 이용하여 면역 침전 분석을 진행한 후, 그 결과물을 항-FOXO3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충 용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화-나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-O-GlcNAc(RL2, Abcam)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충 용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-마우스(mouse) IgG-HRP(Santa Cruz)를 1:5000배를 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.

그 결과, 도 2a 및 2b에 도시한 바와 같이, 웨스턴 블랏에서 명확한 밴드가 나타났는 바, O-GlcNAc의 증가는 FOXO3 단백질 결합에 기인한 것임을 알 수 있다. 또한 FOXO3 O-GlcNAc 당화 수준은 종양부위(T)가 인접한 부위보다 더 높은 것을 확인 하였다(7.37±1.68 배, n=3). 그러나 췌장암 환자의 비 종양 부위에서 O-GlcNAc 당화된 단백질의 검출이 적었다.

상기의 면역침강 결과물을 10% SDS-PAGE 분석 후 쿠마시블루(Coomassie blue) 염료로 단백질을 염색한다. 이미지 분석 후, FOXO3의 존재를 확인하기 위하여 밴드에 대하여 질량 분석을 수행하였다. 단백질 밴드는 쿠마시블루 염료로 염색된 겔로부터 피킹(picking)하였고, 탈색하여 트립신으로 절단(digestion)한 후, 절단된 펩티드들은 포로스(Poros) R2 및 올리고(Oligo) R3 레진(resin) 혼합물을 사용하여 탈염(desalting)시켰다.

항-O-GlcNAc 단클론 항체를 이용해서 웨스턴 블랏(Western blotting)으로 검출 된 밴드가 FOXO3 단백질과 정확히 일치하는지 더 확인하기 위해 Quadrupole time-of-flight 탠덤 질량 분석기(Q-TOF MS/MS) (Agilent 6530)를 사용하여 겔에서 절제된 단백질 밴드를 관찰하였다. Q-TOF-MS로 얻은 스펙트럼은 MASCOT 데이터베이스를 이용하여 동정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

번호	단백질명	질량	스코어	pl밸류	쿼리스매치드	시퀀스 커버리지
gi42519916	Forkhead box protein O3	71517	1455	4.99	227	77%

표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 겔로부터 절제된 단백질은 실제로 FOXO3(MW 71517, 서열커버리지: 77 %)임을 확인했다.

[ 실시예 1-2] 췌장 외의 기타 다른 장기에서의 FOXO3 발현 및 O- GlcNAc 당화 수준 분석

또한, 모든 종양부위가 FOXO3에서 더 높은 O-GlcNAc 당화를 나타내는(4.61±0.38 배, n=12), 개별 PDAC 환자의 12 쌍의 조직 샘플을 검사하여 상기한 결과의 재현성을 확인했다.

췌장 이외의 여러 암 환자들의 조직에서의 FOXO3의 O-GlcNAc 당화 수준을 분석하기 위하여, 면역 침전 및 면역 블롯을 수행하였다. 췌장암의 조직(12명)과 마찬가지로 간암(HCC, 10명), 위암(GC, 10명), 담관암(BD, 5명), 대장암(CC, 10명), 및 폐암(LC, 10명) 환자의 조직을 각각 종양 부위와 비 종양부위(종양부위와 인접한 비 종양부위)로 나누어 면역 침전 분석을 진행한 후, 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과물을 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충 용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화-나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-O-GlcNAc(RL2, Abcam)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충 용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-마우스(mouse) IgG-HRP(Santa Cruz)를 1:5000배로 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.

그 결과, 도 3a 및 3b에 도시한 바와 같이, 췌장암, 간암, 위암 등 소화기 계통의 암환자의 조직에서 FOXO3의 O-GlcNAc 당화가 더 많이 발현하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 위암(위암, 2.65±0.31 배, n=10), 간 종양(간세포 암종, HAC)은 1.76±0.46 배, n=10)의 수준으로 더 많은 당화가 나타났다. FOXO3 O-GlcNAc 당화 수준의 가장 높은 변화는 췌장(PDAC) 종양 (vs. GC 종양 또는 HCC 종양)에서 확인되었다.

[ 실시예 2] 췌장암 세포 내에서 포크머리상자 O 3( FOXO3 ) 과발현 세포주 제작

[실시예 2-1] 췌장암 세포 내에서의 FOXO3의 과발현 세포주 제작

FOXO3의 O-GlcNAc 당화 지점을 확인하기 위하여 췌장암 세포주에서 FOXO3의 과발현 세포주를 제작하였다.

우선, 여러 췌장암 세포주에서 FOXO3 O- GlcNAc 당화 수준을 확인하기 위해, HPDE, PANC -1, BxPC -3 및 HPAC 세포주 각각에 대하여 웨스턴 블랏 및 면역침전분석을 수행했다. 그 결과에 대해서는 GAPDH(표준화 대조군)에 대한 상대적인 O- GlcNAc 당화비로 나타내어, 도 4a 및 4b에 그 결과를 나타내었다.

도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 전반적인 O- GlcNAc 당화 수준은 췌장암 세포주(PANC-1)에서 불명성 상피 췌장 세포주 HPDE와 비교해서 꽤 유의적으로 증가하였음을 확인하였다. 또한, FOXO3의 수준은 또한 PANC-1, BxPC-3 및 HAPC 세포주에서 증가하였고, FOXO3에 대한 O-GlcNAc의 더 높은 상대비는 갖는 PANC-1 및 HAPC 세포주에서 증가하였음을 확인하였다.

PDAC에서 유의하게 강화된 FOXO3 O -GlcNAc 당화의 존재를 확인한 후(4.61±0.38 배, n=12), 특정 O-GlcNAc 당화 부위를 확인하고 FOXO3의 O-GlcNAc 수준을 더 정량화하여 암세포 증식과 관련한 이들 부위의 잠재적인 역할을 규명하고자 노력하였다. 이를 위해, FOXO3 내에서 O-GlcNAc 수준의 정량화와 특정 부위의 지도를 작성하기 위해 FOXO3 과발현 세포주를 제조하였다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, 췌장암 세포주로 PANC-1(human pancreas epithelioid carcinoma)을 사용하여 pCMV6-FOXO3::GFP 플라스미스 벡터를 이용해 세포에 과발현 시켰다. 100mm 페트리접시에 2.2 X 10⁶ 마리의 세포를 둘베코수정이글배지(DMEM, Gibco) 혼합물[10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, Gibco)]에 배양 했다. 이틀 후, 혈청 성분이 들어가지 않은 옵티엠이엠(Opti-MEM, Gibco)에 하루 배양했다. 포크머리상자 O 3(FOXO3)가 들어있는 플라스미드벡터와 리포펙타민(Lipofectamine 3000, Invitrogen)을 잘 섞어 37℃에서 2시간 배양한 후, 다시 둘베코수정이글배지 혼합물로 배양하였다. 이틀 동안 안정화 시킨 후, G418(Sigma)을 이용하여 과발현이 진행되지 않은 세포를 제거하였다. 이 세포주를 FOX-OV라 명명했다.

[ 실시예 3] Q- Exactive orbitrap LC- MS 질량분석기를 이용한 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 O- GlcNAc 당화 지점의 분석

[ 실시예 3-1] 포크머리상자 O 3( FOXO3 ) 과발현 세포주에서 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 분리

MS에 의한 O-GlcNAc당화 지점 분석을 위해 정제된 FOXO3 단백질을 얻고자, 면역침전분석법과 전기영동 및 OFFGEL 분류 및 웨스턴 블롯을 수행하였다.

세포주 용해물(lysate) 10mg을 사용하여 OFFGEL 분류 장치(OFFGEL Fractionator 3100, Agilent)를 이용하여 단백질을 pH 별로 분류하였다. 기계의 각 칸에 재수화 용액 [IPG(pH3 - 10, Agilent) 용액, 증류수]을 넣어준 후, 세포주 용해물(lysate)을 넣어준다. 광유(Mineral oil)을 이용하여 손실을 줄여주고, 800V에서 8000V까지 전압을 걸어 분류하였다(도 6a).

분류장치에서 분류된 단백질을 항-FOXO3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 이동(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충 용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화-나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간 동안 블로킹하였다. 항-O-GlcNAc(RL2, Abcam)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충 용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-마우스(mouse) IgG-HRP(Santa Cruz)를 1:5000배를 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.

그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 FOXO3 과발현 세포주에서만 단백질이 검출되었고, PANC-1, Mock 그리고 GFP 세포주에서는 검출이 되지 않음을 확인 하였다. 또한, 당화 역시 FOXO3 과발현 세포주에서만 검출되었다.

또한, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 농축된 단백질은 이론적으로 pH 5.24인 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질임을 확인하였고, 상기 결과는 FOXO3 과발현 세포주(FOX-OV)에서 과발현된 재조합 FOXO3-GFP 단백질이 예상 크기와 동일함을 보여준다.

[실시예 3-2] 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 당화 지점 분석

OFFGEL 결과물을 사용하여 항-포크머리상자 O 3(FOXO3) 항체(75D8, Cell Signaling Technology) 2 ㎍, 단백질 G 아가로즈 10㎕ 를 함께 1ml 튜브에서 4 에서 하룻밤 동안 면역 침강 시킨 후, 10% SDS-PAGE 전기영동으로 분리한다. 분리된 면역 침강 결과물을 쿠마시블루(Coomassie blue) 염료로 단백질을 염색한다. 이미지 분석 후, FOXO3의 존재를 확인하기 위하여 밴드에 대하여 질량 분석을 수행하였다. 단백질 밴드는 쿠마시블루 염료로 염색된 겔로부터 피킹(picking)하였고, 탈색하여 엔도프로테아제(트립신, Lys-C, Asp-N의 조합)으로 절단(digestion)한 후, 절단된 펩티드들은 포로스(Poros) R2 및 올리고(Oligo) R3 레진(resin) 혼합물을 사용하여 탈염(desalting)시켰다. 단백질 동정은 Q-Exactive orbitrap LC-MS(Thermo Scientific)로 분석하였으며, Q-Exactive orbitrap LC-MS로 얻은 스펙트럼은 MASCOT 데이터베이스를 이용하여 동정하였다. 엔도프로테아제 처리 이후 13번의 독립적인 실험을 실시하였다.

번호	단백질명	질량	스코어	pl밸류	시퀀스 커버리지	O-GlcNAc 변이 부위
gi42519916	Forkhead box protein O3	71.2	10969±4691	5.16	92.72%	S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551

단백질	위치	Score	Charge	MH+[Da]	△M[ppm]	Miss	Sequence
FOX03	S284	11.55	3	2222.01	-5.16	1	DDsPSQLSKWPGSPTSRSS
	S286	14.31	3	2579.15	-9.13	2	DDSPsQLSKWPGSPTSRSSDEL
	S411	37.5	2	1220.56	-3.09	0	sSSFPYTTK
	T475	16.16	2	1377.64	0.41	1	DLLtSDSLSHS
	T475/S476	18.34	2	1580.71	-3.75	1	DLLtsDSLSHS
	S482	23.69	2	1377.64	-1.98	0	DLLTSDSLSHs
	S551	100.09	2	2229.05	-0.10	0	ALsNSVSNMGLSESSSLGSAK

그 결과, 상기 표 2, 표 3 및 도 6d에 나타낸 바와 같이, FOXO3의 당화 지점 7 지점(S284, S286, S411, T475, S476, S482 및 S551)을 새롭게 발견했다. FOXO3의 모든 당화 부위는 통상적으로 전사 보조 조절자가 부착하는 전사촉진 부위(TAD; transactivation domain) 상에 위치하고 있었다. 반복적이고 엄격한 MS 분석결과 재조합 과발현 FOXO3의 평균 점수는 10969.46±4691(n=13)였다.

[실시예 4] 포크머리 상자 O 3(FOXO3)의 당화 지점의 기능 분석

[ 실시예 4-1] 포크머리상자 O 3( FOXO3 )의 당화 지점 별 당화 불가용 플라스미드 벡터 제작

FOXO3의 O-GlcNAc 당화 지점별 당화의 기능을 확인하기 위하여 췌장암 세포주에서 FOXO3의 각 당화 지점 별로 당화가 불가능한 과발현 세포주를 제작하였다. 앞서 제작한 포크머리상자 O 3 과발현 세포주에 사용한 pCMV6-FOXO3::GFP 플라스미스 벡터를 위치 지정 점 돌연변이 기법(site directed point mutagenesis method)을 이용하여 해당 지점의 세린(serine)과 트레오닌(threonine)을 알라닌(alanine)으로 치환시켜 당화가 일어나지 못하는 플라스미스 벡터를 제작하였다. 각 당화 지점별 당화 불능 벡터 제작을 위해 사용된 프라이머는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.

No	Site	Primer sequences
1	S284A	(Sense)	5'-cgaatcagctgacgac GCT cccttcccagctctccaag-3'
		(Antisense)	5'-cttggagagctgggaggg AGC gtcgtcagctgattcg-3'
2	S284D	(Sense)	5'-cgaatcagctgacgac GAT cccttcccagctctccaag-3'
		(Antisense)	5'-cttggagagctgggaggg ATC gtcgtcagctgattcg-3'
3	S286A	(Sense)	5'-cagctgacgacagtccc GCC cagctctccaagtggc-3'
		(Antisense)	5'-gccacttggagagctggg CGG gactgtcgtcagctg-3'
4	S411A	(Sense)	5'-gggactcatgcagcgg GCC tctagcttcccgtatac-3'
		(Antisense)	5'-gtatacgggaagctagaggc CCG ctgcatgagtccc-3'
5	T475A	(Sense)	5'-cactccaggacctgctc GCT tcggactcacttagcc-3'
		(Antisense)	5'-ggctaagtgagtccga AGC gagcaggtcctggagtg-3'
6	S476A	(Sense)	5'-ccaggacctgctcact GCG gactcacttagccacag-3'
		(Antisense)	5'-ctgtggctaagtgagtc CGC agtgagcaggtcctgg-3'
7	S482A	(Sense)	5'-ggactcacttagccac GCC gatgtcatgatgacac-3'
		(Antisense)	5'-gtgtcatcatgacatc GGC gtggctaagtgagtcc-3'
8	S551A	(Sense)	5'-gtggcagccgtgccttg GCG aattctgtcagcaac-3'
		(Antisense)	5'-gttgctgacagaatt CGC caaggcacggctgccac-3'

[ 실시예 4-2] 포크머리상자 O 3( FOXO3 )의 당화 지점 별 당화 불가 과발현 세포주 제작

FOXO3의 O-GlcNAc 당화 지점별 당화의 기능을 확인하기 위하여 췌장암 세포주에서 FOXO3의 당화 지점 별 당화 불가 과발현 세포주를 제작하였다. 앞서 실시예 4-1에서 제작한 플라스미드 벡터를 이용하여 췌장암 세포주인 PANC-1(human pancreas epithelioid carcinoma)을 사용하여 각 세포에 과발현 시켰다. 100mm 페트리접시에 2.2 X 10⁶ 마리의 세포를 둘베코수정이글배지(DMEM, Gibco) 혼합물[10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, Gibco)]에 배양 했다. 이틀 후, 혈청 성분이 들어가지 않은 옵티엠이엠(Opti-MEM, Gibco)에 하루 배양했다. 포크머리상자 O 3(FOXO3)가 들어있는 플라스미드벡터와 리포펙타민(Lipofectamine 3000, Invitrogen)을 잘 섞어 37℃에서 2시간 배양한 후, 다시 둘베코수정이글배지 혼합물로 배양한다. 이틀 안정화 시킨 후, G418(Sigma)을 이용하여 과발현이 진행되지 않은 세포를 제거한 후, 각 지점 별 당화 불능 세포를 얻었다. 각 세포주에 대한 명명은 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 변이가 일어난 지점 별로 FOX-S284A, FOX-S286A, FOX-S411A, FOX-T475A, FOX-S476A, FOX-S482A, FOX-S551A로 나타내었고, FOX-OV는 야생형의 FOXO3단백질 과발현 세포주이며, 대조군(control)으로는 FOXO3를 포함하지 않는 벡터로 형질전환 시킨 Mock을 사용하였다.

No	Cell name	Description	Remarks
1	FOX-OV	FOXO3 과발현 세포주 (FOXO3 overexpressed cell line)	야생형 FOXO3 (Wild type FOXO3)
2	FOX-S284A	FOXO3의 S284가 A로 치환됨 (S284 within FOXO3 was substituted to A)	PTMs defective FOXO3 (O-GlcNAcylation 및 phosphorylation)
3	FOX-S286A	FOXO3의 S286가 A로 치환됨 (S286 within FOXO3 was substituted to A)
4	FOX-S411A	FOXO3의 S411이 A로 치환됨 (S411 within FOXO3 was substituted to A)
5	FOX-T475A	FOXO3의 T475가 A로 치환됨 (T475 within FOXO3 was substituted to A)
6	FOX-S476A	FOXO3의 S476가 A로 치환됨 (S476 within FOXO3 was substituted to A)
7	FOX-S482A	FOXO3의 S482가 A로 치환됨 (S482 within FOXO3 was substituted to A)
8	FOX-S551A	FOXO3의 S551이 A로 치환됨 (S551 within FOXO3 was substituted to A)
9	FOX-S284D	FOXO3의 S284가 D로 치환됨 (S284 within FOXO3 was substituted to D)	Phospho-mimeted FOXO3

상기에서 제조한 세포주로부터 FOXO3의 과발현이 잘 일어나는지 확인하기 위하여, 동일한 단백질 양으로부터 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 단백질 20㎍을 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충 용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화-나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-O-GlcNAc(RL2, Abcam)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충 용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-마우스(mouse) IgG-HRP(Santa Cruz)를 1:5000배를 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.

그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 당화 지점 별 당화 불가 과발현 세포주 모두에서 FOXO3의 과발현이 잘 이루어졌음을 확인하였다.

[ 실시예 4-3] 포크머리상자 O 3( FOXO3 )의 당화 지점의 기능 확인

앞서 확인한 포크머리 상자 O 3(FOXO3)의 당화 지점은 모두 전사촉진 지점(TAD) 상에 위치해 있었다. 이는 FOXO3와 결합하여 하위 유전자의 발현을 조절과 관련된 지점이다. 따라서, 각 지점에서 O-GlcNAc 당화가 다양한 FOXO3 표적 유전자의 발현에 영향을 주는지 평가하여, 당화 지점의 기능을 확인하기 위해 전사 인자인 FOXO3의 하위 유전자(FasL, MnSod, Nib, p27 및 p21)를 분석하였다.

상기 실시예 4-2에서 제작한 각 과발현 세포주를 모아서 트리졸(Trizol)을 이용하여 RNA를 분리한 후, RNeasy kit를 이용하여 RNA를 정제했다. 그 이후 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA로 합성했다. 합성된 각각의 cDNA에 각 유전자의 해당 프라이머(표 5)와 10Mm dNTP, 그리고 SYBR green PCR mix를 이용하여 실시간 정량분석 유전자 증폭(quantitative real time PCR)을 CFX Real-Time PCR 검출 시스템을 이용하여 하위 유전자의 발현을 분석하였다.

No	Gene	Primer sequences
1	FOXO3	(Forward)	5'-CAACCAGCTCCTTTAACAGC-3'
		(Reverse)	5'-TAAGTGAGTCCGAAGTGAGC-3'
2	FasL	(Forward)	5'-TCCGTGAGTTCACCAACCAAA-3'
		(Reverse)	5'-GGGGGTTCCCTGTTAAATGGG-3'
3	MnSod	(Forward)	5'-CAGACCTGCCTTACGACTATGG-3'
		(Reverse)	5'-CTCGGTGGCGTTGAGATTGTT-3'
4	Nib3	(Forward)	5'-CTGGGTAGAACTGCACTTCAG-3'
		(Reverse)	5'-GGAGCTACTTCGTCCAGATTCAT-3'
5	p21	(Forward)	5'-CCTGGTGATGTCCGACCTG-3'
		(Reverse)	5'-CCATGAGCGCATCGCAATC-3'
6	p27	(Forward)	5'-TCTCTTCGGCCCGGTCAAT-3'
		(Reverse)	5'-AAATTCCACTTGCGCTGACTC-3'
7	GAPDH	(Forward)	5'-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3'
		(Reverse)	5'-ACCAGGAAATGAGCTTGACA-3'

그 결과 하기 도 7b에 도시한 바와 같이, 대부분의 FOXO3 표적 유전자의 발현은 변하지 않았지만, 하위유전자 중 p21 유전자(cyclin dependent kinase inhibitor 1, CDKN1A)만이 FOXO3의 S284 지점의 당화가 없을 때 그 발현량이 증가 (57.6±2.91%, p=0.0015, FOX-OV 세포에 대한 FOX-S284A 변이세포의 상대값)하는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4-4] 포크머리상자 O 3( FOXO3 )의 당화와 인산화의 차이 확인

FOXO3의 S284 지점의 인산화가 p21의 발현에 미치는 영향을 제거하기 위해서 pCMV6-FOXO3::GFP 플라스미드 벡터를 위치 지정 점 돌연변이 기법(site directed point mutagenesis method)를 이용하여 해당 지점의 세린(serine)과 트레오닌(threonine)을 아스파르트산(aspartic acid)로 치환하여 표 3의 프라이머를 이용하여 인산화 미믹(phospho-mimic) 플라스미스 벡터를 제작하였다.

또한, 앞서 제작한 인산화 미믹 플라스미드 벡터를 이용하여 췌장암 세포주인 PANC-1(human pancreas epithelioid carcinoma)을 사용하여 세포에 과발현 시켰다. 100mm 페트리접시에 2.2 x 10⁶ 마리의 세포를 둘베코수정이글배지(DMEM, Gibco) 혼합물[10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, Gibco)]에 배양 했다. 이틀 후, 혈청 성분이 들어가지 않은 옵티엠이엠(Opti-MEM, Gibco)에 하루 배양했다. 포크머리상자 O 3(FOXO3)가 들어있는 플라스미드 벡터와 리포펙타민(Lipofectamine 3000, Invitrogen)을 잘 섞어 37℃에서 2시간 배양한 후, 다시 둘베코수정이글배지 혼합물로 배양했다. 이틀 안정화 시킨 후, G418(Sigma)을 이용하여 과발현이 진행되지 않은 세포를 제거했다. 제작된 과발현 세포주를 FOX-S284D(표3 참고)라 명명하였다(S284 인산화로부터 O-GlcNAc 당화의 손실 효과를 구분하기 위해서 인산-모방 FOX-OV를 가짐). 트리졸(Trizol)을 이용하여 RNA를 분리한 후, RNeasy kit를 이용하여 RNA를 정제했다. 그 이후 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 cDNA로 합성했다. 합성된 각각의 cDNA에 각 유전자의 해당 프라이머와 10Mm dNTP와 SYBR green PCR mix를 이용하여 실시간 정량분석 유전자 증폭(quantitative real time PCR)을 하였고, CFX Real-Time PCR 검출 시스템을 이용하여 하위 유전자의 발현을 분석하였다.

FOXO3의 O-GlcNAc 당화 지점별 당화의 기능을 확인은 췌장암 세포주에서 FOXO3의 당화 지점 별 당화 불가 과발현 세포주는 실시예 4-2에서와 동일한 방법으로 제작하여 사용하였다. 또한, Mock과 앞서 제작한 FOX-OV를 이용하여 p21 유전자의 발현을 분석하였다.

그 결과, 하기 도 7c에 나타낸 바와 같이, FOX-S284A 세포주에서 FOXO3의 S284 부위에 당화가 진행되지 않은 경우(S284 Lacking O-GlcNAc)와 FOX-S284D발현하지 않는 경우(인산화 없는 경우)에만 p21의 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는, FOXO3 S284에서 인산화가 아닌 O-GlcNAc 당화가 p21의 발현을 억제하는 것을 의미하며, FOXO3 종양 억제 활성의 손실을 가리킨다.

[실시예 4-5] p21 의 발현 조절에 따른 세포내 기능 연구

실제 p21은 세포 주기에 연관된 키나제 억제자(cell cycle dependent kinase inhibitor)로 p21의 변화가 세포 주기 및 세포의 증식에 영향을 준다. 따라서, 복원된 p21 단백질이 상기 세포주에서 G1에서 S기로 세포 주기가 진행하는 동안 사이클린 CDK 계열 복합체의 활성을 억제할 수 있는지 확인하였다.

이를 확인하기 위하여 앞서 제작한 FOXO3의 S284지점 관련 돌연변이 세포(FOX-S284A, FOX-S248D), Mock(FOXO3 유전자를 포함하지 않는 벡터로 형질전환 된 세포), 및 FOX-OV를 이용하여 실험을 진행했다.

각 세포를 동일한 양(10,000 cells)으로 분주한 후, 전체 세포의 수를 24시간 마다 측정하였다.

도 8a 및 8b에 나타낸 바와 같이, 세포수의 변화가 최적으로 관찰되는 형질감염 5일 이후부터 FOXO3의 S284지점의 당화의 변화에 따라서, 세포수의 변화가 나타남을 확인하였다. S284 지역에 당화가 일어나지 않거나(FOX-S284A) 인산화가 진행된 경우(FOX-S284D), 전체 세포의 수는 증가하지 않았다. 이는 FOXO3의 S284지점의 당화가 암세포(PDAC 세포)의 증식에 필수적임을 의미한다. WST-1 분석 결과인 도 8b의 경우도 역시, FOX-OV 세포와 비교해서 FOX-S284A 와 FOX-S284D 실험군에서 암세포의 증식을 감소시키는 결과를 나타내었다. 이와 동시에 각 세포를 크리스털 바이올렛 염색(crystal violet staining) 하여 확인한 도 8c의 경우도, FOX-OV 세포수는 증가하는 반면, FOX-S284A 및 FOX-S284D 세포 집단은 동일한 조건 하에서 형질감혐 5 일 후에 고정되는 결과는 나타냈다. 이러한 결과는 종합적으로, FOXO3 S284에 O-GlcNAc의 결합은 p21 억제를 통해 FOXO3 종양 억제 활성을 차단함으로써 세포의 표현형을 고도의 증식성으로 바꿀 수 있음을 시사한다.

FOXO3는 p21 억제를 통해 세포주기를 조절하기 때문에, 이러한 현상이 왜 일어나는지 확인하기 위하여 FACS(fluorescence activated cell sorter)를 이용하여 상기 세포주들(Mock, FOX-OV, FOX-S284A 및 FOX-S284D)에 대하여 세포주기를 측정하였다.

그 결과 하기 도 9a 및 9b에 나타낸 바와 같이, FOX-S284A 세포주는 CDK2, 사이클린 D1(cyclin D1), 및 사이클린 E(cyclin E)의 발현을 억제하는 p21의 활성형의 유지를 통해서 감소된 증식 활성을 보이고, G1 억제를 유도한다는 것이 밝혀졌다. FOX-S284D는 G2 정지를 보였고, 이는 FOXO3 S284에서 O-GlcNAc 당화는 세포주기 패턴에 영향이 있음을 시사한다. 즉, 상기 결과는 S284는 췌장암 세포의 증식을 조절하는 데 필요한 중요한 PTM 사이트이며, S284의 O-GlcNAc 당화는 p21의 억제를 통해 FOXO3 종양 억제 활성을 손상시켜 암세포 증식을 유도한다는 것을 더욱 확실하게 보여준다.

[ 실시예 5] 췌장암 세포주에 췌장암 치료제를 투여 후, 포크머리상자 O 3(FOXO3)의 발현 수준 및 O- GlcNAc 당화 수준 분석

항암제가 O-GlcNAc 변이된 FOXO3의 기능(종양 억제 활성이 손상됨)에 효과가 있는지 확인하기 위해서, 췌장암 세포주에 췌장암 치료제를 투여한 이후의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 발현 및 당화 수준을 췌장암 치료제를 처리한 이후 웨스턴 블롯을 수행하여 확인하였다.

세포주를 처리하기 전에 각 약물의 50 % 억제 효과가 관찰되는 IC₅₀값 또는 농도를 결정하였다(도 10a).

다른 췌장암 세포주와 비교해서 FOXO3 O-GlcNAc 당화 수준이 높은 HPAC세포(Homo sapiens pancreas adenocarcinoma) 2.2X10⁶ 개와 둘베코수정이글배지(DMEM, Gibco) 혼합물[10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, Gibco), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin, Gibco)]을 넣은 100mm 페트리접시에서 배양 했다. 각 10nM 젬시타빈(Gem, Gemcitabine, Sigma), 10nM 독소루비신(Dox, Doxorubicin, Sigma), 0.5ng/ml 악티노마이신 디(Act D, Actinomycin D, Sigma), 10nM 파클리탁셀(Pac, Paclitaxel, Sigma), 10nM 살리노마이신(Sal, Salinomycin, Sigma), 그리고 BG(OGT 저해제)를 각각 세포에 처리 후, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 다시 둘베코수정이글배지 혼합물에 옮겨 배양하였다. 대조군으로 타이멧G(Thiamet G)를 처리, 그리고 음성대조군으로 DMSO만 50 ㎕를 처리하는 것 외에 동일한 방법으로 세포를 배양하여 사용하였다.

각각의 췌장암 치료제를 투여한 세포주를 면역 침전 분석을 진행한 후, 그 결과물을 항-FOXO3 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충 용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화-나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-O-GlcNAc(RL2, Abcam)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충 용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-마우스(mouse) IgG-HRP(Santa Cruz)를 1:5000배를 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.

그 결과, 도 10b, 10c 및 10d에 나타낸 바와 같이, 대조군(DMSO)를 제외한 대부분의 췌장암 치료제를 투여한 췌장암 세포주에서 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준이 감소하여, p21 수준이 증가한 것으로 나타났다. 이는 항암제가 암세포의 FOXO3의 당화를 저해하여 암세포의 증식을 억제한다는 의미를 나타낸다. 흥미롭게도, 췌장암 치료에 흔히 사용되는 젬시타빈은 용량의존적으로 O-GlcNAc 당화 수준을 감소시켰다. 이러한 결과는 췌장암 세포 증식을 촉진하는 S284에서 부위 특이적 O-GlcNAc 당화에 의한 FOXO3의 손상은 p21 활성화를 유도하는 항암제로 치료함으로써 부분적으로 회복될 수 있고, FOXO3 단백질의 부위 특이적 O-GlcNAc 당화를 타겟으로 하는 화학치료제를 위한 잠재적 생화학 기초를 암시한다. 따라서, 이를 이용하여 항암제의 민감도 확인이 가능할 뿐만 아니라, FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 정도에 따라 항암 활성을 갖는 물질의 탐색에 적용할 수 있다.

<110> UNIVERSITY-INDUSTRY FOUNDATION, YONSEI UNIVERSITY <120> USE OF FORKHEAD BOX O 3 PROTEIN <130> P17U16C1053 <150> KR 10-2016-0156311 <151> 2016-11-23 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 673 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> FORKHEAD BOX O 3 PROTEIN <400> 1 Met Ala Glu Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Leu Ser Pro Leu Glu Val 1 5 10 15 Glu Leu Asp Pro Glu Phe Glu Pro Gln Ser Arg Pro Arg Ser Cys Thr 20 25 30 Trp Pro Leu Gln Arg Pro Glu Leu Gln Ala Ser Pro Ala Lys Pro Ser 35 40 45 Gly Glu Thr Ala Ala Asp Ser Met Ile Pro Glu Glu Glu Asp Asp Glu 50 55 60 Asp Asp Glu Asp Gly Gly Gly Arg Ala Gly Ser Ala Met Ala Ile Gly 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Leu Leu Leu Glu Asp 85 90 95 Ser Ala Arg Val Leu Ala Pro Gly Gly Gln Asp Pro Gly Ser Gly Pro 100 105 110 Ala Thr Ala Ala Gly Gly Leu Ser Gly Gly Thr Gln Ala Leu Leu Gln 115 120 125 Pro Gln Gln Pro Leu Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ala Ala Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gln Pro Arg Lys Cys Ser Ser Arg Arg Asn Ala Trp Gly Asn Leu 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Leu Ile Thr Arg Ala Ile Glu Ser Ser Pro Asp Lys 165 170 175 Arg Leu Thr Leu Ser Gln Ile Tyr Glu Trp Met Val Arg Cys Val Pro 180 185 190 Tyr Phe Lys Asp Lys Gly Asp Ser Asn Ser Ser Ala Gly Trp Lys Asn 195 200 205 Ser Ile Arg His Asn Leu Ser Leu His Ser Arg Phe Met Arg Val Gln 210 215 220 Asn Glu Gly Thr Gly Lys Ser Ser Trp Trp Ile Ile Asn Pro Asp Gly 225 230 235 240 Gly Lys Ser Gly Lys Ala Pro Arg Arg Arg Ala Val Ser Met Asp Asn 245 250 255 Ser Asn Lys Tyr Thr Lys Ser Arg Gly Arg Ala Ala Lys Lys Lys Ala 260 265 270 Ala Leu Gln Thr Ala Pro Glu Ser Ala Asp Asp Ser Pro Ser Gln Leu 275 280 285 Ser Lys Trp Pro Gly Ser Pro Thr Ser Arg Ser Ser Asp Glu Leu Asp 290 295 300 Ala Trp Thr Asp Phe Arg Ser Arg Thr Asn Ser Asn Ala Ser Thr Val 305 310 315 320 Ser Gly Arg Leu Ser Pro Ile Met Ala Ser Thr Glu Leu Asp Glu Val 325 330 335 Gln Asp Asp Asp Ala Pro Leu Ser Pro Met Leu Tyr Ser Ser Ser Ala 340 345 350 Ser Leu Ser Pro Ser Val Ser Lys Pro Cys Thr Val Glu Leu Pro Arg 355 360 365 Leu Thr Asp Met Ala Gly Thr Met Asn Leu Asn Asp Gly Leu Thr Glu 370 375 380 Asn Leu Met Asp Asp Leu Leu Asp Asn Ile Thr Leu Pro Pro Ser Gln 385 390 395 400 Pro Ser Pro Thr Gly Gly Leu Met Gln Arg Ser Ser Ser Phe Pro Tyr 405 410 415 Thr Thr Lys Gly Ser Gly Leu Gly Ser Pro Thr Ser Ser Phe Asn Ser 420 425 430 Thr Val Phe Gly Pro Ser Ser Leu Asn Ser Leu Arg Gln Ser Pro Met 435 440 445 Gln Thr Ile Gln Glu Asn Lys Pro Ala Thr Phe Ser Ser Met Ser His 450 455 460 Tyr Gly Asn Gln Thr Leu Gln Asp Leu Leu Thr Ser Asp Ser Leu Ser 465 470 475 480 His Ser Asp Val Met Met Thr Gln Ser Asp Pro Leu Met Ser Gln Ala 485 490 495 Ser Thr Ala Val Ser Ala Gln Asn Ser Arg Arg Asn Val Met Leu Arg 500 505 510 Asn Asp Pro Met Met Ser Phe Ala Ala Gln Pro Asn Gln Gly Ser Leu 515 520 525 Val Asn Gln Asn Leu Leu His His Gln His Gln Thr Gln Gly Ala Leu 530 535 540 Gly Gly Ser Arg Ala Leu Ser Asn Ser Val Ser Asn Met Gly Leu Ser 545 550 555 560 Glu Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys His Gln Gln Gln Ser Pro Val 565 570 575 Ser Gln Ser Met Gln Thr Leu Ser Asp Ser Leu Ser Gly Ser Ser Leu 580 585 590 Tyr Ser Thr Ser Ala Asn Leu Pro Val Met Gly His Glu Lys Phe Pro 595 600 605 Ser Asp Leu Asp Leu Asp Met Phe Asn Gly Ser Leu Glu Cys Asp Met 610 615 620 Glu Ser Ile Ile Arg Ser Glu Leu Met Asp Ala Asp Gly Leu Asp Phe 625 630 635 640 Asn Phe Asp Ser Leu Ile Ser Thr Gln Asn Val Val Gly Leu Asn Val 645 650 655 Gly Asn Phe Thr Gly Ala Lys Gln Ala Ser Ser Gln Ser Trp Val Pro 660 665 670 Gly

Claims

포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 여부를 조사하는 것을 포함하는 FOXO3 단백질의 수준을 분석하는 방법.
제1항에 있어서,
단백질의 O-GlcNAc 당화는 서열번호 1의 염기서열에서 S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 위치에서 O-GlcNAc 당화 여부를 조사하는 것인, FOXO3 단백질의 수준을 분석하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 O-GlcNAc 당화 여부는 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 이용하여 수행되는 것인, FOXO3 단백질의 수준을 분석하는 방법.
포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 시료와 후보물질을 접촉시키는 것;
상기 시료의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것; 및
상기 후보물질과 접촉 후 시료의 O-GlcNAc 당화 수준이 후보물질과 접촉 전 시료의 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준과 비교해서 더 낮아진 경우 상기 후보물질은 항암활성이 있는 것으로 판단하는 것;을 포함하는 항암물질 스크리닝 하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질을 발현하는 세포는 췌장암 세포주, 위암 세포주, 간암 세포주 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 항암물질 스크리닝 방법.
제4항에 있어서,
포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화는 서열번호 1의 염기서열에서 S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 위치에서 O-GlcNAc 당화 여부를 조사하는 것인, 항암물질 스크리닝 방법.
포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 항암물질 스크리닝용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 1의 염기서열에서 S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위 중 O-GlcNAc 당화가 일어난 곳에 특이적으로 결합하는 것인, 항암물질 스크리닝용 조성물.
개체로부터 분리된 시료에서 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것;을 포함하는 치료 예후를 예측하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 개체에 항암 치료 전 개체로부터 분리된 시료에서 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준과 항암 치료 후 개체로부터 분리된 시료에서 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 비교하여, 치료 후 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준이 더 낮은 경우, 항암 치료의 효과가 있다고 판단하는 것;을 더 포함하는 치료 예후를 예측하는 방법.
개체로부터 분리된 시료에 항암제를 처리하는 것;
상기 항암제 처리된 시료의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 측정하는 것;을 포함하는 개체의 항암제에 대한 감수성을 확인하는 방법.
제11항에 있어서,
상기 시료에 항암제 처리 전 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준과 항암제 처리 후 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준을 비교하여, 항암제 처리 후 FOXO3 단백질의 O-GlcNAc 당화 수준이 더 낮은 경우, 항암제에 대한 감수성이 있다고 판단하는 것; 더 포함하는 개체의 항암제에 대한 감수성을 확인하는 방법.
포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 물질을 포함하는 항암용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 물질은 서열번호 1의 염기서열에서 S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위의 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 것인, 항암용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 물질은 서열번호 1의 염기서열에서 S284 부위의 O-GlcNAc 당화를 저해하는 것인, 항암용 조성물.
개체로부터 분리된 시료에서 포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화여부를 측정하는 것;을 포함하는 췌장암의 진단을 위한 정보의 제공 방법.
포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질의 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 암 진단용 조성물.
제17항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 1의 염기서열에서 S284, S286, S411, T475, S476, S482, S551 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 위치에서 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 것인, 암 진단용 조성물.
포크머리상자 O 3(FOXO3) 단백질을 특이적으로 인식하는 항체; 및 O-GlcNAc 당화를 특이적으로 인식하는 항체;를 포함하는 암 진단용 키트.