KR20100093595A

KR20100093595A - 인간 유방암의 전이 능력을 예측하는 카피수 변경

Info

Publication number: KR20100093595A
Application number: KR1020107015456A
Authority: KR
Inventors: 이 장; 잭 엑스. 유; 위츄 쟝; 이신 왕
Original assignee: 베리덱스, 엘엘씨
Priority date: 2007-12-14
Filing date: 2008-12-15
Publication date: 2010-08-25
Also published as: WO2009079450A2; WO2009079450A3; US20090155805A1; CA2709395A1; CN101918591A; JP2011505840A; BRPI0821503A2; EP2231874A2; IL206194A0

Abstract

염색체의 소정의 구획에서 모든 SNP(단일 뉴클레오티드 다형성)의 유의성을 요약하여 예후적 가치가 있는 염색체 부위를 규정함으로써 예후적 가치가 있는 염색체 부위를 규정하는 방법이 본 명세서에서 개시된다. 특정된 유전자 내의 SNP에 기반하여, 유방암에 대한 더욱 정확한 예후가 제공될 수 있다.

Description

인간 유방암의 전이 능력을 예측하는 카피수 변경{Copy number alterations that predict metastatic capability of human breast cancer}

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 2007년 12월 14일자로 출원된, 공계류 중인 미국 가특허 출원 제61/007,650호에 대한 우선권 및 그 이득을 청구하며, 상기 미국 가특허 출원은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명은, 일 실시 형태에서, 특정 유전자 내 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)의 개수를 결정함으로써 유방암에 대한 예후를 제공하는 방법에 관한 것이다.

유방암은 매우 다양한 임상적 증상, 병리학적 유형 및 성장 속도를 나타내는 이질적 질환이다. 탐지가능한 림프절 병발(involvement)이 없는 환자들(저 위험도인 것으로 생각되는 집단) 중, 20-30%의 환자들은 5년 내지 10년의 추적 검사 후 재발성 질환이 발병된다. 재발의 위험이 있는 이러한 군의 개인의 확인은 현재 신뢰성있게 행해질 수 없다.

결실, 삽입 및 증폭과 같은, DNA 카피수 변경(copy number alteration, CNA) 또는 카피수 다형성(copy number polymorphism, CNP)은 발암에 기여하는 주요한 게놈 변경 중 하나인 것으로 여겨진다. 통상적인 그리고 어레이에 기반한(array-based) 비교 게놈 혼성화(comparative genomic hybridization) 둘 모두 유방 종양 내에 변경된 염색체 부위를 나타내었다. 그러나, 고 처리량(high throughput), 고 해상도 플랫폼을 사용하여 DNA 카피수 변경과 유방암 예후의 관계를 조사한 연구는 없다.

본 발명에서 개시되는 방법은 카피수 변경(CNA)을 사용하여 환자 예후 결과를 예측하는 것을 실현 가능하게 만든다. 예후에 대한 유전자 발현-기반 사인(signature)과 조합되는 경우, 카피수 사인(copy number signature, CNS)은 위험도 분류를 개량하고, 유의하게 악화된 예후 전망 및 화학요법 약물에 대한 잠재적으로 차별적인 응답을 갖는 유방암 환자를 확인할 수 있다.

본 명세서에서 논의된 실시예에서는, 고 처리량 및 고 해상도 올리고-뉴클레오티드-기반 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP) 어레이 기술을 사용하여 유방암 게놈 내의 100,000개 초과의 SNP 유전자좌에 대해 CNA를 분석하였다. 313명의 LNN(림프절 음성(lymph node negative)) 유방암 환자의 대규모 코호트(large cohort)에서, 원격 전이가 발병할 확률이 매우 높은 환자의 하위세트와 상관된 CNA를 확인하였다. CNA의 예후력을 2개의 독립적인 환자 코호트 내에서 확인하였다. 또한, 공개된 예측 유전자 사인을 사용하여, 상이한 예후를 갖는 확인된 환자 하위군(subgroup)을 추정(putative) 약물 효능에 대해 검사하였다. 결과는 DNA 카피수 분석과 유전자 발현 분석의 조합이 유방암 환자에 대한 위험도 평가에 있어서 추가적인 그리고 더 우수한 수단을 제공함을 나타낸다.

본 발명은 첨부하는 도면을 참고로 하여 개시된다.
<도 1>
도 1은 예후적 카피수 변경(CNA)을 갖는 유전자(SNP)를 확인하기 위한 분석 작업 흐름도.
<도 2a 및 도 2b>
도 2a 및 도 2b는 예후적 CNA를 갖는 염색체 부위를 도시한 도면.
<도 3>
도 3은 CNS의 함수로서의 무-원격 전이 생존률을 도시한 도면.
<도 4>
도 4는 화학요법 화합물에 대한 민감도를 예시한 도면.
<도 5>
도 5는 ER-양성 및 ER-음성 종양의 차별성을 도해적으로 도시한 도면.
<도 6>
도 6은 ER-음성 종양의 소정의 데이터를 예시한 도면.
본 명세서에 개시된 실시예는 본 발명의 여러 실시 형태를 설명하지만 어떤 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

결실 및 증폭과 같은 특정 DNA 카피수 변경(CNA)은 감소된 아폽토시스(apoptosis), 저지되지 않는 증식(unchecked proliferation), 증가된 운동성 및 혈관신생(angiogenesis)을 통한 발암 및 종양 진행에 기여하는 주요한 게놈 변경이다. 게놈 이상의 상당한 비율은 암 생물학과 관련이 없고 단지 무작위적 중성 이벤트(neutral event)로 인한 것이기 때문에, 궁극적으로 악성 전환 및 진행에 이르게 하는 유전자 발현 조절에 책임이 있는 원인 유전자 CNA를 확인하는 것은 난제이다. 형광 원위치(in situ) 혼성화 및 비교 게놈 혼성화(CGH) 둘 모두 유방 종양 내에 CNA를 보이는 염색체 부위를 나타내었다. 51가지의 유방 종양을 포함하는 최근 연구에서는, 고 해상도 SNP 어레이가 유방암 앰플리콘(amplicon) 경계를 한정하고 잠재적인 드라이버(driver) 유전자들의 목록을 좁히기 위해 유전자-발현 프로파일링(profiling)과 함께 사용되었다. 그러나, 제한된 개수의 연구만이 CNA의 예후적 유의성(prognostic significance)과 관련하여 CNA를 조사하였으며, 한편 이들 연구의 샘플 크기는 확고한 결론을 끌어내기에는 너무 작았다. 또한, 보다 소수의 연구는 CNA 및 유전자 발현 프로파일링과, 인간 게놈의 적절한 커버 및 지도화(mapping) 해상도를 갖는 기술 및 충분한 샘플 크기의 조합된 분석을 이용해 유방암 예후를 조사하였다.

본 명세서는 313가지의 림프절-음성(LNN) 원발성 유방 종양 (그에 대한 게놈-광범위 유전자 발현 데이터가 또한 입수가능함) 유래의 게놈 DNA 내에서 인간 게놈 전체에 대해 100,000개 초과의 SNP 유전자좌에 대한 DNA 카피수의 분석을 기술한다. 이들 2가지 데이터 세트의 조합은 게놈 유전자좌의 확인, 및 원격 전이와의 상관성이 높은 이들의 지도화된 유전자의 확인을 허용하였다. 확인된 환자 하위군을 공개된 예측 사인을 근거로 하여 추정 약물 효능에 대해 추가로 검사하였다.

DNA 카피수와 유전자 발현의 조합된 분석을 어떠한 보조 전신 요법도 받지 않은 313명의 LNN 유방암 환자의 대규모 코호트에 대해 수행하였다. 본 발명자들이 아는 한, 이는 aCGH보다 훨씬 더 높은 해상도를 갖는 고-밀도 SNP 어레이 기술을 이용하여 유방암 예후에 대해 CNA를 분석하기 위한 가장 큰 연구이다. CNA 및 동향성(concordant) 유전자 발현 조절을 나타내는 81개 유전자의 사인을 200명 LNN 환자의 트레이닝 세트(training set)로부터 확인하였다. 이 CNS를 116명 LNN 환자의 외부 aCGH 데이터 세트에서뿐만 아니라, 독립적인 113명 LNN 환자에서도 확인하였다. 81-유전자 CNS에 의해 확인된 특히 신속한 재발이 있는 매우 불량한 예후군은 실제로 76-유전자 GES 단독으로 예측된 불량한 예후 환자의 하위세트를 구성하기 때문에 예비적 임상 유용성이 입증되었다. 따라서 GES 외에 CNS를 적용함으로써, 유방암 환자의 예후에 대한 위험도 분류는 명확히 개선된다. 더욱이, 화학요법 화합물에 대한 민감도에 대해 이전에 보고된 유전자 사인 프로파일을 이용함으로써, 이 매우 불량한 예후군이 수술 전 T/FAC 조합 화학요법, 특히 에토포시드와 토포테칸으로부터는 효과를 보지만, 사이클로포스파미드 및 독소루비신 화합물에 대해서는 훨씬 더 내성일 수 있음이 밝혀졌다. 이는 이 카테고리에 속하는 환자가 면밀히 관찰되고 다른 환자군과 비교하여 상이한 화학요법 계획으로 관리되어야 하며, CNS의 81개 유전자가 또한 화학적 민감도에 중요한 역할을 함을 시사할 수 있다.

유전자 증폭과 유방암 예후 사이의 관련성을 조사한 이전의 연구는 단일 동종 코호트로서 ER 양성 및 ER 음성과 같은 상이한 유방암 아형들을 고려하였다. 그러나, 광대한 별개의 전체적 유전자 발현 프로파일에 의해 입증되는 바와 같이 이들 종양이 병리학적 및 생물학적으로 매우 상이하다는 것은 잘 알려져 있다. 이 이분법(dichotomy)은 또한 DNA 카피수의 전체적 패턴으로 확장되었다. 따라서, ER-양성 및 ER-음성(에스트로겐-수용체 양성 및 음성) 종양에 대한 분석이 개별적으로 수행될 필요가 있었다. 실제로, ER-양성 종양으로부터 확인된 예후적 염색체 부위는 ER-음성 종양 유래의 것과 공통점이 거의 없다. 예를 들어, 염색체 부위 8q는 유방암에서의 불량한 예후와 관련된 DNA 증폭의 널리 알려진 부위이다. 실제로 부위 8q는 ER-양성 종양에서 증폭을 위한 핫스팟(hotspot)이었지만, ER-음성 종양에 있어서는 어떠한 유의한 증폭 영역도 포함하고 있지 않았다. ER-음성 종양은 LNN 유방암의 단지 작은 비율(약 25%)만을 구성하기 때문에, 이들의 분석에서 2가지 유형의 유방 종양을 구분하지 않았던 연구들이 ER-양성 종양의 대부분의 샘플들로부터의 결과에 의해 압도되는 이들의 결론을 내릴 수 있음을 추측하는 것은 합리적이다. 본 발명의 분석으로부터 관찰된 2가지 유형의 종양 사이의 다른 명백한 차이는 염색체 부위 20q13.2-13.3에 있다. ER-양성 종양에서 이 부위의 카피수의 증가, 그러나 반대로, ER-음성 종양에서 이 부위의 카피수의 손실은 조기 재발과 관련이 있었다. 종합하면, 이들 결과는 ER-양성 및 ER-음성 종양이 암 발생 및 진행에 있어서 상이한 생물학적 경로를 따라감을 재-강조한다.

예후적 염색체 부위의 확인

각 SNP의 사분위(interquartile) 카피수 개산으로부터 산출된 평균 카피수의 중앙값은 2.1이었고, 이는 대다수의 게놈이 이배체라는 일반적 가설과 일치하였다. 모든 313개 종양에 대한 PCA를 이용한 무감독(unspervised) 분석은 염색체 카피수 변이가 ER-양성과 ER-음성 종양 사이에서 명확한 성향의 구분을 나타내었음을 보여주었다(도 5). 따라서, 이들 2가지 유형의 유방 종양은 이전의 많은 연구에 의해 나타내어진 바와 같이 전체적 유전자 발현 프로파일 상에서 상이할 뿐만 아니라, DNA 수준에서 별개의 염색체 변이도 갖는다. 따라서, 후속 분석은 ER-양성 및 ER-음성 종양에 대해 개별적으로 수행될 필요가 있다. 환자를 대략 2:1 비로 200명 환자의 트레이닝 세트(ER-양성 종양에 대해 133명 및 ER-음성 종양에 대해 67명) 및 113명 환자의 검사 세트(ER-양성 종양에 대해 66명 및 ER 음성 종양에 대해 47명)로 무작위로 나누었다(표 1 및 도 1). 트레이닝 세트는 예후적 염색체 부위 및 지도화된 유전자를 확인하고 원격 전이를 예측하기 위해 CNS를 구축하는데 사용하였고; 검사 세트는 단지 확인 목적을 위해 따로 놔두었다.

먼저, CNA가 환자의 DMFS와 상관된 염색체 부위를 확인하였다. ER-양성 종양에 있어서, 17개 염색체 전체에 분포된 45개 염색체 부위가 DMFS와 상관된 CNA를 갖는 것으로 확인되었고(도 2a 및 표 7), ER-음성 종양에 있어서는 19개 염색체 전체에 분포된 56개 부위가 확인되었다(표 8). ER-양성 및 ER-음성 종양에 있어서의 이들 부위 크기의 총계는 각각 521 Mb(표 4) 및 496 Mb(표 5)였다. ER-양성 종양으로부터 확인된 예후적 염색체 부위는 ER-음성 종양 유래의 것과 공통점이 거의 없다(도 2a 및 도 2b).

200명 환자의 트레이닝 세트에서, 113명 환자의 독립적 검사 세트(위험비 [HR]: 2.8, 95% 신뢰 구간 [CI]: 1.4 - 5.6, p = 0.0036)에서, 및 116명 환자의 외부 데이터 세트(HR: 3.7, 95 CI: 1.3 - 10.6, p = 0.0102)에서 높은 원격 전이 가능성을 갖는 환자의 하위군을 확인하는 81-유전자 예후적 카피수 사인(CNS)을 구축하였다. 이들 고-위험도 환자는 본 발명자들의 앞서 확립된 76-유전자 발현 사인(GES)에 의해 예측된 고-위험도 환자의 하위세트를 구성하였다. CNS 및 GES에 의해 확인된 이 매우 불량한 예후군은 추정적으로 수술 전 파클리탁셀 및 5-FU-독소루비신-사이클로포스파미드(T/FAC) 조합 화학요법(p = 0.0003)에 대해, 특히 독소루비신 및 사이클로포스파미드 화합물에 대해 더욱 내성적인 반면, 에토포시드 및 토포테칸으로부터는 잠재적으로 덕을 본다.

환자 샘플

에라스무스 메디칼 센터(Erasmus Medical Center)(네덜란드 로테르담 소재)의 종양 은행으로부터 선택된 313명 LNN 유방암 환자의 냉동 종양 시편을 본 연구에 사용하였다. 이들 환자들 중 누구도 임의의 전신 (신)보조 요법을 받지 않았다. 국소적 일차 치료에 대한 지침은 동일하였다. 이들 시편 중에서, 273개를 어피메트릭스(Affymetrix) U133A 칩을 사용해 원격 전이의 예측을 위한 76-유전자 사인을 개발하는데 사용하였다. 나머지 40명 환자는 예후적 생물학적 경로를 연구하는데 사용하였다. 본 연구는 네덜란드, 에라스무스 MC 로테르담의 의료 윤리 위원회(MEC 02.953)로부터 승인을 받았고, 네덜란드의 의과학 협회 총연맹(Federation of Medical Scientific Societies)의 행동 수칙(http://www.fmwv.nl/)에 따라 수행되었으며, 가능한 경우에는 언제나 종양 마커 예후 연구 REMARK를 위한 보도 권고안에 따랐다.

앞서 기술된 ER (및 PgR) 컷오프를 이용해, 199개 종양의 샘플링을 ER 양성으로, 114개 종양의 샘플링을 ER 음성으로 분류하였다. 수술(유방보존술(BCS): 230명 환자; 변형근치유방절제술: 83명 환자) 시점에서 환자의 중간 연령은 54세(범위, 26세-83세). 생존 환자(n = 220)에 대한 중간 추적 검사 기간은 99개월(범위, 20개월-169개월)이었다. 총 114명의 환자(36%)에서 원격 전이가 발생하였고 이들은 DMFS의 분석에서 실패로 카운팅하였다. 사망한 93명의 환자 중, 7명은 질환의 증거 없이 사망하여 DMFS의 분석에서 최후 추적 검사에서 삭제되었고; 86명의 환자는 이른 재발 후 사망하였다. 환자들의 임상병리학적 특징이 표 1에 제시되어 있다. 임상적 및 SNP 데이터를 포함하는 데이터 세트를 등록 번호 10099로 유전자 발현 옴니버스 데이터베이스(Gene Expression Omnibus database)에 제출하였다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo, 사용자명: jyu8; 비밀번호: jackxyu).

독립된 확인으로서 본 연구에 사용된 116명 LNN 환자의 외부 어레이 CGH(aCGH) 데이터 세트는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE8757로부터 다운로드받았다. 이 데이터 세트와 관련된 임상 데이터(표 1)는 영국 캠브리지 대학의 테센도르프(Teschendorff) 박사가 친절하게 제공하였다.

DNA 단리, 혼성화 및 DNA 카피수 분석

게놈 DNA를 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 퀴아앰프 DNA 미니 키트(QIAamp DNA mini kit)(네덜란드 벤로(Venlo) 소재의 퀴아젠(Qiagen))를 이용해 5 내지 10개의 30 ㎛ 종양 크리오스탯 절편(cryostat section)(10-25 mg)으로부터 단리하였다. 각 환자 샘플로부터의 게놈 DNA를 표준 프로토콜에 따라서 어피메트릭스 유전자칩(등록상표) 지도화 100K 어레이 세트(미국 캘리포니아주 산타 클라라소재의 어피메트릭스)를 이용해 대립유전자형을 분석하였다. 간략히, 250 ng의 게놈 DNA를 Hind III 또는 XbaI으로 절단한 후, 코헤시브(cohesive) 4 염기쌍(bp) 오버행(overhang)을 인식하는 어댑터에 라이게이션시켰다. 어댑터 서열을 인식하는 일반 프라이머를 디엔에이 엔진(DNA Engine)(미국 마이애미주 워터타운 소재의 엠제이 리서치(MJ Research))을 이용하여 250 내지 2000 bp 크기 범위의 단편을 우선적으로 증폭하도록 최적화된 PCR 조건을 이용해 어댑터-라이게이션된 DNA 단편을 증폭하는데 사용하였다. 퀴아젠 민일루트(Qiagen MinElute) 96 UF PCR 정제 시스템을 이용한 정제 후, 총 40 ㎍의 PCR 생성물을 단편화하였고 약 2.9 ㎍을 4% TBE 아가로스 젤 상에서 시각화하여 DNA 단편의 평균 크기가 180 bp보다 작음을 확인하였다. 이어서 단편화된 DNA를 바이오틴으로 표지하고 혼성화 오븐 내에서 17시간 동안 480C에서 어피메트릭스 유전자칩(등록상표) 인간 지도화 100K 어레이 세트에 혼성화하였다. 어레이를 세척하고 어피메트릭스 플루이딕스 스테이션(Affymetrix Fluidics Station)을 사용해 염색하고, 유전자칩 스캐너 3000 G7 및 유전자칩(등록상표) 작동 소프트웨어(GCOS)(어피메트릭스)를 이용해 스캔하였다. GTYPE(어피메트릭스) 소프트웨어를 어레이 상에서 각 프로브 세트에 대한 SNP 콜(call)을 생성하는데 사용하였다. SNP 콜을 연구 전체에서 프로브 세트의 96.6%에 대해 결정하였으며, 이때 표준 편차는 2.6%였다. 이어서 CCNT 3.0 소프트웨어를 각 프로브 세트의 카피수를 나타내는 값을 생성하는데 사용하였다. 이는 각 칩의 혼성화 강도를 다양한 인종의 100명 초과의 정상 개인들에 있어서의 제조사 제공된 참고용 강도 측정 세트와 비교함으로써 행하였다. 이어서 카피수 측정을 CCNT의 게놈 평탄화 함수(smoothing function)를 이용해 평탄화하였는데, 이때 윈도 크기는 0.5 Mb였다. 어피메트릭스 유전자칩(등록상표) 인간 지도화 100K 어레이 세트는 그에 대한 정확한 지도화 위치가 규정되어 있는 115,353개 프로브를 포함한다. 프로브 세트들 사이의 간격의 중간 길이는 8.6 kb였고, 이 간격의 75%는 28 kb 미만이었고 95%는 94.5 kb 미만이었다.

예후적 카피수 변경을 갖는 염색체 부위의 확인

본 발명자들의 이전 연구로부터 생성된 RNA 유전자 발현 및 본 연구에서 이용가능해진 환자들의 동일한 코호트로부터의 DNA 카피수 둘 모두에 대한 게놈 데이터의 이용가능성을 이용함으로써, 통합적 분석 방법을 염색체 부위 및 그의 CNA가 원격 전이와 상관된 지도화된 후보 유전자를 확인하기 위해 고안하였다(도 1). 본 방법은 앨더(Adler) 등이 채용하고 게놈-광범위 DNA 카피수와 유전자 발현 데이터를 교차시킴으로써 발현 사인의 유전적 조절자를 확인하기 위한 마이크로어레이 사인의 단계적 연계 분석(stepwise linkage analysis of microarray signatures, SLAMS)으로 기재한 접근법과 원칙적으로 매우 유사하다. T 시기, 등급, 폐경 상태 및 재발을 비롯한 임상적 및 병리학적 파라미터에 대해 균형을 이루면서, ER-양성 및 ER-음성 환자를 개별적으로 분석하고 환자들을, 대략 2:1 비로, 200명 환자의 트레이닝 세트 및 113명 환자의 검사 세트로 무작위적으로 나누었다(도 1). 트레이닝 세트는 예후적 염색체 부위 및 지도화된 유전자를 확인하고 원격 전이를 예측하기 위해 CNS를 구축하는데 사용하였고; 검사 세트는 단지 확인 목적을 위해 따로 놔두었다.

본 분석의 제1 단계는 그의 카피수 변경이 원격 전이와 상관된 염색체 부위를 확인하는 것이었다. 간략히, 트레이닝 세트에서, 단일변량 콕스 비례 위험 회귀(univariate Cox proportional-hazards regression)를 각 개인 SNP의 카피수와 DMFS의 시간 사이의 상관관계의 통계적 유의성을 평가하는데 사용하였다. 이어서, 예후적 염색체 부위를 규정하기 위해, 염색체를 평균 250개 SNP를 포함하는 5 Mb의 슬라이딩 윈도를 사용해 1 Mb의 단계로 스캔하여 윈도 내 모든 SNP의 콕스 회귀 p-값들을 수집하고 교체된 데이터 세트에 대해 전체로서 모든 이들 SNP의 평탄화된 p-값을 결정하였다. 간략히, n개 SNP를 포함하는 크기 5 Mb의 주어진 윈도에 있어서, β_i및 P_i는 각각 콕스 회귀 계수 및 i번째 SNP에 있어서의 콕스 회귀로부터의 P 값을 나타낸다. 이 윈도에 대한 로그 점수 S는 하기와 같이 전체로서 이 윈도 내에 모든 SNP의 통계적 유의성을 요약함으로써 규정되었다:

지표 변수(indicator variable) I _i 는 양성적으로 상관된 카피수 변화를 설명하고 이를, 콕스 회귀 계수 β _i 의 신호로 표시되는, 음성적으로 상관된 것들로부터 구분하는데 사용하였다. 양성 계수는 재발한 환자가 무-질환 환자보다 더 높은 카피수를 가짐을 반영하고 음성 계수는 그 반대를 시사하였다. 로그 점수로부터 평탄화된 p-값을 계산하기 위해, 로그 점수의 영 분포(null distribution)를 유도하는 데 순열을 사용하였다. 환자 ID와 관련한 임상 정보를 셔플링(shuffling)함으로써 400개의 순열을 완성하였다. 평탄화된 p-값들로부터, 예후적 염색체 부위는 평탄화된 p-값들이 모두 0.05 미만인 염색체 절편으로 규정되었다.

CNS 및 예측 모델의 구축

일단 예후적 염색체 부위가 확인되었다면, 충분히 규정된 유전자를 UCSC 게놈 브라우저(http://genome.ucsc.edu) Human March 2006(hg18) 어셈블리를 사용해 그들 부위 내 엔트레즈 유전자(Entrez Gene) ID로 지도화하였다. 다음, 2회의 필터링(filtering) 단계를 예후적 가치를 갖는 더 큰 신뢰도의 유전자를 선택하는데 사용하여 CNS를 구축하였다. 먼저, 적어도 하나의 상응하는 어피메트릭스 U133A 프로브 세트 ID를 갖는 유전자들을 필터링 다운하였다(filtered down). 유전자 발현 데이터로부터 통계적으로 유의한 콕스 회귀 p-값(p < 0.05)을 갖는 유전자들만이 끝까지 진행되었다. 둘째로, 유전자 발현 수준과 카피수 사이의 상관관계는 0.5를 초과해야만 한다. 만약 유전자가 내부에 다수의 SNP를 포함한다면, 최상의 콕스 회귀 p-값을 갖는 SNP를 선택하였고; 만약 SNP를 포함하지 않는다면, 가장 근접한 SNP를 선택하였다. U133A 프로브 세트에 있어서, 최상의 콕스 p-값을 갖는 것을 사용하였다.

원격 전이를 예측하기 위해 CNS 내 유전자를 사용하는 모델을 구축하기 위해, 유전자의 수치적 카피수 개산치를 별개의 값(discrete value), 즉, 증폭, 무변화, 또는 결실로 변환시켰다. 이 변환을 수행하기 위해, 각 유전자의 이배체 카피수는 대표적인 SNP의 카피수 데이터에 대한 정상 혼합 모델링을 수행하고 이배체 카피수의 개산치로서 모델링된 분포의 주 피크를 사용함으로써 개산하였다. 이어서 증폭의 경우, 이는 고유한 데이터 가변성으로 인한 낮은 위양성(false positives)을 보장하기 위해 이배체 카피수 개산치보다 1.5 유닛 큰 것으로 규정하였고; 반면 결실은 이 변경의 성질 및 카피수 손실에 있어서의 카피수 데이터의 좁은 분포 때문에 이배체 카피수 개산치보다 0.5 유닛 작은 것으로 규정하였다. 일단 카피수 데이터가 변환되었다면, 하기의 간단하고 직관적인 알고리즘을 예측 모델을 구축하는데 사용하였다. 알고리즘은 만약 적어도 n개 유전자가 재발자로서의 환자에서 변경된 카피수를 갖는다면 이 환자를 재발자로 분류하였고, 만약 그렇지 않으면 비-재발자로 분류하였다. 모든 가능한 시나리오를 CNS 내 1 내지 모든 유전자 범위에서 n에 대해 조사하였고, 유의한 로그-순위 검정(log-rank test) p-값에 의해 측정되는 바와 같이 트레이닝 세트 내 사인의 성능을 조사하고 n이 증가함에 따라 양성 수가 매우 적어지는 상황을 방지하기 위해 양성(재발자로 예측됨)의 백분율에 대한 하한을 설정함으로써 n의 값을 결정하였다.

CNS의 확인

CNS의 성능을 상기에 기술된 것과 동일한 알고리즘을 사용하여 남아있는 검사 환자의 카피수 데이터 세트 및 외부 aCGH 데이터 세트 둘 모두에서 평가하였다. 외부 데이터 세트에 있어서는, 이것이 완전히 상이한 aCGH 기술로부터 유래하고 데이터 포맷이 log2 비이기 때문에, 증폭에 대한 컷오프는 0.45로 설정한 반면 결실에 대한 컷오프는 -0.35로 하여서 SNP 어레이 기술로서 생성된 비견되는 백분율의 양성을 보장하였다. CNS의 구축과 함께, CNS 내 유전자들의 상응하는 하위세트를 사용하여 개별적으로 ER 양성 및 음성 종양에서 확인을 수행하였다. 그러나, 드러난 최종 성능은 검사 세트 내에서 ER 양성 및 음성 환자 둘 모두에 있어서 조합된 성능을 나타내었다.

화학요법에 대한 추정 응답

화학요법 화합물에 대한 검사 세트 환자의 추정 응답에 대한 검사를 위해, 2가지의 공개된 연구에서 유전자 발현 사인을 사용하였다. 원래의 유전자 발현 데이터 세트 및 30-유전자 수술 전 파클리탁셀, 플루오로우라실, 독소루비신 및 사이클로포스파미드(T/FAC) 응답 사인에 대한 대각선 선형 판별 분석(diagonal linear discriminant analysis, DLDA)의 예측 알고리즘에 대한 R 함수를 http://bioinformatics.mdanderson.org/pubdata.html로부터 다운로드 받았다. 이 모델을 제공된 R 함수를 사용해 원래 데이터 세트로부터 트레이닝하고 이어서 본 발명의 유전자 발현 데이터 세트에서 검정하였다. 개별적인 화학요법 약물에 대한 민감도를 예측하는 7개의 유전자 발현 사인들 각각에 대해, 이항 프로빗(binary probit) 회귀 모델의 베이시안 피팅(Bayesian fitting)을 이용하여 각 화합물에 대한 민감도의 예측 확률을 아닐 포티(Anil Potti) 박사 및 조셉 네빈스(Joseph Nevins) 박사의 도움으로 계산하였다(상세한 사항은 문헌[Potti A, Dressman HK, Bild A, Riedel RF, Chan G, Sayer R, et al, Genomic signatures to guide the use of chemotherapeutics. Nat Med. 2006 Nov;12(11):1294-300]을 참고).

통계 분석

주성분 분석(principal component analysis, PCA)을 이용한 무감독 분석을 모든 SNP를 갖는 카피수 데이터 세트에 대해 수행하여 종양의 잠재적 하위클래스를 조사하였다. 카플란-메이어 생존 곡선(Kaplan-Meier survival plot) 및 로그-순위 검정을 예측된 고 위험도 및 저 위험도 군의 DMFS에서의 차이를 평가하는데 사용하였다. 콕스의 비례-위험 회귀를 HR 및 그의 95% CI를 계산하기 위해 수행하였다. 등급에 대한 누락된 데이터로 인해, 일반적인 위치 모델(문헌[Schafer JL. Analysis of incomplete multivariate data. London: Chapman & Hall/CRC Press; 1997]) 하에서 마코프 체인 몬테 카를로 방법(Markov Chain Monte Carlo method)에 따라 다변량(multivariate) 콕스 회귀 분석을 수행하였다. T 검정을 예후 군 중 차별적 치료 응답의 유의성을 평가하기 위해 수행하였다. 모든 통계 분석을 R 버전 2.6.2를 이용해 수행하였다.

CNS를 구축하기 위한 예후적 후보 유전자의 조사

동일한 종양에 대한 본 발명자의 이전 연구로부터의 유전자 발현 프로파일링 데이터를 사용하여(문헌[Wang Y, Klijn JG, Zhang Y, Sieuwerts AM, Look MP, Yang F, et al, Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer. Lancet. 2005 Feb 19;365(9460):671-9] 및 문헌[Yu JX, Sieuwerts AM, Zhang Y, Martens JW, Smid M, Klijn JG, et al, Pathway analysis of gene signatures predicting metastasis of node-negative primary breast cancer. BMC Cancer. 2007 Sep 25;7(1):182]) 유전자 발현 프로파일과 카피수 변이 사이에 일관된 변화 패턴을 갖는 유전자에 대해 스크리닝하였다. 카피수에서의 변화가 표현형 효과를 갖기 위해 유전자 발현 수준에서의 상응하는 변화에 반영되어야 하는 것이 합리적이라고 생각되었다. 이들 예후적 부위 내에, 총 2,833개 및 3,656개 유전자를 각각 ER-양성 종양(표 4) 및 ER-음성 종양(표 5)에 대해 지도화하였다. ER-양성 종양에 있어서, 122개 유전자가 유전자 발현 데이터와 카피수 데이터 둘 모두에서 유의한 콕스 회귀 p < 0.05를 가졌고, DNA 카피수와 유전자 발현에서의 변화에 대해 동일한 방향을 나타내었다. ER-음성 종양에 있어서, 78개 유전자가 둘 모두의 데이터 세트에서 유의한 p-값을 가졌고, 동일한 방향의 변경을 나타내었다(도 6). 이들 중, ER-양성 종양에 대한 53개(43%) 유전자 및 ER-음성 종양에 대한 28개(36%) 유전자는 각각 0.5를 초과하는 유전자 발현과 카피수 사이의 상관 계수를 가졌다. 따라서 총 81개 예후적 후보 유전자를 확인하였고 이들을 이후에 예후에 대한 CNS로 사용하였다(표 2 및 표 6A 및 6B).

CNS의 확인

각각 CNS로부터 53개 및 28개 유전자를 사용하는 검사 세트에 대해 개별적으로 ER 양성 및 음성 종양에서 확인을 수행하였다. 드러난 최종 성능은 2개 하위군의 조합된 결과를 나타내었다. 113명의 독립된 환자의 검사 세트에서, 81-유전자 CNS에 의해 계층화된 2개 환자 군의 카플란-메이어 분석은 2.8의 위험비(HR)(p = 0.0036)를 갖는 원격 전이에 대한 시간에서의 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(도 3, A). 2개 군에 대한 5년째 원격 전이의 추정된 비율은 각각 27%[95% 신뢰 구간(CI), 17% 내지 35%] 및 67%(95% CI, 32% 내지 84%)였다. 본 발명자의 이전에 확인된 76-유전자 GES(문헌[Wang Y, Klijn JG, Zhang Y, Sieuwerts AM, Look MP, Yang F, et al. Gene-expression profiles to predict distant metastasis of lymph-node-negative primary breast cancer. Lancet. 2005 Feb 19;365(9460):671-9])와 함께 사용하는 경우, 81-유전자 CNS로 규정된 더욱 악화된 예후 결과를 갖는 환자 군은 67%의 5년째 추정된 원격 전이와 동일하게 남아있었다. 76-유전자 GES는 더 나은 예후를 갖는 다른 환자 군을 각각 11% 및 37%의 5년째 추정 재발률을 갖는 우수 및 불량 예후 군으로 추가로 계층화하였다(도 3, B). 이 결과는 3개 예후 군으로 되었는데, 각각 GES 우수/CNS 우수, GES 불량/CNS 우수, GES 불량/CNS 불량 군에 대해 우수, 불량 및 매우 불량한 군으로서 규정하였다. 전통적인 임상 및 병리학적 인자들과 함께 둘 모두의 사인을 다변량 콕스 회귀 분석하면 상기 2개 사인의 조합이, DMFS에 있어서의 유일하게 유의한(공산비(likelihood ratio) 검정 p = 0.0003) 예후 인자였음이 나타났으며, 이때 매우 불량 대 우수 예후 군을 비교하면 HR이 8.86이고, 및 불량 대 우수 예후 군의 비교에 있어서는 HR이 3.59였다(표 3).

다음에, CNS를 더 낮은 해상도의 aCGH 기술로부터 유래하는 116명 LNN 환자(79 ER-양성 및 37 ER-음성 종양)의 완벽하게 독립된 외부 데이터 세트에서 검사하였다(문헌[Chin SF, Teschendorff AE, Marioni JC, Wang Y, Barbosa-Morais NL, Thorne NP, et al, High-resolution array-CGH and expression profiling identifies a novel genomic subtype of ER negative breast cancer. Genome Biol. 2007 Oct 9;8(10):R215]). 81-유전자 CNS는 이 환자 코호트(도 3, C)를 3.7의 HR(p = 0.0102)을 갖는 2개의 예후 군으로 유의하게 계층화하였고, 이는 연령, 종양 크기, 등급, ER 상태(p = 0.015)를 포함하는 다변량 콕스 회귀 분석에서 유일하게 유의한 예후 인자로 남아있었다. 불량한 예후 군에 있어서의 5년째 원격 전이의 더 낮은 비율(19%)은 본 발명자의 데이터 세트의 것과 비교하면, 더 작은 종양 크기(2 cm 미만이 78%) 및 환자의 1/3 초과가 이 코호트에서 보조(adjuvant) 호르몬 및/또는 화학요법을 받았다는 사실에 기인하는 것 같았다(표 1).

화학요법에 대한 응답

후속적으로, 두 연구로부터 유래된 잘 확인된 유전자 사인을 사용하여 GES 및 CNS 예후 분석에 의해 결정된 3개 예후 군에 대해 화학요법 응답 프로파일을 조사하였으며 (문헌[Potti A, Dressman HK, Bild A, Riedel RF, Chan G, Sayer R, et al. Genomic signatures to guide the use of chemotherapeutics. Nat Med. 2006 Nov;12(11):1294-300] 및 문헌[Hess KR, Anderson K, Symmans WF, Valero V, Ibrahim N, Mejia JA, et al, Pharmacogenomic predictor of sensitivity to preoperative chemotherapy with paclitaxel and fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide in breast cancer. J Clin Oncol. 2006 Sep 10;24(26):4236-44]), 이것에 있어서 추적 검사 확인 연구가 또한 이용가능하였다 (문헌[Bonnefoi H, Potti A, Delorenzi M, Mauriac L, Campone M, Tubiana-Hulin M, et al. Validation of gene signatures that predict the response of breast cancer to neoadjuvant chemotherapy: a substudy of the EORTC 10994/BIG 00-01 clinical trial. Lancet Oncol. 2007 Dec;8(12):1071-8] 및 문헌[Peintinger F, Anderson K, Mazouni C, Kuerer HM, Hatzis C, Lin F, et al. Thirty-gene pharmacogenomic test correlates with residual cancer burden after preoperative chemotherapy for breast cancer. Clin Cancer Res. 2007 Jul 15;13(14):4078-82]). 먼저, 수술 전 T/FAC 화학요법에 대한 병리학적 완전 응답(pathological complete response, pCR)을 예측하는 이전에 공개된 30-유전자 사인(문헌[Hess KR, Anderson K, Symmans WF, Valero V, Ibrahim N, Mejia JA, et al, Pharmacogenomic predictor of sensitivity to preoperative chemotherapy with paclitaxel and fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide in breast cancer.. J Clin Oncol. 2006 Sep 10;24(26):4236-44])를 사용하여, 상이한 예후 하위군 내 각 환자를 2개 응답 군: pCR을 갖는 군 또는 여전히 잔여 질환을 갖는 군으로 할당하였다. 매우 불량한 예후 군 내 15명 환자 중 단 2명(13%)만이 pCR을 갖는 것으로 예측된 반면, 각각 불량한 예후 군 내 60명 환자 중 34명(57%) 및 우수 예후 군 내 38명 환자 중 14명(37%)이 pCR을 갖는 것으로 예측되었다. 매우 불량한 예후 군에 대한 화학 응답 점수는 불량한 예후 군에 대한 것보다 유의하게 낮았는데(p = 0.0003), 이는 이들 환자가 수술 전 T/FAC 화학요법을 받은 경우에 수술 전 T/FAC 화학요법에 대해 더욱 더 큰 내성을 가짐을 나타낸다(도 4, A). 둘째로, 세포주에 대해 확립된 발현 사인을 사용하여 7가지의 개별적인 화학요법 화합물에 대해 3개 예후 군의 반응 프로파일을 결정하였다(문헌[Potti A, Dressman HK, Bild A, Riedel RF, Chan G, Sayer R, et al, Genomic signatures to guide the use of chemotherapeutics. Nat Med. 2006 Nov;12(11):1294-300). 각 화합물에 있어서, 화합물에 대한 민감도의 예측 확률을 이항 프로빗 회귀 모델의 베이시안 피팅을 이용하여 계산하였다. 불량한 예후 군과 비교하여, 매우 불량한 예후 군 내 환자는 독소루비신(도 4, D)과 사이클로포스파미드(도 4, E)에 더욱 큰 내성을 갖는 것으로 나타났는데, 이는 30-유전자 사인에 의한 T/FAC에 대한 응답의 예측과 일치하였다(도 4, A). 한편, 매우 불량한 예후 군은 에토포시드(도 4, G)와 토포테칸(도 4, H)에 더욱 민감하였다. 따라서, 예후의 사인에 근거한 유전자 발현과 요법 예측을 조합하는 경우, SNP 어레이에 의해 측정된 CNA는 위험도 분류를 개선시키고 유의하게 더욱 악화된 예후 결과와 화학요법 약물에 대해 잠재적으로 차별적인 응답을 갖는 유방암 환자를 확인할 수 있다.

[표 1]

지역 병리학자에 의해 등급을 평가하였고 이는 종양이 수집된 시기 동안 당시의 진료를 반영한다; ER 양성 및 PgR 양성: >10 fmol/mg 단백질 또는 >10% 양성 종양 세포. NA, 이용가능하지 않음.

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

[표 6A]

[표 6B]

상부 53개 유전자는 ER-양성 종양으로부터 유래하고, 하부 28개 유전자는 ER-음성 종양으로부터 유래한다.

[표 7]

[표 8]

Claims

예후적 가치가 있는 염색체 부위를 규정하는 방법으로서,
예후적 가치가 있는 염색체 부위를 규정하기 위하여 염색체의 소정의 구획에서 모든 SNP의 유의성(significance)을 요약하는 단계를 포함하는, 예후적 가치가 있는 염색체 부위를 규정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 요약하는 단계는 상기 부위 내 각 SNP의 콕스 비례 위험 회귀(Cox proportion hazard regression)의 P 값을 결정하고 결합 P 값(combined P value)들을 요약함으로써 행해지는, 예후적 가치가 있는 염색체 부위를 규정하는 방법.
제1항에 있어서, SNP 카피수(copy number)를 상기 소정의 염색체 구획 내에 위치하는 유전자의 발현 수준과 상관시키는 단계를 추가로 포함하는, 예후적 가치가 있는 염색체 부위를 규정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 결합 P 값들을 근거로 치료 계획(treatment regiment)을 개발하는 단계를 추가로 포함하는, 예후적 가치가 있는 염색체 부위를 규정하는 방법.
인간 유방암의 예후를 제공하는 방법으로서,
인간으로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계;
적어도 SMC4, PDCD10, PREP, CBX3, NUP205, TCEB1, TERF1, TPD52, GGH, TRAM1, ZBTB10, YTHDF3, EIF3E, POLR2K, RPL30, CCNE2, RAD54B, MTERFD1, ENY2, DPY19L4, ZNF623, SCRIB, SLC39A4, ATP6V1G1, TCTN3, PSMA6, STRN3, CLTC, TRIM37, NME1, NME2, RPS6KB1, PPM1D, MED13, SLC35B1, APPBP2, MKS1, C17orf71, HEATR6, TMEM49, USP32, ANKRD40, NME1-NME2, ZNF264, ZNF304, ATP5E, CSTF1, PPP1R3D, AURKA, RAE1, STX16, C20orf43, RAB22A, HDAC1, BSDC1, C1orf9, COX5B, EIF5B, DDX18, TSN, p20, METTL5, MGAT1, TUBB2A, RWDD1, PGM3, FOXO3, CDC40, REV3L, HDAC2, TSPYL4, C6orf60, ASF1A, MED23, TSPYL1, ACTR10, KIAA0247, RARA, KRT10, RIOK3, IMPACT, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism)에 대해 상기 DNA 샘플을 조사하는 단계;
상기 DNA 샘플을 조사하는 단계의 결과에 근거하여 인간 유방암에 대한 예후를 제공하는 단계
를 포함하는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
제5항에 있어서, 인간으로부터 유방 종양 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 종양 샘플이 에스트로겐-수용체 양성인지 또는 에스트로겐-수용체 음성인지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 종양 샘플이 에스트로겐-수용체 양성인 것으로 결정되고 상기 단일 뉴클레오티드 다형성이 TCTN3의 손실인 것으로 결정되는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 종양 샘플이 에스트로겐-수용체 음성인 것으로 결정되고 상기 단일 뉴클레오티드 다형성이 HDAC1의 손실, BSDC1의 손실, 또는 이들의 조합인 것으로 결정되는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
인간 유방암의 예후를 제공하는 방법으로서,
인간으로부터 DNA 샘플을 수득하는 단계;
1번 염색체, 2번 염색체, 3번 염색체, 4번 염색체, 5번 염색체, 6번 염색체, 7번 염색체, 9번 염색체, 10번 염색체, 11번 염색체, 12번 염색체, 14번 염색체, 16번 염색체, 17번 염색체, 18번 염색체, 19번 염색체, 20번 염색체, 21번 염색체, 23번 염색체, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 염색체 상에서, 표 7 및 표 8에 상술된 상응하는 개시 염기(starting base)와 종결 염기(ending base) 사이에서 나타나는 단일 뉴클레오티드 다형성에 대해 상기 DNA 샘플을 조사하는 단계;
상기 DNA 샘플을 조사하는 단계의 결과에 근거하여 인간 유방암에 대한 예후를 제공하는 단계
를 포함하는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
제10항에 있어서, 인간으로부터 유방 종양 샘플을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 종양 샘플이 에스트로겐-수용체 양성인지 또는 에스트로겐-수용체 음성인지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 종양 샘플이 에스트로겐-수용체 양성인 것으로 결정되고 상기 단일 뉴클레오티드 다형성이 표 7에 상술된 상응하는 개시 염기와 종결 염기 사이에서 나타나는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 종양 샘플이 에스트로겐-수용체 음성인 것으로 결정되고 상기 단일 뉴클레오티드 다형성이 표 8에 상술된 상응하는 개시 염기와 종결 염기 사이에서 나타나는, 인간 유방암의 예후를 제공하는 방법.