CN104293943A - 检测Ppm1d基因多态突变位点的引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测癌症患者，特别是检测脑胶质瘤患者的 Ppm1d 基因第6号外显子S421-S541段突变的引物和方法，其包括(i)扩增 Ppm1d 基因第478位和525位氨基酸序列的引物；采用Sanger测序技术和测序引物。本发明可一次性快速地将癌症患者体内 Ppm1d 基因突变热点的第478位及第525位氨基酸所有的突变类型检测出来。利用本发明完成的检测结果准确，可以为放疗和化疗提供参考意见，减少病人的负担。

Description

检测Ppm1d基因多态突变位点的引物和方法
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测Ppm1d基因多态突变热点的引物，采用普通PCR技术和Sanger测序，可用于快速检测癌症患者体内Ppm1d基因多态位点的突变情况。
背景技术
Ppm1d基因位于人类第17号染色体上，总长66097bp，共有6个外显子。Ppm1d基因编码的是一种称为蛋白磷酸酶1D(PPM1D)的酶类。PPM1D属于PP2C家族，具有丝氨酸/苏氨酸酶活性。PPM1D是DNA损伤应答中的调控因子，对几个重要的细胞周期检查点包括ATM，CHK等有去磷酸化作用。因此PPM1D功能的行使对环境压力诱导的凋亡起到重要的作用。
人的PPM1D蛋白主要有两个主要区域：N端为高度保守的磷酸酶区，C端为无催化区，但C端序列是蛋白质和多肽的重要结构与功能部位，对蛋白质的生物功能甚至起决定性作用。有研究报道，Ppm1d的6号外显子发生的截断突变具有促进肿瘤细胞生长的功能。这可能是由于6号外显子的突变使PPM1D的C端部分缺失，从而使PPM1D蛋白的磷酸酶功能高活性化，增强对DNA损伤检验蛋白CHK2激活功能的抑制，阻碍癌细胞灭亡。中国每年新增300多万癌症患者，大多数采用放疗和化疗进行治疗，而部分患者对这种治疗方案具有抗性，这可能就与之前报道的Ppm1d基因的截断突变相关。当基因发生这种突变的时候，放疗和化疗不仅没有好的治疗效果，还增加病人的负担。
目前，发现的Ppm1d突变中有功能性增强突变的多发生于PPM1D的C端，本发明中所检测的两个热点突变C478X(1434C>A)和E525X(1573G>T)均为6号外显子上的截断突变，其中478位的突变与乳腺浸润性癌相关，而525位突变更是与多种癌症相关，包括子宫内膜样癌和脑胶质瘤。
分子检测的样本通常是血液样本或用石蜡包埋的病理组织样本。由于石蜡中的组织经过甲醛固定、酒精脱水等步骤后，组织中的DNA会出现不同程度的断裂、降解，并且断裂和降解又是随机的。因此针对石蜡包埋样本的检测时，引物的设计就比较重要，它会影响石蜡组织中DNA的扩增效果。
目前检测Ppm1d基因突变的方法是：提取样本中的RNA，将其逆转录为cDNA后测序。采用该检测方法需进行逆转录，无法实现石蜡包埋样本中的基因扩增。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测Ppm1d基因多态突变热点的引物，采用PCR技术，可用于快速检测癌症患者体内Ppm1d基因多态位点的突变情况。所述检测Ppm1d基因多态热点突变情况的引物，包括：
扩增Ppm1d基因的引物，其碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG
进一步地，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测Ppm1d基因的测序引物碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG
进一步地，引物序列I Ppm1d-6-1-F和Ppm1d-6-1-R是扩增Ppm1d基因包含第478位及525位氨基酸序列的引物。
本发明还提供了检测Ppm1d基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：
1.抽提血液/石蜡切片中的组织DNA；
2.用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3.对步骤2中的扩增产物进行测序；
4.对测序结果进行判断，确定Ppm1d基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为：
扩增Ppm1d基因的引物，其碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG
进一步地，测序引物碱基序列为：
检测Ppm1d基因的测序引物碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG
本发明还提供了一种检测Ppm1d基因多态突变位点的试剂盒，包括：
(i)组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR扩增反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中PCR扩增反应液引物为：
(ⅰ)扩增Ppm1d基因的引物，其碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG
进一步地，测序引物碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG
有益效果：本发明设计了扩增Ppm1d第478位和525位氨基酸序列的引物。采用PCR技术，构建了稳定的扩增体系。通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳。本发明利用测序技术检测患者Ppm1d突变热点的方法，可以一次将Ppm1d第478位及第525位氨基酸所有的突变类型检测出来，相比较荧光定量PCR法降低了检测的成本和难度。荧光定量PCR法要针对不同的突变类型设计2个探针，而且不能在同一管里检测，成本高，检测难度大；相比较测序cDNA的方法，本发明介绍的方法无需进行逆转录。本发明充分考虑了石蜡包埋组织中DNA的断裂问题，设计出的引物其所扩增的片段较短，提高了石蜡包埋样本DNA的扩展率和检出的准确性。因此本发明不仅适用于血液样本的Ppm1d基因突变的检测，并且可以接受石蜡包埋样本的检测。
附图说明
图1为Ppm1d基因在染色体上定位图
图2为Ppm1d-6-1F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-14为送检的石蜡包埋样本1-14号，如图2所示，引物Ppm1d-6-1F/R扩增有效，且条带单一。
图3样本A Ppm1d第478位点野生型测序截图。
图4样本B Ppm1d第478位点突变型测序截图。
图5样本C Ppm1d第525位点野生型测序截图。
图6样本D Ppm1d第525位点突变型测序截图。
图7样本E Ppm1d第478位点突变型测序截图。
图8样本E Ppm1d第525位点突变型测序截图。
图9为Ppm1d-6-1F/R的电泳图，M为Marker DL 2000，1-14为送检的血液样本1-14号，如图9所示，引物Ppm1d-6-1F/R扩增有效，且条带单一。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
一种检测Ppm1d基因多态突变位点的引物，该引物的设计是针对Ppm1d突变热点所设计的特异性扩增引物，包括：
扩增Ppm1d基因包含第478及525位氨基酸序列的引物，其碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F：GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R：GGCTGAGCACCACTACTTCG
一种检测Ppm1d基因多态突变位点的试剂盒，包括
(i)组织DNA抽提试剂；
(ii)检测体系PCR反应液；
(iii)测序体系试剂；
其中，组织DNA抽提试剂可购自天根DNA抽提试剂盒等商品化试剂。
检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；Ppm1d基因第478及525位氨基酸序列的上、下游引物Ppm1d-6-1-F(10μM)、Ppm1d-6-1-R(10μM)。
测序体系试剂包括：测序纯化液(ExoI:0.6U，CIP:1.2U)、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：检测Ppm1d基因第478位及525位氨基酸序列的上、下游引物分别为Ppm1d-6-1-F(3.2μm)、Ppm1d-6-1-R(3.2μm),以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。
送检样本不仅有血液样本，还有为石蜡样本的可能性。本发明设计的引物充分考虑了石蜡样本中DNA的特性，引物所扩增的片段长度为505bp，即能满足血液样本的检测又能满足石蜡样本的检测。引物设计时首先将上游引物设在6号外显子编码区前52bp处，是考虑了测序引物后的20-30bp检测是不稳定的，这样测序就可以从6号外显子的编码区开始一直测到突变位点，同样下游引物离525位突变位点大概93bp也是基于这个考虑。
实施例2
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液。9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)抽提石蜡样本中的DNA：1)用刀片刮去样本表层用于封闭的蜡，切3片5-10μm厚的样本，迅速将其放入1.5ml离心管中，加1ml二甲苯，盖好管盖，漩涡搅拌10s。室温全速离心2min，吸去上清液，弃掉。2)加入1ml乙醇(96-100％)，漩涡混匀，室温全速离心2min。吸取上清液，弃去。打开管盖，在室温(15-25℃)或37℃的条件下孵育10min或直至残留的乙醇蒸干。3)用180μl缓冲液ATL重悬沉淀。加入20μl蛋白酶K，漩涡混匀。56℃孵育1h(或至样本完全溶解)。90℃孵育1h。短暂离心去除管壁上的液滴。4)加入200μl缓冲液AL，漩涡混匀。加入200μl乙醇(96-100％)，漩涡混匀。5)短暂离心去除盖上的液滴，将全部的消化液移入QIAamp MinElute吸附柱中(放入2ml收集管中)，关上盖子，8000rpm离心1min。弃去收集管及管内液体，将QIAamp MinElute吸附柱置于新的收集管中。6)小心打开QIAampMinElute的盖子，加入500μl缓冲液AW1，关上盖子，8000rpm离心1min。弃去收集管及管内液体，将QIAamp MinElute吸附柱置于新的收集管中。7)全速(13200rpm)离心3min使吸附膜完全干燥。弃去收集管及管内液体。8)将QIAamp MinElute放入新的1.5ml离心管中，小心加入50μl缓冲液ATE至滤膜中间。盖上管盖，室温(15-25℃)静置1min。全速(13200rpm)离心，收集溶液。
(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份空白对照)
n为检测标本数。
(4)加样：加入检测体系PCR反应液中2μl DNA；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(5)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下：
其中，引物序列为：
引物名称 引物序列
Ppm1d-6-1-F GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R GGCTGAGCACCACTACTTCG
(6)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。
如图2所示，即为14例石蜡例样本以Ppm1d-6-1引物扩增后所得产物的电泳图谱。本发明扩增的片段长度为505bp，通过电泳图的分析表明本发明所述引物Ppm1d-6-1F/R扩增有效，且条带单一。
(7)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50μl70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl Hi-Di后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。
(8)结果判断：分别将测序结果与Ppm1d野生型参考序列(Genbank accn：NC_000017.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
取5例石蜡包埋的脑胶质瘤病变临床样本(样本编号为A-E)。按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系PCR反应液中2μl。其中有一例478位由半胱氨酸突变为终止密码子，另有一例525位谷氨酸突变为终止密码子，另一例是478位和525位均突变的样本。
样本A的检测结果如图3所示，图3显示是Ppm1d 478野生型测序截图，说明样本A的478位未发生突变。
样本B的检测结果如图4所示，图4显示是Ppm1d 478突变型测序截图。如图4所见，框内的碱基1434C>A，即C478X。说明样本B为478位由半胱氨酸突变为终止密码子。
样本C的检测结果如图5所示，图5是Ppm1d 525野生型测序截图。说明样本C的525位未发生突变。
样本D的检测结果如图6所示，图6是Ppm1d 525突变型测序截图。如图6所见，框内的碱基1573G>T，即E525X。说明样本D为525位谷氨酸突变为终止密码子。
样本E的检测结果如图7，图8所示。图7是Ppm1d 478突变型测序截图，框内的碱基1434C>A。图8是Ppm1d525突变型测序截图，碱基1573G>T。说明样本E在478位和525位均发生突变。
实施例4
取14例血液样本(样本编号为血液样本1-14)，按实施例1和2的试剂和方法提取基因组、配制试剂、扩增和测序。每份样本加入检测体系PCR反应液中2μl。电泳结果如图9所示，表明本发明所述引物Ppm1d-6-1F/R对血液样本同样能有效扩增，且条带单一。对这14例样本的测序，分别将测序结果与Ppm1d野生型参考序列进行比对测序结果准确，获得测定样本的Ppm1d基因类型。
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  武汉艾迪康医学检验所有限公司
 
<120>  检测Ppm1d基因多态突变位点的引物和方法
 
<130> 
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gcctaatatc acatgcatag atttg                                           25
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ggctgagcac cactacttcg                                                 20

Claims (6)

1.检测Ppm1d基因多态热点突变情况的引物，其特征在于，包括：
扩增Ppm1d基因的引物，其碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R： GGCTGAGCACCACTACTTCG.。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，还包括测序引物，其碱基序列为：
检测Ppm1d基因的测序引物碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R： GGCTGAGCACCACTACTTCG。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，引物序列Ppm1d-6-1-F和Ppm1d-6-1-R是扩增Ppm1d基因包含第478位及525位氨基酸序列的引物。
4.如权利要求2所述的引物，其特征在于，引物序列Ppm1d-6-1-F和Ppm1d-6-1-R是测序Ppm1d基因扩增产物包含第478位及525位氨基酸序列的引物。
5.检测Ppm1d基因多态热点突变情况的方法，包括以下步骤：
1）抽提血液或石蜡切片中的组织DNA；
2）用PCR扩增步骤1中提取的DNA；
3）对步骤2中的扩增产物进行测序；
4）对测序结果进行判断，确定Ppm1d基因是否发生突变；
其中PCR扩增引物为： 
Ppm1d-6-1-F： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R： GGCTGAGCACCACTACTTCG。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，测序引物碱基序列为：
Ppm1d-6-1-F： GCCTAATATCACATGCATAGATTTG
Ppm1d-6-1-R： GGCTGAGCACCACTACTTCG。
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