KR20080003692A - 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트 - Google Patents

항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20080003692A
KR20080003692A KR1020060062231A KR20060062231A KR20080003692A KR 20080003692 A KR20080003692 A KR 20080003692A KR 1020060062231 A KR1020060062231 A KR 1020060062231A KR 20060062231 A KR20060062231 A KR 20060062231A KR 20080003692 A KR20080003692 A KR 20080003692A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
gene
resistance
genes
drug resistance
Prior art date
Application number
KR1020060062231A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101326367B1 (ko
Inventor
정연준
김동욱
김진우
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to KR1020060062231A priority Critical patent/KR101326367B1/ko
Publication of KR20080003692A publication Critical patent/KR20080003692A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101326367B1 publication Critical patent/KR101326367B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

본 발명은 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 만성 골수성 백혈성 (chronic myelogenous leukemia; CML)을 치료하는 약제에 대한 저항성 (drug resistance)을 예측하는 유전자, 이를 이용하는 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단 방법 및 진단 키트는 항암제인 이마티닙 (imatinib)에 대한 저항성을 부여하는 유전자 발현 신호를 다양한 저항성 유전자군을 사용하여 감지하는 과정으로, 만성 골수성 백혈병을 포함한 각종 암을 효과적으로 진단하고 치료하며 더 나아가 글리벡에 대한 저항성 기작을 연구하는 데 널리 사용될 수 있다.
항암제 저항성, 이마티닙 (imatinib), 저항성 유전자군, 만성 골수성 백혈병 (CML), 진단 키트

Description

항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트{Diagnostic methods and kits for monitoring resistance to therapeutic chemoagent}
도 1 은 이마티닙-저항성 유전자군의 배열 순서를 유전자 발현 프로파일에 따라 나타낸 것이다.
도 2a 는 이마티닙의 투여량에 따라 포지티브하게 상관된 유전자의 발현 변화를 이마티닙-저항성 유전자군을 사용하여 분석한 것이다.
도 2b 는 이마티닙의 투여량에 따라 네가티브하게 상관된 유전자의 발현 변화를 이마티닙-저항성 유전자군을 사용하여 분석한 것이다.
도 3a 은 만성 골수성 백혈병 (CML)의 이마티닙 저항성을 6가지 후보 유전자 중에서 CASP4 및 TNFRSF21 유전자의 발현 변화로 분석한 것이다.
도 3b 은 만성 골수성 백혈병 (CML)의 이마티닙 저항성을 6가지 후보 유전자 중에서 RAB11A 및 IGF1 유전자의 발현 변화로 분석한 것이다.도 3c 은 만성 골수성 백혈병 (CML)의 이마티닙 저항성을 6가지 후보 유전자 중에서 LYN 및 RHOA 유전자의 발현 변화로 분석한 것이다.
본 발명은 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 만성 골수성 백혈성 (chronic myelogenous leukemia; 이하, ?CML?라고 약칭함)을 치료하는 약제에 대한 저항성을 예측하는 유전자, 이를 이용하는 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것이다.
항암제 이마티닙 (imatinib)은 이마티닙 메실레이트 (imatinib mesylate), STI-571 및 글리벡 (Gleevec) 등으로 불리는 타이로신 키나제 (tyrosine kinase)에 대한 선택적인 저해제로서, 만성 골수성 백혈병 (chronic myelogenous leukemia; 이하, ?CML?이라고 약칭함)을 치료하는 데 주로 사용되고 있다. BCR-ABL 융합 키나제를 겨낭하여 치료하는 일차적인 약제인 이마티닙은 특히 만성 골수성 백혈병의 초기 단계에서 80% 이상 증상을 완화시키는 것으로 알려져 있다 (O'Dwyer, M. E. 및 Druker, B. J. J. Intern. Med . 250: 3-9, 2001). 그러나, 초기 혈액 및 세포 반응 후에 증상이 재발되는 현상이 자주 발생한다 (Druker, B. J. et al., N. Engl . J. Med ., 344: 1038-1042, 2001). 따라서, BCR-ABL 키나제을 겨낭한 치료법은 약제 저항성으로 인해 방해를 받고 이마티닙의 임상적 효능을 심각하게 감소시킨다.
또한, BCR-ABL 타이로신 키나제의 일정 도메인에 전사 증폭 (transcription amplification) 또는 점 돌연변이가 종종 저항성의 임상 사례들 또는 생체 외 (in vitro) 세포 모델에서 관찰되어 왔다 (Hochhaus, A. et al., Science, 293: 876-880, 2001; Shah, N. P. et al., Cancer Cell, 2: 117-125, 2002; Gorre, M. E. et al., Science, 293: 876-880, 2001). 이러한 변화가 이마티닙-저항성을 획득하는 가장 그럴듯한 원인이라고 할지라도, 선행 연구들은 이 저항성이 증폭 또는 돌연변이 없이 생길 수 있다고 보여주기도 한다 (Donato, N. J. et al., Blood, 101: 690-698, 2003; Hofmann, W. K. et al., Lancet, 359: 481-486, 2002; Mahon, F. X. et al., Blood, 96: 1070-1079, 2000). 또한, 다제 저항성유전자의 과발현이 이마티닙에 대한 저항성을 부여하기도 한다. 이러한 연구들은 이마티닙-저항성이 서로 다른 기작들에 의해 야기될 수 있는 점을 제시한다. 따라서 이마티닙-저항성을 유발하는 주요 인자를 확인하기 위하여 마이크로어레이 (microarray)를 사용한 범용 유전자 발현 분석과 같은 다양한 접근법이 도입되어 왔다 (Tipping, A. J. et al., Exp . Hematol ., 31: 1073-1080, 2003; Ohmine, K. et al., Stem Cells, 21: 315-321, 2003).
본 발명자들은 이마티닙-저항성 유전자군을 다양한 이마티닙 투여량 및 CML 사례들을 참고하여 확립하고 이마티닙-저항성의 발현 프로파일을 조사하여 생물학적으로 적절히 발현 변화를 보이는 전사체 (transcript)들에 초점을 맞추어 이마티닙-저항성과 관련된 유전자 발현 서명 (gene expression signature)을 밝혔다. 또한, 유전자 세트 증폭 분석 (gene set enrichment analysis)과 같은 생물정보학적 접근법을 통하여 이마티닙-저항성과 관련된 발현 프로파일 및 후보 신호전달과정을 설명하려고 하였다.
이에 본 발명자들은 새로운 항암제 저항성을 검사하는 진단 방법을 개발하기 위하여 노력을 계속한 결과, 만성 골수성 백혈성 (chronic myelogenous leukemia; CML) 을 치료하는 항암제인 이마티닙 (imatinib)에 대한 저항성을 부여하는 유전자 신호를 선별하여 저항성 유전자 6종을 분리하고 다양한 유전자 프로브들을 제작하여 진단 키트를 개발한 다음 CML을 포함한 각종 암의 약제 저항성을 검사하는 데 유용한 점을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.
본 발명은 항암제 저항성 유전자, 이를 이용한 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 항암제 저항성 유전자들 선택하고; 및
(2) 상기 유전자의 발현 정도를 측정하여 결과를 분석하는; 과정으로 이루어진 항암제에 대한 저항성을 검사하는 진단 방법을 제공한다.
상기 (1) 과정에서 항암제 저항성 유전자는 아폽토시스 (apoptosis), 세포 신호 전달, 세포 주기 조절, GTP 결합 단백질, 세포 증식 및 전사 관련 유전자 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기 항암제 저항성 유전자는 CASP4, TNFRF21 , TNFRSF9, NOTCH2, SQSTM1, TGIF, PLCD1, CCNB1P1, RAB11A , IGF1 , LYN , RHOA, NMI, FOXO3A, ZNF226, ZNF140, LTBP1 및 ABCA8 유전자 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하고, CASP4 , TNFRF21, RAB11A , IGF1 , LYN 및 RHOA 유전자 중에서 선택된 하나 이상인 것은 더욱 바람직하다.
상기 (2) 과정에서 상기 항암제 저항성 유전자의 발현 정도는 상승 또는 감소 조절되고, 이 때 CASP4 , TNFRF21 , LYN 및/또는 RHOA 유전자는 상승 발현되고 RAB11A 및/또는 IGF1 유전자는 감소 발현되는 것이 바람직하다.
상기 (2) 과정에서 상기 항암제 저항성 유전자의 발현 정도는 중합효소 연쇄반응 (PCR) 및/또는 마이크로어레이 (microarray) 등을 수행하여 분석하는 것이 바람직하다.
본 발명의 진단 방법은 만성 골수성 백혈병 (CML)을 치료하는 데 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 아폽토시스 (apoptosis), 세포 신호 전달, 세포 주기 조절, GTP 결합 단백질, 세포 증식 및 전사 관련 유전자 중에서 선택되는 항암제 저항성 유전자 및 그의 전부 또는 일부 서열로 구성된 상기 유전자에 대한 표지자를 제공한다. 상기 항암제 저항성 유전자는 CASP4, TNFRF21 , TNFRSF9, NOTCH2, SQSTM1, TGIF, PLCD1, CCNB1P1, RAB11A , IGF1 , LYN , RHOA, NMI, FOXO3A, ZNF226, ZNF140, LTBP1 및 ABCA8 유전자 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하고, CASP4, TNFRF21 , RAB11A , IGF1 , LYN 및 RHOA 유전자 중에서 선택된 하나 이상인 것은 더욱 바람직하며, 만성 골수성 백혈병 (CML)을 치료하는 데 사용되는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 항암제 저항성 유전자에 대한 프로브를 이용하여 항암제에 대한 저항성 을 검사하는 진단 방법을 제공한다.
상기 항암제로는 이마티닙 (imatinib), 글리벡 (Gleevec) 및 STI-571 등이 포함된다. 또한, 상기 항암제 저항성 유전자로는 CASP4 , TNFRF21 , RAB11A , IGF1 , LYN 및 RHOA 유전자 중에서 선택된 하나 이상이 포함된다.
본 발명의 진단 방법에는 항암제 저항성 유전자에 대한 프로브를 사용하는 모든 검사 방법이 포함될 수 있고, 바람직하게는 상기 저항성 유전자에 대한 프로브를 사용하여 수행하는 중합효소 연쇄반응 등이 포함될 수 있다. 보다 바람직하게는 항암제 저항성 유전자 CASP4 에 대한 서열번호 1 과 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트;
항암제 저항성 유전자 TNFRF21 에 대한 서열번호 3 과 서열번호 4의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트;
항암제 저항성 유전자 RAB11A 에 대한 서열번호 5 과 서열번호 6의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트;
항암제 저항성 유전자 IGF1 에 대한 서열번호 7 과 서열번호 8의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트;
항암제 저항성 유전자 LYN 에 대한 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트; 및
항암제 저항성 유전자 RHOA에 대한 서열번호 11 과 서열번호 12의 염기서열을 가지는 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제 저항성 진단 프라이머 세트를 제공한다. 또한 상기 프라이머 세트를 이용하 여 중합효소 연쇄반응(PCR)를 하는 것을 특징으로 하는 항암제 저항성 진단방법을 제공한다. 본 발명의 진단 방법은 만성 골수성 백혈병 (CML)을 포함하는 각종 암 질환을 치료하는 데 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 항암제 저항성 유전자에 대한 프로브를 이용하여 항암제에 대한 저항성을 검사하는 진단 키트를 제공한다. 바람직하게는 항암제 저항성 유전자 CASP4 , TNFRF21, RAB11A , IGF1 , LYN 및 RHOA 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 암호화 하는 핵산서열을 포함하는 항암제에 대한 저항성을 검사하는 진단 키트를 제공한다. 보다 바람직하게는 상기 항암제 저항성 유전자에 더하여 TNFRSF9, NOTCH2, SQSTM1, TGIF, PLCD1, CCNB1P1, NMI, FOXO3A, ZNF226, ZNF140, LTBP1 및 ABCA8 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 암호화 하는 핵산서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 저항성을 검사하는 진단 키트를 제공한다. 상기 항암제 저항성 진단키트는 만성 골수성 백혈병 (CML)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 상기 항암제로는 이마티닙 (imatinib), 글리벡 (Gleevec) 및 STI-571 등이 포함된다. 또한, 상기 항암제 저항성 유전자로는 CASP4 , TNFRF21 , RAB11A , IGF1, LYN 및 RHOA 유전자 중에서 선택된 하나 이상이 포함된다. 본 발명의 진단 키트는 만성 골수성 백혈병 (CML)을 포함하는 각종 암 질환을 치료하는 데 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 진단 키트에는 항암제 저항성 유전자에 대한 프로브를 사용하는 모든 검사용 시약 및 장치 등이 포함될 수 있고, 바람직하게는 상기 저항성 유전자에 대한 프로브를 사용하여 중합효소 연쇄반응 등을 수행하는 데 필요한 시약 및 장치 등이 포함될 수 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 이마티닙 -저항성 K562 세포주들의 발현 프로파일 조사
먼저, 본 발명에서는 이마티닙-저항성 세포주를 확립하기 위하여, 이마티닙에 대한 저항성을 적혈구가 되는 백혈병성 K562 세포주에 이마티닙을 2주마다 50 mM 씩 농도를 증가시키면서 노출하여 유도하였다. 이마티닙을 처리하여 세포를 배양하는 동안 다양한 이마티닙 농도 200 nM, 400 nM, 600 nM 및 800 nM에 각각 노출된 4가지 저항성 세포주 계열, KR200nM, KR400nM, KR600nM 및 KR800nM 을 확립하였다. 이 때 BCR-ABL 키나제 도메인에 생긴 돌연변이는 이미 기술되어 있는 바와 같이 검색하였다 (Shah, N. P. et al., Cancer Cell, 2: 117-125, 2002). 또한, BCR-ABL 키나제 도메인의 발현 수준은 돌연변이 분석에 사용되는 프라이머들을 사용한 실시간 (real time) 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하여 측정하였다. 이 때 대조군으로는 인간 GAPDH 를 사용하였다.
먼저, 상기 세포주들의 이마티닙 저항성이 선행 연구에서 이미 보고된 바와 같이 증가된 전사 활성 때문인지 또는 BCR-ABL 키나제 도메인의 점 돌연변이로부터 유발되는지 여부를 조사하였다 (Shah, N. P. et al., Cancer Cell, 2: 117-125, 2002). 그러나 상기 키나제 도메인의 특정 영역에 점 돌연변이와 BCR-ABL 유전자의 상승적 전사 조절 모두가 4가지 저항성 세포주에서는 관찰되지 않았다. K562 세포주 및 이마티닙 저항성 세포주의 발현 프로파일은 30,000개 정도의 인간 유전자를 포함하는 올리고-마이크로어레이를 사용하여 측정되었다. 3,000개의 가장 다양한 전사체들의 집단이 저항성을 유도하는 이마티닙 투여량에 의한 세포주들을 서로 구별되게 하였다 (도 1 참조). 이러한 집단 구성에 따라, 고투여량 그룹, 즉 KR600nM 및 KR800nM 은 저투여량 그룹, 즉 KR200nM 및 KR400nM 그리고 K562 모세포와는 분명히 구별되는 것을 확인하였다.
실시예 2. 항암제 저항성 세포주에서 전사체들의 변화 분석
(1) RNA 분리 및 하이브리디제이션
먼저, 전체 RNAs 가 K562 모세포 및 이마티닙-저항성 세포주로부터 트리졸 (Trizol; Invitrogen사 제품)을 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 분리하였다. 분리된 RNAs 의 양과 질은 바이오애널라이저 (Bioanalyzer 2100; 애질런트 테크놀로지사 제품)를 사용하여 평가하였다. 30,000개 정도의 인간 유전자 세트를 포함하는 인간 게놈 조사 마이크로어레이 (Human Genome Survey Microarray; 어플라이드 바이오시스템사 제품) 버전 2.0을 사용하여 5가지 세포주들, 즉 민감성 K562 세포 및 4가지 저항성 세포주들의 발현 프로파일을 분석하였다. 디옥시제닌-UTP 로 표 지된 cRNA 를 만들고 화학형광 RT-IVT 라벨링 키트 버전 2.0 (어플라이드 바이오시스템사 제품)을 사용하여 5 μg 전체 RNAs 로부터 차례대로 증폭시켰다. 어레이 하이브리디제이션, 화학형광 검사 및 이미지 촬영 및 분석이 화학형광 검사 키트 및 화학형광 마이크로어레이 애널라이저 1700 (어플라이드 바이오시스템사 제품)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 진행되었다. 하이브리디제이션 반응은 각 시료마다 3번 반복 수행되었다.
(2) 데이타 프로세싱
각 어레이-하이브리디제이션의 이미지들은 고해상도 광포맷 CCD 카메라가 장착된 1700 애널라이저를 사용하여 모았다. 여기에는 유전자 발현을 분석하기 위해 5초 동안 노출시킨 2개의 화학형광 이미지들, 특징 연구 및 스폿 정상화를 위한 2개의 형광 이미지들 및 스펙트럼 교정을 위한 2개의 QC 이미지들이 포함된다. 이들 이미지는 자동으로 입력되어 (gridded) 화학형광 신호가 정량되었다. 백그라운드를 감안하여, 스폿의 강도 데이터가 편차 안정화 및 정상화 (VSN) 방법을 사용하여 조정되었다 (Huber, W. et al., Bioinformatics, 18: S96-104, 2002).
(3) 차별적으로 발현된 전사체들의 분석
K562 모세포를 포함하는 5가지 세포주들에서 나온 29,098개 유전자의 평균적인 발현이 One-way ANOVA 분석으로 평가되었다. 가장 변화가 많은 3,000개의 전사체들이 선택되고, 평균적 연관성을 통한 집단이 클러스터 및 트리뷰 (Cluster and Treeview; http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm) 소프트웨어를 사용하여 형성되 었다. 상기 전사체들이 저항성 세포주들에서 상승적 또는 감소적으로 조절되는지 여부를 조사하기 위하여, 발현 변화를 민감성 모세포 대조군과 비교하고 상대적인 차이를 계산하여 평가하였다.
(4) 투여량-의존적인 발현 변화의 조사
저항성 세포주들에서 투여량에 의존적으로 발현이 변화하는 유전자를 확인하기 위하여, 2가지 통계적 접근법을 조합하였다 (Tseng, Y. H. et al., Nat. Cell Biol ., 7: 601-611, 2005). 먼저, 5개의 평균 발현 수준이 대조군 및 4가지 저항성 세포주들에서 이마티닙 투여량이 200 nM 로부터 800 nM 범위까지 연속적으로 고려되었다. 상승적 및 감소적 진행 상태의 중요도가 하기 수학식 1의 가설 또는 수학식 2의 역가설에 따라 결정되었다.
Figure 112006047802618-PAT00001
Figure 112006047802618-PAT00002
먼저, 대조군으로 사용된 K562 세포와 비교하여 저항성을 보이는 4개 세포주 모두에서 상승적 또는 감소적으로 조절되는 전사체들 조사한 결과, 공통적으로 변화되는 전사체들은 과다 또는 과소 발현되는 것으로 관찰되었다 (표 1 참조). 구체적으로, 아폽토시스 (apoptosis) 관련 유전자, 즉 CASP4, TNFRSF21 및 TNFRSF9 는 저 항성 세포주들에서 공통적으로 상승 조절되고, 또한 전사 및 신호전달과 연관된 유전자, 즉 NOTCH2, SQSTM1 및 TGIF 는 감소적으로 조절되었다.
Figure 112006047802618-PAT00003
특히 NOTCH2 유전자는 그 산물이 백혈병 유발 과정 (leukemogenesis)에서 RAS 신호 전달에 포지티브 조절자이고, 미토젠-활성화 단백질 (MAP) 키나제와 함께 분자적 상호 연결에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Aster, J. C. 및 Pear, W. S. Curr . Opin . Hematol ., 8: 237-244, 2001; Zeng, Q. et al., Cancer Cell, 8: 13-23, 2005). 또한, TGIF 는 TGF-β 신호 전달에 네가티브 피드백을 형성하는 전사 억제인자 (co-repressor)이다. 상기 발현 감소되는 유전자들 중에서, IGF1 및 PLCD1 유전자는 신호 전달과 관련되고, IGF1 는 발암화 뿐만 아니라 체세포 성장 및 발생을 조절하는 성장인자를 인코딩하는 것으로 보고되어 있다 (Zumkeller, W., Mol . Pathol ., 54: 285-288, 2001). 또한, PLCD1 유전자는 신호전달물질 (second messenger molecule)인 디아실글리세롤 및 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트를 생산하여 신호 전달에 관여하였다 (Stallings, J. D. et al., J. Biol . Chem ., 280: 22060-22069, 2005). 또한, CCNB1P1과 같은 세포 주기와 관련된 분자들이 확인되어, G2/M 기를 통한 세포 주기의 진행 과정에 작용하는 것으로 보고되었다 (Toby, G. G. et al., Mol . Cell. Biol ., 23: 2109-2122, 2003).
실시예 3. 이마티닙 -저항성 세포주에서 이마티닙 투여량과 관련된 발현 변화 조사
4가지 저항성 세포주들에서 유전자 발현 및 이마티닙 투여량 간의 반응 양상 (dose-response)을 보이는 유전자들이 조사되었다 (표 2 참조). 도 2 는 이마티닙의 투여량에 따른 유전자의 발현 변화를 이마티닙-저항성 유전자군을 사용하여 분석한 것이다. 이마티닙 투여량의 증가와 상호연관된 22개 유전자들 중에서, 전사와 관련된 4개의 유전자, 즉 NMI , FOXO3A , ZNF226 및 ZNF140 가 확인되었다.
Figure 112006047802618-PAT00004
구체적으로, NMI 유전자로부터 인코드되는 단백질은 N-MYC, C-MYC 및 신호전달인자 (signal transducer)와 같은 전자조절인자 및 전자활성인자 (STAT)와 반응한다. 또한, NMI 유전자로부터 인코딩되는 단백질은 골수성 백혈병에서 높게 발현되는 것이 밝혀졌다 (Bao, J. 및 Zervos, A. S., Oncogene, 12: 2171-2176, 1996). 또한 신호 전달과 관련된 전사체인 LTBP1 은 TGF-β 신호전달 과정에 관련되어 TGF-β 분자와 반응하는 단백질을 생산한다. ATP 의존성 약제 전달체 (drug transporter)인 ABCA8 도 역시 이마티닙 투여량과 포지티브하게 관련된 발현 변화를 보이는 유전자들 중에서 확인되었다 (Tsuruoka, S. et al., Biochem . Biophys . Res. Commun ., 298: 41-45, 2002). 세포증식과 연관된 유전자는 이마티닙 투여량과 네가티브하게 상관된 전사체들 중에서 확인되었다. 또한, MLF1 의 전위 (translocation) 도 종종 골수형성이상 증후군 및 급성 골수성 백혈병에서 관찰되어 왔다 (Matsumoto, N. et al., Leukemia, 14: 1757-1765, 2000). 대사와 신호 전달과 관련된 유전자들 중에서, RAB11A 는 발암화 과정에 작용하는 RAS와 관련된 GTP 결합 단백질이다.
실시예 4. 유전자 세트 증폭 분석
기능적으로 관련된 유전자: GO (Gene Ontology), BioCarta (http://www.biocarta.com) 및 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), 및 GenMAPP (Gene MicroArray Pathway Profiler)가 일반 유전자 데이터베이스로부터 수집되었다 (Harris, M. A. et al., Nucleic Acids Res., 32: D258-D261, 2004; Kanehisa, M. et al., Nucleic Acids Res., 30: 42-46, 2002; Dahlquist, K. D. et al., Nat. Genet., 31: 19-20, 2002). 유전자를 매치하여 특정 표시가 된 유전자 세트로 분류하고, 공통의 기능적 표시가 있지만 서로 배타적이지는 않은 3,774개 유전자 세트들이 수집되었다. 유전자의 증폭 분석은 Z-통계에 기초한 중요도를 직접 계산하는 지수 분석 (PAGE)을 사용하여 이루어졌다. 상기 분석을 수행하기 위하여, 최소 유전자 세트에 해당하는 적어도 10개의 유전자를 포함하는 721 세트들로 초기 유전자 세트들을 제한하였다. 여기서는 Z-통계학에 기초한 중요도를 산정하기 위하여 2종류의 지수값, 즉 상대적 차이 r.d. 및 Fk 를 사용하였다.
이마티닙 저항성 유전자 세트들에서 700개 정도의 기능이 알려진 유전자 세트들에 대한 증폭의 통계적 중요도를 측정하여 분석한 결과, 표 3에 보는 바와 같이 활성화 또는 억제된 유전자 세트가 밝혀졌다.
Figure 112006047802618-PAT00005
15개의 활성화된 유전자 세트는 다음과 같다: 전사 조절과 관련된 4개의 유전자 세트; DNA 결합, 핵산 결합, 아연 이온 결합과 같은 전사와 관련이 있는 듯한 3개의 유전자 세트; 아폽토시스와 연관된 2개의 유전자 세트; 및 TGF-β 신호전달 과정과 관련된 유전자 세트. 또한, 7개의 억제된 유전자 세트는 다음과 같다: 생합성, 운반 및 접힘 그리고 단백질 대사에 관련된 유전자 세트; 및 작은 GTPase 신호전달과 관련된 3개의 유전자 세트.
실시예 5. 골수성 백혈병 환자에서 유전자 발현 프로파일 조사
본 발명은 CML 환자의 유전자 발현 프로파일을 조사하기 위하여, 실시간 정량적 PCR 분석을 다음과 같이 실시하였다. 이마티닙 저항성이 획득된 전후로 6명의 CML 환자들의 혈액 시료로부터 얻은 전체 RNA 가 6가지 후보 유전자: CASP4 , TNFRF21 , RAB11A, IGF1 , LYN 및 RHOA 에 대한 실시간 QPCR 분석에 사용되었다. 그 결과, 환자들 중 3명은 BCR-ABL 돌연변이를 가지고 있고, 나머지 3명에서는 돌연변이가 발견되지 않았다. 첫 번째 cDNA 가닥은 M-MLV 역전사효소 (Invitrogen사 제품)를 사용하여 합성되어 PCR 에 사용되었다. 실시간 QPCR 은 MxPro 버전 3.00 소프트웨어 (Stratagene사 제품)과 함께 Mx300P QPCR 시스템을 사용하여 수행되었다. 20 μL의 실시간 QPCR 반응물에는 10 ng cDNA, 1X SYBR Green Tbr 폴리머라제 혼합물, 0.5X ROX 및 20 pmole 프라이머를 첨가하였다. 본 발명에서는 서열번호 1 내지 서열번호 14의 염기 서열을 포함하는 프라이머를 합성하여 사용하였다. 이 때 GAPDH가 각 과정의 대조군으로 사용되었다.
상기 QPCR 과정은: 95℃, 10분; 94℃, 10초, 40회 반복; 55 - 60℃, 30초; 및 72℃, 30초로 진행되었다. 특정 증폭 여부를 확인하기 위하여, 곡선 (melting curve) 분석이 55 - 95℃, 0.5℃/sec로 수행되었다. 상대적 정량은 △Ct 방법으로 수행하였다.
생체 외 모델에서 이마티닙 저항성을 획득하여 생긴 발현 변화가 실제로 백혈병 (CML) 환자들에게도 적절한지 여부를 확인하기 위하여, 이마티닙 저항성을 보이는 6명의 CML 환자들을 대상으로 실험하였다. 상기 저항성을 획득하기 전 및 후에 발현 변화의 로그 비율 (Log2 ratio)이 BCR-ABL 돌연변이 (n = 3)가 있는지에 따라 각 환자에 대해 계산되었다 (도 3 참조). 도 3a, 도 3b 및 도 3c 는 만성 골수성 백혈병 (CML)의 이마티닙 저항성을 6가지 후보 유전자의 발현 변화로 분석한 것이다. 이 때 K562 대 KR800nM 간의 발현 비율이 기준이 되었다.
구체적으로 CASP4 및 TNFRSF21 은 이마티닙 저항성을 획득한 후에 각각 4명과 3명에서 상승적으로 조절되었다, 그러나 이 발현 비율이 BCR-ABL 돌연변이에 대한 포지티브 및 네가티브 환자들 간에는 명확하게 구분되지 않았다. 한편, RAB11A 및 IGF1 은 BCR-ABL 돌연변이 네가티브 환자들에서 일관되게 감소되었으며, BCR-ABL 돌연변이 포지티브 환자들 3명 중 2명에서는 상승되었다. 또한, 이미 이마티닙 저항성과 관련되어 상승되는 것으로 보고된 LYN 및 RHOA 에 대해서도 조사되었다. 이들이 BCR-ABL 돌연변이가 없는 세포주에서 증가된다고 하더라도, 본 연구에서는 상기 돌연변이 네가티브 환자 3명 중 2명에서 과소발현되는 것으로 밝혀졌다. 또한, LYN 및 RHOA 의 발현은 오히려 돌연변이 포지티브 환자 3명 중 2명에서 유의하게 상승되었다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 만성 골수성 백혈성 (chronic myelogenous leukemia; CML)을 치료하는 약제 저항성 (drug resistance)을 예측하는 유전자, 이를 이용하는 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것으로서, 항암제인 이마티닙 (imatinib)에 대한 저항성을 부여하는 유전자 발현 신호를 다양한 저항성 유전자군을 사용하여 감지하는 과정으로, 만성 골수성 백혈병을 포함한 각종 암을 효과적으로 진단하고 치료하며 더 나아가 글리벡에 대한 저항성 기작을 연구하는 데 널리 사용될 수 있다.
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Diagnostic methods and kits for monitoring resistance to therapeutic chemoagent <130> PN060075 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CASP4-Forward primer <400> 1 acacgcctgg ctctcatcat a 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CASP-4 Reverse primer <400> 2 cacagttccc cacggtttg 19 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF21 Foward Primer <400> 3 caaggccccc accacagaca catc 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF21 Reverse Primer <400> 4 gccggggccc ctttttcaga gt 22 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAB11A Forward primer <400> 5 acccgcgacg acgagta 17 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RAB11A Revers Primer <400> 6 gcccacaagc atgataacaa t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1 Forward Primer <400> 7 gcggggctga gctggtggat 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGF1 Reverse Primer <400> 8 ggtcttgggc atgtcggtgt gg 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LYN Forward Primer <400> 9 atacatcgag cggaagaact acat 24 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LYN Reverse Primer <400> 10 acagggcggt catcacg 17 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RHOA Forward Primer <400> 11 acagctgggc aggaagatta tgat 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RHOA Reverse Primer <400> 12 acaagacaag gcacccagat tttt 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Forward Primer <400> 13 gcggggctct ccagaacatc at 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH Reverse Primer <400> 14 ccagccccag cgtcaaaggt g 21

Claims (9)

  1. 항암제 저항성 유전자 CASP4 , TNFRF21 , RAB11A , IGF1 , LYN 및 RHOA 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 암호화 하는 핵산서열을 포함하는 항암제에 대한 저항성을 검사하는 진단 키트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항암제 저항성 유전자에 더하여 TNFRSF9, NOTCH2, SQSTM1, TGIF, PLCD1, CCNB1P1, NMI, FOXO3A, ZNF226, ZNF140, LTBP1 및 ABCA8 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 암호화 하는 핵산서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 저항성을 검사하는 진단 키트.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    만성 골수성 백혈병 (CML)을 치료하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 저항성 진단 키트.
  4. CASP4 , TNFRF21 , RAB11A , IGF1 , LYN 및 RHOA 중에서 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 정도을 측정하는 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 저항성을 검사하는 진단 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 항암제 저항성 유전자에 더하여 TNFRSF9, NOTCH2, SQSTM1, TGIF, PLCD1, CCNB1P1, NMI, FOXO3A, ZNF226, ZNF140, LTBP1 및 ABCA8 유전자 중에서 선택된 하나 이상의 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 저항성을 검사하는 진단 방법.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    만성 골수성 백혈병 (CML)을 치료하는 데 사용되는 것을 특징으로 하는 항암제에 대한 저항성 진단 방법.
  7. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 항암제 저항성 유전자의 발현 정도는 중합효소 연쇄반응 (PCR) 및/또는 마이크로어레이 (microarray)를 수행하여 분석하는 것을 특징으로 하는 진단 방법.
  8. 항암제 저항성 유전자 CASP4 에 대한 서열번호 1 과 서열번호 2의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트;
    항암제 저항성 유전자 TNFRF21 에 대한 서열번호 3 과 서열번호 4의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트;
    항암제 저항성 유전자 RAB11A 에 대한 서열번호 5 과 서열번호 6의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트;
    항암제 저항성 유전자 IGF1 에 대한 서열번호 7 과 서열번호 8의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트;
    항암제 저항성 유전자 LYN 에 대한 서열번호 9 또는 서열번호 10의 염기 서열을 가지는 프라이머 세트; 및
    항암제 저항성 유전자 RHOA에 대한 서열번호 11 과 서열번호 12의 염기서열을 가지는 프라이머 세트로 이루어진 그룹에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제 저항성 진단 프라이머 세트.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 제 8 항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)를 하는 것을 특징으로 하는 항암제 저항성 진단방법.
KR1020060062231A 2006-07-03 2006-07-03 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트 KR101326367B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060062231A KR101326367B1 (ko) 2006-07-03 2006-07-03 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060062231A KR101326367B1 (ko) 2006-07-03 2006-07-03 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080003692A true KR20080003692A (ko) 2008-01-08
KR101326367B1 KR101326367B1 (ko) 2013-11-11

Family

ID=39214819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060062231A KR101326367B1 (ko) 2006-07-03 2006-07-03 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101326367B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180058186A (ko) * 2016-11-23 2018-05-31 연세대학교 산학협력단 포크머리상자 o 3 단백질의 용도

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115054687A (zh) * 2014-08-22 2022-09-16 广州英恩迈生物医药科技有限公司 治疗和/或预防与ifp35蛋白家族的异常水平和/或活性相关的疾病或不适的方法和组合物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180058186A (ko) * 2016-11-23 2018-05-31 연세대학교 산학협력단 포크머리상자 o 3 단백질의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR101326367B1 (ko) 2013-11-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6404208B2 (ja) 特発性肺線維症の予後予測、診断および処置の方法
KR101719376B1 (ko) 연령-관련 황반 변성에서 유전자 다형성
Infante et al. Identification of candidate genes for Parkinson's disease through blood transcriptome analysis in LRRK2-G2019S carriers, idiopathic cases, and controls
JP5161091B2 (ja) 急性骨髄性白血病患者の抗癌剤治療反応性予測用マーカー
JP6280206B2 (ja) 局所進行性胃癌に対する予後予測システム
US20140005070A1 (en) Markers associated with cyclin-dependent kinase inhibitors
Gao et al. Arsenic exposure, telomere length, and expression of telomere-related genes among Bangladeshi individuals
Jensen et al. A distinctive gene expression fingerprint in mentally retarded male patients reflects disease-causing defects in the histone demethylase KDM5C
KR20180054829A (ko) 면역 레퍼토리 정상성 평가 방법 및 그 용도
Kim et al. Somatic mTOR mutation in clonally expanded T lymphocytes associated with chronic graft versus host disease
Jones et al. Large family cohorts of lymphoblastoid cells provide a new cellular model for investigating facioscapulohumeral muscular dystrophy
CN107312861A (zh) 一种b‑all患者预后风险评估标记物
Lim et al. Identifying New COVID-19 receptor neuropilin-1 in severe Alzheimer’s disease patients group brain using genome-wide association study approach
CN109837340A (zh) 用于肺癌无创诊断的外周血基因标记物
EP3309263B1 (en) Biomarkers associated with cdk inhibitors
Abramzon et al. Investigating RFC1 expansions in sporadic amyotrophic lateral sclerosis
CN112921091B (zh) Flt3基因突变在预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用
KR101326367B1 (ko) 항암제 저항성의 진단 방법 및 진단 키트
WO2015093557A1 (ja) 胃がんの責任因子としての新規融合遺伝子
JPWO2006013862A1 (ja) Ｃｄｋ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法
CN107267611B (zh) 一种检测p.Pro189Ala位点基因型的引物组及其检测试剂盒和应用
KR20160035230A (ko) 만성폐쇄성폐질환 진단용 마커 조성물
US20190161810A1 (en) Method for assisting determination of hematological stage of childhood acute lymphoblastic leukemia
Xu et al. Genetic Arg-304-His substitution in GRK5 protects against sepsis progression by alleviating NF-κB-mediated inflammation
KR102072772B1 (ko) 말초신경병증 아형별 진단용 바이오마커

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161027

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170927

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181001

Year of fee payment: 6