KR20200140270A - Cartyrin 조성물 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20200140270A
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transposon
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amino acid
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에릭 오스터택
데본 쉐들록
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포세이다 테라퓨틱스, 인크.
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Publication date
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Abstract

센티린 키메라 항원 수용체(CARTyrin), 본 개시의 CARTyrin을 코딩하는 CARTyrin 트랜스포존, 본 개시의 CARTyrin을 발현하도록 변형된 세포, 이들의 제조 방법, 및 입양 세포 요법을 위해 이들을 사용하는 방법이 개시된다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시의 CARTyrin은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)의 서열에 특이적으로 결합한다.

Description

CARTYRIN 조성물 및 사용 방법
관련 출원
본원은 2018년 3월 7일에 출원된 미국 가출원 제62/639,978호, 2018년 10월 12일에 출원된 미국 가출원 제62/745,151호, 및 2018년 12월 20일에 출원된 미국 가출원 제62/783,140호의 우선권 이익을 주장하고, 이 출원들 각각의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
서열목록의 참고에 의한 포함
2019년 3월 7일에 생성되었고 크기가 6 KB인, "POTH-033_001WO_SequenceListing_ST25_R.txt"로 명명된 파일의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
본 개시의 분야
본 개시는 분자 생물학, 보다 구체적으로 키메라 항원 수용체, 및 하나 이상의 CARTyrin을 함유하는 트랜스포존(transposon)뿐만 아니라, 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
전통적인 항체 서열 또는 이의 단편을 사용하지 않으면서 면역 세포의 특이성을 유도하는 방법에 대한 필요성은 당분야에서 오랫동안 느껴졌으나 충족되지 않았다. 본 개시는 우수한 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 개시는 (a) 적어도 하나의 센티린(Centyrin)을 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인; 및 (c) 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 본 개시 전체에서 사용된 바와 같이, 센티린을 포함하는 CAR은 CARTyrin으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 항원 인식 영역은 2개의 센티린을 포함하여 이중특이적 또는 탠덤(tandem) CARTyrin을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원 인식 영역은 3개의 센티린을 포함하여 삼중특이적 CARTyrin을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시는 (a) 전립선 특이적 막 항원(PSMA)의 서열에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 센티린을 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 본 개시 전체에서 사용된 바와 같이, 센티린을 포함하는 CAR은 CARTyrin으로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 항원 인식 영역은 2개의 센티린을 포함하여 이중특이적 또는 탠덤 CARTyrin을 생성할 수 있다. 항원 인식 영역이 2개의 센티린을 포함하여 이중특이적 또는 탠덤 CARTyrin을 생성할 수 있는 실시양태를 포함하는 일부 실시양태에서, 2개의 센티린 중 하나 또는 둘 다는 PSMA의 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 센티린은 PSMA의 제1 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 센티린은 PSMA의 제2 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, PSMA의 제1 서열과 PSMA의 제2 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, PSMA의 제1 서열과 PSMA의 제2 서열은 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 항원 인식 영역은 3개의 센티린을 포함하여 삼중특이적 CARTyrin을 생성할 수 있다. 항원 인식 영역이 3개의 센티린을 포함하여 삼중특이적 또는 탠덤 CARTyrin을 생성할 수 있는 실시양태를 포함하는 일부 실시양태에서, 3개의 센티린 중 1개, 2개 또는 3개의 센티린은 PSMA의 서열에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 제1 센티린은 PSMA의 제1 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 센티린은 PSMA의 제2 서열에 특이적으로 결합할 수 있고, 제3 센티린은 PSMA의 제3 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PSMA의 제1 서열, 제2 서열 또는 제3 서열 중 2개 이상의 서열은 동일하다. 일부 실시양태에서, PSMA의 제1 서열, 제2 서열 또는 제3 서열 중 2개 이상의 서열은 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, PSMA의 제1 서열, PSMA의 제2 서열 및 PSMA의 제3 서열은 동일하지 않다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항-PSMA CARTyrin"은 PSMA의 서열에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 센티린을 포함하는 CARTyrin을 지칭한다.
본 개시의 항-PSMA CARTyrin의 일부 실시양태에서, 센티린은 아미노산 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
("PSMA5 센티린"), 또는 핵산 서열
Figure pct00003
Figure pct00004
("PSMA5 센티린")을 포함하거나 이러한 서열로 구성된다.
본 개시의 항-PSMA CARTyrin의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 아미노산 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
과 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 아미노산 서열
Figure pct00007
Figure pct00008
과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 항-PSMA CARTyrin의 일부 실시양태에서, 센티린은 아미노산 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
또는 핵산 서열
Figure pct00011
Figure pct00012
을 포함하거나 이러한 서열로 구성된다.
본 개시의 항-PSMA CARTyrin의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 아미노산 서열
Figure pct00013
Figure pct00014
와 적어도 70% 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 아미노산 서열
Figure pct00015
Figure pct00016
와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 인간 CD8α 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩타이드는 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열번호 18004)를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩타이드는 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열번호 18004)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열번호 18004)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩타이드는
Figure pct00017
를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8α 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. CD8α 막횡단 도메인은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(서열번호 18006)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(서열번호 18006)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. CD8α 막횡단 도메인은
Figure pct00018
을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함할 수 있다.
본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 CD28 및/또는 4-1BB 보조자극 도메인을 포함할 수 있다. CD3ζ 보조자극 도메인은
Figure pct00019
Figure pct00020
을 포함하는 아미노산 서열, 또는
Figure pct00021
Figure pct00022
를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. CD3ζ 보조자극 도메인은
Figure pct00023
(서열번호 18010)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 보조자극 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 18011)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 18012)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. 4-1BB 보조자극 도메인은
Figure pct00024
Figure pct00025
을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 보조자극 도메인은 막횡단 도메인과 CD28 보조자극 도메인 사이에 위치될 수 있다.
본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4 서열로부터 유래한 서열을 포함할 수 있다. 본 개시의 CARTyrin의 일부 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유래한 서열을 포함할 수 있다. 힌지는 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 18014)를 포함하는 인간 CD8α 아미노산 서열, 또는 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 18015)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 힌지 아미노산 서열은 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다:
Figure pct00026
Figure pct00027
본 개시의 센티린은 적어도 하나의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시의 센티린은 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 개시의 바람직한 센티린은 PSMA의 서열에 특이적으로 결합한다. 적어도 하나의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인은 인간 단백질로부터 유래할 수 있다. 인간 단백질은 테나신(Tenascin)-C일 수 있다. 컨센서스 서열은
Figure pct00028
Figure pct00029
또는
Figure pct00030
Figure pct00031
를 포함할 수 있다. 컨센서스 서열은 (a) 컨센서스 서열의 위치 13 내지 16에서 아미노산 잔기 TEDS(서열번호 18020)을 포함하거나 이러한 잔기들로 구성된 A-B 루프; (b) 컨센서스 서열의 위치 22 내지 28에서 아미노산 잔기 TAPDAAF(서열번호 18021)을 포함하거나 이러한 잔기들로 구성된 B-C 루프; (c) 컨센서스 서열의 위치 38 내지 43에서 아미노산 잔기 SEKVGE(서열번호 18022)를 포함하거나 이러한 잔기들로 구성된 C-D 루프; (d) 컨센서스 서열의 위치 51 내지 54에서 아미노산 잔기 GSER(서열번호 18023)을 포함하거나 이러한 잔기들로 구성된 D-E 루프; (e) 컨센서스 서열의 위치 60 내지 64에서 아미노산 잔기 GLKPG(서열번호 18024)를 포함하거나 이러한 잔기들로 구성된 E-F 루프; (f) 컨센서스 서열의 위치 75 내지 81에서 아미노산 잔기 KGGHRSN(서열번호 18025)를 포함하거나 이러한 잔기들로 구성된 F-G 루프; 또는 (g) (a) 내지 (f)의 임의의 조합 내의 하나 이상의 위치에서 변형될 수 있다. 본 개시의 센티린은 적어도 5개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인, 적어도 10개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인 또는 적어도 15개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 컨센서스 서열을 포함할 수 있다. 본 개시의 센티린 및/또는 CARTyrin은 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 10-13 M 이하, 10-14 M 이하 및 10-15 M 이하의 KD로부터 선택된 적어도 하나의 친화성으로 항원에 결합할 수 있다. KD는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정될 수 있다.
본 개시는 본 개시의 CARTyrin 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CARTyrin을 포함하는 트랜스포존을 제공한다.
본 개시의 트랜스포존은 이 트랜스포존을 발현하는 세포의 확인, 농축 및/또는 단리를 위한 선택 유전자를 포함할 수 있다. 예시적 선택 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 임의의 유전자 생성물(예를 들면, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적 선택 유전자는 선택 유전자에 의해 코딩된 유전자 생성물의 부재 하에서 세포가 민감한(또는 세포에 치명적일 수 있는) 약물 챌린지에 대한 내성을 부여하는 데 필수적인 임의의 유전자 생성물(예를 들면, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적 선택 유전자는 선택 유전자의 부재 하에서 세포 생존능 및/또는 생존에 필수적인 하나 이상의 영양분을 결여하는 세포 배지에서의 생존능 및/또는 생존에 필수적인 임의의 유전자 생성물(예를 들면, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적 선택 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타제(합성효소)를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase)를 코딩함), 다중약물 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데하이드 데하이드로게나제(dehydrogenase) 1 패밀리, 구성원 A1을 코딩함), FRANCF, RAD51C(RAD51 파랄로그(Paralog) C를 코딩함), GCS(글루코실세라마이드 신타제(합성효소)를 코딩함) 및 NKX2.2(NK2 호메오박스(Homeobox) 2를 코딩함)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 아폽토시스 유발성(전구아폽토시스) 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체성 리간드 결합 영역일 수 있다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 "iC9 안전성 스위치"로서 지칭될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 캐스파제(caspase) 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 단축형(truncated) 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 이 서열의 위치 36에서 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00032
Figure pct00033
을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00034
(서열번호 18027)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)을 가진 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 리간드 결합 영역에 특이적인 유도제는 합성 약물인 AP20187 및/또는 AP1903을 포함한다.
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS(서열번호 18028)을 포함하는 아미노산 서열 또는 GGAGGAGGAGGATCC(서열번호 18029)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 개시의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 87에서 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 282에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는
Figure pct00035
(서열번호 18030)을 포함하는 아미노산 서열, 또는
Figure pct00036
Figure pct00037
(서열번호 18031)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩타이드는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는
Figure pct00038
Figure pct00039
(서열번호 18032)를 포함하는 아미노산 서열, 또는
Figure pct00040
Figure pct00041
(서열번호 18033)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 개시의 트랜스포존은 예를 들면, 본 개시의 하나 이상의 센티린(들) 또는 CARTyrin(들)과 본 개시의 선택 유전자 사이에 위치된 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드(들)를 포함할 수 있다. 본 개시의 트랜스포존은 예를 들면, 본 개시의 하나 이상의 센티린(들) 또는 CARTyrin(들)과 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드 사이에 위치된 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드(들)를 포함할 수 있다. 본 개시의 트랜스포존은 적어도 2개의 자가-절단 펩타이드(들), 즉 예를 들면, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 업스트림, 또는 업스트림 바로 옆에 위치된 제1 자가-절단 펩타이드, 및 예를 들면, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 다운스트림 또는 업스트림 바로 다음에 위치된 제2 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있다.
적어도 하나의 자가-절단 펩타이드는 예를 들면, T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드 또는 GSG-P2A 펩타이드를 포함할 수 있다. T2A 펩타이드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18034)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18035)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩타이드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18036)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18037)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩타이드는 ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca(서열번호 18038)을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩타이드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18039)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18040)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩타이드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18041)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18042)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩타이드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18043)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18044)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩타이드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18045)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18046)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18047)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18048)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩타이드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18049)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18050)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 트랜스포존은 제1 자가-절단 펩타이드 및 제2 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 제1 자가-절단 펩타이드는 예를 들면, 본 개시의 하나 이상의 센트린(들) 또는 CARTyrin(들)의 업스트림에 위치되고, 제2 자가-절단 펩타이드는 예를 들면, 본 개시의 하나 이상의 센티린(들) 또는 CARTyrin(들)의 다운스트림에 위치된다. 제1 자가-절단 펩타이드 및/또는 제2 자가-절단 펩타이드는 예를 들면, T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드 또는 GSG-P2A 펩타이드를 포함할 수 있다. T2A 펩타이드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18034)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18035)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩타이드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18036)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18037)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩타이드는 ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca(서열번호 18038)을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩타이드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18039)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18040)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩타이드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18041)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18042)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩타이드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18043)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18044)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩타이드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18045)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18046)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18047)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18048)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩타이드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18049)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18050)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 CAR을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 본 개시의 트랜스포존의 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 키메라 자극 수용체(CSR)를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR은 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인; 및 (c) 적어도 하나의 신호 전달(도입)(transduction) 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하고; 이때 (a), (b) 및 (c)의 조합은 비-천연 발생이다. 일부 실시양태에서, (a)의 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, (c)의 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질과 제2 단백질은 동일하지 않다. 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 인간 막횡단 수용체, 인간 세포 표면 수용체, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 활성화 성분의 아고니스트가 결합하는 T 세포 수용체(TCR)의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 단백질 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 전달 도메인은 인간 신호 전달 도메인의 성분, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 전달 도메인은 CD3 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3 단백질은 CD3ζ 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질과 제3 단백질은 동일하다. 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 제4 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질과 제4 단백질은 동일하다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 제5 단백질로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질과 제5 단백질은 동일하다. 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 천연 발생 분자에 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, CSR은 활성화 성분과 천연 발생 분자의 결합 시 신호를 전달하지 않는다. 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 제1 단백질의 야생형 서열과 비교될 때 활성화 성분을 코딩하는 서열의 돌연변이 또는 단축(truncation)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 비-천연 발생 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, CSR은 활성화 성분과 비-천연 발생 분자의 결합 시 신호를 선택적으로 전달한다.
본 개시의 트랜스포존의 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존이다.
본 개시의 트랜스포존의 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 TcBuster 트랜스포존이다.
본 개시의 트랜스포존의 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 슬립핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존이다.
본 개시의 트랜스포존의 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 헬라이저(Helraiser) 트랜스포존이다.
본 개시의 트랜스포존의 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이다.
본 개시는 본 개시의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 트랜스포사제(transposase) 효소(전위효소)를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다.
본 개시는 본 개시의 CAR을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 본 개시의 CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 본 개시의 세포에 도입될 때 상기 세포에 의해 안정하게 통합된다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 본 개시의 세포에 도입될 때 상기 세포에 의해 안정하게 통합되지 않는다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 본 개시의 세포에 도입될 때 상기 세포에 의해 안정하게 발현된다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 본 개시의 세포에 도입될 때 상기 세포에 의해 일시적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 본 개시의 세포에 도입될 때 RNA 또는 mRNA를 포함하고, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 상기 세포에 의해 일시적으로 발현된다.
본 개시는 본 개시의 CAR을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 본 개시의 CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 DNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 RNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 세포의 게놈 좌위 또는 좌위들 내로 안정하게 통합된다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 세포의 게놈 좌위 또는 좌위들 내로 안정하게 통합되지 않는다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 세포에 의해 안정하게 발현된다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 세포에 의해 일시적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 RNA 또는 mRNA를 포함하고, CSR 또는 CSR을 코딩하는 서열은 세포에 의해 일시적으로 발현된다.
본 개시의 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존을 포함할 수 있다. 이 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 인슐레이터(insulator) 요소에 의해 플랭킹된 키메라 항원 수용체를 코딩하는 서열을 가진 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존이다.
본 개시의 트랜스포사제 효소는 piggyBac 트랜스포사제 또는 호환 가능한 효소를 포함할 수 있다. 본 개시의 트랜스포사제 효소는 piggyBac 유사 트랜스포사제 또는 호환 가능한 효소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태, 구체적으로 트랜스포존이 piggyBac 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac™ 또는 수퍼(Super) piggyBac™(SPB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태, 구체적으로 트랜스포사제가 수퍼 piggyBac™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 piggyBac™(PB) 트랜스포사제 효소이다. piggyBac(PB) 트랜스포사제 효소는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00042
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 하기 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다:
Figure pct00043
일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 2개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 3개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 하기 위치 30, 165, 282 및 538 각각에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 538에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 수퍼 piggyBac™(sPBo) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 수퍼 piggyBac™(sPBo) 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 이때 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이고, 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이고, 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이고, 위치 538에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 수퍼 piggyBac™(sPBo) 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00044
Figure pct00045
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 TcBuster 트랜스포존이고, 이때 트랜스포사제는 TcBuster 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 과활성 TcBuster 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 75% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00046
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬립핑 뷰티 트랜스포존이고, 트랜스포사제는 슬립핑 뷰티 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 슬립핑 뷰티 트랜스포사제는 서열번호 14485의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 슬립핑 뷰티 트랜스포사제는 과활성 슬립핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다. 일부 실시양태에서, 과활성 슬립핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)는 서열번호 14486의 서열을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬라이저 트랜스포존이고, 이때 트랜스포사제는 헬라이저 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 헬라이저 트랜스포사제는 서열번호 14501의 서열을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포존이고, 이때 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, Tol2 트랜스포사제는 서열번호 14502의 서열을 포함한다.
본 개시는 본 개시의 CARTyrin을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본 개시의 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리되거나 유래한 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 단리되거나 유래한 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 재조합 AAV(rAAV)를 포함할 수 있다. 본 개시의 예시적 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 본 개시의 센티린 또는 CARTyrin을 코딩하는 서열 바로 옆에 시스로 위치된 2개 이상의 역위 말단 반복부(ITR) 서열을 포함한다. 본 개시의 예시적 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 모든 혈청형들(예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9)을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 예시적 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 한 혈청형의 게놈 및 또 다른 혈청형의 캡시드를 함유하는 자가-상보적 AAV(scAAV) 및 AAV 하이브리드(예를 들면, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 예시적 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 rAAV-LK03을 포함하나, 이것으로 제한되지 않는다.
본 개시의 바이러스 벡터는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 선택 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 챌린지될 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있고, 이때 상기 유전자 생성물은 상기 화합물에 대한 내성을 부여한다. 본 개시의 예시적 선택 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다중약물 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데하이드 데하이드로게나제 1 패밀리, 구성원 A1을 코딩함), FRANCF, RAD51C(RAD51 파랄로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라마이드 신타제를 코딩함), NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함) 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 바이러스 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체성 리간드 결합 영역일 수 있다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 "iC9 안전성 스위치"로서 지칭될 수도 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00047
Figure pct00048
(서열번호 18026)을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00049
Figure pct00050
(서열번호 18027)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)을 가진 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 리간드 결합 영역에 특이적인 유도제는 합성 약물인 AP20187 및/또는 AP1903을 포함한다.
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS(서열번호 18028)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GGAGGAGGAGGATCC(서열번호 18029)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 개시의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 87에서 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 282에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열:
Figure pct00051
(서열번호 18030), 또는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열:
Figure pct00052
에 의해 코딩된다.
단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열:
Figure pct00053
(서열번호 18032), 또는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열:
Figure pct00054
을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 개시의 바이러스 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 자가-절단 펩타이드는 CARtyrin과 선택 유전자 사이에 위치된다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 제1 자가-절단 펩타이드는 CARtyrin의 업스트림에 위치되고, 제2 자가-절단 펩타이드는 CARtyrin의 다운스트림에 위치된다. 본 개시의 바이러스 벡터는 예를 들면, 본 개시의 CARTyrin, CAR 또는 CAR 중 하나 이상과 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드 사이에 위치된 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드(들)을 포함할 수 있다. 본 개시의 바이러스 벡터는 적어도 2개의 자가-절단 펩타이드(들), 즉, 예를 들면, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 업스트림 또는 업스트림 바로 옆에 위치된 제1 자가-절단 펩타이드, 및 예를 들면, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 다운스트림 또는 업스트림 바로 옆에 위치된 제2 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있다. 자가-절단 펩타이드는 예를 들면, T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드 또는 GSG-P2A 펩타이드를 포함할 수 있다. T2A 펩타이드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18034)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18035)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩타이드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18036)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18037)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩타이드는 ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca(서열번호 18038)을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩타이드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18039)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18040)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩타이드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18041)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18042)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩타이드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18043)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18044)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩타이드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18045)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18046)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18047)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18048)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩타이드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18049)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18050)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
본 개시는 본 개시의 CARTyrin을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 나노입자이다. 본 개시의 예시적 나노입자 벡터는 핵산(예를 들면, RNA, DNA, 합성 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 이들의 임의의 조합), 아미노산(L-아미노산, D-아미노산, 합성 아미노산, 변형된 아미노산 또는 이들의 임의의 조합), 중합체(예를 들면, 폴리머좀), 마이셀, 지질(예를 들면, 리포좀), 유기 분자(예를 들면, 탄소 원자, 시트, 섬유, 튜브), 무기 분자(예를 들면, 인산칼슘 또는 금) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 나노입자 벡터는 세포막을 가로질러 능동적으로 또는 수동적으로 수송될 수 있다.
본 개시의 나노입자 벡터는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 선택 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 챌린지될 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있고, 이때 상기 유전자 생성물은 상기 화합물에 대한 내성을 부여한다. 본 개시의 예시적 선택 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다중약물 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데하이드 데하이드로게나제 1 패밀리, 구성원 A1을 코딩함), FRANCF, RAD51C(RAD51 파랄로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라마이드 신타제를 코딩함), NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함) 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 나노입자 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체성 리간드 결합 영역일 수 있다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 "iC9 안전성 스위치"로서도 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 나노입자 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 나노입자 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 나노입자 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00055
Figure pct00056
(서열번호 18026)을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00057
(서열번호 18027)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)을 가진 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 리간드 결합 영역에 특이적인 리간드는 합성 약물인 AP20187 및/또는 AP1903을 포함한다.
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS(서열번호 18028)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GGAGGAGGAGGATCC(서열번호 18029)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 개시의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 87에서 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 282에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열:
Figure pct00058
(서열번호 18030), 또는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열:
Figure pct00059
에 의해 코딩된다.
단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열:
Figure pct00060
(서열번호 18032), 또는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열:
Figure pct00061
에 의해 코딩된다.
본 개시의 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 자가-절단 펩타이드는 CARTyrin과 나노입자 사이에 위치된다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 제1 자가-절단 펩타이드는 CARTyrin의 업스트림에 위치되고, 제2 자가-절단 펩타이드는 CARTyrin의 다운스트림에 위치된다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 제1 자가-절단 펩타이드는 CARTyrin과 나노입자 사이에 위치되고, 제2 자가-절단 펩타이드는 CARTyrin의 다운스트림에 위치된다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있고, 이때 제1 자가-절단 펩타이드는 CARTyrin과 나노입자 사이에 위치되고, 제2 자가-절단 펩타이드는 CARTyrin의 다운스트림, 예를 들면, CARTyrin과 선택 유전자 사이에 위치된다.
본 개시의 나노입자 벡터는 예를 들면, 본 개시의 하나 이상의 센티린(들) 또는 CARTyrin(들)과 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드 사이에 위치된 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드(들)을 포함할 수 있다. 본 개시의 나노입자 벡터는 적어도 2개의 자가-절단 펩타이드(들), 즉, 예를 들면, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 업스트림 또는 업스트림 바로 옆에 위치된 제1 자가-절단 펩타이드, 및 예를 들면, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 다운스트림 또는 업스트림 바로 옆에 위치된 제2 자가-절단 펩타이드를 포함할 수 있다. 자가-절단 펩타이드는 예를 들면, T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드 또는 GSG-P2A 펩타이드를 포함할 수 있다. T2A 펩타이드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18034)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18034)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩타이드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18036)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18036)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩타이드는 ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca(서열번호 18038)을 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩타이드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18039)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18039)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩타이드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18041)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18041)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩타이드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18043)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18043)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩타이드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18045)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18045)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18047)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18047)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩타이드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18050)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18050)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다.
본 개시는 본 개시의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 본 개시의 CARTyrin을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시는 본 개시의 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 CARTyrin, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 세포는 세포 표면 상에서 CARTyrin을 발현할 수 있다. 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 면역 세포이다. 면역 세포는 T 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 천연 킬러(NK) 유사 세포, 사이토카인 유도된 킬러(CIK) 세포, 조혈 조상(progenitor) 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포 또는 제대혈(UCB) 유래 T 세포일 수 있다. 바람직하게는, 면역 세포는 T 세포이다. T 세포는 초기 기억 세포, 줄기 유사 T 세포, TSCM 유사 세포, TSCM 또는 TCM일 수 있다. T 세포는 TSCM일 수 있다. 세포는 임의적으로 본 개시의 변형된 면역 세포 또는 T 세포를 자극하고 확장시키는 데 사용될 수 있는 인공 항원 제시 세포일 수 있다. 세포는 임의적으로 인공 또는 변형된 항원 제시 세포로서 사용될 수 있는 종양 세포일 수 있다.
입양 요법을 위해 사용될 수 있는 본 개시의 변형된 세포는 자가 또는 동종이계 세포일 수 있다.
본 개시는 세포의 표면 상에 CARTyrin을 발현시키는 방법으로서, (a) 세포 집단을 수득하는 단계; (b) CARTyrin을 세포 집단 내의 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로질러 전달하기에 충분한 조건 하에서 상기 세포 집단을, 본 개시의 CARTyrin 또는 CARTyrin을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써, 변형된 세포 집단을 생성하는 단계; (c) 트랜스포존의 통합에 적합한 조건 하에서 상기 변형된 세포 집단을 배양하는 단계; 및 (d) 세포 표면 상에 CARTyrin을 발현하는 변형된 세포 집단으로부터 적어도 하나의 세포를 확장시키고/시키거나 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 세포 집단은 백혈구 및/또는 CD4+ 백혈구 및 CD8+ 백혈구를 포함할 수 있다. 세포 집단은 최적화된 비로 CD4+ 백혈구 및 CD8+ 백혈구를 포함할 수 있다. CD8+ 백혈구에 대한 CD4+ 백혈구의 최적화된 비는 생체내에서 천연적으로 존재하지 않는다. 세포 집단은 종양 세포를 포함할 수 있다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포존 또는 벡터는 CARTyrin 또는 CARTyrin을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 항-PSMA CARTyrin 또는 항-PSMA CARTyrin을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물을 추가로 포함한다. 트랜스포사제가 piggyBac 트랜스포사제인 실시양태를 포함하는 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 mRNA 서열이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 트랜스포사제는 서열번호 18017을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 트랜스포사제는 과활성 변이체이고, 이때 과활성 변이체는 서열번호 18017의 위치 30, 165, 282 및 538 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호 18017의 위치 30에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)의 발린(V)으로의 치환(I30V)이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 18017의 위치 165에서의 아미노산 치환은 글리신(G)의 세린(S)으로의 치환(G165S)이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 18017의 위치 282에서의 아미노산 치환은 메티오닌(M)의 발린(V)으로의 치환(M282V)이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 18017의 위치 538에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)의 라이신(K)으로의 치환(N538K)이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 수퍼 piggyBac(sPBo) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 수퍼 piggyBac(sPBo) 트랜스포사제는 서열번호 14484를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시는 본 개시의 CARTyrin 또는 CARTyrin을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 벡터는 본 개시의 항-PSMA CARTyrin 또는 항-PSMA CARTyrin을 코딩하는 서열을 포함한다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, CARTyrin을 코딩하는 서열을 세포 집단 내의 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로질러 전달하기에 충분한 조건은 뉴클레오펙션(핵감염)을 포함한다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, CARTyrin을 코딩하는 서열을 세포 집단 내의 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로질러 전달하기에 충분한 조건은 특정된 전압에서의 1회 이상의 전기 펄스의 적용, 완충제 및 하나 이상의 보충 인자(들) 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector), 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충제 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 보충 인자(들)는 (a) 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 또는 이들의 임의의 조합; (b) 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합; (c) 세포 배지; (d) 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제; 및 (e) 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약을 포함할 수 있다. 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 또는 이들의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼(Earle)의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 석신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운(Crown)-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로(CellGro) DC 배지, CTS 옵티마이저(OpTimizer) T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트(ImmunoCult)-XF T 세포 확장 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성(전구염증성) 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 캐스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt 또는 Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 억제제(예를 들면, TWS119), 바필로마이신(Bafilomycin), 클로로퀸(Chloroquine), 퀴나크린(Quinacrine), AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩타이드, TREX1 효소 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 본 개시의 CARTyrin 또는 CARTyrin을 코딩하는 서열의 통합에 적합한 조건은 완충제 및 하나 이상의 보충 인자(들) 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 트랜스포존 또는 벡터는 본 개시의 CARTyrin 또는 CARTyrin을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사 뉴클레오펙터, 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충제 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 보충 인자(들)는 (a) 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 또는 이들의 임의의 조합; (b) 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합; (c) 세포 배지; (d) 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제; 및 (e) 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약을 포함할 수 있다. 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 또는 이들의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 석신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 캐스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt 또는 Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 억제제(예를 들면, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩타이드, TREX1 효소 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 확장 및 선택 단계는 순차적으로 일어난다. 확장은 선택 전에 일어날 수 있다. 확장은 선택 후에 일어날 수 있고, 임의적으로 추가(즉, 제2) 선택은 확장 후에 일어날 수 있다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 확장 및 선택 단계는 동시에 일어날 수 있다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 확장은 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 항원과 접촉시켜 CARTyrin을 통해 상기 적어도 하나의 세포를 자극함으로써, 확장된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 항원은 기재의 표면 상에 제시될 수 있다. 기재는 표면, 웰, 비드 또는 복수의 비드들, 및 매트릭스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 임의의 형태를 가질 수 있다. 기재는 상자성 또는 자성 성분을 추가로 포함할 수 있다. CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 항원은 기재의 표면 상에 제시될 수 있고, 이때 기재는 자성 비드이고, 자석은 자성 비드를 변형되고 확장된 세포 집단으로부터 제거하거나 분리하는 데 사용될 수 있다. 항원은 세포 또는 인공 항원 제시 세포의 표면 상에 제시될 수 있다. 본 개시의 인공 항원 제시 세포는 종양 세포 및 줄기 세포를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포존 또는 벡터는 선택 유전자를 포함하고, 선택 단계는 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를, 선택 유전자에 의해 내성이 부여되는 화합물과 접촉시킴으로써, 선택 유전자를 발현하는 세포를 선택에서 생존하는 세포로서 확인하고 선택 유전자를 발현하지 못하는 세포를 선택 단계에서 생존하지 못하는 세포로서 확인하는 단계를 포함한다.
CARTyrin을 발현시키는 이 방법의 일부 실시양태에서, 확장 및/또는 선택 단계는 종점을 포함하는 10일 내지 14일의 기간 동안 진행될 수 있다.
본 개시는 본 개시의 방법의 변형되고 확장되고 선택된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 본 개시의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, CARTyrin이 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 악성 종양 세포일 수 있다. 본 개시의 변형된 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 일부 실시양태에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 자가 세포 또는 세포 집단일 수 있다. 본 개시의 변형된 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 일부 실시양태에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 동종이계 세포 또는 세포 집단일 수 있다.
본 개시는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 본 개시의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 항-PSMA CARTyrin이 종양 세포 상의 PSMA 항원 또는 종양 세포의 혈관구조의 성분에 특이적으로 결합하는 것인 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 전립선 세포이다. 일부 실시양태에서, 종양 세포는 악성 종양 세포일 수 있다. 본 개시의 변형된 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 일부 실시양태에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 자가 세포 또는 세포 집단일 수 있다. 본 개시의 변형된 세포 또는 세포 집단을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 일부 실시양태에서, 상기 세포 또는 세포 집단은 동종이계 세포 또는 세포 집단일 수 있다.
본 개시의 세포 요법을 변형시키는 방법은 예를 들면, 회복의 징후 또는 질환 중증도/진행의 감소의 징후, 질환 관해/중단의 징후, 및/또는 부작용의 발생에 반응하여 요법을 종결하거나 약화시키는 데 이용될 수 있다. 본 개시의 세포 요법은, 질환의 징후 또는 증상이 다시 나타나거나 중증도 및/또는 부작용의 증가가 해결되면, 유도제를 억제함으로써 재개될 수 있다.
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도 1은 EF1α 프로모터, 안전성 스위치(iC9), PSMA CARTyrin 및 선택 유전자 카세트를 포함하는 7738개의 염기쌍의 piggyBac CARTyrin P-PSMA-101 플라스미드를 도시하는 개략도이다.
도 2는 (CD8α 신호 펩타이드, 항-PSMA 센티린, CD8α 스페이서, CD8α 막횡단 서열, 4-1BB 보조자극 도메인 및 CD3ζ 보조자극 도메인을 포함하는) PSMA CARTyrin을 포함하는 P-PSMA-101 트랜스포존을 포함하는 piggyBac CARTyrin을 도시하는 개략도이다.
도 3a는 본 개시의 P-PSMA5-101 구축물의 아미노산 서열의 개략도이다.
도 3b는 본 개시의 P-PSMA5-101 구축물의 핵산 서열의 개략도이다.
도 3c는 본 개시의 P-PSMA5-101 구축물의 핵산 서열의 개략도이다.
도 4a는 본 개시의 P-PSMA8-101 구축물의 아마노산 서열의 개략도이다.
도 4b는 본 개시의 P-PSMA8-101 구축물의 아미노산 서열의 개략도이다.
도 4c는 본 개시의 P-PSMA8-101 구축물의 아미노산 서열의 개략도이다.
도 5는 본 개시의 CARTyrin의 구축을 도시하는 개략도, 및 센티린 및 항체의 특성을 대조하는 표이다.
도 6a 내지 6e는 PSMA CARTyrin의 일시적 발현 및 작용을 보여준다. 시험관내 어세이를 수행하여, P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101을 생성하는 데 사용된 선도물질 PSMA CARTyrin의 발현 및 작용을 시험하였다. PSMA CARTyrin은 전날 밤에 PSMA CARTyrin을 코딩하는 mRNA에 의해 일시적으로 형질감염된 일차 인간 T 세포의 표면 상에서 검출되었다(도 6a). 요약하건대, 미리 활성화된 후 냉동된 범 T 세포를 해동시키고 T 세포 배양 배지에서 하룻밤 동안 그대로 놓아두었고, 세포를 다음날 저녁에 10 ㎍의 PSMA CARTyrin mRNA로 전기천공한 후, 다음날 아침에 표지부착을 위해 가용성 재조합 인간 PSMA 단백질(rPSMA)을 사용하여 FACS로 표면 발현 분석을 수행하였다. 시험관내에서 이 T 세포의 작용을 시험하기 위해, 세포를 4시간 동안 PSMA 발현 세포의 패널과 함께 공-배양한 후, 탈과립화의 마커이고 T 세포 사멸에 대한 대용물인 CD107a의 발현으로 표적 세포 사멸을 측정하였다. PSMA를 안정하게 발현하도록 조작된 K562 세포(K562.PSMA), 및 PSMA를 내생적으로 발현하는 인간 전립선암 세포주인 LNCaP에 대해 PSMA의 표면 발현을 평가하였다(도 6b). PSMA CARTyrin 발현 T 세포는 PSMA- 세포주(K562, PC-3)에 대해 배경 초과의 탈과립화를 거의 내지 전혀 야기하지 않으면서 PSMA를 발현하는 모든 세포주들(LNCaP, K562.PSMA)에 대해 탈과립화시킬 수 있었다(도 6c). PSMA를 코딩하는 mRNA를 PSMA- 세포주인 K562 내로 적정하여, PSMA의 표면 발현의 수준을 조절하였다(도 6d). PSMA CARTyrin+ 세포는 다양한 양의 표면 PSMA를 발현하는 K562 세포에 대한 강한 세포독성 작용을 나타내었다(도 6e). 이 데이터는 PSMA CARTyrin이 T 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고 PSMA+ 세포 표적에 대한 세포독성 작용을 용이하게 할 수 있음을 보여준다.
도 7a 내지 7f는 piggyBac 제조된 P-PSMA-101의 표현형 및 작용을 보여준다. 선도물질 PSMA CARTyrin의 생체내 평가를 뒷받침하기 위해, piggyBac DNA 변형 시스템을 사용하여 P-PSMA-101을 구축하였다. PSMA CARTyrin은 P-PSMA5-101 또는 P-PSMA8-101 플라스미드가 전위된, 대표 공여자로부터의 일차 인간 T 세포의 표면 상에서 검출되었으나, P-BCMA-101 플라스미드 대조군이 전위된 세포 상에서는 검출되지 않았다(도 7a). 두 경우들에서, 대다수의 CD8+ CAR-T 세포들은 염색 및 FACS 분석 후 T 줄기 세포 기억 표현형(Tscm)과 통상적으로 관련된 마커인 CD45RA 및 CD62L의 발현에 대해 이중 양성을 나타내었다(도 7b). 나아가, FACS 분석 시 (CD8+ 또는 CD4+ 상에서 게이팅된) 이 세포들은 활성화 및/또는 작용적 T 세포 소진과 관련된 분자인 PD-1, Tim-3 및 Lag-3을 낮은 수준으로 발현하였거나 전혀 발현하지 않았다(도 7c). 그 다음, PSMA 발현 세포와 함께 공-배양한 후 시험관내에서 이 CAR-T 세포의 이펙터 작용을 평가하였다. IFN-γ 분비는 24시간 후 표준 ELISA에 의해 측정되었고, (3명의 독립적인 공여자들로부터의) CAR-T 세포들을 이들의 동족 표적 항원의 존재 하에서 항온처리하였을 때 배지에서 검출되었다; P-BCMA-101은 표면 상에서 BCMA를 발현하도록 조작된 K562 세포(K562.BCMA)의 존재 하에서만 IFN-γ를 분비한 반면, P-PSMA-101은 표면 상에서 PSMA를 발현하는 종양 세포주(LNCaP 및 K562.PSMA)의 존재 하에서만 IFN-γ를 분비하였다(도 7d). 추가로, P-PSMA-101은 표준 사멸 어세이에 의해 측정되었을 때 LNCaP에 대한 강한 세포독성 작용을 나타낸 반면, P-BCMA-101은 사멸 능력을 거의 나타내지 않았다; 2명의 독립적인 공여자들로부터의 데이터(도 7e). 96시간 후, 여러 종양 세포주들과 공-배양하였을 때 세포 증식 능력을 평가하였다. P-PSMA-101은 PSMA+ LNCaP 및 22Rv1에 대한 강한 증식 능력을 나타내었고, P-BCMA-101은 BCMA+ H929에 대한 증식 능력을 나타낸 반면, CAR-T 세포는 PSMA-BCMA- 세포주 K562뿐만 아니라 DU145에 대해서도 증식 능력을 나타내지 않았다(도 7f). 이 데이터는 P-PSMA-101 세포가 표면 상에서 PSMA CARTyrin을 발현하였고 PSMA+ 세포 표적에 대한 시험관내 세포독성 작용 및 증식 능력을 나타내었다는 것을 보여준다.
도 8a 내지 8f는 뮤린 이종이식편 모델을 사용한 P-PSMA8-101의 임상전 평가를 보여준다. 도 8a는 치료 일정의 개략도이다. NSG 마우스 내로 피하 주사된(SC) 루시퍼라제 발현 LNCaP 세포주(LNCaP.luc)를 사용한 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 P-PSMA8-101의 생체내 항-종양 효능을 평가하였다. 이 생체내 연구를 위해, P-PSMA8-101 플라스미드의 PB 전달 및 포세이다(Poseida) 제조 과정을 이용하여 모든 CAR-T 세포들을 생성하였다. LNCaP를 마우스의 겨드랑이에 주사하였고(좋지 않은 LNCaP "흡수"율을 고려하여 n=25), 종양이 확립되었을 때(이식한 지 17일 후, 칼리퍼에 의해 측정될 때 100 내지 300 mm3) 치료하였다. IV 주사를 통해 초저용량(1x10^6), '스트레스' 용량(5x10^6) 및 표준 용량(10x10^6)의 P-PSMA-101로 마우스를 치료하였다. 도 8b는 항-종양 활성의 생존 곡선 그래프이다. 도 8c는 혈액에서의 P-PSMA8-101 CD8+ T 세포 확장 및 검출을 보여주는 막대 그래프이다. 도 8d는 칼리퍼 측정에 의한 종양 부피 평가를 보여주는 일련의 선 그래프들이다. 도 8e는 BLI에 의한 LNCaP 종양의 생체발광을 보여주는 선 그래프이다. 도 8f는 도 8e에서 정량된, 마우스 내의 LNCaP 종양의 생체발광의 대표적인 사진을 보여준다.
도 9a 내지 9g는 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 "스트레스" 용량의 선도물질 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101 후보를 임상전 평가한 결과를 보여준다. 도 9a는 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 '스트레스' 용량의 P-PSMA-101 후보를 임상전 평가하기 위한 연구의 타임라인을 도시하는 개략도이다. NSG 마우스 내로 피하 주사된(SC) 루시퍼라제 발현 LNCaP 세포주(LNCaP.luc)를 사용한 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 '스트레스' 용량(4x10^6)의 총 CAR-T 세포들에서 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101의 생체내 항-종양 효능을 평가하였다. 이 생체내 연구를 위해, 포세이다 제조 과정을 이용하여 P-PSMA5-101 또는 P-PSMA8-101 플라스미드의 PB 전달을 이용하여 모든 CAR-T 세포들을 생성하였다. LNCaP를 마우스의 겨드랑이에 주사하였고 종양이 확립되었을 때(칼리퍼에 의해 측정될 때 100 내지 300 mm3) 치료하였다. PSMA5 CAR과 PSMA8 CAR 사이의 임의의 가능한 효능 차이를 파악하기 위해 IV 주사를 통해 '스트레스' 용량(4x10^6)의 P-PSMA-101로 마우스를 치료하였다. 생존, 혈액에서의 CD8+ T 세포 확장 및 검출, 칼리퍼 측정에 의한 종양 부피 평가, 및 LNCaP 종양의 생체발광으로 항-종양 활성을 평가하였다. '스트레스' 용량의 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101은 T 세포(CAR 부재) 대조군 마우스에 비해 NSG 마우스 내의 확립된 SC LNCaP.luc 고형 종양에 대한 상당히 향상된 항-종양 효능 및 생존을 나타내었다. 구체적으로, T 세포(CAR 부재) 대조군 동물에서는 생존이 없었고, P-BCMA-101 치료군에서는 25% 생존이 있었고, P-PSMA5-101 치료군에서는 75% 생존이 있었고, '스트레스' 용량의 P-PSMA8-101로 치료된 동물에서는 100% 생존이 있었다. 말초 혈액에서, P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101은 확장되었고, 검출 가능한 칼리퍼 및 생체발광 영상화 한계 미만으로의 종양 부담의 감소를 수반하는 분화된 이펙터 CARTyrin+ T 세포를 생성하였다. 그 다음, 이 세포들은 수축하였으나 말초 혈액에 존속하였다. 도 9b는 항-종양 활성의 생존 곡선 그래프이다. 도 9c는 혈액에서의 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101 CD8+ T 세포 확장 및 검출을 보여주는 막대 그래프이다. 도 9d는 칼리퍼 측정에 의한 종양 부피 평가를 보여주는 일련의 선 그래프들이다. 좌측 패널은 우측 패널 상의 일련의 그래프들에서 표시된 종양 부피 데이터의 평균을 보여준다. 도 9e는 BLI에 의한 LNCaP 종양의 생체발광을 보여주는 선 그래프이다. 도 9f는 도 9e에서 정량된, LNCaP 종양 마우스의 생체발광의 대표적인 사진을 보여준다. 도 9g는 P-PSMA-101(TSCM/TCM)이 고형 종양을 공격하기 위해 CARTyrin+ TCM, TEM 및 Teff를 생성함을 보여주는 일련의 유세포분석도이다. 고형 종양 제거 후, P-PSMA-101 TSCM의 집단은 존속한다.
도 10은 뉴클레오펙션 후 12일째 날 치료제(CARTyrin)를 단독으로 또는 본 개시의 유도성 캐스파제 폴리펩타이드(piggyBac(PB) 트랜스포사제에 의해 세포 내로 도입된 iC9 구축물("안전성 스위치"로서도 공지되어 있음)에 의해 코딩됨)과 함께 발현하도록 변형된 세포에서 증가하는 용량의 유도제(AP1903)의 함수로서, 생존 세포의 영역(게이팅된 아래쪽 우측 사분원)으로부터 아폽토시스 세포에 의해 차지된 영역(위쪽 좌측 사분원)으로 이동하는 세포의 존재도를 도시하는 일련의 유세포분석도이다.
도 11은 뉴클레오펙션 후 19일째 날 치료제(CARTyrin)를 단독으로 또는 본 개시의 유도성 캐스파제 폴리펩타이드(piggyBac(PB) 트랜스포사제에 의해 세포 내로 도입된 iC9 구축물("안전성 스위치"로서도 공지되어 있음)에 의해 코딩됨)와 함께 발현하도록 변형된 세포에서 증가하는 용량의 유도제(AP1903)의 함수로서, 생존 세포의 영역(게이팅된 아래쪽 우측 사분원)으로부터 아폽토시스 세포에 의해 차지된 영역(위쪽 좌측 사분원)으로 이동하는 세포의 존재도를 도시하는 일련의 유세포분석도이다.
도 12는 도 10(좌측 그래프) 또는 도 11(우측 그래프)에 나타낸 취합된 결과의 정량을 도시하는 한 쌍의 그래프들이다. 구체적으로, 이 그래프들은 12일째 날(도 10 및 좌측 그래프) 또는 19일째 날(도 11 및 우측 그래프) 각각의 변형된 세포 유형에 대한 iC9 스위치의 유도제(AP1903)의 농도의 함수로서 퍼센트 세포 생존능에 대한 iC9 안전성 스위치의 영향을 보여준다.
도 13은 T 세포를 강화하는 데 사용될 수 있는 다양한 체크포인트 신호전달(signaling) 단백질들을 표적화하는 넉아웃 효율을 도시하는 막대 그래프이다. 휴면 일차 인간 범 T 세포에서 Cas-CLOVER를 사용하여 체크포인트 수용체인 PD-1, TGFBR2, LAG-3, TIM-3 및 CTLA-4를 넉아웃시켰다. 퍼센트 넉아웃은 y 축 상에 표시되어 있다. 유전자 편집은 유세포분석에 의해 측정되었을 때 세포 표면에서 30% 내지 70%의 단백질 발현 손실을 초래하였다.
도 14는 일차 T 세포에서 야생형 수용체, 널(null) 수용체 및 스위치 수용체, 및 세포내 억제 또는 자극 신호전달에 대한 이들의 효과의 개략도이다. T 세포 상에서 내생적으로 발현된 야생형 억제 수용체와 이의 내생성 리간드의 결합은 부분적으로 T 세포 이펙터 작용을 감소시키는 억제 신호의 전달을 야기한다. 그러나, 체크포인트 수용체 단백질, 예컨대, PD1(위쪽 패널) 또는 TGFBRII(아래쪽 패널)의 세포내 도메인(ICD)의 돌연변이(돌연변이된 널) 또는 결실(단축형 널)은 동족 리간드(들)가 결합될 때 그의 신호전달 능력을 감소시키거나 제거한다. 따라서, 변형된 T 세포의 표면 상에서의 조작된 돌연변이된 또는 단축형 널 수용체의 발현은 유리 내생성 리간드(들)의 결합에 대해 내생적으로 발현된 야생형 수용체와 경쟁하게 만들어, 내생적으로 발현된 야생형 수용체에 의한 억제 신호의 전달을 감소시키거나 제거한다. 구체적으로, 돌연변이된 또는 널 수용체에 의한 임의의 결합은 내생성 리간드(들)가 야생형 수용체에 결합하지 못하게 하고 변형된 T 세포에게 효과적으로 전달된 체크포인트 신호전달의 전체 수준의 희석을 야기함으로써, 변형된 T 세포의 체크포인트 억제 및 작용적 소진을 감소시키거나 차단한다. 스위치 수용체는 야생형 ICD를 보조자극 분자(예컨대, CD3z, CD28, 4-1BB) 또는 상이한 억제 분자(예컨대, CTLA4, PD1, Lag3)로부터의 ICD로 대체함으로써 생성된다. 전자의 경우, 변형된 스위치 수용체에 의한 내생성 리간드(들)의 결합은 양성 신호를 T 세포에게 전달함으로써, 변형된 T 세포의 자극을 향상시키고 잠재적으로 표적 종양 세포 사멸을 향상시키는 데 도움을 준다. 후자의 경우, 변형된 스위치 수용체에 의한 내생성 리간드(들)의 결합은 음성 신호를 T 세포에게 전달함으로써, 변형된 T 세포의 자극을 제거하고 표적 종양 세포 사멸을 잠재적으로 감소시킨다. 신호 펩타이드(자주색 화살표), 세포외 도메인(ECD)(밝은 녹색), 막횡단 도메인(황색), 세포내 신호전달 도메인(ICD)(주황색) 및 대체 ICD(녹색)가 수용체 도표에 표시되어 있다. "*"는 돌연변이된 ICD를 표시한다. "+"는 체크포인트 신호의 존재를 표시한다. "-"는 체크포인트 신호의 부재를 표시한다.
도 15a는 변형된 T 세포의 표면 상에서의 수용체의 발현을 증가시키는 데 도움을 줄 수 있는 특정 변경을 가진 널 수용체의 디자인의 일례를 보여주는 개략도이다. PD1 및 TGFBRII 널 수용체에 대한 예가 제시되어 있고, PD1(위쪽 패널) 및 TGFBRII(아래쪽 패널)에 대한 단축형 널 수용체의 신호 펩타이드 도메인(SP), 막횡단 도메인(TM) 및 세포외 도메인(ECD)이 표시되어 있다. 야생형 PD-1 SP 및 TM을 코딩하는, 위쪽 4개의 분자들 중 첫 번째 분자는 야생형 PD-1 수용체이다. PD1 널 수용체의 경우, 인간 T 세포 CD8a 수용체의 SP 또는 TM 도메인(적색)에 의한 PD1 야생형 SP 또는 TM 도메인(녹색; 밝은 녹색)의 대체가 도시되어 있다. 두 번째 분자는 천연 PD-1 TM과 함께 CD8a SP를 코딩하고, 세 번째 분자는 야생형 PD-1 SP 및 대안적 CD8a TM을 코딩하고, 네 번째 분자는 대안적 CD8a SP 및 대안적 CD8a TM을 코딩한다. 유사하게, TGFβRII의 널 수용체의 경우, 인간 T 세포 CD8a 수용체의 SP 도메인(적색)에 의한 야생형 TGFBRII SP(분홍색)의 대체. 구축물의 명칭 및 각각의 구축물 단백질의 아미노산 길이(aa)는 도표의 좌측 상에 나열되어 있다.
도 15b는 유세포분석에 의해 측정될 때 변형된 일차 인간 T 세포의 표면 상에서의 PD1 및 TGFβRII 널 수용체의 발현을 도시하는 일련의 히스토그램들이다. 도 15a로부터의 6개의 단축형 널 구축물들 각각을 일차 인간 T 세포의 표면 상에서 발현시켰다. T 세포를 항-PD1(위쪽: 청색 히스토그램) 또는 항-TGFβRII(아래쪽: 청색 히스토그램), 또는 이소타입 대조군 또는 이차로만(회색 히스토그램) 염색하였다. PD-1 또는 TGFβRII 발현에 대해 양성으로 염색되는 세포는 게이팅되었고(게이트 위에 표시된 주파수), 평균 형광 강도(MFI) 값은 각각의 양성 히스토그램 위에 표시되어 있다. 널 수용체 구축물의 명칭은 각각의 도표 위에 표시되어 있다. 널 수용체 유전자 전략 둘 다의 경우, 대안적 CD8a에 의한 야생형 SP의 대체는 성공적으로 발현되었다. 02.8aSP-PD-1 및 02.8aSP-TGFβRII는 T 세포 표면에서 최고 수준의 발현을 야기하였다. 02.8aSP-PD-1 널 수용체는 내생성 T 세포 PD-1 발현보다 177배 더 높고 야생형 PD-1 널 수용체보다 2.8배 더 높은 43,680의 MFI를 나타내었다. 02.8aSP-TGFβRII 널 수용체는 내생성 T 세포 TGFβRII 발현보다 102배 더 높고 야생형 TGFβRII 널 수용체보다 1.8배 더 높은 13,809의 MFI를 나타내었다. PD-1 및 TGRBRII 둘 다의 경우 대안적 CD8a SP에 의한 야생형 SP의 대체는 내생성 리간드(들)의 결합 및 격리 시 체크포인트 억제의 감소 또는 차단을 최대화하는 데 도움을 줄 수 있는, 널 또는 스위치 수용체의 향상된 표면 발현을 야기한다.
도 16a 및 16b는 T 세포에서 발현시킬 NF-KB 유도성 벡터를 도시하는 한 쌍의 개략도이다. 2개의 T 세포 활성화 NF-KB 유도성 벡터들; 즉, 정방향으로 항시성 EF1a 프로모터 앞에 유전자 발현 시스템(GES)을 가진 T 세포 활성화 NF-KB 유도성 벡터(도 16a), 및 상보적 방향으로 항시성 EF1a 프로모터 앞에 GES를 가진 T 세포 활성화 NF-KB 유도성 벡터(도 16b)를 개발하였다. 이 벡터들은 T2A 서열에 의해 분리된, CAR 분자 및 DHFR 선택 유전자의 발현도 유도한다. 조건부 NF-KB 유도성 시스템, 및 EF1a에 의해 유도되는 유전자 둘 다가 전기천공(EP)을 이용함으로써 T 세포 내로 영구적으로 통합될 수 있는 piggyBac 트랜스포존의 부분이다. 일단 게놈 내로 통합되면, T 세포는 막 표면 상에서 CAR을 항시적으로 발현할 것이고 세포 내부에서 DHFR을 항시적으로 발현할 것인 반면, NF-KB 유도성 유전자인 GFP의 발현은 T 세포 활성화 시에만 최고 수준까지 발현될 것이다.
도 17은 활성화된 T 세포에서의 GFP의 NF-KB 유도성 발현을 도시하는 한 쌍의 그래프들이다. 정방향(pNFKB-GFP 정방향) 또는 역방향(pNFKB-GFP 역방향)으로 GFP 발현을 유도하는 NF-KB 유도성 발현 시스템의 부재(GES 조절 부재) 또는 존재와 함께 EF1a 프로모터의 조절 하에서 항-BCMA CAR 및 DHFR 뮤테인 유전자를 발현하는 piggyBac 벡터로 T 세포를 뉴클레오펙션시켰다. 세포가 거의 완전히 휴면할 때(19일째 날)까지 메토트렉세이트 선택의 존재 하에서 세포를 배양하였고, 5일째 날 및 19일째 날 GFP 발현을 평가하였다. 5일째 날, 모든 T 세포들은 증식하고 고도로 자극되는데, 이때 세포는 강한 NFκB 활성으로 인해 고수준의 GFP를 생성하는 NF-KB 유도성 발현 카세트를 가진다. GES 조절이 없는 세포는 검출 가능한 수준의 GFP를 발현하지 않았다. 19일째 날까지, GES T 세포는 거의 완전히 휴면하였고, NFκB 활성이 더 낮기 때문에 GFP 발현은 5일째 날보다 상당히 더 낮았다(약 1/8 MFI). GFP 발현은 19일째 날 여전히 관찰되는데, 이는 GFP 단백질의 긴 반감기(약 30시간), 또는 예를 들면, TCR, CAR, 사이토카인 수용체 또는 성장 인자 수용체 신호를 통한 기본 수준의 NFκB 활성에 기인할 수 있다.
도 18은 BCMA+ 종양 세포의 존재 하에서 GFP의 NF-KB 유도성 발현의 항-BCMA CAR 매개 활성화를 도시하는 일련의 그래프들이다. T 세포를 변형시키지 않았거나(모의 T 세포), 정방향(pNFKB-GFP 정방향) 또는 역방향(pNFKB-GFP 역방향)으로 GFP 발현을 유도하는 NF-KB 유도성 발현 시스템의 부재(GES 조절 부재) 또는 존재와 함께 EF1a 프로모터의 조절 하에서 항-BCMA CAR 및 DHFR 뮤테인 유전자를 발현하는 piggyBac 벡터로 T 세포를 뉴클레오펙션시켰다. 세포들이 거의 완전히 휴면할 때까지, 메토트렉세이트 선택을 이용하거나 이용하지 않으면서(모의 T 세포) 모든 세포들을 22일 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 BCMA-(K562), BMCA+(RPMI 8226), 또는 양성 대조군 항-CD3 항-CD28 활성화제(CD3/28 자극)의 부재(자극 부재) 또는 존재 하에서 3일 동안 자극하였다. GES 조절이 없는 T 세포 또는 모의 T 세포를 사용한 모든 조건들 하에서 GFP 발현은 검출될 수 없었다. 그러나, pNFKB-GFP 정방향 전위된 세포 및 역방향 전위된 세포는 BCMA- K562 세포와 함께 배양되었을 때 자극 없는 대조군에 비해 GFP 발현을 거의 나타내지 않았지만, 이 세포들 둘 다가 BCMA+ 종양 세포의 존재 하에서 또는 양성 대조군 조건 하에서 유전자 발현의 현저한 상향조절을 나타내었다. BCMA+ 종양 세포와 공-배양된 pNFKB-GFP 정방향 전위된 세포와 역방향 전위된 세포 사이에 GFP 발현의 차이는 거의 관찰되지 않았다.
도 19는 유도성 유전자의 발현 수준이 프로모터 앞에 있는 다수의 반응 요소들에 의해 조절될 수 있다는 것을 입증하는 일련의 그래프들이다. 인간 EF1a 프로모터의 조절 하에서 항-BCMA CARTyrin 다음에 선택 유전자를 코딩하는 piggyBac 벡터로 T 세포를 뉴클레오펙션시켰다. 추가로, 벡터는 단축형 CD19 단백질(dCD19)의 발현을 유도하는 조건부 NF-KB 유도성 유전자 발현 시스템을 추가로 코딩하였고, 0개 내지 5개의 NFKB 반응 요소(RE)를 포함하였거나, GES를 포함하지 않았거나(GES 부재), 전기천공 펄스를 제공받되, piggyBac 핵산을 제공받지 않았다(모의). 역(반대)방향/배향으로 오로지 GES에 대한 데이터가 제시되어 있다. 모든 세포들을 18일 동안 배양하였고, 메토트렉세이트 첨가를 이용하는, piggyBac-변형된 T 세포에 대한 선택을 포함시켰다. 그 다음, 항-CD3 항-CD28 비드 활성화제를 사용하여 3일 동안 세포를 자극하였고, 0일째 날, 3일째 날 및 18일째 날 FACS로 dCD19 표면 발현을 평가하였고, 데이터를 FACS 히스토그램 및 표적 단백질 염색의 MFI로서 표시한다. 각각의 FACS 히스토그램의 x 축은 로그 크기(0, 103, 104, 105)로 도시되어 있다. 각각의 FACS 히스토그램에 작도된 샘플은 위부터 아래까지 NFKB-A08-DHFR_Rev002.fcs, NFKB-A08_DHFR_Rev-RE4X_12.fcs, NFKB-A08_DHFR_Rev-RE3X_011.fcs, NFKB-A08_DHFR_Rev-RE2X_010.fcs, NFKB-A08_DHFR_Rev-RE1X_009.fcs, NFKB-A08_DHFR_Rev-RE0X_008.fcs, NFKB-A08_DHFR_v5_013.fcs 및 NFKB-A08_DHFR_MOCK_014.fcs이다. 표면 dCD19 발현은 GES를 코딩하는 벡터에 의해 전위된 모든 T 세포들에서 0일째 날 낮은 수준으로 검출되었다. 자극한 지 3일 후, GES를 발현하는 모든 T 세포들에 대해 dCD19 발현의 현저한 상향조절이 관찰되었는데, 이때 더 높은 수의 RE를 가진 세포들에서 표면 발현의 더 큰 배수 증가가 관찰되었다. 따라서, 표면 dCD19 발현은 GES에 코딩된 RE의 수와 정비례하였다. GES를 갖지 않은 T 세포, 즉 GES가 없는 T 세포 및 모의 대조군의 표면 상에서는 dCD19가 검출되지 않았다.
도 20은 Csy4-T2A-Clo051-G4S링커-dCas9 구축물 맵의 개략도이다(실시양태 2).
도 21은 pRT1-Clo051-dCas9 이중 NLS 구축물 맵의 개략도이다(실시양태 1).
도 22는 전립선암 골 전이 뮤린 이종이식편 모델에서 선도물질 P-PSMA-101 후보의 임상전 평가를 위한 연구의 타임라인을 도시하는 개략도이다. 인간 PSMA 단백질을 발현하도록 조작된 루시퍼라제 발현 PC3 세포주(PC3.lucGFP.hPSMA)를 사용한 뮤린 이종이식편 모델을 NSG 마우스 내로 경골주위 주사하였고(IT), 두 상이한 용량, 즉 '스트레스' 용량인 4x10^6개의 총 CAR-T 세포 및 표준 용량인 12x10^6개의 총 CAR-T 세포에서 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101의 생체내 항-종양 효능을 평가하는 데 사용하였다. 음성 대조군으로서, T 세포 단독(CAR을 발현하지 않음; 12e6 용량) 또는 P-BCMA-101 T 세포(무관한 항-BCMA CAR을 발현함; 12e6 용량)도 포함시켰다. 이 생체내 연구를 위해, 포세이다 제조 과정을 이용한 P-PSMA5-101 또는 P-PSMA8-101 플라스미드의 PB 전달을 이용하여 모든 CAR-T 세포들을 생성하였다. Pc3.lucGFP.hPSMA를 마우스에게 경골주위 주사하고 4일 후 CAR-T 세포로 치료하였다(모든 종양-챌린지된 마우스들은 총 발광 플럭스(p/sec/m2)가 1x10^6 내지 5x10^6인 생체발광 영상화(BLI)에 의해 검출 가능한 종양을 가졌다).
도 23은 '스트레스' 용량 또는 표준 용량의 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101의 용량 효능이 T 세포(CAR 부재) 단독 또는 P-BCMA-101 치료 대조군 마우스에 비해 NSG 마우스 내의 확립된 IT PC3.lucGFP.hPSMA 고형 종양에 대한 항-종양 효능을 나타냄을 보여주는 그래프이다.
도 24는 본 개시의 piggyBac P-PSMA-101 나노트랜스포존을 도시하는 개략도이다.
도 25는 수퍼 piggyBac 트랜스포사제와 함께 P-PSMA-101 piggyBac 플라스미드(밝은 회색 막대) 또는 P-PSMA-101 piggyBac 나노트랜스포존(어두운 회색 막대)의 전기천공(EP) 전달이 PSMA CARTyrin의 표면 발현에 의해 측정될 때 인간 범 T 세포(EP로부터 5일 후)에서 높은 전위 효율(퍼센트 전위(%))을 야기하였다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 26은 항-PSMA CAR 나노트랜스포존(NT)을 사용함으로써 생성된 인간 CAR-T 세포가 표적 종양 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 보여주는 일련의 그래프들이다. 전체 크기 piggyBac 플라스미드(FP) 또는 piggyBac 나노트랜스포존(NT)을 사용함으로써 생성된 항-PSMA CAR T 세포는 표준 포세이다 과정을 이용함으로써 생성되었다. PSMA(K562.PSMA)를 발현하도록 조작된 K562 세포는 표시된 이펙터 대 표적 비에서 CAR-T 세포에 의해 사멸되었다. 이 데이터는 FP를 사용함으로써 생성되든 아니면 NT를 사용함으로써 생성되든 모든 CAR-T 세포들이 항원 의존적 방식으로 표적 종양 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 보여준다. 이것은 2명의 상이한 정상 공여자들로부터 인간 범 T 세포로부터 생성된 CAR-T 세포에도 해당되었다.
도 27은 항-PSMA CAR 나노트랜스포존(NT)을 사용함으로써 생성된 인간 CAR-T 세포가 표현형 조성에 있어서 필적할만하였다는 것을 보여주는 일련의 그래프들이다. 전체 크기 piggyBac 플라스미드(FP) 또는 piggyBac 나노트랜스포존(NT)을 사용함으로써 생성된 항-PSMA CAR T 세포는 표준 포세이다 과정을 이용함으로써 제조되었다. 기억 T 세포 마커 및 활성화/소진 마커의 표현형 분석(데이터는 제시되어 있지 않음)을 수행하였다. 이 데이터는 FP를 사용함으로써 생성되든 아니면 NT를 사용함으로써 생성되든 모든 CAR-T 세포들이 CD45RA+CD62L+(Tscm), CD45RA-CD62L+(Tcm), CD45RA-CD62L-(Tem) 및 CD45RA+CD62L-(Teff) 세포의 유사한 표현형 조성을 나타내었음을 보여준다. 추가로, CCR7(CD197), CD127, CD27, LAG3, TIM3, CXCR3, PD-1 및 CD25의 필적할만한 발현 수준이 관찰되었다(데이터는 제시되어 있지 않음). 이것은 2명의 상이한 정상 공여자들로부터 인간 범 T 세포로부터 생성된 CAR-T 세포에도 해당되었다.
도 28은 항-PSMA CAR 나노트랜스포존(NT)을 사용함으로써 생성된 인간 CAR-T 세포가 유사한 통합된 카피 수를 가진다는 것을 보여주는 일련의 그래프들이다. 전체 크기 piggyBac 플라스미드(FP) 또는 piggyBac 나노트랜스포존(NT)을 사용함으로써 생성된 항-PSMA CAR T 세포는 표준 포세이다 과정을 이용함으로써 제조되었다. 통합된 트랜스포존의 평균 카피 수를 정량 PCR로 측정하였다. 이 데이터는 2명의 상이한 공여자들에서 FP를 사용함으로써 생성되든 아니면 NT를 사용함으로써 생성되든 모든 CAR-T 세포들이 유사한 통합된 카피 수의 트랜스포존을 나타내었음을 보여준다.
도 29a는 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 '스트레스' 용량에서 나노트랜스포존(NT)에 의해 전달될 때에 비해 전체 길이 플라스미드(FLP)에 의해 전달될 때 P-PSMA-101 트랜스포존의 임상전 평가를 보여주는 개략도이다. NSG 마우스 내로 피하 주사된(SC) 루시퍼라제 발현 LNCaP 세포주(LNCaP.luc)를 사용하는 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여, 2명의 상이한 정상 공여자들로부터의 두 상이한 '스트레스' 용량(2.5x10^6 또는 4x10^6)의 총 CAR-T 세포에서 전체 길이 플라스미드(FLP) 또는 나노트랜스포존(NT)에 의해 전달된 P-PSMA-101 트랜스포존의 생체내 항-종양 효능을 평가하였다. FLP 또는 NT 전달을 이용한 P-PSMA-101 트랜스포존의 piggyBac(PB) 전달을 이용함으로써 모든 CAR-T 세포들을 생성하였다. LNCaP를 마우스의 겨드랑이에 주사하고, 종양이 확립되었을 때(칼리퍼에 의한 측정 시 100 내지 200 mm3) 치료하였다. FLP에 의한 트랜스포존 전달과 NT에 의한 트랜스포존 전달 사이의 가능한 작용적 효능 차이를 검출하는 데 있어서 더 큰 해상도를 위해 두 상이한 '스트레스' 용량(2.5x10^6 또는 4x10^6)의 P-PSMA-101 CAR-T를 IV 주사하여 마우스를 치료하였다.
도 29b는 도 29a에 기재된 바와 같이 치료된 마우스의 종양 부피 평가를 보여주는 일련의 그래프들이다. 대조군 마우스(흑색), 공여자 #1 FLP 마우스(적색), 공여자 #1 NT 마우스(청색), 공여자 #2 FLP 마우스(주황색) 및 공여자 #2 NT 마우스(녹색)에 대한 칼리퍼 측정에 의한 종양 부피 평가는 오차 막대를 가진 군 평균(위) 및 개별 마우스(아래)로서 표시되어 있다. y 축은 칼리퍼 측정에 의해 평가된 종양 부피(mm3)를 보여준다. x 축은 T 세포 치료 후 날짜의 수를 보여준다. NT에 의해 전달된, '스트레스' 용량의 P-PSMA-101 트랜스포존은 칼리퍼에 의해 측정될 때 FLP 및 대조군 마우스에 비해 확립된 SC LNCaP.luc 고형 종양에 대한 향상된 항-종양 효능을 나타내었다.
도 30은 T 세포 수용체(TCR), 및 보조수용체 CD28 및 CD2를 도시하는 개략도이다.
도 31은 아고니스트 mAb(항-CD3, 항-CD28 및 항-CD2)의 결합을 통해 T 세포에게 전달된 일차 보조자극 및 이차 보조자극을 도시하는 개략도이다. 전체 T 세포 활성화는 면역 반응을 증강시키는 보조자극 수용체에 의한 제2 신호와 함께 TCR 개입에 결정적으로 의존한다. 일차 보조자극 및 이차 보조자극은 아고니스트 mAb(예를 들면, 항-CD3, 항-CD28, 항-CD2, 이 mAb들과 접합된 비드, 이 mAb들의 다량체성 복합체 등)를 표시하는 물질을 사용한 표면 수용체의 처리 및 개입을 통해 T 세포에게 전달될 수 있다.
도 32는 TCR의 부재 하에서 자극이 키메라 자극 수용체(CSR)의 발현에 의해 향상된다는 것을 보여주는 개략도이다. 일시적으로 또는 안정적으로 발현된 표면-발현된 CSR의 존재 하에서, T 세포가 아고니스트 mAb를 표시하는 물질로 처리될 때 향상된 일차 보조자극 및 이차 보조자극 신호가 전달된다. 더 완전한 T 세포 활성화가 CSR 매개 자극 신호를 통해 달성되기 때문에, T 세포 활성화 및 확장은 향상된다.
도 33a는 본 개시의 예시적 CSR CD28z를 도시하는 개략도이다.
도 33b는 도 33a에 나타낸 CSR CD28z를 코딩하는 아미노산 서열이다.
도 33c는 도 33a에 나타낸 CSR CD28z를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
도 34a는 본 개시의 예시적 CSR CD2z를 도시하는 개략도이다.
도 34b는 도 34a에 나타낸 CSR CD2z를 코딩하는 아미노산 서열이다.
도 34c는 도 34a에 나타낸 CSR CD2z를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이다.
도 35는 CSR이 T 세포의 표면 상에서 발현되고 외생성 자극의 부재 하에서 세포 활성화를 유발하지 않는다는 것을 보여주는 일련의 그래프들이다. 정상 혈액 공여자로부터의 범 T 세포를 표준 T 세포 배양 배지에서 항-CD3/항-CD28 비드로 자극한 후, 휴면시켰다. 그 다음, CD28 CSR, CD2 CSR 또는 야생형 CD19 대조군을 코딩하는 10 ㎍의 mRNA로 상기 세포를 전기천공하였다(700 μs 동안 500V에서 BTX ECM 830 전기천공기). 2일 후, 전기천공된 세포를 각각의 분자의 표면 발현에 대해 유세포분석으로 조사하였고, 데이터는 적층된 히스토그램으로서 표시되어 있다. 추가로, 모의 전기천공된 대조군 세포보다 높은 세포 활성화의 가능한 표시로서 세포 크기(FSC-A) 및 CD69 발현을 평가하였다. CD28z CSR, CD2z CSR 또는 CD19로 전기천공된 T 세포에서 각각 CD28, CD 및 CD19의 증가된 표면 발현이 검출되었다. T 세포의 표면 상에서의 이 분자들의 발현은 본질적으로 외생성 자극의 부재 하에서 상기 세포를 활성화시키지 않았다.
도 36은 CSR의 전달이 CAR-T 세포의 확장을 향상시킴을 보여주는 그래프이다. mRNA로 일시적으로 또는 piggyBac™로 안정적으로 CSR을 CAR-T 세포에게 전달하였다. piggyBac™ DNA 변형 시스템 및 표준 포세이다 과정을 이용하여 정상 공여자의 혈액으로부터 단리된 범 T 세포를 유전적으로 변형시켰다. CSR(CD28z 또는 CD2z; 일시적 발현을 야기함)을 코딩하는 추가 mRNA 또는 CD19 mRNA 대조군과 함께, 또는 BCMA CAR, 선택 유전자 및 CSR(CD28z 또는 CD2z; 안정한 발현을 야기함)을 코딩하는 트랜스포존과 함께, 수퍼 piggyBac 트랜스포사제(SPB)를 코딩하는 mRNA, BCMA CAR을 코딩하는 트랜스포존 및 선택 유전자를 사용하여 단일 반응에서 세포를 공-전기천공하였다. 그 후, 아고니스트 mAb 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28로 상기 세포를 자극한 후, 19일 배양 기간의 과정에 걸쳐 유전적 변형에 대해 선택하였다. 초기 배양 기간의 말기에 모든 T 세포들은 CAR을 발현하였는데, 이것은 유전적으로 변형된 세포에 대한 성공적인 선택을 시사한다(데이터는 제시되어 있지 않음). 막대는 웰 내의 총 생존 CAR-T 세포를 나타내고, 숫자는 CSR 또는 CD19 mRNA 대조군의 부재 하에서 생성된 CAR-T 세포보다 더 높은 확장의 배수 향상을 표시한다. CD2z 또는 CD28z CSR을 일시적으로 또는 안정적으로 발현하는 샘플에서, CAR-T 세포의 더 큰 확장 정도.
도 37은 CSR의 발현이 CAR-T 세포 세포독성에 유의미한 영향을 미치지 않음을 보여주는 일련의 막대 그래프들이다. mRNA로 일시적으로 또는 piggyBac™로 안정적으로 CSR을 CAR-T 세포에게 전달하였다. piggyBac™ DNA 변형 시스템 및 표준 포세이다 과정을 이용하여 정상 공여자의 혈액으로부터 단리된 범 T 세포를 유전적으로 변형시켰다. CSR(CD28z 또는 CD2z; 일시적 발현을 야기함)을 코딩하는 추가 mRNA와 함께, 또는 BCMA CAR, 선택 유전자 및 CSR(CD28z 또는 CD2z; 안정한 발현을 야기함)을 코딩하는 트랜스포존과 함께, 수퍼 piggyBac 트랜스포사제(SPB)를 코딩하는 mRNA, BCMA CAR을 코딩하는 트랜스포존 및 선택 유전자를 사용하여 단일 반응에서 세포를 공-전기천공하였다. 그 후, 아고니스트 mAb 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28로 상기 세포를 자극한 후, 19일 배양 기간의 과정에 걸쳐 유전적 변형에 대해 선택하였다. 초기 배양 기간의 말기에 모든 T 세포들은 CAR을 발현하였는데, 이것은 유전적으로 변형된 세포에 대한 성공적인 선택을 시사한다(데이터는 제시되어 있지 않음). 사멸시키는 CAR-T 세포 능력을 평가하기 위해, 10:1, 3:1 또는 1:1 E:T 비에서 48시간 동안 세포를 조작된 K562-BCMA-루시퍼라제(eK562-Luc.BCMA) 또는 음성 대조군 세포주 K562-루시퍼라제(eK562-Luc)와 공-배양하였다. 루시퍼라제 신호를 측정하여 세포독성을 측정하였다. eK562-Luc의 사멸은 좌측 상에 막대 그래프로 표시되어 있는 반면, eK562-Luc.BCMA의 사멸은 우측 상에 막대 그래프로 표시되어 있다. 모든 CAR+ T 세포들은 항-BCMA 특이적 CAR을 발현하였고 BCMA+ 표적 세포에 대한 유사한 시험관내 세포독성을 나타내었다. 요약하건대, 이 활성은 일시적인 또는 안정한 CSR 공-발현에 의해 유의미한 영향을 받지 않았다.
본 개시는 적어도 하나의 센티린을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)(CARTyrin)를 제공한다. 본 개시의 키메라 항원 수용체는 하나 초과의 센티린을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이중특이적 CARTyrin은 2개의 상이한 항원들에 특이적으로 결합하는 2개의 CARTyrin을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시의 CARTyrin은 PSMA의 서열에 특이적으로 결합하므로, PSMA 특이적 센티린으로서 지칭되는 적어도 하나의 CARTyrin을 포함한다. 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린을 포함하는 본 개시의 CARTyrin은 본원에서 PSMA의 서열에 특이적으로 결합하는 항-PSMA CARTyrin으로서 지칭된다.
본 개시의 센티린은 항원에 특이적으로 결합한다. 항원에 특이적으로 결합하는 하나 초과의 센티린을 포함하는 본 개시의 키메라 항원 수용체는 특정 항원에 대한 세포(예를 들면, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 유도하는 데 사용될 수 있다.
본 개시의 센티린은
Figure pct00062
Figure pct00063
(서열번호 18018)을 포함하는 컨센서스 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 키메라 항원 수용체는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR의 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 개시의 힌지/스페이서 도메인은 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4의 힌지/스페이서/줄기를 포함할 수 있다. 본 개시의 세포내 도메인 또는 엔도도메인은 인간 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있고 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 예시적 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시는 본 개시의 CARTyrin을 세포에 도입함으로써 하나 이상의 항원에 대한 특이성을 갖게 된 유전적으로 변형된 세포, 예컨대, T 세포, NK 세포, 조혈 조상 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포(G-CSF-동원된 말초 혈액으로부터의 T 세포를 포함함), 제대혈(UCB) 유래 T 세포를 제공한다. 본 개시의 세포는 본 개시의 CARTyrin을 코딩하는 트랜스포존 및 본 개시의 트랜스포사제를 코딩하는 서열(바람직하게는, 본 개시의 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열임)을 포함하는 플라스미드의 전기전달에 의해 변형될 수 있다.
세포 조성의 추가 변형
본 개시는 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인 및 (b) 막횡단 도메인 또는 세포막 부착 영역을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공하고, 이때 (a)와 (b)의 조합은 비-천연 발생이다. 일부 실시양태에서, 이 CSR은 환경의 성분에 결합하고, 수용체의 전체 길이 또는 막횡단 버전과 경쟁함으로써 그 신호전달의 세포 결과를 변화시켜, 상기 환경의 성분과 활성화 성분의 결합으로부터 비롯된 세포내 신호를 감소시킨다.
본 개시는 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인; 및 (c) 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공하고, 이때 (a), (b) 및 (c)의 조합은 비-천연 발생이다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, (a)의 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, (c)의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질과 제2 단백질은 동일하지 않다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, CSR은 세포외에서의 활성화 성분의 결합을, 신호의 억제, 또는 제1 단백질의 야생형, 전체 길이 또는 막횡단 버전에 의해 전달될 신호와 정성적으로 상이한 신호의 전달로 바꾸는 스위치 수용체이다. CSR 스위치 수용체는 키메라 세포외 도메인 및 세포내 도메인을 갖기 때문에, 상기 CSR은 세포외 활성화 성분의 결합의 결과를 천연 발생 시나리오에서 조작된 비-천연 발생 시나리오로 바꿀 수 있다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 인간 막횡단 수용체의 성분, 인간 세포 표면 수용체, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 활성화 성분의 아고니스트가 결합하는 인간 막횡단 수용체의 성분, 인간 세포 표면 수용체, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상의 부분을 포함한다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 상기 아고니스트는 유기 또는 무기 소분자, 핵산, 아미노산, 항체 또는 이의 단편, 항체 모방체, 앱타머, 스카폴드 단백질, 리간드, 수용체, 천연 발생 생체분자 및 비-천연 발생 분자(유기 또는 무기) 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 단백질 또는 이의 부분을 포함한다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 신호 전달 도메인은 인간 신호 전달 도메인의 성분, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 전달 도메인은 CD3 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3 단백질은 CD3ζ 단백질을 포함한다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포질 도메인을 코딩하는 서열은 보조자극 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질과 제3 단백질은 동일하다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 제4 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질과 제4 단백질은 동일하다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 제5 단백질로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 제1 단백질과 제5 단백질은 동일하다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, CSR은 CD2 단백질로부터 단리되거나 유래한 서열을 가진 신호 펩타이드, 및 아고니스트가 결합하는 CD2 단백질 또는 이의 부분으로부터 단리되거나 유래한 서열을 포함하는 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인; CD2 단백질로부터 단리되거나 유래한 서열을 포함하는 막횡단 도메인; 및 CD2 단백질로부터 단리되거나 유래한 서열을 포함하는 세포질 도메인 및 CD3ζ 단백질로부터 단리되거나 유래한 서열을 포함하는 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 천연 발생 분자에 결합하지 않는다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, CSR은 활성화 성분과 천연 발생 분자의 결합 시 신호를 전달하지 않는다. 일부 실시양태에서, 엑토도메인은 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 제1 단백질의 야생형 서열과 비교될 때 활성화 성분을 코딩하는 서열의 돌연변이 또는 단축을 포함한다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, 활성화 성분은 비-천연 발생 분자에 결합한다.
본 개시의 CSR의 일부 실시양태에서, CSR은 활성화 성분과 비-천연 발생 분자의 결합 시 신호를 선택적으로 전달한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 본 개시의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 CSR을 코딩하고/하거나 본 개시의 CSR을 발현하는 서열을 포함하는 세포를 비롯한 본 개시의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 CSR을 코딩하고/하거나 본 개시의 CSR을 발현하는 서열을 포함하는 세포를 비롯한 복수의 본 개시의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 (a) 본 개시의 CSR을 코딩하는 서열 및 (b) 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 변형된 세포를 제공하고, 이때 상기 세포는 T 세포이다.
본 개시는 (a) 본 개시의 CSR을 코딩하는 서열 및 (b) 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 변형된 세포를 제공한다. 본 개시의 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 상기 변형된 세포는 비-천연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열 및/또는 치료 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
변형된 세포가 비-천연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인 및 (c) 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 (a)의 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 (a)의 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 CD28 및/또는 4-1BB 보조자극 도메인을 포함한다.
본 개시의 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 트랜스포존, 벡터, 공여 서열 또는 공여 플라스미드는 CSR을 코딩하는 서열 및/또는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존, 벡터, 공여 서열 또는 공여 플라스미드는 비-천연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존, 벡터, 공여 서열 또는 공여 플라스미드는 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 piggyBac 또는 piggy-Bac 유사 트랜스포존이다.
본 개시의 변형된 세포의 일부 실시양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 세포에서 일시적으로 발현되고, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열 또는 치료 단백질을 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 실시양태에서, 제1 트랜스포존, 제1 벡터, 제1 공여 서열 또는 제1 공여 플라스미드는 CSR을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 트랜스포존, 제2 벡터, 제2 공여 서열 또는 제2 공여 플라스미드는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 비-천연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열, 및 치료 단백질을 코딩하는 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 트랜스포존, 제1 벡터, 제1 공여 서열 또는 제1 공여 플라스미드는 제1 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 트랜스포존, 제2 벡터, 제2 공여 서열 또는 제2 공여 플라스미드는 제2 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 선택 마커와 제2 선택 마커는 동일하지 않다.
본 개시의 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 선택 마커는 세포 표면 마커이다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 상기 마커 또는 검출 가능한 태그에 의해 분류될 때 세포를 구별한다. 일부 실시양태에서, 검출 가능한 태그는 형광 또는 자기 태그이다.
본 개시의 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 선택 마커는 분열하는 세포에서 활성을 띠고 분열하지 않는 세포에서 활성을 띠지 않는 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 마커는 대사 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 마커는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 뮤테인 효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, DHFR 뮤테인 효소는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된다:
Figure pct00064
일부 실시양태에서, DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80, 113 또는 153 중 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80에서의 페닐알라닌(F) 또는 류신(L)의 치환, 위치 113에서의 류신(L) 또는 발린(V)의 치환, 및 위치 153에서의 발린(V) 또는 아스파르트산(D)의 치환 중 하나 이상의 치환을 포함한다.
키메라 자극 수용체(CSR)
본 개시는 아고니스트 항-CD3 mAb를 포함하는 표준 활성화/자극 물질을 사용함으로써 자극될 때 CD3z 일차 자극을 T 세포(및 결과적으로 내생성 CD3ζ)에게 전달하기 위한 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다.
본 개시의 키메라 자극 수용체(CSR)는 T 세포의 활성화 및 확장을 향상시키기 위한 CD3ζ 자극을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 CSR은 세포외 아고니스트 mAb 에피토프 및 세포내 CD3ζ 자극 도메인을 포함하고, 작용적으로, CSR을 발현하도록 변형된 동종이계 T 세포에서 표면 상에서의 항-CD28 또는 항-CD2 결합 이벤트를 CD3z 신호전달 이벤트로 전환시킨다. 일부 실시양태에서, CSR은 CD28z CSR 및 CD2z CSR을 생성하기 위해 각각 야생형 CD28 또는 CD2 단백질 및 CD3z 세포내 자극 도메인을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, CD28z CSR 및/또는 CD2z CSR은 비-천연 발생 항원 수용체 및/또는 치료 단백질을 추가로 발현한다. 바람직한 실시양태에서, 비-천연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, CD28z CSR은 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00065
일부 실시양태에서, CD28z CSR은 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00066
일부 실시양태에서, CD2z CSR은 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00067
일부 실시양태에서, CD2z CSR은 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00068
본 개시의 CSR을 포함/발현하는 본 개시의 변형된 T 세포는 본 개시의 CSR을 포함/발현하지 않는 세포에 비해 T 세포의 확장을 개선한다.
면역 및 면역 전구체 세포
일부 실시양태에서, 본 개시의 면역 세포는 림프 조상 세포, 천연 킬러(NK) 세포, T 림프구(T 세포), 줄기 기억 T 세포(TSCM 세포), 중심 기억 T 세포(TCM), 줄기 세포 유사 T 세포, B 림프구(B 세포), 골수 조상 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵세포, 대식세포, 혈소판, 적혈구, 적혈 세포(RBC), 거핵구 또는 파골세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 전구체 세포는 1종 이상의 면역 세포로 분화될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 전구체 세포는 자가-재생할 수 있고 면역 세포로 발달될 수 있는 다분화능 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 전구체 세포는 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 이의 자손 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 전구체 세포는 면역 세포로 발달될 수 있는 전구체 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 전구체 세포는 조혈 조상 세포(HPC)를 포함한다.
조혈 줄기 세포(HSC)
조혈 줄기 세포(HSC)는 다분화능 자가-재생 세포이다. 림프 및 골수 계통으로부터의 모든 분화된 혈액 세포들은 HSC로부터 발생된다. HSC는 성인 골수, 말초 혈액, 동원된 말초 혈액, 복막 투석 유출물 및 제대혈에서 발견될 수 있다.
본 개시의 HSC는 일차 또는 배양된 줄기 세포로부터 단리될 수 있거나 유래할 수 있다. 본 개시의 HSC는 배아 줄기 세포, 다분화능 줄기 세포, 전분화능 줄기 세포, 성인 줄기 세포 또는 유도된 전분화능 줄기 세포(iPSC)로부터 단리될 수 있거나 유래할 수 있다.
본 개시의 면역 전구체 세포는 HSC 또는 HSC 자손 세포를 포함할 수 있다. 본 개시의 예시적 HSC 자손 세포는 다분화능 줄기 세포, 림프 조상 세포, 천연 킬러(NK) 세포, T 림프구 세포(T 세포), B 림프구 세포(B 세포), 골수 조상 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단핵세포 및 대식세포를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 방법에 의해 생성된 HSC는 성인 줄기 세포로부터 단리되거나 유래하고 단일 계통으로 구속되지만, 배아 줄기 세포의 특성을 공유하는 "원시" 줄기 세포의 특징을 보유할 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 방법에 의해 생성된 "원시" HSC는 분열 후 그의 "줄기성"을 보유하고 분화하지 않는다. 결과적으로, 입양 세포 요법으로서, 본 개시의 방법에 의해 생성된 "원시" HSC는 그의 수를 보충할 뿐만 아니라 생체내에서 확장한다. 본 개시의 방법에 의해 생성된 "원시" HSC는 단일 용량으로서 투여될 때 치료 효과적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 원시 HSC는 CD34+이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 원시 HSC는 CD34+ 및 CD38-이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 원시 HSC는 CD34+, CD38- 및 CD90+이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+ 및 CD45RA-이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA- 및 CD49f+이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 대다수의 원시 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA- 및 CD49f+이다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 원시 HSC, HSC 및/또는 HSC 자손 세포는 외생성 서열(예를 들면, 키메라 항원 수용체 또는 치료 단백질)을 발현하도록 본 개시의 방법에 따라 변형될 수 있다. 본 개시의 일부 실시양태에서, 변형된 원시 HSC, 변형된 HSC 및/또는 변형된 HSC 자손 세포는 본 개시의 변형된 T 세포, 변형된 천연 킬러 세포 및/또는 변형된 B 세포를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 변형된 면역 세포를 생성하도록 향후 분화될 수 있다.
T 세포
본 개시의 변형된 T 세포는 변형된 조혈 줄기 및 조상 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래할 수 있다.
전통적인 생물제제 및 화학요법제와 달리, 본 개시의 변형된 T 세포는 항원 인식 시 빠르게 재생하는 능력을 가짐으로써, 잠재적으로 반복 치료 필요성을 없앤다. 이를 달성하기 위해, 일부 실시양태에서, 본 개시의 변형된 T 세포는 초기 반응을 유도할 뿐만 아니라, 생존 기억 T 세포의 안정한 집단으로서 환자에 존속하여 잠재적 재발도 예방한다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, 이러한 잠재적 재발의 예방이 요구되지 않을 때, 본 개시의 변형된 T 세포는 환자에 존속하지 않는다.
집중적인 노력은 항원 비의존성(긴장성) 신호전달을 통해 T 세포 소진을 야기하지 않는 항원 수용체 분자, 및 초기 기억 T 세포, 특히 줄기 세포 기억(TSCM) 또는 줄기 세포 유사 T 세포를 함유하는 변형된 T 세포 생성물의 개발에 초점이 맞추어졌다. 본 개시의 줄기 세포 유사 변형된 T 세포는 가장 큰 자가-재생 능력, 및 중심 기억(TCM) T 세포 또는 TCM 유사 세포, 이펙터 기억(TEM) 및 이펙터 T 세포(TE)를 유도하는 다분화능을 나타냄으로써, 보다 더 우수한 종양 박멸 및 장기간 변형된 T 세포 생착을 유발한다. 분화의 선형 경로는 이 세포들을 생성하는 원인일 수 있다: 미감작 T 세포(TN) > TSCM > TCM > TEM > TE > TTE, 이때 TN은 TSCM을 직접 생성하는 모 전구체 세포이고, 그 다음 이 TSCM은 TCM을 직접 생성한다. 본 개시의 T 세포의 조성물은 각각의 모 T 세포 서브세트의 하나 이상의 모 T 세포를 포함할 수 있고, 이때 TSCM 세포가 가장 풍부하다(예를 들면, TSCM > TCM > TEM > TE > TTE).
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 면역 세포 전구체는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T 세포, 미감작 T 세포(TN), TSCM, TCM, TEM, TE 또는 TTE로 분화되거나 분화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 전구체는 본 개시의 원시 HSC, HSC 또는 HSC 자손 세포이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 면역 세포는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T 세포, 미감작 T 세포(TN), TSCM, TCM, TEM, TE 또는 TTE이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 면역 세포는 초기 기억 T 세포이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 면역 세포는 줄기 세포 유사 T 세포이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 면역 세포는 TSCM이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 면역 세포는 TCM이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 T 세포들을 변형시키고/시키거나, 복수의 변형된 T 세포들을 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포들은 초기 기억 T 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 초기 기억 T 세포는 적어도 하나의 변형된 줄기 세포 유사 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 초기 기억 T 세포는 적어도 하나의 변형된 TSCM을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 초기 기억 T 세포는 적어도 하나의 변형된 TCM을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 T 세포들을 변형시키고/시키거나, 복수의 변형된 T 세포들을 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포들은 줄기 세포 유사 T 세포의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 줄기 세포 유사 T 세포는 적어도 하나의 변형된 TSCM을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 변형된 줄기 세포 유사 T 세포는 적어도 하나의 변형된 TCM을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 T 세포들을 변형시키고/시키거나, 복수의 변형된 T 세포들을 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포들은 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L 및 CD45RA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 T 세포들을 변형시키고/시키거나, 복수의 변형된 T 세포들을 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포들은 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 T 세포들을 변형시키고/시키거나, 복수의 변형된 T 세포들을 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포들은 미감작 T 세포(TN)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 T 세포들을 변형시키고/시키거나, 복수의 변형된 T 세포들을 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포들은 이펙터 T 세포(변형된 TEFF)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 마커는 CD45RA, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 T 세포들을 변형시키고/시키거나, 복수의 변형된 T 세포들을 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포들은 줄기 세포 유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 완충제는 면역 세포 또는 이의 전구체를 포함한다. 완충제는 T 세포를 포함하는 면역 세포 또는 이의 전구체의 세포 생존능 및/또는 줄기 유사 표현형의 수준을 유지하거나 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 완충제는 뉴클레오펙션 전 일차 인간 T 세포의 세포 생존능 및/또는 줄기 유사 표현형의 수준을 유지하거나 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 완충제는 뉴클레오펙션 동안 일차 인간 T 세포의 세포 생존능 및/또는 줄기 유사 표현형의 수준을 유지하거나 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 완충제는 뉴클레오펙션 후 일차 인간 T 세포의 세포 생존능 및/또는 줄기 유사 표현의 수준을 유지하거나 향상시킨다. 일부 실시양태에서, 완충제는 임의의 절대적 또는 상대적 존재도 또는 농도로 KCl, MgCl2, ClNa, 글루코스 및 Ca(NO3)2 중 하나 이상을 포함하고, 임의적으로, 완충제는 HEPES, Tris/HCl 및 인산염 완충제로 구성된 군으로부터 선택된 보충제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코스 및 0.4 mM Ca(NO3)2을 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코스 및 0.4 mM Ca(NO3)2, 및 20 mM HEPES 및 75 mM Tris/HCl을 포함하는 보충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완충제는 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코스 및 0.4 mM Ca(NO3)2, 및 pH 7.2의 40 mM Na2HPO4/NaH2PO4을 포함하는 보충제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 일차 인간 T 세포를 포함하는 조성물은 100 ㎕의 완충제 및 5x106개 내지 25x106개의 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 도입 단계 동안 완충제 또는 다른 배지 밀리리터당 250x106개의 일차 인간 T 세포의 확장 가능한 비를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본 개시의 T 세포를 비롯한 본 개시의 면역 세포를 T 세포 확장 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 본 개시의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 본 개시의 면역 세포 내로 도입하는 단계는 면역 세포를 T 세포 확장 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법의 도입 단계가 전기천공 또는 뉴클레오펙션 단계를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한 일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포 확장 조성물과 접촉하는 면역 세포를 사용하여 전기천공 또는 뉴클레오펙션 단계를 수행할 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 인; 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산 및 올레산 중 하나 이상; 및 알칸을 포함하거나, 본질적으로 이들로 구성되거나, 이들로 구성된다.
본 개시의 변형된 T 세포를 생성하는 방법의 일부 실시양태에서, 확장 보충제는 하나 이상의 사이토카인(들)을 포함한다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 림포카인을 포함하나, 이것으로 제한되지 않는 임의의 사이토카인을 포함할 수 있다. 예시적 림포카인은 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-21(IL-21), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터페론-감마(INFγ)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 IL-2를 포함할 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캡토에탄올 및 확장 보충제를 포함한다. 이 방법의 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠설폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 하이드라자이드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 종점을 포함하는 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg의 농도로 옥탄산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 팔미트산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 리놀레산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 올레산; 및 종점을 포함하는 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 약 9 mg/kg의 농도로 옥탄산, 약 2 mg/kg의 농도로 팔미트산, 약 2 mg/kg의 농도로 리놀레산, 약 2 mg/kg의 농도로 올레산 및 약 1 mg/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 종점을 포함하는 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg의 농도로 옥탄산; 종점을 포함하는 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg의 농도로 팔미트산; 종점을 포함하는 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도로 리놀레산; 종점을 포함하는 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도로 올레산; 및 종점을 포함하는 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 약 64 μmol/kg의 농도로 옥탄산, 약 7 μmol/kg의 농도로 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg의 농도로 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg의 농도로 올레산 및 약 2.5 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 복수의 확장된 변형된 T 세포들을 생성하기 위해 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캡토에탄올 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하고, 이때 적어도 2%의 복수의 변형된 T 세포들은 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM) 및/또는 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포 표면 마커(들)를 발현한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠설폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산 하이드라자이드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 포함하거나 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들면, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 종점을 포함하는 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg의 농도로 옥탄산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 팔미트산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 리놀레산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 올레산; 및 종점을 포함하는 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 농도로 스테롤(이때, mg/kg = 백만분율) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 약 9 mg/kg의 농도로 옥탄산, 약 2 mg/kg의 농도로 팔미트산, 약 2 mg/kg의 농도로 리놀레산, 약 2 mg/kg의 농도로 올레산 및 약 1 mg/kg의 농도로 스테롤(이때, mg/kg = 백만분율) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 9.19 mg/kg의 농도로 옥탄산, 1.86 mg/kg의 농도로 팔미트산, 약 2.12 mg/kg의 농도로 리놀레산, 약 2.13 mg/kg의 농도로 올레산, 및 약 1.01 mg/kg의 농도로 스테롤(이때, mg/kg = 백만분율) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 9.19 mg/kg의 농도로 옥탄산, 1.86 mg/kg의 농도로 팔미트산, 2.12 mg/kg의 농도로 리놀레산, 약 2.13 mg/kg의 농도로 올레산, 및 1.01 mg/kg의 농도로 스테롤(이때, mg/kg = 백만분율)을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 종점을 포함하는 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg의 농도로 옥탄산; 종점을 포함하는 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg의 농도로 팔미트산; 종점을 포함하는 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도로 리놀레산; 종점을 포함하는 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도로 올레산; 및 종점을 포함하는 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 약 64 μmol/kg의 농도로 옥탄산, 약 7 μmol/kg의 농도로 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg의 농도로 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg의 농도로 올레산 및 약 2.5 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 약 63.75 μmol/kg의 농도로 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg의 농도로 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg의 농도로 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg의 농도로 올레산 및 약 2.61 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 확장 조성물은 약 63.75 μmol/kg의 농도로 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg의 농도로 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg의 농도로 리놀레산, 7.56 μmol/kg의 농도로 올레산 및 2.61 μmol/kg의 농도로 스테롤을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캡토에탄올 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 인, 옥탄 지방산, 팔미트 지방산, 리놀레 지방산 및 올레산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 예를 들면, 이스코브(Iscove)의 변형된 둘베코 배지((IMDM); 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)에서 카탈로그 번호 12440053으로서 입수될 수 있음)에서 발견될 수 있는 것보다 10배 더 높은 양의 인을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캡토에탄올, 이스코브의 MDM 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 하기 원소들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 붕소, 나트륨, 마그네슘, 인, 칼륨 및 칼슘. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 상응하는 평균 농도로 존재하는 하기 원소들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 3.7 mg/ℓ의 붕소, 3000 mg/ℓ의 나트륨, 18 mg/ℓ의 마그네슘, 29 mg/ℓ의 인, 15 mg/ℓ의 칼륨 및 4 mg/ℓ의 칼슘.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캡토에탄올 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 하기 성분들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 옥탄산(CAS 번호 124-07-2), 니코틴아미드(CAS 번호 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD)(CAS 번호 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA)(CAS 번호 6938-94-9), n-부틸-벤젠설폰아미드(CAS 번호 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS 번호 84-69-5), 팔미트산(CAS 번호 57-10-3), 리놀레산(CAS 번호 60-33-3), 올레산(CAS 번호 112-80-1), 스테아르산 하이드라자이드(CAS 번호 4130-54-5), 올레아미드(CAS 번호 3322-62-1), 스테롤(예를 들면, 콜레스테롤)(CAS 번호 57-88-5)), 및 알칸(예를 들면, 노나데칸)(CAS 번호 629-92-5). 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 하기 성분들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 옥탄산(CAS 번호 124-07-2), 니코틴아미드(CAS 번호 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD)(CAS 번호 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA)(CAS 번호 6938-94-9), n-부틸-벤젠설폰아미드(CAS 번호 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS 번호 84-69-5), 팔미트산(CAS 번호 57-10-3), 리놀레산(CAS 번호 60-33-3), 올레산(CAS 번호 112-80-1), 스테아르산 하이드라자이드(CAS 번호 4130-54-5), 올레아미드(CAS 번호 3322-62-1), 스테롤(예를 들면, 콜레스테롤)(CAS 번호 57-88-5), 알칸(예를 들면, 노나데칸)(CAS 번호 629-92-5), 및 페놀 레드(CAS 번호 143-74-8). 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 하기 성분들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 옥탄산(CAS 번호 124-07-2), 니코틴아미드(CAS 번호 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD)(CAS 번호 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA)(CAS 번호 6938-94-9), n-부틸-벤젠설폰아미드(CAS 번호 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS 번호 84-69-5), 팔미트산(CAS 번호 57-10-3), 리놀레산(CAS 번호 60-33-3), 올레산(CAS 번호 112-80-1), 스테아르산 하이드라자이드(CAS 번호 4130-54-5), 올레아미드(CAS 번호 3322-62-1), 페놀 레드(CAS 번호 143-74-8) 및 라놀린 알코올.
일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캡토에탄올 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 하기 이온들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 나트륨, 암모늄, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 염화물, 황산염 및 인산염.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캡토에탄올 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 하기 유리 아미노산들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 히스티딘, 아스파라긴, 세린, 글루타메이트, 아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 글루탐산, 쓰레오닌, 알라닌, 프롤린, 시스테인, 라이신, 티로신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 트립토판. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 상응하는 평균 몰 퍼센트로 하기 유리 아미노산들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 히스티딘(약 1%), 아스파라긴(약 0.5%), 세린(약 1.5%), 글루타민(약 67%), 아르기닌(약 1.5%), 글리신(약 1.5%), 아스파르트산(약 1%), 글루탐산(약 2%), 쓰레오닌(약 2%), 알라닌(약 1%), 프롤린(약 1.5%), 시스테인(약 1.5%), 라이신(약 3%), 티로신(약 1.5%), 메티오닌(약 1%), 발린(약 3.5%), 이소류신(약 3%), 류신(약 3.5%), 페닐알라닌(약 1.5%) 및 트립토판(약 0.5%). 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 상응하는 평균 몰 퍼센트로 하기 유리 아미노산들 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다: 히스티딘(약 .78%), 아스파라긴(약 0.4%), 세린(약 1.6%), 글루타민(약 67.01%), 아르기닌(약 1.67%), 글리신(약 1.72%), 아스파르트산(약 1.00%), 글루탐산(약 1.93%), 쓰레오닌(약 2.38%), 알라닌(약 1.11%), 프롤린(약 1.49%), 시스테인(약 1.65%), 라이신(약 2.84%), 티로신(약 1.62%), 메티오닌(약 0.85%), 발린(약 3.45%), 이소류신(약 3.14%), 류신(약 3.3%), 페닐알라닌(약 1.64%) 및 트립토판(약 0.37%).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-머캡토에탄올, 이스코브의 MDM 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 인, 옥탄 지방산, 팔미트 지방산, 리놀레 지방산 및 올레산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배지는 예를 들면, 이스코브의 변형된 둘베코 배지((IMDM); 써모피셔 사이언티픽에서 카탈로그 번호 12440053으로서 입수될 수 있음)에서 발견될 수 있는 것보다 10배 더 높은 양의 인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산 및 스테롤(예를 들면, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 종점을 포함하는 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg의 농도로 옥탄산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 팔미트산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 리놀레산; 종점을 포함하는 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도로 올레산; 및 종점을 포함하는 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 농도로 스테롤(이때, mg/kg = 백만분율) 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 약 9 mg/kg의 농도로 옥탄산, 약 2 mg/kg의 농도로 팔미트산, 약 2 mg/kg의 농도로 리놀레산, 약 2 mg/kg의 농도로 올레산 및 약 1 mg/kg의 농도로 스테롤(이때, mg/kg = 백만분율) 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 9.19 mg/kg의 농도로 옥탄산, 1.86 mg/kg의 농도로 팔미트산, 약 2.12 mg/kg의 농도로 리놀레산, 약 2.13 mg/kg의 농도로 올레산, 및 약 1.01 mg/kg의 농도로 스테롤(이때, mg/kg = 백만분율) 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 9.19 mg/kg의 농도로 옥탄산, 1.86 mg/kg의 농도로 팔미트산, 2.12 mg/kg의 농도로 리놀레산, 약 2.13 mg/kg의 농도로 올레산, 및 1.01 mg/kg의 농도로 스테롤(이때, mg/kg = 백만분율) 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 종점을 포함하는 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg의 농도로 옥탄산; 종점을 포함하는 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg의 농도로 팔미트산; 종점을 포함하는 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도로 리놀레산; 종점을 포함하는 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도로 올레산; 및 종점을 포함하는 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 약 64 μmol/kg의 농도로 옥탄산, 약 7 μmol/kg의 농도로 팔미트산, 약 7.5 μmol/kg의 농도로 리놀레산, 약 7.5 μmol/kg의 농도로 올레산 및 약 2.5 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 약 63.75 μmol/kg의 농도로 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg의 농도로 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg의 농도로 리놀레산, 약 7.56 μmol/kg의 농도로 올레산 및 약 2.61 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용어 "보충된 T 세포 확장 조성물" 또는 "T 세포 확장 조성물"은 약 63.75 μmol/kg의 농도로 옥탄산, 약 7.27 μmol/kg의 농도로 팔미트산, 약 7.57 μmol/kg의 농도로 리놀레산, 7.56 μmol/kg의 농도로 올레산 및 2.61 μmol/kg의 농도로 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지와 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 개시의 변형된 T 세포(예를 들면, 줄기 세포 유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 생성하는 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 변형된 T 세포를 P13K-Akt-mTOR 경로의 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시의 변형된 줄기 세포 유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM을 비롯한 본 개시의 변형된 T 세포는 PI3K 경로의 성분의 하나 이상의 억제제를 포함하는 성장 배지를 사용하는 절차의 방법의 임의의 단계에서 항온처리될 수 있거나, 배양될 수 있거나, 성장될 수 있거나, 저장될 수 있거나 다른 방식으로 조합될 수 있다. PI3K 경로의 성분의 예시적 억제제는 GSK3β의 억제제, 예컨대, TWS119(GSK 3B 억제제 XII로서도 공지되어 있음; 화학식 C18H14N4O2을 가진 CAS 번호 601514-19-6)를 포함하나, 이것으로 제한되지 않는다. PI3K 경로의 성분의 예시적 억제제는 bb007(BLUEBIRDBIO™)을 포함하나, 이것으로 제한되지 않는다. PI3K 경로의 성분의 추가 예시적 억제제는 알로스테릭(allosteric) Akt 억제제 VIII(화합물 번호 10196499를 가진 Akti-1/2로서도 지칭됨), ATP 경쟁 억제제(단백질 키나제 B(Akt)의 ATP 결합 포켓을 표적화하는 오르토스테릭(Orthosteric) 억제제), 이소퀴놀린-5-설폰아미드(H-8, H-89 및 NL-71-101), 아제판(Azepane) 유도체((??)-발라놀로부터 유도된 일련의 구조물), 아미노퓨라잔(GSK690693), 헤테로환형 고리(7-아자인돌, 6-페닐푸린 유도체, 피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체, CCT128930, 3-아미노피롤리딘, 아닐리노트리아졸 유도체, 스피로인돌 유도체, AZD5363, 이파타세르팁(ipatasertib)(GDC-0068, RG7440), A-674563 및 A-443654), 페닐피라졸 유도체(AT7867 및 AT13148), 티오펜카르복스아미드 유도체(아퓨레세르팁(Afuresertib)(GSK2110183), 2-피리미딜-5-아미도티오펜 유도체(DC120), 우프로세르팁(uprosertib)(GSK2141795)), 알로스테릭 억제제(더 큰 특이성, 감소된 부작용 및 더 낮은 독성을 제공하는 오르토스테릭 억제제보다 더 우수함), 2,3-디페닐퀴녹살린 유사체(2,3-디페닐퀴녹살린 유도체, 트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온 유도체(MK-2206)), 알킬인지질(에델포신(Edelfosine)(1-O-옥타데실-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린, ET-18-OCH3) 일모포신(ilmofosine)(BM 41.440), 밀테포신(miltefosine)(헥사데실포스포콜린, HePC), 페리포신(perifosine)(D-21266), 에루실포스포콜린(ErPC), 에루포신(erufosine)(ErPC3, 에루실포스포호모콜린), 인돌-3-카르비놀 유사체(인돌-3-카르비놀, 3-클로로아세틸인돌, 디인돌릴메탄, 디에틸 6-메톡시-5,7-디하이드로인돌로 [2,3-b]카르바졸-2,10-디카르복실레이트(SR13668), OSU-A9), 설폰아미드 유도체(PH-316 및 PHT-427), 티오우레아 유도체(PIT-1, PIT-2, DM-PIT-1, N-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)카르보닐]-N'-(3-브로모페닐)-티오우레아), 푸린 유도체(트리시리빈(Triciribine)(TCN, NSC 154020), 트리시리빈 모노포스페이트 활성 유사체(TCN-P), 4-아미노-피리도[2,3-d]피리미딘 유도체 API-1, 3-페닐-3H-이미다조[4,5-b]피리딘 유도체, ARQ 092), BAY 1125976, 3-메틸-잔틴, 퀴놀린-4-카르복스아미드 및 2-[4-(사이클로헥사-1,3-디엔-1-일)-1H-피라졸-3-일]페놀, 3-옥소-티루칼산, 3α-아세톡시-티루칼산, 3β-아세톡시-티루칼산, 아세톡시-티루칼산, 및 비가역적 억제제(항생제, 락토퀴노마이신(Lactoquinomycin), 프레놀리신(Frenolicin) B, 칼라펀긴(kalafungin), 메데르마이신(medermycin), Boc-Phe-비닐 케톤, 4-하이드록시노네날(4-HNE), 1,6-나프티리디논 유도체 및 이미다조-1,2-피리딘 유도체)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 변형된 T 세포(예를 들면, 줄기 세포 유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 생성하는 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 변형된 T 세포를 T 세포 이펙터 분화의 억제제와 접촉시키는 단계를 포함한다. T 세포 이펙터 분화의 예시적 억제제는 BET 억제제(예를 들면, JQ1, 히에노트리아졸로디아제핀(hienotriazolodiazepine)) 및/또는 BET 패밀리의 단백질(예를 들면, BRD2, BRD3, BRD4 및 BRDT)의 억제제를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 변형된 T 세포(예를 들면, 줄기 세포 유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 생성하는 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 변형된 T 세포를, 핵-세포질 아세틸-CoA를 환원시키는 물질과 접촉시키는 단계를 포함한다. 핵-세포질 아세틸-CoA를 환원시키는 예시적 물질은 2-하이드록시-시트레이트(2-HC)뿐만 아니라, Acss1의 발현을 증가시키는 물질도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 변형된 T 세포(예를 들면, 줄기 세포 유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 생성하는 방법의 일부 실시양태에서, 상기 방법은 변형된 T 세포를, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제를 포함하는 조성물은 발프로산, 페닐부티르산나트륨(NaPB) 또는 이들의 조합을 포함하거나, 발프로산, 페닐부티르산나트륨(NaPB) 또는 이들의 조합으로 구성된다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제를 포함하는 조성물은 발프로산을 포함하거나 발프로산으로 구성된다. 일부 실시양태에서, HDAC 억제제를 포함하는 조성물은 페닐부티르산나트륨(NaPB)을 포함하거나 페닐부티르산나트륨(NaPB)으로 구성된다.
본 개시의 변형된 T 세포(예를 들면, 줄기 세포 유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 생성하는 방법의 일부 실시양태에서, 활성화 보충제는 하나 이상의 사이토카인(들)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 림포카인을 포함하나 이것으로 제한되지 않는 임의의 사이토카인을 포함할 수 있다. 예시적 림포카인은 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-21(IL-21), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 인터페론-감마(INFγ)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 IL-2를 포함할 수 있다.
본 개시의 변형된 T 세포(예를 들면, 줄기 세포 유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 생성하는 방법의 일부 실시양태에서, 활성화 보충제는 하나 이상의 활성화제 복합체를 포함할 수 있다. 예시적 및 비제한적 활성화제 복합체는 CD3, CD28 및 CD2 중 하나 이상에 결합하는 단량체성, 이량체성, 삼량체성 또는 사량체성 항체 복합체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 보충제는 인간, 인간화된 또는 재조합 또는 키메라 항체를 포함하는 활성화제 복합체를 포함하거나 이러한 복합체로 구성된다. 일부 실시양태에서, 활성화 보충제는 CD3 및 CD28에 결합하는 활성화제 복합체를 포함하거나 이러한 복합체로 구성된다. 일부 실시양태에서, 활성화 보충제는 CD3, CD28 및 CD2에 결합하는 활성화제 복합체를 포함하거나 이러한 복합체로 구성된다.
천연 킬러(NK) 세포
일부 실시양태에서, 본 개시의 변형된 면역 또는 면역 전구체 세포는 천연 킬러(NK) 세포이다. 일부 실시양태에서, NK 세포는 림프 조상 세포로부터 분화되는 세포독성 림프구이다.
본 개시의 변형된 NK 세포는 변형된 조혈 줄기 및 조상 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 비활성화된 NK 세포는 CD3-고갈된 백혈구성분채집술(CD14/CD19/CD56+ 세포를 함유함)로부터 유래한다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 론자(Lonza) 4D 뉴클레오펙터 또는 BTX ECM 830(500V, 700 usec 펄스 길이, 0.2 mm 전극 갭, 하나의 펄스)을 이용함으로써 전기천공된다. 모든 론자 4D 뉴클레오펙터 프로그램들이 본 개시의 방법의 범위 내에 있는 것으로서 고려된다.
일부 실시양태에서, 큐벳 내의 100 ㎕ P3 완충제에서 전기천공당 5x10E6개의 세포를 전기천공하였다. 그러나, 부피당 세포의 이 비는 상업적 제조 방법을 위해 확장될 수 있다.
일부 실시양태에서, NK 세포를 추가 세포주와 함께 공-배양함으로써 자극하였다. 일부 실시양태에서, 상기 추가 세포주는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 자극은 전기천공 후 1일째 날, 2일째 날, 3일째 날, 4일째 날, 5일째 날, 6일째 날 또는 7일째 날에 일어난다. 일부 실시양태에서, 자극은 전기천공 후 2일째 날에 일어난다.
일부 실시양태에서, NK 세포는 CD56을 발현한다.
B 세포
일부 실시양태에서, 본 개시의 변형된 면역 또는 면역 전구체 세포는 B 세포이다. B 세포는 세포 표면 상에서 B 세포 수용체를 발현하는 림프구의 일종이다. B 세포 수용체는 특정 항원에 결합한다.
본 개시의 변형된 B 세포는 변형된 조혈 줄기 및 조상 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 방법을 이용하여 HSPC를 변형시킨 후, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일 또는 적어도 7일 동안 인간 IL-3, Flt3L, TPO, SCF 및 G-CSF의 존재 하에서 B 세포 분화를 위해 프라이밍시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 방법을 이용하여 HSPC를 변형시킨 후, 5일 동안 인간 IL-3, Flt3L, TPO, SCF 및 G-CSF의 존재 하에서 B 세포 분화를 위해 프라이밍시킨다.
일부 실시양태에서, 프라이밍 후, 변형된 HSPC 세포를 피더(feeder) 세포의 층으로 옮기고, 주당 1회 새로운 피더 층으로 옮기면서 격주로 영양분을 공급한다. 일부 실시양태에서, 피더 세포는 MS-5 피더 세포이다.
일부 실시양태에서, 변형된 HSPC 세포를 적어도 7일, 14일, 21일, 28일, 30일, 33일, 35일, 42일 또는 48일 동안 MS-5 피더 세포와 함께 배양한다. 일부 실시양태에서, 변형된 HSPC 세포를 33일 동안 MS-5 피더 세포와 함께 배양한다.
전위 시스템
본 개시의 예시적 트랜스포존/트랜스포사제 시스템은 piggyBac 트랜스포존 및 트랜스포사제, 슬립핑 뷰티 트랜스포존 및 트랜스포사제, 헬라이저 트랜스포존 및 트랜스포사제, Tol2 트랜스포존 및 트랜스포사제, 및 TcBuster 트랜스포존 및 트랜스포사제를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
piggyBac 트랜스포사제는 트랜스포존의 말단 상의 트랜스포존 특이적 역위 말단 반복부 서열(ITR)을 인식하고, ITR들 사이의 내용물을 TTAA 염색체 부위로 이동시킨다. piggyBac 트랜스포존 시스템은 ITR들 사이에 포함될 수 있는 관심 있는 유전자에 대한 페이로드(payload) 한계를 갖지 않는다. 일부 실시양태, 구체적으로 트랜스포존이 piggyBac 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac™ 또는 수퍼 piggyBac™(SPB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태, 구체적으로 트랜스포사제가 수퍼 piggyBac™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다. piggyBac(PB) 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00069
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 하기 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다:
Figure pct00070
일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 2개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 3개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 하기 위치 30, 165, 282 및 538 각각에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac™(PB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 288에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 538에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 수퍼 piggyBac™(SPB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 수퍼 piggyBac™(SPB) 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 이때 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이고, 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신 G)의 치환이고, 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이고, 위치 538에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 수퍼 piggyBac™(SPB) 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00071
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 포함하는, 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 수퍼 piggyBac™ 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 포함하는 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 수퍼 piggyBac™ 트랜스포사제는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 3에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 46에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 46에서의 아미노산 치환은 쓰레오닌(T)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 82에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 103에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 119에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 125에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 125에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 177에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 177에서의 아미노산 치환은 히스티딘(H)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 185에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 187에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 200에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 207에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 209에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 226에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 235에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 240에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 241에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 243에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 258에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 티로신(Y)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 311에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 311에서의 아미노산 치환은 발린에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 315에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 319에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 쓰레오닌(T)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 327에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 328에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 340에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 340에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 421에서의 아미노산 치환은 히스티딘(H)에 의한 아스파르트산(D)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 436에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 456에서의 아미노산 치환은 티로신(Y)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 470에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 485에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 503에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 503에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 552에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 570에서의 아미노산 치환은 쓰레오닌(T)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 591에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 글루타민(Q)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 591에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 글루타민(Q)의 치환이다.
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, piggyBac™ 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, 수퍼 piggyBac™ 트랜스포사제 효소는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, piggyBac™ 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, 수퍼 piggyBac™ 트랜스포사제는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한 일부 실시양태에서, piggyBac™ 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, 수퍼 piggyBac™ 트랜스포사제는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 103에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 194에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 372에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 375에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 라이신(K)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 450에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 의한 아스파르트산(D)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 509에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 570에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 일부 실시양태에서, piggyBac™ 트랜스포사제는 서열번호 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환을 포함할 수 있다. piggyBac™ 트랜스포사제가 서열번호 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환을 포함할 수 있는 것인 실시양태를 비롯한 일부 실시양태에서, piggyBac™ 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, piggyBac™ 트랜스포사제는 서열번호 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환, 서열번호 14487의 372에서 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환, 및 서열번호 14487의 위치 375에서 알라닌(A)에 의한 라이신(K)의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, piggyBac™ 트랜스포사제는 서열번호 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환, 서열번호 14487의 위치 372에서 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환, 서열번호 14487의 위치 375에서 알라닌(A)에 의한 라이신(K)의 치환, 및 서열번호 14487의 위치 450에서 아스파라긴(N)에 의한 아스파르트산(D)의 치환을 포함할 수 있다.
슬립핑 뷰티 트랜스포존은 ITR을 인식하고 ITR들 사이의 내용물을 TA 염색체 부위로 이동시키는 슬립핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 표적 게놈 내로 전위된다. 다양한 실시양태에서, SB 트랜스포존 매개 유전자 전달, 또는 다수의 유사한 트랜스포존들 중 임의의 트랜스포존을 사용한 유전자 전달은 본 개시의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
일부 실시양태, 구체적으로 트랜스포존이 슬립핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬립핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬립핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 슬립핑 뷰티 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00072
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 과활성 슬립핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00073
헬라이저 트랜스포존은 헬리트론(Helitron) 트랜스포사제에 의해 전위된다. 헬리트론 트랜스포사제는 약 3000만 년 내지 3600만 년 전에 활성을 나타내었던, 박쥐 게놈으로부터의 고대 요소인 헬라이저 트랜스포존을 이동시킨다. 본 개시의 예시적 헬라이저 트랜스포존은 하기 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 Helibat1를 포함한다:
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
다른 트랜스포사제와 달리, 헬리트론 트랜스포사제는 RNase-H 유사 촉매 도메인을 함유하지 않으나, 그 대신 복제 개시자 도메인(Rep) 및 DNA 헬리카제(helicase) 도메인으로 구성된 RepHel 모티프를 포함한다. Rep 도메인은 핵산분해효소(nuclease)의 HUH 수퍼패밀리의 핵산분해효소 도메인이다.
본 개시의 예시적 헬리트론 트랜스포사제는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00077
헬리트론 전위에서, 트랜스포존의 3' 말단에 가까운 헤어핀은 터미네이터로서 작용한다. 그러나, 이 헤어핀은 트랜스포사제에 의해 우회되어, 플랭킹 서열의 전달을 초래할 수 있다. 추가로, 헬라이저 전위는 공유폐쇄된 원형 중간체를 생성한다. 나아가, 헬리트론 전위는 표적 부위 중복을 결여할 수 있다. 헬라이저 서열에서, 트랜스포사제는 LTS 및 RTS로 지칭되는 5' 말단 서열 및 3' 말단 서열에 의해 플랭킹된다. 이 서열들은 보존된 5'-TC/CTAG-3' 모티프로 종결된다. 헤어핀 종결 구조를 형성하는 잠재력을 가진 19 bp 팔린드로믹(palindromic) 서열은 RTS의 11개 뉴클레오타이드 업스트림에 위치되고 서열 GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG(서열번호 14500)로 구성된다.
Tol2 트랜스포존은 메다카(medaka) 물고기의 게놈으로부터 단리될 수 있거나 유래할 수 있고, hAT 패밀리의 트랜스포존과 유사할 수 있다. 본 개시의 예시적 Tol2 트랜스포존은 약 4.7 킬로염기를 포함하는 서열에 의해 코딩되고, 4개의 엑손들을 함유하는 Tol2 트랜스포사제를 코딩하는 유전자를 함유한다. 본 개시의 예시적 Tol2 트랜스포사제는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00078
역위 반복부, 하위말단 서열 및 Tol2 트랜스포사제를 포함하는, 본 개시의 예시적 Tol2 트랜스포존은 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
본 개시의 예시적 트랜스포존/트랜스포사제 시스템은 piggyBac 및 piggyBac 유사 트랜스포존 및 트랜스포사제를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
piggyBac 및 piggyBac 유사 트랜스포사제는 트랜스포존의 말단 상의 트랜스포존 특이적 역위 말단 반복부 서열(ITR)을 인식하고, ITR들 사이의 내용물을 TTAA 또는 TTAT 염색체 부위로 이동시킨다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 시스템은 ITR들 사이에 포함될 수 있는 관심 있는 유전자에 대한 페이로드 한계를 갖지 않는다.
일부 실시양태, 구체적으로 트랜스포존이 piggyBac 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac™, 수퍼 piggyBac™(SPB) 트랜스포사제이다. 일부 실시양태, 구체적으로 트랜스포사제가 piggyBac™, 수퍼 piggyBac™(SPB)인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00082
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 하기 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다:
Figure pct00083
Figure pct00084
일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 2개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 3개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 하기 위치 30, 165, 282 및 538 각각에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487의 서열의 위치 538에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 수퍼 piggyBac™(SPB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 수퍼 piggyBac™(SPB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487의 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있고, 이때 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이고, 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이고, 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이고, 위치 538에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 수퍼 piggyBac™(SPB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00085
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, piggyBac™, 수퍼 piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한 일부 실시양태에서, piggyBac™, 수퍼 piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 3에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 46에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 46에서의 아미노산 치환은 쓰레오닌(T)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 82에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 103에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 119에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 125에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 125에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 177에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 177에서의 아미노산 치환은 히스티딘(H)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 185에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 187에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 200에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 207에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 209에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 226에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 235에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 240에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 241에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 243에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 258에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 티로신(Y)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 311에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 311에서의 아미노산 치환은 발린에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 315에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 319에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 쓰레오닌(T)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 327에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 328에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 340에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 340에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 421에서의 아미노산 치환은 히스티딘(H)에 의한 아스파르트산(D)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 436에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 456에서의 아미노산 치환은 티로신(Y)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 470에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 류신(L)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 485에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 503에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 503에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 552에서의 아미노산 치환은 라이신(K)에 의한 발린(V)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 570에서의 아미노산 치환은 쓰레오닌(T)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 591에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 글루타민(Q)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 591에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 글루타민(Q)의 치환이다.
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, 수퍼 piggyBac™ 트랜스포사제는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, 수퍼 piggyBac™ 트랜스포사제는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, 수퍼 piggyBac™ 트랜스포사제는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 103에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 194에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 372에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 375에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 라이신(K)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 450에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 의한 아스파르트산(D)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 509에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 세린(S)의 치환이다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 위치 570에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환을 포함할 수 있다. piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제가 서열번호 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환을 포함할 수 있는 것인 실시양태를 비롯한 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487 또는 서열번호 14484의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환, 서열번호 14487의 위치 372에서 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환, 및 서열번호 14487의 위치 375에서 알라닌(A)에 의한 라이신(K)의 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, piggyBac™ 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환, 서열번호 14487의 위치 372에서 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환, 서열번호 14487의 위치 375에서 알라닌(A)에 의한 라이신(K)의 치환, 및 서열번호 14487의 위치 450에서 아스파라긴(N)에 의한 아스파르트산(D)의 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 곤충으로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 곤충은 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(진뱅크 수탁번호 AAA87375; 서열번호 16796), 아르기로그라마 아그나타(Argyrogramma agnata)(진뱅크 수탁번호 GU477713; 서열번호 14534, 서열번호 16797), 아노펠레스 감비아(Anopheles gambiae)(진뱅크 수탁번호 XP_312615(서열번호 16798); 진뱅크 수탁번호 XP_320414(서열번호 16799); 진뱅크 수탁번호 XP_310729(서열번호 16800)), 아피스 고시피이(Aphis gossypii)(진뱅크 수탁번호 GU329918; 서열번호 16801, 서열번호 16802), 아시르토시폰 피숨(Acyrthosiphon pisum)(진뱅크 수탁번호 XP_001948139; 서열번호 16803), 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon)(진뱅크 수탁번호 GU477714; 서열번호 14537, 서열번호 16804), 봄빅스 모리(Bombyx mori)(진뱅크 수탁번호 BAD11135; 서열번호 14505), 칠로 수프레살리스(Chilo suppressalis)(진뱅크 수탁번호 JX294476; 서열번호 16805, 서열번호 16806), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(진뱅크 수탁번호 AAL39784; 서열번호 16807), 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)(진뱅크 수탁번호 ABS18391; 서열번호 14525), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)(진뱅크 수탁번호 ABD76335; 서열번호 16808), 맥둔노기아 크라시시그나(Macdunnoughia crassisigna)(진뱅크 수탁번호 EU287451; 서열번호 16809, 서열번호 16810), 펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella)(진뱅크 수탁번호 GU270322; 서열번호 14530, 서열번호 16811), 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum)(진뱅크 수탁번호 XP_001814566; 서열번호 16812), 크테노플루시아 아그나타(Ctenoplusia agnata)(아르기로그라마 아그나타(Argyrogramma agnata)로서도 지칭됨), 메소르 보우비에리(Messour bouvieri), 메가칠레 로툰다타(Megachile rotundata), 봄부스 임파티엔스(Bombus impatiens), 마메스트라 브라시카(Mamestra brassicae), 메이에티올라 데스럭토르(Mayetiola destructor) 또는 아피스 멜리페라(Apis mellifera)이다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 곤충으로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 곤충은 트리코플루시아 니(AAA87375)이다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 곤충으로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 곤충은 봄빅스 모리(BAD11135)이다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 갑각류로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 갑각류는 다프니아 풀리카리아(Daphnia pulicaria)(AAM76342, 서열번호 16813)이다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 척추동물로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 척추동물은 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis)(진뱅크 수탁번호 BAF82026; 서열번호 14518), 호모 사피엔스(Homo sapiens)(진뱅크 수탁번호 NP_689808; 서열번호 16814), 무스 무스쿨루스(Mus musculus)(진뱅크 수탁번호 NP_741958; 서열번호 16815), 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)(진뱅크 수탁번호 AB179012; 서열번호 16816, 서열번호 16817), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)(진뱅크 수탁번호 XP_220453; 서열번호 16818) 또는 미요티스 루시푸구스(Myotis lucifugus)이다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 미삭동물로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 미삭동물은 시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis)(진뱅크 수탁번호 XP_002123602; 서열번호 16819)이다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 염색체 부위 내의 서열 5'-TTAT-3'(TTAT 표적 서열)에서 트랜스포존을 삽입한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 염색체 부위 내의 서열 5'-TTAA-3'(TTAA 표적 서열)에서 트랜스포존을 삽입한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 표적 서열은 5'-CTAA-3', 5'-TTAG-3', 5'-ATAA-3', 5'-TCAA-3', 5'-AGTT-3', 5'-ATTA-3', 5'-GTTA-3', 5'-TTGA-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTAC-3', 5'-ACTA-3', 5'-AGGG-3', 5'-CTAG-3', 5'-TGAA-3', 5'-AGGT-3', 5'-ATCA-3', 5'-CTCC-3', 5'-TAAA-3', 5'-TCTC-3', 5'-TGAA-3', 5'-AAAT-3', 5'-AATC-3', 5'-ACAA-3', 5'-ACAT-3', 5'-ACTC-3', 5'-AGTG-3', 5'-ATAG-3', 5'-CAAA-3', 5'-CACA-3', 5'-CATA-3', 5'-CCAG-3', 5'-CCCA-3', 5'-CGTA-3', 5'-GTCC-3', 5'-TAAG-3', 5'-TCTA-3', 5'-TGAG-3', 5'-TGTT-3', 5'-TTCA-3', 5'-TTCT-3' 및 5'-TTTT-3'를 포함하거나 이러한 서열로 구성된다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 봄빅스 모리로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00086
piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00087
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 핵 국소화 신호에 융합된다. 일부 실시양태에서, 핵 국소화 신호에 융합된 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00088
Figure pct00089
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 과활성을 나타낸다. 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 그 자신의 기원이 되는 천연 발생 변이체보다 더 높은 활성을 나타내는 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 봄빅스 모리로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14505의 과활성 변이체이다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00090
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14576을 포함한다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00091
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00092
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00093
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00094
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00095
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14505의 트랜스포사제보다 더 높은 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14505와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%, 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일하다.
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 (서열번호 14505에 비해) 92, 93, 96, 97, 165, 178, 189, 196, 200, 201, 211, 215, 235, 238, 246, 253, 258, 261, 263, 271, 303, 321, 324, 330, 373, 389, 399, 402, 403, 404, 448, 473, 484, 507, 523, 527, 528, 543, 549, 550, 557, 601, 605, 607, 609, 610 또는 이들의 조합으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 아미노산 치환 Q92A, V93L, V93M, P96G, F97H, F97C, H165E, H165W, E178S, E178H, C189P, A196G, L200I, A201Q, L211A, W215Y, G219S, Q235Y, Q235G, Q238L, K246I, K253V, M258V, F261L, S263K, C271S, N303R, F321W, F321D, V324K, V324H, A330V, L373C, L373V, V389L, S399N, R402K, T403L, D404Q, D404S, D404M, N441R, G448W, E449A, V469T, C473Q, R484K T507C, G523A, I527M, Y528K Y543I, E549A, K550M, P557S, E601V, E605H, E605W, D607H, S609H, L610I 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 아미노산 치환 Q92A, V93L, V93M, P96G, F97H, F97C, H165E, H165W, E178S, E178H, C189P, A196G, L200I, A201Q, L211A, W215Y, G219S, Q235Y, Q235G, Q238L, K246I, K253V, M258V, F261L, S263K, C271S, N303R, F321W, F321D, V324K, V324H, A330V, L373C, L373V, V389L, S399N, R402K, T403L, D404Q, D404S, D404M, N441R, G448W, E449A, V469T, C473Q, R484K T507C, G523A, I527M, Y528K Y543I, E549A, K550M, P557S, E601V, E605H, E605W, D607H, S609H 및 L610I를 포함한다.
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 야생형이 아닌 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하고, 이때 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 치환은 (서열번호 14505에 비해) 치환 E4X, A12X, M13X, L14X, E15X, D20X, E24X, S25X, S26X, S27X, D32X, H33X, E36X, E44X, E45X, E46X, I48X, D49X, R58X, A62X, N63X, A64X, I65X, I66X, N68X, E69X, D71X, S72X, D76X, P79X, R84X, Q85X, A87X, S88X, Q92X, V93X, S94X, G95X, P96X, F97X, Y98X, T99X, I145X, S149X, D150X, L152X, E154X, T157X, N160X, S161X, S162X, H165X, R166X, T168X, K169X, T170X, A171X, E173X, S175X, S176X, E178X, T179X, M183X, Q184X, T186X, T187X, L188X, C189X, L194X, I195X, A196X, L198X, L200X, A201X, L203X, I204X, K205X, A206X, N207X, Q209X, S210X, L211X, K212X, D213X, L214X, W215X, R216X, T217X, G219X, V222X, D223X, I224X, T227X, M229X, Q235X, L237X, Q238X, N239X, N240X, P302X, N303X, P305X, A306X, K307X, Y308X, I310X, K311X, I312X, L313X, A314X, L315X, V316X, D317X, A318X, K319X, N320X, F321X, Y322X, V323X, V324X, L326X, E327X, V328X, A330X, Q333X, P334X, S335X, G336X, P337X, A339X, V340X, S341X, N342X, R343X, P344X, F345X, E346X, V347X, E349X, I352X, Q353X, V355X, A356X, R357X, N361X, D365X, W367X, T369X, G370X, L373X, M374X, L375X, H376X, N379X, E380X, R382X, V386X, V389X, N392X, R394X, Q395X, S399X, F400X, I401X, R402XT403X, D404X, R405X, Q406X, P407X, N408X, S409X, S410X, V411X, F412X, F414X, Q415X, I418X, T419X, L420X, N428XV432X, M434X, D440X, N441X, S442X, I443X, D444X, E445X, G448X, E449X, Q451X, K452X, M455X, I456X, T457X, F458X, S461X, A464X, V466X, Q468X, V469X, E471X, L472X, C473X, A474X, K483X, W485X, T488X, L489X, Y491X, G492X, V493X, M496X, I499X, C502X, I503X, T507X, K509X, N510X, V511X, T512X, I513X, R515X, E517X, S521X, G523X, L524X, S525X, I527X, Y528X, E529X, H532X, S533X, N535X, K536X, K537X, N539X, I540X, T542X, Y543X, Q546X, E549X, K550X, Q551X, G553X, E554X, P555X, S556X, P557X, R558X, H559X, V560X, N561X, V562X, P563X, G564X, R565X, Y566X, V567X, Q570X, D571X, P573X, Y574X, K576X, K581X, S583X, A586X, A588X, E594X, F598X, L599X, E601X, N602X, C603X, A604X, E605X, L606X, D607X, S608X, S609X 또는 L610X를 포함한다. 과활성 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에서 확인될 수 있고, 이 특허의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 통합 결핍 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 그의 상응하는 트랜스포존을 절제할 수 있으나, 절제된 트랜스포존을 상응하는 야생형 트랜스포사제보다 더 낮은 빈도로 통합시키는 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14505의 통합 결핍 변이체이다.
일부 실시양태에서, 절제 능력을 가진 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 야생형이 아닌 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하고, 이때 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 치환은 (서열번호 14505에 비해) 치환 R9X, A12X, M13X, D20X, Y21K, D23X, E24X, S25X, S26X, S27X, E28X, E30X, D32X, H33X, E36X, H37X, A39X, Y41X, D42X, T43X, E44X, E45X, E46X, R47X, D49X, S50X, S55X, A62X, N63X, A64X, I66X, A67X, N68X, E69X, D70X, D71X, S72X, D73X, P74X, D75X, D76X, D77X, I78X, S81X, V83X, R84X, Q85X, A87X, S88X, A89X, S90X, R91X, Q92X, V93X, S94X, G95X, P96X, F97X, Y98X, T99X, W012X, G103X, Y107X, K108X, L117X, I122X, Q128X, I312X, D135X, S137X, E139X, Y140X, I145X, S149X, D150X, Q153X, E154X, T157X, S161X, S162X, R164X, H165X, R166X, Q167X, T168X, K169X, T170X, A171X, A172X, E173X, R174X, S175X, S176X, A177X, E178X, T179X, S180X, Y182X, Q184X, E185X, T187X, L188X, C189X, L194X, I195X, A196X, L198X, L200X, A201X, L203X, I204X, K205X, N207X, Q209X, L211X, D213X, L214X, W215X, R216X, T217X, G219X, T220X, V222X, D223X, I224X, T227X, T228X, F234X, Q235X, L237X, Q238X, N239X, N240X, N303X, K304X, I310X, I312X, L313X, A314X, L315X, V316X, D317X, A318X, K319X, N320X, F321X, Y322X, V323X, V324X, N325X, L326X, E327X, V328X, A330X, G331X, K332X, Q333X, S335X, P337X, P344X, F345X, E349X, H359X, N361X, V362X, D365X, F368X, Y371X, E372X, L373X, H376X, E380X, R382X, R382X, V386X, G387X, T388X, V389X, K391X, N392X, R394X, Q395X, E398X, S399X, F400X, I401X, R402XT403X, D404X, R405X, Q406X, P407X, N408X, S409X, S410X, Q415X, K416X, A424X, K426X, N428X, V430X, V432X, V433X, M434X, D436X, D440X, N441X, S442X, I443X, D444X, E445X, S446X, T447X, G448X, E449X, K450X, Q451X, E454X, M455X, I456X, T457X, F458X, S461X, A464X, V466X, Q468X, V469X, C473X, A474X, N475X, N477X, K483X, R484X, P486X, T488X, L489X, G492X, V493X, M496X, I499X, I503X, Y505X, T507X, N510X, V511X, T512X, I513X, K514X, T516X, E517X, S521X, G523X, L524X, S525X, I527X, Y528X, L531X, H532X, S533X, N535X, I540X, T542X, Y543X, R545X, Q546X, E549X, L552X, G553X, E554X, P555X, S556X, P557X, R558X, H559X, V560X, N561X, V562X, P563X, G564X, V567X, Q570X, D571X, P573X, Y574X, K575X, K576X, N585X, A586X, M593X, K596X, E601X, N602X, A604X, E605X, L606X, D607X, S608X, S609X 또는 L610X를 포함한다. 통합 결핍 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에서 확인될 수 있고, 이 특허의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00096
일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00097
일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00098
일부 실시양태에서, 통합 결핍 트랜스포사제는 서열번호 14608과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 봄빅스 모리로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00099
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00100
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00101
일부 실시양태에서, piggyBac™(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00102
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14506에 상응하는 5' 서열 및 서열번호 14507에 상응하는 3' 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 말단은 서열번호 14506과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일하고, 다른 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 말단은 서열번호 14507과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일하다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14506 및 서열번호 14507 또는 서열번호 14509를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14508 및 서열번호 14507 또는 서열번호 14509를 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 트랜스포존 말단과 3' 트랜스포존 말단은 양 말단들에서 배향이 역위된 5'-TTAT-3 표적 삽입 부위에 바로 인접한 CCCGGCGAGCATGAGG(서열번호 14510)의 16 bp 반복부 서열을 그들의 말단에서 공유한다. 일부 실시양태에서, 5' 트랜스포존 말단은 5'-TTATCCCGGCGAGCATGAGG-3'(서열번호 14511)을 포함하는 서열로 시작되고, 3' 트랜스포존은 이 서열의 역 상보체인 5'-CCTCATGCTCGCCGGGTTAT-3'(서열번호 14512)를 포함하는 서열로 종결된다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14506 또는 서열번호 14508의 적어도 14개, 16개, 18개, 20개, 30개 또는 40개의 연속(인접) 뉴클레오타이드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14507 또는 서열번호 14509의 적어도 14개, 16개, 18개, 20개, 30개 또는 40개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14506 또는 서열번호 14508과 적어도 90% 동일한 한 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14507 또는 서열번호 14509와 적어도 90% 동일한 한 말단을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00103
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00104
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 CCCGGCGAGCATGAGG(서열번호 14510)을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14510의 ITR 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 TTATCCCGGCGAGCATGAGG(서열번호 14511)을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14511로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 CCTCATGCTCGCCGGGTTAT(서열번호 14512)를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14512로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14511로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 한 말단, 및 서열번호 14512로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14511 및 서열번호 14512를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 TTAACCCGGCGAGCATGAGG(서열번호 14513)을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 CCTCATGCTCGCCGGGTTAA(서열번호 14514)를 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14506 및 서열번호 14507을 포함하는 말단들, 또는 서열번호 14506 또는 서열번호 14507과 적어도 90% 서열 동일성을 가진, 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 변이체를 가질 수 있고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14504 또는 서열번호 14505의 서열, 또는 서열번호 14504 또는 서열번호 14505와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 한 쌍의 역위 반복부들 사이에 삽입된 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 이때 트랜스포존은 서열번호 14504 또는 서열번호 14505와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제에 의해 전위될 수 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 트랜스포존 말단들을 포함하고, 이 말단들 각각은 2개의 트랜스포존 말단들에서 역위 배향으로 서열번호 14510을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 역위된 말단 반복부(ITR)는 서열번호 14510과 적어도 90% 동일하다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 표적 핵산 내의 서열 5'-TTAT-3'에서 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제에 의해 삽입될 수 있다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 말단은 서열번호 14506으로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 서열번호 14507로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 말단은 서열번호 14506으로부터의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개, 적어도 30개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 서열번호 14507로부터의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개, 적어도 30개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14506 및 서열번호 14507에 상응하는 트랜스포존 말단들(각각의 말단은 ITR을 포함함)을 포함하고, 5'-TTAT-3'에 상응하는 표적 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 트랜스포사제(예를 들면, 서열번호 14505)를 코딩하는 서열도 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14506에 상응하는 한 트랜스포존 말단, 및 서열번호 14516에 상응하는 제2 트랜스포존 말단을 포함한다. 서열번호 14516은 서열번호 14507과 매우 유사하나, ITR 바로 앞에 큰 삽입을 가진다. 2개의 트랜스포존 말단들에 대한 ITR 서열들이 동일할지라도(이들은 둘 다 서열번호 14510과 동일함), 이들은 상이한 표적 서열을 가진다: 제2 트랜스포존은 5'-TTAA-3'에 상응하는 표적 서열을 가짐으로써, ITR 서열의 변화 부재가 표적 서열 특이성을 변형시키는 데 필요하다는 증거를 제공한다. 5'-TTAA-3' 표적 부위와 관련된 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제(서열번호 14504)는 4개의 아미노산 변화(D322Y, S473C, A507T, H582R)에 의해서만 5'-TTAT-3' 관련 트랜스포사제(서열번호 14505)와 상이하다. 일부 실시양태에서, 5'-TTAA-3' 표적 부위와 관련된 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제(서열번호 14504)는 5'-TTAT-3' 말단을 가진 트랜스포존에 대해 5'-TTAT-3' 관련 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제(서열번호 14505)보다 더 낮은 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 5'-TTAA-3' 표적 부위를 가진 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 5'-TTAA-3' 표적 부위를 5'-TTAT-3'로 대체함으로써 5'-TTAT-3' 표적 부위를 가진 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제로 전환될 수 있다. 이러한 트랜스포존은 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제, 예컨대, 5'-TTAT-3' 표적 서열을 인식하는 서열번호 14504, 또는 5'-TTAA-3' 트랜스포존과 원래 관련된 트랜스포사제의 변이체와 함께 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5'-TTAA-3' piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제와 5'-TTAT-3' piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제 사이의 높은 유사성은 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제의 아미노산 서열에 대한 매우 적은 변화가 표적 서열 특이성을 변경시킨다는 것을 입증한다. 일부 실시양태에서, 임의의 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존-트랜스포사제 유전자 전달 시스템의 변형에서, 5'-TTAA-3' 표적 서열은 5'-TTAT-3' 표적 서열로 대체되고, ITR은 동일하게 유지되고, 트랜스포사제는 원래의 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제, 또는 돌연변이를 트랜스포사제 내로 도입하기 위한 저수준 돌연변이유발의 이용으로부터 비롯된 이의 변이체이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 트랜스포사제 전달 시스템은 5'-TTAT-3' 활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존-트랜스포사제 유전자 전달 시스템의 변형에 의해 형성될 수 있고, 이때 5'-TTAT-3' 표적 서열은 5'-TTAA-3' 표적 서열로 대체되고, ITR은 동일하게 유지되고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 원래의 트랜스포사제 또는 이의 변이체이다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 봄빅스 모리로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00105
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00106
일부 실시양태에서, 트랜스포존은 서열번호 14577로부터의 적어도 16개의 연속 염기들 및 서열번호 14578로부터의 적어도 16개의 연속 염기들, 및 CCCGGCGAGCATGAGG(서열번호 14510)과 적어도 87% 동일한 역위 말단 반복부를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00107
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00108
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14595 및 서열번호 14596을 포함하고, 서열번호 14505의 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제에 의해 전위된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14595 및 서열번호 14596의 ITR은 5'-TTAA-3' 서열에 의해 플랭킹되지 않는다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14595 및 서열번호 14596의 ITR은 5'-TTAT-3' 서열에 의해 플랭킹된다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00109
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00110
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00111
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 5' 말단은 서열번호 14577, 서열번호 14595, 서열번호 14597, 서열번호 14598 또는 서열번호 14599의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 5' 말단 앞에 5' 표적 서열이 있다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00112
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00113
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00114
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 3' 말단은 서열번호 14578, 서열번호 14596, 서열번호 14600 또는 14601의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 3' 말단은 3' 표적 서열 앞에 있다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 서열번호 14505의 트랜스포사제에 의해 전위된다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 5' 말단과 3' 말단은 역위 배향으로 표적 서열에 바로 인접한 서열번호 14510의 16 bp 반복부 서열을 공유한다. 일부 실시양태에서, 5' 트랜스포존 말단은 서열번호 14510으로 시작되고, 3' 트랜스포존 말단은 서열번호 14510의 역 상보체인 5'- CCTCATGCTCGCCGGG-3'(서열번호 14603)으로 종결된다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14510 또는 서열번호 14603과 적어도 93%, 적어도 87% 또는 적어도 81%, 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 표적 서열 다음에 서열번호 14577, 14595 또는 14597로부터 선택된 서열을 포함하는 5' 트랜스포존 말단, 및 서열번호 14578 또는 14596을 포함하는 3' 트랜스포존 말단을 포함하고, 그 다음에 표적 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14577과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%, 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 서열을 포함하는 한 말단, 및 서열번호 14578과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%, 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 서열을 포함하는 한 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14577로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개의 연속 염기를 포함하고, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14578로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개의 연속 염기를 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 2개의 트랜스포존 말단들을 포함하고, 이때 각각의 트랜스포존 말단은 상기 2개의 트랜스포존 말단들에서 역위 배향으로 서열번호 14510과 적어도 81% 동일하거나, 적어도 87% 동일하거나, 적어도 93% 동일하거나, 임의의 중간치 퍼센트 동일한 서열을 포함한다. 한 말단은 서열번호 14599로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개의 연속 염기를 추가로 포함할 수 있고, 다른 말단은 서열번호 14601로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개의 연속 염기를 추가로 포함할 수 있다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14505의 트랜스포사제에 의해 전위될 수 있고, 트랜스포사제는 임의적으로 핵 국소화 신호에 융합될 수 있다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14595 및 서열번호 14596을 포함하고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14504 또는 서열번호 14505를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14597 및 서열번호 14596을 포함하고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14504 또는 서열번호 14505를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14595 및 서열번호 14578을 포함하고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14504 또는 서열번호 14505를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14602 및 서열번호 14600을 포함하고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14504 또는 서열번호 14505를 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 ATGAGGCAGGGTAT(서열번호 14614), ATACCCTGCCTCAT(서열번호 14615), GGCAGGGTAT(서열번호 14616), ATACCCTGCC(서열번호 14617), TAAAATTTTA(서열번호 14618), ATTTTATAAAAT(서열번호 14619), TCATACCCTG(서열번호 14620) 및 TAAATAATAATAA(서열번호 14621)로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 서열을 포함하는 5' 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14617, 서열번호 14620 및 서열번호 14621로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 서열을 포함하는 3' 말단을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis)로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00115
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14517의 과활성 변이체이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14517의 통합 결핍 변이체이다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00116
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 제노푸스 트로피칼리스로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00117
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 그 자신의 기원이 되는 천연 발생 변이체보다 더 높은 활성을 나타내는 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14517의 트랜스포사제보다 더 높은 활성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00118
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00119
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00120
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00121
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00122
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00123
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 (서열번호 14517에 비해) 아미노산 6, 7, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 31, 34, 67, 73, 76, 77, 88, 91, 141, 145, 146, 148, 150, 157, 162, 179, 182, 189, 192, 193, 196, 198, 200, 210, 212, 218, 248, 263, 270, 294, 297, 308, 310, 333, 336, 354, 357, 358, 359, 377, 423, 426, 428, 438, 447, 450, 462, 469, 472, 498, 502, 517, 520, 523, 533, 534, 576, 577, 582, 583 또는 587로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 (서열번호 14517에 비해) 아미노산 치환 Y6C, S7G, M16S, S19G, S20Q, S20G, S20D, E21D, E22Q, F23T, F23P, S24Y, S26V, S28Q, V31K, A34E, L67A, G73H, A76V, D77N, P88A, N91D, Yl41Q, Y141A, N145E, N145V, P146T, P146V, P146K, P148T, P148H, Y150G, Y150S, Y150C, H157Y, A162C, A179K, L182I, L182V, T189G, L192H, S193N, S193K, V196I, S198G, T200W, L210H, F212N, N218E, A248N, L263M, Q270L, S294T, T297M, S308R, L310R, L333M, Q336M, A354H, C357V, L358F, D359N, L377I, V423H, P426K, K428R, S438A, T447G, T447A, L450V, A462H, A462Q, I469V, I472L, Q498M, L502V, E5171, P520D, P520G, N523S, I533E, D534A, F576R, F576E, K577I, I582R, Y583F, L587Y 또는 L587W, 또는 이 돌연변이들 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 전부를 포함하는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 야생형이 아닌 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하고, 이때 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 치환은 (서열번호 14517에 비해) 치환 A2X, K3X, R4X, F5X, Y6X, S7X, A11X, A13X, C15X, M16X, A17X, S18X, S19X, S20X, E21X, E22X, F23X, S24X, G25X, 26X, D27X, S28X, E29X, E42X, E43X, S44X, C46X, S47X, S48X, S49X, T50X, V51X, S52X, A53X, L54X, E55X, E56X, P57X, M58X, E59X, E62X, D63X, V64X, D65X, D66X, L67X, E68X, D69X, Q70X, E71X, A72X, G73X, D74X, R75X, A76X, D77X, A78X, A79X, A80X, G81X, G82X, E83X, P84X, A85X, W86X, G87X, P88X, P89X, C90X, N91X, F92X, P93X, E95X, I96X, P97X, P98X, F99X, T100X, T101X, P103X, G104X, V105X, K106X, V107X, D108X, T109X, N111X, P114X, I115X, N116X, F117X, F118X, Q119X, M122X, T123X, E124X, A125X, I126X, L127X, Q128X, D129X, M130X, L132X, Y133X, V126X, Y127X, A138X, E139X, Q140X, Y141X, L142X, Q144X, N145X, P146X, L147X, P148X, Y150X, A151X, A155X, H157X, P158X , I161X, A162X, V168X, T171X, L172X, A173X, M174X, I177X, A179X, L182X, D187X, T188X, T189X, T190X, L192X, S193X, I194X, P195X, V196X, S198X, A199X, T200X, S202X, L208X, L209X, L210X, R211X, F212X, F215X, N217X, N218X, A219X, T220X, A221X, V222X, P224X, D225X, Q226X, P227X, H229X, R231X, H233X, L235X, P237X, I239X, D240X, L242X, S243X, E244X, R244X, F246X, A247X, A248X, V249X, Y250X, T251X, P252X, C253X, Q254X, I256X, C257X, I258X, D259X, E260X, S261X, L262X, L263X, L264X, F265X, K266X, G267X, R268X, L269X, Q270X, F271X, R272X, Q273X, Y274X, I275X, P276X, S277X, K278X, R279X, A280X, R281X, Y282X, G283X, I284X, K285X, F286X, Y287X, K288X, L289X, C290X, E291X, S292X, S293XS294X, G295X, Y296X, T297X, S298X, Y299X, F300X, E304X, L310X, P313X, G314X, P316X, P317X, D318X, L319X, T320X, V321X, K324X, E328X, I330X, S331X, P332X, L333X, L334X, G335X, Q336X, F338X, L340X, D343X, N344X, F345X, Y346X, S347X, L351X, F352X, A354X, L355X, Y356X, C357X, L358X, D359X, T360X, R422X, Y423X, G424X, P426X, K428X, N429X, K430X, P431X, L432X, S434X, K435X, E436X, S438X, K439X, Y440X, G443X, R446X, T447X, L450X, Q451X, N455X, T460X, R461X, A462X, K465X, V467X, G468X, I469X, Y470X, L471X, I472X, M474X, A475X, L476X, R477X, S479X, Y480X, V482XY483X, K484X, A485X, A486X, V487X, P488X, P490X, K491X, S493X, Y494X, Y495X, K496X, Y497T, Q498X, L499X, Q500X, I501X, L502X, P503X, A504X, L505X, L506X, F507X, G508X, G509X, V510X, E511X, E512X, Q513X, T514X, V515X, E517X, M518X, P519X, P520X, S521X, D522X, N523X, V524X, A525X, L527X, I528X, K530X, H531X, F532X, I533X, D534X, T535X, L536X, T539X, P540X, Q546X, K550X, R553X, K554X, R555X, G556X, I557X, R558X, R559X, D560X, T561X, Y564X, P566X, K567X, P569X, R570X, N571X, L574X, C575X, F576X, K577X, P578X, F580X, E581X, I582X, Y583X, T585X, Q586X, L587X, H588X 또는 Y589X를 포함한다. 과활성 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에서 확인될 수 있고, 이 특허의 내용은 전체적으로 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 통합 결핍 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 그의 상응하는 트랜스포존을 절제할 수 있으나, 절제된 트랜스포존을 상응하는 천연 발생 트랜스포사제보다 더 낮은 빈도로 통합시키는 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14517의 통합 결핍 변이체이다. 일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14517에 비해 결핍되어 있다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 절제에 대한 활성을 나타내나, 통합 결핍 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00124
일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00125
일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00126
Figure pct00127
일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14611을 포함한다. 일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00128
일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14612를 포함한다. 일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00129
일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14613을 포함한다. 일부 실시양태에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 아미노산 치환을 포함하고, 이때 위치 218의 Asn은 (서열번호 14517에 비해) Glu 또는 Asp로 대체된다(N218D 또는 N218E).
일부 실시양태에서, 절제 능력을 가진 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 야생형이 아닌 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하고, 이때 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 치환은 (서열번호 14517에 비해) 치환 A2X, K3X, R4X, F5X, Y6X, S7X, A8X, E9X, E10X, A11X, A12X, A13X, H14X, C15X, M16X, A17X, S18X, S19X, S20X, E21X, E22X, F23X, S24X, G25X, 26X, D27X, S28X, E29X, V31X, P32X, P33X, A34X, S35X, E36X, S37X, D38X, S39X, S40X, T41X, E42X, E43X, S44X, W45X, C46X, S47X, S48X, S49X, T50X, V51X, S52X, A53X, L54X, E55X, E56X, P57X, M58X, E59X, V60X, M122X, T123X, E124X, A125X, L127X, Q128X, D129X, L132X, Y133X, V126X, Y127X, E139X, Q140X, Y141X, L142X, T143X, Q144X, N145X, P146X, L147X, P148X, R149X, Y150X, A151X, H154X, H157X, P158X, T159X, D160X, I161X, A162X, E163X, M164X, K165X, R166X, F167X, V168X, G169X, L170X, T171X, L172X, A173X, M174X, G175X, L176X, I177X, K178X, A179X, N180X, S181X, L182X, S184X, Y185X, D187X, T188X, T189X, T190X, V191X, L192X, S193X, I194X, P195X, V196X, F197X, S198X, A199X, T200X, M201X, S202X, R203X, N204X, R205X, Y206X, Q207X, L208X, L209X, L210X, R211X, F212X, L213X, H241X, F215X, N216X, N217X, N218X, A219X, T220X, A221X, V222X, P223X, P224X, D225X, Q226X, P227X, G228X, H229X, D230X, R231X, H233X, K234X, L235X, R236X, L238X, I239X, D240X, L242X, S243X, E244X, R244X, F246X, A247X, A248X, V249X, Y250X, T251X, P252X, C253X, Q254X, N255X, I256X, C257X, I258X, D259X, E260X, S261X, L262X, L263X, L264X, F265X, K266X, G267X, R268X, L269X, Q270X, F271X, R272X, Q273X, Y274X, I275X, P276X, S277X, K278X, R279X, A280X, R281X, Y282X, G283X, I284X, K285X, F286X, Y287X, K288X, L289X, C290X, E291X, S292X, S293X, S294X, G295X, Y296X, T297X, S298X, Y299X, F300X, I302X, E304X, G305X, K306X, D307X, S308X, K309X, L310X, D311X, P312X, P313X, G314X, C315X, P316X, P317X, D318X, L319X, T320X, V321X, S322X, G323X, K324X, I325X, V326X, W327X, E328X, L329X, I330X, S331X, P332X, L333X, L334X, G335X, Q336X, F338X, H339X, L340X, V342X, N344X, F345X, Y346X, S347X, S348X, I349X, L351X, T353X, A354X, Y356X, C357X, L358X, D359X, T360X, P361X, A362X, C363X, G364X, I366X, N367X, R368X, D369X, K371X, G372X, L373X, R375X, A376X, L377X, L378X, D379X, K380X, K381X, L382X, N383X, R384XG385X, T387X, Y388X, A389X, L390X, K392X, N393X, E394X, A397X, K399X, F400X, F401X, D402X, N405X, L406X, L409X, R422X, Y423X, G424X, E425X, P426X, K428X, N429X, K430X, P431X, L432X, S434X, K435X, E436X, S438X, K439X, Y440X, G442X, G443X, V444X, R446X, T447X, L450X, Q451X, H452X, N455X, T457X, R458X, T460X, R461X, A462X, Y464X, K465X, V467X, G468X, I469X, L471X, I472X, Q473X, M474X, L476X, R477X, N478X, S479X, Y480X, V482XY483X, K484X, A485X, A486X, V487X, P488X, G489X, P490X, K491X, L492X, S493X, Y494X, Y495X, K496X, Q498X, L499X, Q500X, I501X, L502X, P503X, A504X, L505X, L506X, F507X, G508X, G509X, V510X, E511X, E512X, Q513X, T514X, V515X, E517X, M518X, P519X, P520X, S521X, D522X, N523X, V524X, A525X, L527X, I528X, G529X, K530X, F532X, I533X, D534X, T535X, L536X, P537X, P538X, T539X, P540X, G541X, F542X, Q543X, R544X, P545X, Q546X, K547X, G548X, C549X, K550X, V551X, C552X, R553X, K554X, R555X, G556X, I557X, R558X, R559X, D560X, T561X, R562X, Y563X, Y564X, C565X, P566X, K567X, C568X, P569X, R570X, N571X, P572X, G573X, L574X, C575X, F576X, K577X, P578X, C579X, F580X, E581X, I582X, Y583X, H584X, T585X, Q586X, L587X, H588X 또는 Y589X를 포함한다. 절제 능력을 가진 통합 결핍 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에서 확인될 수 있고, 이의 내용은 전체적으로 참고로 포함된다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 핵 국소화 신호에 융합된다. 일부 실시양태에서, 서열번호 14517 또는 서열번호 14518은 핵 국소화 신호에 융합된다. 일부 실시양태에서, 핵 국소화 신호에 융합된 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00130
Figure pct00131
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 제노푸스 트로피칼리스로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00132
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00133
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14519 및 서열번호 14520을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00134
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00135
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00136
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14520 및 서열번호 14519, 서열번호 14521 또는 서열번호 14523을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14522 및 서열번호 14519, 서열번호 14521 또는 서열번호 14523을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14519, 서열번호 14521 또는 서열번호 14523으로부터의 적어도 14개, 16개, 18개, 20개, 30개 또는 40개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14520 또는 서열번호 14522로부터의 적어도 14개, 16개, 18개, 20개, 30개 또는 40개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14519, 서열번호 14521 또는 서열번호 14523과 적어도 90% 동일한 한 말단을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14520 또는 서열번호 14522와 적어도 90% 동일한 한 말단을 포함한다. 한 실시양태에서, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14519와 적어도 90% 동일하고, 다른 트랜스포존 말단은 서열번호 14520과 적어도 90% 동일하다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 TTAACCTTTTTACTGCCA(서열번호 14524)를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 TTAACCCTTTGCCTGCCA(서열번호 14526)을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 TTAACCYTTTTACTGCCA(서열번호 14527)을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 TGGCAGTAAAAGGGTTAA(서열번호 14529)를 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 TGGCAGTGAAAGGGTTAA(서열번호 14531)을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열 TTAACCYTTTKMCTGCCA(서열번호 14533)을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 말단은 서열번호 14524, 서열번호 14526 및 서열번호 14527로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac™(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 말단은 서열번호 14529 및 서열번호 14531로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 각각의 역위 말단 반복부는 ITR 서열 CCYTTTKMCTGCCA(서열번호 14563)의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac™(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 각각의 말단은 역위 배향으로 서열번호 14563을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 ITR은 서열번호 14524, 서열번호 14526 및 서열번호 14527로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 ITR은 서열번호 14529 및 서열번호 14531로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 2개의 트랜스포존 말단들에서 역위 배향으로 서열번호 14533을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14519 및 서열번호 14520을 포함하는 말단들, 또는 서열번호 14519 또는 서열번호 14520과 적어도 90% 서열 동일성을 가진, 이들 중 하나 또는 둘 다의 변이체를 가질 수 있고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14517의 서열, 또는 서열번호 14517 또는 서열번호 14518과 적어도 %, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 서열 동일성을 보이는 변이체를 가진다. 일부 실시양태에서, 한 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 말단은 서열번호 14519, 서열번호 14521 또는 서열번호 14523으로부터의 적어도 14개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 서열번호 14520 또는 서열번호 14522로부터의 적어도 14개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14519, 서열번호 14521 또는 서열번호 14523으로부터의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개 또는 적어도 30개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 서열번호 14520 또는 서열번호 14522로부터의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개 또는 적어도 30개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14519에 상응하는 5' 서열 및 서열번호 14520에 상응하는 3' 서열을 가진 트랜스포존 말단을 인식한다. 상기 트랜스포사제는 한 트랜스포존 말단의 5' 말단에 있는 5'-TTAA-3' 서열 및 제2 트랜스포존 말단의 3' 말단에 있는 5'-TTAA-3'에서 DNA를 절단함으로써, 이들 사이에 배치된 임의의 이종 DNA를 포함하는 트랜스포존을 한 DNA 분자로부터 절제할 것이고, 절제된 서열을 제2 DNA 분자 내로 삽입할 것이다. 일부 실시양태에서, 5' 트랜스포존 말단 및 3' 트랜스포존 말단의 단축형 버전 및 변형된 버전도 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제에 의해 전위될 수 있는 트랜스포존의 부분으로서 작용할 것이다. 예를 들면, 5' 트랜스포존 말단은 서열번호 14521 또는 서열번호 14523에 상응하는 서열로 대체될 수 있고, 3' 트랜스포존 말단은 서열번호 14522에 상응하는 더 짧은 서열로 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, 5' 트랜스포존 말단과 3' 트랜스포존 말단은 5'-TTAA-3' 삽입 부위를 포함하는 거의 완벽히 반복된 18 bp 서열(5'-TTAACCYTTTKMCTGCCA: 서열번호 14533)을 그들의 말단에서 공유하고, 이 서열의 배향은 상기 양 말단에서 역위되어 있다. 즉, 서열번호 14519 및 서열번호 14523에서 5' 트랜스포존 말단은 서열 5'-TTAACCTTTTTACTGCCA-3'(서열번호 14524)로 시작되거나, 서열번호 14521에서 5' 트랜스포존 말단은 서열 5'-TTAACCCTTTGCCTGCCA-3'(서열번호 14526)로 시작되고; 3' 트랜스포존 말단은 이 서열의 대략 역 상보체로 종결된다: 서열번호 14520에서 3' 트랜스포존 말단은 5'-TGGCAGTAAAAGGGTTAA-3'(서열번호 14529)로 종결되고, 서열번호 14522에서 3' 트랜스포존 말단은 5'-TGGCAGTGAAAGGGTTAA-3'(서열번호 14531)로 종결된다. 본 발명의 한 실시양태는 2개의 트랜스포존 말단들에서 역위 배향으로 서열번호 14533을 각각 포함하는 2개의 트랜스포존 말단들 사이에 삽입된 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14524, 서열번호 14526 및 서열번호 14527로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14529 및 서열번호 14531로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac™(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 제노푸스 트로피칼리스로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00137
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00138
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14573 또는 서열번호 14574로부터의 적어도 16개의 연속 염기들, 및 역위 말단 반복부인 CCYTTTBMCTGCCA(서열번호 14575)를 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00139
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00140
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00141
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00142
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00143
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00144
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00145
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00146
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14573 및 서열번호 14579 내지 14585로부터 선택된 5' 트랜스포존 말단 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 트랜스포존 말단 서열 앞에 5' 표적 서열이 있다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00147
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00148
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00149
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00150
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14574 및 서열번호 14587 내지 14590으로부터 선택된 3' 트랜스포존 말단 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' 트랜스포존 말단 서열 다음에 3' 표적 서열이 있다. 일부 실시양태에서, 5' 트랜스포존 말단과 3' 트랜스포존 말단은 표적 서열에 인접한 양 말단들에서 배향이 역위된 14 반복부 서열(서열번호 14575)을 공유한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 표적 서열 및 서열번호 14582 내지 14584 및 14573으로부터 선택된 서열을 포함하는 5' 트랜스포존 말단, 및 서열번호 14588 내지 14590 및 14574로부터 선택된 서열 다음에 3' 표적 서열을 포함하는 3' 트랜스포존 말단을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 5' 트랜스포존 말단은 하기 서열 및 ITR을 포함한다:
Figure pct00151
일부 실시양태에서, 5' 트랜스포존 말단은 하기 서열 및 ITR을 포함한다:
Figure pct00152
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 3' 트랜스포존 말단은 하기 서열 및 ITR을 포함한다:
Figure pct00153
일부 실시양태에서, 3' 트랜스포존 말단은 하기 서열 및 ITR을 포함한다:
Figure pct00154
일부 실시양태에서, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14573과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 서열을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 서열번호 14574와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14573으로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 적어도 20개 또는 적어도 25개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함하고, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14574로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 적어도 20개 또는 적어도 25개의 연속 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 한 트랜스포존 말단은 서열번호 14591로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개를 포함하고, 다른 말단은 서열번호 14593으로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개를 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 트랜스포존 말단은 역위 배향으로 서열번호 14575를 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14573, 서열번호 14579, 서열번호 14581, 서열번호 14582, 서열번호 14583 및 서열번호 14588로부터 선택된 서열, 및 서열번호 14587, 서열번호 14588, 서열번호 14589 및 서열번호 14586으로부터 선택된 서열을 포함하고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14517 또는 서열번호 14518을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 표적 서열에 인접한 ITR인 CCCTTTGCCTGCCA(서열번호 14622)(5' ITR) 및 TGGCAGTGAAAGGG(서열번호 14623)(3' ITR)을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 헬리코베르파 아르미게라로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00155
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 헬리코베르파 아르미게라로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00156
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00157
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 펙티노포라 고시피엘라로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00158
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 펙티노포라 고시피엘라로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00159
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00160
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 크테노플루시아 아그나타로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00161
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 크테노플루시아 아그나타로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00162
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00163
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 ITR 서열인 CCCTAGAAGCCCAATC(서열번호 14564)를 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 아그로티스 입실론으로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00164
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 아그로티스 입실론으로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00165
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00166
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 메가칠레 로툰다타로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00167
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 메가칠레 로툰다타로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00168
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00169
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 봄부스 임파티엔스로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00170
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 봄부스 임파티엔스로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00171
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00172
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 마메스트라 브라시카로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00173
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 마메스트라 브라시카로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00174
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00175
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 메이에티올라 데스럭토르로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00176
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 메이에티올라 데스럭토르로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00177
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00178
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 아피스 멜리페라로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00179
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 아피스 멜리페라로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00180
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00181
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 메소르 보우비에리로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00182
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 메소르 보우비에리로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00183
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00184
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제이다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 트리코플루시아 니로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac(PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00185
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 트리코플루시아 니로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00186
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00187
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00188
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00189
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00190
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00191
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14561 및 서열번호 14562를 포함하고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14558을 포함한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 서열번호 14609 및 서열번호 14610을 포함하고, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제는 서열번호 14558을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 아피스 고시피이로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 ITR 서열 CCTTCCAGCGGGCGCGC(서열번호 14565)를 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 칠로 수프레살리스로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 ITR 서열 CCCAGATTAGCCT(서열번호 14566)을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 헬리오티스 비레센스로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 ITR 서열 CCCTTAATTACTCGCG(서열번호 14567)을 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 펙티노포라 고시피엘라로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 ITR 서열 CCCTAGATAACTAAAC(서열번호 14568)를 포함한다.
일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 아노펠레스 스테펜시(Anopheles stephensi)로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 ITR 서열 CCCTAGAAAGATA(서열번호 14569)를 포함한다.
hAT 패밀리 내의 DNA 트랜스포존은 식물 및 동물에서 널리 퍼져있다. 헤르메스(Hermes) 트랜스포존, Ac 트랜스포존, 호보(hobo) 트랜스포존 및 Tol2 트랜스포존을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 다수의 활성 hAT 트랜스포존 시스템들이 확인되었고 작용하는 것으로 밝혀졌다. hAT 패밀리는 그의 트랜스포사제의 일차 서열에 근거하여 AC 서브패밀리와 Buster 서브패밀리로서 분류된 2개의 패밀리들로 구성된다. hAT 패밀리의 구성원들은 클래스 II 전위 가능한 요소에 속한다. 클래스 II 이동성 요소는 전위의 절단 및 붙이기 기작을 이용한다. hAT 요소들은 유사한 트랜스포사제, 짧은 말단 역위 반복부, 및 게놈 표적의 8개 염기쌍 중복을 공유한다.
본 개시의 조성물 및 방법은 TcBuster 트랜스포존 및/또는 TcBuster 트랜스포사제를 포함할 수 있다.
본 개시의 조성물 및 방법은 TcBuster 트랜스포존 및/또는 과활성 TcBuster 트랜스포사제를 포함할 수 있다. 과활성 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제의 절제 및/또는 삽입 빈도에 비해 증가된 절제 및/또는 증가된 삽입 빈도를 나타낸다. 과활성 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제의 전위 빈도에 비해 증가된 전위 빈도를 나타낸다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사제는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된다:
Figure pct00192
(진뱅크 수탁번호 ABF20545 및 서열번호 17900).
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된 야생형 TcBuster 트랜스포사제와 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된다:
Figure pct00193
(진뱅크 수탁번호 ABF20545 및 서열번호 17900).
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사제는 하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00194
Figure pct00195
(진뱅크 수탁번호 DQ481197 및 서열번호 17901).
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 핵산 서열에 의해 코딩된 야생형 TcBuster 트랜스포사제와 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된다:
Figure pct00196
Figure pct00197
(진뱅크 수탁번호 DQ481197 및 서열번호 17901).
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 천연 발생 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 비-천연 발생 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 천연 발생 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 구성된 서열에 의해 코딩된다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 비-천연 발생 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 구성된 서열에 의해 코딩된다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17900의 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17901의 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 구성된 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 치환, 역위, 삽입, 결실, 전위 및 프레임시프트 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 변형된, 합성, 인공 또는 비-천연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 변형된, 합성, 인공 또는 비-천연 발생 핵산을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 DNA 결합 및 올리고머화 도메인, 삽입 도메인 및 Zn-BED 도메인 중 하나 이상의 도메인에서 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 순 전하 중성 pH를 증가시키는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17900의 아미노산 서열을 포함하거나 이러한 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17901의 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 구성된 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 223의 아스파르트산(D)(D223), 위치 289의 아스파르트산(D)(D289) 및 위치 589의 아스파르트산(E)(E289)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 223, 289 및/또는 289에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 중간치 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 223, 289 및/또는 289에서 70개 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 223, 289 및/또는 289에서 80개 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 중성 아미노산, 라이신(L) 또는 아르기닌(R)으로의 아스파르트산(D) 또는 아스파르트산(E)의 아미노산 치환을 포함한다(예를 들면, 서열번호 17900의 D223L, D223R, D289L, D289R, E289L, E289R).
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 Q82E, N85S, D99A, D132A, Q151S, Q151A, E153K, E153R, A154P, Y155H, E159A, T171K, T171R, K177E, D183K, D183R, D189A, T191E, S193K, S193R, Y201A, F202D, F202K, C203I, C203V, Q221T, M222L, I223Q, E224G, S225W, D227A, R239H, E243A, E247K, P257K, P257R, Q258T, E263A, E263K, E263R, E274K, E274R, S278K, N281E, L282K, L282R, K292P, V297K, K299S, A303T, H322E, A332S, A358E, A358K, A358S, D376A, V377T, L380N, I398D, I398S, I398K, F400L, V431L, S447E, N450K, N450R, I452F, E469K, K469K, P510D, P510N, E517R, R536S, V553S, P554T, P559D, P559S, P559K, K573E, E578L, K590T, Y595L, V596A, T598I, K599A, Q615A, T618K, T618K, T618R, D622K 및 D622R 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 154, 155, 159, 171, 177, 183, 189, 191, 193, 201, 202, 203, 221, 223, 224, 225, 227, 239, 243, 247, 257, 258, 263, 274, 278, 281, 282, 292, 297, 299, 303, 322, 332, 358, 376, 377, 380, 398, 400, 431, 447, 450, 452, 469, 510, 517, 536, 553, 554, 559, 573, 578, 590, 595, 596, 598, 599, 615, 618 및 622에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 중간치 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 E247K, V297K, A358K, S278K, E247R, E274R, V297R, A358R, S278R, T171R, D183R, S193R, P257K, E263R, L282K, T618K, D622R, E153K, N450K, T171K, D183K, S193K, P257R, E263K, L282R, T618R, D622K, E153R 및 N450R 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 153, 171, 183, 193, 247, 257, 263, 274, 278, 282, 297, 358, 450, 618, 622에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 중간치 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 V377T/E469K, V377T/E469K/R536S, A332S, V553S/P554T, E517R, K299S, Q615A/T618K, S278K, A303T, P510D, P510N, N281S, N281E, K590T, Q258T, E247K, S447E, N85S, V297K, A358K, I452F, V377T/E469K/D189A, K573E/E578L, I452F/V377T/E469K/D189A, A358K/V377T/E469K/D189A, K573E/E578L/V377T/E469K/D189A, T171R, D183R, S193R, P257K, E263R, L282K, T618K, D622R, E153K, N450K, T171K, D183K, S193K, P257R, E263K, L282R, T618R, D622K, E153R, N450R, E247K/E274K/V297K/A358K 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 85, 153, 171, 189, 193, 247, 257, 258, 263, 274, 278, 281, 282, 297, 299, 303, 332, 358, 377, 450, 469, 447, 452, 469, 510, 517, 536, 553, 554, 573, 578, 590, 615, 618, 622에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 중간치 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 V377T/E469K, V377T/E469K/R536S, V553S/P554T, Q615A/T618K, S278K, A303T, P510D, P510N, N281S, N281E, K590T, Q258T, E247K, S447E, N85S, V297K, A358K, I452F, V377T/E469K/D189A 및 K573E/E578L 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 85, 189, 247, 258, 278, 281, 297, 303, 358, 377, 447, 452, 469, 510, 536, 553, 554, 573, 578, 590, 615, 618에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 중간치 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 Q151S, Q151A, A154P, Q615A, V553S, Y155H, Y201A, F202D, F202K, C203I, C203V, F400L, I398D, I398S, I398K, V431L, P559D, P559S, P559K, M222L 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900의 위치 151, 154, 615, 553, 155, 201, 202, 203, 400, 398, 431, 559, 222에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 중간치 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 V377T, E469K 및 D189A 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 K573E 및 E578L 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 아미노산 치환 I452K를 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 A358K를 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 V297K를 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 N85S를 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 I452F, V377T, E469K 및 D189A 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 A358K, V377T, E469K 및 D189A 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사제는 야생형 TcBuster 트랜스포사제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 서열 변이는 서열번호 17900에 따라 넘버링될 때 V377T, E469K, D189A, K573E 및 E578L 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 5' 역위 반복부를 인식한다:
Figure pct00198
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 3' 역위 반복부를 인식한다:
Figure pct00199
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17902의 서열을 포함하거나 이 서열로 구성된 5' 역위 반복부 및 서열번호 17903의 서열을 포함하거나 이 서열로 구성된 3' 역위 반복부를 인식한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 5' 역위 반복부를 인식한다:
Figure pct00200
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 3' 역위 반복부를 인식한다:
Figure pct00201
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17904의 서열을 포함하거나 이 서열로 구성된 5' 역위 반복부 및 서열번호 17905의 서열을 포함하거나 이 서열로 구성된 3' 역위 반복부를 인식한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17902, 17903, 17904 또는 17905 중 하나 이상의 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95,% 97%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된 역위 반복부를 인식한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 적어도 가진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된 역위 반복부를 인식한다. 본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17902, 17903, 17904 또는 17905, 또는 이들의 임의의 부분과 90% 내지 100% 동일성을 가진 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 97개, 99개 또는 임의의 중간치 수의 연속 뉴클레오타이드들을 가진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된 역위 반복부를 인식한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17902, 17903, 17904 또는 17905, 또는 이들의 임의의 부분과 90% 내지 100% 동일성을 가진 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 97개, 99개 또는 임의의 중간치 수의 불연속 뉴클레오타이드들을 가진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된 역위 반복부를 인식한다.
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포존은 3' 역위 반복부 및 5' 역위 반복부를 포함한다. 본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시양태에서, TcBuster 트랜스포사제는 서열번호 17902, 17903, 17904 또는 17905, 또는 이들의 임의의 부분과 90% 내지 100% 동일성을 가진 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 97개, 99개 또는 임의의 중간치 수의 불연속 뉴클레오타이드들을 가진 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성된 3' 역위 반복부 및 5' 역위 반복부를 포함하는 TcBuster 트랜스포존을 인식한다.
비-전위 기반 유전자 변형 방법
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 본 개시의 변형된 HSC 또는 변형된 HSC 자손 세포는 전이유전자(transgene)를 본 개시의 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 도입 단계는 비-전위 전달 시스템을 통한 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물의 전달을 포함할 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기천공, 스핀감염, 공-배양, 형질감염, 기계적 전달, 초음파 전달, 진동 전달, 자기감염(magnetofection) 또는 나노입자 매개 전달 중 하나 이상을 포함한다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 리포좀 형질감염, 인산칼슘 형질감염, 퓨진(fugene) 형질감염 및 덴드리머 매개 형질감염을 포함한다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 기계적 형질감염으로 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 세포 스퀴징(squeezing), 세포 포격(bombardment) 또는 유전자총 기법을 포함한다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 나노입자 매개 형질감염으로 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 리포좀 전달, 마이셀에 의한 전달 및 폴리머로좀에 의한 전달을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 이중 가닥 DNA(dsDNA), 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA), DoggyBone™ DNA, 나노플라스미드, 미니서클 DNA, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN), DDNA 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 mRNA(ssRNA), 및 이중 가닥 mRNA(dsRNA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 본 개시의 트랜스포존을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 비-통합 비-염색체 벡터이다. 예시적 비-통합 비-염색체 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 통합 염색체 벡터이다. 통합 염색체 벡터는 아데노 관련 벡터(AAV), 렌티바이러스 및 감마-레트로바이러스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 벡터들의 조합을 포함한다. 예시적 비제한적 벡터 조합은 바이러스 벡터와 비-바이러스 벡터, 복수의 비-바이러스 벡터들, 또는 복수의 바이러스 벡터들을 포함한다. 예시적 비제한적 벡터 조합은 DNA 유래 벡터와 RNA 유래 벡터의 조합, RNA와 역전사효소의 조합, 트랜스포존과 트랜스포사제의 조합, 비-바이러스 벡터와 핵산내부분해효소(endonuclease)의 조합, 및 바이러스 벡터와 핵산내부분해효소의 조합을 포함한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 게놈 변형은 핵산 서열을 안정적으로 통합시키거나, 핵산 서열을 일시적으로 통합시키거나, 핵산 서열의 부위 특이적 통합을 일으키거나, 핵산 서열의 편향된 통합을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 전이유전자이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 게놈 변형은 핵산 서열을 안정적으로 통합시킨다. 일부 실시양태에서, 안정한 염색체 통합은 무작위 통합, 부위 특이적 통합 또는 편향된 통합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 부위 특이적 통합은 보조되지 않을 수 있거나 보조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보조된 부위 특이적 통합은 부위 지정 핵산분해효소와 공-전달된다. 일부 실시양태에서, 부위 지정 핵산분해효소는 게놈 통합 부위의 업스트림 및 다운스트림 영역에 대한 퍼센트 상동성을 함유하는 5' 및 3' 뉴클레오타이드 서열 연장을 가진 전이유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상동성 뉴클레오타이드 연장을 가진 전이유전자는 상동성 재조합, 마이크로상동성 매개 말단 연결 또는 비상동성 말단 연결에 의한 게놈 통합을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 부위 특이적 통합은 안전 피난처 부위에서 일어난다. 게놈 안전 피난처 부위는 새로 삽입된 유전 요소가 신뢰할만하게 작용하고(예를 들면, 치료 유효 발현 수준으로 발현되고) 숙주 유기체에 위험을 야기하는, 숙주 게놈에 대한 유해한 변경을 야기하지 않도록 보장하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있다. 잠재적 게놈 안전 피난처는 인간 알부민 유전자의 인트론 서열, 아데노 관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 19번 염색체 상의 천연 발생 AAV 바이러스 통합 부위, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자의 부위 및 마우스 Rosa26 좌위의 인간 오르톨로그의 부위를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 파괴하는 부위에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자 발현의 파괴는 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 서프레서, 출발 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서 부위 특이적 통합에 의해 일어난다. 일부 실시양태에서, 부위 특이적 통합에 의해 표적화된 예시적 표적 유전자는 TRAC, TRAB, PDI, 임의의 면역억제 유전자, 및 동종 거부에 관여된 유전자를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 향상시키는 부위에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자 발현의 향상은 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 서프레서, 출발 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서 부위 특이적 통합에 의해 일어난다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 효소는 숙주 게놈에서 가닥 절단을 생성하여 전이유전자의 전달 또는 통합을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소는 단일 가닥 절단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 효소는 이중 가닥 절단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 절단 유도 효소의 예는 트랜스포사제, 통합효소(integrase), 핵산내부분해효소, CRISPR-Cas9, 전사 활성화제 유사 이펙터 핵산분해효소(TALEN), 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN), Cas-CLOVER™ 및 CPF1을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 절단 유도 효소는 DNA에 코딩된 상태로, mRNA에 코딩된 상태로, 단백질로서, 또는 가이드 RNA(gRNA)를 가진 핵단백질 복합체로서 세포에게 전달될 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 벡터 매개 통합 부위 편향에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 렌티바이러스 벡터에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 감마-레트로바이러스 벡터에 의해 조절된다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 부위 특이적 전이유전자 통합 부위는 불안정한 염색체 삽입이다. 일부 실시양태에서, 통합된 전이유전자는 침묵될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 절제될 수 있거나 추가 변형될 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 전이유전자의 불안정한 통합이다. 일부 실시양태에서, 불안정한 통합은 일시적인 비-염색체 통합, 반안정한 비-염색체 통합, 반영구적인 비-염색체 삽입 또는 불안정한 염색체 삽입일 수 있다. 일부 실시양태에서, 일시적인 비-염색체 삽입은 에피-염색체 또는 세포질 삽입일 수 있다.
일부 실시양태에서, 전이유전자의 일시적인 비-염색체 삽입은 염색체 내로 통합되지 않고, 변형된 유전 물질은 세포 분열 동안 복제되지 않는다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 전이유전자의 반안정한 또는 영구적인 비-염색체 통합이다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 분열 세포의 핵에서의 자율 복제를 가능하게 하는 비-바이러스 벡터의 에피좀 보유를 위해 핵 매트릭스 단백질에 결합하는 스카폴드/매트릭스 부착 영역(S-MAR) 모듈을 코딩한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 전이유전자의 불안정한 염색체 통합이다. 일부 실시양태에서, 통합된 전이유전자는 침묵될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 절제될 수 있거나 추가 변형될 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 상동성 재조합(HR)에 의한 숙주 세포 유도 이중 가닥 절단 복구(상동성 유도 복구), 마이크로상동성 매개 말단 연결(MMEJ), 비상동성 말단 연결(NHEJ), 트랜스포사제 매개 변형, 통합효소 매개 변형, 핵산내부분해효소 매개 변형 또는 재조합 효소 매개 변형을 통해 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 CRISPR-Cas9, TALEN, ZFNs, Cas-CLOVER 및 cpf1을 통해 일어날 수 있다.
새로운 또는 기존 뉴클레오타이드/핵산의 삽입을 수반하는 유전자 편집 시스템에서, 절단 효소(예를 들면, 핵산분해효소, 재조합효소(recombinase), 통합효소 또는 트랜스포사제) 이외에 삽입 수단(예를 들면, DNA 주형 벡터, 전위 가능한 요소(트랜스포존 또는 레트로트랜스포존))을 세포에게 전달해야 한다. 재조합효소의 경우 이러한 삽입 수단의 예는 DNA 벡터를 포함할 수 있다. 다른 유전자 편집 시스템은 삽입 벡터와 함께 통합효소, 트랜스포존/레트로트랜스포존과 함께 트랜스포사제 등의 전달을 요구한다. 일부 실시양태에서, 절단 효소로서 사용될 수 있는 재조합효소의 예는 CRE 재조합효소이다. 다양한 실시양태에서, 삽입 수단에서 사용될 수 있는 예시적 통합효소는 AAV, 감마 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 다수의 바이러스들 중 임의의 바이러스로부터 수득된 바이러스 기반 효소를 포함한다. 삽입 수단에서 사용될 수 있는 예시적 트랜스포존/레트로트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존, 슬립핑 뷰티 트랜스포존 및 L1 레트로트랜스포존을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 전이유전자는 생체내로 전달된다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체내 전이유전자 전달은 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기천공, 스핀감염, 공-배양, 형질감염, 기계적 전달, 초음파 전달, 진동 전달, 자기감염 또는 나노입자 매개 전달에 의해 일어날 수 있다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 형질감염에 의한 생체내 전이유전자 전달은 리포좀 형질감염, 인산칼슘 형질감염, 퓨진 형질감염 및 덴드리머 매개 형질감염에 의해 일어날 수 있다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체내 기계적 전이유전자 전달은 세포 스퀴징, 포격 및 유전자총에 의해 일어날 수 있다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체내 나노입자 매개 전이유전자 전달은 리포좀 전달, 마이셀에 의한 전달 및 폴리머로좀에 의한 전달에 의해 일어날 수 있다. 다양한 실시양태에서, 절단 효소로서 사용될 수 있는 핵산분해효소는 Cas9, 전사 활성화제 유사 이펙터 핵산분해효소(TALEN) 및 징크 핑거 핵산분해효소를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 전이유전자 전달을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 핵산이다. 일부 실시양태에서, 핵산 비-바이러스 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 이중 가닥 DNA(dsDNA), 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA), DoggyBone™ DNA, 나노플라스미드, 미니서클 DNA, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN), DDNA 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 mRNA(ssRNA) 및 이중 가닥 mRNA(dsRNA)이다. 일부 실시양태에서, 비-바이러스 벡터는 트랜스포존이다. 일부 실시양태에서, 트랜스포존은 piggyBac™이다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 전이유전자 전달은 바이러스 벡터를 통해 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 비-통합 비-염색체 벡터이다. 비-통합 비-염색체 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 통합 염색체 벡터이다. 통합 염색체 벡터는 아데노 관련 벡터(AAV), 렌티바이러스 및 감마-레트로바이러스를 포함할 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 전이유전자 전달은 벡터들의 조합에 의해 일어날 수 있다. 예시적 비제한적 벡터 조합은 바이러스 벡터 플러스 비-바이러스 벡터, 하나 초과의 비-바이러스 벡터, 또는 하나 초과의 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 예시적 비제한적 벡터 조합은 DNA 유래 벡터 플러스 RNA 유래 벡터, RNA 플러스 역전사효소, 트랜스포존과 트랜스포사제, 비-바이러스 벡터 플러스 핵산내부분해효소, 및 바이러스 벡터 플러스 핵산내부분해효소를 포함할 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 전이유전자의 안정한 통합, 전이유전자의 일시적인 통합, 전이유전자의 부위 특이적 통합 또는 전이유전자의 편향된 통합일 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 전이유전자의 안정한 염색체 통합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안정한 염색체 통합은 무작위 통합, 부위 특이적 통합 또는 편향된 통합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 부위 특이적 통합은 보조되지 않을 수 있거나 보조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보조된 부위 특이적 통합은 부위 지정 핵산분해효소와 공-전달된다. 일부 실시양태에서, 부위 지정 핵산분해효소는 게놈 통합 부위의 업스트림 영역 및 다운스트림 영역에 대한 상동성을 함유하는 5' 및 3' 뉴클레오타이드 서열 연장을 가진 전이유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상동성 뉴클레오타이드 연장을 가진 전이유전자는 상동성 재조합, 마이크로상동성 매개 말단 연결 또는 비상동성 말단 연결에 의한 게놈 통합을 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, 부위 특이적 통합은 안전 피난처 부위에서 일어난다. 게놈 안전 피난처 부위는 새로 삽입된 유전 요소가 신뢰할만하게 작용하고(예를 들면, 치료 유효 발현 수준으로 발현되고) 숙주 유기체에 위험을 야기하는, 숙주 게놈에 대한 유해한 변경을 야기하지 않도록 보장하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있다. 잠재적 게놈 안전 피난처는 인간 알부민 유전자의 인트론 서열, 아데노 관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 19번 염색체 상의 천연 발생 AAV 바이러스 통합 부위, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자의 부위 및 마우스 Rosa26 좌위의 인간 오르톨로그의 부위를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 파괴하는 부위에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자 발현의 파괴는 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 서프레서, 출발 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서 부위 특이적 통합에 의해 일어난다. 일부 실시양태에서, 부위 특이적 통합에 의해 표적화된 예시적 표적 유전자는 TRAC, TRAB, PDI, 임의의 면역억제 유전자, 및 동종 거부에 관여된 유전자를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 향상시키는 부위에서 일어난다. 일부 실시양태에서, 표적 유전자 발현의 향상은 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 서프레서, 출발 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서 부위 특이적 통합에 의해 일어난다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 효소는 숙주 게놈에서 가닥 절단을 생성하여 전이유전자의 전달 또는 통합을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효소는 단일 가닥 절단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 효소는 이중 가닥 절단을 생성한다. 일부 실시양태에서, 절단 유도 효소의 예는 트랜스포사제, 통합효소, 핵산내부분해효소, CRISPR-Cas9, 전사 활성화제 유사 이펙터 핵산분해효소(TALEN), 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN), Cas-CLOVER™ 및 cpf1을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 절단 유도 효소는 DNA에 코딩된 상태로, mRNA에 코딩된 상태로, 단백질로서, 또는 가이드 RNA(gRNA)를 가진 핵단백질 복합체로서 세포에게 전달될 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 벡터 매개 통합 부위 편향에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 렌티바이러스 벡터에 의해 조절된다. 일부 실시양태에서, 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 감마-레트로바이러스 벡터에 의해 조절된다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 부위 특이적 전이유전자 통합 부위는 불안정한 염색체 삽입이다. 일부 실시양태에서, 통합된 전이유전자는 침묵될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 절제될 수 있거나 추가 변형될 수 있다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 전이유전자의 불안정한 통합이다. 일부 실시양태에서, 불안정한 통합은 일시적인 비-염색체 통합, 반안정한 비-염색체 통합, 반영구적인 비-염색체 삽입 또는 불안정한 염색체 삽입일 수 있다. 일부 실시양태에서, 일시적인 비-염색체 삽입은 에피-염색체 또는 세포질 삽입일 수 있다. 일부 실시양태에서, 전이유전자의 일시적인 비-염색체 삽입은 염색체 내로 통합되지 않고, 변형된 유전 물질은 세포 분열 동안 복제되지 않는다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 전이유전자의 반안정한 또는 영구적인 비-염색체 통합이다. 일부 실시양태에서, DNA 벡터는 분열 세포의 핵에서의 자율 복제를 가능하게 하는 비-바이러스 벡터의 에피좀 보유를 위해 핵 매트릭스 단백질에 결합하는 스카폴드/매트릭스 부착 영역(S-MAR) 모듈을 코딩한다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 게놈 변형은 전이유전자의 불안정한 염색체 통합이다. 일부 실시양태에서, 통합된 전이유전자는 침묵될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 절제될 수 있거나 추가 변형될 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 상동성 재조합(HR)에 의한 숙주 세포 유도 이중 가닥 절단 복구(상동성 유도 복구), 마이크로상동성 매개 말단 연결(MMEJ), 비상동성 말단 연결(NHEJ), 트랜스포사제 매개 변형, 통합효소 매개 변형, 핵산내부분해효소 매개 변형 또는 재조합 효소 매개 변형을 통해 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 CRISPR-Cas9, TALEN, ZFNs, Cas-CLOVER 및 cpf1을 통해 일어날 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 생체내 또는 생체외 게놈 변형을 가진 세포는 생식세포주 세포 또는 체세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 인간, 비-인간, 포유동물, 래트, 마우스 또는 개 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 분화될 수 있거나, 미분화될 수 있거나 불멸화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 미분화된 세포는 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 분화될 수 있거나, 미분화될 수 있거나 불멸화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 미분화된 세포는 유도된 전분화능 줄기 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 T 세포, 조혈 줄기 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 수지상세포, 단핵세포, 거핵세포 또는 파골세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 세포가 휴지기에 있거나, 활성화된 상태에 있거나, 휴면 상태에 있거나, 간기에 있거나, 전기에 있거나, 중기에 있거나, 후기에 있거나 또는 말기에 있는 동안 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 새로 채취될 수 있거나, 냉동보존될 수 있거나, 부피가 늘어날 수 있거나, 하위집단으로 분류될 수 있거나, 전혈, 백혈구성분채집술 또는 불멸화된 세포주로부터 유래할 수 있다.
센티린
본 개시의 센티린은 피브로넥틴 III형(FN3) 반복부 단백질, 코딩 또는 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 조합, 제제, 디바이스, 및 이들의 제조 및 사용 방법으로부터 유래할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 센티린은 인간 테나신-C(이하, "테나신")로부터의 다수의 FN3 도메인들의 컨센서스 서열로 구성된다. 추가 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 스카폴드는 15개의 FN3 도메인들의 컨센서스 서열이다. 본 개시의 센티린은 다양한 분자들, 예를 들면, 세포 표적 단백질에 결합하도록 디자인될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시의 센티린은 야생형 및/또는 변이체 형태의 항원의 에피토프에 결합하도록 디자인될 수 있다.
본 개시의 센티린은 추가 분자 또는 모이어티, 예를 들면, 항체의 Fc 영역, 알부민 결합 도메인, 또는 반감기에 영향을 미치는 다른 모이어티를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 본 개시의 센티린은 센티린을 코딩할 수 있는 핵산 분자에 결합될 수 있다.
본 개시는 숙주 세포에서 다수의 FN3 도메인들의 컨센서스 서열에 기반한 적어도 하나의 센티린을 발현시키는 적어도 하나의 방법으로서, 적어도 하나의 단백질 스카폴드가 검출 가능하고/하거나 회수 가능한 양으로 발현되는 조건 하에서 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 개시는 (a) 다수의 FN3 도메인들의 컨센서스 서열 및/또는 본원에 기재된 코딩 핵산에 기반한 센티린; 및 (b) 적합한 및/또는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공한다.
본 개시는 피브로넥틴 III형(FN3) 반복부 단백질, 바람직하게는 다수의 FN3 도메인들의 컨센서스 서열, 보다 바람직하게는 인간 테나신으로부터의 다수의 FN3 도메인들의 컨센서스 서열에 기반한 센티린의 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 라이브러리는 센티린의 부분, 예를 들면, 루프 영역 내의 특정 위치에서 분자의 아미노산 또는 아미노산 수를 변경(돌연변이)시켜 센티린을 연속적으로 생성함으로써 형성된다. 라이브러리는 단일 루프의 아미노산 조성의 변경, 또는 센티린 분자의 다수의 루프들 또는 추가 위치의 동시적 변경에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 변경되는 루프는 길어질 수 있거나 짧아질 수 있다. 이러한 라이브러리는 각각의 위치에서 모든 가능한 아미노산들, 또는 지정된 서브세트의 아미노산들을 포함하도록 생성될 수 있다. 라이브러리 구성원은 디스플레이, 예컨대, 시험관내 또는 CIS 디스플레이(DNA, RNA, 리보좀 디스플레이 등), 효모, 세균 및 파지 디스플레이에 의한 스크리닝을 위해 사용될 수 있다.
본 개시의 센티린은 향상된 생체물리적 성질, 예컨대, 환원 조건 하에서의 안정성 및 고농도에서의 가용성을 제공하고; 원핵생물 시스템, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli), 진핵생물 시스템, 예컨대, 효모, 및 시험관내 전사/번역 시스템, 예컨대, 토끼 망상적혈구 용해물 시스템에서 발현되고 폴딩될 수 있다.
본 개시는 표적 및 검출 결합제로 본 발명의 센티린 라이브러리를 패닝(panning)함으로써 특정 표적에 결합하는 센티린 분자를 생성하는 방법을 제공한다. 다른 관련 양태에서, 본 개시는 원하는 활성을 가진, 예를 들면, 특정 친화성으로 표적 단백질에 결합할 수 있는 센티린을 생성하거나 친화성 성숙시키는 데 이용될 수 있는 스크리닝 방법을 포함한다. 친화성 성숙은 시스템, 예컨대, 파지 디스플레이 또는 시험관내 디스플레이를 이용한 반복적 라운드의 돌연변이유발 및 선택에 의해 달성될 수 있다. 이 과정 동안 돌연변이유발은 특정 센티린 잔기에 대한 부위 지정 돌연변이유발, 오류 유발 PCR로 인한 무작위 돌연변이유발, DNA 셔플링 및/또는 이 기법들의 조합의 결과일 수 있다.
본 개시는 포유동물 유래 센티린을 포함하나 이것으로 제한되지 않는, 피브로넥틴 III형(FN3) 반복부 단백질의 컨센서스 서열에 기반한 단리된 재조합 및/또는 합성 센티린뿐만 아니라, 컨센서스 FN3 서열에 기반한 센티린을 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물 및 코딩 핵산 분자도 제공한다. 본 개시는 진단 및 치료 조성물, 방법 및 디바이스를 비롯한, 이러한 핵산 및 센티린의 제조 및 사용 방법도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 센티린은 통상적인 치료제에 비해 장점, 예컨대, 국소 투여되거나, 경구 투여되거나 혈액-뇌 장벽을 가로질러 투여되는 능력, 다수의 표적들 또는 동일한 표적의 다수의 에피토프들에 결합하는 이중특이적 또는 탠덤 분자로 조작되는 포유동물 세포 발현 능력에 비해 자원의 함수로서 증가된 단백질 발현을 가능하게 하는, 이. 콜라이에서 발현되는 능력, 약물, 중합체 및 프로브에 접합되는 능력, 고농도로 제제화되는 능력, 및 병든 조직 및 종양을 효과적으로 침투하는 이러한 분자의 능력을 제공한다.
더욱이, 센티린은 항체의 가변 영역을 모방하는 그의 폴드(fold)와 관련하여 항체의 성질들 중 대다수의 성질들을 가진다. 이 배향은 FN3 루프들이 항체 상보성 결정 영역들(CDR들)과 유사하게 노출될 수 있게 한다. 이들은 세포 표적에 결합할 수 있어야 하고, 상기 루프들은 특정 결합 또는 관련 성질을 개선하기 위해 변경될, 예를 들면, 친화성 성숙될 수 있다.
본 개시의 센티린의 6개의 루프들 중 3개의 루프들은 항체의 상보성 결정 영역들(CDR1 내지 CDR3), 즉 항원 결합 영역들에 위상학적으로 상응하는 반면, 남은 3개의 루프들은 항체 CDR과 유사한 방식으로 표면 노출된다. 이 루프들은 서열번호 18018의 정확히 또는 대략 잔기 13 내지 16, 22 내지 28, 38 내지 43, 51 내지 54, 60 내지 64, 및 75 내지 81에 걸쳐 있다. 바람직하게는, 서열번호 18018의 정확히 또는 대략 잔기 22 내지 28, 51 내지 54, 및 75 내지 81에 있는 루프 영역들은 결합 특이성 및 친화성을 위해 변경된다. 이 루프 영역들 중 하나 이상은 골격 부분으로서 그들의 서열을 유지하는 다른 루프 영역들 및/또는 다른 가닥들과 무작위조합되어 라이브러리를 형성하고, 강력한 결합제는 특정 단백질 표적에 대한 고친화성을 가진 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 루프 영역들 중 하나 이상은 단백질과 상호작용하는 항체 CDR과 유사하게 표적 단백질과 상호작용할 수 있다.
본 개시의 일부 실시양태에서, PSMA 특이적 센티린은 PSMA의 서열에 특이적으로 결합하도록 디자인되고/되거나, 진화되고/되거나, 이처럼 특이적으로 결합하는 그의 능력으로 인해 선택된다. 일부 실시양태에서, PSMA 특이적 센티린은 PSMA의 에피토프에 결합하는 항-PSMA 항체의 친화성에 필적할만한 친화성으로 PSMA의 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, PSMA 특이적 센티린은 PSMA의 에피토프에 결합하는 항-PSMA 항체의 친화성보다 더 강한 친화성으로 PSMA의 서열에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, PSMA 특이적 센티린은 항체가 결합할 수 없는 PSMA의 서열에 결합할 수 있다. 예를 들면, PSMA의 서열은 불연속적일 수 있거나 이차 구조를 가질 수 있다.
CARTyrin의 제조 및 생성
본 개시의 적어도 하나의 CARTyrin은 당분야에서 잘 공지된 바와 같이 임의적으로 세포주, 혼합된 세포주, 불멸화된 세포 또는 불멸화된 세포의 클론 집단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]을 참조한다.
CARTyrin으로부터의 아미노산은 당분야에서 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화성, 결합 속도, 해리 속도, 결합력, 특이성, 반감기, 안정성, 가용성 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소시키거나, 향상시키거나 변형시키도록 변경될 수 있고/있거나, 추가될 수 있고/있거나 결실될 수 있다.
임의적으로, CARTyrin은 항원에 대한 고친화성 및 다른 유리한 생물학적 성질을 보유하도록 조작될 수 있다. 이 목적을 달성하기 위해, CARTyrin은 임의적으로 모 서열 및 조작된 서열의 3차원 모델을 이용함으로써 모 서열 및 다양한 개념적 조작된 생성물들의 분석 과정에 의해 제조될 수 있다. 3차원 모델은 통상적으로 입수될 수 있고 당분야에서 숙련된 자에게 익숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 입체배열 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 입수될 수 있고 가능한 면역원성을 측정할 수 있다(예를 들면, 캘리포니아주 몬로비아 소재의 젠코 인코포레이티드(Xencor, Inc.)의 이뮤노필터(Immunofilter) 프로그램). 이 디스플레이의 조사는 후보 서열의 작용에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 센티린 또는 CARTyrin이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이 방식으로, 원하는 특성, 예컨대, 표적 항원(들)에 대한 친화성이 달성되도록 모 서열 및 기준 서열로부터 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 상기 절차들에 대한 대안으로 또는 상기 절차들 이외에, 다른 적합한 조작 방법이 이용될 수 있다.
CARTyrin 단백질의 스크리닝
유사한 단백질 또는 단편에의 특이적 결합에 대한 센티린 또는 CARTyrin의 스크리닝은 뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA 디스플레이) 또는 펩타이드 디스플레이 라이브러리, 예를 들면, 시험관내 디스플레이를 이용함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 이 방법은 원하는 작용 또는 구조를 가진 개별 구성원들에 대한 큰 펩타이드 집단의 스크리닝을 수반한다. 디스플레이된 뉴클레오타이드 또는 펩타이드 서열은 길이가 종종 3개 내지 5000개 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산, 종종 길이가 5개 내지 100개의 아미노산, 종종 길이가 약 8개 내지 25개의 아미노산일 수 있다. 펩타이드 라이브러리를 생성하는 직접적인 화학적 합성 방법 이외에, 여러 재조합 DNA 방법들이 기재되어 있다. 한 유형은 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에서의 펩타이드 서열의 디스플레이를 수반한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩타이드 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 본 개시의 센티린인 CARTyrin은 광범위한 친화성(KD)으로 인간 또는 다른 포유동물 단백질에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 적어도 하나의 센티린은 당분야에서 숙련된 자에 의해 실시되는 바와 같이 표면 플라스몬 공명 또는 키넥사(Kinexa) 방법에 의해 측정될 때, 임의적으로 고친화성, 예를 들면, 0.1 내지 9.9(또는 이 범위 내의 임의의 범위 또는 값) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 , 또는 이 범위 내의 임의의 범위 또는 값과 같은, 그러나 이들로 제한되지 않는, 약 10-7 M 이하의 KD로 표적 단백질에 결합할 수 있다.
항원에 대한 센티린 또는 CARTyrin의 친화성 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 실험적으로 측정될 수 있다(예를 들면, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984)]; 문헌[Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 이들에 기재된 방법 참조). 특정 센티린-항원 또는 센티린-항원 상호작용의 측정된 친화성은 상이한 조건들(예를 들면, 염 농도, pH) 하에서 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, 바람직하게는 센티린 또는 CARTyrin 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제, 예컨대, 본원에 기재된 완충제를 사용하여 친화성 및 다른 항원 결합 파라미터(예를 들면, KD, Kon, Koff)를 측정한다.
어떤 단백질, 항체 및 다른 길항제가 표적 단백질에의 결합에 대해 본 발명의 센티린 또는 CARTyrin과 경쟁하고/하거나 에피토프 영역을 공유하는 지를 확인하기 위해 본 개시의 센티린 또는 CARTyrin을 사용하여 경쟁 어세이를 수행할 수 있다. 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 용이하게 공지된 이 어세이는 단백질 상의 제한된 수의 결합 부위에 대한 길항제들 또는 리간들 사이의 경쟁을 평가한다. 경쟁 전 또는 후에 단백질 및/또는 항체를 고정시키거나 불용성 상태로 만들고, 예를 들면, 디캔팅(decanting)(단백질/항체가 미리 불용성 상태로 만들어진 경우) 또는 원심분리(단백질/항체가 경쟁 반응 후 침전된 경우)로 표적 단백질에 결합된 샘플을 비결합된 샘플로부터 분리한다. 또한, 경쟁 결합은 작용이 센티린 또는 CARTyrin과 표적 단백질의 결합 또는 결합 결여에 의해 변경되는 지, 예를 들면, 센티린 또는 CARTyrin 분자가 예를 들면, 표지의 효소 활성을 억제하거나 증강시키는 지에 의해 확인될 수 있다. ELISA 및 다른 작용 어세이는 당분야에서 잘 공지된 바와 같이 이용될 수 있다.
핵산 분자
센티린 또는 CARTyrin을 코딩하는 본 개시의 핵산 분자는 RNA의 형태, 예컨대, mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태로 존재할 수 있거나, 클로닝 또는 합성 제조, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 수득된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 DNA의 형태로 존재할 수 있다. DNA는 삼중 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 적어도 하나의 가닥의 임의의 부분은 센스 가닥으로서도 공지된 코딩 가닥일 수 있거나, 안티센스 가닥으로서도 지칭된 비-코딩 가닥일 수 있다.
본 개시의 단리된 핵산 분자는 임의적으로 하나 이상의 인트론, 예를 들면, 적어도 하나의 CARTyrin의 적어도 하나의 특정된 부분(그러나, 이것으로 제한되지 않음)을 가진 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 핵산 분자; CARTyrin에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 전술된 핵산 분자들과 실질적으로 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하나, 본원에 기재되고/되거나 당분야에서 공지된 바와 같이 유전 코드의 축퇴성으로 인해 여전히 CARTyrin을 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전 코드는 당분야에서 잘 공지되어 있다. 따라서, 당분야에서 숙련된 자는 본 발명의 특정 CARTyrin을 코딩하는 이러한 축퇴 핵산 변이체를 관용적으로 생성할 것이다. 예를 들면, 상기 문헌[Ausubel, et al.]을 참조하고, 이러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다.
본원에 표시된 바와 같이, CARTyrin을 코딩하는 핵산을 포함하는 본 개시의 핵산 분자는 그 자체가 센티린 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자; 전체 CARTyrin 또는 이의 부분에 대한 코딩 서열; 비-코딩 5' 및 3' 서열, 예컨대, 전사, mRNA 프로세싱에 있어서 역할을 하는, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들면, mRNA의 리보좀 결합 및 안정성)를 포함하는 전사된 비-번역 서열을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 추가 비-코딩 서열과 함께, 센티린, 단편 또는 부분에 대한 코딩 서열뿐만 아니라, 상기 언급된 추가 코딩 서열, 예컨대, 적어도 하나의 인트론을 갖거나 갖지 않는 추가 서열, 예컨대, 적어도 하나의 신호 리더 또는 융합 펩타이드의 코딩 서열; 추가 아미노산, 예컨대, 추가 작용성을 제공하는 추가 아미노산을 코딩하는 추가 코딩 서열을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 따라서, CARTyrin을 코딩하는 서열은 마커 서열, 예컨대, 센티린 단편 또는 부분을 포함하는 융합된 CARTyrin의 정제를 용이하게 하는 펩타이드를 코딩하는 서열에 융합될 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드
본 개시는 선택적 하이브리드화 조건 하에서 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 이 실시양태의 폴리뉴클레오타이드는 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산을 단리하고/하거나, 검출하고/하거나 정량하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 기탁된 라이브러리에서 부분적 또는 전체 길이 클론을 확인하거나, 단리하거나 증폭하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 인간 또는 포유동물 핵산 라이브러리로부터 단리된 게놈 또는 cDNA 서열, 또는 이러한 라이브러리로부터의 cDNA에 다른 방식으로 상보적인 게놈 또는 cDNA 서열이다.
바람직하게는, cDNA 라이브러리는 적어도 80%의 전체 길이 서열, 바람직하게는 적어도 85% 또는 90%의 전체 길이 서열, 보다 바람직하게는 적어도 95%의 전체 길이 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 표시를 증가시키기 위해 표준화될 수 있다. 낮은 또는 중간 엄격도 혼성화 조건은 전적으로는 아니지만 전형적으로 상보적 서열에 비해 감소된 서열 동일성을 가진 서열과 함께 사용된다. 중간 엄격도 및 높은 엄격도 조건은 임의적으로 더 큰 동일성의 서열을 위해 사용될 수 있다. 낮은 엄격도 조건은 약 70% 서열 동일성을 가진 서열들의 선택적 혼성화를 가능하게 하고 오르톨로그성 또는 파랄로그성 서열을 확인하는 데 사용될 수 있다.
임의적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 CARTyrin의 적어도 부분을 코딩할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 CARTyrin을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에의 선택적 하이브리드화를 위해 사용될 수 있는 핵산 서열을 포괄한다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 각각 참고로 포함된 상기 문헌[Ausubel]; 및 상기 문헌[Colligan]을 참조한다.
핵산의 구축
본 개시의 단리된 핵산은 당분야에서 잘 공지된 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기법, (c) 정제 기법 및/또는 (d) 이들의 조합을 이용함으로써 제조될 수 있다.
핵산은 편리하게는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 이외의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 핵산내부분해효소 제한 부위를 포함하는 다중클로닝 부위를 핵산 내로 삽입하여 폴리뉴클레오타이드의 단리를 도울 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열을 삽입하여 본 개시의 번역된 폴리뉴클레오타이드의 단리를 도울 수 있다. 예를 들면, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 개시의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 개시의 핵산은 임의적으로 본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
추가 서열을 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 추가하여 클로닝 및/또는 발현에 있어서 이들의 작용을 최적화함으로써, 폴리뉴클레오타이드의 단리를 도울 수 있거나, 세포 내로의 폴리뉴클레오타이드의 도입을 개선할 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 상기 문헌[Ausubel]; 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
핵산을 구축하는 재조합 방법
본 개시의 단리된 핵산 조성물, 예컨대, RNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합은 당분야에서 숙련된 자에게 공지된 임의의 수의 클로닝 방법을 이용함으로써 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 엄격한 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 확인하는 데 사용된다. RNA의 단리, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 잘 공지되어 있다(예를 상기 문헌[Ausubel]; 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
핵산 스크리닝 및 단리 방법
본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 서열에 기반한 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 하이브리드화시켜 동일한 또는 상이한 유기체에서 상동성 유전자를 단리하는 데 사용될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 하이브리드화의 다양한 엄격도가 어세이에서 사용될 수 있고, 하이브리드화 또는 세척 매질이 엄격할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하이브리드화를 위한 조건이 더 엄격해질수록, 이중체 형성이 일어나기 위해서는 프로브와 표적 사이에 더 큰 정도의 상보성이 있어야 한다. 엄격도는 온도, 이온 강도, pH 및 부분적 변성 용매, 예컨대, 포름아미드의 존재 중 하나 이상에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 하이브리드화의 엄격도는 예를 들면, 포름아미드의 농도를 0% 내지 50%의 범위 내에서 조작하여 반응물 용액의 극성을 변화시킴으로써 편리하게 변경된다. 검출 가능한 결합을 위해 요구되는 상보성(서열 동일성)의 정도는 하이브리드화 매질 및/또는 세척 매질의 엄격도에 따라 달라질 것이다. 상보성의 정도는 최적으로 100%, 또는 70% 내지 100%, 또는 이 범위 내의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머의 미미한 서열 변이는 하이브리드화 및/또는 세척 매질의 엄격도를 감소시킴으로써 보상될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
RNA 또는 DNA 증폭 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 본원에 제시된 교시 및 지침에 기반하여, 과도한 실험 없이 본 개시에 따라 이용될 수 있다.
공지된 DNA 또는 RNA 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 방법(예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호(Mullis, et al.); 미국 특허 제4,795,699호 및 제4,921,794호(Tabor, et al); 미국 특허 제5,142,033호(Innis); 미국 특허 제5,122,464호(Wilson, et al.); 미국 특허 제5,091,310호(Innis); 미국 특허 제5,066,584호(Gyllensten, et al); 미국 특허 제4,889,818호(Gelfand, et al); 미국 특허 제4,994,370호(Silver, et al); 미국 특허 제4,766,067호(Biswas); 미국 특허 제4,656,134호(Ringold) 참조), 및 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭(미국 특허 제5,130,238호(Malek, et al), 상표명 NASBA)을 포함하나, 이들로 제한되지 않고, 이 참고문헌들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다(예를 들면, 상기 문헌[Ausubel]; 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
예를 들면, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 본 개시의 폴리뉴클레오타이드 및 관련 유전자의 서열을 직접적으로 증폭하는 데 이용될 수 있다. PCR 및 다른 시험관내 증폭 방법은 예를 들면, 발현될 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 클로닝, 샘플에서 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용할 핵산의 제조, 핵산 서열분석, 또는 다른 목적에 유용할 수도 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해 숙련된 자를 안내하기에 충분한 기법의 예는 상기 문헌[Berger], 상기 문헌[Sambrook] 및 상기 문헌[Ausubel]뿐만 아니라, 미국 특허 제4,683,202호(Mullis, et al.)(1987) 및 문헌[Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)]에서도 확인된다. 상업적으로 입수가능한 게놈 PCR 증폭용 키트는 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 어드밴티지(Advantage)-GC 게놈 PCR 키트(Clontech)를 참조한다. 추가로, 예를 들면, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)을 사용하여 긴 PCR 생성물의 수율을 개선할 수 있다.
핵산 구축을 위한 합성 방법
본 개시의 단리된 핵산은 공지된 방법에 의한 직접적인 화학적 합성에 의해 제조될 수도 있다(예를 들면, 상기 문헌[Ausubel, et al.,] 참조). 화학적 합성은 일반적으로 상보적 서열과의 하이브리드화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하는 DNA 중합효소에 의한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 생성한다. 당분야에서 숙련된 자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개 이상의 염기의 서열로 제한될 수 있지만, 더 긴 서열이 더 짧은 서열의 라이게이션에 의해 수득될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트
본 개시는 본 개시의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트도 제공한다. 본 개시의 핵산 서열, 예를 들면, 본 개시의 CARTyrin을 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 구축하는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도된 숙주 세포에서 본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 전사를 유도할 전사 개시 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 이종 프로모터 및 비-이종(즉, 내생성) 프로모터 둘 다가 본 개시의 핵산의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로모터, 인핸서 또는 다른 요소로서 사용되는 단리된 핵산을 본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 비-이종 형태의 적절한 위치(업스트림, 다운스트림 또는 인트론)에 도입하여, 본 개시의 폴리뉴클레오타이드의 발현을 상향 또는 하향 조절할 수 있다. 예를 들면, 내생성 프로모터는 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체내 또는 시험관내에서 변경될 수 있다.
나노트랜스포존
본 개시는 (a) 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열, 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 및 ITR내 서열을 포함하는, 트랜스포존 삽입체를 코딩하는 서열; (b) 종점을 포함하는 1개 내지 450개의 뉴클레오타이드를 가진 복제 기점을 코딩하는 서열을 포함하는, 골격을 코딩하는 서열 및 종점을 포함하는 1개 내지 200개의 뉴클레오타이드를 가진, 선택 마커를 코딩하는 서열; 및 (c) ITR간 서열을 포함하는 나노트랜스포존을 제공한다. 일부 실시양태에서, (c)의 ITR간 서열은 (b)의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, (a)의 ITR내 서열은 (b)의 서열을 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 골격을 코딩하는 서열은 종점을 포함하는 1개 내지 600개의 뉴클레오타이드를 포함하다. 일부 실시양태에서, 골격을 코딩하는 서열은 종점을 포함하는 1개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200개 내지 250개의 뉴클레오타이드, 230개 내지 300개의 뉴클레오타이드, 300개 내지 350개의 뉴클레오타이드, 350개 내지 400개의 뉴클레오타이드, 400개 내지 450개의 뉴클레오타이드, 450개 내지 500개의 뉴클레오타이드, 500개 내지 550개의 뉴클레오타이드, 550개 내지 600개의 뉴클레오타이드로 구성된다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR간 서열은 종점을 포함하는 1개 내지 1000개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ITR간 서열은 종점을 포함하는 1개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200개 내지 250개의 뉴클레오타이드, 250개 내지 300개의 뉴클레오타이드, 300개 내지 350개의 뉴클레오타이드, 350개 내지 400개의 뉴클레오타이드, 400개 내지 450개의 뉴클레오타이드, 450개 내지 500개의 뉴클레오타이드, 500개 내지 550개의 뉴클레오타이드, 550개 내지 600개의 뉴클레오타이드, 600개 내지 650개의 뉴클레오타이드, 650개 내지 700개의 뉴클레오타이드, 700개 내지 750개의 뉴클레오타이드, 750개 내지 800개의 뉴클레오타이드, 800개 내지 850개의 뉴클레오타이드, 850개 내지 900개의 뉴클레오타이드, 900개 내지 950개의 뉴클레오타이드, 또는 950개 내지 1000개의 뉴클레오타이드로 구성된다.
본 개시의 짧은 나노트랜스포존(SNT)을 포함하는 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR간 서열은 종점을 포함하는 1개 내지 200개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, ITR간 서열은 종점을 포함하는 1개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개 내지 90개의 뉴클레오타이드, 또는 90개 내지 100개의 뉴클레오타이드로 구성된다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 종점을 포함하는 1개 내지 200개의 뉴클레오타이드를 가진 선택 마커는 수크로스 선택 마커를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수크로스 선택 마커를 코딩하는 서열은 RNA-OUT 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, RNA-OUT 서열을 코딩하는 서열은 137개의 염기쌍(bp)들을 포함하거나 이 염기쌍들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 종점을 포함하는 1개 내지 200개의 뉴클레오타이드를 가진 선택 마커는 형광 마커를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종점을 포함하는 1개 내지 200개의 뉴클레오타이드를 가진 선택 마커는 세포 표면 마커를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 종점을 포함하는 1개 내지 450개의 뉴클레오타이드를 가진 복제 기점을 코딩하는 서열은 mini 복제 기점을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종점을 포함하는 1개 내지 450개의 뉴클레오타이드를 가진 복제 기점을 코딩하는 서열은 R6K 복제 기점을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, R6K 복제 기점은 R6K 감마 복제 기점을 포함한다. 일부 실시양태에서, R6K 복제 기점은 R6K mini 복제 기점을 포함한다. 일부 실시양태에서, R6K 복제 기점은 R6K 감마 mini 복제 기점을 포함한다. 일부 실시양태에서, R6K 감마 mini 복제 기점은 281개의 염기쌍(bp)들을 포함하거나 이러한 염기쌍들로 구성된다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 골격을 코딩하는 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 라이게이션 부위 또는 이들의 조합을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 나노트랜스포존 및 골격을 코딩하는 서열 중 어느 것도 재조합 부위, 절제 부위, 라이게이션 부위 또는 이들의 조합의 생성물을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 나노트랜스포존 및 골격을 코딩하는 서열 중 어느 것도 재조합 부위, 절제 부위, 라이게이션 부위 또는 이들의 조합으로부터 유래하지 않는다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 재조합 부위는 재조합 이벤트로부터 비롯된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 부위는 재조합 이벤트의 생성물인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 재조합 이벤트는 재조합효소(예를 들면, 재조합효소 부위)의 활성을 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 골격을 코딩하는 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 추가로 포함하지 않는다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR간 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 라이게이션 부위 또는 이들의 조합을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, ITR간 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 라이게이션 부위 또는 이들의 조합의 생성물을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, ITR간 서열은 재조합 부위, 절제 부위, 라이게이션 부위 또는 이들의 조합으로부터 유래하지 않는다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR간 서열은 외래 DNA를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR내 서열은 인슐레이터를 코딩하는 적어도 하나의 서열, 및 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR내 서열은 인슐레이터를 코딩하는 제1 서열, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열, 및 인슐레이터를 코딩하는 제2 서열을 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR내 서열은 인슐레이터를 코딩하는 제1 서열, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열, 폴리아데노신(폴리A) 서열 및 인슐레이터를 코딩하는 제2 서열을 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR내 서열은 인슐레이터를 코딩하는 제1 서열, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열, 적어도 하나의 외생성 서열, 폴리아데노신(폴리A) 서열 및 인슐레이터를 코딩하는 제2 서열을 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열은 인간 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열은 항시성 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열은 유도성 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ITR내 서열은 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 제1 프로모터를 코딩하는 제1 서열, 및 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 제2 프로모터를 코딩하는 제2 서열을 포함하고, 이때 상기 제1 프로모터는 항시성 프로모터이고, 제2 프로모터는 유도성 프로모터이고, 제1 프로모터를 코딩하는 제1 서열 및 제2 프로모터를 코딩하는 제2 서열은 반대 방향으로 배향된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열은 세포 유형 또는 조직 유형 특이적 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포에서 외생성 서열을 발현시킬 수 있는 프로모터를 코딩하는 서열은 EF1a 프로모터를 코딩하는 서열, CMV 프로모터를 코딩하는 서열, MND 프로모터를 코딩하는 서열, SV40 프로모터를 코딩하는 서열, PGK1 프로모터를 코딩하는 서열, Ubc 프로모터를 코딩하는 서열, CAG 프로모터를 코딩하는 서열, H1 프로모터를 코딩하는 서열 또는 U6 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 폴리아데노신(폴리A) 서열은 바이러스 폴리A 서열로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 폴리아데노신(폴리A) 서열은 (SV40) 폴리A로부터 단리되거나 유래한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 외생성 서열은 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드는 상기 서열의 위치 36에서 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)을 포함한다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00202
Figure pct00203
(서열번호 14635)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00204
(서열번호 14636)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS(서열번호 14637)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 GGAGGAGGAGGATCC(서열번호 14638)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 상기 서열의 위치 87에서 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 상기 서열의 위치 282에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는
Figure pct00205
(서열번호 14639)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00206
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00207
일부 실시양태에서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00208
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 마커를 코딩하는 서열은 검출 마커를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 마커는 형광 마커 또는 세포 표면 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 마커를 코딩하는 서열은 분열 세포에서 활성을 나타내고 비-분열 세포에서 활성을 나타내지 않는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 마커를 코딩하는 서열은 대사 마커를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 마커를 코딩하는 서열은 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 뮤테인 효소를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, DHFR 뮤테인 효소는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 하기 아미노산 서열로 구성된다:
Figure pct00209
일부 실시양태에서, DHFR 뮤테인 효소는 하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00210
일부 실시양태에서, DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80, 113 또는 153 중 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80에서의 페닐알라닌(F) 또는 류신(L)의 치환, 위치 113에서의 류신(L) 또는 발린(V)의 치환, 및 위치 153에서의 발린(V) 또는 아스파르트산(D)의 치환 중 하나 이상의 치환을 포함한다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하고/하거나 상기 외생성 서열이 선택 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 상기 외생성 서열은 비-천연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열, 및/또는 치료 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 항원 수용체는 T 세포 수용체(TCR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR을 코딩하는 서열은 상응하는 야생형 서열에 비해 삽입, 결실, 치환, 역위, 전위 또는 프레임시프트 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR을 코딩하는 서열은 키메라 또는 재조합 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR은 (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 (a)의 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR의 (a)의 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 CD28 및/또는 4-1BB 보조자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원 인식 영역은 scFv, VHH, VH 및 센티린 중 하나 이상을 포함한다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하고/하거나 상기 외생성 서열이 선택 마커를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 상기 외생성 서열은 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다.
본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, ITR내 서열은 선택 마커를 코딩하는 서열, 외생성 서열, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 코딩하는 서열, 및 자가-절단 펩타이드를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가-절단 펩타이드를 코딩하는 적어도 하나의 서열은 (a) 선택 마커를 코딩하는 서열 및 외생성 서열, (b) 선택 마커를 코딩하는 서열 및 유도성 캐스파제 폴리펩타이드, 및 (c) 외생성 서열 및 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 중 하나 이상의 서열들 사이에 위치된다. 일부 실시양태에서, 자가-절단 펩타이드를 코딩하는 제1 서열은 선택 마커를 코딩하는 서열과 외생성 서열 사이에 위치되고, 자가-절단 펩타이드를 코딩하는 제2 서열은 외생성 서열과 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 사이에 위치된다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 선택 마커를 코딩하는 서열 및 외생성 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 piggyBac 트랜스포사제 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 piggyBac 트랜스포사제에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 piggyBac 유사 트랜스포사제에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 TTAA, TTAT 또는 TTAX 인식 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 TTAA, TTAT 또는 TTAX 인식 서열, 및 piggyBac 트랜스포사제 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제로부터 단리되거나 유래한 서열과 적어도 50% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 적어도 2개의 뉴클레오타이드(nts), 3개의 nts, 4개의 nts, 5개의 nts, 6개의 nts, 7개의 nts, 8개의 nts, 9개의 nts, 10개의 nts, 11개의 nts, 12개의 nts, 13개의 nts, 14개의 nts, 15개의 nts, 16개의 nts, 17개의 nts, 18개의 nts, 19개의 nts 또는 20개의 nts를 포함한다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 선택 마커를 코딩하는 서열 및 외생성 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 piggyBac 트랜스포사제 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 서열 CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG(서열번호 17096), 또는 서열 CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG(서열번호 17096)과 적어도 70% 동일한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 서열 CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATG(서열번호 17097)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 서열 CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG(서열번호 17096)을 포함하고 서열 CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATG(서열번호 17097)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 서열 CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG(서열번호 17096)을 포함하고 서열 CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATG(서열번호 17098)을 포함하다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 서열 CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG(서열번호 17096)을 포함하고 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00211
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 선택 마커를 코딩하는 서열 및 외생성 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 piggyBac 트랜스포사제 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 하기 아미노산 서열과 적어도 20% 동일한 아미노산 서열을 가진 piggyBac 트랜스포사제에 의해 인식된다:
Figure pct00212
일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 하기 아미노산 서열을 가진 piggyBac 트랜스포사제에 의해 인식된다:
Figure pct00213
일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 하기 아미노산 서열과 적어도 20% 동일한 아미노산 서열을 가진 piggyBac 트랜스포사제에 의해 인식된다:
Figure pct00214
일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 하기 아미노산 서열을 가진 piggyBac 트랜스포사제에 의해 인식된다:
Figure pct00215
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 선택 마커를 코딩하는 서열 및 외생성 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 슬립핑 뷰티 트랜스포사제에 의해 인식된다. 일부 실시양태에서, 슬립핑 뷰티 트랜스포사제는 과활성 슬립핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)이다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 선택 마커를 코딩하는 서열 및 외생성 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 헬리트론 트랜스포사제에 의해 인식된다.
적어도 하나의 외생성 서열이 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 선택 마커를 코딩하는 서열 및 외생성 서열 중 하나 이상을 포함하는 것인 실시양태를 비롯한, 본 개시의 나노트랜스포존의 일부 실시양태에서, 제1 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열 또는 제2 역위 말단 반복부(ITR)를 코딩하는 서열은 Tol2 트랜스포사제에 의해 인식된다.
본 개시는 본 개시의 나노트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 트랜스포사제 조성물을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제 조성물은 나노트랜스포존의 제1 ITR 또는 제2 ITR을 인식할 수 있는 트랜스포사제 또는 이 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 트랜스포사제 조성물은 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 나노트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 외생성 서열을 포함하는 제1 나노트랜스포존 및 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 제2 나노트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 동종이계 세포이다.
본 개시는 본 개시의 나노트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 본 개시의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 본 개시의 나노트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 동종이계 세포이다.
본 개시는 본 개시의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 본 개시의 나노트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 추가로 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 자가 세포이다.
본 개시는 복수의 본 개시의 세포들을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 복수의 세포들 중 적어도 하나의 세포는 본 개시의 나노트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 복수의 세포들 중 일부는 본 개시의 나노트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 일부는 상기 복수의 세포들의 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 임의의 중간치 퍼센트를 차지한다. 일부 실시양태에서, 상기 복수의 세포들 중 각각의 세포는 본 개시의 나노트랜스포존을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 복수의 세포들은 본 개시의 변형된 세포를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 복수의 세포들 중 적어도 하나의 세포는 추가로 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 복수의 세포들 중 어느 세포도 추가로 변형되지 않는다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포들은 동종이계 세포들이다. 일부 실시양태에서, 동종이계 복수의 세포들은 본 개시의 방법에 따라 생성된다. 일부 실시양태에서, 복수의 세포들은 자가 세포들이다. 일부 실시양태에서, 자가 복수의 세포들은 본 개시의 방법에 따라 생성된다.
본 개시는 (a) 본 개시의 나노트랜스포존; (b) 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열; 및 세포가 T 세포인 경우, (c) T 세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내생성 서열의 변형을 포함하는 변형된 세포로서, 변형이 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소시키거나 제거하는 것인 변형된 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 (d) HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 쇄 E(HLA-E)를 포함하는 비-천연 발생 서열, 및 (e) 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내생성 서열의 변형을 추가로 포함하고, 이때 상기 변형은 주조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소시키거나 제거한다.
본 개시는 (a) 본 개시의 나노트랜스포존; (b) 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열; (c) HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 쇄 E(HLA-E)를 포함하는 비-천연 발생 서열; 및 (e) 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내생성 서열의 변형을 포함하는 변형된 세포로서, 변형이 주조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소시키거나 제거하는 것인 변형된 세포를 제공한다.
본 개시의 변형된 세포의 일부 실시양태에서, HLA-E를 포함하는 비-천연 발생 서열은 B2M 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-E를 포함하는 비-천연 발생 서열은 B2M 폴리펩타이드를 코딩하는 서열과 HLA-E를 코딩하는 서열 사이에 위치된 링커를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-E를 포함하는 비-천연 발생 서열은 펩타이드를 코딩하는 서열 및 B2M 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, HLA-E를 포함하는 비-천연 발생 서열은 B2M 신호 펩타이드를 코딩하는 서열과 펩타이드를 코딩하는 서열 사이에 위치된 제1 링커, 및 B2M 폴리펩타이드를 코딩하는 서열과 HLA-E를 코딩하는 서열 사이에 위치된 제2 링커를 추가로 포함한다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포이다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 분화된 세포이다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 체세포이다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포 또는 면역 세포 전구체이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 림프 조상 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 사이토카인 유도된 킬러(CIK) 세포, T 림프구(T 세포), B 림프구(B 세포) 또는 항원 제시 세포(APC)이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포, 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(Tscm) 또는 중심 기억 T 세포 (Tcm)이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 전구체는 조혈 줄기 세포(HSC)이다. 일부 실시양태에서, 세포는 항원 제시 세포(APC)이다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 유전자 편집 조성물을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 조성물은 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열 및 핵산분해효소 단백질 또는 이의 핵산분해효소 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 조성물은 핵산분해효소 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 핵산분해효소 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산분해효소 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 핵산분해효소 도메인을 코딩하는 서열은 DNA 서열, RNA 서열 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산분해효소 단백질 또는 이의 핵산분해효소 도메인은 CRISPR/Cas 단백질, 전사 활성화제 유사 이펙터 핵산분해효소(TALEN), 징크 핑거 핵산분해효소(ZFN) 및 핵산내부분해효소 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR/Cas 단백질은 핵산분해효소-불활성화된 Cas(dCas) 단백질을 포함한다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 유전자 편집 조성물을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 조성물은 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열 및 핵산분해효소 단백질 또는 이의 핵산분해효소 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산분해효소 또는 이의 핵산분해효소 도메인은 핵산분해효소-불활성화된 Cas(dCas) 단백질 및 핵산내부분해효소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산내부분해효소는 Clo051 핵산분해효소 또는 이의 핵산분해효소 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 조성물은 융합 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 핵산분해효소-불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 및 Clo051 핵산분해효소 또는 Clo051 핵산분해효소 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 편집 조성물은 가이드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열은 RNA 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 아미노산 서열:
Figure pct00216
하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 핵산:
Figure pct00217
Figure pct00218
Figure pct00219
을 포함하거나 이러한 아미노산 서열 또는 핵산으로 구성된다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 하기 아미노산 서열:
Figure pct00220
Figure pct00221
하기 서열을 포함하거나 하기 서열로 구성된 핵산:
Figure pct00222
Figure pct00223
을 포함하거나 이러한 아미노산 서열 또는 핵산으로 구성된다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 나노트랜스포존은 가이드 서열, 및 불활성화된 Cas9(dCas9)를 코딩하는 서열 및 Clo051 핵산분해효소 또는 이의 핵산분해효소 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 유전자 편집 조성물을 포함한다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 유전자 편집 조성물을 일시적으로 발현한다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이고, 가이드 RNA는 내생성 TCR을 코딩하는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 B2M 폴리펩타이드를 코딩하는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, 가이드 RNA는 게놈 DNA 서열의 안전 피난처 부위 내의 표적 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
본 개시의 세포, 비변형된 세포 및 변형된 세포의 일부 실시양태에서, Clo051 핵산분해효소 또는 이의 핵산분해효소 도메인은 표적 서열에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도한다. 일부 실시양태에서, 공여 서열, 공여 플라스미드 또는 공여 나노트랜스포존 ITR내 서열은 단일 또는 이중 가닥 절단의 위치 및/또는 표적 서열 내의 세포 복구의 위치에서 통합된다.
본 개시는 본 개시에 따른 변형된 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
본 개시는 본 개시에 따른 복수의 변형된 세포들을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
본 개시는 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 본 개시의 조성물을 제공한다.
본 개시는 질환 또는 장애의 치료를 위한 본 개시의 조성물의 용도를 제공한다.
본 개시는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 본 개시의 조성물을, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 조성물의 투여 후 이식편 대 숙주(GvH) 및/또는 숙주 대 이식편(HvG)을 발생시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 투여는 전신 투여이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내 경로에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 정맥내 주사 또는 정맥내 주입에 의해 투여된다.
본 개시는 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 본 개시의 조성물을, 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 대상체는 조성물의 투여 후 이식편 대 숙주(GvH) 및/또는 숙주 대 이식편(HvG)을 발생시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 투여는 국소 투여이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 경로, 척추내 경로, 뇌실내 경로, 안구내 경로 또는 골내 경로에 의해 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 종양내 주사 또는 주입, 척추내 주사 또는 주입, 뇌실내 주사 또는 주입, 안구내 주사 또는 주입, 또는 골내 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
본 개시의 질환 또는 장애를 치료하는 방법의 일부 실시양태에서, 치료 유효 용량은 단일 용량이고, 조성물의 동종이계 세포는 질환 또는 장애를 치료하기에 충분한 시간 동안 생착하고/하거나 존속한다. 일부 실시양태에서, 단일 용량은 동시에 제조되는 적어도 2회, 5회, 10회, 15회, 20회, 25회, 30회, 35회, 40회, 45회, 50회, 55회, 60회, 65회, 70회, 75회, 80회, 85회, 90회, 95회, 100회 또는 임의의 중간치 수의 용량 중 적어도 하나이다.
벡터 및 숙주 세포
본 개시는 본 개시의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터에 의해 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 당분야에서 잘 공지된 재조합 기법에 의한 적어도 하나의 센티린 또는 CARTyrin의 생성에 관한 것이기도 하다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 각각 포함된 상기 문헌[Sambrook] 및 상기 문헌[Ausubel]을 참조한다.
예를 들면, PB-EF1a 벡터가 사용될 수 있다. 상기 벡터는 하기 뉴클레오타이드 서열을 포함한다:
Figure pct00224
Figure pct00225
폴리뉴클레오타이드는 임의적으로 숙주에서 확장되기 위해 선택 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예컨대, 인산칼슘 침전물, 또는 하전된 지질을 가진 복합체 내로 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 상기 벡터는 적절한 팩키징 세포주를 사용함으로써 시험관내에서 팩키징된 후 숙주 세포 내로 형질도입될 수 있다.
DNA 삽입체는 적절한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어야 한다. 발현 구축물은 전사 개시 및 종결을 위한 부위, 및 전사된 영역 내의 번역용 리보좀 결합 부위를 추가로 함유할 것이다. 상기 구축물에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 시작 부위의 번역 개시 코돈, 및 번역될 mRNA의 말단에 적절하게 위치된 종결 코돈(예를 들면, UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 것이고, 이때 UAA 및 UAG가 포유동물 또는 진핵생물 세포 발현을 위해 바람직하다.
발현 벡터는 바람직하게는, 그러나 임의적으로 적어도 하나의 선택 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커는 예를 들면, 앰피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 마이코페놀산 또는 글루타민 신테타제(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 및 제5,827,739호), 블라스티시딘(blasticidin)(bsd 유전자), 진핵생물 세포 배양을 위한 내성 유전자뿐만 아니라, 앰피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리쓰로마이신, 폴리믹신 B, 또는 이. 콜라이 및 다른 세균 또는 원핵생물에서의 배양을 위한 테트라사이클린 내성 유전자도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다(상기 특허들은 전체적으로 본원에 참고로 포함됨). 전술된 숙주 세포에 적합한 배양 배지 및 조건은 당분야에서 공지되어 있다. 적합한 벡터는 숙련된 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 숙주 세포 내로의 벡터 구축물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 당분야, 예컨대, 상기 문헌[Sambrook]의 제1장 내지 제4장 및 제16장 내지 제18장; 상기 문헌[Ausubel]의 제1장, 제9장, 제13장, 제15장 및 제16장에 기재되어 있다.
발현 벡터는 바람직하게는, 그러나 임의적으로 본 개시의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선택 세포 표면 마커를 포함할 것이다. 본 개시의 선택 세포 표면 마커는 표면 단백질, 당단백질, 또는 세포 또는 세포의 서브세트를 세포의 또 다른 한정된 서브세트와 구별하는 일군의 단백질들을 포함한다. 바람직하게는, 선택 세포 표면 마커는 본 개시의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를, 본 개시의 조성물 또는 방법에 의해 비변형된 세포와 구별한다. 이러한 세포 표면 마커는 예를 들면, "지정의 클러스터" 또는 "분류 결정인자" 단백질(종종 "CD"로서 약칭됨), 예컨대, 단축형 또는 전체 길이 형태의 CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 세포 표면 마커는 자살 유전자 마커 RQR8(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87)을 추가로 포함한다.
발현 벡터는 바람직하게는, 그러나 임의적으로 본 개시의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선택 약물 내성 마커를 포함할 것이다. 본 개시의 선택 약물 내성 마커는 야생형 또는 돌연변이체 Neo, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 적어도 하나의 센티린 또는 CARTyrin은 변형된 형태, 예컨대, 융합 단백질로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라 추가 이종 작용 영역도 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역을 CARTyrin의 N-말단에 추가하여, 정제 동안 또는 후속 취급 및 저장 동안 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 개선할 수 있다. 또한, 펩타이드 모이어티를 본 개시의 CARTyrin에 추가하여 정제를 용이하게 할 수 있다. 이러한 영역은 CARTyrin 또는 이의 적어도 하나의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼들, 예컨대, 상기 문헌[Sambrook]의 제17.29장 내지 제17.42장 및 제18.1장 내지 제18.74장; 및 상기 문헌[Ausubel]의 제16장, 제17장 및 제18장에 기재되어 있다.
당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 개시의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 위해 사용될 수 있는 다수의 발현 시스템들을 잘 알고 있다. 대안적으로, 본 개시의 핵산은 본 개시의 센티린 또는 CARTyrin을 코딩하는 내생성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 (조작에 의해) 껴짐으로써 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호 및 제5,733,761호에 기재되어 있는 바와 같이 당분야에서 잘 공지되어 있다.
CARTyrin, 이의 특정된 부분 또는 변이체의 생성에 유용한 예시적 세포 배양물은 당분야에서 공지된 세균, 효모 및 포유동물 세포이다. 포유동물 세포 시스템은 종종 세포의 단층의 형태로 존재할 것이지만, 포유동물 세포 현탁액 또는 생물반응기도 사용될 수 있다. 온전한 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주들은 당분야에서 개발되었고, 예를 들면, 버지니아주 마나사스 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(www.atcc.org)으로부터 용이하게 입수될 수 있는 COS-1(예를 들면, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들면, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들면, ATCC CRL-10), CHO(예를 들면, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들면, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 림프 유래 세포, 예컨대, 골수종 및 림프종 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 수탁번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 수탁번호 CRL-1851)이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.
이 세포들을 위한 발현 벡터는 하기 발현 조절 서열들, 예컨대, 복제 기점; 프로모터(예를 들면, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호 및 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 프로모터; 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예컨대, 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들면, SV40 큰 T Ag 폴리A 추가 부위); 및 전사 터미네이터 서열(그러나, 이들로 제한되지 않음) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌[Ausubel et al.]; 및 상기 문헌[]Sambrook, et al.을 참조한다. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 생성에 유용한 다른 세포는 예를 들면, 세포주 및 하이브리도마의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 카탈로그, 또는 다른 공지된 또는 상업적 공급원으로부터 공지되어 있고/있거나 입수될 수 있다.
진핵생물 숙주 세포가 사용될 때, 폴리아데닐화 또는 전사 터미네이터 서열이 전형적으로 벡터 내에 포함된다. 터미네이터 서열의 일례는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 일례는 SV40으로부터의 VP1 인트론이다(Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). 추가로, 당분야에서 공지된 바와 같이, 숙주 세포에서 복제를 조절하는 유전자 서열이 벡터 내에 포함될 수 있다.
CARTyrin의 정제
센티린 또는 CARTyrin은 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 잘 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되고 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")도 정제를 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 각각 참고로 포함된 문헌[Colligan, Current Protocols in Immunology], 또는 문헌[Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)], 예를 들면, 제1장, 제4장, 제6장, 제8장, 제9장 및 제10장을 참조한다.
본 개시의 센티린 또는 CARTyrin은 정제된 생성물, 화학적 합성 절차의 생성물, 및 예를 들면, 이. 콜라이, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 비롯한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주로부터 재조합 기법에 의해 생성된 생성물을 포함한다. 재조합 생성 절차에서 사용된 숙주에 따라, 본 개시의 CARTyrin은 글리코실화될 수 있거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼들, 예컨대, 모두 전체적으로 본원에 참고로 포함된 상기 문헌[Sambrook]의 단락 17.37 내지 17.42; 상기 문헌[Ausubel]의 제10장, 제12장, 제13장, 제16장, 제18장 및 제20장; 및 상기 문헌[Colligan, Protein Science]의 제12장 내지 제14장에 기재되어 있다.
아미노산 코드
본 개시의 CARTyrin을 구성하는 아미노산은 종종 약칭된다. 아미노산 표기는 당분야에서 잘 이해되는 바와 같이 아미노산을 그의 단일 문자 코드, 그의 세 문자 코드, 명칭, 또는 3개 뉴클레오타이드 코돈(들)으로 표기함으로써 표시될 수 있다(문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994) 참조). 본 개시의 CARTyrin은 본원에 특정된 바와 같이 자연발생적 또는 돌연변이 및/또는 인간 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 포함할 수 있다. 작용을 위해 필수적인, 본 개시의 CARTyrin의 아미노산은 당분야에서 공지된 방법, 예컨대, 부위 지정 돌연변이유발 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 확인될 수 있다(예를 들면, 상기 문헌[Ausubel], 제8장 및 제15장; 문헌[Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]). 후자 절차인 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 분자의 모든 잔기에서 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그 다음, 생물학적 활성, 예컨대, 적어도 하나의 중화 활성(그러나, 이것으로 제한되지 않음)에 대해 생성된 돌연변이체 분자를 시험한다. CARTyrin 결합에 결정적인 부위도 구조 분석, 예컨대, 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화성 표지부착에 의해 확인될 수 있다(문헌[Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 문헌[de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)]).
숙련된 자가 인식할 바와 같이, 본 발명은 적어도 하나의 본 개시의 생물학적 활성 CARTyrin을 포함한다. 생물학적 활성 CARTyrin은 천연(비-합성), 내생성 또는 관련 공지된 CARTyrin의 비활성의 적어도 20%, 30% 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90% 또는 95% 내지 99% 이상의 비활성을 가진다. 효소 활성 및 기질 특이성의 측정치를 어세이하고 정량하는 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 유기 모이어티의 공유 부착에 의해 변형된, 본원에 기재된 센티린 및 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 개선된 약동학적 성질(예를 들면, 증가된 생체내 혈청 반감기)를 가진 CARTyrin 단편을 생성할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지된 친수성 중합체 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 친수성 중합체 기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고 폴리알칸 글리콜(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 기는 약 8개 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 개시의 변형된 CARTyrin 및 단편은 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 공유결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 개시의 CARTyrin 또는 이의 단편에 결합된 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노카르복실산 및 디카르복실산을 포괄한다. 본원에서 사용된 용어 "친수성 중합체 기"는 옥탄보다 물에서 더 잘 용해될 수 있는 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들면, 폴리라이신은 옥탄보다 물에서 더 잘 용해될 수 있다. 따라서, 폴리라이신의 공유부착에 의해 변형된 센티린 또는 CARTyrin은 본 개시에 의해 포괄된다. 본 개시의 센티린 또는 CARTyrin을 변형시키기에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지된 친수성 중합체일 수 있고, 예를 들면, 폴리알칸 글리콜(예를 들면, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물(예를 들면, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 등), 친수성 아미노산의 중합체(예를 들면, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 산화물(예를 들면, 폴리에틸렌 산화물, 폴리프로필렌 산화물 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는 본 개시의 CARTyrin을 변형시키는 친수성 중합체는 별개의 분자 독립체로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 가진다. 예를 들면, 숫자가 달톤 단위의 중합체 평균 분자량인 PEG5000 및 PEG20,000이 사용될 수 있다. 친수성 중합체 기는 1개 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환된 친수성 중합체는 적합한 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 아민 기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예를 들면, N,N-카르보닐 디이미다졸에 의해 활성화됨)는 중합체 상의 하이드록실 기에 커플링될 수 있다.
본 개시의 CARTyrin을 변형시키는 데 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 유닛을 함유할 수 있다. 본 개시의 CARTyrin을 변형시키는 데 적합한 지방산은 예를 들면, n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 올 시스(all cis)-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄디오산, 테트라데칸디오산, 옥타데칸디오산, 도코산디오산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지된 저급 알킬 기를 포함하는 디카르복실산의 모노에스테르를 포함한다. 저급 알킬 기는 1개 내지 약 12개, 바람직하게는 1개 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
변형된 CARTyrin 및 단편은 적합한 방법을 이용함으로써, 예컨대, 하나 이상의 변형제와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "변형제"는 활성화 기를 포함하는 적합한 유기 기(예를 들면, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 지칭한다. "활성화 기"는 적절한 조건 하에서 제2 화학적 기와 반응함으로써, 변형제와 제2 화학적 기 사이의 공유결합을 형성할 수 있는 화학적 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들면, 아민 반응성 활성화 기는 친전자성 기, 예컨대, 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 요오도), N-하이드록시석신이미딜 에스테르(NHS) 등을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 기는 예를 들면, 말레이미드, 요오도아세틸, 아크릴로일, 피리딜 디설파이드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등을 포함한다. 알데하이드 작용기는 아민 또는 하이드라자이드 함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드 기는 3가 인 기와 반응하여 포스포르아미데이트 또는 포스포르이미드 결합을 형성할 수 있다. 활성화 기를 분자 내로 도입하는 적합한 방법은 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)) 참조). 활성화 기는 유기 기(예를 들면, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접적으로, 또는 링커 모이어티, 예를 들면, 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로원자, 예컨대, 산소, 질소 또는 황으로 대체될 수 있는 2가 C1-C12 기를 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 모이어티는 예를 들면, 테타르에틸렌 글리콜, -(CH2)3-, -NH-(CH2)6-NH-, -(CH2)2-NH- 및 -CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-를 포함한다. 링커 모이어티를 포함하는 변형제는 예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)의 존재 하에서 모노-Boc-알킬디아민(예를 들면, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카르복실레이트 사이의 아미드 결합을 형성함으로써 생성될 수 있다. Boc 보호기는 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용한 처리에 의해 제거되어, 본원에 기재된 바와 같이 또 다른 카르복실레이트에 커플링될 수 있거나 말레산 무수물과 반응할 수 있는 일차 아민을 노출시킬 수 있고, 그 결과 생성물은 고리화되어 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생성할 수 있다(예를 들면, 전체 교시가 본원에 참고로 포함된 문헌[Thompson, et al., WO 92/16221] 참조).
본 개시의 변형된 CARTyrin 및 단편은 CARTyrin 단백질 또는 단편을 변형제와 반응시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 유기 모이어티는 아민 반응성 변형제, 예를 들면, PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 비-부위 특이적 방식으로 CARTyrin 단백질에 결합될 수 있다. 본 개시의 CARTyrin의 특정 부위에 결합되는 유기 모이어티를 포함하는 변형된 CARTyrin 단백질 및 단편은 적합한 방법, 예컨대, 역 단백질용해(문헌[Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992)]; 문헌[Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994)]; 문헌[Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997)]; 문헌[Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996)]; 문헌[Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)]); 및 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)]에 기재된 방법을 이용함으로서 제조될 수 있다.
추가 치료적 활성 성분을 포함하는 CARTyrin 조성물
본 개시의 센티린 또는 CARTyrin 화합물, 조성물 또는 조합은 임의의 적합한 보조제, 예컨대, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친유성 용매, 보존제, 아쥬번트 등(그러나, 이들로 제한되지 않음) 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 보조제가 바람직하다. 이러한 멸균 용액의 비제한적 예 및 제조 방법은 당분야, 예컨대, 문헌[Gennaro, Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (Easton, Pa.) 1990](그러나, 이 문헌으로 제한되지 않음)에서 잘 공지되어 있다. 당분야에서 잘 공지되어 있거나 본원에 기재된 바와 같이 센티린 또는 CARTyrin, 단편 또는 변이체 조성물의 투여 방식, 가용성 및/또는 안정성에 적합한 약학적으로 허용 가능한 담체는 관용적으로 선택될 수 있다.
본 조성물에 유용한 약학 부형제 및 첨가제는 단독으로 또는 조합으로 1 내지 99.99 중량% 또는 부피%를 차지하는, 단독으로 또는 조합으로 존재할 수 있는 단백질, 펩타이드, 아미노산, 지질 및 탄수화물(예를 들면, 모노사카라이드, 디사카라이드, 테트라사카라이드 및 올리고사카라이드; 유도체화된 당, 예컨대, 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 당 등; 및 폴리사카라이드 또는 당 중합체)을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 단백질 부형제는 혈청 알부민, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함한다. 완충 성능에 있어서도 작용할 수 있는 대표적 아미노산/단백질 성분은 알라닌, 글리신, 아르기닌, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 류신, 이소류신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파르탐 등을 포함한다. 한 바람직한 아미노산은 글리신이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 탄수화물 부형제는 예를 들면, 모노사카라이드, 예컨대, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 디사카라이드, 예컨대, 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 폴리사카라이드, 예컨대, 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예컨대, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨(글루시톨), 미요이노시톨 등을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 바람직한 탄수화물 부형제는 만니톨, 트레할로스 및 라피노스이다.
CARTyrin 조성물은 완충제 또는 pH 조절제도 포함할 수 있고; 전형적으로, 완충제는 유기 산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적 완충제는 유기 산 염, 예컨대, 구연산, 아스코르브산, 글루콘산, 탄산, 주석산, 석신산, 아세트산 또는 프탈산의 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드, 또는 인산염 완충제를 포함한다. 본 조성물에서 사용하기에 바람직한 완충제는 유기 산 염, 예컨대, 구연산염이다.
추가로, 본 발명의 CARTyrin 조성물은 중합체 부형제/첨가제, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(중합체 당), 덱스트레이트(예를 들면, 사이클로덱스트린, 예컨대, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 풍미제, 항균제, 감미제, 항산화제, 대전방지제, 계면활성제(예를 들면, 폴리소르베이트, 예컨대, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80"), 지질(예를 들면, 인지질, 지방산), 스테로이드(예를 들면, 콜레스테롤), 및 킬레이팅제(예를 들면, EDTA)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 센티린 또는 CARTyrin, 부분 또는 변이체 조성물에서 사용하기에 적합한 이들 공지된 약학 부형제들 및/또는 첨가제들, 및 추가 공지된 약학 부형제들 및/또는 첨가제들은 예를 들면, 개시가 전체적으로 본원에 참고로 포함된 문헌["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995)] 및 문헌["Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998)]에 나열된 바와 같이 당분야에서 공지되어 있다. 바람직한 담체 또는 부형제 물질은 탄수화물(예를 들면, 사카라이드 및 알디톨) 및 완충제(예를 들면, 구연산염) 또는 중합체 물질이다. 예시적 담체 분자는 관절내 전달에 유용할 수 있는 뮤코폴리사카라이드인 히알루론산이다.
백혈구성분채집술 생성물로부터의 T 세포 단리
백혈구성분채집술 생성물 또는 혈액은 폐쇄된 시스템 및 표준 방법(예를 들면, COBE 스펙트라 성분채집술 시스템)을 이용함으로써 임상 장소에서 대상체로부터 수집될 수 있다. 바람직하게는, 상기 생성물은 표준 병원 또는 기관 백혈구성분채집술 절차에 따라 표준 백혈구성분채집술 수집 백 내에 수집된다. 예를 들면, 본 개시의 방법의 바람직한 실시양태에서, 백혈구성분채집술 동안 통상적으로 사용되는 항응고제 또는 혈액 첨가제 이외의 추가 항응고제 또는 혈액 첨가제(헤파린 등)는 포함되지 않는다.
대안적으로, 백혈구 세포(WBC)/말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(바이오세이프 세팍스(Biosafe Sepax) 2(폐쇄/자동화됨)를 이용함) 또는 T 세포(CliniMACS® 프로디지(Prodigy)(폐쇄/자동화됨)를 이용함)는 전혈로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 그러나, 일부 대상체들(예를 들면, 암으로 진단되고/되거나 암 치료를 받은 대상체들)에서, WBC/PBMC 수율은 백혈구성분채집술에 의해 단리된 때보다 전혈로부터 단리된 때 유의미하게 더 낮을 수 있다.
백혈구성분채집술 절차 및/또는 직접적인 세포 단리 절차 중 어느 하나가 본 개시의 임의의 대상체를 위해 이용될 수 있다.
백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 절연된 용기 내에 채워 넣어져야 하고 임상 프로토콜과 함께 사용되도록 승인된 표준 병원 기관 혈액 수집 절차에 따라 조절된 실온(+19℃ 내지 +25℃)에서 보관되어야 한다. 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 냉장되지 않아야 한다.
백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 세포 농도는 수송 동안 ㎖당 0.2x109개 세포를 초과하지 않아야 한다. 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 강력한 혼합은 피해져야 한다.
백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 예를 들면, 하룻밤 동안 저장되어야 하는 경우, 조절된 실온(전술된 바와 동일한 온도)에서 보관되어야 한다. 저장 동안, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 농도는 ㎖당 0.2x109개 세포를 초과하지 않아야 한다.
바람직하게는, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 세포는 자가 혈장에 저장되어야 한다. 일부 실시양태에서, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 세포 농도가 ㎖당 0.2x109개 세포보다 더 높은 경우, 상기 생성물은 자가 혈장에 의해 희석되어야 한다.
바람직하게는, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 표지부착 및 분리 절차를 시작할 때 24시간보다 더 오래되지 않아야 한다. 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 폐쇄되고/되거나 자동화된 시스템(예를 들면, CliniMACS 프로디지)을 이용함으로써 세포 표지부착을 위해 프로세싱될 수 있고/있거나 준비될 수 있다.
자동화된 시스템은 가능하게는 피콜레이션(ficolation)에 의한 추가 버피 코트 단리, 및/또는 세포 생성물(예를 들면, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물)의 세척을 수행할 수 있다.
폐쇄되고/되거나 자동화된 시스템은 (예를 들면, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물로부터의) T 세포 단리를 위해 세포를 준비하고 표지부착시키는 데 이용될 수 있다.
WBC/PBMC가 직접적으로 뉴클레오펙션될 수 있을지라도(더 용이하고 추가 단계를 피하게 함), 본 개시의 방법은 뉴클레오펙션 전에 먼저 T 세포를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 더 용이한 전략인 PBMC의 직접적인 뉴클레오펙션은 T 세포를 작용적으로 소진되게 만듦으로써 생성물의 생체내 효율을 직접적으로 감소시키는 좋지 않은 확장 방법임을 그 자체로 입증하는, CARTyrin 신호전달을 통해 매개되는 CARTyrin+ 세포의 선택적 확장을 요구한다. 생성물은 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 CARTyrin+ 세포의 불균질한 조성물일 수 있고, 이 점은 환자와 환자 사이의 생성물의 가변성을 증가시키고 투약 및 CRS 관리를 더 어렵게 만든다. T 세포가 종양 억제 및 사멸에 있어서 일차 이펙터인 것으로 생각되기 때문에, 자가 생성물의 제조를 위한 T 세포 단리는 다른 더 불균질한 조성물에 비해 상당한 이점을 야기할 수 있다.
T 세포는 일방향 표지부착 절차에서 표지부착된 세포의 농축 또는 표지부착된 세포의 고갈에 의해 직접적으로 단리될 수 있거나, 2-단계 표지부착 절차에서 간접적으로 단리될 수 있다. 본 개시의 일부 농축 전략에 따라, T 세포는 세포 수집 백 내에 수집될 수 있고, 표지부착되지 않은 세포(비-표적 세포)는 음성 분획 백 내에 수집될 수 있다. 본 개시의 농축 전략과 대조적으로, 표지부착되지 않은 세포(표적 세포)는 세포 수집 백 내에 수집되고, 표지부착된 세포(비-표적 세포)는 음성 분획 백 또는 비-표적 세포 백 내에 수집된다. 선택 물질은 항체-코팅된 비드를 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되지 않는다. 항체-코팅된 비드는 변형 및/또는 확장 단계 전에 제거될 수 있거나, 변형 및/또는 확장 단계 전에 세포 상에 보유될 수 있다. 세포 마커의 하기 비제한적 예들 중 하나 이상을 사용하여 T 세포를 단리할 수 있다: CD3, CD4, CD8, CD25, 항-바이오틴, CD1c, CD3/CD19, CD3/CD56, CD14, CD19, CD34, CD45RA, CD56, CD62L, CD133, CD137, CD271, CD304, IFN-감마, TCR 알파/베타, 및/또는 이들의 임의의 조합. T 세포를 단리하는 방법은 T 세포를 단리하는 데 사용될 수 있는 세포 마커의 하기 비제한적 예들 중 하나 이상의 세포 마커에 특이적으로 결합하고/하거나 이러한 세포 마커를 검출 가능하게 표지부착시키는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다: CD3, CD4, CD8, CD25, 항-바이오틴, CD1c, CD3/CD19, CD3/CD56, CD14, CD19, CD34, CD45RA, CD56, CD62L, CD133, CD137, CD271, CD304, IFN-감마, TCR 알파/베타, 및/또는 이들의 임의의 조합. 이 물질은 "우수 제조관리 기준"("GMP") 등급일 수 있거나 이러한 등급이 아닐 수 있다. 상기 물질은 써모(Thermo) DynaBead 및 밀테니이(Miltenyi) CliniMACS 제품을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 T 세포 단리 방법은 표지부착 및/또는 단리 단계의 다회 반복을 포함할 수 있다. 본 개시의 T 세포 단리 방법에 있어서 임의의 시점에서 원치 않는 세포 및/또는 원치 않는 세포 유형에 대한 양성 또는 음성 선택으로 본 개시의 T 세포 생성물 조성물로부터 원치 않는 세포 및/또는 원치 않는 세포 유형을 고갈시킬 수 있다. 본 개시의 T 세포 생성물 조성물은 CD4, CD8 및/또는 또 다른 T 세포 마커(들)를 발현할 수 있는 추가 세포 유형을 함유할 수 있다.
본 개시의 T 세포 뉴클레오펙션 방법은 예를 들면, 뉴클레오펙션 후 단리 단계 또는 TCR 신호전달을 통한 선택적 확장 단계를 포함하는, WBC/PBMC의 집단 또는 조성물 중의 T 세포를 뉴클레오펙션시키는 과정으로 T 세포 단리 단계를 제거할 수 있다.
일부 세포 집단들은 T 세포 농축 및/또는 분류 전 또는 후에 양성 또는 음성 선택에 의해 고갈될 수 있다. 세포 생성물 조성물로부터 고갈될 수 있는 세포 조성물의 예는 골수 세포, CD25+ 조절 T 세포(T Reg), 수지상 세포, 대식세포, 적혈구, 비만 세포, 감마-델타 T 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 천연 킬러(NK) 유사 세포(예를 들면, 사이토카인 유도된 킬러(CIK) 세포), 유도된 천연 킬러(iNK) T 세포, NK T 세포, B 세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 T 세포 생성물 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 단리 또는 선택 절차 동안 별개의 수집 백 내로 단리될 수 있다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 따로 추가 처리될 수 있거나, 특정 비로 재구성된(동일한 조성물로 조합된) 후 처리될 수 있다.
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 재구성될 수 있는 특정 비는 이용된 확장 기술의 유형 및 효능, 세포 배지, 및/또는 T 세포 생성물 조성물의 확장을 위해 사용된 성장 조건에 의해 좌우될 수 있다. 가능한 CD4+:CD8+ 비의 예는 50%:50%, 60%:40%, 40%:60%, 75%:25% 및 25%:75%를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
CD8+ T 세포는 강력한 종양 세포 사멸 능력을 나타내는 반면, CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포 증식 능력 및 작용을 뒷받침하는 데 요구되는 사이토카인들의 대부분을 제공한다. 정상 공여자로부터 단리된 T 세포는 주로 CD4+ T 세포이기 때문에, T 세포 생성물 조성물은 생체내에 존재할 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비를 개선하기 위해 CD4+:CD8+ 비에 대하여 시험관내에서 인위적으로 조절된다. 최적화된 비는 자가 T 세포 생성물 조성물의 생체외 확장을 위해 이용될 수도 있다. T 세포 생성물 조성물의 인위적으로 조절된 CD4+:CD8+ 비에 비추어 볼 때, 본 개시의 생성물 조성물은 임의의 내생적으로 생성된 T 세포 집단과 상당히 상이할 수 있고 이 집단보다 상당히 더 큰 장점을 제공할 수 있다.
바람직한 T 세포 단리 방법은 본래 그대로의 범 T 세포를 수득하기 위한 음성 선택 전략을 포함할 수 있는데, 이것은 생성된 T 세포 조성물이 내생적으로 생성된 변종/비의 T 세포를 함유하는, 조작되지 않은 T 세포를 포함한다는 것을 의미한다.
양성 또는 음성 선택을 위해 사용될 수 있는 물질은 자기 세포 분리 비드를 포함하나, 이것으로 제한되지 않는다. 자기 세포 분리 비드는 본 개시의 T 세포 단리 방법에서 다음 단계를 수행하기 전에 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 선택된 집단, 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다의 혼합된 집단으로부터 제거 또는 고갈될 수 있거나, 제거 또는 고갈되지 않을 수 있다.
T 세포 조성물 및 T 세포 생성물 조성물은 냉동보존, 표준 T 세포 배양 배지에서의 저장, 및/또는 유전자 변형을 위해 준비될 수 있다.
T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 높은 회수, 생존능, 표현형 및/또는 작용 능력을 가진 인간 세포를 저장하고 회수하도록 최적화된 표준 냉동보존 방법을 이용함으로써 냉동보존될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 냉동보존 배지 및/또는 프로토콜이 이용될 수 있다. 본 개시의 냉동보존 방법은 냉동 관련 독성을 감소시키는 DMSO 무함유 냉동보존제(예를 들면, CryoSOfree™ DMSO 무함유 냉동보존 배지)를 포함할 수 있다.
T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 배양 배지에 저장될 수 있다. 본 개시의 T 세포 배양 배지는 세포 저장, 세포 유전자 변형, 세포 표현형 및/또는 세포 확장을 위해 최적화될 수 있다. 본 개시의 T 세포 배양 배지는 하나 이상의 항생제를 포함할 수 있다. 세포 배양 배지 내로의 항생제의 포함이 뉴클레오펙션을 통한 유전자 변형 후 형질감염 효율 및/또는 세포 수율을 감소시킬 수 있기 때문에, 특정 항생제들(또는 이들의 조합) 및 이들 각각의 농도(들)는 뉴클레오펙션을 통한 유전자 변형 후 최적 형질감염 효율 및/또는 세포 수율을 위해 변경될 수 있다.
본 개시의 T 세포 배양 배지는 혈청을 포함할 수 있고, 게다가 혈청 조성 및 농도는 최적 세포 결과를 위해 변경될 수 있다. FBS/FCS는 본 개시의 T 세포 배양 배지에서 사용될 것으로 예상되지만 제노-단백질을 도입할 수 있기 때문에, 인간 AB 혈청이 T 세포의 배양에 있어서 FBS/FCS보다 선호된다. 혈청은 배양물 중의 T 세포 조성물을 투여받을 대상체의 혈액으로부터 단리될 수 있으므로, 본 개시의 T 세포 배양 배지는 자가 혈청을 포함할 수 있다. 무혈청 배지 또는 혈청 대용물도 본 개시의 T 세포 배양 배지에서 사용될 수 있다. 본 개시의 T 세포 배양 배지 및 방법의 일부 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 혈청 대용물은, 제노-혈청을 사용한 배지의 보충에 비해 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 더 건강한 세포라는 장점을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 장점을 제공할 수 있다.
T 세포 배양 배지는 상업적으로 입수 가능한 세포 성장 배지를 포함할 수 있다. 예시적 상업적으로 입수 가능한 세포 성장 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 유전자 변형을 위해 준비될 수 있다. 유전자 변형을 위한 T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분의 준비는 원하는 뉴클레오펙션 완충제를 사용한 세포 세척 및/또는 재현탁을 포함할 수 있다. 냉동보존된 T 세포 조성물은 해동될 수 있고 뉴클레오펙션에 의한 유전자 변형을 위해 준비될 수 있다. 냉동보존된 세포는 표준 또는 공지된 프로토콜에 따라 해동될 수 있다. 냉동보존된 세포의 해동 및 준비는, 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다. 예를 들면, 그리폴스 알부테인(Grifols Albutein)(25% 인간 알부민)은 해동 및/또는 준비 과정에서 사용될 수 있다.
자가 T 세포 생성물 조성물의 유전자 변형
T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 예를 들면, 뉴클레오펙션 전략, 예컨대, 전기천공을 이용함으로써 유전적으로 변형될 수 있다. 뉴클레오펙션될 세포의 총 수, 뉴클레오펙션 반응의 총 부피, 및 샘플의 준비의 정확한 시간은, 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다.
뉴클레오펙션 및/또는 전기천공은 예를 들면, 론자(Lonza) 아막사, 맥스사이트(MaxCyte) 펄스애자일(PulseAgile), 하바드 어패라터스(Apparatus) BTX 및/또는 인비트로겐(Invitrogen) 네온(Neon)을 이용함으로써 달성될 수 있다. 플라스틱 중합체 전극을 포함하나 이것으로 제한되지 않는 비-금속 전극 시스템이 뉴클레오펙션을 위해 바람직할 수 있다.
뉴클레오펙션에 의한 유전자 변형 전, T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 뉴클레오펙션 완충제에 재현탁될 수 있다. 본 개시의 뉴클레오펙션 완충제는 상업적으로 입수 가능한 뉴클레오펙션 완충제를 포함한다. 본 개시의 뉴클레오펙션 완충제는, 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다. 본 개시의 뉴클레오펙션 완충제는 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사 뉴클레오펙터, 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충제 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 뉴클레오펙션 완충제는, 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하기 위해 하나 이상의 보충 인자를 포함할 수 있다. 예시적 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 사이토카인, 케모카인 및 인터류킨은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 염, 광물 및 대사물질은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 석신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 배지, 예컨대, PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 아폽토시스 경로 또는 이들의 조합의 억제제들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 캐스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt 또는 Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 억제제(예를 들면, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/시키거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/시키거나, 핵 내로의 핵산의 용이해진 수송을 향상시키고/시키거나, 에피-염색체 핵산의 분해를 향상시키고/시키거나, DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 예시적 물질은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩타이드, TREX1 효소, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
트랜스포존 및 트랜스포사제를 비롯한 전위 물질은 세포를 (임의적으로 뉴클레오펙션 반응 바이알 또는 큐벳 내에 함유된) 뉴클레오펙션 완충제에 첨가하기 전에, 첨가함과 동시에 또는 첨가한 후에 본 개시의 뉴클레오펙션 반응에 첨가될 수 있다. 본 개시의 트랜스포존은 플라스미드 DNA, 선형화된 플라스미드 DNA, PCR 생성물, DOGGYBONE™ DNA, mRNA 주형, 단일 또는 이중 가닥 DNA, 단백질-핵산 조합 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시의 트랜스포존은 하나 이상의 TTAA 부위(들), 하나 이상의 역위 말단 반복부(ITR)(들), 하나 이상의 긴 말단 반복부(LTR)(들), 하나 이상의 인슐레이터(들), 하나 이상의 프로모터(들), 하나 이상의 전체 길이 또는 단축형 유전자(들), 하나 이상의 폴리A 신호(들), 하나 이상의 자가-절단 2A 펩타이드 절단 부위(들), 하나 이상의 내부 리보좀 진입 부위(들)(IRES), 하나 이상의 인핸서(들), 하나 이상의 조절제(들), 하나 이상의 복제 기점(들) 및 이들의 임의의 조합을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
본 개시의 트랜스포존은 하나 이상의 전체 길이 또는 단축형 유전자(들)을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 본 개시의 트랜스포존에 의해 도입된 전체 길이 및/또는 단축형 유전자(들)는 신호 펩타이드, CARTyrin, 항-PSMA CARTyrin, 센티린, PSMA 특이적 센티린, 힌지, 막횡단 도메인, 보조자극 도메인, 키메라 항원 수용체(CAR), 키메라 T 세포 수용체(CAR-T, CARTyrin 또는 항-PSMA CARTyrin), 수용체, 리간드, 사이토카인, 약물 내성 유전자, 종양 항원, 동종 또는 자가 항원, 효소, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 형광 단백질, 뮤테인 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 코딩할 수 있다.
본 개시의 트랜스포존은 물, TAE, TBE, PBS, HBSS, 배지, 본 개시의 보충 인자 또는 이들의 임의의 조합에서 제조될 수 있다.
본 개시의 트랜스포존은 임상 안전성을 최적화하고/하거나 제조 가능성을 개선하도록 디자인될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 개시의 트랜스포존은 불필요한 서열 또는 영역을 제거하고/하거나 비-항생제 선택 마커를 포함시킴으로써 임상 안전성을 최적화하고/하거나 제조 가능성을 개선하도록 디자인될 수 있다. 본 개시의 트랜스포존은 GMP 등급일 수 있거나 GMP 등급이 아닐 수 있다.
본 개시의 트랜스포사제는 플라스미드 DNA, mRNA, 단백질, 단백질-핵산 조합 또는 이들의 임의의 조합의 하나 이상의 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 개시의 트랜스포사제는 물, TAE, TBE, PBS, HBSS, 배지, 본 개시의 보충 인자 또는 이들의 임의의 조합에서 제조될 수 있다. 본 개시의 트랜스포사제 또는 이를 코딩하거나 전달하는 서열/구축물은 GMP 등급일 수 있거나 GMP 등급이 아닐 수 있다.
본 개시의 트랜스포존 및 트랜스포사제는 임의의 수단에 의해 세포에게 전달될 수 있다.
본 개시의 조성물 및 방법은 플라스미드 DNA(pDNA)로 본 개시의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 세포에게 전달하는 단계를 포함하지만, 전달을 위한 플라스미드의 사용은 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제가 세포의 염색체 내로 통합될 수 있게 함으로써, 연속된 트랜스포사제 발현을 유발할 수 있다. 따라서, 본 개시의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제는 임의의 염색체 통합 가능성을 제거하기 위해 mRNA 또는 단백질로서 세포에게 전달될 수 있다.
본 개시의 트랜스포존 및 트랜스포사제는 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 뉴클레오펙션 반응 내로 도입하기 전에 단독으로, 또는 서로 함께 미리 항온처리될 수 있다. 트랜스포존 및 트랜스포사제 각각의 절대적 양뿐만 아니라, 상대적 양, 예를 들면, 트랜스포존 대 트랜스포사제의 비도 최적화될 수 있다.
임의적으로 바이알 또는 큐벳 내에서의 뉴클레오펙션 반응의 준비 후, 반응물은 뉴클레오펙터 장치 내로 로딩될 수 있고 제조자의 프로토콜에 따라 전기 펄스의 전달을 위해 활성화될 수 있다. 본 개시의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제(또는 본 개시의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열)을 세포에게 전달하는 데 사용되는 전기 펄스 조건은 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 바람직한 세포 표현형 및/또는 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 가진 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다. 아막사 뉴클레오펙터 기술을 이용할 때, 아막사 2B 또는 4D 뉴클레오펙터를 위한 다양한 뉴클레오펙션 프로그램들 각각이 고려된다.
본 개시의 뉴클레오펙션 반응 후, 세포는 세포 배지에 조심스럽게 첨가될 수 있다. 예를 들면, T 세포가 뉴클레오펙션 반응을 겪을 때, T 세포는 T 세포 배지에 첨가될 수 있다. 본 개시의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 임의의 하나 이상의 상업적으로 입수 가능한 배지를 포함할 수 있다. (본 개시의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 더 큰 생존능 및 더 높은 뉴클레오펙션 효율을 갖고/갖거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다. (본 개시의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. (본 개시의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 생존능, 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 생존능, 세포 표현형 및/또는 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 향상시키기 위해 본 개시의 하나 이상의 보충 인자를 포함할 수 있다. 예시적 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 사이토카인, 케모카인 및 인터류킨은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 염, 광물 및 대사물질은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 석신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 배지, 예컨대, PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 아폽토시스 경로 및 이들의 조합의 억제제들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 캐스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt 또는 Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 억제제(예를 들면, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/시키거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/시키거나, 핵 내로의 핵산의 용이해진 수송을 향상시키고/시키거나, 에피-염색체 핵산의 분해를 향상시키고/시키거나, DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 예시적 물질은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩타이드, TREX1 효소, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
(본 개시의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 실온에서 사용될 수 있거나, 예를 들면, 종점을 포함하는 32℃ 내지 37℃까지 미리 가온될 수 있다. (본 개시의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 본 개시의 트랜스포존 또는 이의 부분의 세포 생존능 및/또는 발현을 유지하거나 향상시키는 임의의 온도까지 미리 가온될 수 있다.
(본 개시의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 조직 배양 플라스크 또는 접시, G-렉스 플라스크, 생물반응기 또는 세포 배양 백, 또는 임의의 다른 표준 용기 내에 함유될 수 있다. (본 개시의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배양물을 비롯한) 본 개시의 뉴클레오펙션 후 세포 배양물은 정지된 상태로 유지될 수 있거나, 대안적으로 교란될 수 있다(예를 들면, 흔들릴 수 있거나, 휘저어질 수 있거나 진탕될 수 있다).
뉴클레오펙션 후 세포 배양물은 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있다. 뉴클레오펙션 후 T 세포 배양물은 유전적으로 변형된 T 세포를 포함할 수 있다. 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 소정의 시간 동안 휴면될 수 있거나, 예를 들면, T 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 자극될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 소정의 시간 동안 휴면될 수 있거나, 예를 들면, T 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 즉시 자극될 수 있다. 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 적응하기에 충분한 시간, 전위가 일어나기에 충분한 시간, 및/또는 양성 또는 음성 선택을 위한 충분한 시간을 이 세포에게 허용하여, 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 바람직한 세포 표현형, 및/또는 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 가진 세포를 생성하도록 휴면될 수 있다. 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 예를 들면, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 이상 동안 휴면될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 예를 들면, 하룻밤 동안 휴면될 수 있다. 일부 양태에서, 하룻밤은 약 12시간이다. 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 이상 동안 휴면될 수 있다.
본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 뉴클레오펙션 반응 후 및 확장제 기술의 추가 전에 선택될 수 있다. 유전적으로 변형된 세포의 최적 선택을 위해, 세포는 변형된 세포의 확인(예를 들면, 변형된 세포와 비변형된 세포의 구별)을 용이하게 하기 위해 적어도 2일 내지 14일 동안 뉴클레오펙션 후 세포 배지에서 휴면하도록 허용될 수 있다.
본 개시의 센티린 또는 CARTyrin 및 선택 마커의 발현은 본 개시의 트랜스포존의 성공적인 뉴클레오펙션 시 변형된 T 세포에서 뉴클레오펙션 후 24시간만큼 일찍 검출될 수 있다. 트랜스포존의 에피-염색체 발현으로 인해, 선택 마커 단독의 발현은 변형된 T 세포(트랜스포존이 성공적으로 통합된 세포)와 비변형된 T 세포(트랜스포존이 성공적으로 통합되지 않은 세포)를 구별할 수 없다. 트랜스포존의 에피-염색체 발현이 선택 마커에 의한 변형된 세포의 검출을 모호하게 할 때, 뉴클레오펙션된 세포(변형된 세포 및 비변형된 세포 둘 다)는 세포가 발현을 중단할 수 있거나 모든 에피-염색체 트랜스포존 발현을 상실할 수 있도록 소정의 시간(예를 들면, 2일 내지 14일) 동안 휴면될 수 있다. 이 연장된 휴면 기간 후, 변형된 T 세포만이 선택 마커의 발현에 대해 양성을 유지해야 한다. 이 연장된 휴면 기간의 길이는 각각의 뉴클레오펙션 반응 및 선택 과정에 대해 최적화될 수 있다. 트랜스포존의 에피-염색체 발현이 선택 마커에 의한 변형된 세포의 검출을 모호하게 할 때, 선택은 이 연장된 휴면 기간 없이 수행될 수 있으나, 추가 선택 단계가 추후 시점에서(예를 들면, 확장 단계 동안 또는 후에) 포함될 수 있다.
본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 선택은 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 본 개시의 방법의 일부 실시양태에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 선택은 특정 선택 마커를 발현하는 세포를 단리함으로써 수행될 수 있다. 본 개시의 선택 마커는 트랜스포존 내의 하나 이상의 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 개시의 선택 마커는 성공적인 전위의 결과로서 변형된 세포에 의해 발현될 수 있다(즉, 트랜스포존 내의 하나 이상의 서열에 의해 코딩되지 않을 수 있다). 일부 실시양태에서, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 뉴클레오펙션 후 세포 배지의 유해한 화합물에 대한 내성을 부여하는 선택 마커를 함유한다. 상기 유해한 화합물은 예를 들면, 선택 마커에 의해 변형된 세포에게 부여된 내성이 부재할 때 세포 사멸을 초래할 항생제 또는 약물을 포함할 수 있다. 예시적 선택 마커는 야생형(WT) 또는 돌연변이체 형태의 하기 유전자들 중 하나 이상의 유전자를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다: neo, DHFR, TYMS, ALDH, MDR1, MGMT, FANCF, RAD51C, GCS 및 NKX2.2. 예시적 선택 마커는 Ab-코팅된 자기 비드 기술 또는 컬럼 선택에 의해 표적화될 수 있는 각각 표면-발현된 선택 마커 또는 표면-발현된 태그를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 절단 가능한 태그, 예컨대, 단백질 정제에 사용되는 절단 가능한 태그는 효율적인 컬럼 선택, 세척 및 용출을 위해 본 개시의 선택 마커에 첨가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 선택 마커는 (변형된 T 세포를 포함하는) 변형된 세포에 의해 내생적으로 발현되지 않으므로, (예를 들면, 세포 분류 기법에 의한) 변형된 세포의 물리적 단리에 유용할 수 있다. 본 개시의 예시적 선택 마커는 (변형된 T 세포를 포함하는) 변형된 세포에 의해 내생적으로 발현되지 않고, 전체 길이, 돌연변이된 또는 단축된 형태의 CD271, CD19, CD52, CD34, RQR8, CD22, CD20, CD33 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 뉴클레오펙션 반응 후 선택적으로 확장될 수 있다. 일부 실시양태에서, CARTyrin을 포함하는 변형된 T 세포는 CARTyrin 자극에 의해 선택적으로 확장될 수 있다. CARTyrin을 포함하는 변형된 T 세포는 표적에 의해 덮인 물질(예를 들면, 표적을 발현하는 종양 세포주 또는 정상 세포주, 또는 표적에 의해 덮인 확장제 비드)과 접촉함으로써 자극될 수 있다. 대안적으로, CARTyrin을 포함하는 변형된 T 세포는 방사선조사된 종양 세포, 방사선조사된 동종이계 정상 세포 또는 방사선조사된 자가 PBMC와 접촉함으로써 자극될 수 있다. 자극을 위해 사용된 표적 발현 세포에 의한 본 개시의 세포 생성물 조성물의 오염을 최소화하기 위해, 예를 들면, 상기 세포 생성물 조성물이 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있을 때, CARTyrin 표적 단백질로 코팅된 확장제 비드를 사용하여 자극을 수행할 수 있다. CARTyrin 자극에 의한 CARTyrin을 포함하는 변형된 T 세포의 선택적 확장은 작용적으로 소진된 변형된 T 세포를 피하도록 최적화될 수 있다.
본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 세포는 냉동보존될 수 있거나, 소정의 시간 동안 휴면될 수 있거나, 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 자극될 수 있다. 본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 세포는 냉동보존될 수 있거나, 소정의 시간 동안 휴면될 수 있거나, 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 즉시 자극될 수 있다. 선택된 유전적으로 변형된 세포가 T 세포일 때, T 세포는 T 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 자극될 수 있다. 본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 세포는 예를 들면, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 이상 동안 휴면될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 세포는 예를 들면, 하룻밤 동안 휴면될 수 있다. 일부 양태에서, 하룻밤은 약 12시간이다. 본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 세포는 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 이상 동안 휴면될 수 있다. 본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 세포는 임의의 시간 동안 휴면되어, 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 바람직한 세포 표현형, 및/또는 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 가진 세포를 생성할 수 있다.
(본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 유전적으로 변형된 세포는 높은 회수, 생존능, 표현형 및/또는 작용 능력을 가진 인간 세포를 저장하고/하거나 회수하도록 최적화될 수 있는 임의의 표준 냉동보존 방법을 이용함으로써 냉동보존될 수 있다. 본 개시의 냉동보존 방법은 상업적으로 입수 가능한 냉동보존 배지 및/또는 프로토콜을 포함할 수 있다.
(본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 유전적으로 변형된 세포의 전위 효율은 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, 확장제 기술의 적용 전, (본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 유전적으로 변형된 세포에 의한 트랜스포존의 발현은 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 측정될 수 있다. (본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 유전적으로 변형된 세포의 전위 효율의 측정은 트랜스포존(예를 들면, CARTyrin)을 발현하는 선택된 세포의 퍼센트를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, T 세포의 순도, 트랜스포존 발현(예를 들면, CARTyrin 발현)의 평균 형광 강도(MFI), CARTyrin 리간드를 발현하는 표적 세포의 탈과립화 및/또는 사멸을 매개하는 (트랜스포존에 의해 전달된) CARTyrin의 능력, 및/또는 (본 개시의 선택된 유전적으로 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 유전적으로 변형된 세포의 표현형은 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다.
본 개시의 세포 생성물 조성물은 일부 방출 기준을 충족시킬 때 대상체에게 투여되도록 방출될 수 있다. 예시적 방출 기준은 세포 표면 상에서 검출 가능한 수준의 CARTyrin을 발현하는, 변형된, 선택된 및/또는 확장된 T 세포의 특정 퍼센트를 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되지 않는다.
자가 T 세포 생성물 조성물의 유전자 변형
본 개시의 (유전적으로 변형된 T 세포를 포함하는) 유전적으로 변형된 세포는 확장제 기술을 이용함으로써 확장될 수 있다. 본 개시의 확장제 기술은 상업적으로 입수 가능한 확장제 기술을 포함할 수 있다. 본 개시의 예시적 확장제 기술은 TCR을 통한 본 개시의 유전적으로 변형된 T 세포의 자극을 포함한다. 본 개시의 유전적으로 변형된 T 세포를 자극하기 위한 모든 수단들이 고려되지만, TCR을 통한 본 개시의 유전적으로 변형된 T 세포의 자극은 더 우수한 수준의 사멸 능력을 가진 생성물을 제공하는 바람직한 방법이다.
TCR을 통해 본 개시의 유전적으로 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 써모(Thermo) 확장제 DynaBead를 T 세포에 대한 비드의 3:1 비로 사용할 수 있다. 확장제 비드가 생체분해될 수 없는 경우, 비드는 확장제 조성물로부터 제거될 수 있다. 예를 들면, 상기 비드는 약 5일 후 확장제 조성물로부터 제거될 수 있다. TCR을 통해 본 개시의 유전적으로 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 밀테니이 T 세포 활성화/확장제를 사용할 수 있다. TCR을 통해 본 개시의 유전적으로 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies)의 이뮤노컬트 인간 CD3/CD28 또는 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화제를 사용할 수 있다. 이 기술은 가용성 사량체 항체 복합체가 소정의 시간 후 분해될 것이고 과정으로부터의 제거를 요구하지 않을 것이기 때문에 바람직할 수 있다.
인공 항원 제시 세포(APC)는 표적 항원을 공-발현하도록 조작될 수 있고, 본 개시의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 인공 APC는 (예를 들면, 불멸화된 골수성 백혈병 세포주 K562를 포함하는) 종양 세포주를 포함할 수 있거나 이 종양 세포주로부터 유래할 수 있고, 기술에 의해 다수의 보조자극 분자들 또는 기술들(예컨대, CD28, 4-1BBL, CD64, mbIL-21, mbIL-15, CAR 표적 분자 등)을 공-발현하도록 조작될 수 있다. 본 개시의 인공 APC가 보조자극 분자와 조합될 때, 조건은 바람직하지 않은 표현형 및 작용 능력, 즉 말기 분화된 이펙터 T 세포의 발생 또는 출현을 방지하도록 최적화될 수 있다.
방사선조사된 (자가 또는 동종) PBMC는 일부 표적 항원들, 예컨대, CD19를 발현할 수 있고, 본 개시의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 방사선조사된 종양 세포는 일부 표적 항원들을 발현할 수 있고, 본 개시의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다.
플레이트에 결합된 항-CD3, 항-CD2 및/또는 항-CD28, 및/또는 가용성 항-CD3, 항-CD2 및/또는 항-CD28 자극은 본 개시의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다.
항원으로 코팅된 비드는 표적 단백질을 표시할 수 있고 본 개시의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, CARTyrin 표적 단백질로 코팅된 확장제 비드는 본 개시의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다.
확장 방법은 TCR 또는 CARTyrin, 및 유전적으로 변형된 T 세포의 표면에 발현된 CD2, CD3, CD28, 4-1BB 및/또는 다른 마커를 통해 본 개시의 세포 또는 T 세포의 자극을 이끌어낸다.
확장 기술은 뉴클레오펙션 후 대략 24시간까지 뉴클레오펙션 직후 본 개시의 세포에 적용될 수 있다. 다양한 세포 배지들이 확장 절차 동안 사용될 수 있지만, 본 개시의 바람직한 T 세포 확장 배지는 예를 들면, 더 큰 생존능, 세포 표현형, 총 확장 또는 더 큰 생체내 존속 능력, 생착 및/또는 CAR 매개 사멸을 가진 세포를 제공할 수 있다. 본 개시의 세포 배지는 본 개시의 유전적으로 변형된 세포의 확장, 표현형 및 작용을 개선/향상시키도록 최적화될 수 있다. 확장된 T 세포의 바람직한 표현형은 T 줄기 세포 기억 세포, T 중심 세포 및 T 이펙터 기억 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. 확장제 Dynabead는 주로 중심 기억 T 세포를 제공할 수 있고, 이것은 임상에서 더 우수한 성능으로 이어질 수 있다.
본 개시의 예시적 T 세포 확장 배지는 부분적으로 또는 전체적으로 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시의 T 세포 확장 배지는 하나 이상의 보충 인자를 추가로 포함할 수 있다. 본 개시의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 생존능, 세포 표현형, 총 확장을 향상시키거나, 생체내 존속 능력, 생착 및/또는 CARTyrin 매개 사멸을 증가시킨다. 본 개시의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인 및/또는 인터류킨, 예컨대, IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 염, 광물 및/또는 대사물질, 예컨대, HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 석신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달 및/또는 아폽토시스 경로의 억제제, 예컨대, TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 캐스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt 또는 Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 억제제(예를 들면, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/시키거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/시키거나, 핵 내로의 핵산의 용이해진 수송을 향상시키고/시키거나, 에피-염색체 핵산의 분해를 향상시키고/시키거나, DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약, 예컨대, pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩타이드, TREX1 효소 또는 이들의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 유전적으로 변형된 세포는 선택 약물 또는 화합물의 사용에 의해 확장 과정 동안 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 본 개시의 트랜스포존이 배양 배지에 첨가된 약물에 대한 내성을 유전적으로 변형된 세포에게 부여하는 선택 마커를 코딩할 수 있을 때, 선택은 확장 과정 동안 일어날 수 있고 선택이 일어나기 위해 대략 1일 내지 14일의 배양을 요구할 수 있다. 본 개시의 트랜스포존에 의해 코딩된 선택 마커로서 사용될 수 있는 약물 내성 유전자의 예는 야생형(WT) 또는 돌연변이체 형태의 유전자 neo, DHFR, TYMS, ALDH, MDR1, MGMT, FANCF, RAD51C, GCS, NKX2.2 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 선택 마커가 내성을 부여할 수 있는, 배양 배지에 첨가될 수 있는 상응하는 약물 또는 화합물의 예는 G418, 푸로마이신(Puromycin), 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 멜팔란(Mephalan), 테모졸로마이드(Temozolomide), 빈크리스틴(Vincristine), 에토포사이드(Etoposide), 독소루비신(Doxorubicin), 벤다무스틴(Bendamustine), 플루다라빈(Fludarabine), 아레디아(Aredia)(파미드로네이트 이나트륨), 베세눔(Becenum)(카르무스틴(Carmustine)), BiCNU(카르무스틴), 보르테조밉(Bortezomib), 카르필조밉(Carfilzomib), 카르무브리스(Carmubris)(카르무스틴), 카르무스틴, 클라펜(Clafen)(사이클로포스프아미드), 사이클로포스프아미드, 사이톡산(Cytoxan)(사이클로포스프아미드), 다라투무맙(Daratumumab), 다르잘렉스(Darzalex)(다라투무맙), 독실(Doxil)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀, 독스-SL(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 엘로투주맙(Elotuzumab), 엠플리시티(Empliciti)(엘로투주맙), 에바세트(Evacet)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 파리닥(Farydak)(파노비노스타트(Panobinostat)), 익사조밉(Ixazomib) 구연산염, 키프롤리스(Kyprolis)(카르필로조밉(Carfilzomib)), 레날리도마이드(Lenalidomide), 리포독스(LipoDox)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 모조빌(Mozobil)(플레릭사포르(Plerixafor)), 네오사르(Neosar)(사이클로포스프아미드), 닌라로(Ninlaro)(익사조밉 구연산염), 파미드로네이트 이나트륨, 파노비노스타트, 플레릭사포르, 포말리도마이드(Pomalidomide), 포마리스트(Pomalyst)(포말리도마이드), 레블리미드(Revlimid)(레날리도마이드), 시노비르(Synovir)(탈리도마이드), 탈리도마이드, 탈로미드(Thalomid)(탈리도마이드), 벨케이드(Velcade)(보르테조밉), 졸레드론산, 조메타(Zometa)(졸레드론산) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 T 세포 확장 과정은 WAVE 생물반응기, G-렉스 플라스크, 또는 임의의 다른 적합한 용기 및/또는 반응기 내의 세포 배양 백에서 일어날 수 있다.
본 개시의 세포 또는 T 세포 배양물은 정지된 상태, 흔들리는 상태, 휘저어지는 상태 또는 진탕되는 상태로 보관될 수 있다.
본 개시의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 배양 지속시간, 세포 농도, T 세포 배지 첨가/제거를 위한 일정, 세포 크기, 총 세포 수, 세포 표현형, 세포 집단의 순도, 성장하는 세포 집단 내의 유전적으로 변형된 세포의 퍼센트, 보충제의 사용 및 조성, 확장제 기술의 추가/제거, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 일부 조건들을 최적화할 수 있다.
본 개시의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 생성된 확장된 세포 집단의 제제화 전에 소정의 종점까지 계속될 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 소정의 시간, 즉 적어도 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간; 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일; 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주; 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월; 또는 적어도 1년 동안 계속될 수 있다. 본 개시의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 생성된 배양물이 소정의 총 세포 밀도, 즉 부피(㎕, ㎖, ℓ)당 1개, 10개, 100개, 1000개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개 세포, 또는 임의의 중간치 밀도에 도달할 때까지 계속될 수 있다. 본 개시의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 생성된 배양물의 유전적으로 변형된 세포가 본 개시의 트랜스포존의 소정의 발현 수준, 즉 역치 발현 수준(생성된 유전적으로 변형된 세포가 임상적으로 효과적임을 표시하는 최소치, 최대치 또는 평균 발현 수준)의 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 임의의 중간치 퍼센트를 나타낼 때까지 계속될 수 있다. 본 개시의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 비변형된 세포의 비율에 대한 생성된 배양물의 유전적으로 변형된 세포의 비율이 소정의 역치, 즉 적어도 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 2:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 또는 임의의 중간치 비에 도달할 때까지 계속될 수 있다.
방출을 위한 유전적으로 변형된 자가 T 세포의 분석
유전적으로 변형된 세포의 퍼센트는 본 개시의 확장 과정 동안 또는 후에 평가될 수 있다. 본 개시의 유전적으로 변형된 세포에 의한 트랜스포존의 세포 발현은 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, FACS를 이용하여 본 개시의 CARTyrin을 발현하는 세포 또는 T 세포의 퍼센트를 측정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 유전적으로 변형된 세포 또는 T 세포의 순도, 본 개시의 유전적으로 변형된 세포 또는 T 세포에 의해 발현된 CARTyrin의 평균 형광 강도(MFI), CARTyrin 리간드를 발현하는 표적 세포의 탈과립화 및/또는 사멸을 매개하는 CARTyrin의 능력, 및/또는 CARTyrin+ T 세포의 표현형이 평가될 수 있다.
대상체에게 투여될 본 개시의 조성물은 조성물이 약학 제품으로서의 제제화 및/또는 대상체에게의 투여를 위해 안전하고 효과적임을 표시하는 하나 이상의 "방출 기준"을 충족시킬 것을 요구받을 수 있다. 방출 기준은 본 개시의 조성물(예를 들면, 본 개시의 T 세포 생성물)이 세포 표면 상에서 검출 가능한 수준의 본 개시의 CARTyrin을 발현하는 특정 퍼센트의 T 세포를 포함해야 한다는 요건을 포함할 수 있다.
확장 과정은 특정 기준(예를 들면, 특정 총 세포 수의 달성, 특정 기억 세포 집단의 달성, 특정 크기의 집단의 달성)이 충족될 때까지 계속되어야 한다.
특정 기준은 확장 과정이 종결되어야 하는 점을 신호로 보낸다. 예를 들면, 세포는 일단 300 fL의 세포 크기에 도달하면 제제화되거나, 재활성화되거나 냉동보존되어야 한다(그렇지 않으면, 이 역치를 초과하는 크기에 도달한 세포는 사멸하기 시작할 수 있다). 일단 세포의 집단이 300 fL 미만의 평균 세포 크기에 도달하면 즉시 냉동보존은 해동 및 배양 시 더 우수한 세포 회수를 제공할 수 있는데, 이는 세포가 냉동보존 전에 완전한 휴지 상태에 아직 도달하지 못하였기 때문이다(완전한 휴지 상태 크기는 대략 180 fL이다). 확장 전, 본 개시의 T 세포는 약 180 fL의 세포 크기를 가질 수 있으나, 그의 세포 크기를 확장 후 3일째 날 대략 900 fL까지 4배 이상 증가시킬 수 있다. T 세포의 집단은 다음 6일 내지 12일에 걸쳐 세포 크기를 180 fL의 완전한 휴지 상태 크기까지 서서히 감소시킬 것이다.
제제화를 위해 세포 집단을 준비하는 과정은 세포 집단의 세포를 농축시키는 단계, 세포를 세척하는 단계, 및/또는 약물 내성 또는 자기 비드 분류를 통해 표면에 발현된 특정 마커에 대해 세포를 추가 선택하는 단계를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 제제화를 위해 세포 집단을 준비하는 과정은 최종 생성물의 안전성 및 순도를 보장하기 위한 분류 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 환자로부터의 종양 세포가 본 개시의 유전적으로 변형된 T 세포를 자극하는 데 사용되었거나, 제제화를 위해 준비되고 있는 본 개시의 유전적으로 변형된 T 세포를 자극하기 위해 유전적으로 변형된 경우, 환자로부터의 종양 세포가 최종 생성물에 포함되지 않는 것이 매우 중요하다.
세포 생성물 주입 및/또는 주입을 위한 냉동보존
본 개시의 약학 제제는 주입, 냉동보존 및/또는 저장을 위해 백 내에 분배될 수 있다.
본 개시의 약학 제제는 표준 프로토콜 및 임의적으로 주입 가능한 냉동보존 배지를 사용함으로써 냉동보존될 수 있다. 예를 들면, DMSO 무함유 냉동보존제(예를 들면, CryoSOfree™ DMSO 무함유 냉동보존 배지)가 냉동 관련 독성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 본 개시의 냉동보존된 약학 제제는 나중에 환자에게 주입하기 위해 저장될 수 있다. 효과적인 치료는 본 개시의 약학 제제의 다회 투여를 요구할 수 있으므로, 약학 제제는 냉동된 상태로 저장될 수 있으나 개별 용량의 해동을 위해 분리될 수 있는 미리 분취된 "용량"으로 포장될 수 있다.
본 개시의 약학 제제는 실온에서 저장될 수 있다. 효과적인 치료는 본 개시의 약학 제제의 다회 투여를 요구할 수 있으므로, 약학 제제는 함께 저장될 수 있으나 개별 용량의 투여를 위해 분리될 수 있는 미리 분취된 "용량"으로 포장될 수 있다.
본 개시의 약학 제제는 동종이계 요법의 경우, 예를 들면, 질병의 관해 및 재발 후 나중에 투여를 필요로 할 수 있는 동일한 환자를 위한 추가 용량을 생성하기 위한 후속 재확장 및/또는 선택을 위해 보관될 수 있다.
제제
상기 인지된 바와 같이, 본 개시는 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 가진 인산염 완충제뿐만 아니라, 보존제를 함유하는 보존된 용액 및 제제도 포함하는 안정한 제제뿐만 아니라, 약학적으로 허용 가능한 제제 중에 적어도 하나의 CARTyrin을 포함하는, 약학 또는 수의학 용도에 적합한 다용도 보존된 제제도 제공한다. 보존된 제제는 수성 희석제 중에 임의적으로 적어도 하나의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 아질산페닐수은, 페녹시에탄올, 포름알데하이드, 클로로부탄올, 염화마그네슘(예를 들면, 육수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 공지된 보존제, 또는 이들의 중합체 또는 혼합물을 함유한다. 임의의 적합한 농도 또는 혼합물, 예컨대, 약 0.0015%, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분획은 당분야에서 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. 비제한적 예는 보존제 부재, 약 0.1% 내지 2% m-크레졸(예를 들면, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.9%, 1.0%), 약 0.1% 내지 3% 벤질 알코올(예를 들면, 0.5%, 0.9%, 1.1%, 1.5%, 1.9%, 2.0%, 2.5%), 약 0.001% 내지 0.5% 티메로살(예를 들면, 0.005%, 0.01%), 약 0.001% 내지 2.0% 페놀(예를 들면, 0.05%, 0.25%, 0.28%, 0.5%, 0.9%, 1.0%), 0.0005% 내지 1.0% 알킬파라벤(들)(예를 들면, 0.00075%, 0.0009%, 0.001%, 0.002%, 0.005%, 0.0075%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.075%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.75%, 0.9%, 1.0%) 등을 포함한다.
상기 인지된 바와 같이, 본 발명은 포장재, 및 임의적으로 수성 희석제 중에 규정된 완충제 및/또는 보존제와 함께 적어도 하나의 CARTyrin의 용액을 포함하는 적어도 하나의 바이알을 포함하는 제품을 제공하고, 이때 상기 포장재는 이러한 용액이 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간, 18시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 40시간, 48시간, 54시간, 60시간, 66시간 또는 72시간 이상의 시간에 걸쳐 유지될 수 있음을 표시하는 표지를 포함한다. 본 발명은 포장재, 동결건조된 적어도 하나의 CARTyrin을 포함하는 제1 바이알, 및 규정된 완충제 또는 보존제의 수성 희석제를 포함하는 제2 바이알을 포함하는 제품도 포함하고, 이때 상기 포장재는 환자가 수성 희석제로 적어도 하나의 CARTyrin을 재구성하여 24시간 이상의 시간에 걸쳐 유지될 수 있는 용액을 형성하도록 지시하는 표지를 포함한다.
본 발명에 따라 사용된 적어도 하나의 CARTyrin은 포유동물 세포 또는 형질전환 제제를 포함하는 재조합 수단에 의해 생성될 수 있거나, 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 바와 같이 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있다.
본 발명의 생성물 중의 적어도 하나의 CARTyrin의 범위는 습식/건식 시스템의 경우 재구성 시 약 1.0 ㎍/㎖ 내지 약 1000 ㎎/㎖의 농도를 제공하는 양을 포함하지만, 더 낮은 농도 및 더 높은 농도가 사용될 수 있고 의도된 전달 비히클에 의해 좌우되고, 예를 들면, 용액 제제는 경피 패치, 폐, 경점막, 또는 삼투 또는 마이크로 펌프 방법과 상이할 것이다.
바람직하게는, 수성 희석제는 임의적으로 약학적으로 허용 가능한 보존제를 추가로 포함한다. 바람직한 보존제는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살로 구성된 군으로부터 선택된 보존제, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 제제에서 사용된 보존제의 농도는 항균 효과를 제공하기에 충분한 농도이다. 이러한 농도는 선택된 보존제에 의해 좌우되고 숙련된 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
다른 부형제, 예를 들면, 등장화제, 완충제, 항산화제 및 보존제 증강제는 임의적으로 그리고 바람직하게는 희석제에 첨가될 수 있다. 등장화제, 예컨대, 글리세린은 통상적으로 공지된 농도로 사용된다. 생리학적으로 용인되는 완충제는 바람직하게는 개선된 pH 조절을 제공하기 위해 첨가된다. 제제는 광범위한 pH, 예컨대, 약 pH 4 내지 약 pH 10, 바람직하게는 약 pH 5 내지 약 pH 9의 범위, 가장 바람직하게는 약 6.0 내지 약 8.0의 범위를 커버할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 제제는 약 6.8 내지 약 7.8의 pH를 가진다. 바람직한 완충제는 인산염 완충제, 가장 바람직하게는 인산나트륨, 특히 인산염 완충 식염수(PBS)를 포함한다.
다른 첨가제, 예컨대, 약학적으로 허용 가능한 가용화제, 예컨대, Tween 20(폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트), Tween 40(폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트), Tween 80(폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트), Pluronic F68(폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체), 및 PEG(폴리에틸렌 글리콜) 또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트 20 또는 80, 또는 폴록사머 184 또는 188, Pluronic® 폴리올, 다른 블록 공중합체, 및 킬레이터, 예컨대, EDTA 및 EGTA는 임의적으로 응집을 감소시키기 위해 제제 또는 조성물에 첨가될 수 있다. 이 첨가제들은 펌프 또는 플라스틱 용기가 제제를 투여하는 데 이용되는 경우 특히 유용하다. 약학적으로 허용 가능한 계면활성제의 존재는 단백질이 응집되는 성향을 경감시킨다.
본 발명의 제제는 수성 희석제에서 적어도 하나의 CARTyrin을, 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살로 구성된 군으로부터 선택된 보존제 또는 이들의 혼합물과 혼합하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제에서의 적어도 하나의 CARTyrin과 보존제의 혼합은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 이용함으로써 수행된다. 적합한 제제를 제조하기 위해, 예를 들면, 완충된 용액 중의 측정된 양의 적어도 하나의 CARTyrin을, 단백질 및 보존제를 원하는 농도로 제공하기에 충분한 양으로 완충된 용액 중의 원하는 보존제와 조합한다. 이 과정의 변경은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 인식될 것이다. 예를 들면, 성분이 첨가되는 순서, 추가 첨가제가 사용되는지 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용되는 농도 및 투여 수단을 위해 최적화될 수 있는 모든 요인들이다.
청구된 제제는 투명한 용액으로서 환자에게 제공될 수 있거나, 수성 희석제 중에 물, 보존제 및/또는 부형제, 바람직하게는 인산염 완충제 및/또는 식염수 및 선택된 염을 함유하는 제2 바이알에 의해 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 CARTyrin의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 재구성을 요구하는 단일 용액 바이알 또는 이중 바이알은 다회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단회 또는 다회 주기에 충분할 수 있으므로, 현재 이용 가능한 치료법보다 더 편리한 치료법을 제공할 수 있다.
본 청구된 제품은 즉시부터 24시간 이상에 이르는 시간에 걸쳐 투여하는 데 유용하다. 따라서, 본 청구된 제품은 환자에게 상당한 장점을 제공한다. 본 발명의 제제는 임의적으로 약 2℃ 내지 약 40℃의 온도에서 안전하게 저장될 수 있고 연장된 시간 동안 단백질의 생물학적 활성을 보유함으로써, 용액이 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간 또는 96시간 이상의 시간에 걸쳐 유지될 수 있고/있거나 사용될 수 있음을 표시하는 포장 표지를 허용할 수 있다. 보존된 희석제가 사용되는 경우, 이러한 표지는 1개월 내지 12개월, 반년, 1년 반 및/또는 2년까지 사용을 포함할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 CARTyrin의 용액은 수성 희석제에서 적어도 하나의 CARTyrin을 혼합하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조될 수 있다. 혼합은 통상적인 용해 및 혼합 절차를 이용함으로써 수행된다. 적합한 희석제를 제조하기 위해, 물 또는 완충제 중의 측정된 양의 적어도 하나의 CARTyrin은 원하는 농도로 단백질 및 임의적으로 보존제 또는 완충제를 제공하기에 충분한 양으로 조합된다. 이 과정의 변경은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 인식될 것이다. 예를 들면, 성분이 첨가되는 순서, 추가 첨가제가 사용되는지 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용되는 농도 및 투여 수단을 위해 최적화될 수 있는 모든 요인들이다.
청구된 생성물은 투명한 용액으로서 환자에게 제공될 수 있거나, 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알에 의해 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 CARTyrin의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 재구성을 요구하는 단일 용액 바이알 또는 이중 바이알은 다회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단회 또는 다회 주기에 충분할 수 있으므로, 현재 이용 가능한 치료법보다 더 편리한 치료법을 제공한다.
청구된 생성물은 투명한 용액, 또는 수성 희석제를 함유하는 제2 바이알에 의해 재구성되는 동결건조된 적어도 하나의 CARTyrin의 바이알을 포함하는 이중 바이알을 약국, 병원, 또는 다른 이러한 기관 및 시설에게 제공함으로써 환자에게 직접적으로 제공될 수 있다. 이 경우 투명한 용액은 적어도 하나의 CARTyrin 용액의 보다 더 작은 부분이 보다 더 작은 바이알 내로의 전달을 위해 1회 또는 다회 회수될 수 있고 약국 또는 병원에 의해 그들의 고객 및/또는 환자에게 제공될 수 있는 큰 용기를 제공할 정도로 크기가 최대 1 리터 또는 심지어 더 클 수 있다.
단일 바이알 시스템을 포함하는 인정받은 디바이스는 예를 들면, 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)(뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재, www.bectondickenson.com), 디세트로닉(Disetronic)(스위스 부르그도르프 소재, www.disetronic.com), 바이오젝트(Bioject)(오레곤주 포틀랜드 소재, www.bioject.com), 네이셔날 메디칼 프로덕츠(National Medical Products), 웨스톤 메디칼(Weston Medical)(영국 피터보로우 소재, www.weston-medical.com), 메디-젝트 코포레이션(Medi-Ject Corp)(미네소타주 미네아폴리스 소재, www.mediject.com)에 의해 제조되었거나 개발된 용액 전달용 펜-주사기 디바이스, 예컨대, BD Pen, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen®, 및 OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-팁 무바늘 Injector®, Intraject®, Medi-Ject®, 및 유사하게 적합한 디바이스를 포함한다. 이중 바이알 시스템을 포함하는 인정받은 디바이스는 재구성된 용액의 전달을 위해 카트리지 내에서 동결건조된 약물을 재구성하는 펜-주사기 시스템, 예컨대, HumatroPen®을 포함한다. 다른 적합한 디바이스의 예는 미리 충전된 주사기, 자동 주사기, 무바늘 주사기 및 무바늘 IV 주입 세트를 포함한다.
본 청구된 생성물은 포장재를 포함한다. 포장재는 규제 관청에 의해 요구된 정보 이외에 생성물이 사용될 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명의 포장재는 두 바이알, 즉 습윤/건조 바이알 생성물의 경우 환자가 수성 희석제에서 적어도 하나의 CARTyrin을 재구성하여 용액을 형성하고 2시간 내지 24시간 이상의 시간에 걸쳐 상기 용액을 사용할 것을 지시하는 설명서를 제공한다. 단일 바이알 용액 생성물의 경우, 표지는 이러한 용액이 2시간 내지 24시간 이상의 시간에 걸쳐 사용될 수 있음을 표시한다. 본 청구된 생성물은 인간 약학 제품 용도에 유용하다.
본 발명의 제제는 적어도 하나의 CARTyrin을 선택된 완충제, 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 함유하는 인산염 완충제와 혼합하는 단계를 포함하는 과정에 의해 제조될 수 있다. 수성 희석제에서 적어도 하나의 CARTyrin을 완충제와 혼합하는 단계는 통상적인 용해 및 혼합 절차를 이용함으로써 수행된다. 적합한 제제를 제조하기 위해, 예를 들면, 물 또는 완충제 중의 측정된 양의 적어도 하나의 CARTyrin은 원하는 농도로 단백질 및 완충제를 제공하기에 충분한 양으로 물 중의 원하는 완충제와 조합된다. 이 과정의 변경은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 인식될 것이다. 예를 들면, 성분이 첨가되는 순서, 추가 첨가제가 사용되는지 여부, 제제가 제조되는 온도 및 pH는 사용되는 농도 및 투여 수단을 위해 최적화될 수 있는 모든 요인들이다.
청구된 안정한 또는 보존된 제제는 투명한 용액으로서 환자에게 제공될 수 있거나, 수성 희석제 중에 보존제 또는 완충제 및 부형제를 함유하는 제2 바이알에 의해 재구성되는 동결건조된 CARTyrin의 바이알을 포함하는 이중 바이알로서 환자에게 제공될 수 있다. 재구성을 요구하는 단일 용액 바이알 또는 이중 바이알은 다회 재사용될 수 있고 환자 치료의 단회 또는 다회 주기에 충분할 수 있으므로, 현재 이용 가능한 치료법보다 더 편리한 치료법을 제공한다.
CARTyrin을 안정화시키는 다른 제제 또는 방법은 CARTyrin을 포함하는 동결건조된 분말의 투명하지 않은 용액을 생성할 수 있다. 투명하지 않은 용액들 중에는 미립자 현탁액을 포함하는 제제가 있고, 이때 상기 미립자는 마이크로스피어, 마이크로입자, 나노입자, 나노스피어 또는 리포좀으로서 다양하게 공지된 가변적 치수의 구조물 내에 CARTyrin을 함유하는 조성물이다. 활성 작용제를 함유하는, 이러한 상대적으로 균질하고 본질적으로 구형인 미립자 제제는 미국 특허 제4,589,330호에 교시된 바와 같이 활성 작용제 및 중합체를 함유하는 수성 상을 비수성 상과 접촉시킨 후, 비수성 상을 증발시켜 수성 상으로부터의 입자의 유착을 야기함으로써 형성될 수 있다. 다공성 마이크로입자는 미국 특허 제4,818,542호에 교시된 바와 같이 연속적인 용매에 분산된 활성 작용제 및 중합체를 함유하는 제1 상을 사용하고 냉동건조 또는 희석-추출-침전으로 현탁액으로부터 상기 용매를 제거함으로써 제조될 수 있다. 이러한 제조에 바람직한 중합체는 젤라틴 한천, 전분, 아라비노갈락탄, 알부민, 콜라겐, 폴리글리콜산, 폴리젖산, 글리콜라이드-L(-) 락타이드 폴리(엡실론-카프로락톤), 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-젖산), 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-글리콜산), 폴리(β-하이드록시 부티르산), 폴리에틸렌 산화물, 폴리에틸렌, 폴리(알킬-2-시아노아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트), 폴리아미드, 폴리(아미노산), 폴리(2-하이드록시에틸 DL-아스파르트아미드), 폴리(에스테르 우레아), 폴리(L-페닐알라닌/에틸렌 글리콜/1,6-디이소시아네이토헥산) 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)로 구성된 군으로부터 선택된 천연 또는 합성 공중합체 또는 중합체이다. 특히 바람직한 중합체는 폴리에스테르, 예컨대, 폴리글리콜산, 폴리젖산, 글리콜라이드-L(-) 락타이드 폴리(엡실론-카프로락톤), 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-젖산) 및 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-글리콜산)이다. 중합체 및/또는 활성 작용제를 용해시키는 데 유용한 용매는 물, 헥사플루오로이소프로판올, 메틸렌클로라이드, 테트라하이드로퓨란, 헥산, 벤젠 또는 헥사플루오로아세톤 세스퀴수화물을 포함한다. 활성 작용제 함유 상을 제2 상으로 분산시키는 과정은 노즐 내의 천공을 통해 상기 제1 상에 압력을 가하여 액적 형성을 달성하는 단계를 포함할 수 있다.
건조 분말 제제는 동결건조 이외의 과정, 예컨대, 분무 건조, 또는 증발 또는 결정성 조성물의 침전에 의한 용매 추출 후 수성 또는 비수성 용매를 제거하는 하나 이상의 단계로부터 생성될 수 있다. 분무 건조된 CARTyrin 제제의 제조는 미국 특허 제6,019,968호에 교시되어 있다. CARTyrin 기제 건조 분말 조성물은 호흡 가능한 건조 분말을 제공하는 조건 하에서 용매 중의 CARTyrin 및 임의적으로 부형제의 용액 또는 슬러리를 분무 건조함으로써 생성될 수 있다. 용매는 용이하게 건조될 수 있는 극성 화합물, 예컨대, 물 및 에탄올을 포함할 수 있다. CARTyrin 안정성은 산소의 부재 하에서, 예컨대, 질소 담요 하에서 분무 건조 절차를 수행함으로써, 또는 건조 기체로서 질소를 사용함으로써 향상될 수 있다. 또 다른 상대적 건조 제제는 국제 특허출원 공개 제WO 9916419호에 교시된 바와 같이 전형적으로 하이드로플루오로알칸 추진제를 포함하는 현탁 매질에 분산된 다수의 천공된 마이크로구조물들의 분산액이다. 안정화된 분산액은 계량된 용량 흡입기를 이용함으로써 환자의 폐에 투여될 수 있다. 분무 건조된 의약의 상업적 제조에 유용한 장치는 부치 리미티드(Buchi Ltd.) 또는 니로 코포레이션(Niro Corp.)에 의해 제조된다.
본원에 기재된 안정한 또는 보존된 제제 또는 용액 중의 적어도 하나의 CARTyrin은 당분야에서 잘 공지되어 있는 바와 같이 SC 또는 IM 주사; 경피, 폐, 경점막, 임플란트, 삼투 펌프, 카트리지, 마이크로 펌프 또는 숙련된 당업자에 의해 인식된 다른 수단을 포함하는 다양한 전달 방법들을 통해 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.
치료 적용
본 발명은 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 적어도 하나의 CARTyrin을 사용하여, 예를 들면, 치료 유효량의 CARTyrin을 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하거나 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자와 접촉시킴으로써 상기 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 질환을 조절하거나 치료하는 방법도 제공한다. 본 발명은 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 악성 질환을 포함하나 이것으로 제한되지 않는 질환을 조절하거나 치료하는 방법도 제공한다.
본 발명은 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 하기 악성 질환들 중 적어도 하나의 악성 질환을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 적어도 하나의 악성 질환을 조절하거나 치료하는 방법도 제공한다: 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 림프구성 백혈병, B 세포, T 세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발 세포 백혈병, 골수형성이상 증후군(MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 대장암종, 췌장암종, 비인두암종, 악성 조직구증, 부신생물성 증후군/악성 고칼슘혈증, 고형 종양, 방광암, 유방암, 대장암, 자궁내막암, 두부암, 경부암, 유전성 비용종성 암, 호지킨 림프종, 간암, 폐암, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장세포암종, 고환암, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골 재흡수, 암 관련 골 통증 등.
본 발명의 임의의 방법은 적어도 하나의 CARTyrin을 포함하는 유효량의 조성물 또는 약학 조성물을, 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임의적으로 이러한 질환 또는 장애를 치료하기 위해 공-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 적어도 하나의 CARTyrin, 이의 특정된 부분 또는 변이체의 투여는 투여 전에, 투여와 동시에 및/또는 투여 후에 적어도 하나의 알킬화제, 유사분열 억제제 및 방사성약물로부터 선택된 적어도 하나를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 용량은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 각각 참고로 포함된 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)]; 문헌[Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001]; 문헌[Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.]을 참조한다.
바람직한 용량은 임의적으로 단회 또는 다회 투여당 약 0.1 내지 5000 ㎍/㎖ 혈청 농도, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분획의 혈청 농도를 달성하기 위해 약 0.1 내지 99 mg/kg/투여 및/또는 100 내지 500 mg/kg/투여, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분획을 포함할 수 있다. 본 발명의 CARTyrin에 대한 바람직한 용량 범위는 환자의 체중 kg당 약 1 mg 내지 약 3, 약 6 또는 약 12 mg이다.
대안적으로, 투여되는 용량은 공지된 요인, 예컨대, 구체적인 작용제의 약력학적 특성, 및 이의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과에 따라 달라질 수 있다. 통상적으로, 활성 성분의 용량은 체중 kg당 약 0.1 내지 100 mg일 수 있다. 지속 방출 형태에서 통상적으로 투여당 kg당 0.1 내지 50 mg, 바람직하게는 0.1 내지 10 mg이 원하는 결과를 수득하는 데 효과적이다.
비제한적 예로서, 인간 또는 동물의 치료는 단회, 주입 또는 반복 용량을 사용함으로써, 1일 내지 40일 중 적어도 하루, 또는 대안적으로 또는 추가로 1주 내지 52주 중 적어도 한 주, 또는 대안적으로 또는 추가로 1년 내지 20년 중 적어도 한 해, 또는 이들의 임의의 조합에 하루에 약 0.1 내지 100 mg/kg, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분획의 양으로 본 발명의 적어도 하나의 CARTyrin의 1회 또는 주기적 용량으로서 제공될 수 있다.
내부 투여에 적합한 제형(조성물)은 일반적으로 유닛 또는 용기당 약 0.001 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 이 약학 조성물에서, 활성 성분은 통상적으로 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5 내지 99.999 중량%의 양으로 존재할 것이다.
비경구 투여의 경우, CARTyrin은 약학적으로 허용 가능한 비경구 비히클과 함께 또는 별도로 제공된 용액, 현탁액, 유화액, 입자, 분말 또는 동결건조된 분말로서 제제화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 약 1% 내지 10% 인간 혈청 알부민이다. 리포좀 및 비수성 비히클, 예컨대, 고정유도 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결건조된 분말은 등장성을 유지하는 첨가제(예를 들면, 염화나트륨, 만니톨) 및 화학적 안정성을 유지하는 첨가제(예를 들면, 완충제 및 보존제)를 함유할 수 있다. 제제는 공지된 또는 적합한 기법에 의해 멸균된다.
적합한 약학 담체는 이 분야의 표준 참고 교재인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol]의 가장 최신판에 기재되어 있다.
대안적 투여
본 발명에 따른 약학적 유효량의 적어도 하나의 CARTyrin을 투여하기 위해 많은 공지되고 개발된 방식들이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 폐 투여가 하기 설명에서 이용되지만, 적합한 결과를 제공하는 다른 투여 방식이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명의 CARTyrin은 본원에 기재되어 있거나 당분야에서 공지되어 있는 흡입 또는 다른 방식에 의한 투여에 적합한 다양한 디바이스들 및 방법들 중 임의의 디바이스 및 방법을 이용함으로써 용액, 유화액, 콜로이드 또는 현탁액으로서, 또는 건조 분말로서 담체에 의해 전달될 수 있다.
비경구 제제 및 투여
비경구 투여용 제제는 통상의 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 식물 유래 오일, 수소첨가된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 공지된 방법에 따라 적절한 유화제 또는 보습제 및 현탁제를 사용함으로써 제조될 수 있다. 주사용 작용제는 무독성 비경구 투여 가능한 희석제, 예컨대, 용매 중의 수성 용액, 멸균 주사 가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 비히클 또는 용매로서, 물, 링거 용액, 등장성 식염수 등이 허용되고; 통상의 용매 또는 현탁 용매로서, 멸균 비휘발성 오일이 사용될 수 있다. 이 목적들을 위해, 천연 또는 합성 또는 반합성 지방 오일 또는 지방산; 천연 또는 합성 또는 반합성 모노글리세라이드, 디글리세라이드 또는 트리글리세라이드를 비롯한 임의의 종류의 비휘발성 오일 및 지방산이 사용될 수 있다. 비경구 투여는 당분야에서 공지되어 있고, 통상적인 주사 수단, 미국 특허 제5,851,198호에 기재된 기체 가압 무바늘 주사 디바이스, 및 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,839,446호에 기재된 레이저 천공기 디바이스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
대안적 전달
본 발명은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 공동내, 복강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장막내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액내, 흉강내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비내 또는 경피 수단에 의한 적어도 하나의 CARTyrin의 투여에 관한 것이기도 하다. 적어도 하나의 CARTyrin 조성물은 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구(피하, 근육내 또는 정맥내) 또는 임의의 다른 투여에 사용되도록; 특히 반고체 형태, 예컨대, 크림 및 좌약(그러나, 이들로 제한되지 않음) 형태로 질 또는 직장 투여에 사용되도록; 예컨대, 정제 또는 캡슐(그러나, 이들로 제한되지 않음)의 형태로 협측 또는 설하 투여에 사용되도록; 예컨대, 분말, 점비액 또는 에어로졸 또는 특정 작용제(그러나, 이들로 제한되지 않음)의 형태로 비내 투여에 사용되도록; 또는 피부 구조를 변형시키거나 경피 패치에서 약물 농도를 증가시키기 위해 화학적 증강제, 예컨대, 디메틸 설폭사이드(전체적으로 본원에 참고로 포함된 문헌[Junginger, et al. In “Drug Permeation Enhancement;” Hsieh, D. S., Eds., pp. 59-90 (Marcel Dekker, Inc. New York 1994])와 함께, 또는 단백질 및 펩타이드를 함유하는 제제를 피부 상에 적용할 수 있게 하거나(WO 98/53847), 전기장을 적용하여 일시적 수송 경로, 예컨대, 전기천공을 생성할 수 있게 하거나 피부를 통한 하전된 약물의 이동성, 예컨대, 이온영동을 증가시킬 수 있게 하거나, 초음파, 예컨대, 음파영동(미국 특허 제4,309,989호 및 제4,767,402호)을 적용할 수 있게 하는 산화제와 함께 경피 투여, 예컨대, 겔, 연고, 로션, 현탁액 또는 패치 전달 시스템(그러나, 이들로 제한되지 않음)에 의한 투여에 사용되도록 제조될 수 있다(상기 공개문헌 및 특허들은 전체적으로 본원에 참고로 포함됨).
입양 세포 요법으로서 변형된 세포의 주입
본 개시는 선택된 및/또는 확장된 본 개시의 하나 이상의 CAR 및/또는 CARTyrin을 발현하는 변형된 세포로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 변형된 세포를 제공한다. 본 개시의 변형된 세포는 실온 및 체온을 포함하는 임의의 온도에서 저장되도록 제제화될 수 있다. 본 개시의 변형된 세포는 냉동보존 및 후속 해동을 위해 제제화될 수 있다. 본 개시의 변형된 세포는 멸균 포장물로부터 대상체에게 직접적으로 투여되도록 약학적으로 허용 가능한 담체에 제제화될 수 있다. 본 개시의 변형된 세포는 최소 수준의 세포 작용 및 CAR/CARTyrin 발현을 보장하기 위해 세포 생존능 및/또는 CAR/CARTyrin 발현 수준의 표시자와 함께 약학적으로 허용 가능한 담체에 제제화될 수 있다. 본 개시의 변형된 세포는 추가 확장을 억제하고/하거나 세포 사멸을 예방하는 하나 이상의 물질과 함께 규정된 밀도로 약학적으로 허용 가능한 담체에 제제화될 수 있다.
유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드가 훨씬 더 낮은 면역원성을 갖기 때문에, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 기존 유도성 폴리펩타이드보다 더 우수하다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드가 재조합 폴리펩타이드이므로, 비-천연 발생 폴리펩타이드이지만, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 생성하기 위해 재조합되는 서열은 숙주 인간 면역 시스템이 "비-자가"로서 인식함으로써, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 세포, 또는 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드 또는 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 제공받는 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 비-인간 서열을 포함하지 않는다.
본 개시는 리간드 결합 영역, 링커 및 아폽토시스 유발성 펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드로서, 비-인간 서열을 포함하지 않는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 비-인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 아폽토시스 유발성 펩타이드는 캐스파제 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 캐스파제 폴리펩타이드는 캐스파제 9 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 캐스파제 9 폴리펩타이드는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드이다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-천연 발생 폴리펩타이드일 수 있다.
본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드는 캐스파제 1, 캐스파제 2, 캐스파제 3, 캐스파제 4, 캐스파제 5, 캐스파제 6, 캐스파제 7, 캐스파제 8, 캐스파제 9, 캐스파제 10, 캐스파제 11, 캐스파제 12 및 캐스파제 14를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드는 캐스파제 2, 캐스파제 3, 캐스파제 6, 캐스파제 7, 캐스파제 8, 캐스파제 9 및 캐스파제 10을 포함하는, 아폽토시스와 관련된 캐스파제 폴리펩타이드들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드는 캐스파제 2, 캐스파제 8, 캐스파제 9 및 캐스파제 10을 포함하는, 아폽토시스를 개시하는 캐스파제 폴리펩타이드들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드는 캐스파제 3, 캐스파제 6 및 캐스파제 7을 포함하는, 아폽토시스를 수행하는 캐스파제 폴리펩타이드들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드는 야생형 아미노산 또는 핵산 서열에 비해 하나 이상의 변형을 가진 아미노산 또는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드의 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 하나 이상의 변형은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열에 비해 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드의 상호작용, 교차결합, 교차활성화 또는 활성화를 증가시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드의 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 하나 이상의 변형은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열에 비해 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드는 야생형 캐스파제 폴리펩타이드에 비해 단축될 수 있다. 예를 들면, 캐스파제 폴리펩타이드는 본 개시의 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 개시하는 것 이외에 국소 염증 반응을 활성화시킬 가능성을 제거하거나 최소화하기 위해 캐스파제 활성화 및 동원 도메인(CARD)을 코딩하는 서열을 제거하도록 단축될 수 있다. 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 야생형 캐스파제 폴리펩타이드에 비해 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드의 변이체 아미노산 서열을 형성하도록 스플라이싱될 수 있다. 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드는 재조합 및/또는 키메라 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 개시의 재조합 및/또는 키메라 캐스파제 폴리펩타이드는 하나 이상의 상이한 캐스파제 폴리펩타이드로부터의 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시의 재조합 및/또는 키메라 캐스파제 폴리펩타이드는 하나 이상의 종으로부터의 서열(예를 들면, 인간 서열 및 비-인간 서열)을 포함할 수 있다. 본 개시의 캐스파제 폴리펩타이드는 비-천연 발생 캐스파제 폴리펩타이드일 수 있다.
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 리간드 결합 영역은 본 개시의 제1 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드와 본 개시의 제2 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 이량체화를 용이하게 하거나 촉진하는 임의의 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있고, 이때 상기 이량체화는 세포에서 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 교차결합 및 아폽토시스의 개시를 활성화시키거나 유도한다.
리간드 결합("이량체화") 영역은 내생성 또는 비-천연 발생 리간드(즉, 유도제), 예를 들면, 비-천연 발생 합성 리간드를 사용한 유도를 가능하게 할 임의의 폴리펩타이드 또는 이의 작용성 도메인을 포함할 수 있다. 리간드 결합 영역은 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 성질 및 리간드(즉, 유도제)의 선택에 따라 세포막의 내부 또는 외부에 존재할 수 있다. 수용체를 비롯한, 매우 다양한 리간드 결합 폴리펩타이드들 및 이의 작용성 도메인들이 공지되어 있다. 본 개시의 리간드 결합 영역은 수용체로부터의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 공지되어 있거나 용이하게 생성될 수 있는 리간드(예를 들면, 작은 유기 리간드)에 대한 리간드 결합 영역이 특히 관심을 끈다. 이 리간드 결합 영역 또는 수용체는 FKBP 및 사이클로필린(cyclophilin) 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체 등뿐만 아니라, 항체, 특히 중쇄 또는 경쇄 서브유닛, 이의 돌연변이된 서열, 확률적 절차인 조합 합성에 의해 수득된 무작위 아미노산 서열 등으로부터 수득될 수 있는 "비-천연 발생" 수용체도 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FKBP 리간드 결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드 결합 영역, 스테로이드 수용체 리간드 결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드 결합 영역 및 테트라사이클린 수용체 리간드 결합 영역으로 구성된 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 수용체 도메인(들)을 포함하는 리간드 결합 영역은 내생성 도메인 또는 이의 단축형 활성 부분으로서 적어도 약 50개의 아미노산 내지 약 350개 미만의 아미노산, 통상적으로 200개 미만의 아미노산일 수 있다. 결합 영역은 예를 들면, 작을 수 있고(< 25 kDa, 바이러스 벡터에 의한 효율적인 형질감염을 허용할 정도) 단량체일 수 있고 면역원성을 띠지 않을 수 있고 이량체화를 위해 배열될 수 있는 합성적으로 접근 가능한 세포 투과성 무독성 리간드를 가질 수 있다.
하나 이상의 수용체 도메인(들)을 포함하는 리간드 결합 영역은 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 디자인 및 적절한 리간드(즉, 유도제)의 이용 가능성에 따라 세포내 또는 세포외 리간드 결합 영역일 수 있다. 소수성 리간드의 경우, 결합 영역은 막의 어느 한 쪽에 있을 수 있으나, 친수성 리간드, 특히 단백질 리간드의 경우, 결합 영역은, 결합을 위해 이용될 수 있는 형태로 리간드를 내재화하기 위한 수송 시스템이 있지 않은 한, 통상적으로 세포막 외부에 존재할 것이다. 세포내 수용체의 경우, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 또는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하는 트랜스포존 또는 벡터는 수용체 도메인 서열의 5' 또는 3'에서 신호 펩타이드 및 막횡단 도메인을 코딩할 수 있거나, 수용체 도메인 서열의 5'에서 지질 부착 신호 서열을 가질 수 있다. 수용체 도메인이 신호 펩타이드와 막횡단 도메인 사이에 있는 경우, 상기 수용체 도메인은 세포외 수용체 도메인일 것이다.
항체 및 항체 서브유닛, 예를 들면, 중쇄 또는 경쇄, 구체적으로 단편, 보다 구체적으로 가변 영역의 전부 또는 일부, 또는 고친화성 결합을 생성하기 위한 중쇄와 경쇄의 융합체는 본 개시의 리간드 결합 영역으로서 사용될 수 있다. 고려되는 항체는 이소적으로 발현된 인간 생성물인 항체, 예컨대, 면역 반응을 유발하지 않을 것이고 일반적으로 말초(즉, CNS/뇌 영역 외부)에서 발현되지 않을 세포외 도메인을 포함한다. 이러한 예는 저친화성 신경 성장 인자 수용체(LNGFR) 및 배아 표면 단백질(즉, 암배아 항원)을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 생리학적으로 허용 가능한 햅텐 분자에 대한 항체를 제조할 수 있고, 결합 친화성에 대해 개별 항체 서브유닛을 스크리닝할 수 있다. 상기 서브유닛을 코딩하는 cDNA를 단리할 수 있고 불변 영역의 결실, 가변 영역의 부분, 가변 영역의 돌연변이유발 등으로 변형시켜, 리간드에 대한 적절한 친화성을 가진 결합 단백질 도메인을 수득할 수 있다. 이 방식으로, 거의 임의의 생리학적으로 허용 가능한 햅텐 화합물이 리간드로서 사용될 수 있거나, 리간드에 대한 에피토프를 제공하는 데 사용될 수 있다. 항체 유닛 대신에 내생성 수용체가 사용될 수 있고, 이때 결합 영역 또는 도메인은 공지되어 있고 결합을 위한 유용한 또는 공지된 리간드가 있다.
수용체를 다량체화하는 경우, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 리간드 결합 영역/수용체 도메인에 대한 리간드는 이 리간드가 적어도 2개의 결합 부위들을 가질 수 있다는 의미에서 다량체일 수 있고, 이때 각각의 결합 부위는 리간드 수용체 영역에 결합할 수 있다(즉, 제1 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 리간드 결합 영역에 결합할 수 있는 제1 결합 부위, 및 제2 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 리간드 결합 영역에 결합할 수 있는 제2 결합 부위를 가진 리간드로서, 제1 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 리간드 결합 영역과 제2 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 리간드 결합 영역이 동일하거나 상이한 것인 리간드). 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다량체 리간드 결합 영역"은 다량체 리간드에 결합하는 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 리간드 결합 영역을 지칭한다. 본 개시의 다량체 리간드는 이량체 리간드를 포함한다. 본 개시의 이량체 리간드는 리간드 수용체 도메인에 결합할 수 있는 2개의 결합 부위들을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 다량체 리간드는 합성 유기 소분자의 이량체, 또는 통상적으로 약 사량체보다 더 크지 않은 고차 올리고머이고, 이때 개별 분자는 전형적으로 적어도 약 150 Da 내지 약 5 kD 미만, 통상적으로 약 3 kDa 미만이다. 합성 리간드와 수용체의 다양한 쌍들이 사용될 수 있다. 예를 들면, 내생성 수용체를 수반하는 실시양태에서, 이량체 FK506은 FKBP12 수용체와 함께 사용될 수 있고, 이량체화된 사이클로스포린 A는 사이클로필린 수용체와 함께 사용될 수 있고, 이량체화된 에스트로겐은 에스트로겐 수용체와 함께 사용될 수 있고, 이량체화된 글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체와 함께 사용될 수 있고, 이량체화된 테트라사이클린은 테트라사이클린 수용체와 함께 사용될 수 있고, 이량체화된 비타민 D는 비타민 D 수용체와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로, 고차, 예를 들면, 삼량체 리간드가 사용될 수 있다. 비-천연 발생 수용체, 예를 들면, 항체 서브유닛, 변형된 항체 서브유닛, 유연성 링커에 의해 분리된, 일렬로 늘어선 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 단일 쇄 항체, 또는 변형된 수용체, 및 이들의 돌연변이된 서열 등을 수반하는 실시양태의 경우, 매우 다양한 화합물들 중 임의의 화합물이 사용될 수 있다. 본 개시의 다량체 리간드를 포함하는 유닛의 유의미한 특성은 각각의 결합 부위가 고친화성으로 수용체에 결합할 수 있다는 점, 및 바람직하게는 이러한 결합 부위가 화학적으로 이량체화될 수 있다는 점이다. 또한, 리간드가 작용 수준으로 혈청에 용해될 수 있되, 대다수의 적용을 위해 원형질막을 가로질러 확산할 수 있도록 리간드의 소수성/친수성의 균형을 달성하는 방법이 이용될 수 있다.
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 활성화는 예를 들면, 유도제에 의해 매개된 화학적으로 유도된 이량체화(CID)를 통해 달성되어, 조건에 따라 조절되는 단백질 또는 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 본 개시의 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드일 뿐만 아니라, 이 폴리펩타이드의 유도 또한 불안정한 이량체화제의 분해 또는 단량체 경쟁 억제제의 투여로 인해 가역적이다.
일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 위치 36에서 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환(F36V)을 가진 FKBP12 폴리펩타이드를 포함한다. 리간드 결합 영역이 위치 36에서 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환(F36V)을 가진 FKBP12 폴리펩타이드를 포함하는 것인 일부 실시양태에서, 유도제는 합성 약물인 AP1903(CAS 인덱스 명칭: 2-피페리딘카르복실산, 1-[(2S)-1-옥소-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부틸]-, 1,2-에탄디일비스[이미노(2-옥소-2,1-에탄디일)옥시-3,1-페닐렌[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로필리덴]]에스테르, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS 등록번호: 195514-63-7; 분자식: C78H98N4O20; 분자량: 1411.65))을 포함할 수 있다. 리간드 결합 영역이 위치 36에서 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환(F36V)을 가진 FKBP12 폴리펩타이드를 포함하는 것인 일부 실시양태에서, 유도제는 AP20187(CAS 등록번호: 195514-80-8 및 분자식: C82H107N5O20)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도제는 AP20187 유사체, 예를 들면, AP1510이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 유도제 AP20187, AP1903 및 AP1510은 교환 가능하게 사용될 수 있다.
AP1903 API는 알포라 리서치 인코포레이티드(Alphora Research Inc.)에 의해 제조되고, 주사용 AP1903 약품은 포르마텍 인코포레이티드(Formatech Inc.)에 의해 제조된다. 이것은 비-이온성 가용화제 솔루톨 HS 15(250 mg/㎖, BASF)의 25% 용액 중의 5 mg/㎖ AP1903 용액으로서 제제화된다. 실온에서, 이 제제는 투명한 연한 황색 용액이다. 냉장 시, 이 제제는 가역적 상 전이를 겪음으로써, 유백색 용액을 생성한다. 이 상 전이는 실온까지 재가온할 때 역전된다. 충전은 3 ㎖ 유리 바이알에서 2.33 ㎖이다(바이알당 주사 전체를 위한 대략 10 mg AP1903). AP1903을 투여할 필요성을 확인할 때, 예를 들면, 비-DEHP 비-에틸렌 산화물 멸균된 주입 세트를 사용하여 2시간에 걸쳐 IV 주입을 통해 단회 고정된 용량의 주사용 AP1903(0.4 mg/kg)을 환자에게 투여할 수 있다. 모든 환자들에 대해 개별적으로 AP1903의 용량을 계산하고, 체중이
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10%까지 변동되지 않는 한, 재계산하지 않는다. 계산된 용량을 주입 전에 100 ㎖의 0.9% 생리 식염수로 희석한다. AP1903의 종래 I 상 연구에서, 24명의 건강한 지원자들을 2시간에 걸쳐 IV 주입된 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mg/kg의 용량 수준으로 단회 용량의 주사용 AP1903으로 치료하였다. AP1903 혈장 수준은 용량에 정비례하였고, 이때 평균 Cmax 값은 0.01 내지 1.0 mg/kg 용량 범위에 걸쳐 대략 10 내지 1275 ng/㎖이었다. 초기 주입 시간 후, 혈중 농도는 신속한 분포 상을 입증하였고, 이때 혈장 수준은 투약 후 0.5시간, 2시간 및 10시간에서 각각 최대 농도의 대략 18%, 7% 및 1%까지 감소되었다. 주사용 AP1903은 모든 용량 수준에서 안전하고 내약성이 우수한 것으로 확인되었고 유리한 약동학적 프로파일을 나타내었다(Iuliucci J D, et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001).
예를 들면, 사용된 주사용 AP1903의 고정된 용량은 2시간에 걸쳐 정맥내로 주입된 0.4 mg/kg일 수 있다. 세포의 효과적인 신호전달을 위해 시험관내에서 요구되는 AP1903의 양은 10 내지 100 nM(1600 Da MW)이다. 이것은 16 내지 160 ㎍/ℓ 또는 약 0.016 내지 1.6 ㎍/kg(1.6 내지 160 ㎍/kg)에 해당한다. 1 mg/kg 이하의 용량은 전술된 AP1903의 I 상 연구에서 내약성이 우수하였다. 따라서, 0.4 mg/kg은 치료 세포와 함께 이 I 상 연구를 위한 AP1903의 안전하고 효과적인 용량일 수 있다.
본 개시의 리간드 결합을 코딩하는 아미노산 및/또는 핵산 서열은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열에 비해 하나 이상의 서열 변형을 함유할 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 리간드 결합 영역을 코딩하는 아미노산 및/또는 핵산 서열은 코돈-최적화된 서열일 수 있다. 상기 하나 이상의 변형은 야생형 폴리펩타이드에 비해 본 개시의 리간드 결합 영역에 대한 리간드(예를 들면, 유도제)의 결합 친화성을 증가시킬 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 상기 하나 이상의 변형은 야생형 폴리펩타이드에 비해 본 개시의 리간드 결합 영역의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 본 개시의 리간드 결합 영역 및/또는 본 개시의 유도제는 비-천연적으로 발생될 수 있다.
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 리간드 결합 영역, 링커 및 아폽토시스 유발성 펩타이드를 포함하고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 링커는 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 상호작용 또는 활성화가 세포에서 아폽토시스를 개시하도록 리간드 결합 영역의 이량체화 시 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 상호작용, 교차결합, 교차활성화 또는 활성화를 허용하는 임의의 유기 또는 무기 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 G/S 풍부 아미노산 서열("GS" 링커)을 포함하는 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGGGS(서열번호 18028)을 포함하는 폴리펩타이드이다. 바람직한 실시양태에서, 링커는 폴리펩타이드이고, 이 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 제한 핵산내부분해효소를 위한 제한 부위를 함유하지 않는다. 본 개시의 링커는 비-천연적으로 발생될 수 있다.
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 세포에서 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 발현을 개시할 수 있고/있거나 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절 하에서 그 세포에서 발현될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "프로모터"는 RNA 중합효소가 유전자를 전사하도록 초기 결합 부위로서 작용하는 프로모터를 지칭한다. 예를 들면, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 천연 프로모터, 내생성 프로모터, 외생성 프로모터 및 이종 프로모터를 포함하나, 이들로 제한되지 않는, 포유동물 세포에서 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 발현을 개시할 수 있고/있거나 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절 하에서 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 바람직한 포유동물 세포는 인간 세포를 포함한다. 따라서, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 인간 프로모터 또는 바이러스 프로모터를 포함하나, 이들로 제한되지 않는, 인간 세포에서 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 발현을 개시할 수 있고/있거나 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절 하에서 인간 세포에서 발현될 수 있다. 인간 세포에서의 발현을 위한 예시적 프로모터는 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복부, β-액틴 프로모터, 래트 인슐린 프로모터 및 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 프로모터를 포함하나, 이들로 제한되지 않고, 이 프로모터들 각각은 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 고수준 발현을 수득하는 데 사용될 수 있다. 발현 수준이 세포에서 아폽토시스를 개시하는 데 충분하다면, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 발현을 달성하기 위해 당분야에서 잘 공지된 다른 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 세균 파지 프로모터를 사용하는 것도 고려된다. 잘 공지된 성질을 가진 프로모터를 사용함으로써, 형질감염 또는 형질전환 후 관심 있는 단백질의 발현 수준 및 패턴을 최적화할 수 있다.
특정 생리학적 또는 합성 신호에 반응하여 조절되는 프로모터의 선택은 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 유도성 발현을 허용할 수 있다. 엑디손(ecdysone) 시스템(인비트로겐, 캘리포니아주 칼스바드 소재)은 이러한 시스템 중 하나이다. 이 시스템은 포유동물 세포에서 관심 있는 유전자의 조절된 발현을 가능하게 하도록 디자인된다. 이것은 전이유전자의 기초 수준 발현을 사실상 허용하지 않으나 200배 이상의 유도성을 허용하는, 엄격히 조절되는 발현 기작으로 구성된다. 상기 시스템은 초파리(Drosophila)의 이종이량체성 엑디손 수용체에 기반을 두고, 엑디손 또는 유사체, 예컨대, 뮤리스테론(muristerone) A가 상기 수용체에 결합할 때, 상기 수용체는 다운스트림 전이유전자의 발현을 켜도록 프로모터를 활성화시키고, 고수준의 mRNA 전사체가 수득된다. 이 시스템에서, 이종이량체성 수용체의 단량체들 둘 다가 한 벡터로부터 항시적으로 발현되는 반면, 관심 있는 유전자의 발현을 유도하는 엑디손 반응성 프로모터는 또 다른 플라스미드 상에 존재한다. 따라서, 관심 있는 벡터 내로의 이 유형의 시스템의 조작은 유용할 수 있다. 유용할 수 있는 또 다른 유도성 시스템은 고센(Gossen)과 부자드(Bujard)(Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossen et al., Science, 268:1766-1769, 1995)에 의해 최초로 개발된 Tet-Off™ 또는 Tet-On™ 시스템(클론텍(Clontech), 캘리포니아주 팔로 알토 소재)이다. 또한, 이 시스템은 고수준의 유전자 발현이 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유도체, 예컨대, 독시사이클린에 반응하여 조절될 수 있게 한다. Tet-On™ 시스템에서, 유전자 발현은 독시사이클린의 존재 하에서 켜지는 반면, Tet-Off™ 시스템에서 유전자 발현은 독시사이클린의 부재 하에서 켜진다. 이 시스템들은 이. 콜라이의 테트라사이클린 내성 오페론으로부터 유래한 2개의 조절 요소들, 즉 (테트라사이클린 리프레서가 결합하는) 테트라사이클린 오퍼레이터 서열 및 테트라사이클린 리프레서 단백질에 기반을 둔다. 관심 있는 유전자는 테트라사이클린 반응성 요소가 존재하는 프로모터 뒤에서 플라스미드 내로 클로닝된다. Tet-Off™ 시스템에서 제2 플라스미드는 헤르페스 심플렉스 바이러스로부터의 VP16 도메인 및 야생형 테트라사이클린 리프레서로 구성된, 테트라사이클린에 의해 조절되는 트랜스활성화제로서 지칭되는 조절 요소를 함유한다. 따라서, 독시사이클린의 부재 하에서, 전사는 항시적으로 켜져 있다. Tet-On™ 시스템에서, 테트라사이클린 리프레서는 야생형이 아니고, 독시사이클린의 존재 하에서 전사를 활성화시킨다. 유전자 요법 벡터 생성의 경우, Tet-Off™ 시스템은 생산자 세포가 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 하에서 성장할 수 있고 잠재적 독성 전이유전자의 발현을 방지하도록 사용될 수 있으나, 벡터가 환자에 도입될 때, 유전자 발현은 항시적으로 켜져 있을 것이다.
일부 환경에서, 유전자 요법 벡터 내의 전이유전자의 발현을 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 다양한 강도의 활성을 가진 상이한 바이러스 프로모터들이 원하는 발현 수준에 따라 사용된다. 포유동물 세포에서, CMV 즉시 초기 프로모터는 강한 전사 활성화를 제공하기 위해 종종 사용된다. CMV 프로모터는 문헌[Donnelly, J. J., et al., 1997. Annu. Rev. Immunol. 15:617-48]에서 검토되어 있다. 덜 강력한 변형된 버전의 CMV 프로모터도 전이유전자의 감소된 발현 수준이 요구될 때 사용된다. 조혈 세포에서의 전이유전자의 발현을 원할 때, 레트로바이러스 프로모터, 예컨대, MLV 또는 MMTV로부터의 LTR이 종종 사용된다. 원하는 효과에 따라 사용되는 다른 바이러스 프로모터는 SV40, RSV LTR, HIV-1 및 HIV-2 LTR, 아데노바이러스 프로모터, 예컨대, E1A, E2A 또는 MLP 영역으로부터의 아데노바이러스 프로모터, AAV LTR, HSV-TK, 및 조류 육종 바이러스를 포함한다.
다른 예에서, 발생적으로 조절되고 특정 분화된 세포에서 활성을 띠는 프로모터가 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 프로모터는 전분화능 줄기 세포에서 활성을 나타내지 않을 수 있으나, 예를 들면, 전분화능 줄기 세포가 더 성숙한 세포로 분화하는 경우, 프로모터는 활성화될 수 있다
유사하게 조직 특이적 프로모터는 표적화되지 않은 조직에 대한 잠재적 독성 또는 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위해 특정 조직 또는 세포에서 전사를 수행하는 데 사용된다. 이 프로모터는 더 강한 프로모터, 예컨대, CMV 프로모터에 비해 감소된 발현을 야기할 수 있으나, 더 제한된 발현 및 면역원성을 야기할 수도 있다(Bojak, A., et al., 2002. Vaccine. 20:1975-79; Cazeaux, N., et al., 2002. Vaccine 20:3322-31). 예를 들면, 조직 특이적 프로모터, 예컨대, PSA 관련 프로모터 또는 전립선 특이적 선 칼리크레인(glandular kallikrein), 또는 근육 크레아틴 키나제 유전자가 적절한 경우 사용될 수 있다.
조직 특이적 또는 분화 특이적 프로모터의 예는 하기 프로모터들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다: B29(B 세포); CD14(단핵구 세포); CD43(백혈구 및 혈소판); CD45(조혈 세포); CD68(대식세포); 데스민(desmin)(근육); 엘라스타제(elastase)-1(췌장 선방(acinar) 세포); 엔도글린(endoglin)(내피 세포); 피브로넥틴(분화 세포, 치유 조직); 및 Flt-1(내피 세포); GFAP(성상세포).
일부 적응증에서, 유전자 요법 벡터의 투여 후 특정 시간에 전사를 활성화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 호르몬 또는 사이토카인에 의해 조절될 수 있는 프로모터와 같은 프로모터에 의해 수행된다. 사용될 수 있는 사이토카인 및 염증 단백질 반응성 프로모터는 K 및 T 키니노겐(kininogen)(Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351), c-fos, TNF-알파, C-반응성 단백질(Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(8), 3195-3207), 햅토글로빈(haptoglobin)(Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912), 혈청 아밀로이드 A2, C/EBP 알파, IL-1, IL-6(Poli and Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 8202-8206), 보체 C3(Wilson et al., (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191), IL-8, 알파-1 산 당단백질(Prowse and Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51), 알파-1 항트립신, 지단백질 리파제(lipase)(Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988), 안지오텐시노겐(angiotensinogen)(Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895), 피브리노겐, c-jun(포르볼 에스테르, TNF-알파, UV 방사선, 레티노산 및 과산화수소에 의해 유도될 수 있음), 콜라겐분해효소(collagenase)(포르볼 에스테르 및 레티노산에 의해 유도됨), 메탈로티오네인(metallothionein)(중금속 및 글루코코르티코이드 유도성), 스트로멜라이신(Stromelysin)(포르볼 에스테르, 인터류킨-1 및 EGF에 의해 유도될 수 있음), 알파-2 마크로글로불린 및 알파-1 항-키모트립신(chymotrypsin)을 포함한다. 다른 프로모터는 예를 들면, SV40, MMTV, 인간 면역결핍 바이러스(MV), 몰로니(Moloney) 바이러스, ALV, 엡스테인 바(Epstein Barr) 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 인간 액틴, 미요신, 헤모글로빈 및 크레아틴을 포함한다.
상기 프로모터들 중 임의의 프로모터는 단독으로 또는 또 다른 프로모터와 함께 원하는 작용에 따라 유용할 수 있을 것으로 예상된다. 프로모터 및 다른 조절 요소는 이들이 원하는 세포 또는 조직에서 작용하도록 선택된다. 추가로, 프로모터의 이 목록은 완전한 또는 제한적인 것으로 해석되어서는 안 되고; 다른 프로모터가 본원에 개시된 프로모터 및 방법과 함께 사용된다.
강화된(armored) T 세포 "넉다운" 전략
본 개시의 T 세포는 그의 치료 잠재력을 향상시키도록 유전적으로 변형될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시의 T 세포는 이 세포를 면역학적 및/또는 대사적 체크포인트에 덜 민감하게 만들도록 변형될 수 있다. 이 유형의 변형은 본 개시의 T 세포를 "강화"시키고, 이 변형 후 상기 T 세포는 본원에서 "강화된" T 세포로서 지칭될 수 있다. 본 개시의 강화된 T 세포는 예를 들면, 종양 면역억제 미세환경 내의 T 세포에게 전달되는 특정 내생성 체크포인트 신호를 차단하고/하거나 희석함으로써(즉, 체크포인트 억제) 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 강화된 T 세포는 T 세포, NK 세포, 조혈 조상 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포(G-CSF-동원된 말초 혈액으로부터 단리되거나 유래한 T 세포를 포함함), 또는 제대혈(UCB) 유래 T 세포로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 강화된 T 세포는 본 개시의 키메라 리간드 수용체(단백질 스카폴드, 항체, ScFv 또는 항체 모방체를 포함하는 CLR)/키메라 항원 수용체(단백질 스카폴드, 항체, ScFv 또는 항체 모방체를 포함하는 CAR), CARTyrin(센티린을 포함하는 CAR) 및/또는 VCAR(낙타과 VHH 또는 단일 도메인 VH를 포함하는 CAR) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 강화된 T 세포는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 포함하고, 이때 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 비-인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 비-인간 서열은 제한 부위이다. 일부 실시양태에서, 리간드 결합 영역 유도성 캐스파제 폴리펩타이드는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형은 위치 36에서 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환(F36V)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 강화된 T 세포는 외생성 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외생성 서열은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 예시적 치료 단백질은 핵 단백질, 세포질 단백질, 세포내 단백질, 막횡단 단백질, 세포 표면에 결합된 단백질 또는 분비된 단백질일 수 있다. 강화된 T 세포에 의해 발현되는 예시적 치료 단백질은 강화된 T 세포의 활성을 변형시킬 수 있거나 제2 세포의 활성을 변형시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 강화된 T 세포는 선택 유전자 또는 선택 마커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 강화된 T 세포는 (본원에서 유도성 전이유전자 구축물로서도 지칭되는) 합성 유전자 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 억제 체크포인트 신호의 수용체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 억제 체크포인트 신호의 예는 본 개시의 CAR-T 세포 상의 PD-1 수용체에 결합하는 PD-L1 리간드, 또는 CAR-T 세포 상의 TGFβRII 수용체에 결합하는 TGFβ 사이토카인을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 억제 체크포인트 신호의 수용체는 T 세포의 세포 표면 상에서 또는 세포질 내에서 발현된다. 억제 체크포인트 신호의 수용체를 코딩하는 유전자의 발현의 침묵 또는 감소는 본 개시의 강화된 T 세포의 표면 상에서 또는 세포질 내에서의 억제 체크포인트 수용체의 단백질 발현의 손실을 야기한다. 따라서, 억제 체크포인트 수용체를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 침묵된 또는 감소된 발현을 가진 본 개시의 강화된 T 세포는 체크포인트 신호에 대한 내성, 비-수용성 또는 불감성을 가진다. 억제 체크포인트 신호에 대한 강화된 T 세포의 내성 또는 감소된 민감성은 이 억제 체크포인트 신호의 존재 하에서 강화된 T 세포의 치료 잠재력을 향상시킨다. 억제 체크포인트 신호는 표 1에 나열된 예를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 강화된 T 세포에서 침묵될 수 있는 예시적 억제 체크포인트 신호는 PD-1 및 TGFβRII를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00227
Figure pct00228
일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 체크포인트 신호전달에 관여하는 세포내 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 본 개시의 T 세포의 활성은 체크포인트 신호전달 경로에 관여하는 임의의 세포내 신호전달 단백질을 표적화함으로써, 하나 이상의 체크포인트 경로에 대한 체크포인트 억제 또는 간섭을 달성함으로써 향상될 수 있다. 체크포인트 신호전달에 관여하는 세포내 신호전달 단백질은 표 2에 나열된 예시적 세포내 신호전달 단백질들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00229
일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 요법의 효능을 방해하는 전사 인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 강화된 T 세포의 활성은 요법의 효능을 방해하는 전사 인자의 발현을 침묵시키거나 감소시킴으로써(또는 작용을 억제함으로써) 향상될 수 있거나 조절될 수 있다. 발현을 침묵시키거나 감소시키거나 그의 작용을 억제하도록 변형될 수 있는 예시적 전사 인자는 표 3에 나열된 예시적 전사 인자들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 개시의 강화된 T 세포에서 FOXP3 유전자의 발현을 침묵시키거나 감소시켜, 요법의 효능을 감소시킬 수 있는 발현 또는 활성을 가진 T 조절 CAR-T 세포(CAR-Treg 세포)의 형성을 방해할 수 있거나 감소시킬 수 있다.
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일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 세포 사멸 또는 세포 아폽토시스 수용체를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 사멸 수용체와 그의 내생성 리간드의 상호작용은 아폽토시스의 개시를 야기한다. 세포 사멸 및/또는 세포 아폽토시스 수용체 및/또는 리간드의 발현, 활성 또는 상호작용의 파괴는 본 개시의 강화된 T 세포가 사멸 신호를 덜 수용하게 만듦으로써, 본 개시의 강화된 T 세포가 종양 환경에서 더 우수한 효능을 갖게 만든다. 본 개시의 강화된 T 세포에서 변형될 수 있는 예시적 세포 사멸 수용체는 Fas(CD95)이다. 본 개시의 예시적 세포 사멸 및/또는 세포 아폽토시스 수용체 및 리간드는 표 4에 제공된 예시적 수용체들 및 리간드들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00270
일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 대사 감지 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 본 개시의 강화된 T 세포에 의한 면역억제 종양 미세환경(저수준의 산소, pH, 글루코스 및 다른 분자를 특징으로 함)의 대사 감지의 파괴는 T 세포 작용의 연장된 보유를 유발함으로써, 강화된 T 세포당 더 많은 종양 세포가 사멸되게 한다. 예를 들면, HIF1a 및 VHL은 저산소 환경에서 T 세포 작용에 있어서 역할을 한다. 본 개시의 강화된 T 세포는 HIF1a 또는 VHL을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 침묵된 또는 감소된 발현을 가질 수 있다. 대사 감지에 관여하는 유전자 및 단백질은 표 5에 제공된 예시적 유전자들 및 단백질들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00271
Figure pct00272
일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 단일클론 항체를 포함하는, 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜, 본 개시의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 따라서, 본 개시의 강화된 T 세포는 암 요법(예를 들면, 화학요법, 단일클론 항체 요법 또는 또 다른 항-종양 치료)의 존재 하에서 작용할 수 있고 더 우수한 작용 또는 효능을 나타낼 수 있다. 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 데 관여하는 단백질은 표 6에 제공된 예시적 단백질들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00273
일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 성장 이점 인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 발암유전자의 발현의 침묵 또는 감소는 본 개시의 강화된 T 세포에게 성장 이점을 부여할 수 있다. 예를 들면, CAR-T 제조 과정 동안 TET2 유전자의 발현의 침묵 또는 감소(예를 들면, 발현의 파괴)는 확장 능력을 결여하는 비-강화된 CAR-T에 비해 유의미한 확장 및 후속 종양 박멸 능력을 가진 강화된 CAR-T의 생성을 야기한다. 이 전략은 대상체로부터의 불리한 반응 또는 강화된 CAR-T의 조절되지 않은 성장의 경우 강화된 CAR-T 세포의 표적화된 파괴를 가능하게 하는 안전성 스위치(예를 들면, 본 개시의 iC9 안전성 스위치)에 커플링될 수 있다. 예시적 성장 이점 인자는 표 7에 제공된 인자들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00274
강화된 T 세포 "널 또는 스위치 수용체" 전략
일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 변형된/키메라 체크포인트 수용체를 발현하여 본 개시의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 널 수용체, 미끼(decoy) 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다. 본 개시의 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체는 변형된/키메라 수용체/단백질일 수 있다. 본 개시의 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체는 세포내 신호전달 도메인의 발현을 위해 단축될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시의 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체는 효과적인 신호전달을 위해 결정적인 또는 요구되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 세포내 신호전달 도메인 내에서 돌연변이될 수 있다. 본 개시의 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체의 단축 또는 돌연변이는 체크포인트 신호를 세포에게 또는 세포 내에서 전달하거나 전달하는 수용체의 능력의 상실을 야기할 수 있다.
예를 들면, 종양 세포의 표면 상에서 발현된 PD-L1 수용체로부터의 면역억제 체크포인트 신호의 희석 또는 차단은 강화된 T 세포의 표면 상에서 발현된 내생성(비변형된) PD-1 수용체와 효과적으로 경쟁하여, 상기 강화된 T 세포의 내생성 PD-1 수용체를 통한 면역억제 체크포인트 신호의 전달을 감소시키거나 억제하는 변형된/키메라 PD-1 널 수용체를 본 개시의 강화된 T 세포의 표면 상에서 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 이 예시적 실시양태에서, 종양 세포 상에서 발현된 PD-L1에의 결합에 대한 2개의 상이한 수용체들 사이의 경쟁은 효과적인 체크포인트 신호전달의 수준을 감소시키거나 경감시킴으로써, PD-1 널 수용체를 발현하는 강화된 T 세포의 치료 잠재력을 향상시킨다.
일부 실시양태에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 막횡단 수용체인 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 막-회합된 또는 막-결합된 수용체/단백질인 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 세포내 수용체/단백질인 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 세포내 수용체/단백질인 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다. 본 개시의 예시적 널, 미끼 또는 우성 음성 세포내 수용체/단백질은 억제 체크포인트 신호의 다운스트림에 있는 신호전달 성분(예를 들면, 표 1 및 2에 제공됨), 전사 인자(예를 들면, 표 3에 제공됨), 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드(예를 들면, 표 4에 제공됨), 대사 감지 분자(예를 들면, 표 5에 제공됨), 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 단백질(예를 들면, 표 6에 제공됨), 및 발암유전자 또는 종양 서프레서 유전자(예를 들면, 표 7에 제공됨)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시의 예시적 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체는 표 8에 제공된 사이토카인 및 사이토카인 수용체뿐만 아니라 케모카인 및 케모카인 수용체도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00275
Figure pct00276
Figure pct00277
Figure pct00278
Figure pct00279
일부 실시양태에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 스위치 수용체를 포함한다. 예시적 스위치 수용체는 본 개시의 변형된/키메라 수용체/단백질을 포함할 수 있고, 이때 천연 또는 야생형 세포내 신호전달 도메인은 상기 단백질에 비-천연적이고/이거나 야생형 도메인이 아닌 상이한 세포내 신호전달 도메인으로 교체되거나 대체된다. 예를 들면, 자극 신호전달 도메인에 의한 억제 신호전달 도메인의 대체는 면역억제 신호를 면역자극 신호로 교체할 것이다. 대안적으로, 상이한 억제 도메인에 의한 억제 신호전달 도메인의 대체는 억제 신호전달의 수준을 감소시킬 수 있거나 향상시킬 수 있다. 스위치 수용체의 발현 또는 과다발현은 면역억제 종양 미세환경 내에서 발현된 동족 체크포인트 수용체에의 결합에 대해 내생성 야생형 체크포인트 수용체(스위치 수용체가 아님)와 경쟁함으로써 동족 체크포인트 신호의 희석 및/또는 차단을 야기할 수 있다. 본 개시의 강화된 T 세포는 본 개시의 스위치 수용체를 코딩하는 서열을 포함하여, 본 개시의 하나 이상의 스위치 수용체의 발현을 유발함으로써, 본 개시의 강화된 T 세포의 활성을 변경시킬 수 있다. 본 개시의 강화된 T 세포는 본 개시의 체크포인트 수용체, 전사 인자, 사이토카인 수용체, 사멸 수용체, 대사 감지 분자, 암 요법, 발암유전자, 및/또는 종양 서프레서 단백질 또는 유전자의 다운스트림에 있는 세포내 발현된 단백질을 표적화하는 본 개시의 스위치 수용체를 발현할 수 있다.
본 개시의 예시적 스위치 수용체는 억제 체크포인트 신호의 다운스트림에 있는 신호전달 성분(예를 들면, 표 1 및 2에 제공됨), 전사 인자(예를 들면, 표 3에 제공됨), 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드(예를 들면, 표 4에 제공됨), 대사 감지 분자(예를 들면, 표 5에 제공됨), 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 단백질(예를 들면, 표 6에 제공됨), 및 발암유전자 또는 종양 서프레서 유전자(예를 들면, 표 7에 제공됨)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 단백질을 포함할 수 있거나 이러한 단백질로부터 유래할 수 있다. 본 개시의 예시적 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체는 표 8에 제공된 사이토카인 및 사이토카인 수용체뿐만 아니라 케모카인 및 케모카인 수용체도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
강화된 T 세포 "합성 유전자 발현" 전략
일부 실시양태에서, 본 개시의 T 세포는 조건부 유전자 발현을 매개하는 키메라 리간드 수용체(CLR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하여 본 개시의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 강화된 T 세포의 핵에서 CLR/CAR과 조건부 유전자 발현 시스템의 조합은 동족 리간드(들)와 CLR 또는 동족 항원(들)과 CAR의 결합 시 조건에 따라 활성화되는 합성 유전자 발현 시스템을 구성한다. 이 시스템은 예를 들면, 리간드 또는 항원 결합의 부위에서, 종양 환경에서, 또는 종양 환경 내에서 합성 유전자 발현을 감소시키거나 제한함으로써 변형된 T 세포의 치료 잠재력을 '강화시키거나' 향상시키는 데 도움을 줄 수 있다.
외생성 수용체
일부 실시양태에서, 강화된 T 세포는 (a) 유도성 프로모터를 코딩하는 서열 및 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 유도성 전이유전자 구축물, 및 (b) 항시성 프로모터를 코딩하는 서열 및 외생성 수용체, 예컨대, CLR 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 수용체 구축물을 포함하는 조성물을 포함하고, 이때 상기 외생성 수용체는 (a)의 구축물 및 (b)의 구축물이 세포의 게놈 서열 내로 통합될 때 발현되고, 상기 외생성 수용체는 리간드 또는 항원에 결합될 때 (a)의 유도성 전이유전자의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 직접적으로 또는 간접적으로 표적화하여 유전자 발현을 변형시키는 세포내 신호를 전달한다.
본 개시의 합성 유전자 발현 시스템의 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 유전자 발현을 감소시킴으로써 유전자 발현을 변형시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 (예를 들면, 리간드와 외생성 수용체의 결합의 지속시간 동안) 유전자 발현을 일시적으로 변형시킴으로써 유전자 발현을 변형시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 유전자 발현을 급성으로 변형시킨다(예를 들면, 리간드는 외생성 수용체에 가역적으로 결합한다). 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 유전자 발현을 만성으로 변형시킨다(예를 들면, 리간드는 외생성 수용체에 비가역적으로 결합한다).
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, (b)의 외생성 수용체는 세포의 게놈 서열에 대하여 내생성 수용체를 포함한다. 예시적 수용체는 세포내 수용체, 세포 표면 수용체, 막횡단 수용체, 리간드-게이팅된 이온 채널 및 G-단백질 커플링된 수용체를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, (b)의 외생성 수용체는 비-천연 발생 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 합성, 변형된, 재조합, 돌연변이체 또는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 T 세포 수용체(TCR)로부터 단리되거나 유래한 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 스카폴드 단백질로부터 단리되거나 유래한 하나 이상의 서열을 포함한다. 비-천연 발생 수용체가 막횡단 도메인을 포함하지 않는 것인 실시양태를 비롯한 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 비-천연 발생 수용체와 접촉한 후 세포내 신호를 전달하는 제2 막횡단, 막-결합된 및/또는 세포내 수용체와 상호작용한다.
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, (b)의 외생성 수용체는 비-천연 발생 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 합성, 변형된, 재조합, 돌연변이체 또는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 T 세포 수용체(TCR)로부터 단리되거나 유래한 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 스카폴드 단백질로부터 단리되거나 유래한 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 세포내 신호를 전달하는 세포내 수용체와 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-천연 발생 수용체는 키메라 리간드 수용체(CLR)이다. 일부 실시양태에서, CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, (b)의 외생성 수용체는 비-천연 발생 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 실시양태에서, 키메라 리간드 수용체는 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 리간드 인식 영역이 적어도 스카폴드 단백질을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다.
본 개시의 CLR/CAR의 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 인간 CD8α 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열번호 18004)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 개시의 CLR/CAR의 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8α 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(서열번호 18006)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc(서열번호 18007)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 개시의 CLR/CAR의 일부 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 CD28 및/또는 4-1BB 보조자극 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ζ 보조자극 도메인은
Figure pct00280
Figure pct00281
(서열번호 18008)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3ζ 보조자극 도메인은
Figure pct00282
(서열번호 18010)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 보조자극 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 18011)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 보조자극 도메인은
Figure pct00283
Figure pct00284
(서열번호 18013)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 보조자극 도메인은 막횡단 도메인과 CD28 보조자극 도메인 사이에 위치된다.
본 개시의 CLR/CAR의 일부 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4 서열로부터 유래한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유래한 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지는 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 18014)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00285
Figure pct00286
일부 실시양태에서, 적어도 하나의 단백질 스카폴드는 리간드에 특이적으로 결합한다.
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, (b)의 외생성 수용체는 비-천연 발생 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 실시양태에서, 키메라 리간드 수용체는 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 리간드 인식 영역이 적어도 스카폴드 단백질을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 단백질 스카폴드는 항체, 항체 단편, 단일 도메인 항체, 단일 쇄 항체, 항체 모방체 또는 센티린(본원에서 CARTyrin으로서 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 인식 영역은 항체, 항체 단편, 단일 도메인 항체, 단일 쇄 항체, 항체 모방체 또는 센티린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 VHH 또는 VH(본원에서 VCAR로서도 지칭됨)를 포함하거나 이러한 VHH 또는 VH로 구성된다. 일부 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인간 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 VHH 또는 VH를 포함하거나 이러한 VHH 또는 VH로 구성된다. 일부 실시양태에서, VH는 재조합 또는 키메라 단백질이다. 일부 실시양태에서, VH는 재조합 또는 키메라 인간 단백질이다. 일부 실시양태에서, 항체 모방체는 아피바디(affibody), 아플리린(afflilin), 아피머(affimer), 아피틴(affitin), 알파바디(alphabody), 안티칼린(anticalin), 아비머(avimer), DARPin, 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩타이드 또는 모노바디(monobody)를 포함하거나 이러한 모방체로 구성된다. 일부 실시양태에서, 센티린은 적어도 하나의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 컨센서스 서열을 포함하거나 이러한 컨센서스 서열로 구성된다.
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, (b)의 외생성 수용체는 비-천연 발생 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 실시양태에서, 키메라 리간드 수용체는 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 리간드 인식 영역이 적어도 스카폴드 단백질을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인 및 (c) 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센티린은 적어도 하나의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 컨센서스 서열을 포함하거나 이러한 컨센서스 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인은 인간 단백질로부터 유래한다. 일부 실시양태에서, 인간 단백질은 테나신-C이다. 일부 실시양태에서, 상기 컨센서스 서열은
Figure pct00287
Figure pct00288
(서열번호 18018)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 컨센서스 서열은
Figure pct00289
Figure pct00290
(서열번호 18019)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 컨센서스 서열은 (a) 상기 컨센서스 서열의 위치 13 내지 16에서 아미노산 잔기 TEDS(서열번호 18020)을 포함하거나 이러한 아미노산 잔기들로 구성된 A-B 루프; (b) 상기 컨센서스 서열의 위치 22 내지 28에서 아미노산 잔기 TAPDAAF(서열번호 18021)을 포함하거나 이러한 아미노산 잔기들로 구성된 B-C 루프; (c) 상기 컨센서스 서열의 위치 38 내지 43에서 아미노산 잔기 SEKVGE(서열번호 18022)를 포함하거나 이러한 아미노산 잔기들로 구성된 C-D 루프; (d) 상기 컨센서스 서열의 위치 51 내지 54에서 아미노산 잔기 GSER(서열번호 18023)을 포함하거나 이러한 아미노산 잔기들로 구성된 D-E 루프; (e) 상기 컨센서스 서열의 위치 60 내지 64에서 아미노산 잔기 GLKPG(서열번호 18024)를 포함하거나 이러한 아미노산 잔기들로 구성된 E-F 루프; (f) 상기 컨센서스 서열의 위치 75 내지 81에서 아미노산 잔기 KGGHRSN(서열번호 18025)를 포함하거나 이러한 아미노산 잔기들로 구성된 F-G 루프; 또는 (g) (a) 내지 (f)의 임의의 조합 내의 하나 이상의 위치에서 변형된다. 일부 실시양태에서, 센티린은 적어도 5개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인들의 컨센서스 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센티린은 적어도 10개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인들의 컨센서스 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 센티린은 적어도 15개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인들의 컨센서스 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스카폴드는 10-9 M 이하의 KD, 10-10 M 이하의 KD, 10-11 M 이하의 KD, 10-12 M 이하의 KD, 10-13 M 이하의 KD, 10-14 M 이하의 KD, 및 10-15 M 이하의 KD로부터 선택된 적어도 하나의 친화성으로 항원에 결합한다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다.
유도성 프로모터
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, (a)의 유도성 프로모터를 코딩하는 서열은 NFκB 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, (a)의 유도성 프로모터를 코딩하는 서열은 인터페론(IFN) 프로모터를 코딩하는 서열 또는 인터류킨-2 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인터페론(IFN) 프로모터는 IFNγ 프로모터이다. 본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 사이토카인 또는 케모카인의 프로모터로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 사이토카인 또는 케모카인은 IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12, IL13, IL17A/F, IL21, IL22, IL23, 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ), 콜로니 자극 인자 2(GM-CSF), 인터페론 감마(IFNγ), 종양 괴사 인자(TNFα), LTα, 퍼포린(perforin), 그랜자임 C(Gzmc), 그랜자임 B(Gzmb), C-C 모티프 케모카인 리간드 5(CCL5), C-C 모티프 케모카인 리간드 4(Ccl4), C-C 모티프 케모카인 리간드 3(Ccl3), X-C 모티프 케모카인 리간드 1(Xcl1) 및 LIF 인터류킨 6 패밀리 사이토카인(Lif)을 포함한다.
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 세포 분화, 활성화, 소진 및 작용에 관여하는 표면 단백질을 포함하는 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래한다. 일부 실시양태에서, 유전자는 CD69, CD71, CTLA4, PD-1, TIGIT, LAG3, TIM-3, GITR, MHCII, COX-2, FASL 및 4-1BB를 포함한다.
본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 CD 대사 및 분화에 관여하는 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래한다. 본 개시의 조성물의 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 Nr4a1, Nr4a3, Tnfrsf9(4-1BB), Sema7a, Zfp36l2, Gadd45b, Dusp5, Dusp6 및 Neto2의 프로모터로부터 단리되거나 유래한다.
유도성 전이유전자
일부 실시양태에서, 유도성 전이유전자 구축물은 억제 체크포인트 신호의 다운스트림에 있는 신호전달 성분(예를 들면, 표 1 및 2에 제공됨), 전사 인자(예를 들면, 표 3에 제공됨), 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 아폽토시스 수용체/리간드(예를 들면, 표 4에 제공됨), 대사 감지 분자(예를 들면, 표 5에 제공됨), 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 단백질(예를 들면, 표 6 및/또는 9에 제공됨) 및 발암유전자 또는 종양 서프레서 유전자(예를 들면, 표 7에 제공됨)의 발현을 포함하거나 유도한다. 본 개시의 예시적 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체는 표 8에 제공된 사이토카인 및 사이토카인 수용체뿐만 아니라 케모카인 및 케모카인 수용체도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
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Cas-Clover
본 개시는 가이드 RNA 및 융합 단백질 또는 이 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 융합 단백질은 dCas9 및 Clo051 핵산내부분해효소 또는 이의 핵산분해효소 도메인을 포함한다.
작은 Cas9(SaCas9)
본 개시는 이펙터에 작동 가능하게 연결된 작은 Cas9(Cas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 DNA 국소화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 본질적으로 이러한 성분 및 분자로 구성되거나, 이러한 성분 및 분자로 구성된 융합 단백질을 제공하고, 이때 상기 이펙터는 작은 Cas9(Cas9)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 작은 Cas9 구축물은 IIS형 핵산내부분해효소를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다.
활성 촉매 부위를 가진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9의 아미노산 서열.
Figure pct00366
불활성화된 작은 Cas9(dSaCas9)
본 개시는 이펙터에 작동 가능하게 연결된 불활성화된 작은 Cas9(dSaCas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 DNA 국소화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 본질적으로 이러한 성분 및 분자로 구성되거나, 이러한 성분 및 분자로 구성된 융합 단백질을 제공하고, 이때 상기 이펙터는 작은 불활성화된 Cas9(dSaCas9)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 작은 불활성화된 Cas9(dSaCas9) 구축물은 IIS형 핵산내부분해효소를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다.
dSaCas9 서열: D10A 및 N580A 돌연변이(굵은 대문자 및 밑줄로 표시됨)는 촉매 부위를 불활성화시킨다.
Figure pct00367
불활성화된 Cas9(dCas9)
본 개시는 이펙터에 작동 가능하게 연결된 불활성화된 Cas9(dCas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 DNA 국소화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 본질적으로 이러한 성분 및 분자로 구성되거나, 이러한 성분 및 분자로 구성된 융합 단백질을 제공하고, 이때 상기 이펙터는 불활성화된 Cas9(dCas9)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 불활성화된 Cas9(dCas9) 구축물은 IIS형 핵산내부분해효소를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시의 dCas9는 스타필로코커스 피오게네스(Staphyloccocus pyogenes)로부터 단리되거나 유래한 dCas9를 포함한다. 일부 실시양태에서, dCas9는 dCas9의 아미노산 서열의 위치 10 및 840에서 촉매 부위를 불활성화시키는 치환을 가진 dCas9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이 치환은 D10A 및 H840A이다. 일부 실시양태에서, dCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00368
일부 실시양태에서, dCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00369
Clo051 핵산내부분해효소
예시적 Clo051 핵산분해효소 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있거나, 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다:
Figure pct00370
Cas-Clover 융합 단백질
일부 실시양태에서, 예시적 dCas9-Clo051 융합 단백질(실시양태 1)은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있거나, 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다(밑줄로 표시된 Clo051 서열, 굵은 이탤릭체로 표시된 링커, 이탤릭체로 표시된 dCas9 서열(스타필로코커스 피오게네스)):
Figure pct00371
일부 실시양태에서, 예시적 dCas9-Clo051 융합 단백질(실시양태 1)은 하기 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이러한 핵산 서열로 구성될 수 있거나, 이러한 핵산 서열로 구성될 수 있다(스타필로코커스 피오게네스로부터 유래한 dCas9 서열):
Figure pct00372
Figure pct00373
일부 실시양태에서, 본 개시의 dCas9-Clo051 융합 단백질(실시양태 1)을 코딩하는 핵산 서열은 DNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 dCas9-Clo051 융합 단백질(실시양태 1)을 코딩하는 핵산 서열은 RNA를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예시적 dCas9-Clo051 융합 단백질(실시양태 2)은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있거나, 이러한 아미노산 서열로 구성될 수 있다(밑줄로 표시된 Clo051 서열, 굵은 이탤릭체로 표시된 링커, 이탤릭체로 표시된 dCas9 서열(스타필로코커스 피오게네스)):
Figure pct00374
일부 실시양태에서, 예시적 dCas9-Clo051 융합 단백질(실시양태 2)은 하기 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이러한 핵산 서열로 구성될 수 있거나, 이러한 핵산 서열로 구성될 수 있다(스타필로코커스 피오게네스로부터 유래한 dCas9 서열):
Figure pct00375
Figure pct00376
일부 실시양태에서, 본 개시의 dCas9-Clo051 융합 단백질(실시양태 2)을 코딩하는 핵산 서열은 DNA를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시의 dCas9-Clo051 융합 단백질(실시양태 2)을 코딩하는 핵산 서열은 RNA를 포함할 수 있다.
실시예
실시예 1: PSMA5 및 PSMA8 CARTyrin의 구축 및 시험관내 특징규명
PSMA5 및 PSMA8 CARTyrin을 도 1, 2, 3a 내지 3c 및 4a 내지 4c에 나타낸 바와 같이 구축하였다. 도 5는 항-PSMA CARTyrin의 구조를 도시한다.
PSMA5 또는 PSMA8 CARTyrin을 코딩하는 서열을 인간 범 T 세포 내로 mRNA 전기천공한 지 24시간 후 유세포분석으로 본 개시의 CARTyrin의 표면 발현을 평가하였다(도 6a). 유세포분석에 의해, PSMA로 형질감염된 LNCaP 종양 세포주 및 K562 세포주 상에서 표면 PSMA 단백질 발현이 검출되었다(도 6b). CARTyrin 발현 T 세포의 작용성을 종양 세포주에 대한 탈과립화로 측정하였다. PSMA+ 종양 세포주에 대한 RNA-전기천공된 PSMA CARTyrin T 세포의 탈과립화가 관찰되었다(도 6c). 증가하는 양의 PSMA mRNA를 사용하여 K562 세포주를 형질감염시킨 후 유세포분석으로 PSMA 표면 단백질 발현을 검출하였다(도 6d). 다양한 양의 PSMA 단백질을 발현하는 K562에 대한 RNA-전기천공된 PSMA CARTyrin T 세포의 탈과립화가 관찰되었다(도 6e). 종합하건대, 이 데이터들은 PSMA5 및 PSMA8 CARTyrin이 T 세포의 표면 상에서 발현될 수 있고 PSMA+ 세포 표적에 대한 세포독성 작용을 용이하게 할 수 있음을 보여준다.
PSMA CARTyrin의 생체내 평가를 뒷받침하기 위해, piggyBac DNA 변형 시스템을 사용하여 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101을 구축하였다. P-PSMA5-101 또는 P-PSMA8-101 플라스미드가 전위된, 대표 공여자로부터의 일차 인간 T 세포의 표면 상에서 PSMA CARTyrin이 검출되었다(도 7a). 표면 발현 마커를 사용한 유세포분석은 PSMA CARTyrin을 발현하는 T 세포가 T 줄기 세포 기억 표현형의 마커를 가졌으나 T 세포 소진 표현형의 활성화 및/또는 작용을 갖지 않음을 보여주었다(도 7b 및 7c). ELISA 분석은 PSMA CARTyrin을 발현하는 T 세포가 PSMA를 발현하는 세포에서 IFNγ 분비를 야기한다는 것을 보여줌으로써, T 세포의 이펙터 작용을 입증한다(도 7d). PSMA CARTyrin을 발현하는 T 세포는 표준 사멸 어세이 및 세포 증식 어세이에 의해 확인될 때 강한 세포독성 작용을 보였다(도 7e 및 7f). 종합하건대, 이 데이터들은 T 세포 상에서의 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101 PSMA CARTyrin의 표면 발현이 시험관내에서 PSMA+ 세포 표적에 대한 세포독성 작용 및 증식 능력을 나타냄을 보여준다. 시험관내에서의 이 확실한 수행 후, 생체내에서 작용하는 PSMA CARTyrin의 능력을 평가하였다.
실시예 2: 뮤린 이종이식편 모델을 사용한 PSMA5 및 PSMA8 CARTyrin의 생체내 특징규명
도 8a는 P-PSMA8-101 CARTyrin을 사용하여 마우스에서 생체내 연구를 수행하기 위한 치료 일정을 도시한다. 생존(도 8b), P-PSMA8-101 CD8+ T 세포 확장 및 혈액에서의 검출(도 8c), 칼리퍼 측정에 의한 종양 부피 추정(도 8d), 및 LNCaP 종양의 생체발광(도 8e 및 8f)으로 항-종양 활성을 평가하였다. '스트레스' 용량 및 표준 용량의 P-PSMA8-101은 NSG 마우스 내의 확립된 SC LNCaP.luc 고형 종양에 대해 'T 세포 부재' 대조군 마우스에 비해 유의미하게 향상된 항-종양 효능 및 생존을 나타내었다. 구체적으로, 대조군 동물에서는 생존이 없었고, '초저' 용량의 P-PSMA8-101로 치료받은 동물에서는 50% 생존이 있었고, '스트레스' 또는 표준 용량의 P-PSMA8-101로 치료받은 동물에서는 100% 생존이 있었다. 표준 용량의 P-PSMA8-101은 연구의 지속기간(치료 후 42일) 동안 100%의 동물들에서 확립된 LNCaP 종양을 제거한 반면, '스트레스' 용량이 투약된 동물의 2/3는 종양 부재 상태로 유지되었다. 말초 혈액에서, P-PSMA8-101은 검출 가능한 칼리퍼 및 생체발광 영상화 한계 미만으로의 종양 부하의 감소에 수반되는 분화된 이펙터 PSMA8 CARTyrin+ T 세포를 확장시키고 발생시켰다. 그 다음, P-PSMA8-101은 말초 혈액에서 줄어들었으나 존속하였다. 종합하건대, 이 데이터들은 PSMA8 CARTyrin을 발현하는 동물이 대조군에 비해 감소된 종양 부하를 나타냄을 입증한다.
도 9a는 뮤린 이종이식편 모델을 사용하여 "스트레스" 용량(4x10^6)의 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101 CARTyrin을 사용하여 마우스에서 생체내 연구를 수행하기 위한 치료 일정을 도시한다. 생존(도 9b), CD8+ T 세포 확장 및 혈액에서의 검출(도 9c), 칼리퍼 측정에 의한 종양 부피 추정(도 9d), 및 LNCaP 종양의 생체발광(도 9e 및 9f)으로 항-종양 활성을 평가하였다. '스트레스' 용량의 P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101은 NSG 마우스 내의 확립된 SC LNCaP.luc 고형 종양에 대해 T 세포(CAR 부재) 대조군 마우스에 비해 유의미하게 향상된 항-종양 효능 및 생존을 나타내었다. 구체적으로, T 세포(CAR 부재) 대조군 동물에서는 생존이 없었고, P-BCMA-101 치료군에서는 25% 생존이 있었고, P-PSMA5-101 치료군에서는 75% 생존이 있었고, '스트레스' 용량의 P-PSMA8-101로 치료받은 동물에서는 100% 생존이 있었다. 말초 혈액에서, P-PSMA5-101 및 P-PSMA8-101은 검출 가능한 칼리퍼 및 생체발광 영상화 한계 미만으로의 종양 부하의 감소에 수반되는 분화된 이펙터 CARTyrin+ T 세포를 확장시키고 발생시켰다. 그 다음, 이 세포들은 말초 혈액에서 줄어들었으나 존속하였다.
실시예 3: 인간 범 T 세포에서의 piggyBac 통합된 iC9 안전성 스위치의 발현 및 작용
아막사 4D 뉴클레오펙터를 이용하여 인간 범 T 세포를 4개의 piggyBac 트랜스포존들 중 하나로 뉴클레오펙션시켰다. "모의" 조건을 제공받은 변형된 T 세포를 빈 piggyBac 트랜스포존으로 뉴클레오펙션시켰다. 변형된 T 세포는 치료제(CARTyrin을 코딩하는 서열)만을 함유하는 piggyBac 트랜스포존, 또는 통합된 iC9 서열 및 치료제(CARTyrin을 코딩하는 서열)를 함유하는 piggyBac 트랜스포존을 제공받았다.
도 8은 리간드 결합 영역, 링커 및 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 함유하는 iC9 안전성 스위치의 개략도를 제공한다. 구체적으로, iC9 폴리펩타이드는 위치 36에서 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환(F36V)을 포함하는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함하는 리간드 결합 영역을 함유한다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00377
Figure pct00378
(서열번호 18026)을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, FKBP12 폴리펩타이드는
Figure pct00379
Figure pct00380
(서열번호 18027)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 위치 36에서 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환(F36V)을 가진 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 리간드 결합 영역에 특이적인 유도제는 합성 약물인 AP20187 및/또는 AP1903을 포함한다.
본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS(서열번호 18028)을 포함하는 아미노산 서열 또는 GGAGGAGGAGGATCC(서열번호 18029)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 개시의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 87에서 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 282에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 개시의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드, 유도성 캐스파제 폴리펩타이드 또는 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열:
Figure pct00381
(서열번호 18030), 또는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열:
Figure pct00382
에 의해 코딩된다.
단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 일부 실시양태에서, 상기 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열:
Figure pct00383
(서열번호 18032), 또는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열:
Figure pct00384
에 의해 코딩된다.
iC9 안전성 스위치를 시험하기 위해, 4개의 변형된 세포들 각각을 0 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1000 nM AP1903(AP1903에 대한 유도제)과 함께 24시간 동안 항온처리하였다. 아폽토시스를 겪는 세포에 대한 마커로서 형광 인터칼레이터인 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)를 사용하여 유세포분석으로 생존능을 평가하였다.
12일째 날 세포 생존능을 평가하였다(도 9 참조). 데이터는 iC9 구축물을 함유하는 세포에서 유도제의 농도가 증가함에 따라 세포 집단이 하부 우측 사분원으로부터 상부 좌측 사분원으로 이동한다는 것을 입증하나; 이 효과는 iC9 구축물을 결여하는 세포(CARTyrin만을 제공받은 세포)에서는 관찰되지 않고, 이때 세포는 유도제의 농도와 관계없이 이들 두 대역들 사이에 균일하게 분포된다. 19일째 날에도 세포 생존능을 평가하였다(도 10 참조). 데이터는 도 9(뉴클레오펙션 후 12일째 날)에 나타낸 추세와 동일한 추세를 보여주었으나; 상부 좌측 사분원으로의 집단 이동은 이 후기 시점(뉴클레오펙션 후 19일째 날)에서 더 현저하다.
취합된 결과의 정량을 수행하였고, 12일째 날(도 9 및 좌측 그래프) 또는 19일째 날(도 10 및 우측 그래프) 각각의 변형된 세포 유형에 대한 iC9 스위치의 유도제(AP1903)의 농도의 함수로서 퍼센트 세포 생존능에 대한 iC9 안전성 스위치의 유의미한 영향을 보여주는 이 정량은 도 11에 제공되어 있다. iC9 안전성 스위치의 존재는 12일째 날까지 상당한 대다수의 세포들에서 아폽토시스를 유도하고, 효과는 19일째 날까지 훨씬 더 현저하다.
이 연구의 결과는 AP1903이 심지어 연구의 가장 낮은 농도(0.1 nM)에서도 아폽토시스를 유도하기 때문에 iC9 안전성 스위치가 유도제(예를 들면, AP1903)와 접촉할 때 활성 세포를 제거하는 데 있어서 매우 효과적임을 보여준다. 나아가, iC9 안전성 스위치는 트리시스트론성(tricistronic) 벡터의 부분으로서 작용적으로 발현될 수 있다.
실시예 4: 강화된 T 세포에 대한 체크포인트 신호전달 단백질의 넉다운 효율
향상된 치료 잠재력을 가진 강화된 T 세포를 생성하기 위해, T 세포가 면역학적 및/또는 대사적 체크포인트에 덜 민감해지도록 유전자 변형을 만들었다. 강화된 T 세포를 생성하는 한 기작은 체크포인트 신호전달을 억제하거나 다양한 체크포인트 수용체들을 넉아웃시키는 것이다. Cas-CLOVER™ 플랫폼을 사용하여 휴면(또는 휴지) 일차 범 T 세포에서 체크포인트 수용체 PD-1, TGFβR2, LAG-3, Tim-3 및 CTLA-4를 표적화하고 넉아웃시켰다. 유세포분석에 의해 측정되었을 때, 유전자 편집은 세포 표면에서 30% 내지 70%의 단백질 발현 상실을 야기하였다(도 13). 이 결과는 Cas-CLOVER™가 이 유전자들의 넉아웃을 효율적으로 표적화하여, T 세포 표면 상에서의 표적 단백질 발현의 상실을 야기할 수 있음을 보여준다. 넉아웃 효율은 가이드 RNA 쌍의 추가 최적화, 또는 표적 유전자와 동일한 유전자 및/또는 표적 유전자의 조절제 또는 프로모터를 표적화하는 추가 가이드 RNA 쌍의 사용에 의해 유의미하게 증가될 수 있다.
실시예 5: 강화된 T 세포 상에서 널 또는 스위치 세포내 신호전달 단백질을 발현시키기 위한 전략
강화된 T 세포를 생성하는 또 다른 전략은 변경된 세포내 신호전달 도메인을 갖거나 세포내 신호전달 도메인을 갖지 않는 다양한 변형된/키메라 체크포인트 수용체들을 발현시킴으로써 내생성 체크포인트 신호전달을 감소시키거나 억제하는 것이다. 이 전략을 이용함으로써 표적화될 수 있는 체크포인트 신호는 PD-L1 리간드 및 TGFβ 사이토카인에 결합하는 각각 T 세포의 PD-1 또는 TGFβRII를 포함한다. 도 14는 2개의 상이한 억제 수용체들(PD-1(위 패널) 및 TGFβRII(아래 패널))에 대한 미끼/널/우성 음성 수용체(널 수용체)를 생성하기 위한 다양한 전략들의 개략도를 보여준다. 널 수용체를 디자인하기 위해, PD1 또는 TGFβRII의 세포내 도메인(ICD)을 돌연변이시킬 수 있거나(돌연변이된 널) 결실시킬 수 있다(단축형 널). 그 결과, 널 수용체의 동족 리간드(들)의 결합은 T 세포로의 체크포인트 신호의 전달을 야기하지 않는다. 더욱이, 널 수용체가 내생성 리간드(들)의 결합에 대해 야생형 수용체와 경쟁하기 때문에, 널 수용체에 의한 임의의 결합은 내생성 리간드(들)가 야생형 수용체에 결합하지 못하게 한다. 이것은 T 세포에게 효과적으로 전달된 체크포인트 신호전달의 전체 수준의 희석을 야기함으로써, 체크포인트 억제를 감소시키거나 차단한다. 도 15도 억제 수용체 PD-1(위 패널) 및 TGFβRII(아래 패널)에 대한 스위치 수용체 디자인 전략을 보여준다. 스위치 수용체에서, 야생형 ICD는 면역자극 분자(보조자극 스위치) 또는 상이한 억제 분자(억제 스위치)로부터의 ICD로 대체된다. 면역자극 분자는 CD3z, CD28, 4-1BB 및 표 1에 나열된 예를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 억제 분자는 CTLA4, PD1, Lag3, 및 표 1 및 9에 나열된 예를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 전자의 경우, 변형된 스위치 수용체에 의한 내생성 리간드의 결합은 T 세포로의 양성 신호의 전달을 야기함으로써, T 세포의 자극을 향상시키는 것을 도와, 종양 표적화 및 사멸의 지속을 용이하게 한다. 후자의 경우, 변형된 스위치 수용체에 의한 내생성 리간드의 결합은 T 세포로의 음성 신호의 전달을 야기함으로써, T 세포의 자극 및 활성을 감소시키는 것을 돕는다.
실시예 6: 강화된 T 세포 상에서의 PD1 및 TGFβRII 널 또는 스위치 세포내 신호전달 단백질의 표면 발현 향상
강화된 T 세포를 생성하기 위해, 대안적 신호 펩타이드(SP) 및 막횡단 도메인(TM)을 발현하는 다수의 단축형 널 수용체들을 디자인하였고 변형된 T 세포의 표면 상에서의 최대 발현에 대해 시험하였다. 도 15a는 PD-1(위) 및 TGFβRII(아래)에 대한 여러 널 수용체 구축물들의 개략도를 보여준다. 야생형 신호 펩타이드(SP) 및/또는 막횡단 도메인(TM)이 인간 T 세포 CD8a 수용체로부터의 신호 펩타이드 및/또는 막횡단 도메인(적색 화살표)으로 대체되도록 이 단백질들의 세포외 도메인(ECD)을 변형시켰다. 도 15a에 나타낸 6개의 단축형 널 구축물들 각각을 DNA 합성한 후, mRNA IVT DNA 벡터(pRT) 내로 서브클로닝하였다. 각각에 대해 IVT를 통해 고품질 mRNA를 생성하였다. 일차 인간 T 세포 내로의 전기천공(EP) 전달을 이용하여 6개의 분자들 각각을 코딩하는 mRNA의 형질감염을 수행하였고, 전기천공한 지 24시간 후 FACS 분석을 수행하여 세포 표면 상에서의 각각의 구축물의 발현 수준을 평가하였다(도 15b). 유세포분석에 의해 확인되었을 때, 대안적 CD8a(02.8aSP-PD-1 및 02.8aSP-TGFβRII)에 의한 야생형 SP의 대체는 T 세포 표면에서 가장 높은 발현 수준을 야기하였다. 02.8aSP-PD-1 널 수용체는 내생성 T 세포 PD-1 발현보다 177배 더 높고 야생형 PD-1 널 수용체보다 2.8배 더 높은 43,680의 MFI를 나타내었다. 02.8aSP-TGFβRII 널 수용체는 내생성 T 세포 TGFβRII 발현보다 102배 더 높고 야생형 TGFβRII 널 수용체보다 1.8배 더 높은 13,809의 MFI를 나타내었다. 이 결과들은 PD1 및 TGFβRII 억제 단백질 둘 다의 경우 대안적 CD8a SP에 의한 야생형 SP의 대체가 널 또는 스위치 수용체의 향상된 표면 발현을 유발한다는 것을 보여준다. 결과적으로 이것은 내생성 리간드(들)의 결합 시 각각 체크포인트 억제 또는 보조자극을 최대화할 것이다.
실시예 7: 변형된 T 세포에서 발현시킬 NF-KB 유도성 벡터의 디자인
2개의 T 세포 활성화 NF-KB 유도성 벡터들; 즉, 정방향으로 항시성 EF1a 프로모터 앞에 유전자 발현 시스템(GES)을 가진 벡터(A), 및 상보적 방향으로 항시성 EF1a 프로모터 앞에 GES를 가진 벡터(B)를 개발하였다. 이 벡터들은 T2A 서열에 의해 분리된, CAR 분자 및 DHFR 선택 유전자의 발현도 유도한다. 조건부 NF-KB 유도성 시스템, 및 EF1a에 의해 유도되는 유전자 둘 다가 EP를 이용함으로써 T 세포 내로 영구적으로 통합될 수 있는 piggyBac 트랜스포존의 부분이다. 일단 게놈 내로 통합되면, T 세포는 막 표면 상에서 CAR을 항시적으로 발현하고 세포 내부에서 DHFR을 항시적으로 발현하는 반면, NF-KB 유도성 유전자인 GFP의 발현은 T 세포 활성화 시에만 최고 수준까지 발현될 것이다.
실시예 8: 변형된 T 세포에서 GFP를 발현시키기 위한 NF-KB 유도성 벡터
정방향(pNFKB-GFP 정방향) 또는 역방향(pNFKB-GFP 역방향)으로 GFP 발현을 유도하는 NF-KB 유도성 발현 시스템의 부재(유전자 발현 시스템(GES) 조절 부재) 또는 존재와 함께 EF1a 프로모터의 조절 하에서 항-BCMA CAR 및 DHFR 뮤테인 유전자를 발현하는 piggyBac 벡터로 T 세포를 뉴클레오펙션시켰다. 세포가 거의 완전히 휴면할 때(19일째 날)까지 메토트렉세이트 선택의 존재 하에서 세포를 배양하였고, 5일째 날 및 19일째 날 GFP 발현을 평가하였다. 5일째 날, 모든 T 세포들은 증식하고 고도로 자극되는데, 이때 세포는 강한 NFκB 활성으로 인해 고수준의 GFP를 생성하는 NF-KB 유도성 발현 카세트를 가진다(도 17 참조). GES 조절이 없는 세포는 검출 가능한 수준의 GFP를 발현하지 않았다. 19일째 날까지, GES T 세포는 거의 완전히 휴면하였고, NFκB 활성이 더 낮기 때문에 GFP 발현은 5일째 날보다 유의미하게 더 낮았다(약 1/8 MFI). GFP 발현은 19일째 날 여전히 관찰되는데, 이는 GFP 단백질의 긴 반감기(약 30시간), 또는 예를 들면, TCR, CAR, 사이토카인 수용체 또는 성장 인자 수용체 신호를 통한 기본 수준의 NFκB 활성에 기인할 수 있다.
실시예 9: 변형된 T 세포에서의 항-BCMA CAR 매개 GFP 발현을 위한 NF-KB 유도성 벡터
T 세포를 변형시키지 않았거나(모의 T 세포), 정방향(pNFKB-GFP 정방향) 또는 역방향(pNFKB-GFP 역방향)으로 GFP 발현을 유도하는 NF-KB 유도성 발현 시스템의 부재(GES 조절 부재) 또는 존재와 함께 EF1a 프로모터의 조절 하에서 항-BCMA CAR 및 DHFR 뮤테인 유전자를 발현하는 piggyBac 벡터로 T 세포를 뉴클레오펙션시켰다. 세포들이 거의 완전히 휴면할 때까지 메토트렉세이트 선택의 존재 또는 부재(모의 T 세포) 하에서 모든 세포들을 22일 동안 배양하였다. 그 다음, 세포를 BCMA-(K562), BMCA+(RPMI 8226), 또는 양성 대조군 항-CD3 항-CD28 활성화제(CD3/28 자극)의 부재(자극 부재) 또는 존재 하에서 3일 동안 자극하였다. GES 조절이 없는 T 세포 또는 모의 T 세포를 사용한 모든 조건들 하에서 GFP 발현은 검출될 수 없었다. 그러나, pNFKB-GFP 정방향 전위된 세포 및 역방향 전위된 세포는 BCMA- K562 세포와 함께 배양되었을 때 자극 부재 대조군에 비해 GFP 발현을 거의 나타내지 않았지만, 이 세포들 둘 다가 BCMA+ 종양 세포의 존재 하에서 또는 양성 대조군 조건 하에서 유전자 발현의 현저한 상향조절을 나타내었다(도 18). BCMA+ 종양 세포와 공-배양된 pNFKB-GFP 정방향 전위된 세포와 역방향 전위된 세포 사이에 GFP 발현의 차이는 거의 관찰되지 않았다.
실시예 10: 변형된 T 세포에서 항-BCMA CAR 매개 발현의 조절
유도성 유전자의 발현 수준은 유도성 프로모터의 업스트림 또는 앞에 있는 다수의 반응 요소들에 의해 조절될 수 있다. 인간 EF1a 프로모터의 조절 하에서, 항-BCMA CARTyrin 다음에 선택 유전자를 코딩하는 piggyBac 벡터로 T 세포를 뉴클레오펙션시켰다(도 19). 추가로, 벡터는 단축형 CD19 단백질(dCD19)의 발현을 유도하는 조건부 NF-KB 유도성 유전자 발현 시스템을 추가로 코딩하였고, 0개 내지 5개의 NFKB 반응 요소(RE)를 포함하였거나, GES를 포함하지 않았거나(GES 부재), 전기천공 펄스를 제공받되, piggyBac 핵산을 제공받지 않았다(모의). 역(반대)방향/배향으로 오로지 GES에 대한 데이터가 제시되어 있다. 모든 세포들을 18일 동안 배양하였고, 메토트렉세이트 첨가를 사용한 piggyBac-변형된 T 세포에 대한 선택을 포함시켰다. 그 다음, 항-CD3 항-CD28 비드 활성화제를 사용하여 3일 동안 세포를 자극하였고, 0일째 날, 3일째 날 및 18일째 날 FACS로 dCD19 표면 발현을 평가하였고, 데이터를 FACS 히스토그램 및 표적 단백질 염색의 MFI로서 표시한다. 표면 dCD19 발현은 GES를 코딩하는 벡터가 전위된 모든 T 세포들에서 0일째 날 낮은 수준으로 검출되었다. 자극한 지 3일 후, GES를 발현하는 모든 T 세포들에 대해 dCD19 발현의 현저한 상향조절이 관찰되었는데, 이때 더 높은 수의 RE를 가진 세포들에서 표면 발현의 더 큰 배수 증가가 관찰되었다. 따라서, 표면 dCD19 발현은 GES에 코딩된 RE의 수와 정비례하였다. GES를 갖지 않은 T 세포, 즉 GES 부재 대조군 및 모의 대조군의 표면 상에서는 dCD19가 검출되지 않았다.
참고에 의한 포함
명확히 배제되어 있거나 다른 방식으로 제한되어 있지 않은 한, 임의의 교차참고된 또는 관련된 특허 또는 출원을 포함하는, 본원에서 인용된 모든 문헌들은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 임의의 문헌의 인용은 이 문헌이 본원에 개시되거나 청구된 임의의 발명에 대한 선행 기술이거나, 단독으로 또는 임의의 다른 참고문헌 또는 참고문헌들과 임의의 조합으로 임의의 이러한 발명을 교시하거나, 암시하거나, 개시한다는 것을 인정하는 것이 아니다. 추가로, 본 명세서에서 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참고로 포함된 문헌에서 동일한 용어의 임의의 의미 또는 정의와 모순되는 경우, 본 명세서에서 그 용어에 배정된 의미 또는 정의가 적용될 것이다.
다른 실시양태
본 개시의 특정 실시양태가 예시되고 기재되어 있지만, 본 개시의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 다른 변화 및 변형을 만들 수 있다. 첨부된 청구범위는 본 개시의 범위 내에 있는 모든 이러한 변화 및 변형을 포함한다.

Claims (273)

  1. (a) 적어도 하나의 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 특이적 센티린(Centyrin)을 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인;
    (b) 막횡단 도메인, 및
    (c) 적어도 하나의 보조자극 도메인을 포함하는 엔도도메인
    을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
  2. 제1항에 있어서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 CAR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (a)의 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함하는 것인 CAR.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 신호 펩타이드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 CAR.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 신호 펩타이드는 인간 CD8α 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 CAR.
  6. 제5항에 있어서, 신호 펩타이드는 MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열번호 18004)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 신호 펩타이드는 atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca(서열번호 18005)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 CAR.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 CAR.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인은 인간 CD8α 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 CAR.
  10. 제9항에 있어서, 막횡단 도메인은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(서열번호 18006)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 막횡단 도메인은 atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc(서열번호 18007)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 CAR.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함하는 것인 CAR.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 CAR.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 보조자극 도메인은 인간 CD28 및/또는 4-1BB 보조자극 도메인을 포함하는 것인 CAR.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, CD3ζ 보조자극 도메인은 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR:
    Figure pct00385
  16. 제15항에 있어서, CD28 보조자극 도메인은 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 CAR:
    Figure pct00386
  17. 제13항 또는 제14항에 있어서, 4-1BB 보조자극 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(서열번호 18011)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
  18. 제17항에 있어서, 4-1BB 보조자극 도메인은 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 CAR:
    Figure pct00387
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 4-1BB 보조자극 도메인은 막횡단 도메인과 CD28 보조자극 도메인 사이에 위치하는 것인 CAR.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 것인 CAR.
  21. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유래한 서열을 포함하는 것인 CAR.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 힌지는 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(서열번호 18014)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR.
  23. 제22항에 있어서, 힌지는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 CAR:
    Figure pct00388
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 적어도 하나의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인을 포함하는 것인 CAR.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)의 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 CAR.
  26. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 하기 아미노산 서열로 구성된 것인 CAR:
    Figure pct00389
  27. 제26항에 있어서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 하기 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR:
    Figure pct00390
  28. 제25항 또는 제26항에 있어서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 하기 핵산 서열을 포함하거나 하기 핵산 서열로 구성된 것인 CAR:
    Figure pct00391
  29. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 하기 아미노산 서열을 포함하거나 하기 아미노산 서열로 구성된 것인 CAR:
    Figure pct00392
  30. 제29항에 있어서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 하기 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 CAR:
    Figure pct00393
  31. 제25항 또는 제29항에 있어서, 적어도 하나의 PSMA 특이적 센티린은 하기 핵산 서열을 포함하거나 하기 핵산 서열로 구성된 것인 CAR:
    Figure pct00394
  32. 제25항에 있어서, 적어도 하나의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인은 인간 단백질로부터 유래한 것인 CAR.
  33. 제32항에 있어서, 인간 단백질은 테나신(Tenascin)-C인 CAR.
  34. 제25항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 컨센서스 서열은 하기 서열을 포함하는 것인 CAR:
    Figure pct00395
  35. 제25항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 컨센서스 서열은 하기 서열을 포함하는 것인 CAR:
    Figure pct00396
  36. 제25항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 컨센서스 서열은 하기 아미노산 서열에 대해 적어도 70% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 CAR:
    Figure pct00397
  37. 제25항 및 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 컨센서스 서열은
    (a) 컨센서스 서열의 위치 13 내지 16에서 아미노산 잔기 TEDS(서열번호 18020)를 포함하거나 이러한 잔기로 구성된 A-B 루프;
    (b) 컨센서스 서열의 위치 22 내지 28에서 아미노산 잔기 TAPDAAF(서열번호 18021)를 포함하거나 이러한 잔기로 구성된 B-C 루프;
    (c) 컨센서스 서열의 위치 38 내지 43에서 아미노산 잔기 SEKVGE(서열번호 18022)를 포함하거나 이러한 잔기로 구성된 C-D 루프;
    (d) 컨센서스 서열의 위치 51 내지 54에서 아미노산 잔기 GSER(서열번호 18023)을 포함하거나 이러한 잔기로 구성된 D-E 루프;
    (e) 컨센서스 서열의 위치 60 내지 64에서 아미노산 잔기 GLKPG(서열번호 18024)를 포함하거나 이러한 잔기로 구성된 E-F 루프;
    (f) 컨센서스 서열의 위치 75 내지 81에서 아미노산 잔기 KGGHRSN(서열번호 18025)을 포함하거나 이러한 잔기로 구성된 F-G 루프; 또는
    (g) (a) 내지 (f)의 임의의 조합
    내의 하나 이상의 위치에서 변형된 것인 CAR.
  38. 제25항 및 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 컨센서스 서열을 포함하는 CAR.
  39. 제25항 및 제332항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 10개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 컨센서스 서열을 포함하는 CAR.
  40. 제25항 및 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 15개의 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 컨센서스 서열을 포함하는 CAR.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 센티린은 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 10-13 M 이하, 10-14 M 이하 및 10-15 M 이하의 KD로부터 선택된 적어도 하나의 친화성으로 항원에 결합하는 것인 CAR.
  42. 제41항에 있어서, KD는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되는 것인 CAR.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 CAR 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  44. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 CAR을 포함하는 트랜스포존.
  45. 제44항에 있어서, 선택 유전자를 추가로 포함하는 트랜스포존.
  46. 제45항에 있어서, 선택 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩하는 것인 트랜스포존.
  47. 제45항에 있어서, 선택 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 챌린지되었을 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩하는 것인 트랜스포존.
  48. 제47항에 있어서, 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함하고, 유전자 생성물은 상기 화합물에 대한 내성을 부여하는 것인 트랜스포존.
  49. 제44항에 있어서, 선택 유전자는 neo, TYMS(티미딜레이트 신테타제), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제), 다중약물 내성 유전자(MDR1), DHFR, ALDH1(알데하이드 데하이드로게나제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파랄로그(Paralog) C), GCS(글루코실세라마이드 신타제), NKX2.2(NK2 호메오박스 2) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 트랜스포존.
  50. 제44항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은
    (a) 리간드 결합 영역,
    (b) 링커, 및
    (c) 단축형(truncated) 캐스파제 9 폴리펩타이드
    를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 유도성 캐스파제 폴리펩타이드가 비-인간 서열을 포함하지 않는 것인 트랜스포존.
  51. 제50항에 있어서, 비-인간 서열은 제한 부위인 트랜스포존.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 리간드 결합 영역 유도성 캐스파제 폴리펩타이드는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함하는 것인 트랜스포존.
  53. 제52항에 있어서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함하는 것인 트랜스포존.
  54. 제53항에 있어서, 변형은 위치 36에서의 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)인 트랜스포존.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, FKBP12 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 트랜스포존:
    Figure pct00398
  56. 제55항에 있어서, FKBP12 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 트랜스포존:
    Figure pct00399
  57. 제50항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 링커 영역은 GGGGS(서열번호 18028)를 포함하는 아미노산에 의해 코딩된 것인 트랜스포존.
  58. 제57항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 링커 영역은 GGAGGAGGAGGATCC(서열번호 18029)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 트랜스포존.
  59. 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 87에서 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 트랜스포존.
  60. 제50항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 282에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 트랜스포존.
  61. 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산에 의해 코딩된 것인 트랜스포존:
    Figure pct00400
  62. 제61항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 트랜스포존:
    Figure pct00401
  63. 제50항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 트랜스포존:
    Figure pct00402
  64. 제63항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 트랜스포존:
    Figure pct00403
  65. 제50항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함하는 트랜스포존.
  66. 제50항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함하고, 자가-절단 펩타이드가 CAR과 선택 유전자 사이에 위치하는 것인 트랜스포존.
  67. 제50항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함하고, 자가-절단 펩타이드가 CAR과 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드 사이에 위치하는 것인 트랜스포존.
  68. 제50항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 2개의 자가-절단 펩타이드를 포함하고, 제1 자가-절단 펩타이드가 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 업스트림에 위치하고, 제2 자가-절단 펩타이드가 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 다운스트림에 위치하는 것인 트랜스포존.
  69. 제50항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함하고, 제1 자가-절단 펩타이드가 CAR의 업스트림에 위치하고, 제2 자가-절단 펩타이드가 CAR의 다운스트림에 위치하는 것인 트랜스포존.
  70. 제65항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드는 T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드 또는 GSG-P2A 펩타이드를 포함하는 것인 트랜스포존.
  71. 제70항에 있어서, T2A 펩타이드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18034)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  72. 제70항에 있어서, GSG-T2A 펩타이드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18035)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  73. 제70항에 있어서, E2A 펩타이드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18036)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  74. 제70항에 있어서, GSG-E2A 펩타이드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18037)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  75. 제70항에 있어서, F2A 펩타이드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18038)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  76. 제70항에 있어서, GSG-F2A 펩타이드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18039)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  77. 제70항에 있어서, P2A 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18040)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  78. 제70항에 있어서, GSG-P2A 펩타이드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18041)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  79. 제44항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 자극 수용체(CSR)를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 트랜스포존.
  80. 제79항에 있어서, CSR은
    (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인;
    (b) 막횡단 도메인; 및
    (c) 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인
    을 포함하고; (a), (b) 및 (c)의 조합은 비-천연 발생인 트랜스포존.
  81. 제80항에 있어서, (a)의 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래한 것인 트랜스포존.
  82. 제81항에 있어서, (c)의 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래한 것인 트랜스포존.
  83. 제81항 또는 제82항에 있어서, 제1 단백질과 제2 단백질은 동일하지 않은 것인 트랜스포존.
  84. 제80항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 성분은 인간 막횡단 수용체의 성분, 인간 세포 표면 수용체, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함하는 것인 트랜스포존.
  85. 제84항에 있어서, 활성화 성분은, 활성화 성분의 아고니스트가 결합하는 T 세포 수용체(TCR)의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 트랜스포존.
  86. 제80항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 단백질 또는 이의 부분을 포함하는 것인 트랜스포존.
  87. 제80항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 전달 도메인은 인간 신호 전달 도메인의 성분, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함하는 것인 트랜스포존.
  88. 제87항에 있어서, 신호 전달 도메인은 CD3 단백질을 포함하는 것인 트랜스포존.
  89. 제88항에 있어서, CD3 단백질은 CD3ζ 단백질을 포함하는 것인 트랜스포존.
  90. 제80항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함하는 것인 트랜스포존.
  91. 제90항에 있어서, 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리되거나 유래한 것인 트랜스포존.
  92. 제91항에 있어서, 제1 단백질과 제3 단백질은 동일한 것인 트랜스포존.
  93. 제80항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 트랜스포존.
  94. 제93항에 있어서, 신호 펩타이드는 제4 단백질로부터 유래한 것인 트랜스포존.
  95. 제94항에 있어서, 제1 단백질과 제4 단백질은 동일한 것인 트랜스포존.
  96. 제80항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인은 제5 단백질로부터 단리되거나 유래한 것인 트랜스포존.
  97. 제96항에 있어서, 제1 단백질과 제5 단백질은 동일한 것인 트랜스포존.
  98. 제80항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 성분은 천연 발생 분자에 결합하지 않는 것인 트랜스포존.
  99. 제80항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, CSR은 활성화 성분이 천연 발생 분자에의 결합 시 신호를 전달하지 않는 것인 트랜스포존.
  100. 제80항에 있어서, 엑토도메인은 변형을 포함하는 것인 트랜스포존.
  101. 제100항에 있어서, 변형은 제1 단백질의 야생형 서열과 비교했을 때 활성화 성분을 코딩하는 서열의 돌연변이 또는 단축(truncation)을 포함하는 것인 트랜스포존.
  102. 제80항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 성분은 비-천연 발생 분자에 결합하는 것인 트랜스포존.
  103. 제80항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, CSR은 활성화 성분이 비-천연 발생 분자에의 결합 시 신호를 선택적으로 전달하는 것인 트랜스포존.
  104. 제45항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존인 트랜스포존.
  105. 제45항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, TcBuster 트랜스포존인 트랜스포존.
  106. 제45항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 슬립핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존인 트랜스포존.
  107. 제45항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 헬라이저(Helraiser) 트랜스포존인 트랜스포존.
  108. 제45항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, Tol2 트랜스포존인 트랜스포존.
  109. 제45항 내지 제108항 중 어느 한 항의 트랜스포존을 포함하는 조성물.
  110. 제109항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  111. 제110항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열인 조성물.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존이고, 트랜스포사제는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사제인 조성물.
  113. 제112항에 있어서, piggyBac 트랜스포사제는 서열번호 14487을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, piggyBac 트랜스포사제는 과활성 변이체이고, 과활성 변이체는 서열번호 14487의 위치 30, 165, 282 및 538 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 조성물.
  115. 제114항에 있어서, 서열번호 14487의 위치 30에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)의 발린(V)으로의 치환(I30V)인 조성물.
  116. 제114항에 있어서, 서열번호 14487의 위치 165에서의 아미노산 치환은 글리신(G)의 세린(S)으로의 치환(G165S)인 조성물.
  117. 제114항에 있어서, 서열번호 14487의 위치 282에서의 아미노산 치환은 메티오닌(M)의 발린(V)으로의 치환(M282V)인 조성물.
  118. 제114항에 있어서, 서열번호 14487의 위치 538에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)의 라이신(K)으로의 치환(N538K)인 조성물.
  119. 제110항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포사제는 수퍼(Super) piggyBac(sPBo) 트랜스포사제인 조성물.
  120. 제119항에 있어서, 수퍼 piggyBac(sPBo) 트랜스포사제는 서열번호 14484를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  121. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 TcBuster 트랜스포존이고, 트랜스포사제 효소는 TcBuster 트랜스포사제 효소인 조성물.
  122. 제121항에 있어서, TcBuster 트랜스포사제 효소는 과활성 TcBuster 트랜스포사제 효소인 조성물.
  123. 제121항 또는 제122항에 있어서, TcBuster 트랜스포사제 효소는 하기 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 조성물:
    Figure pct00404
  124. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 슬립핑 뷰티 트랜스포존이고, 트랜스포사제 효소는 슬립핑 뷰티 트랜스포사제 효소인 조성물.
  125. 제124항에 있어서, 슬립핑 뷰티 트랜스포사제 효소는 서열번호 14485의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  126. 제124항에 있어서, 슬립핑 뷰티 트랜스포사제 효소는 과활성 슬립핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)인 조성물.
  127. 제126항에 있어서, 과활성 슬립핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)는 서열번호 14486의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  128. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 헬라이저 트랜스포존이고, 트랜스포사제 효소는 헬라이저 트랜스포사제 효소인 조성물.
  129. 제128항에 있어서, 헬라이저 트랜스포사제 효소는 서열번호 14501의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  130. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이고, 트랜스포사제 효소는 Tol2 트랜스포사제 효소인 조성물.
  131. 제130항에 있어서, Tol2 트랜스포사제 효소는 서열번호 14502의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  132. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 CAR을 포함하는 벡터.
  133. 제132항에 있어서, 바이러스 벡터인 벡터.
  134. 제133항에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리되거나 유래한 서열을 포함하는 것인 벡터.
  135. 제133항 또는 제134항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스로부터 단리되거나 유래한 서열을 포함하는 것인 벡터.
  136. 제133항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 재조합 벡터인 벡터.
  137. 제132항에 있어서, 나노입자 벡터인 벡터.
  138. 제137항에 있어서, 나노입자 벡터는 핵산, 아미노산, 중합체, 마이셀, 지질, 유기 분자, 무기 분자 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 벡터.
  139. 제132항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 유전자를 추가로 포함하는 벡터.
  140. 제139항에 있어서, 선택 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩하는 것인 벡터.
  141. 제140항에 있어서, 선택 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 챌린지되었을 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩하는 것인 벡터.
  142. 제138항에 있어서, 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함하고, 유전자 생성물은 상기 화합물에 대한 내성을 부여하는 것인 벡터.
  143. 제139항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 유전자는 neo, TYMS(티미딜레이트 신테타제), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제), 다중약물 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데하이드 데하이드로게나제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파랄로그 C), GCS(글루코실세라마이드 신타제), NKX2.2(NK2 호메오박스 2) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 벡터.
  144. 제132항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는
    (a) 리간드 결합 영역,
    (b) 링커, 및
    (c) 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드
    를 포함하는 유도성 캐스파제 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 유도성 캐스파제 폴리펩타이드가 비-인간 서열을 포함하지 않는 것인 벡터.
  145. 제144항에 있어서, 비-인간 서열은 제한 부위인 벡터.
  146. 제144항 또는 제145항에 있어서, 리간드 결합 영역 유도성 캐스파제 폴리펩타이드는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드를 포함하는 것인 벡터.
  147. 제146항에 있어서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함하는 것인 벡터.
  148. 제147항에 있어서, 변형은 위치 36에서의 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)인 벡터.
  149. 제147항 또는 제148항에 있어서, FKBP12 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 벡터:
    Figure pct00405
  150. 제149항에 있어서, FKBP12 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 벡터:
    Figure pct00406
  151. 제144항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 링커 영역은 GGGGS(서열번호 18028)을 포함하는 아미노산에 의해 코딩된 것인 벡터.
  152. 제151항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 링커 영역은 GGAGGAGGAGGATCC(서열번호 18029)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 벡터.
  153. 제144항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 87에서 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 벡터.
  154. 제144항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 서열의 위치 282에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 벡터.
  155. 제144항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산에 의해 코딩된 것인 벡터:
    Figure pct00407
  156. 제155항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 단축형 캐스파제 9 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 벡터:
    Figure pct00408
  157. 제144항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된 것인 벡터:
    Figure pct00409
  158. 제157항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드는 하기 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된 것인 벡터:
    Figure pct00410
  159. 제132항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함하는 벡터.
  160. 제132항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함하고, 자가-절단 펩타이드가 CAR과 선택 유전자 사이에 위치하는 것인 벡터.
  161. 제132항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함하고, 자가-절단 펩타이드는 CAR과 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드 사이에 위치하는 것인 벡터.
  162. 제132항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 2개의 자가-절단 펩타이드를 포함하고, 제1 자가-절단 펩타이드는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 업스트림에 위치하고, 제2 자가-절단 펩타이드는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드의 다운스트림에 위치하는 것인 벡터.
  163. 제132항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드를 포함하고, 제1 자가-절단 펩타이드가 CAR의 업스트림에 위치하고, 제2 자가-절단 펩타이드가 CAR의 다운스트림에 위치하는 것인 벡터.
  164. 제159항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자가-절단 펩타이드는 T2A 펩타이드, GSG-T2A 펩타이드, E2A 펩타이드, GSG-E2A 펩타이드, F2A 펩타이드, GSG-F2A 펩타이드, P2A 펩타이드 또는 GSG-P2A 펩타이드를 포함하는 것인 벡터.
  165. 제164항에 있어서, T2A 펩타이드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18034)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  166. 제164항에 있어서, GSG-T2A 펩타이드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP(서열번호 18035)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  167. 제164항에 있어서, E2A 펩타이드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18036)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  168. 제164항에 있어서, GSG-E2A 펩타이드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP(서열번호 18037)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  169. 제164항에 있어서, F2A 펩타이드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18038)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  170. 제164항에 있어서, GSG-F2A 펩타이드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(서열번호 18039)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  171. 제164항에 있어서, P2A 펩타이드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18040)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  172. 제164항에 있어서, GSG-P2A 펩타이드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(서열번호 18041)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  173. 제132항 내지 제172항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
  174. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 CAR을 포함하는 세포.
  175. 제174항에 있어서,
    (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인;
    (b) 막횡단 도메인; 및
    (c) 적어도 하나의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인
    을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)를 추가로 포함하고, (a), (b) 및 (c)의 조합은 비-천연 발생인 세포.
  176. 제175항에 있어서, (a)의 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래한 것인 세포.
  177. 제176항에 있어서, (c)의 적어도 하나의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래한 것인 세포.
  178. 제176항 또는 제177항에 있어서, 제1 단백질과 제2 단백질은 동일하지 않은 것인 세포.
  179. 제175항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 성분은 인간 막횡단 수용체의 성분, 인간 세포 표면 수용체, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함하는 것인 세포.
  180. 제179항에 있어서, 활성화 성분은, 활성화 성분의 아고니스트가 결합하는 T 세포 수용체(TCR)의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상의 부분을 포함하는 것인 세포.
  181. 제175항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 단백질 또는 이의 부분을 포함하는 것인 세포.
  182. 제175항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 신호 전달 도메인은 인간 신호 전달 도메인의 성분, T 세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 보조수용체의 성분, TCR 보조자극 단백질의 성분, TCR 억제 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함하는 것인 세포.
  183. 제182항에 있어서, 신호 전달 도메인은 CD3 단백질을 포함하는 것인 세포.
  184. 제183항에 있어서, CD3 단백질은 CD3ζ 단백질을 포함하는 것인 세포.
  185. 제175항 내지 제184항 중 어느 한 항에 있어서, 엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함하는 것인 세포.
  186. 제185항에 있어서, 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리되거나 유래한 것인 세포.
  187. 제186항에 있어서, 제1 단백질과 제3 단백질은 동일한 것인 세포.
  188. 제175항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 엑토도메인은 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것인 세포.
  189. 제188항에 있어서, 신호 펩타이드는 제4 단백질로부터 유래한 것인 세포.
  190. 제189항에 있어서, 제1 단백질과 제4 단백질은 동일한 것인 세포.
  191. 제175항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인은 제5 단백질로부터 단리되거나 유래한 것인 세포.
  192. 제191항에 있어서, 제1 단백질과 제5 단백질은 동일한 것인 세포.
  193. 제175항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 성분은 천연 발생 분자에 결합하지 않는 것인 세포.
  194. 제175항 내지 제192항 중 어느 한 항에 있어서, CSR은 활성화 성분이 천연 발생 분자에의 결합 시 신호를 전달하지 않는 것인 세포.
  195. 제194항에 있어서, 엑토도메인은 변형을 포함하는 것인 세포.
  196. 제195항에 있어서, 변형은 제1 단백질의 야생형 서열과 비교했을 때 활성화 성분을 코딩하는 서열의 돌연변이 또는 단축을 포함하는 것인 세포.
  197. 제175항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 성분은 비-천연 발생 분자에 결합하는 것인 세포.
  198. 제175항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, CSR은 활성화 성분이 비-천연 발생 분자에의 결합 시 신호를 선택적으로 전달하는 것인 세포.
  199. 제44항 내지 제95항 중 어느 한 항의 트랜스포존 또는 트랜스포사제를 포함하는 세포.
  200. 제132항 내지 제172항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  201. 제198항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 상에서 CAR을 발현하는 세포.
  202. 제198항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포인 세포.
  203. 제202항에 있어서, 면역 세포는 T 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 천연 킬러(NK) 유사 세포, 사이토카인 유도된 킬러(CIK) 세포, 조혈 조상 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포 또는 제대혈(UCB) 유래 T 세포인 세포.
  204. 제203항에 있어서, 면역 세포는 T 세포인 세포.
  205. 제175항 내지 제204항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 세포.
  206. 제204항 또는 제205항에 있어서, T 세포는 초기 기억 세포, 줄기 유사 T 세포, TSCM 유사 세포, TSCM 또는 TCM인 세포.
  207. 제26항에 있어서, T 세포는 TSCM인 세포.
  208. 제174항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 인공 항원 제시 세포인 세포.
  209. 제174항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포인 세포.
  210. 제174항 내지 제209항 중 어느 한 항에 있어서, 자가 유래인 세포.
  211. 제174항 내지 제210항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 조성물.
  212. 세포의 표면 상에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현시키는 방법으로서,
    (a) 세포 집단을 수득하는 단계;
    (b) 상기 세포 집단 내의 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로질러 CAR을 전달하기에 충분한 조건 하에서, 상기 세포 집단을, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 CAR 또는 이 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써, 변형된 세포 집단을 생성하는 단계;
    (c) 상기 CAR의 통합에 적합한 조건 하에서 변형된 세포 집단을 배양하는 단계;
    (d) 세포 표면 상에서 상기 CAR을 발현하는 변형된 세포 집단으로부터 적어도 하나의 세포를 확장시키고/시키거나 선택하는 단계
    를 포함하는, 세포의 표면 상에서 CAR을 발현시키는 방법.
  213. 제212항에 있어서, 세포 집단은 백혈구를 포함하는 것인 방법.
  214. 제212항 또는 제213항에 있어서, 세포 집단은 최적화된 비로 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 포함하는 것인 방법.
  215. 제214항에 있어서, CD4+ 대 CD8+ 백혈구의 최적화된 비는 생체내에서 천연적으로 발생되지 않는 것인 방법.
  216. 제212항에 있어서, 트랜스포존 또는 벡터는 CAR, 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  217. 제216항에 있어서, 제42항 내지 제77항 중 어느 한 항의 트랜스포존은 CAR, 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  218. 제216항 또는 제217항에 있어서, 트랜스포존은 piggyBac 트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
  219. 제216항 또는 제217항에 있어서, 트랜스포존은 TcBuster 트랜스포존을 포함하는 것인 방법.
  220. 제215항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 포함하는 조성물을 추가로 포함하는 방법.
  221. 제220항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열인 방법.
  222. 제220항 또는 제221항에 있어서, 트랜스포사제는 piggyBac 트랜스포사제인 방법.
  223. 제222항에 있어서, piggyBac 트랜스포사제는 서열번호 14487을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  224. 제222항 또는 제223항에 있어서, piggyBac 트랜스포사제는 과활성 변이체이고, 과활성 변이체는 서열번호 14487의 위치 30, 165, 282 및 538 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 방법.
  225. 제224항에 있어서, 서열번호 14487의 위치 30에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)의 발린(V)으로의 치환(I30V)인 방법.
  226. 제224항에 있어서, 서열번호 14487의 위치 165에서의 아미노산 치환은 글리신(G)의 세린(S)으로의 치환(G165S)인 방법.
  227. 제224항에 있어서, 서열번호 14487의 위치 282에서의 아미노산 치환은 메티오닌(M)의 발린(V)으로의 치환(M282V)인 방법.
  228. 제224항에 있어서, 서열번호 14487의 위치 538에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)의 라이신(K)으로의 치환(N538K)인 방법.
  229. 제220항 또는 제221항에 있어서, 트랜스포사제는 수퍼 piggyBac(sPBo) 트랜스포사제인 방법.
  230. 제229항에 있어서, 수퍼 piggyBac(sPBo) 트랜스포사제는 서열번호 14484를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  231. 제200항에 있어서, 벡터는 CAR, 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 것인 방법.
  232. 제212항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단 내의 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로질러 CAR을 코딩하는 서열을 전달하기에 충분한 조건은 뉴클레오펙션을 포함하는 것인 방법.
  233. 제212항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 세포 집단 내의 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로질러 CAR을 코딩하는 서열을 전달하기에 충분한 조건은 특정된 전압에서의 1회 이상의 전기 펄스의 적용, 완충제, 및 하나 이상의 보충 인자(들) 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  234. 제233항에 있어서, 완충제는 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector), 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충제 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  235. 제233항 또는 제234항에 있어서, 하나 이상의 보충 인자(들)는
    (a) 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 또는 이들의 임의의 조합;
    (b) 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합;
    (c) 세포 배지;
    (d) 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제; 및
    (e) 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약
    을 포함하는 것인 방법.
  236. 제235항에 있어서, 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 또는 이들의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  237. 제235항에 있어서, 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼(Earle)의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 석신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운(Crown)-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  238. 제235항에 있어서, 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로(CellGro) DC 배지, CTS 옵티마이저(OpTimizer) T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트(ImmunoCult)-XF T 세포 확장 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  239. 제235항에 있어서, 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 캐스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 억제제, TWS119, 바필로마이신(Bafilomycin), 클로로퀸(Chloroquine), 퀴나크린(Quinacrine), AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  240. 제235항에 있어서, 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩타이드, TREX1 효소 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  241. 제212항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 또는 CAR을 코딩하는 서열의 통합에 적합한 조건은 완충제 및 하나 이상의 보충 인자(들) 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  242. 제241항에 있어서, 완충제는 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사 뉴클레오펙터, 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충제 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  243. 제241항 또는 제242항에 있어서, 하나 이상의 보충 인자(들)는
    (a) 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 또는 이들의 임의의 조합;
    (b) 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합;
    (c) 세포 배지;
    (d) 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제; 및
    (e) 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약
    을 포함하는 것인 방법.
  244. 제243항에 있어서, 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 또는 이들의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  245. 제243항에 있어서, 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 석신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  246. 제243항에 있어서, 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  247. 제243항에 있어서, 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 캐스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 억제제, TWS119, 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  248. 제243항에 있어서, 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 시약은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩타이드, TREX1 효소 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
  249. 제212항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 확장 및 선택은 순차적으로 이루어지는 것인 방법.
  250. 제249항에 있어서, 확장은 선택 전에 이루어지는 것인 방법.
  251. 제249항에 있어서, 확장은 선택 후에 이루어지는 것인 방법.
  252. 제249항에 있어서, 추가 선택이 확장 후에 이루어지는 것인 방법.
  253. 제212항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 확장 및 선택은 동시에 이루어지는 것인 방법.
  254. 제212항 내지 제253항 중 어느 한 항에 있어서, 확장은 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 항원과 접촉시켜 CAR을 통해 상기 적어도 하나의 세포를 자극하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  255. 제254항에 있어서, 항원은 기재의 표면 상에 제시되는 것인 방법.
  256. 제255항에 있어서, 기재는 비드 또는 복수의 비드인 방법.
  257. 제256항에 있어서, 비드 또는 복수의 비드는 확장 후 변형된 세포 집단으로부터 분리되는 것인 방법.
  258. 제257항에 있어서, 항원은 세포의 표면 상에 제시되는 것인 방법.
  259. 제258항에 있어서, 항원은 인공 항원 제시 세포의 표면 상에 제시되는 것인 방법.
  260. 제212항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존 또는 벡터는 선택 유전자를 포함하고, 선택 단계는 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를, 상기 선택 유전자가 내성을 부여하는 화합물과 접촉시킴으로써, 상기 선택 유전자를 발현하는 세포를 선택에서 생존하는 것으로서 확인하고 상기 선택 유전자를 발현하지 못하는 세포를 선택 단계에서 생존하지 못하는 것으로서 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  261. 제212항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, 확장 및 선택 단계는 종점을 포함하여 10일 내지 14일의 기간 동안 진행되는 것인 방법.
  262. 제212항 내지 제261항 중 어느 한 항의 확장 및 선택된 세포 집단을 포함하는 조성물.
  263. 제43항, 제109항 내지 제123항, 제173항, 제211항 및 제262항 중 어느 한 항의 조성물을, 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, CAR이 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  264. 제263항에 있어서, 종양 세포는 악성 종양 세포인 방법.
  265. 제263항 또는 제264항에 있어서, 제211항 또는 제262항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 세포 또는 세포 집단이 자가 유래인 방법.
  266. 제263항 또는 제264항에 있어서, 제211항 또는 제262항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 세포 또는 세포 집단이 동종이계인 방법.
  267. 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 트랜스포존을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을, 세포 요법의 변형을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 세포 요법을 변형시키는 방법으로서, 아폽토시스가 세포를 유도제와 접촉시킴으로써 세포에서 선택적으로 유도될 수 있는 것인 방법.
  268. 제96항 내지 제136항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을, 세포 요법의 변형을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 세포 요법을 변형시키는 방법으로서, 아폽토시스가 세포를 유도제와 접촉시킴으로써 세포에서 선택적으로 유도될 수 있는 것인 방법.
  269. 제267항 또는 제268항에 있어서, 세포는 자가 유래인 방법.
  270. 제267항 내지 제269항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 요법은 입양 세포 요법인 방법.
  271. 제267항 내지 제269항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 세포 요법의 종결인 방법.
  272. 제267항 내지 제271항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 세포 요법에서 제공된 세포의 부분의 고갈인 방법.
  273. 제267항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 유도제의 억제제를 투여하여 세포 요법의 변형을 억제함으로써, 세포 요법의 작용 및/또는 효능을 회복시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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