KR20210073520A - 동종이계 세포 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

동종이계 세포 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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KR20210073520A
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에릭 엠 오스터택
데본 쉐들록
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포세이다 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

키메라 자극 수용체(CSR), CSR을 포함하는 세포 조성물, 대상체의 질병 또는 장애 치료를 위해 이를 제조하는 방법 및 이를 이용하는 방법이 개시된다.

Description

동종이계 세포 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 9월 5일에 출원된 미국 임시출원 제62/727,498호, 2018년 10월 10일에 출원된 미국 임시출원 제62/744,073호, 2019년 3월 7일에 출원된 미국 임시출원 제62/815,334호 및 2019년 3월 8일에 출원된 미국 임시출원 제62/815,880호의 우선권 및 이점을 주장한다. 이들 출원 각각의 내용은 그 전체가 본원에서 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시 내용은 분자 생물학에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 키메라 수용체, 동종이계 세포 조성물, 이의 제조 방법 및 사용 방법에 관한 것이다.
서열목록의 참조에 의한 통합
2019년 9월 5일에 생성된 크기가 55.7 MB인 파일명 "POTH-046_001WO_SequenceListing.txt"의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
이식편 대 숙주 반응 및 숙주 대 이식편 반응에 관여하는 유전자를 제거함으로써 제시된 문제를 극복하는 동종이계 세포 조성물에 대해 당업계에서 오랫동안 느껴졌지만 충족되지 않은 요구가 존재해왔다. 본 개시 내용은 동종이계 세포가 환경 자극에 대한 반응성을 회복할뿐 아니라 자연 살해 세포-매개 세포독성에 의한 거부를 감소 또는 방지하기 위한 비-자연 발생 구조적 개선을 포함하는 동종이계 세포 조성물, 이들 조성물의 제조 방법 및 이용 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인(ectodomain); (b) 막횡단(transmembrane) 도메인; 및 (c) 하나 이상의 신호 전달(transduction) 도메인을 포함하는 엔도도메인(endodomain)으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하는 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공하고, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않다.
활성화 성분은 활성화 성분의 아고니스트(agonist)가 결합하는 T-세포 수용체(TCR)의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 저해 단백질의 성분, 사이토카인 수용체, 및 케모카인 수용체 중 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다. 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분을 포함할 수 있다.
신호 전달 도메인은 인간 신호 전달 도메인의 성분, T-세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분 TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 저해 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 신호 전달 도메인은 CD3 단백질 또는 그 일부를 포함할 수 있다. CD3 단백질은 CD3ζ 단백질 또는 그 일부를 포함할 수 있다.
엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리 또는 유래될 수 있다. 제1 단백질 및 제3 단백질은 동일할 수 있다. 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 제4 단백질로부터 유래될 수 있다. 제1 단백질 및 제4 단백질은 동일할 수 있다. 막횡단 도메인은 제5 단백질로부터 단리 또는 유래될 수 있다. 제1 단백질 및 제5 단백질은 동일할 수 있다.
일부 양태에서, 활성화 성분은 자연-발생 분자에 결합하지 않는다. 일부 양태에서, 활성화 성분은 자연-발생 분자에 결합하나, CSR은 활성화 성분이 자연-발생 분자와 결합시 신호를 전달하지 않는다. 일부 양태에서, 활성화 성분은 비-자연 발생 분자에 결합한다. 일부 양태에서, 활성화 성분은 자연-발생 분자와 결합하지 않지만 비-자연 발생 분자에 결합한다. CSR은 활성화 성분이 비-자연 발생 분자에 결합시 신호를 선택적으로 전달할 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 개시 내용은 (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 그의 일부를 포함하고, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하는, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인으로서, 이때 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 그의 일부를 포함하는, 막횡단 도메인; 및 (c) 세포질 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 그의 일부를 포함하고, 하나 이상의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 엔도도메인을 포함하는 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 일부 양태에서, 비-자연 CSR은 SEQ ID NO:17062와 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비-자연 발생 CSR은 SEQ ID NO:17062의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용은 또한 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 이때 엑토도메인이 변형을 포함하는 비-자연 발생 키메라 자극 수용체를 제공한다. 변형은 활성화 성분 또는 제1 단백질의 야생형 서열과 비교시 활성화 성분 또는 제1 단백질의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 절단(truncation)을 포함할 수 있다. 활성화 성분의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 절단은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 일부의 돌연변이 또는 절단을 포함할 수 있다. CD2 세포외 도메인의 돌연변이 또는 절단은 자연 발생 CD58과의 결합을 감소 또는 제거할 수 있다. 일부 양태에서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO:17119와 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO:17119의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 양태에서, 본 개시 내용은 (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 그의 일부를 포함하고, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 신호 펩티드 또는 그의 일부를 포함하고, 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 일부는 돌연변이 또는 절단을 포함하는, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인으로서, 이때 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 그의 일부를 포함하는, 막횡단 도메인; 및 (c) 세포질 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 그의 일부를 포함하고, 하나 이상의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 엔도도메인을 포함하는 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 일부 양태에서, 비-자연 CSR은 SEQ ID NO:17118과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비-자연 발생 CSR은 SEQ ID NO:17118의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존(transposon)을 제공한다.
본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 백터를 포함하는 세포를 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다.
본원에서 개시된 변형된 세포는 동종이계 세포 또는 자가 세포일 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 변형된 세포는 동종이계 세포이다. 일부 바람직한 양태에서, 변형된 세포는 동종이계 T-세포 또는 변형된 동종이계 CAR T-세포이다.
본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 CSR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 변형된 세포를 포함하는 조성물 또는 본원에서 개시된 변형된 세포를 복수 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시 내용은 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; 및 (b) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 키메라 자극 수용체를 포함하는 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
변형된 T-세포는 유도성 세포자멸촉진(proapoptotic) 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 변형된 T-세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거한다.
변형된 T-세포는 HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E(HLA-E) 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 폴리펩티드와 HLA-E 폴리펩티드 사이에 위치된 링커를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 펩티드 및 B2M 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드와 펩티드 사이에 위치된 제1 링커, 및 B2M 폴리펩티드와 HLA-E를 코딩하는 펩티드 사이에 위치된 제2 링커를 추가로 포함할 수 있다.
변형된 T-세포는 비-자연 발생 항원 수용체, 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 그 조합을 추가로 포함할 수 있다. 비-자연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함할 수 있다.
CSR은 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. CSR은 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현될 수 있다.
변형된 T-세포는 자가 세포일 수 있다. 변형된 T-세포는 동종이계 세포일 수 있다. 변형된 T-세포는 초기 기억 T-세포, 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM), 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 줄기 세포-유사 T 세포일 수 있다.
본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 변형된 T-세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 변형된 T 림프구(T-세포)의 집단(population)을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이때 집단의 복수의 변형된 T-세포는 본원에 개시된 CSR을 포함한다. 본 개시 내용은 또한 T 림프구(T-세포)의 집단을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이때 집단의 복수의 T-세포는 본원에 개시된 변형된 T-세포를 포함한다.
본 개시 내용은 치료적 유효량의 본원에 개시된 임의의 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애를 치료하는 방법; 또는 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 조성물은 본원에서 개시된 바와 같은 변형된 T-세포 또는 변형된 T-세포의 집단이다. 본 개시 내용은 또한 치료적 유효량의 본원에 개시된 조성물 및 CSR을 결합하는 하나 이상의 비-자연 발생 분자를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애를 치료하는 방법이다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 CSR 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 안정적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 상기 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, CSR을 포함하는 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함한다. 일부 양태에서, 집단이 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함한다. 조성물은 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 개시 내용은 또한 질병 또는 장애의 치료 방법에 의해 제조된 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 치료적 유효량의 상기 방법에 의해 제조된 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법을 추가로 제공한다. 치료 방법은 활성화제 조성물을 대상체에 투여하여 생체 내 변형된 T-세포의 집단을 활성화시키는 단계, 생체 내 변형된 T-세포의 집단의 세포 분열을 유도하는 단계 또는 그 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 CSR 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 일시적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 상기 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, CSR을 포함하는 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함한다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함한다. 조성물은 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 개시 내용은 또한 질병 또는 장애의 치료 방법에 의해 제조된 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 치료적 유효량의 상기 방법에 의해 제조된 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 대상체에 투여된 변형된 T-세포의 집단 내 변형된 T-세포는 더이상 CSR을 발현하지 않는다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 CSR 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 안정적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계 및 세포를 활성화제 조성물과 접촉시켜 복수의 활성화된 변형된 T-세포를 제조하는 단계를 포함하는 변형된 T-세포의 집단을 확장하는 방법으로서, 이때 복수의 변형된 T-세포의 확장이 동일한 조건 하에서 CSR을 안정적으로 발현하지 않는 복수의 야생형 T-세포의 확장보다 적어도 2배 더 높은 확장 방법을 제공한다. 일부 양태에서, CSR을 포함하는 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함한다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함한다. 본 개시 내용은 상기 방법에 의해 확장된 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 개시 내용은 또한 질병 또는 장애의 치료를 위한 상기 방법에 의해 확장된 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 치료적 유효량의 상기 방법에 의해 확장된 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법을 추가로 제공한다. 치료 방법은 활성화제 조성물을 대상체에 투여하여 생체 내 변형된 T-세포의 집단을 활성화시키는 단계, 생체 내 변형된 T-세포의 집단의 세포 분열을 유도하는 단계 또는 그 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 CSR 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 안정적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계 및 세포를 활성화제 조성물과 접촉시켜 복수의 활성화된 변형된 T-세포를 제조하는 단계를 포함하는 변형된 T-세포의 집단을 확장하는 방법으로서, 이때 복수의 변형된 T-세포의 확장이 동일한 조건 하에서 CSR을 일시적으로 발현하지 않는 복수의 야생형 T-세포의 확장보다 적어도 2배 더 높은 확장 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 상기 방법에 의해 확장된 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, CSR을 포함하는 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함한다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함한다. 조성물은 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 것일 수 있다. 본 개시 내용은 또한 질병 또는 장애의 치료를 위한 상기 방법에 의해 확장된 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 치료적 유효량의 상기 방법에 의해 확장된 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법을 추가로 제공한다. 일부 양태에서, 대상체에 투여된 변형된 T-세포의 집단 내 변형된 T-세포는 더이상 CSR을 발현하지 않는다.
상기 양태들 중 임의의 것은 임의의 다른 양태와 조합될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시 내용이 속하는 업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서, 문맥에서 명백하게 달리 지시되지 않는 한, 단수 형태는 또한 복수를 포함할 수 있고; 예로서, 용어 "a", "an", 및 "the"는 단수 또는 복수로 이해되고, 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 예로서 "요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다. 명세서 전체에 걸쳐서, 단어 "포함하는", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해될 수 있지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제는 아니다. 약이란 명시된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다. 문맥에서 달리 명확하지 않는 한, 본원에서 제공된 모든 수치는 용어 "약"에 의해 수식된다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시 내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참조문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 본원에서 인용된 참조문헌은 청구된 본 발명에 대한 선행 기술로 인정되지 않는다. 상충되는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 제어할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일뿐이며, 제한하려는 의도는 아니다. 본 개시 내용의 다른 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.
특허 또는 출원 파일에는 컬러로 실행된 하나 이상의 도면이 포함되어 있다. 컬러 도면(들)이 있는 이 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청에 의하고 필요시 비용을 지불하면 사무소로부터 제공될 수 있다.
도 1은 T-세포 수용체(TCR) 및 공동-수용체 CD28 및 CD2를 나타내는 개략도이다.
도 2는, 1차 및 2차 공동-자극이 아고니스트 mAb(항-CD3, 항-CD28, 및 항-CD2)의 결합을 통해 T-세포에 전달되는 것을 나타내는 개략도이다. 완전한 T-세포 활성화는 면역 반응을 부스팅하는 공동-자극 수용체에 의한 제2 신호와 함께 TCR의 결합에 결정적으로 의존한다. 1차 및 2차 공동-자극은 아고니스트 mAb(예를 들어, 항-CD3, 항-CD28, 및 항-CD2)를 이용한 표면 수용체로의 처리 및 결합을 통해 T-세포로 전달될 수 있다.
도 3은 TCR의 부재 하에서 오직 2차 공동-자극만이 아고니스트 mAb의 결합을 통해 T-세포에 전달된다는 점을 보여주는 개략도이다. 완전한 T-세포 활성화는 공동-자극 수용체에 의한 제2 신호와 함께 CD3ζ을 통한 1차 자극에 결정적으로 의존하기 때문에, T 세포 활성화 및 확장은 차선적이며 감소된다.
도 4는 TCR의 부재 하에서 자극이 키메라 자극 수용체(CSR)의 발현으로 향상된다는 점을 나타내는 개략도이다. TCR의 부재 하에서, 그러나 표면-발현된 CSR의 존재 하에서, 1차 및 2차 공동-자극 신호는 T 세포가 표준 아고니스트 mAb로 처리될 때 전달된다. CSR-매개 자극 신호를 통해 더 완전한 T-세포 활성화가 달성되기 때문에, T 세포 활성화 및 확장이 향상된다.
도 5는 본 개시 내용의 예시적인 CSR CD28z를 묘사하는 개략도이다.
도 6는 본 개시 내용의 예시적인 CSR CD2z를 묘사하는 개략도이다.
도 7은 자연 리간드 (CD58) 결합을 제거하기 위한 CSR CD2z의 돌연변이 전략의 개략도이다. CSR CD2z 돌연변이체 패널이 CD2의 세포외 도메인 내에서 설계되었다. 이 패널의 목표는 더이상 CD58에 결합하지 않지만 항-CD2 활성화제 물질에 의해 결합되는 이들의 수용력을 유지하는 돌연변이체를 식별하는 것이다. 이는 두가지 주요 이유에서 바람직할 수 있다: 1) 활성화된 T 세포에 의한 CD58 발현은 야생형(WT) CD2z CSR과 상호작용할 수 있고, 가능하면 CSR의 최적 성능을 방해할 수 있다는 점, 및 2) WT CD2z CSR가 자연 리간드 CAR로서 작용하기 때문에, CSR을 발현하는 T 세포가 활성화된 T 세포를 비롯하여 CD58-발현 세포에 대한 세포독성 활성을 매개할 수 있다는 점. 따라서, CD58과 상호작용할 수 없지만 최적의 세포 확장을 위해 활성화 항-CD2 물질에 결합하는 이것의 능력을 보유한 돌연변이체 CD2z CSR이 요구된다.
도 8는 본 개시 내용의 예시적인 CSR CD2z-D111H를 묘사하는 개략도이다. D111H 돌연변이는 CSR CD2z-D111H 구축물의 CD2 세포외 도메인 내 존재한다.
도 9a 및 도 9b는 CSR의 piggyBac® 전달이 TCRb/b2M 이중-녹아웃 CAR-T 세포의 확장을 향상시킨다는 점을 보이는 일련의 플롯이다. 정상 공여자 혈액에서 단리된 Pan T 세포는 Cas-CLOVER™ 유전자-편집 시스템과 조합된 piggyBac® DNA 변형 시스템을 이용하여 유전적으로 변형되었다. 세포는, CAR, 선택 유전자 및 CSR(CD28z 또는 CD2z)를 코딩하는 트랜스포존, Super piggyBac™ 트랜스포사아제 효소를 코딩하는 mRNA, Cas-CLOVER™를 코딩하는 mRNA 및 TCR 및 MHCI을 녹아웃하기 위해(이중-녹아웃; DKO) TCRb 및 b2M을 표적화하는 다중 가이드 RNA(gRNA)을 이용하여 단일 반응으로 전기천공되었다. 세포는 후속해서 아고니스트 mAb 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28으로 자극되고, 나중에 16일의 배양 기간에 걸친 유전자 변형을 위해 선택되었다. 초기 배양 기간의 말미에, 모든 T 세포는 CAR을 발현하였으며, 이는 유전적으로 변형된 세포에 대한 성공적인 선택을 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). CD2z 또는 CD28z CSR를 발현하는 샘플에서, DKO 세포의 확장의 더 큰 정도는 CAR 단독 DKO 세포의 더 큰 빈도 만큼 관찰되었다(도 9a 및 도 9b). CD2z 또는 CD28z CSR을 발현하는 DKO CAR-T 세포 샘플에서, DKO CAR-T 세포 단독에 비해 적어도 2배의 세포 확장이 관찰되었다.
도 10a 및 도 10b는 정제된 DKO CAR-T 세포에서 CSR CD2z 또는 CD28z가 재자극시 향상된 확장을 도모하는 점을 보여주는 일련의 플롯이다. 초기 유전자 변형과 1차 자극 및 확장 후, 각 그룹에서의 세포(모의(WT CAR-T 세포), DKO CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포 + CD2z CSR, 및 DKO CAR-T 세포 + CD28z CSR)는 자기 비드를 이용하여 TCR-MHCI- 세포에 대해 정제되었다. 이어서 정제된 세포는 항-CD2, 항-CD3, 및 항-CD28 아고니스트 mAb를 이용하여 재자극되었다. 14일 배양 기간의 말미에, TCR 및 MHCI 발현(a)뿐 아니라 세포 집단 확장의 크기(b)가 결정되었다. 이 2차 확장 후, CD2z 또는 CD28z CSR을 발현하는 세포를 비롯하여 모든 정제된 DKO 세포는 DKO 세포에 대해 여전히 극도로 순수하였다(>98.8% DKO). CD2z 또는 CD28z CSR을 발현하는 DKO CAR-T 세포는 CSR을 발현하지 않는 세포와 비교했을 때 확장이 향상되었다.
도 11은 사이토카인 보충이 재자극시 CSR을 발현하는 정제된 DKO CAR-T 세포를 추가로 확장할 수 있다는 점을 보여주는 그래프이다. 초기 유전자 변형 및 1차 자극 및 확장 후, CSR을 발현하는 세포는 자기 비드를 이용하여 DKO 세포를 위해 정제되었다. 이어서, 정제된 세포는 외인성 정제된 재조합 IL7 및 IL15의 존재 하에서 항-CD2, 항-CD3, 및 항-CD28 아고니스트 mAb를 이용하여 재자극되었다. 14일 배양 기간의 말미에, 세포 집단 확장의 크기가 결정되었다. 2차 확장 후, CD2z 또는 CD28z CSR을 발현하는 세포를 비롯하여 모든 정제된 DKO 세포는 TCR-MHCI- 세포에 대해 여전히 극도로 순수했다(>98.8% 이중 녹아웃(데이터는 표시되지 않음)). 또한, IL7 및 IL15의 존재 하에서 세포가 견고하게 성장하였으며, 이는 보충하지 않은 것보다 더 컸다. 이들 데이터는 외인성 사이토카인이 부가되어 CSR을 발현하는 WT CAR-T 세포를 추가로 확장시킬 수 있음을 입증한다.
도 12는 CAR의 표면 발현이 DKO 세포에서 CSR의 공동-발현에 의해 크게 영향받지 않음을 보여주는 그래프이다. 2차 확장 후, 세포(모의(WT T 세포), WT CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포 + CD2z CSR, 및 DKO CAR-T 세포 + CD28z CSR)를 CAR의 표면-발현에 대해 염색하고, 대조군 WT CAR-T 세포 및 모의 T 세포와 비교하였다. CD2z 또는 CD28z CSR의 발현은 T 세포의 표면 상 CAR 분자의 발현에 대해 큰 영향을 미치지 않았다.
도 13은 CSR의 발현이 시험관 내 DKO CAR-T 세포 세포독성에 유의미하게 영향을 미치지 않는다는 점을 보이는 그래프이다. 2차 확장 후, 세포(모의(WT T 세포), WT CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포 + CD2z CSR, 및 DKO CAR-T 세포 + CD28z CSR)를 조작된 K562-BCMA-루시퍼라아제(eK562-Luc.BCMA) 또는 음성 대조군 라인 K562-PSMA-루시퍼라아제(eK562-Luc.PSMA)와 함께 48시간 동안 10:1, 3:1, 또는 1:1 E:T 비율로 공동-배양하였다. 루시퍼라아제 신호를 측정하여 세포독성을 결정하였다. eK562-Luc.PSMA의 사멸은 점선으로 나타낸 반면 eK562-Luc.BCMA의 사멸은 실선으로 나타낸다. 모든 CAR+ T 세포는 항-BCMA 특이적 CAR을 발현하였다. DKO CAR-T 세포는 WT CAR-TCR 세포와 유사한 시험관 내 세포독성을 나타낸다. 이 활동은 CD2z 또는 CD28z CSR 공동-발현에 의해 유의미하게 영향받지 않았다.
도 14은 CSR의 발현이 시험관 내 IFNg의 DKO CAR-T 세포 분비에 유의미하게 영향을 미치지 않는다는 점을 보이는 그래프이다. 48시간 사멸 어세이로부터 얻은 상청액을 BCMA CAR T 세포의 항원-특이적 기능의 척도로서 분비된 IFNg에 대해 분석했다. CD2z 또는 CD28z CSR 발현이 있거나 없는 모든 CAR-T 세포는 BCMA를 발현하는 표적 세포(eK562-Luc.BCMA)와의 공동-배양에 반응하여 IFNg를 분비하지만, 관련없는 표적을 발현하는 것은 분비하지 않는다(eK562-Luc.PSMA).
도 15은 CSR의 발현이 시험관 내 DKO CAR-T 세포 증식에 유의미하게 영향을 미치지 않는다는 점을 보이는 일련의 플롯이다. 모의(WT T-세포), WT CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포 + CD2z CSR, 및 DKO CAR-T 세포 + CD28z CSR 세포는, 세포 증식에 따라 희석되는 Cell Trace Violet(CTV)로 라벨링되었다. 세포는 eK562-Luc.PSMA 또는 eK562-Luc.BCMA 세포와 1:2 E:T 비율로 5일 동안 공동-배양되었다. CD2z 또는 CD28z가 있거나 없는 모든 CAR-T 세포는 BCMA를 발현하는 표적 세포(eK562-Luc.BCMA)에 반응하여 증식하지만, 관련없는 항원을 발현하는 세포(eK562-Luc.PSMA)에는 그렇지 않다.
도 16은 DKO CAR-T의 기억 표현형이 CD2z CSR 공동-발현으로 유의미하게 영향 받지 않음을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. WT CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포 + CD2z, 및 DKO CAR-T 세포 + CD28z은 Tscm, Tcm, Tem, 및 Teff 세포를 정의하기 위해 표면 CD45RA, CD45RO, 및 CD62L의 발현에 대해 염색되었다; Tscm (CD45RA+CD45RO-CD62L+), Tcm (CD45RA-CD45RO+CD62L+), Tem (CD45RA-CD45RO+CD62L-), Teff (CD45RA+CD45RO-CD62L-). CD2z의 존재 또는 부재 하 WT 및 DKO CAR-T 세포는 주로 매우 높은 수준의 유리한 Tscm 및 Tcm 세포로 구성된다. 그러나, CD28z가 DKO CAR-T 세포에서 발현되면, 표현형은 훨씬 더 분화되어, Tcm 및 Tem 세포에 유리하다. 상기 표현형은 이러한 CAR T 세포가 더 분화되는 것처럼 보이기 때문에 이들의 생체 내 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
도 17은 DKO CAR-T에서 활성화/고갈 마커의 발현이 CD2z CSR 공동-발현으로 유의미하게 영향 받지 않음을 나타내는 일련의 그래프이다. 모의(WT T 세포), WT CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포, DKO CAR-T 세포 + CD2z, 및 DKO CAR-T 세포 + CD28z는 중요한 고갈 분자 Lag3, PD1, 및 Tim3의 발현에 대해 유세포 분석법에 의해 조사되었다. CD2z가 있거나 없는 WT 및 DKO CAR-T 세포는 모의 T 세포와 비교할 때 고갈 분자의 발현이 거의 내지 전혀 없다. 그러나, 확장 과정 동안 DKO CAR-T 세포에서 CD28z CSR의 발현은 고갈 마커 Lag3, PD1, 및 Tim3의 상당한 상향조절을 도모한다. 상기 표현형은 이러한 CAR T 세포가 더 고갈된 것처럼 보이기 때문에 이들의 생체 내 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 대조적으로, CD2z 발현은 DKO CAR-T 세포의 고갈 표현형에 거의 내지 전혀 영향을 미치지 않으면서 세포의 확장 능력을 상당히 향상시킨다.
도 18은 CSR의 전달이 CAR-T 세포의 확장을 향상시킨다는 점을 나타내는 그래프이다. CSR은 mRNA에 의해 일시적으로 또는 piggyBac®에 의해 안정적으로 CAR-T 세포에 전달되었다. 정상 공여자 혈액에서 단리된 Pan T 세포는 piggyBac® DNA 변형 시스템 및 표준 포세이다(Poseida) 공정을 사용하여 유전적으로 변형되었다. 세포는 Super piggyBacTM 트랜스포사아제 효소(SPB)를 코딩하는 mRNA, BCMA CAR 및 선택 유전자를 코딩하는 트랜스포존으로, CSR(CD28z 또는 CD2z; 결과적으로 일시적 발현을 초래함)을 코딩하는 추가적인 mRNA 또는 CD19 mRNA 대조군과 함께, 또는 BCMA CAR, 및 선택 유전자 및 CSR(CD28z 또는 CD2z; 결과적으로 안정적 발현을 초래함)을 코딩하는 트랜스포존으로, 단일 반응으로 공동-전기천공되었다. 세포는 후속해서 아고니스트 mAb 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28으로 자극되고, 나중에 19일의 배양 기간에 걸친 유전자 변형을 위해 선택되었다. 초기 배양 기간의 말미에, 모든 T 세포는 CAR을 발현하였으며, 이는 유전적으로 변형된 세포에 대한 성공적인 선택을 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). 막대는 웰에서 살아있는 총 CAR-T 세포를 나타내고, 숫자는 CD19 mRNA 대조군 또는 CSR 부재 하에서 생성된 CAR-T 세포보다 확장의 배-증가를 나타낸다. 일시적으로 또는 안정적으로, CD2z 또는 CD28z CSR를 발현하는 샘플에서, CAR-T 세포의 더 큰 정도의 확장.
도 19는 CSR의 발현이 CAR-T 세포 세포독성에 유의미하게 영향을 미치지 않는다는 점을 보이는 일련의 막대 그래프이다. CSR은 mRNA에 의해 일시적으로 또는 piggyBac®에 의해 안정적으로 CAR-T 세포에 전달되었다. 정상 공여자 혈액에서 단리된 Pan T 세포는 piggyBac® DNA 변형 시스템 및 표준 포세이다(Poseida) 공정을 사용하여 유전적으로 변형되었다. 세포는 Super piggyBacTM 트랜스포사아제 효소(SPB)를 코딩하는 mRNA, BCMA CAR 및 선택 유전자를 코딩하는 트랜스포존으로, CSR(CD28z 또는 CD2z; 결과적으로 일시적 발현을 초래함)을 코딩하는 추가적인 mRNA와 함께, 또는 BCMA CAR, 및 선택 유전자 및 CSR(CD28z 또는 CD2z; 결과적으로 안정적 발현을 초래함)을 코딩하는 트랜스포존으로, 단일 반응으로 공동-전기천공되었다. 세포는 후속해서 아고니스트 mAb 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28으로 자극되고, 나중에 19일의 배양 기간에 걸친 유전자 변형을 위해 선택되었다. 초기 배양 기간의 말미에, 모든 T 세포는 CAR을 발현하였으며, 이는 유전적으로 변형된 세포에 대한 성공적인 선택을 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). CAR-T 세포 사멸 능력을 평가하기 위해, 세포를 조작된 K562-BCMA-루시퍼라아제(eK562-Luc.BCMA) 또는 음성 대조군 라인 K562-루시퍼라아제(eK562-Luc)와 함께 48시간 동안 10:1, 3:1, 또는 1:1 E:T 비율로 공동-배양하였다. 루시퍼라아제 신호를 측정하여 세포독성을 결정하였다. eK562-Luc의 사멸은 좌측 막대 그래프에 나타낸 반면에, eK562-Luc.BCMA의 사멸은 우측 막대 그래프에 나타낸다. 모든 CAR+ T 세포는 항-BCMA 특이적 CAR을 발현하였고, BCMA+ 표적 세포에 대항해 유사한 시험관 내 세포독성을 나타냈다. 요약하면, 이 활성은 일시적 또는 안정적인 CSR 공동-발현에 의해 크게 영향받지 않았다.
도 20은 TCR의 존재 하에서, 키메라 자극 수용체(CSR)의 발현으로 자극이 향상된다는 점을 나타내는 개략도이다. 일시적으로 또는 안정적으로 발현된, 표면-발현된 CSR의 존재 하에서, T 세포가 아고니스트 mAb를 나타내는 물질로 처리시 향상된 1차 및 2차 공동-자극 신호가 전달된다. 일 양태에서, 상기 개략도는 자가 세포를 나타낸다. CSR-매개 자극 신호를 통해 더 완전한 T-세포 활성화가 달성되기 때문에, T 세포 활성화 및 확장이 향상된다.
도 21은 CSR이 T 세포의 표면 상에서 발현되고, 외인성 자극 부재 하에서 세포 활성화를 도모하지 않는다는 점을 보여주는 일련의 그래프이다. 정상 혈액 공여자로부터의 Pan T 세포는 표준 T 세포 배양 배지에서 항-CD3/항-CD28 비즈로 자극된 다음 휴면을 취했다. 이어서, 이들 세포는 CD28 CSR, CD2 CSR 또는 야생형 CD19 대조군을 코딩하는 10 μg의 mRNA로 전기천공되었다(700μs 동안 BTX ECM 830 전기천공기, 500V). 이틀 후, 전기천공된 세포는 각 분자의 표면-발현에 대해 유세포분석법에 의해 조사되었고, 데이터는 누적 히스토그램으로 표시되었다. 또한, 세포 크기(FSC-A) 및 CD69 발현이 모의 전기천공된 대조군 세포 위의 세포 활성화의 가능한 지표로 평가되었다. CD28, CD2, 및 CD19의 증가된 표면 발현은 각각 CD28z CSR, CD2z CSR 또는 CD19로 전기천공된 T 세포에서 검출되었다. T 세포의 표면에서 이들 분자의 발현은 외인성 자극 부재 하에서 세포를 본질적으로 활성화하지 않았다.
도 22는 CSR 분자가 CAR-T 세포의 향상된 확장을 위한 제조 동안 일시적으로 전달될 수 있음을 보여주는 일련의 선 그래프이다. 건강한 공여자 혈액에서 단리된 Pan T 세포는 동종(Allo) CAR-T 세포의 생산을 위해 Cas-CLOVER™ 유전자-편집 시스템(CC)과 함께 piggyBac® DNA 변형 시스템을 이용하여, 또는 자가(Auto) CAR-T 세포의 생산을 위해 CC 유전자-편집 없이 이용하여 유전적으로 변형하였다; auto CAR-T 세포는 Super piggyBac® 트랜스포사아제 효소(SPB)를 코딩하는 mRNA 및 CAR, 선택 유전자 및 안전 스위치를 코딩하는 트랜스포존의 뉴클레오펙션에 의해 생성되었다. Allo CAR-T의 생산을 위해, 세포는 SPB 효소를 코딩하는 mRNA, CC를 코딩하는 mRNA, TCR 및 MHCI의 녹아웃을 위한 TCRb 및 b2M을 표적화하는 다중 가이드 RNA(gRNA), 및 CAR, 선택 유전자 및 CSR CD2z를 코딩하는 트랜스포존 또는 CAR, 선택 유전자 및 안전 스위치를 코딩하는 트랜스포존(CSR을 코딩하지 않음)을 이용하여 단일 반응으로 전기천공(EP)되었다. 안정적인 통합을 위해 트랜스포존에 코딩된 CSR을 받지 못한 CAR-T 세포의 경우, CD2z CSR가 초기 EP 반응에서 단 한번만 mRNA로서 일시적으로 세포에, 100 μl EP 반응에서 5 μg, 10 μg, 및 20 μg의 mRNA의 다양한 양으로 제공되었다. EP 후, 모든 세포는 후속해서 아고니스트 mAb 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28의 칵테일로 자극되고, 나중에 선택 유전자를 이용하여 19일의 배양 기간에 걸친 유전자 변형을 위해 선택되었다. 초기 배양 기간의 말미에, 모든 T 세포는 CAR을 발현하였으며, 이는 유전적으로 변형된 세포에 대한 성공적인 선택을 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). 각각에 대한 데이터는 다양한 생산일에서 선 그래프로 나타낸다. CD2z CSR이 안정적으로(트랜스포존에서 코딩된 대로(안정적)) 또는 일시적으로(mRNA에서 코딩된 대로(mRNA)) 제공된 샘플에서, CSR 없이 생산된 CAR-T 세포에 비해 CAR-T 세포의 더 큰 확장이 관찰되었다. 이들 데이터는 CSR이 자가 및 동종이계 CAR-T 생성물 모두의 확장을 향상시키기 위해 제조 동안 mRNA로서 일시적으로 전달될 수 있음을 보여준다.
도 23a는 CSR CD2z 돌연변이 염색 데이터를 나타내는 막대 그래프이다. CSR CD2z 돌연변이체 패널을 설계하고, 구축하고 표면 발현 및 여러 항-CD2 항체 물질에 대한 결합에 대해 테스트하였다. 이를 위해, 각각의 돌연변이체를 합성하고, 사내 mRNA 생성 벡터에 서브클로닝한 다음, 각각에 대해 고-품질 mRNA를 생산했다. K562 세포를 9 μg의 mRNA로 전기천공하고, 각 분자의 표면 발현을 유세포분석을 통해 다음날 분석하고, 데이터를 막대 그래프로 표시하였다. 각 분자는 항-CD2 활성화제 물질, 항-CD2 모노클로날 항체 (클론 TS1/8) 또는 항-CD2 폴리클로날 항체 물질 (염소 항-인간 CD2)로 염색되었다. 각 구축물에 대해 가변적인 결합이 관찰되었고, 데이터는 도 23c에 요약되어 있다.
도 23b는 CSR CD2z 돌연변이체 탈과립 데이터를 나타내는 일련의 막대 그래프이다. CSR CD2z 돌연변이체의 패널은 CD58 양성 세포 표적에 대한 탈과립을 매개하는 능력에 대해 테스트되었다. T 세포 탈과립은 표적 항원을 발현하는 표적 세포주와의 공동배양 후 세포내 CD107a 발현에 대한 FACS 염색에 의해 측정될 수 있는 T 세포 사멸의 대리물이다. 구체적으로, 정상 혈액 공여자로부터의 pan T 세포는 표준 T 세포 배양 배지에서 항-CD3/항-CD28 비즈로 자극된 다음 휴면을 취했다. 이어서, 이들 세포는 CSR CD2z 돌연변이체를 발현하는 mRNA 9 μg로 전기천공되고(700 μs 동안 500V에서 BTX ECM 830 전기천공기), 밤새 배양되었다. 다음날, 세포는 다양한 표적 세포주의 존재 하에서 4-6시간 동안 공동 배양되었다. 양성 표적 세포주는 각각 인간 CD58을 코딩하는 mRNA로 전기천공되거나 리포펙션된 K562 세포 또는 Rat2 세포를 포함하는 반면, 음성 대조군은 T 세포를 단독으로 발현하는 CSR CD2z 돌연변이체이거나 전기천공되지 않은 Rat2 세포였다. 표면-발현된 인간 CD58을 인식하는 CSR CD2z 돌연변이체를 발현하는 T 세포만이 배경 이상의 수준에서 탈과립화할 수 있었다. D111H, K67R/Y110D, K67R/Q70K/Y110D/D111H, Delta K106-120, CD3z 결실 및 모의 대조군에 대한 반응성은 거의 관찰되지 않았고, 데이터는 도 23c에 요약되어 있다.
도 23c는 염색 및 탈과립 데이터의 요약이다. 표면-발현 및 결합 연구의 데이터뿐 아니라 각 CSR CD2z 돌연변이체에 대한 탈과립 실험에 대한 것은 표에 요약된다. 표면에 발현되고/되거나 항-CD58 탈과립 활성을 매개하지 않는 항-CD2 활성화제 물질에 대한 결합을 보유하는 두 후보는 D111H 및K67R/Y110D CSR CD2z 돌연변이체이다. D111H 돌연변이체만이 세포 표면에서 모든 염색 물질에 의해 강하게 결합되는 동안 항-CD58 탈과립 활성을 완전히 제거한다.
도 23d는 K562 및 Rat2 세포 상 CD48, CD58 또는 CD59의 발현을 나타내는 일련의 유세포분석 플롯이다. CSR WT CD2z 분자에 대한 가능한 리간드를 확인하기 위해, 인간 CD48, CD58, 및 CD59를 포함한 알려지고 의심되는 리간드의 패널을 테스트하였다. 조작된 T 세포의 탈과립은 표적 세포를 과발현하도록 제조되고 FACS 염색에 의해 발현이 확인된 세포주 K562 및 Rat2에 대해 평가되었다. 적색 히스토그램은 염색되지 않은 세포이고, 청색 히스토그램은 mRNA로 전기천공/리포펙션된 후 FACS에 의해 각 마커의 발현에 대해 염색된 세포이다.
도 23e는 CSR CD2z가 인간 CD58은 인식하나 CD48 또는 CD59는 인식하지 않는 점을 나타내는 막대 그래프이다. CSR WT CD2z 분자에 대한 가능한 리간드를 확인하기 위해, 인간 CD48, CD58, 및 CD59를 포함한 알려지고 의심되는 리간드의 패널을 테스트하였다. 조작된 T 세포의 탈과립은 표적 세포를 과발현하도록 제조되고 FACS 염색에 의해 발현이 확인된 세포주 K562 및 Rat2에 대해 평가되었다. 세포는 mRNA로 전기천공/리포펙션된 후 FACS에 의해 각 마커의 발현에 대해 염색되었다. 대조군으로서, BCMA CAR뿐 아니라 BCMA를 과발현하는 K562 세포주가 포함되었다. 또한, GFP로 트랜스펙션된 T 세포가 또한 대조군으로서 포함되었다. T 세포 탈과립은 표적 항원을 발현하는 표적 세포주와의 공동배양 후 세포내 CD107a 발현에 대한 FACS 염색에 의해 측정될 수 있는 T 세포 사멸의 대리물이다. 정상 혈액 공여자로부터의 Pan T 세포는 표준 T 세포 배양 배지에서 항-CD3/항-CD28 비즈로 자극된 다음 휴면을 취했다. 이어서 이들 T 세포는 CSR WT CD2z, BCMA CAR, 또는 GFP를 발현하는 mRNA로 전기천공되고 밤새 배양되었다. 다음날, 세포는 인간 CD48, CD58 또는 CD59를 코딩하는 mRNA로 전기천공/리포펙션된 다양한 표적 세포주의 존재 하에서 4-6시간 동안 공동 배양되었으며, 음성 대조군은 전기천공/리포펙션되지 않은 K562 또는 Rat2이거나, 또는 각각의 전기천공된 T 세포 단독이었다. CSR WT CD2z 또는 BCMA CAR를 발현하는 T 세포는 각각 인간 CD58 또는 BCMA를 과발현하는 세포주와 공동배양시 백그라운드보다 높은 수준에서 탈과립할 수 있으나, 인간 CD48 또는 CD59에 대해서는 그렇지 않다. GFP를 발현하는 T 세포에 대해서는 반응성이 거의 관찰되지 않았다.
도 24a는 CSR CD2z-D111H 돌연변이체의 전달이 Allo CAR-T 세포의 확장을 향상시킨다는 점을 나타내는 막대 그래프이다. 건강한 공여자 혈액에서 단리된 Pan T 세포는 동종(Allo) CAR-T 세포의 생산을 위해 Cas-CLOVER™ 유전자-편집 시스템(CC)과 함께 piggyBac® DNA 변형 시스템을 이용하여, 또는 CSR 없이(No CSR) 자가(Auto) CAR-T 세포의 생산을 위해 대조군으로서 CC 유전자-편집 없이 이용하여 유전적으로 변형하였다; auto CAR-T 세포는 Super piggyBacTM 트랜스포사아제 효소(SPB)를 코딩하는 mRNA 및 CAR, 선택 유전자 및 안전 스위치를 코딩하는 트랜스포존의 뉴클레오펙션에 의해 생성되었다. Allo CAR-T의 생산을 위해, 세포는 SPB 효소를 코딩하는 mRNA, CC를 코딩하는 mRNA, TCR 및 MHCI의 녹아웃을 위한 TCRb 및 b2M을 표적화하는 다중 가이드 RNA(gRNA), 및 CAR, 선택 유전자 및 WT 또는 돌연변이체 (D111H) CSR CD2z를 코딩하는 트랜스포존 또는 CAR, 선택 유전자 및 안전 스위치를 코딩하는 트랜스포존(CSR을 코딩하지 않음)을 이용하여 단일 반응으로 전기천공(EP)되었다. 후자인, 안정적인 통합을 위해 트랜스포존에 코딩된 CSR을 받지 않은 Allo CAR-T 세포의 경우, WT 또는 돌연변이체 (D111H) CSR CD2z는 초기 EP 반응에서 단 한번만 mRNA로서 일시적으로 세포에 제공되었다. EP 후, 모든 세포는 후속해서 아고니스트 mAb 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28의 칵테일로 자극되고, 나중에 선택 유전자를 이용하여 최대 15일의 배양 기간에 걸친 유전자 변형을 위해 선택되었다. 초기 배양 기간 말미에, 유전적으로 변형된 세포(데이터는 표시하지 않음)에 대한 성공적인 선택을 나타내는 모든 T 세포는 CAR을 발현하였고, 이어서 편집되지 않은 모든 TCR-양성 세포는 >99% TCR-음성인 Allo CAR-T 세포 집단(데이터는 표시하지 않음)을 산출하는 음성 선택을 통해 고갈되었다. Auto(CSR 없음) 대조군을 제외하고 모든 샘플을 중복하여 수행하고, 각각에 대한 피크 확장에 대한 데이터(피크 확장 날짜는 표시됨)가 오류 막대가 표준 편차를 나타내는 막대 그래프로 표시된다. WT 또는 돌연변이(D111H) CD2z가 안정적으로(트랜스포존에서 코딩된 대로(안정적)) 또는 일시적으로(mRNA에서 코딩된 대로(mRNA)) 제공된 샘플에서, CSR 없이 생산된 Allo CAR-T 세포에 비해 Allo CAR-T 세포의 더 큰 확장이 관찰되었다.
도 24b는 CSR CD2z-D111H 돌연변이체의 전달이 유전자 편집을 저해하지 않는다는 점을 보이는 일련의 막대 그래프이다. 건강한 공여자 혈액에서 단리된 Pan T 세포는 Cas-CLOVER™ 유전자-편집 시스템(CC)과 조합된 piggyBac® DNA 변형 시스템을 이용하여 유전적으로 변형되어 동종이계 (Allo) CAR-T 세포가 생성되었다. 세포는 SPB 효소를 코딩하는 mRNA, CC를 코딩하는 mRNA, TCR 및 MHCI의 녹아웃을 위한 TCRb 및 b2M을 표적화하는 다중 가이드 RNA(gRNA), 및 CAR, 선택 유전자 및 WT 또는 돌연변이체 (D111H) CSR CD2z를 코딩하는 트랜스포존 또는 CAR, 선택 유전자 및 안전 스위치를 코딩하는 트랜스포존(CSR을 코딩하지 않음)을 이용하여 단일 반응으로 전기천공(EP)되었다. 후자인, 안정적인 통합을 위해 트랜스포존에 코딩된 CSR을 받지 않은 세포의 경우, WT 또는 돌연변이체 (D111H) CSR CD2z는 초기 EP 반응에서 단 한번만 mRNA로서 일시적으로 제공되었다. EP 후, 모든 세포는 후속해서 아고니스트 mAb 항-CD2, 항-CD3 및 항-CD28의 칵테일로 자극되고, 나중에 선택 유전자를 이용하여 최대 14일의 배양 기간에 걸친 유전자 변형을 위해 선택되었다. 초기 배양 기간의 말미에, 모든 T 세포는 CAR을 발현하였으며, 이는 유전적으로 변형된 세포에 대한 성공적인 선택을 나타낸다(데이터는 표시되지 않음). 모든 샘플을 중복하여 수행하고, 데이터는 오류 막대가 표준 편차를 나타내는 막대 그래프로 표시된다. WT 또는 돌연변이(D111H) CD2z가 안정적으로(트랜스포존에서 코딩된 대로(안정적)) 또는 일시적으로 (mRNA에서 코딩된 대로(mRNA)) 제공된 샘플에서, CSR 없이 생산된 Allo CAR-T 세포에 비해 Allo CAR-T 세포의 유사하거나 더 큰 정도의 유전자 편집이 관찰되었다.
도 24c는 Allo CAR-T의 기억 표현형이 CD2z CSR의 전달에 의해 유의미하게 영향받지 않는다는 점을 나타내는 막대 그래프이다. CSR이 없는 Allo CAR-T 세포 및 CSR이 있는(안정적으로 또는 일시적으로 전달됨) Allo CAR-T는 Tscm, Tcm, Tem, 및 Teff 세포를 정의하기 위해 표면 CD45RA, CD45RO, 및 CD62L의 발현에 대해 염색되었다; Tscm (CD45RA+CD45RO-CD62L+), Tcm (CD45RA-CD45RO+CD62L+), Tem (CD45RA-CD45RO+CD62L-), Teff (CD45RA+CD45RO-CD62L-). 모든 샘플을 중복하여 수행하고, 데이터는 오류 막대가 표준 편차를 나타내는 막대 그래프로 표시된다. CSR의 전달은 생성물에서 유리한 Tscm 및 Tcm 세포의 수준에 크게 영향을 미치지 않았다.
도 25는 본 개시 내용의 예시적인 HLA-bGBE 조성물을 묘사하는 개략도이다.
도 26는 본 개시 내용의 예시적인 HLA-gBE 조성물을 묘사하는 개략도이다.
도 27는 단일-사슬 HLA-E의 발현이 HLA-결핍 T 세포에 대한 NK 세포-매개 세포독성을 감소시킨다는 점을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. B2M 및 TCRαβ는 CRISPR을 이용하여 T 세포(Jurkat)에서 녹아웃되었다. B2M/TCRαβ 이중-녹아웃(DKO) T 세포는 B2M 및 펩티드 VMAPRETLIL(SEQ ID NO: 17127)를 가진 단일 사슬 상에 발현된, HLA-E 분자(HLA-bGBE)를 코딩하는 mRNA로 전기천공되었다(B2M/펩티드/HLA-E). 단일 사슬 HLA-E를 코딩하는 다양한 양의 mRNA로 전기천공된 DKO T 세포가 3시간 공동배양에서 인공 항원 제시 세포(aAPC)-확장 NK 세포의 표적으로서 사용되었다. 세포독성%는 표적 세포 단독에 비해 3시간 후 남은 표적 세포의 개수를 기반으로 계산되었다. 이들 데이터는 DKO T 세포에서 HLA-E의 표면 발현이 용량-의존적 방식으로 NK 세포에 의한 총 세포 사멸 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 28은 gRNA 서열(위에서 아래로) 및 프라이머 서열(위에서 아래로)의 목록이다.
도 29는 HLA-E가 아닌 내인성 HLA-ABC의 표적화된 녹아웃을 보여주는 일련의 유세포 분석 플롯이다. MHCI KO T 세포에서 HLA-E의 표면 발현이 NK 세포-매개 세포독성에 대한 저항성을 증가시킬 수 있음을 보여주기 때문에, 우리는 단일 사슬 HLA-E 유전자의 도입을 넘어 추가적인 전략을 탐구했다. 이를 위해, 다중 가이드 RNA(gRNA)는 숙주 대 이식편(HvG)의 주요 표적, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 발현을 방해하는 동시에 내인성 HLA-E의 파괴를 최소화하도록 설계되었다. 특히, 가이드는 HLA-E는 아닌 3개의 모든 MHCI 단백질 표적에서 발생하는 보존 영역을 표적화하는 것으로 설계되었다. Pan 인간 T 세포는 다양한 gRNA와 조합된 CRISPR Cas9을 코딩하는 mRNA로 전기천공되었고, MHCI 녹아웃의 효율성은 표면 HLA-A 및 HLA-E 발현으로써 측정되었다. HLA-A 및 HLA-E 발현의 FACS 분석이 단일 라운드의 T 세포 확장 후 수행되었고, 데이터는 아래에 표시된다. 이들 데이터는 유전자-편집 기술이 유전자-편집된 T 세포의 표면 상 내인성 HLA-E의 수준을 유지하면서 MHCI의 파괴를 표적화하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 30은 MHCI-KO 세포에 대한 자연 살해 매개 독성의 자가분실 가설의 개략도이다.
도 31은 Csy4-T2A-Clo051-G4Slinker-dCas9 구축물 지도(구현예 2)의 개략도이다.
도 32은 pRT1-Clo051-dCas9 Double NLS 구축물 지도(구현예 1)의 개략도이다.
도 33은 본 개시 내용의 동종이계 CAR-T의 생산을 위한 예시 방법을 나타내는 개략도이다.
도 34a는 Cas-CLOVER™ (dCas9-Clo051을 포함하는, RNA-가이드된 융합 단백질)을 이용하여 동종이계 및 범용 CAR-T의 생산을 위한 예시 방법으로서 증식 중인 Jurkat 세포 및 휴면 1차 인간 T 세포에서 내인성 TCRa의 고효율 유전자 편집을 나타내는 그래프이다. Cas-CLOVER 시스템은 급속도로 증식하는 Jurkat T 세포 및 비교적 높은 수준의 비분율 휴면 T 세포에서 TCRα 발현을 방해하였다.
도 34b는 Cas-CLOVER™을 이용하여 휴면 1차 인간 pan T 세포에서 내인성 TCRa, TCRb, 및 B2M의 효율적인 유전자 편집을 나타내는 일련의 유세포분석 그래프이다. 동종반응을 매개하는 중요한 표적 TCRa, TCRB, 및 B2M은 휴면 인간 T 세포에서 Cas-CLOVER에 의해 효율적으로 편집되었다.
도 35는 Cas-CLOVER가 TCRβ 및 β2M에 대한 물질을 1차 인간 T 세포로 공동 전달함으로써 다중화될 수 있음을 보이는 일련의 유세포분석 플롯이다. TCRβ/β2M 이중 녹-아웃(DKO) 세포는 항체-비드 기반 정제를 이용하여 추가로 농축되었고, 정제된 세포는 표면 발현된 CD3 및 β2M의 하향조절에 대한 FACS에 의해 분석되었다.
도 36은 TCR 및 MHCI의 KO 후 감소된 동종반응을 보여주는 일련의 그래프이다. WT 또는 DKO (TCR 및 MHCI) CAR-T 세포의 동종반응성이 ELISpot 어세이에 의한 IFNγ 및 혼합 림프구 반응(MLR)에 의해 분석되었다. 좌측에, WT 또는 유전자 편집된 DKO CAR-T 세포는 Cell Trace Violet(CTV)로 표지되었고, 1:1 비율로 조사된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 혼합되고, ELISpot 어세이에 의한 IFNγ의 증식 또는 활성화-유도 분비 각각의 분석 이전에 12일 또는 20시간 동안 인큐베이션되었다. WT 또는 DKO CAR-T 세포는 동종이계 (공여자 #1 PBMC 및 공여자 #2 PBMC) 또는 자가 (자가 PBMC) 공여자로부터 1:1 비율로 PBMC와 인큐베이션되었다. 12일 후, CTV 염료 희석은 FACS에 의해 평가되었고, 그 결과는 동종이계 PBMC와의 인큐베이션시 WT CAR-T 세포의 상당한 증식을 나타냈다; WT CAR-T 세포가 자가 PBMC와 인큐베이션된 경우 단지 2%인 것에 비해 2개의 상이한 공여자로부터의 동종이계 PBMC와 배양시 WT CAR-T 세포에 의한 40% 및 39%의 증식률이 관찰되었다. 반면에, DKO CAR-T 세포는 동종이계 PBMC와 함께 인큐베이션시 증식하지 않았는데, 이는 TCR 및 MHCI의 KO가 이식편 대 숙주 동종반응성을 제거했음을 입증하였다. 이는 ELISpot 어세이(왼쪽 하단)에 의한 단기 IFNγ에서도 마찬가지였는데, 이는 DKO CAR-T가 아닌 WT CAR-T 세포만이 동종이계 PBMC와 함께 인큐베이션시 활성화되고 분비된 IFNγ 이 되었음을 보여준다. 우측에, 조사된 WT 또는 DKO CAR-T 세포는 CFSE로 표지된 PBMC와 1:1 비율로 혼합되었고, 각각 ELISpot 어세이에 의한 IFNγ의 증식 또는 활성화-유도 분비의 분석 이전에 12일 또는 20시간 동안 인큐베이션되었다. 12일 후, CFSE 염료 희석은 FACS에 의해 평가되었고, 동종이계 CAR-T 세포와 함께 인큐베이션시 PBMC(가장 가능성이 높게는 T 세포)의 현저한 증가를 나타내었다; 자가 CAR-T 세포와 인큐베이션 시 오직 2%인 것에 비해 37% 및 9%의 PBMC가 증식하였다. 반면에, PBMC는 동종이계 CAR-T 세포와 인큐베이션 시 백그라운드 이상으로 증식하지 않았으며, 이는 TCR 및 MHCI의 KO가 숙주 대 이식편 동종반응의 제거를 초래했음을 입증한다. 이는 ELISpot 어세이(왼쪽 하단)에 의한 단기 IFNγ에서도 마찬가지였는데, 이는 WT CAR-T 세포만이 DKO CAR-T 세포가 아닌 동종이계 CAR-T와 인큐베이션 시 PBMC에 의한 IFNγ의 활성화 및 분비를 야기한다는 점을 보여준다.
도 37는 DKO 및 WT CAR-T가 유사한 CAR-발현 및 줄기-유사 표현형을 갖는다는 점을 보여주는 일련의 그래프이다. 유전자 편집은 CAR-T 세포 표현형에 영향을 미치지 않는다. BCMA CAR-발현 TCRβ/β2M DKO 및 WT T 세포는 표현형에 대해 분석되었다. CAR 발현은 WT 및 DKO에서 비슷하였다. WT 및 DKO CAR-T 세포는 T 줄기 세포 기억(TSCM)에 대한 마커인 CD45RA 및 CD62L의 발현에 대해 FACS에 의해 분석되었다. 이들 데이터는 allo CAR-T의 유전자 편집이 기억 CAR-T 세포의 조성을 유의미하게 감소시키지 않으면서 유난히 높고 우세하게 Tscm 표현형을 유지한다는 점을 입증한다.
도 38는 DKO 및 CAR-T가 매우 기능적인 점을 보여주는 일련의 그래프이다. 유전자 편집은 CAR-T 세포 기능성에 영향을 미치지 않는다. BCMA CAR-발현 TCRβ/β2M DKO 및 WT T 세포는 기능에 대해 분석되었다. H929 (BCMA+) 종양 라인에 대한 증식이 CAR-T 세포를 H929 세포와 혼합함으로써 평가되었고, 7일 동안 인큐베이션하고 FACS에 의한 종양-특이적 증식에 대해 분석되었다. H929 (BCMA+) 종양 라인에 대한 세포독성 및 IFNg 분비는 CAR-T 세포를 H929 세포와 다양한 비율로 혼합함으로써 평가되었고, 24시간 동안 인큐베이션하고 FACS에 의한 종양-특이적 증식에 대해 분석되었다. 세포독성 데이터는 종양 세포 전용 샘플로 정규화된다. 이들 데이터는 DKO CAR-T 세포를 생성하기 위한 유전자 편집이 이들의 기능 능력에 유의미하게 영향을 미치지 않는다는 점을 보인다.
도 39a는 뮤린 이종이식 모델을 이용하여 '스트레스' 용량에서 전장 플라스미드(FLP) 대 나노트랜스포존(NT)에 의해 전달 시 P-PSMA-101 트랜스포존의 전임상 평가를 나타내는 개략도이다. NSG 마우스에 피하(SC) 주사된 루시퍼라아제-발현 LNCaP 세포주(LNCaP.luc)를 이용하는 뮤린 이종이식 모델을 이용하여, 두 개의 상이한 정상 공여자로부터의 총 CAR-T 세포의 두 개의 상이한 '스트레스' 용량(2.5x10^6 또는 4x10^6)에서 전장 플라스미드(FLP) 또는 나노트랜스포존(NT)에 의해 전달된 바와 같은 P-PSMA-101 트랜스포존의 생체 내 항-종양 효능을 평가하였다. 모든 CAR-T 세포는 FLP 또는 NT 전달을 이용한 P-PSMA-101 트랜스포존의 piggyBac® (PB) 전달을 이용하여 생성되었다. 마우스를 겨드랑이에 LNCaP로 주사하였고, 종양이 확립되었을 때(캘리퍼 측정에 의해 100-200 mm3) 치료하였다. 마우스는 FLP 및 NT에 의한 트랜스포존 전달 간 효능의 가능한 기능적 차이를 검출하는 데 더 큰 해상도를 위해 IV 주사로 P-PSMA-101 CAR-T의 두 가지 상이한 '스트레스' 용량(2.5x10^6 또는 4x10^6)으로 처리되었다.
도 39b는 도 34a에 기술된 바와 같이 처리된 마우스의 종양 부피 평가를 보여주는 일련의 그래프이다. 대조군 마우스 (검정), 공여자 #1 FLP 마우스 (적색), 공여자 #1 NT 마우스 (청색), 공여자 #2 FLP 마우스 (주황색), 및 공여자 #2 NT 마우스 (녹색)에 대한 캘리퍼 측정에 의한 종양 부피 평가는 오차 막대(상단) 및 개별 마우스(하단)이 있는 그룹 평균으로서 표시되었다. y축은 캘리퍼 측정에 의해 평가된 종양 부피(mm3)를 나타낸다. x축은 T 세포 처리 후 일수를 나타낸다. NT에 의해 전달된 '스트레스' 용량의 P-PSMA-101 트랜스포존은 확립된 SC LNCaP.luc 고형 종양에 대한 FLP 및 대조군 마우스와 비교할 때 캘리퍼로써 측정된 바오 같이 향상된 항-종양 효능을 보여주었다.
본 개시 내용은 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인; 및 (c) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공하고, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않다.
활성화 성분은 인간 막횡단 수용체의 성분, 인간 세포-표면 수용체, T-세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 저해 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 또는 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 활성화 성분은 활성화 성분의 아고니스트가 결합하는 T-세포 수용체(TCR)의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 저해 단백질의 성분, 사이토카인 수용체, 또는 케모카인 수용체 중 하나 이상의 부분을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어질 수 있다.
엑토도메인은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있거나, 엑토도메인은 아고니스트가 결합하는 CD28 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이루어질 수 있거나, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD28 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17111의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17111의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17111의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 아고니스트가 결합하는 CD28 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17099의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 아고니스트가 결합하는 CD28 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17099의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 아고니스트가 결합하는 CD28 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17099의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
신호 전달 도메인은 T-세포 수용체(TCR), 인간 신호 전달 도메인의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 저해 단백질의 성분, 사이토카인 수용체, 또는 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 제2 단백질은 CD3 단백질 또는 그 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 신호 전달 도메인은 CD3 단백질 또는 그 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. CD3 단백질은 CD3ζ 단백질 또는 그 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. CD3ζ 단백질은 SEQ ID NO: 17102의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD3ζ 단백질은 SEQ ID NO: 17102의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD3ζ 단백질은 SEQ ID NO: 17102의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 CSR의 엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리 또는 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 CSR의 제1 단백질 및 제3 단백질은 동일하다. 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이루어지거나, 세포질 도메인은 CD28 세포질 도메인 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나 이로 이루어질 수 있다.
CD2 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 17113의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD2 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 17113의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD2 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 17113의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 17101의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 17101의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 세포질 도메인은 SEQ ID NO: 17101의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 CSR의 엔도도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 신호 펩티드는 제4 단백질로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 CSR의 제1 단백질 및 제4 단백질은 동일하다. 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있거나; 신호 펩티드는 CD28 신호 펩티드 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있거나, 신호 펩티드는 CD8a 신호 펩티드 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. CD2 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17110의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD2 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17110의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD2 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17110의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17098의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17098의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17098의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD8a 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17037의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD8a 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17037의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD8a 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17037의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 CSR의 막횡단 도메인은 제5 단백질로부터 단리 또는 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 CSR의 제1 단백질 및 제5 단백질은 동일하다. 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이루어지거나, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인 또는 그의 일부를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나 이로 이루어질 수 있다. CD2 막횡단 도메인은 SEQ ID NO: 17112의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD2 막횡단 도메인은 SEQ ID NO: 17112의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD2 막횡단 도메인은 SEQ ID NO: 17112의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 막횡단 도메인은 SEQ ID NO: 17100의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 막횡단 도메인은 SEQ ID NO: 17100의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CD28 막횡단 도메인은 SEQ ID NO: 17100의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일부 양태에서, 본 개시 내용의 CSR의 활성화 성분은 자연-발생 분자에 결합하지 않거나 결합할 수 없다. 일부 양태에서, 본 개시 내용의 CSR의 활성화 성분은 자연-발생 분자에 결합하거나 결합할 수 있고, CSR은 자연-발생 분자에 활성화 성분이 결합시 신호를 전달한다. 다른 양태에서, 본 개시 내용의 CSR의 활성화 성분은 자연-발생 분자에 결합할 수 있으나, CSR은 활성화 성분이 자연-발생 분자와 결합시 신호를 전달하지 않는다. 바람직한 양태에서, 본 개시 내용의 CSR의 활성화 성분은 비-자연-발생 분자에 결합하거나 결합할 수 있다. 본 개시 내용의 CSR의 활성화 성분은 활성화 성분과 비-자연 발생 분자에 결합시 신호를 선택적으로 전달한다. 일 양태에서, 자연 발생 분자는 CSR의 활성화 성분에 대한 자연 발생 아고니스트/활성화제이다. CSR 활성화 성분에 결합할 수 있는 자연 발생 아고니스트/활성화제는 임의의 자연 발생 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 자연 발생 항체 또는 항체 단편은 자연 발생 항-CD3 항체 또는 그 단편, 항-CD2 항체 또는 그 단편, 항-CD28 항체 또는 그 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양태에서, CSR 활성화 성분과 결합할 수 있는 자연 발생 아고니스트/활성화제는 항-인간 CD3 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일특이적 테트라머 항체 복합체 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 일 양태에서, 비-자연 발생 분자는 CSR의 활성화 성분에 대한 비-자연 발생 아고니스트/활성화제이다. CSR 활성화 성분에 결합할 수 있는 비-자연 발생 아고니스트/활성화제는 임의의 비-자연 발생 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 비-자연 발생 항체 또는 항체 단편은 비-자연 발생 항-CD3 항체 또는 그 단편, 항-CD2 항체 또는 그 단편, 항-CD28 항체 또는 그 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양태에서, CSR 활성화 성분과 결합할 수 있는 비-자연 발생 아고니스트/활성화제는 항-인간 CD3 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일특이적 테트라머 항체 복합체 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 일부 양태에서, CSR 활성화 성분을 결합할 수 있는 비-자연 발생 아고니스트/활성화제는 항-CD2 모노클로날 항체, BTI-322 (Przepiorka et al., Blood 92(11):4066-4071, 1998) 및 인간화 항-CD2 모노클로날 항체 클론 AFC-TAB-104 (시플리주마브; Siplizumab)(Bissonnette et al. Arch. Dermatol. Res. 301(6):429-442, 2009)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시 내용의 CSR의 엑토도메인은 변형을 포함할 수 있다. 변형은 활성화 성분 또는 제1 단백질의 야생형 아미노산 서열과 비교시 활성화 성분 또는 제1 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 절단을 포함할 수 있다. 활성화 성분 또는 제1 단백질의 아미노산 서열에서 돌연변이 또는 절단은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 일부의 돌연변이 또는 절단을 포함할 수 있다. CD2 세포외 도메인의 돌연변이 또는 절단은 자연 발생 CD58과의 결합을 감소 또는 제거한다.
결합에 있어서 감소는, 자연 발생 야생형 대응물과 비교할 때 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인의 결합 능력의 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%가 감소되는 경우이다. 결합에 있어서 제거는, 자연 발생 야생형 CD2 세포외 도메인과 비교할 때 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인의 결합 능력의 100%가 감소되는 경우이다.
돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인은 항-CD2 활성화 아고니스트 및 항-CD2 활성화 분자에 결합하지만 자연 발생 CD58과는 결합하지 않는다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17119의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17119의 아미노산 서열과 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17119의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17119의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17119의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인은 SEQ ID NO: 17119의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인을 포함하는 CSR은 SEQ ID NO: 17118의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인을 포함하는 CSR은 SEQ ID NO: 17118의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인을 포함하는 CSR은 SEQ ID NO: 17118의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인을 포함하는 CSR은 SEQ ID NO: 17118의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
본 개시 내용은 또한 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래되고, 활성화 성분은 비-자연 발생 분자에 결합하나 자연-발생 분자와는 결합하지 않는, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인; 및 (c) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공하고, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않다.
본 개시 내용은 또한 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인; 및 (c) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공하고, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않고, CSR은 활성화 성분과 자연-발생 분자의 결합 시 신호를 전달하지 않는다.
본 개시 내용은 또한 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인; 및 (c) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공하고, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않고, CSR은 활성화 성분과 비-자연-발생 분자의 결합 시 신호를 전달한다.
본 개시 내용은 또한 (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 그의 일부를 포함하고, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 일부를 포함하는, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인으로서, 이때 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 그의 일부를 포함하는, 막횡단 도메인; 및 (c) 세포질 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 그의 일부를 포함하고, 하나 이상의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다.
본 개시 내용은 또한 (a) SEQ ID NO: 17110의 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드 및 SEQ ID NO: 17111의 아미노산 서열을 포함하는 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인; (b) SEQ ID NO: 17112의 막횡단 도메인; 및 (c) SEQ ID NO: 17113의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인 및 SEQ ID NO: 17102의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17062와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17062와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17062와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17062와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17062와 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17062의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
본 개시 내용은 추가로 (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 그의 일부를 포함하고, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 야생형 CD2 세포외 도메인 또는 그의 일부의 돌연변이 또는 절단을 포함하는, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인으로서, 이때 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 그의 일부를 포함하는, 막횡단 도메인; 및 (c) 세포질 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 그의 일부를 포함하고, 하나 이상의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 일 양태에서, CD2 세포외 도메인의 돌연변이 또는 절단은 자연 발생 CD58과의 결합을 감소 또는 제거한다. 또 다른 양태에서, 돌연변이화 또는 절단된 CD2 세포외 도메인은 항-CD2 활성화 아고니스트 및 항-CD2 활성화 분자에 결합하지만 자연 발생 CD58과는 결합하지 않는다.
본 개시 내용은 추가로 (a) SEQ ID NO: 17110의 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩티드 및 SEQ ID NO: 17119의 아미노산 서열을 포함하는 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인; (b) SEQ ID NO: 17112의 막횡단 도메인; 및 (c) SEQ ID NO: 17113의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인 및 SEQ ID NO: 17102의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17118와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17118와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17118와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17118와 적어도 95% 동일한 산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17118와 적어도 99% 동일한 산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)는 SEQ ID NO: 17118의 산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 트랜스포존, 벡터, 공여자 서열 또는 공여자 플라스미드를 제공한다. 일 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 키메라 바이러스 벡터일 수 있다.
본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 세포를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 세포를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 트랜스포존, 벡터, 공여자 서열 또는 공여자 플라스미드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 세포를 제공한다. 일 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 키메라 바이러스 벡터일 수 있다. 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 본 개시 내용의 세포는 동종이계 세포 또는 자가 세포일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 세포는 동종이계 세포이다.
본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 트랜스포존, 벡터, 공여자 서열 또는 공여자 플라스미드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 조성물을 제공한다. 일 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 키메라 바이러스 벡터일 수 있다. 본 개시 내용은 또한 본원에서 개시된 임의의 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 세포 또는 복수의 세포를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 조성물을 제공한다.
본 개시 내용은 (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 세포를 제공하고, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않다.
본 개시 내용은 또한 (a) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR) (이때, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않음); 및 (b) 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 변형된 세포를 제공한다.
본 개시 내용은 또한 (a) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR) (이때, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않음); (b) 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열; 및 (c) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는 변형을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 변형된 세포로서, 이때 세포는 T-세포인 변형된 세포를 제공한다.
본 개시 내용은 (a) 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; 및 (b) HLA 클래스 I 조직적합 항원, 알파 사슬 E(HLA-E) 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 세포를 제공한다.
본 개시 내용은 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; 및 (b) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 키메라 자극 수용체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
본 개시 내용은 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (b) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 키메라 자극 수용체; 및 (c) 비-자연 발생 키메라 항원 수용체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
본 개시 내용은 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (b) 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; 및 (c) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 키메라 자극 수용체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
본 개시 내용은 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (b) 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (c) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 키메라 자극 수용체(CSR); 및 (d) 비-자연 발생 키메라 항원 수용체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
본 개시 내용은 또한 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (b) 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (c) HLA 클래스 I 주 조직적합 항원, 알파 사슬 E(HLA-E)를 포함하는 비-자연 발생 서열; 및 (d) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
본 개시 내용은 또한 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (b) 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (c) HLA 클래스 I 주 조직적합 항원, 알파 사슬 E(HLA-E)를 포함하는 비-자연 발생 서열; (d) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 키메라 자극 수용체(CSR); 및 (e) 비-자연 발생 키메라 항원 수용체를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
본 개시 내용은 또한 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (b) HLA 클래스 I 조직적합 항원, 알파 사슬 A(HLA-A), HLA 클래스 I 조직적합 항원, 알파 사슬 B(HLA-B), HLA 클래스 I 조직적합 항원, 알파 사슬 C(HLA-C) 또는 이들의 조합의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는 변형; 및 (c) 하기를 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR): (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인(이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않음)으로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
본 개시 내용은 또한 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; (b) HLA 클래스 I 조직적합 항원, 알파 사슬 A(HLA-A), HLA 클래스 I 조직적합 항원, 알파 사슬 B(HLA-B), HLA 클래스 I 조직적합 항원, 알파 사슬 C(HLA-C) 또는 이들의 조합의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는 변형; (c) HLA 클래스 I 조직적합 항원, 알파 사슬 E(HLA-E)를 포함하는 비-자연 발생 서열; 및 (d) 하기를 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR): (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인(이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않음)으로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T 림프구(T-세포)를 제공한다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 14641의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 14641의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 유도성 세포자멸 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 14641의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이루어질 수 있으며, 이때 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거한다. 발현 또는 활성 수준의 감소는, 세포의 자연 발생 야생형 대응물과 비교할 때 세포에서 MHC-I의 발현 또는 세포에서 MHC-I의 기능 활성의 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%가 감소되는 경우이다. 발현 또는 활성 수준의 감소는, 자연 발생 야생형 T-세포와 비교할 때 T-세포에서 MHC-I의 발현 또는 T-세포에서 MHC-I의 기능 활성의 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%가 감소되는 경우이다. 발현 또는 활성 수준의 감소는, 세포의 자연 발생 야생형 대응물과 비교할 때 세포에서 MHC-I의 발현 또는 세포에서 MHC-I의 기능 활성의 100%가 감소되는 경우이다. 발현 또는 활성 수준의 감소는, 자연 발생 야생형 T-세포와 비교할 때 T-세포에서 MHC-I의 발현 또는 T-세포에서 MHC-I의 기능 활성의 100%가 감소되는 경우이다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E(HLA-E)를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. HLA-E 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17131의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17131의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17131의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. B2M 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17126의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. B2M 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17131의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. B2M 신호 펩티드는 SEQ ID NO: 17131의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. B2M 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17129의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. B2M 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17129의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. B2M 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17129의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 링커 분자(본원에서 링커로서 지칭됨)를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 폴리펩티드와 HLA-E 폴리펩티드 사이에 위치된 링커를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 링커는 SEQ ID NO: 17130의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 링커는 SEQ ID NO: 17130의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 링커는 SEQ ID NO: 17130의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 펩티드 및 B2M 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 펩티드는 SEQ ID NO: 17127의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 펩티드는 SEQ ID NO: 17127의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 펩티드는 SEQ ID NO: 17127의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드와 펩티드 사이에 위치된 제1 링커, 및 B2M 폴리펩티드와 HLA-E 폴리펩티드 사이에 위치된 제2 링커를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 제1 링커는 SEQ ID NO: 17128의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 제1 링커는 SEQ ID NO: 17128의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 제1 링커는 SEQ ID NO: 17128의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 제2 링커는 SEQ ID NO: 17130의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 제2 링커는 SEQ ID NO: 17130의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 제2 링커는 SEQ ID NO: 17130의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
일 양태에서, HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드, 펩티드, 제1 링커, B2M 폴리펩티드, 제2 링커 및 HLA-E 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. 펩티드는 B2M 신호 펩티드와 제1 링커 사이에 위치될 수 있고, B2M 폴리펩티드는 제1 링커와 제2 링커 사이에 위치될 수 있고, 제2 링커는 B2M 폴리펩티드와 HLA-E 폴리펩티드 사이에 위치될 수 있다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17064의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17064의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17064의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17065의 서열을 가진 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
일 양태에서, HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드, B2M 폴리펩티드, 링커 및 HLA-E 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. B2M 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드와 링커 사이에 위치될 수 있고, 링커는 B2M 폴리펩티드와 HLA-E 폴리펩티드 사이에 위치될 수 있다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17066의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17066의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17066의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17067의 서열을 가진 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
일 양태에서, HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드 및 HLA-E 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. B2M 신호 펩티드는 HLA-E 폴리펩티드 앞에(예를 들어, 핵산 서열의 맥락에서 5' 또는 아미노산 서열의 맥락에서 아미노 말단) 위치될 수 있다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17068의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17068의 아미노산 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17068의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 17069의 서열을 가진 핵산에 의해 코딩될 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 비-자연 발생 항원 수용체, 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 바람직한 양태에서, 비-자연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CAR은 (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다. CAR의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. CAR의 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이의 힌지를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. CAR의 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. CAR의 하나 이상의 공동자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 임의의 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 인간 CD28 및/또는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다.
본 개시 내용의 변형된 세포는 면역 세포 또는 면역 세포 전구체일 수 있다. 면역 세포는 림프구 전구 세포, 자연 살해(NK) 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, T 림프구(T-세포), B 림프구(B-세포) 또는 항원 제시 세포(APC)일 수 있다. 바람직한 양태에서, 면역 세포는 T 세포, 초기 기억 T-세포, 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM), 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 줄기 세포-유사 T 세포일 수 있다. 면역 세포 전구체는 조혈줄기세포(hematopoietic stem cell; HSC)일 수 있다. 변형된 세포는 줄기 세포, 분화된 세포, 체세포 또는 항원 제시 세포(APC)일 수 있다. 변형된 세포는 자가 세포 또는 동종이계 세포일 수 있다. 일 양태에서, 세포는 변형된 동종이계 T-세포이다. 또 다른 양태에서, 세포는 CAR T-세포인 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 변형된 동종이계 T-세포이다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 본 개시 내용의 CSR을 일시적으로 또는 안정적으로 발현할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시 내용의 CSR은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 일시적으로 발현된다. 일 양태에서, 본 개시 내용의 CSR은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 본 개시 내용의 HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드를 일시적으로 또는 안정적으로 발현할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시 내용의 HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 일시적으로 발현된다. 일 양태에서, 본 개시 내용의 HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 일시적으로 또는 안정적으로 발현할 수 있다. 일 양태에서, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 일시적으로 발현된다. 바람직한 양태에서, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 비-자연 발생 항원 수용체 또는 본 개시 내용의 치료적 단백질을 코딩하는 서열을 일시적으로 또는 안정적으로 발현할 수 있다. 일 양태에서, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 본 개시 내용의 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 일시적으로 발현된다. 바람직한 양태에서, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 본 개시 내용의 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
일 양태에서, 본 개시 내용의 CSR은 안정적으로 발현되고, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 안정적으로 발현되고, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
일 양태에서, 본 개시 내용의 CSR은 안정적으로 발현되고, 본 개시 내용의 HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 안정적으로 발현되고, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 안정적으로 발현되고, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
일 양태에서, 본 개시 내용의 CSR은 안정적으로 발현되고, 본 개시 내용의 HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 일시적으로 발현되고, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 안정적으로 발현되고, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
일 양태에서, 본 개시 내용의 CSR은 일시적으로 발현되고, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 안정적으로 발현되고, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
일 양태에서, 본 개시 내용의 CSR은 일시적으로 발현되고, 본 개시 내용의 HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 일시적으로 발현되고, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 안정적으로 발현되고, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
일 양태에서, 본 개시 내용의 CSR은 일시적으로 발현되고, 본 개시 내용의 HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 안정적으로 발현되고, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 안정적으로 발현되고, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)에서 안정적으로 발현된다.
본 개시 내용은 (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거하는, 변형; 및 (b) (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (ii) 막횡단 도메인; 및 (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된 엔도도메인을 포함하는 키메라 자극 수용체(CSR)를 코딩하는 서열로서, 이때, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 세포(바람직하게는 변형된 T 세포)를 제공한다.
변형된 세포는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 변형된 세포는 비-자연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열, 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 비-자연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
트랜스포존, 벡터, 공여자 서열 또는 공여자 플라스미드는 CSR을 코딩하는 서열, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 트랜스포존, 벡터, 공여자 서열 또는 공여자 플라스미드는 비-자연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열, 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 트랜스포존, 벡터, 공여자 서열 또는 공여자 플라스미드는 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 트랜스포존은 piggyBac® 트랜스포존, piggy-Bac® 유사 트랜스포존, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존, 헬라이저(Helraiser) 트랜스포존, Tol2 트랜스포존 또는 TcBuster 트랜스포존일 수 있다. CSR을 코딩하는 서열은 세포에서 일시적으로 발현될 수 있다. CSR을 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 비-자연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 세포에서 일시적으로 발현될 수 있고, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 일부 양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있고, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있다. 일부 양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 세포에서 일시적으로 발현될 수 있고, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있고, 비-자연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현된다. 일부 양태에서, CSR을 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있고, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현될 수 있고, 비-자연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 세포에서 안정적으로 발현된다. 일 양태에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 키메라 바이러스 벡터일 수 있다.
제1 트랜스포존, 제1 벡터, 제1 공여자 서열 또는 제1 공여자 플라스미드는 CSR을 코딩하는 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 제1 트랜스포존, 제1 벡터, 제1 공여자 서열 또는 제1 공여자 플라스미드는 제1 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
제2 트랜스포존, 제2 벡터, 제2 공여자 서열 또는 제2 공여자 플라스미드는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 비-자연 발생 항원 수용체를 코딩하는 서열 및 치료적 단백질을 코딩하는 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 제2 트랜스포존, 제2 벡터, 제2 공여자 서열 또는 제2 공여자 플라스미드는 제2 선택 마커를 코딩하는 서열을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 제1 선택 마커 및 제2 선택 마커는 동일하다. 제1 선택 마커 및 제2 선택 마커는 동일하지 않다. 선택 마커는 세포 표면 마커를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 선택 마커는 분열 세포에서 활성이고, 비-분열 세포에서는 활성이지 않은 단백질을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 선택 마커는 대사 마커를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
일 양태에서, 선택 마커는 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 뮤테인 효소를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. DHFR 뮤테인 효소는 SEQ ID NO: 17012의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
SEQ ID NO: 17012의 DHFR 뮤테인 효소는 위치 80, 113, 또는 153 중 하나 이상에서 돌연변이를 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. SEQ ID NO: 17012의 DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80에서 페닐알라닌(F) 또는 류신(L)의 치환; 위치 113에서 류신(L) 또는 발린(V)의 치환, 및 위치 153에서 발린(V) 또는 아스파르트산(D)의 치환 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)는 유전자 편집 조성물을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 유전자 편집 조성물은 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열 및 뉴클레아제 단백질 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 유전자 편집 조성물은 변형된 세포에 의해 일시적으로 발현될 수 있다. 유전자 편집 조성물은 변형된 세포에 의해 안정적으로 발현될 수 있다.
유전자 편집 조성물은 뉴클레아제 단백질을 코딩하는 서열 또는 이들의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 뉴클레아제 단백질을 코딩하는 서열 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열은 DNA 서열, RNA 서열, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인은 CRISPR/Cas 단백질, 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제(Transcription Activator-Like Effector Nuclease; TALEN), 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc Finger Nuclease; ZFN), 및 엔도뉴클레아제 중 하나 이상을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. CRISPR/Cas 단백질은 뉴클레아제-불활성화된 Cas(dCas) 단백질을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 뉴클레아제 또는 그의 뉴클레아제 도메인은 뉴클레아제-불활성화된 Cas(dCas) 단백질 및 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 엔도뉴클레아제는 Clo051 뉴클레아제 또는 그의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 유전자 편집 조성물은 융합 단백질을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 융합 단백질은 뉴클레아제-불활성화된 Cas9(dCas9) 단백질 및 Clo051 뉴클레아제 또는 Clo051 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 융합 단백질은 SEQ ID NO: 17013의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 융합 단백질은 SEQ ID NO: 17014의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 핵산에 의해 코딩된다. 융합 단백질은 SEQ ID NO: 17058의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 융합 단백질은 SEQ ID NO: 17059의 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 핵산에 의해 코딩된다.
유전자 편집 조성물은 가이드 서열을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 가이드 서열은 RNA 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 변형된 세포가 T-세포인 양태에서, 가이드 RNA는 내인성 TCR을 코딩하는 표적 서열과 상보적인 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 가이드 RNA는 B2M 폴리펩티드를 코딩하는 표적 서열과 상보적인 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 가이드 RNA는 게놈 DNA 서열의 세이프 하버 부위(safe harbor site) 내 표적 서열과 상보적인 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
트랜스포존, 벡터, 공여자 서열 또는 공여자 플라스미드는 불활성화된 Cas9(dCas9)을 코딩하는 서열 및 Clo051 뉴클레아제 또는 그의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열 및 가이드 서열을 포함하는 유전자 편집 조성물을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
제1 트랜스포존, 제1 벡터, 제1 공여자 서열 또는 제1 공여자 플라스미드는 불활성화된 Cas9(dCas9)을 코딩하는 서열 및 Clo051 뉴클레아제 또는 그의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열 및 가이드 서열을 포함하는 유전자 편집 조성물을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
제2 트랜스포존, 제2 벡터, 제2 공여자 서열 또는 제2 공여자 플라스미드는 불활성화된 Cas9(dCas9)을 코딩하는 서열 및 Clo051 뉴클레아제 또는 그의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열 및 가이드 서열을 포함하는 유전자 편집 조성물을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
제3 트랜스포존, 제3 벡터, 제3 공여자 서열 또는 제3공여자 플라스미드는 불활성화된 Cas9(dCas9)을 코딩하는 서열 및 Clo051 뉴클레아제 또는 그의 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 서열 및 가이드 서열을 포함하는 유전자 편집 조성물을 추가로 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
Clo051 뉴클레아제 또는 그의 뉴클레아제 도메인은 표적 서열에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 유도할 수 있다. 공여자 서열 또는 공여자 플라스미드는 단일 또는 이중 가닥 절단 위치에서 또는 표적 서열 내 세포 복구 위치에서 또는 이들의 조합에서 통합될 수 있다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 변형된 세포(바람직하게는, 본 개시 내용의 변형된 T-세포)를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 조성물을 제공한다.
본 개시 내용은 본원에서 개시된 임의의 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하는 복수의 변형된 세포를 제공하고, 본원에서 개시된 임의의 변형된 세포를 포함하는 복수의 변형된 세포를 제공한다. 복수의 변형된 세포는 면역 세포 또는 면역 세포 전구체를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 복수의 면역 세포는 림프구 전구 세포, 자연 살해(NK) 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, T 림프구(T-세포), B 림프구(B-세포) 또는 항원 제시 세포(APC)를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다.
본 개시 내용은 변형된 세포 집단을 포함하는 조성물(이때 집단의 복수의 변형된 세포는 본원에서 개시된 임의의 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함함)을 제공하고, 변형된 세포의 집단을 포함하는 조성물(이때 집단의 복수의 변형된 세포는 본원에서 개시된 임의의 변형된 세포를 포함함)을 제공한다. 변형된 세포의 집단은 면역 세포 또는 면역 세포 전구체를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 면역 세포의 집단은 림프구 전구 세포, 자연 살해(NK) 세포, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, T 림프구(T-세포), B 림프구(B-세포) 또는 항원 제시 세포(APC)를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 변형된 T 림프구(T-세포) 집단을 포함하는 조성물(이때 집단의 복수의 변형된 T-세포는 본원에서 개시된 임의의 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함함)을 제공하고, T 림프구(T-세포)의 집단을 포함하는 조성물(이때 집단의 복수의 T-세포는 본원에서 개시된 임의의 변형된 T-세포를 포함함)을 제공한다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 개시 내용은 T 림프구(T-세포)의 집단을 포함하는 조성물을 제공하는데, 이때 집단의 복수의 T-세포는 (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 이때 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인; 및 (c) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 이때 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리 또는 유래된, 엔도도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)로서, 상기 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않은 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함한다. 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 CSR을 포함한다.
집단의 복수의 T-세포는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 포함한다.
집단의 복수의 T-세포는 T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형을 추가로 포함할 수 있는데, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거한다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 TCR을 코딩하는 내인성 서열의 변형을 포함하며, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거한다.
집단의 복수의 T-세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형을 추가로 포함할 수 있으며, 이때 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거한다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 B2M을 코딩하는 내인성 서열의 변형을 포함하며, 이때 변형은 MHC-I의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거한다.
집단의 복수의 T-세포는 T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형(이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거함) 및 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형(이때 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거함)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 TCR을 코딩하는 내인성 서열의 변형(이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거함) 및 B2M을 코딩하는 내인성 서열의 변형(이때 변형은 MHC-I의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거함) 양자 모두를 포함한다.
집단의 복수의 T-세포는 HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E(HLA-E) 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 서열을 포함한다.
집단의 복수의 T-세포는 비-자연 발생 항원 수용체, 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 그 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 비-자연 발생 항원 수용체, 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직한 양태에서, 비-자연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
집단의 복수의 T-세포는 초기 기억 T-세포, 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM), 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 줄기 세포-유사 T 세포를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 세포 기억 T 세포(TSCM), 및 중심 기억 T 세포(TCM) 중 하나 이상은 변형된 T-세포의 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%를 포함한다.
일부 양태에서, CSR을 포함하는 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 줄기 기억 T 세포 (TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함한다.
일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 중심 기억 T 세포 (TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 이때 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함한다.
일부 양태에서, 집단의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%는 CD127, CD45RO, CD95 및 IL-2Rβ 세포-표면 마커(들) 중 하나 이상을 발현한다.
본 개시 내용은 본원에서 개시된 질병 또는 장애의 치료에 있어서 사용되기 위한 조성물, 또는 본원에서 개시된 임의의 질병 또는 장애의 치료를 위한 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 치료적 유효량의 본원에 개시된 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 조성물은 본원에 개시된 임의의 변형된 세포 또는 변형된 세포의 집단을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 임의의 변형된 T-세포 또는 CAR T-세포가 본원에 개시되어 있다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 키메라 자극화제 수용체(CSR) 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 1차 인간 T-세포에 도입하여 변형된 T-세포 내 CSR을 안정적으로 발현하고 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 변형된 T-세포를 제조하는 방법을 제공한다. 1차 인간 T-세포는 휴면 1차 인간 T-세포일 수 있다. 본 개시 내용은 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포를 제공한다. 본 개시 내용은 개시된 방법에 의해 제조되는, 안정적으로 발현된 CSR을 포함하는 변형된 T-세포를 투여하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 질병 또는 장애를 치료하기 위해 개시된 방법에 의해 제조되는, 안정적으로 발현된 CSR을 포함하는 변형된 T-세포를 투여하는 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 키메라 자극화제 수용체(CSR) 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 안정적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 1차 인간 T-세포는 휴면 1차 인간 T-세포를 포함할 수 있다. 본 개시 내용은 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포의 집단을 제공한다. 본 개시 내용은 개시된 방법에 의해 제조되는, 안정적으로 발현된 CSR을 포함하는 변형된 T-세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 질병 또는 장애를 치료하기 위해 개시된 방법에 의해 제조되는, 안정적으로 발현된 CSR을 포함하는 변형된 T-세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 키메라 자극화제 수용체(CSR) 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 1차 인간 T-세포에 도입하여 변형된 T-세포 내 CSR을 일시적으로 발현하고 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 변형된 T-세포를 제조하는 방법을 제공한다. 1차 인간 T-세포는 휴면 1차 인간 T-세포일 수 있다. 본 개시 내용은 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포를 제공한다. 본 개시 내용은 개시된 방법에 의해 제조되는, 일시적으로 발현된 CSR을 포함하는 변형된 T-세포를 투여하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시 내용은 변형된 T-세포가 더이상 CSR을 발현하지 않은 후에 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포를 투여하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 질병 또는 장애를 치료하기 위해 개시된 방법에 의해 제조되는, 일시적으로 발현된 CSR을 포함하는 변형된 T-세포를 투여하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시 내용은 질병 또는 장애를 치료하기 위해 변형된 T-세포가 더이상 CSR을 발현하지 않은 후에 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포를 투여하는 방법을 제공한다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 키메라 자극화제 수용체(CSR) 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 일시적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법을 제공한다. 1차 인간 T-세포는 휴면 1차 인간 T-세포를 포함할 수 있다. 본 개시 내용은 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포의 집단을 제공한다. 본 개시 내용은 개시된 방법에 의해 제조되는, 일시적으로 발현된 CSR을 포함하는 변형된 T-세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시 내용은 복수의 T-세포가 더이상 CSR을 발현하지 않은 후에 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 본 개시 내용은 질병 또는 장애를 치료하기 위해 개시된 방법에 의해 제조되는, 일시적으로 발현된 CSR을 포함하는 변형된 T-세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 개시 내용은 질병 또는 장애를 치료하기 위해 복수의 변형된 T-세포가 더이상 CSR을 발현하지 않은 후에 개시된 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포의 집단을 투여하는 방법을 제공한다.
변형된 T-세포를 제조하는 방법 또는 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법은 T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 이때 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거한다. 변형된 T-세포를 제조하는 방법 또는 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법은 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 이때 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-1)의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거한다. 일부 양태에서, 변형된 T-세포를 제조하는 방법 또는 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법은 TCR을 코딩하는 내인성 서열의 변형(이때, 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거함)을 도입하고 B2M을 코딩하는 내인성 서열의 변형(이때, 변형은 MHC-1의 발현 또는 활성 수준을 감소 또는 제거함)을 도입하는 단계를 모두 추가로 포함할 수 있다.
변형된 T-세포를 제조하는 방법 또는 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법은 1차 인간 T-세포 또는 복수의 1차 인간 T 세포에 항원 수용체, 치료적 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 항원 수용체는 비-자연 발생 항원 수용체이다. 바람직한 양태에서, 변형된 T-세포를 제조하는 방법 또는 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법은 1차 인간 T-세포 또는 복수의 1차 인간 T 세포에 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 1차 인간 T-세포 또는 복수의 1차 인간 T 세포에 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 변형된 T-세포를 제조하는 방법 또는 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법은 1차 인간 T-세포 또는 복수의 1차 인간 T 세포에 항원 수용체, 치료적 단백질 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물 및 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
변형된 T-세포를 제조하는 방법 또는 변형된 T-세포의 집단을 제조하는 방법은 변형된 T-세포 또는 변형된 T-세포의 집단을 활성화제 조성물과 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 활성화제 조성물은 변형된 T-세포 또는 복수의 변형된 T-세포의 CSR 활성화 성분을 결합할 수 있는 하나 이상의 아고니스트 또는 활성화제를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 아고니스트/활성화제는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 바람직한 양태에서, 아고니스트/활성화제는 항체 또는 항체 단편이다. 아고니스트/활성화제는 항-CD3 항체 또는 그 단편, 항-CD2 항체 또는 그 단편, 항-CD28 항체 또는 그 단편, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 일부 양태에서, 아고니스트/활성화제는 항-인간 CD3 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일특이적 테트라머 항체 복합체 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 아고니스트/활성화제는 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 변형된 T-세포 또는 변형된 T-세포의 집단을 접촉시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, 아고니스트/활성화제는 변형된 T-세포 또는 변형된 T-세포의 집단을 활성화시키고, 변형된 T-세포 또는 변형된 T-세포의 집단에서 세포 분열을 유도하고, 변형된 T-세포 또는 변형된 T-세포의 집단에서 세포 분열(예, 세포 배가 시간)을 증가시키고, 변형된 T-세포 또는 변형된 T-세포의 집단에서 배 확장(fold expansion)을 증가시킨다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 키메라 자극화제 수용체(CSR) 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 안정적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계 및 세포를 활성화제 조성물과 접촉시켜 복수의 활성화된 변형된 T-세포를 제조하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T-세포의 집단을 확장하는 방법으로서, 이때 복수의 변형된 T-세포의 확장이 동일한 조건 하에서 본 개시 내용의 CSR을 안정적으로 발현하지 않는 복수의 야생형 T-세포의 확장보다 적어도 2배 더 높은 확장 방법을 제공한다. 상기 방법에서 복수의 변형된 T-세포의 확장은 동일한 조건 하에서 본 개시 내용의 CSR을 안정적으로 발현하지 않는 복수의 야생형 T-세포의 확장보다 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배 또는 적어도 10배 더 높다.
본 개시 내용은 본 개시 내용의 키메라 자극화제 수용체(CSR) 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 일시적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계 및 세포를 활성화제 조성물과 접촉시켜 복수의 활성화된 변형된 T-세포를 제조하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 변형된 T-세포의 집단을 확장하는 방법으로서, 이때 복수의 변형된 T-세포의 확장이 동일한 조건 하에서 본 개시 내용의 CSR을 일시적으로 발현하지 않는 복수의 야생형 T-세포의 확장보다 적어도 2배 더 높은 확장 방법을 제공한다. 상기 방법에서 복수의 변형된 T-세포의 확장은 동일한 조건 하에서 본 개시 내용의 CSR을 일시적으로 발현하지 않는 복수의 야생형 T-세포의 확장보다 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배 또는 적어도 10배 더 높다.
집단 확장 방법의 활성화제 조성물은 변형된 T-세포 또는 복수의 변형된 T-세포의 CSR 활성화 성분을 결합할 수 있는 하나 이상의 아고니스트 또는 활성화제를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 아고니스트/활성화제는 자연 발생 또는 비-자연 발생일 수 있다. 바람직한 양태에서, 아고니스트/활성화제는 항체 또는 항체 단편이다. 아고니스트/활성화제는 항-CD3 항체 또는 그 단편, 항-CD2 항체 또는 그 단편, 항-CD28 항체 또는 그 단편, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 일부 양태에서, 아고니스트/활성화제는 항-인간 CD3 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일특이적 테트라머 항체 복합체 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다.
조건은 스테롤; 알칸; 인 및 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 및 올레산 중 하나 이상을 포함하는 배지에서 변형된 T-세포 또는 복수의 변형된 T-세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 배양 단계는 생체 내, 또는 생체 외일 수 있다. 변형된 T-세포는 동종이계 T-세포일 수 있거나, 복수의 변형된 T-세포는 동종이계 T-세포일 수 있다. 변형된 T-세포는 자가 T-세포일 수 있거나, 복수의 변형된 T-세포는 자가 T-세포일 수 있다.
일부 양태에서, 배지는 종점들을 포함해서 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg의 농도의 옥탄산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 팔미트산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 리놀레산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점들을 포함해서 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 배지는 약 9 mg/kg의 농도의 옥탄산; 약 2 mg/kg의 농도의 팔미트산; 약 2 mg/kg의 농도의 리놀레산; 약 2 mg/kg의 농도의 올레산; 및 약 1 mg/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 배지는 종점들을 포함해서 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 종점들을 포함해서 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 종점들을 포함해서 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 종점들을 포함해서 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 종점들을 포함해서 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 배지는 약 64 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 약 7 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 약 7.5 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 약 7.5 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 약 2.5 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 개시 내용은 본원에서 개시된 방법에 의해 제조된 임의의 변형된 T-세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 방법에 의해 제조된 임의의 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 방법에 의해 확장된 임의의 변형된 T-세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시 내용은 본원에서 개시된 방법에 의해 확장된 임의의 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시 내용은 본원에서 개시된 질병 또는 장애의 치료에 있어서 사용되기 위한 조성물, 또는 본원에서 개시된 임의의 질병 또는 장애의 치료를 위한 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시 내용은 또한 치료적 유효량의 본원에 개시된 조성물 및 본원에서 개시된 CSR의 활성화 성분에 결합하는 적어도 하나의 비-자연 발생 분자를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 조성물은 본원에 개시된 임의의 변형된 세포 또는 변형된 세포의 집단을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 임의의 변형된 T-세포 또는 CAR T-세포가 본원에 개시되어 있다. 본 개시 내용의 CSR의 활성화 성분에 결합할 수 있고 결합 시 선택적으로 신호를 전달하는 비-자연 발생 분자가 투여될 수 있다. 바람직하게는, 비-자연 발생 분자는 활성화 성분에 대한 비-자연 CSR 아고니스트/활성화제이다. CSR 활성화 성분에 결합할 수 있는 비-자연 발생 아고니스트/활성화제는 임의의 비-자연 발생 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 비-자연 발생 항체 또는 항체 단편은 비-자연 발생 항-CD3 항체 또는 그 단편, 항-CD2 항체 또는 그 단편, 항-CD28 항체 또는 그 단편, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 양태에서, CSR 활성화 성분과 결합할 수 있는 비-자연 발생 아고니스트/활성화제는 항-인간 CD3 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD2 단일특이적 테트라머 항체 복합체, 항-인간 CD28 단일특이적 테트라머 항체 복합체 또는 이들의 조합 중 하나 이상일 수 있다. 일부 양태에서, 활성화 성분을 결합할 수 있는 비-자연 발생 아고니스트/활성화제는 항-CD2 모노클로날 항체, BTI-322 (Przepiorka et al., Blood 92(11):4066-4071, 1998) 및 인간화 항-CD2 모노클로날 항체 클론 AFC-TAB-104 (시플리주마브)(Bissonnette et al. Arch. Dermatol. Res. 301(6):429-442, 2009)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 양태에서, CSR의 활성화 성분에 결합할 수 있는 비-자연 발생 분자의 투여는 생체 내 변형된 세포의 세포 분열을 자극한다. 따라서, 본 개시 내용은 본 개시 내용의 변형된 세포를 보유하는 대상체에 활성화 성분에 대한 비-자연 CSR 아고니스트/활성화제를 투여함으로써 생체 내에서 본 개시 내용의 변형된 세포의 세포 분열을 자극하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 질병 또는 장애는 세포 증식 질병 또는 장애이다. 일부 양태에서, 세포 증식 질병 또는 장애는 암이다. 암은 고형 종양 암 또는 혈액암일 수 있다. 일부 양태에서, 고형 종양은 전립선암 또는 유방암이다. 바람직한 양태에서, 전립선암은 거세-저항성 전립선암이다. 일부 양태에서, 혈액암은 다발골수종이다.
개시된 조성물 내 포함되어진 변형된 세포 또는 변형된 세포의 집단은 필요로 하는 대상체에 투여하기 전에 시험관 내 또는 생체 외에서 배양될 수 있다. 변형된 세포는 동종이계 변형된 세포 또는 자가 변형된 세포일 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 동종이계 변형된 T-세포 또는 자가 변형된 T-세포이다. 일부 양태에서, 세포는 동종이계 변형된 CAR T-세포 또는 자가 변형된 CAR T-세포이다. 일부 양태에서, 세포는 본 개시 내용의 CSR을 포함하는 동종이계 변형된 CAR T-세포 또는 본 개시 내용의 CSR을 포함하는 자가 변형된 CAR T-세포이다.
변형된 세포 조성물 또는 변형된 세포의 집단을 포함하는 조성물은 당업계에 공지되어 있는 임의의 수단에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 전신 투여에 의해 투여된다. 일부 양태에서, 조성물은 정맥내 투여에 의해 투여된다. 정맥내 투여는 정맥내 주사 또는 정맥내 주입일 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 국소 투여에 의해 투여된다. 일부 양태에서, 조성물은 척추내, 뇌실내, 안내 또는 골내 주사 또는 주입에 의해 투여된다.
치료적 유효량은 변형된 세포 조성물 또는 변형된 세포의 집단을 포함하는 조성물의 단일 용량 또는 다중 용량일 수 있다. 일부 양태에서, 치료적 유효량은 단일 용량이고, 이때 조성물의 동종이계 세포는 질병 또는 장애를 치료하기에 충분한 시간 동안 생착(engraft)되고/되거나 지속된다. 일부 양태에서, 단일 용량은 적어도 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 동시에 제조되는 그 사이의 용량들의 임의의 수 중 하나이다.
일부 양태에서, 질병 또는 장애의 치료를 위한 용도 및 방법은 대상체가 본원에서 개시된 변형된 세포 조성물 또는 본원에서 개시된 변형된 세포 집단을 포함하는 조성물의 투여 후에 이식편 대 숙주(GvH) 질병, 숙주 대 이식편(HvG), 또는 이들의 조합을 발생시키지 않는다는 점을 추가로 제공한다.
개시 내용의 동종이계 세포는 대상체 투여 후 생착에 대한 부작용을 방지하도록 조작된다. 동종이계 세포는 임의 유형의 세포일 수 있다.
개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 줄기 세포로부터 유래된다. 예시적인 줄기 세포는 비제한적으로 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 다분화능성 줄기 세포(multipotent stem cell), 다능성 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포(HSC)를 포함한다.
개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 분화된 체세포이다.
개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 T 림프구(T 세포)이다. 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 비-자연 T-세포 수용체(TCR)의 하나 이상의 성분을 발현하지 않는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 비-자연 발생 항원 수용체를 발현하는 T 세포이다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 일부 구현예에서, 동종이계 세포는 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)을 발현하는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 CSR은 스위치 수용체를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 스위치 수용체는 세포외 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 스위치 수용체의 세포외 도메인은 TCR 공동-자극 분자와 결합하고, 신호를 TCR 시그널링 또는 TCR 공동-자극 시그널링을 반복하는 동종이계 세포의 세포내 공간으로 전달한다.
키메라 자극 수용체(CSR)
임의의 환자에게 투여하기에 "보편적으로" 안전한 입양 세포 조성물은 동종반응성의 상당한 감소 또는 제거를 요구한다.
이를 위해, 개시 내용의 동종이계 세포는 T-세포 수용체(TCR) 및/또는 주 조직적합성 복합체(MHC)의 클래스의 발현 또는 기능을 방해하도록 변형된다. TCR은 이식편 대 숙주(GvH) 반응을 매개하는 반면, MHC는 숙주 대 이식편(HvG) 반응을 매개한다. 바람직한 구현예에서, TCR의 임의의 발현 및/또는 기능은 본 개시 내용의 동종이계 세포에서 제거되어 대상체에 사망을 유발시킬 할 수 있는 T-세포 매개 GvH를 방지한다. 따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 본 개시 내용은 순수한 TCR-음성 동종이계 T-세포 조성물(예를 들어, 조성물의 각 세포는 검출불가능하거나 존재하지 않을 정도로 낮은 수준으로 발현됨)을 제공한다.
바람직한 구현예에서, MHC 클래스 I(MHC-I, 구체적으로 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C)의 발현 및/또는 기능은 본 개시 내용의 동종이계 세포에서 감소 또는 제거되어 HvG를 방지하고, 결과적으로, 대상체에서 본 개시 내용의 동종이계 세포의 생착을 개선한다. 본 개시 내용의 동종이계 세포의 개선된 생착은 세포의 더 긴 지속성을 도모하고, 따라서 대상체에 대한 더 큰 치료 창을 도모한다. 구체적으로, 본 개시 내용의 동종이계 세포에서, MHC-I의 구조적 요소인 베타-2-마이크로글로불린(B2M)의 발현 및/또는 기능은 본 개시 내용의 동종이계 세포에서 감소 또는 제거된다.
본 개시 내용의 동종이계 세포를 생성하기 위한 상기 전략은 추가 도전을 유도한다. T 세포에서, T 세포 수용체(TCR) 녹아웃(KO)은 TCR 복합체의 부분인 CD3-제타 (CD3z 또는 CD3ζ)의 발현 손실을 초래한다. TCR-KO T-세포에서 CD3ζ의 손실은 아고니스트 항-CD3 mAb를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 표준 자극/활성화 물질을 사용하여 이들 세포를 최적으로 활성화하고 확장하는 능력을 극적으로 감소시킨다. TCR 복합체의 임의의 한 성분의 발현 또는 기능이 중단되면, TCR-알파(TCRα), TCR-베타 (TCRβ), CD3-감마 (CD3γ), CD3-엡실론 (CD3ε), CD3-델타 (CD3δ), 및 CD3-제타 (CD3ζ)를 포함해 복합체의 모든 성분들이 손실된다. CD3ε 와 CD3ζ는 모두 T 세포 활성화 및 확장에 요구된다. 아고니스트 항-CD3 mAb는 통상적으로 CD3ε 및 가능하게는 또 다른 단백질을 복합체 내에서 인식하고, 이는 차례로 CD3ζ로 신호를 보낸다. CD3ζ는 최적의 활성화 및 확장을 위해 T 세포 활성화를 위한 1차 자극을 (2차 공동 자극 신호와 함께) 제공한다. 정상적인 조건 하에서, 완전한 T-세포 활성화는 면역 반응을 부스팅하는 하나 이상의 공동-자극 수용체(예, CD28, CD2, 4-1BBL, 등…)에 의해 매개된 제2 신호와 함께 TCR의 결속에 따라 달라진다. 그러나, TCR이 존재하지 않는 경우, T 세포 확장은 아고니스트 항-CD3 mAb를 포함한 표준 활성화/자극 물질을 이용해 자극하면 심각하게 감소된다. 실제로, T 세포 확장은 아고니스트 항-CD3 mAb를 포함한 표준 활성화/자극 물질을 이용해 자극하면 정상적인 확장 수준의 단지 20-40%로 감소된다.
본 개시 내용은 아고니스트 항-CD3 mAb를 포함한 표준 활성화/자극 물질을 이용하여 자극 시 내인성 TCR (및 결과적으로 내인성 CD3ζ)의 부재 하에서 동종이계 T 세포로 CD3z 1차 자극을 전달하는 키메라 자극 수용체(CSR)를 제공한다.
내인성 TCR의 부재 하에서, 본 개시 내용의 키메라 자극 수용체(CSR)는 동종이계 T 세포의 활성화 및 확장을 향상시키기 위해 CD3ζ 자극을 제공한다. 달리 말하면, 내인성 TCR의 부재 하에서, 본 개시 내용의 키메라 자극 수용체(CSR)는 내인성 TCR을 발현하는 비-동종이계 T-세포와 비교할 때 활성화-기반 단점으로부터 동종이계 세포를 구제한다. 일부 실시예에서, 본 개시 내용의 CSR은 세포외적으로 아고니스트 mAb 에피토프 및 세포내적으로 CD3ζ 자극 도메인을 포함하고, 작동적으로, 표면 상 항-CD28 또는 항-CD2 결합 이벤트를 CSR을 발현하도록 변형된 동종이계 T 세포에서 CD3z 시그널링 이벤트로 전환시킨다. 일부 구현예에서, CSR은 각각 CD28z CSR 및 CD2z CSR을 생성하도록 야생형 CD28 또는 CD2 단백질 및 CD3z 세포내 자극 도메인을 포함한다. 바람직한 구현예에서, CD28z CSR 및/또는 CD2z CSR은 비-자연 발생 항원 수용체 및/또는 치료적 단백질을 추가로 발현한다. 바람직한 구현예에서, 비-자연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본원에서 제공된 데이터는 본 개시 내용의 CSR을 포함/발현하는 본 개시 내용의 변형된 동종이계 T 세포가 본 개시 내용의 CSR을 포함/발현하지 않는 세포와 비교할 때 내인성 TCR을 더이상 발현하지 않는 동종이계 T 세포의 확장을 개선 또는 구제한다는 점을 입증한다.
야생형/자연 인간 CD28 단백질(NCBI: CD28_HUMAN; UniProt/Swiss-Prot: P10747.1)은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00001
야생형/자연 CD28 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(NCBI: CCDS2361.1)은 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
Figure pct00002
본 개시 내용의 예시적인 CSR CD28z 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(CD28 신호 펩티드, CD28 세포외 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD28 세포질 도메인 , CD3z 세포내 도메인):
Figure pct00003
CD28 신호 펩티드:
Figure pct00004
CD28 세포외 도메인:
Figure pct00005
CD28 막횡단 도메인:
Figure pct00006
CD28 세포질 도메인 :
Figure pct00007
CD3z 세포내 도메인:
Figure pct00008
본 개시 내용의 CSR CD28z 단백질을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(CD28 신호 펩티드, CD28 세포외 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD28 세포질 도메인 , CD3z 세포내 도메인):
Figure pct00009
CD28 신호 펩티드:
Figure pct00010
CD28 세포외 도메인:
Figure pct00011
CD28 막횡단 도메인:
Figure pct00012
CD28 세포질 도메인 :
Figure pct00013
CD3z 세포내 도메인:
Figure pct00014
야생형/자연 인간 CD2 단백질(NCBI: CD2_HUMAN; UniProt/Swiss-Prot: P06729.2)은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00015
야생형/자연 CD2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(NCBI: CCDS889.1)은 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어진다:
Figure pct00016
본 개시 내용의 예시적인 CSR CD2z 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(CD2 신호 펩티드, CD2 세포외 도메인, CD2 막횡단 도메인, CD2 세포질 도메인 , CD3z 세포내 도메인):
Figure pct00017
CD2 신호 펩티드:
Figure pct00018
CD2 세포외 도메인:
Figure pct00019
CD2 막횡단 도메인: IYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYIT (SEQ ID NO: 17112)
CD2 세포질 도메인 :
Figure pct00020
CD3z 세포내 도메인:
Figure pct00021
본 개시 내용은 SEQ ID NO:17062와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 비-자연 발생 CSR CD2 단백질을 제공한다. 본 개시 내용은 SEQ ID NO:17110와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD2 신호 펩티드를 제공한다. 본 개시 내용은 SEQ ID NO:17111와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD2 세포외 도메인을 제공한다. 본 개시 내용은 SEQ ID NO:17112와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD2 막횡단 도메인을 제공한다. 본 개시 내용은 SEQ ID NO:17113와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD2 세포질 도메인을 제공한다. 본 개시 내용은 SEQ ID NO:17102와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD3z 세포내 도메인을 제공한다.
본 개시 내용의 CSR CD2z 단백질을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(CD2 신호 펩티드, CD2 세포외 도메인, CD2 막횡단 도메인, CD2 세포질 도메인 , CD3z 세포내 도메인):
Figure pct00022
CD2 신호 펩티드:
Figure pct00023
CD2 세포외 도메인:
Figure pct00024
CD2 막횡단 도메인:
Figure pct00025
CD2 세포질 도메인 :
Figure pct00026
CD3z 세포내 도메인:
Figure pct00027
본 개시 내용의 예시적인 돌연변이 CSR CD2z-D111H 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(CD2 신호 펩티드, CD2 세포외 도메인 내 D111H 돌연변이 를 가진 CD2 세포외 도메인, CD2 막횡단 도메인, CD2 세포질 도메인 , CD3z 세포내 도메인):
Figure pct00028
CD2 신호 펩티드:
Figure pct00029
CD2 세포외 도메인 내 D111H 돌연변이 를 가진 CD2 세포외 도메인:
Figure pct00030
CD2 막횡단 도메인:
Figure pct00031
CD2 세포질 도메인 :
Figure pct00032
CD3z 세포내 도메인:
Figure pct00033
본 개시 내용은 SEQ ID NO:17118와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 비-자연 발생 CSR CD2 단백질을 제공한다. 본 개시 내용은 SEQ ID NO:17119와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 CD2 세포외 도메인을 제공한다.
본 개시 내용의 돌연변이 CSR CD2z-D111H 단백질을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(CD2 신호 펩티드, CD2 세포외 도메인 내 D111H 돌연변이 를 가진 CD2 세포외 도메인, CD2 막횡단 도메인, CD2 세포질 도메인 , CD3z 세포내 도메인):
Figure pct00034
CD2 신호 펩티드:
Figure pct00035
CD2 세포외 도메인 내 D111H 돌연변이 를 가진 CD2 세포외 도메인:
Figure pct00036
CD2 막횡단 도메인:
Figure pct00037
CD2 세포질 도메인 :
Figure pct00038
CD3z 세포내 도메인:
Figure pct00039
내인성 TCR 녹아웃
dCas9-Clo051을 포함하는 RNA-가이드된 융합 단백질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 본 개시 내용의 유전자 편집 조성물은 본 개시 내용의 동종이계 세포의 내인성 T-세포 수용체의 발현을 표적화하고 감소시키거나 제거하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시 내용의 유전자 편집 조성물은 본 개시 내용의 동종이계 세포의 내인성 T-세포 수용체를 코딩하는 유전자, 유전자의 일부, 또는 유전자의 조절 요소(예컨대, 프로모터)를 표적화하고 결실시킨다.
TCR-알파(TCR-α)를 표적화 및 결실시키기 위한 가이드 RNA(gRNA) 주형을 생성하기 위한 프라이머(T7 프로모터, 게놈 표적 서열, 및 gRNA 스캐폴드 포함)의 비제한적인 예가 표 10에 제공된다.
Figure pct00040
TCR-베타(TCR-β)를 표적화하고 결실시키기 위한 가이드 RNA(gRNA) 주형 생성을 위한 프라이머의 비제한적인 예는 표 11에 제공된다.
Figure pct00041
베타-2-마이크로글로불린(β2M)을 표적화하고 결실시키기 위한 가이드 RNA(gRNA) 주형 생성을 위한 프라이머의 비제한적인 예는 표 12에 제공된다.
Figure pct00042
내인성 MHC 녹아웃
dCas9-Clo051을 포함하는 RNA-가이드된 융합 단백질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아닌 본 개시 내용의 유전자 편집 조성물은 본 개시 내용의 동종이계 세포의 내인성 MHCI, MHCII, 또는 MHC 활성화제의 발현을 표적화하고 감소시키거나 제거하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시 내용의 유전자 편집 조성물은 본 개시 내용의 동종이계 세포의 내인성 MHCI, MHCII, 또는 MHC 활성화제 중 하나 이상의 성분들을 코딩하는 유전자, 유전자의 일부, 또는 유전자의 조절 요소(예컨대, 프로모터)를 표적화하고 결실시킨다.
MHC 활성화제를 표적화하고 결실시키기 위한 가이드 RNA(gRNA)의 비제한적인 예는 표 13 및 14에 제공된다.
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
조작된 HLA-E 조성물
MHCI 녹아웃(KO)은 세포가 T 세포에 의한 사멸에 저항하도록 만들지만 또한 자연 살해(NK) 세포-매개 세포독성에 민감하게 만든다("자기 상실 가설")(도 30 참조). NK 거부가 동종이계 (allo) CAR-T 치료와 같은 치료적 환경에서 이들 KO 세포의 생체 내 효능 및/또는 지속성을 감소시킬 것이라는 가설이 세워진다. Allo CAR-T 세포의 표면 상에 MHCI의 머무름은 이들이 고전적인 혼합 림프구 반응(MLR) 실험에서 관찰된 바와 같이 숙주 T 세포에 의한 사멸에 취약해지게 만들 수 있다. 사람의 T 세포 중 최대 10%는 외래 MHC에 특이적이며, 이는 외래 세포 및 조직의 거부를 매개할 것이라고 추정된다. B2M의 표적화된 KO에 의해 달성될 수 있는 MHCI, 특히 HLA-A, B 및 C의 표적화된 KO는 HLA-E를 포함한 추가적인 HLA 분자의 손실을 초래한다. 예를 들어, HLA-E의 손실은 "자기 상실 가설"로 인해 NK 세포-매개된 세포독성에 KO 세포를 더 취약하게 만든다. 자기 상실 세포에 대항하는 NK-매개 세포독성은 감염된 세포 표면 상 MHC를 하향조절하여 적응 면역계의 세포에 의한 검출 및 사멸을 회피하는 병원체에 대항하는 방어 메카니즘이다.
NK 세포-매개 세포독성에 보다 저항적인 allo (MHCI-neg) T-세포(CAR-T 세포 포함)를 조작하기 위한 2가지 전략이 본 개시 내용에 의해 고려된다. 일부 구현예에서, NK 사멸을 감소시키거나 방지하는 분자(예컨대, 단일-사슬 HLA-E)를 코딩하는 서열은 동종이계 세포로 도입되거나 전달된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 개시 내용의 유전자 편집 방법은 특정한 내인성 HLA 분자(예컨대, 내인성 HLA-E)를 보유한다. 예를 들어, 첫번째 접근법은 B2M KO T 세포로의 단일-사슬 (sc)HLA-E 분자의 piggyBac® (PB) 전달을 포함한다.
두번째 접근법은 예를 들어 HLA-E 또는 MHCI KO 세포에 대해 자연-살해 세포 매개 세포독성에 대항해 보호하는 기타 분자가 아닌 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C에 대해 선택적인 가이드 RNA를 갖는 유전자 편집 조성물을 이용한다.
NK 세포-매개 세포독성에 대항해 보호하는 HLA-E에 대한 대안적이거나 추가적인 분자는 비제한적으로 CD47, 인터페론 알파/베타 수용체 1 (IFNAR1), 인간 IFNAR1, 인터페론 알파/베타 수용체 2 (IFNAR2), 인간 IFNAR2, HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6, HLA-G7, 인간 암 배아 항원-관련 세포 부착 분자 1 (CEACAM1), 바이러스 혈구 응집소, CD48, LLT1 (또한 C-형 렉틴 도메인 패밀리 2 멤버(CLC2D)로서 언급됨), ULBP2, ULBP3, 및 sMICA 또는 이의 변형을 포함한다.
본 개시 내용의 예시적인 CD47 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(신호 펩티드, 세포외, TM , 세포질):
Figure pct00046
본 개시 내용의 예시적인 INFAR1 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(신호 펩티드, 세포외, TM , 세포질):
Figure pct00047
본 개시 내용의 예시적인 INFAR2 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(신호 펩티드, 세포외, TM , 세포질):
Figure pct00048
본 개시 내용의 예시적인 HLA-G1 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(알파 사슬 1, 알파 사슬 2, 알파 사슬 3):
Figure pct00049
본 개시 내용의 예시적인 HLA-G2 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(알파 사슬 1, 알파 사슬 2, 알파 사슬 3):
Figure pct00050
본 개시 내용의 예시적인 HLA-G3 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(알파 사슬 1, 알파 사슬 2, 알파 사슬 3):
Figure pct00051
본 개시 내용의 예시적인 HLA-G4 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(알파 사슬 1, 알파 사슬 2, 알파 사슬 3):
Figure pct00052
본 개시 내용의 예시적인 HLA-G5 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(알파 사슬 1, 알파 사슬 2, 알파 사슬 3, 인트론 4 ):
Figure pct00053
본 개시 내용의 예시적인 HLA-G5 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(알파 사슬 1, 알파 사슬 2, 알파 사슬 3, 인트론 4 ):
Figure pct00054
본 개시 내용의 예시적인 HLA-G5 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(알파 사슬 1, 알파 사슬 2, 알파 사슬 3, 인트론 2 ):
Figure pct00055
본 개시 내용의 예시적인 CEACAM1 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(세포외, TM, 세포질):
Figure pct00056
본 개시 내용의 예시적인 바이러스 혈구 응집소 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(인플루엔자 A 바이러스의 HA(A/뉴칼레도니아/20/1999(H1N1); TM):
Figure pct00057
본 개시 내용의 예시적인 CD48 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(신호 펩티드, 사슬, 성숙 형태에서 제거된 프로 펩티드):
Figure pct00058
본 개시 내용의 예시적인 LLT1 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(세포질, TM, 세포외):
Figure pct00059
본 개시 내용의 예시적인 ULBP2 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(또한 NKG2D 리간드로서 공지됨; Genbank 등록 번호(ACCESSION No.) AAQ89028):
Figure pct00060
본 개시 내용의 예시적인 ULBP3 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(또한 NKG2D 리간드로서 공지됨; Genbank 등록 번호 NP_078794):
Figure pct00061
본 개시 내용의 예시적인 sMICA 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(신호 펩티드, 세포외 도메인의 일부, TM 및 세포질 도메인 ) (Genbank 등록번호 Q29983):
Figure pct00062
본 개시 내용의 예시적인 sMICA 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(알파-1, 알파-2, 알파-3):
Figure pct00063
본 개시 내용의 예시적인 sMICA 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다( 신호 펩티드 ; 알파-1, 알파-2, 알파-3):
Figure pct00064
본 개시 내용의 예시적인 sMICA 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다( 신호 펩티드 ):
Figure pct00065
본 개시 내용의 예시적인 bGBE 트라이머 ( 270G 및 484S ) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00066
본 개시 내용의 예시적인 bGBE 트라이머 ( 270G 및 484S ) 단백질은 하기의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00067
본 개시 내용의 예시적인 bGBE 트라이머 ( 270R 및 484S ) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00068
본 개시 내용의 예시적인 bGBE 트라이머 ( 270R 및 484S ) 단백질은 하기의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00069
본 개시 내용의 예시적인 gBE 다이머 ( R 및 S ) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00070
본 개시 내용의 예시적인 gBE 다이머 ( R 및 S ) 단백질은 하기의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00071
본 개시 내용의 예시적인 gBE 다이머 ( G 및 S ) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00072
본 개시 내용의 예시적인 gBE 다이머 ( G 및 S ) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00073
야생형/자연 인간 HLA-E 단백질(NCBI: HLAE_HUMAN; UniProt/Swiss-Prot: P13747.4)은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00074
야생형/자연 HLA-E 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(NCBI: CCDS34379.1)은 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어진다:
Figure pct00075
본 개시 내용의 예시적인 WT HLA-E 모노머 ( R 및 S ) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00076
본 개시 내용의 예시적인 WT HLA-E 모노머 ( R 및 S ) 단백질은 하기의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00077
본 개시 내용의 예시적인 WT HLA-E 모노머 ( G 및 S ) 단백질은 하기의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00078
본 개시 내용의 예시적인 WT HLA-E 모노머 ( G 및 S ) 단백질은 하기의 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00079
야생형/자연 인간 B2M 단백질(NCBI: B2MG_HUMAN; UniProt/Swiss-Prot: P61769.1)은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다:
Figure pct00080
야생형/자연 B2M 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열(NCBI: CCDS10113.1)은 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이루어진다:
Figure pct00081
본 개시 내용의 예시적인 HLA-bGBE(단일 사슬 트라이머) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(B2M 신호 펩티드, 펩티드, 링커, B2M 도메인 , 링커, HLA-E 펩티드 ):
Figure pct00082
B2M 신호 펩티드:
Figure pct00083
펩티드:
Figure pct00084
링커:
Figure pct00085
B2M 도메인 :
Figure pct00086
링커:
Figure pct00087
HLA-E 펩티드:
Figure pct00088
본 개시 내용의 HLA-bGBE(단일 사슬 트라이머) 단백질을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(B2M 신호 펩티드, 펩티드, 링커, B2M 도메인 , 링커, HLA-E 펩티드 ):
Figure pct00089
B2M 신호 펩티드:
Figure pct00090
펩티드: GTGATGGCCCCCCGGACCCTGATCCTG (SEQ ID NO: 17133)
링커: GGAGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCTCCGGAGGCGGCGGCTCT (SEQ ID NO: 17134)
B2M 도메인 :
Figure pct00091
링커:
Figure pct00092
HLA-E 펩티드 :
Figure pct00093
본 개시 내용의 예시적인 HLA-gBE(단일 사슬 다이머) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(B2M 신호 펩티드, B2M 도메인, 링커, HLA-E 펩티드):
Figure pct00094
B2M 신호 펩티드:
Figure pct00095
B2M 도메인:
Figure pct00096
링커:
Figure pct00097
HLA-E 펩티드:
Figure pct00098
본 개시 내용의 HLA-gBE(단일 사슬 다이머) 단백질을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(B2M 신호 펩티드, B2M 도메인, 링커, HLA-E 펩티드):
Figure pct00099
B2M 신호 펩티드:
Figure pct00100
B2M 도메인:
Figure pct00101
링커:
Figure pct00102
HLA-E 펩티드:
Figure pct00103
본 개시 내용의 예시적인 HLA-bE(모노머) 단백질은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(B2M 신호 펩티드, HLA-E 펩티드):
Figure pct00104
B2M 신호 펩티드:
Figure pct00105
HLA-E 펩티드:
Figure pct00106
본 개시 내용의 HLA-bE(모노머) 단백질을 코딩하는 예시적인 뉴클레오티드 서열은 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다(B2M 신호 펩티드, HLA-E 펩티드):
Figure pct00107
B2M 신호 펩티드:
Figure pct00108
HLA-E 펩티드:
Figure pct00109
면역 및 면역 전구체 세포
특정 구현예에서, 본 개시 내용의 면역 세포는 림프구 전구 세포, 자연 살해(NK) 세포, T 림프구 (T-세포), 줄기 기억 T 세포(TSCM 세포), 중심 기억 T 세포(TCM), 줄기 세포-유사 T 세포, B 림프구(B-세포), 골수 전구 세포, 중성구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 대식세포, 혈소판, 적혈구, 적색 혈액 세포 (RBC), 거대핵세포 또는 파골세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 면역 전구체 세포는 하나 이상의 유형의 면역 세포로 분화될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 전구체 세포는 자가 재생하여 면역 세포로 발전할 수 있는 다분화능성 줄기 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 전구체 세포는 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 이의 후손을 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 전구체 세포는 면역 세포로 발달할 수 있는 전구체 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역 전구체 세포는 조혈 전구 세포(HPC)를 포함한다.
조혈 줄기 세포(HSC)
조혈 줄기 세포(HSC)는 다분화능성, 자가-재생 세포이다. 림프계 및 골수계 계통에서 분화된 모든 혈액 세포는 HSC로부터 발생한다. HSC는 성인의 골수, 말초 혈액, 동원 말초 혈액, 복막 투석 유출물 및 제대혈에서 발견될 수 있다.
본 개시 내용의 HSC는 1차 또는 배양된 줄기 세포로부터 단리 또는 유래될 수 있다. 본 개시 내용의 HSC는 배아 줄기 세포, 다분화능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 성인 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 단리 또는 유래될 수 있다.
본 개시 내용의 면역 전구체 세포는 HSC 또는 HSC 후손 세포를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 예시적인 HSC 후손 세포는 비제한적으로 다분화능성 줄기 세포, 림프구 전구 세포, 자연 살해(NK) 세포, T 림프구 (T-세포), B 림프구 세포 (B-세포), 골수 전구 세포, 중성구, 호염기구, 호산구, 단핵구, 및 대식세포를 포함한다.
본 개시 내용의 방법에 의해 제조된 HSC는 성인 줄기 세포로부터 단리 또는 유래되는 동안 그리고 단일 계통에 수용되는 동안 배아 줄기 세포의 특징을 공유하는 "원시적인" 줄기 세포의 특징을 보유할 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용의 방법에 의해 제조된 "원시적인" HSC는 분열 이후에 이들의 "줄기"를 보유하고 분화하지 않는다. 결과적으로, 입양 세포 치료요법으로서, 본 개시 내용의 방법에 의해 제조된 "원시적인" HSC는 그 수를 보충할뿐 아니라 생체 내에서 확장한다. 본 개시 내용의 방법에 의해 제조된 "원시적인" HSC는 단일 용량으로서 투여시 치료적으로 유효할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 원시적인 HSC는 CD34+이다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 원시적인 HSC는 CD34+ 및 CD38-이다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 원시적인 HSC는 CD34+, CD38- 및 CD90+이다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 원시적인 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+ 및 CD45RA-이다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 원시적인 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, 및 CD49f+이다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 가장 원시적인 HSC는 CD34+, CD38-, CD90+, CD45RA-, 및 CD49f+이다.
본 개시 내용의 일부 구현예에서, 원시적인 HSC, HSC 및/또는 HSC 후손 세포는 본 개시 내용의 방법에 따라 변형되어 외인성 서열(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 치료적 단백질)을 발현할 수 있다. 본 개시 내용의 일부 구현예에서, 변형된 원시적인 HSC, 변형된 HSC 및/또는 변형된 HSC 후손 세포는 전방 분화되어 이에 제한되는 것은 아니나 본 개시 내용의 변형된 T 세포, 변형된 자연 살해 세포 및/또는 변형된 B-세포를 포함하는 변형된 면역 세포를 생성할 수 있다.
T 세포
본 개시 내용의 변형된 T 세포는 변형된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다.
전통적인 생물학제 및 화학요법과 달리, 본 개시 내용의 변형된 T-세포는 항원 인식시 신속하게 번식할 수 있는 능력을 보유하여, 잠재적으로 반복 치료의 요구를 제거한다. 이를 달성하기 위해, 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 T 세포는 초기 반응을 유도할뿐만 아니라 잠재적인 재발을 방지하기 위해 생존 가능한 기억 T 세포의 안정된 집단으로서 환자에게서 지속된다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 이것이 바람직하지 않은 경우, 본 개시 내용의 변형된 T-세포는 환자에게서 지속되지 않는다.
초기 기억 T 세포, 특히 줄기 세포 기억(TSCM) 또는 줄기 세포 유사 T 세포를 함유하는 변형된 T 세포 생성물뿐 아니라 항원-독립적(긴장성) 시그널링을 통해 T 세포 고갈을 유발하지 않는 항원 수용체 분자의 개발에 집약적인 노력이 집중되어 왔다. 본 개시 내용의 줄기 세포-유사 변형된 T 세포는 자가-재생에 대한 가장 큰 능력 및 중심 기억(TCM) T 세포 또는 TCM 유사 세포, 이펙터 기억(TEM) 및 이펙터 T 세포(TE)를 유도하는 다분화능성 능력을 나타내며, 이로써 더 나은 종양 박멸 및 장기간의 변형된 T 세포 생착을 야기한다. 분화의 선형 경로는 이러한 세포를 생성하는 것을 담당할 수 있다: 순수(Naive) T 세포(TN) > TSCM > TCM > TEM > TE > TTE (여기서, TN는 TSCM을 직접 발생시키는 부모 전구체 세포로, 이는 차례로 TCM등을 직접 발생시킨다). 본 개시 내용의 T 세포의 조성물은 TSCM 세포가 가장 풍부한 각각의 모 T 세포 서브세트 중 하나 이상(예를 들어, TSCM > TCM > TEM > TE > TTE)을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포 전구체는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T-세포, 순수 T 세포(TN), TSCM, TCM, TEM, TE, 또는 TTE으로 분화되거나 분화될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포 전구체는 본 개시 내용의 원시적인 HSC, HSC 또는 HSC 후손 세포이다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포 전구체는 초기 기억 T 세포, 줄기 세포 유사 T-세포, 순수 T 세포(TN), TSCM, TCM, TEM, TE, 또는 TTE이다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포는 초기 기억 T 세포이다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포는 줄기 세포 유사 T-세포이다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포는 TSCM이다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 면역 세포는 TCM이다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 복수의 T 세포를 변형시키고/시키거나 변형된 복수의 T 세포를 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포는 초기 기억 T 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 특정 구현예에서, 복수의 변형된 초기 기억 T 세포는 하나 이상의 변형된 줄기 세포-유사 T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 변형된 초기 기억 T 세포는 하나 이상의 변형된 TSCM를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 변형된 초기 기억 T 세포는 하나 이상의 변형된 TCM를 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 복수의 T 세포를 변형시키고/시키거나 변형된 복수의 T 세포를 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포는 줄기 세포-유사 T 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 특정 구현예에서, 복수의 변형된 줄기 세포-유사 T 세포는 하나 이상의 변형된 TSCM를 포함한다. 특정 구현예에서, 복수의 변형된 줄기 세포-유사 T 세포는 하나 이상의 변형된 TCM를 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 복수의 T 세포를 변형시키고/시키거나 변형된 복수의 T 세포를 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포는 줄기 기억 T 세포(TSCM)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 특정 구현예에서, 세포-표면 마커는 CD62L 및 CD45RA을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포-표면 마커는 CD62L, CD45RA, CD28, CCR7, CD127, CD45RO, CD95, CD95 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포-표면 마커는 CD45RA, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 복수의 T 세포를 변형시키고/시키거나 변형된 복수의 T 세포를 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포는 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 특정 구현예에서, 세포-표면 마커는 CD45RO, CD95, IL-2Rβ, CCR7, 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 복수의 T 세포를 변형시키고/시키거나 복수의 변형된 T 세포를 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포는 순수 T 세포(TN)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 특정 구현예에서, 세포-표면 마커는 CD45RA, CCR7 및 CD62L 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 복수의 T 세포를 변형시키고/시키거나 복수의 변형된 T 세포를 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포는 이펙터 T 세포(변형된 TEFF)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 특정 구현예에서, 세포-표면 마커는 CD45RA, CD95, 및 IL-2Rβ 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 복수의 T 세포를 변형시키고/시키거나 복수의 변형된 T 세포를 생성하고, 이때 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 사이의 임의의 퍼센트의 복수의 변형된 T 세포는 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 버퍼는 면역 세포 또는 이의 전구체를 포함한다. 버퍼는 T 세포를 포함해 면역 세포 또는 이의 전구체의 세포 생존율 및/또는 줄기-유사 표현형의 수준을 유지하거나 향상시킨다. 특정 구현예에서, 버퍼는 뉴클레오펙션 이전에 1차 인간 T 세포의 세포 생존율 및/또는 줄기-유사 표현형의 수준을 유지하거나 향상시킨다. 특정 구현예에서, 버퍼는 뉴클레오펙션 동안에 1차 인간 T 세포의 세포 생존율 및/또는 줄기-유사 표현형의 수준을 유지하거나 향상시킨다. 특정 구현예에서, 버퍼는 뉴클레오펙션 후에 1차 인간 T 세포의 세포 생존율 및/또는 줄기-유사 표현형의 수준을 유지하거나 향상시킨다. 특정 구현예에서, 버퍼는 임의의 절대적 또는 상대적 풍부도 또는 농도로 KCl, MgCl2, ClNa, 글루코오스 및Ca(NO3)2 중 하나 이상을 포함하고, 선택적으로는, 버퍼는 HEPES, Tris/HCl, 및 포스페이트 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택된 보충제를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 버퍼는 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코오스 및 0.4 mM Ca(NO3)2를 포함한다. 특정 구현예에서, 버퍼는 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코오스 및 0.4 mM Ca(NO3)2, 및 20 mM HEPES 및 75 mM Tris/HCl를 포함하는 보충제를 포함한다. 특정 구현예에서, 버퍼는 5 mM KCl, 15 mM MgCl2, 90 mM ClNa, 10 mM 글루코오스 및 0.4 mM Ca(NO3)2, 및 40 mM Na2HPO4/NaH2PO4(pH 7.2)를 포함하는 보충제를 포함한다. 특정 구현예에서, 1차 인간 T 세포를 포함하는 조성물은 100 μl의 버퍼 및 5x106 내지 25x106 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 도입 단계 동안 버퍼 또는 다른 배지 밀리리터 당 250x106 1차 인간 T 세포의 확장가능한 비율을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 본 개시 내용의 T 세포를 포함해 본 개시 내용의 면역 세포 및 T-세포 확장 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사아제를 본 개시 내용의 면역 세포 내로 도입하는 단계는 면역 세포 및 T-세포 확장 조성물을 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법의 도입 단계가 전기천공 또는 뉴클레오펙션 단계를 포함하는 구현예를 비롯해 일부 구현예에서, 전기천공 또는 뉴클레오펙션 단계는 본 개시 내용의 T-세포 확장 조성물을 접촉하는 면역 세포로 수행될 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 인; 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 및 올레산 중 하나 이상; 스테롤; 및 알칸을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 변형된 T 세포를 제조하는 방법의 특정 구현예에서, 확장 보충제는 하나 이상의 사이토카인(들)을 포함한다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 비제한적으로 림포카인을 포함한 임의의 사이토카인을 포함할 수 있다. 예시적인 림포카인은 비제한적으로 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-21(IL-21), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 인터페론-감마(INFγ)를 포함한다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 IL-2를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-메르캅토에탄올, 및 확장 보충제를 포함한다. 이 방법의 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필)에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산, 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 및 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 종점들을 포함해서 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg의 농도의 옥탄산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 팔미트산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 리놀레산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점들을 포함해서 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 약 9 mg/kg의 농도의 옥탄산; 약 2 mg/kg의 농도의 팔미트산; 약 2 mg/kg의 농도의 리놀레산; 약 2 mg/kg의 농도의 올레산; 및 약 1 mg/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 종점들을 포함해서 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 종점들을 포함해서 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 종점들을 포함해서 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 종점들을 포함해서 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 종점들을 포함해서 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 이 방법의 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 약 64 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 약 7 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 약 7.5 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 약 7.5 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 약 2.5 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-메르캅토에탄올 및 확장 보충제(복수의 확장 변형된 T-세포를 생성하기 위함) 중 하나 이상을 포함하고, 이때 적어도 2%의 복수의 변형된 T-세포는 초기 기억 T-세포, 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM), 및/또는 중심 기억 T 세포(TCM)의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현한다. 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 옥탄산, 니코틴아미드, 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TMDD), 디이소프로필 아디페이트(DIPA), n-부틸-벤젠술폰아미드, 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필)에스테르, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 스테아르산, 히드라지드, 올레아미드, 스테롤 및 알칸 중 하나 이상을 포함하거나 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 및 스테롤(예, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함한다. 이 방법의 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 종점들을 포함해서 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg의 농도의 옥탄산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 팔미트산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 리놀레산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점들을 포함해서 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(이때, mg/kg =ppm). 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 약 9 mg/kg의 농도의 옥탄산; 약 2 mg/kg의 농도의 팔미트산; 약 2 mg/kg의 농도의 리놀레산; 약 2 mg/kg의 농도의 올레산; 및 약 1 mg/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(이때, mg/kg = ppm). 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 9.19 mg/kg의 농도의 옥탄산; 1.86 mg/kg의 농도의 팔미트산; 약 2.12 mg/kg의 농도의 리놀레산; 약 2.13 mg/kg의 농도의 올레산; 및 약 1.01 mg/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다(이때, mg/kg = ppm). 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 9.19 mg/kg의 농도의 옥탄산; 1.86 mg/kg의 농도의 팔미트산; 약 2.12 mg/kg의 농도의 리놀레산; 약 2.13 mg/kg의 농도의 올레산; 및 약 1.01 mg/kg의 농도의 스테롤을 포함한다(이때, mg/kg = ppm). 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 종점들을 포함해서 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 종점들을 포함해서 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 종점들을 포함해서 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 종점들을 포함해서 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 종점들을 포함해서 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 약 64 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 약 7 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 약 7.5 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 약 7.5 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 약 2.5 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 약 63.75 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 약 7.27 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 약 7.57 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 약 7.56 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 약 2.61 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함한다. 특정 구현예에서, T-세포 확장 조성물은 약 63.75 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 약 7.27 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 약 7.57 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 약 7.56 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 약 2.61 μmol/kg의 농도의 스테롤을 포함한다.
본원에서 이용한 바, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-메르캅토에탄올, 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 인, 옥탄 지방산, 팔미트 지방산, 리놀 지방산 및 올레산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 배지는 예를 들어 이스코브 변형 듈베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM); ThermoFisher Scientific에서 카탈로그 번호 12440053로 입수 가능함)에서 발견될 수 있는 것보다 10배 더 높은 인의 양을 포함한다.
본원에서 이용한 바, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-메르캅토에탄올, 이스코브 MDM 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 하기의 원소 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 붕소, 나트륨, 마그네슘, 인, 칼륨 및 칼슘. 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 해당하는 평균 농도로 존재하는 하기의 원소 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 3.7 mg/L의 붕소, 3000 mg/L의 나트륨, 18 mg/L의 마그네슘, 29 mg/L의 인, 15 mg/L의 칼륨 및 4 mg/L의 칼슘.
본원에서 이용한 바, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-메르캅토에탄올, 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 하기의 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 옥탄산 (CAS No. 124-07-2), 니코틴아미드 (CAS No. 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올 (TMDD) (CAS No. 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA) (CAS No. 6938-94-9), n-부틸-벤젠술폰아미드 (CAS No. 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS No. 84-69-5), 팔미트산 (CAS No. 57-10-3), 리놀레산 (CAS No. 60-33-3), 올레산 (CAS No. 112-80-1), 스테아르산 히드라지드 (CAS No. 4130-54-5), 올레아미드 (CAS No. 3322-62-1), 스테롤 (예, 콜레스테롤) (CAS No. 57-88-5), 및 알칸 (예, 노나데칸) (CAS No. 629-92-5). 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 하기의 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 옥탄산 (CAS No. 124-07-2), 니코틴아미드 (CAS No. 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올 (TMDD) (CAS No. 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA) (CAS No. 6938-94-9), n-부틸-벤젠술폰아미드 (CAS No. 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS No. 84-69-5), 팔미트산 (CAS No. 57-10-3), 리놀레산 (CAS No. 60-33-3), 올레산 (CAS No. 112-80-1), 스테아르산 히드라지드 (CAS No. 4130-54-5), 올레아미드 (CAS No. 3322-62-1), 스테롤 (예, 콜레스테롤) (CAS No. 57-88-5), 알칸 (예, 노나데칸) (CAS No. 629-92-5) 및 페놀 레드 (CAS No. 143-74-8). 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 하기의 성분 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 옥탄산 (CAS No. 124-07-2), 니코틴아미드 (CAS No. 98-92-0), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올 (TMDD) (CAS No. 126-86-3), 디이소프로필 아디페이트(DIPA) (CAS No. 6938-94-9), n-부틸-벤젠술폰아미드 (CAS No. 3622-84-2), 1,2-벤젠디카르복실산, 비스(2-메틸프로필) 에스테르(CAS No. 84-69-5), 팔미트산 (CAS No. 57-10-3), 리놀레산 (CAS No. 60-33-3), 올레산 (CAS No. 112-80-1), 스테아르산 히드라지드 (CAS No. 4130-54-5), 올레아미드 (CAS No. 3322-62-1), 페놀 레드 (CAS No. 143-74-8) 및 라놀린 알코올.
특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-메르캅토에탄올, 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 하기의 이온 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 나트륨, 암모늄, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 클로라이드, 술페이트 및 포스페이트.
본원에서 이용한 바, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-메르캅토에탄올, 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 하기의 유리 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 히스티딘, 아스파라긴, 세린, 글루타메이트, 아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 글루탐산, 트레오닌, 알라닌, 프롤린, 시스테인, 리신, 티로신, 메티오닌, 발린, 이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 트립토판. 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 상응하는 평균 몰 백분율로 하기의 유리 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 히스티딘 (약 1%), 아스파라긴 (약 0.5%), 세린 (약 1.5%), 글루타민 (약 67%), 아르기닌 (약 1.5%), 글리신 (약 1.5%), 아스파르트산 (약 1%), 글루탐산 (약 2%), 트레오닌 (약 2%), 알라닌 (약 1%), 프롤린 (약 1.5%), 시스테인 (약 1.5%), 리신 (약 3%), 티로신 (약 1.5%), 메티오닌 (약 1%), 발린 (약 3.5%), 이소류신 (약 3%), 류신 (약 3.5%), 페닐알라닌 (약 1.5%) 및 트립토판 (약 0.5%). 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 상응하는 평균 몰 백분율로 하기의 유리 아미노산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다: 히스티딘 (약 .78%), 아스파라긴 (약 0.4%), 세린 (약 1.6%), 글루타민 (약 67.01%), 아르기닌 (약 1.67%), 글리신 (약 1.72%), 아스파르트산 (약 1.00%), 글루탐산 (약 1.93%), 트레오닌 (약 2.38%), 알라닌 (약 1.11%), 프롤린 (약 1.49%), 시스테인 (약 1.65%), 리신 (약 2.84%), 티로신 (약 1.62%), 메티오닌 (약 0.85%), 발린 (약 3.45%), 이소류신 (약 3.14%), 류신 (약 3.3%), 페닐알라닌 (약 1.64%) 및 트립토판 (약 0.37%).
본원에서 이용한 바, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 37℃에서 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 인슐린, 인간 트랜스페린, 2-메르캅토에탄올, 이스코브 MDM 및 확장 보충제 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 인, 옥탄 지방산, 팔미트 지방산, 리놀 지방산 및 올레산 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, 배지는 예를 들어 이스코브 변형 듈베코 배지((IMDM); ThermoFisher Scientific에서 카탈로그 번호 12440053로 입수 가능함)에서 발견될 수 있는 것보다 10배 더 높은 인의 양을 포함한다.
특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 옥탄산, 팔미트산, 리놀레산, 올레산, 및 스테롤(예, 콜레스테롤) 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환되어 사용될 수 있다. 이 방법의 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 종점들을 포함해서 0.9 mg/kg 내지 90 mg/kg의 농도의 옥탄산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 팔미트산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 리놀레산; 종점들을 포함해서 0.2 mg/kg 내지 20 mg/kg의 농도의 올레산; 및 종점들을 포함해서 약 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 (이때, mg/kg =ppm) 배지와 상호교환되어 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 약 9 mg/kg의 농도의 옥탄산; 약 2 mg/kg의 농도의 팔미트산; 약 2 mg/kg의 농도의 리놀레산; 약 2 mg/kg의 농도의 올레산; 및 약 1 mg/kg(이때, mg/kg = ppm)의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지로 상호교환되어 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 9.19 mg/kg의 농도의 옥탄산; 1.86 mg/kg의 농도의 팔미트산; 약 2.12 mg/kg의 농도의 리놀레산; 약 2.13 mg/kg의 농도의 올레산; 및 약 1.01 mg/kg(이때, mg/kg = ppm)의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지로 상호교환되어 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 9.19 mg/kg의 농도의 옥탄산; 1.86 mg/kg의 농도의 팔미트산; 2.12 mg/kg의 농도의 리놀레산; 약 2.13 mg/kg의 농도의 올레산; 및 1.01 mg/kg(이때, mg/kg = ppm)의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지로 상호교환되어 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 종점들을 포함해서 6.4 μmol/kg 내지 640 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 종점들을 포함해서 0.7 μmol/kg 내지 70 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 종점들을 포함해서 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 종점들을 포함해서 0.75 μmol/kg 내지 75 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 종점들을 포함해서 0.25 μmol/kg 내지 25 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 약 64 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 약 7 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 약 7.5 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 약 7.5 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 약 2.5 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 약 63.75 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 약 7.27 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 약 7.57 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 약 7.56 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 약 2.61 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 용어 "보충된 T-세포 확장 조성물" 또는 "T-세포 확장 조성물"은 약 63.75 μmol/kg의 농도의 옥탄산; 약 7.27 μmol/kg의 농도의 팔미트산; 약 7.57 μmol/kg의 농도의 리놀레산; 7.56 μmol/kg의 농도의 올레산; 및 2.61 μmol/kg의 농도의 스테롤 중 하나 이상을 포함하는 배지와 상호교환하여 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 T 세포(예를 들어, 줄기 세포-유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 제조하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 변형된 T 세포 및 P13K-Akt-mTOR 경로의 저해제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시 내용의 변형된 줄기 세포-유사 T 세포, TSCM 및/또는TCM를 포함해 본 개시 내용의 변형된 T-세포는 절차의 방법에서 임의의 단계에서 PI3K 경로의 성분의 하나 이상의 저해제를 포함하는 성장 배지와 인큐베이션, 배양, 성장, 저장 또는 그 밖에 달리 조합될 수 있다. PI3K 경로의 성분의 예시적인 저해제는 비제한적으로 TWS119와 같은 GSK3β의 저해제(GSK 3B 저해제 XII로서도 공지됨; 화학식 C18H14N4O2을 가진 CAS 넘버 601514-19-6)를 포함한다. PI3K 경로의 성분의 예시적인 저해제는 비제한적으로 bb007 (BLUEBIRDBIO™)을 포함한다. PI3K 경로의 성분의 추가적인 예시의 저해제는 비제한적으로 하기를 포함한다:알로스테릭 Akt 저해제 VIII (화합물 번호 10196499를 갖는 Akti-1/2로서 지칭됨), ATP 경쟁적 저해제 (단백질 키나아제 B(Akt)의 ATP-결합 포켓을 표적화하는 오르토스테릭 저해제), 이소퀴놀린-5-술폰아미드 (H-8, H-89, 및 NL-71-101), 아제판 유도체((-)-발라놀로부터 유래된 일련의 구조), 아미노푸라잔(GSK690693), 헤테로시클릭 고리 (7-아자인돌, 6-페닐퓨린 유도체, 피롤로[2,3-d]피리미딘 유도체, CCT128930, 3-아미노피롤리딘, 아닐리노트리아졸 유도체, 스피로인돌린 유도체, AZD5363, 이파타세르팁 (GDC-0068, RG7440), A-674563, 및 A-443654), 페닐피라졸 유도체(AT7867 및 AT13148), 티오펜카르복사미드 유도체(아푸레세르팁((Afuresertib) GSK2110183), 2-피리미딜-5-아미도티오펜 유도체 (DC120), 유프로세르팁 (GSK2141795)), 알로스테릭 저해제(더 큰 특이성, 감소된 부작용 및 덜한 독성을 제공하는 오르토스테릭 저해제보다 우수), 2,3-디페닐퀴녹살린 유사체(2,3-디페닐퀴녹살린 유도체, 트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온 유도체(MK-2206)), 알킬포스포리피드 (에델포신 (1-O-옥타데실-2-O-메틸-rac-글리세로-3-포스포콜린, ET-18-OCH3) 일모포신 (BM 41.440), 밀테포신 (헥사데실포스포콜린, HePC), 페리포신 (D-21266), 에루실포스포콜린 (ErPC), 에루포신 (ErPC3, 에루실포스포호모콜린), 인돌-3-카르비놀 유사체 (인돌-3-카르비놀, 3-클로로아세틸인돌, 디인돌릴메탄, 디에틸 6-메톡시-5,7-디히드로인돌로 [2,3-b]카르바졸-2,10-디카르복실레이트 (SR13668), OSU-A9), 술폰아미드 유도체 (PH-316 및 PHT-427), 티오우레아 유도체 (PIT-1, PIT-2, DM-PIT-1, N-[(1-메틸-1H-피라졸-4-일)카르보닐]-N′-(3-브로모페닐)-티오우레아), 퓨린 유도체 (트리시리빈 (TCN, NSC 154020), 트리시리빈 모노-포스페이트 활성 유사체(TCN-P), 4-아미노-피리도[2,3-d]피리미딘 유도체 API-1, 3-페닐-3H-이미다조[4,5-b]피리딘 유도체, ARQ 092), BAY 1125976, 3-메틸-잔틴, 퀴놀린-4-카르복사미드 및 2-[4-(시클로헥사-1,3-디엔-1-일)-1H-피라졸-3-일]페놀, 3-옥소-티루칼릭산, 3α- 및 3β-아세톡시-티루칼릭산, 아세톡시-티루칼릭산 및 비가역적 저해제 (항생제, 락토퀴노마이신, 프레놀리신 B, 칼라푼긴, 메데르마이신, Boc-Phe-비닐 케톤, 4-히드록시노네날 (4-HNE), 1,6-나프티리디논 유도체 및 이미다조-1,2-피리딘 유도체).
본 개시 내용의 변형된 T 세포(예를 들어, 줄기 세포-유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 제조하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 변형된 T 세포 및 T 세포 이펙터 분화의 저해제를 접촉시키는 단계를 포함한다. T 세포 이펙터 분화의 예시적인 저해제는 비제한적으로 BET 저해제(예, JQ1, 히에노트리아졸로디아제핀) 및/또는 단백질의 BET 패밀리(예, BRD2, BRD3, BRD4, 및 BRDT)의 저해제를 포함한다.
본 개시 내용의 변형된 T 세포(예를 들어, 줄기 세포-유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 제조하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 변형된 T 세포 및 핵-세포질 아세틸-CoA를 감소시키는 제제를 접촉시키는 단계를 포함한다. 핵-세포질 아세틸-CoA를 감소시키는 예시적인 제제는 비제한적으로 2-히드록시-시트레이트(2-HC)뿐 아니라 Acss1의 발현을 증가시키는 제제를 포함한다.
본 개시 내용의 변형된 T 세포(예를 들어, 줄기 세포-유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 제조하는 방법의 특정 구현예에서, 방법은 변형된 T 세포 및 히스톤 데아세틸라아제(HDAC) 저해제를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제를 포함하는 조성물은 발프로산, 나트륨 페닐부티레이트(NaPB) 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제를 포함하는 조성물은 발프로산을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, HDAC 저해제를 포함하는 조성물은 나트륨 페닐부티레이트(NaPB)을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 변형된 T 세포(예를 들어, 줄기 세포-유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 제조하는 방법의 특정 구현예에서, 활성화 보충제는 하나 이상의 사이토카인(들)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 비제한적으로 림포카인을 포함한 임의의 사이토카인을 포함할 수 있다. 예시적인 림포카인은 비제한적으로 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-21(IL-21), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 인터페론-감마(INFγ)를 포함한다. 하나 이상의 사이토카인(들)은 IL-2를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 T 세포(예를 들어, 줄기 세포-유사 T 세포, TSCM 및/또는 TCM)를 제조하는 방법의 특정 구현예에서, 활성화 보충제는 하나 이상의 활성화제 복합체를 포함할 수 있다. 예시적이고 비제한적인 활성화제 복합체는 CD3, CD28, 및 CD2 중 하나 이상을 결합하는 모노머, 다이머, 트라이머 또는 테트라머 항체 복합체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화 보충제는 인간, 인간화 또는 재조합 또는 키메라 항체를 포함하는 활성화제 복합체를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 활성화 보충제는 CD3 및 CD28을 결합하는 활성화제 복합체를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 활성화 보충제는 CD3, CD28 및 CD2을 결합하는 활성화제 복합체를 포함하거나, 이로 이루어진다.
자연 살해(NK) 세포
특정 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 면역 또는 면역 전구체 세포는 자연 살해(NK) 세포이다. 특정 구현예에서, NK 세포는 림프구 전구 세포로부터 분화된 세포독성 림프구이다.
본 개시 내용의 변형된 NK 세포는 변형된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, 비활성화된 NK 세포는 CD3-결실 백혈구성분채집(CD14/CD19/CD56+ 세포 함유)로부터 유래된다.
특정 구현예에서, NK 세포는 Lonza 4D 뉴클레오펙터 또는 BTX ECM 830(500V, 700 usec 펄스 길이, 0.2 mm 전극 갭, 1 펄스)를 사용하여 전기천공된다. 모든 Lonza 4D 뉴클레오펙터 프로그램은 본 개시 내용의 방법의 영역 내에서 고려된다.
특정 구현예에서, 5x10E6 세포는 큐벳 중 100 μL P3 버퍼에서 전기천공마다 전기천공되었다. 그러나, 부피 당 세포의 이러한 비율은 상업적 제조 방법으로 확장가능하다.
특정 구현예에서, NK 세포는 추가적인 세포주와 공동-배양에 의해 자극되었다. 특정 구현예에서, 추가적인 세포주는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극은 전기 천공 후 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일에 발생한다. 특정 구현예에서, 자극은 전기 천공 후 2일에 발생한다.
특정 구현예에서, NK 세포는 CD56을 발현한다.
B 세포
특정 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 면역 또는 면역 전구체 세포는 B 세포이다. B 세포는 세포 표면 상 B 세포 수용체를 발현하는 림프구 유형이다. B 세포 수용체는 특정 항원에 결합한다.
본 개시 내용의 변형된 B 세포는 변형된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 또는 변형된 HSC로부터 유래될 수 있다.
특정 구현예에서, HSPC는 본 개시 내용의 방법을 이용하여 변형된 다음, 인간 IL-3, Flt3L, TPO, SCF, 및 G-CSF의 존재 하에서 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 또는 적어도 7일 동안 B 세포 분화를 위해 프라이밍된다. 특정 구현예에서, HSPC는 본 개시 내용의 방법을 이용하여 변형된 다음, 인간 IL-3, Flt3L, TPO, SCF, 및 G-CSF의 존재 하에서 5일 동안 B 세포 분화를 위해 프라이밍된다.
특정 구현예에서, 프라이밍 후, 변형된 HSPC 세포는 공급자 세포 층으로 옮겨지고, 1주에 1회 새로운 공급자 층으로의 전달과 함께 격주로 공급된다. 특정 구현예에서, 공급자 세포는 MS-5 공급자 세포이다.
특정 구현예에서, 변형된 HSPC 세포는 적어도 7, 14, 21, 28, 30, 33, 35, 42 또는 48일 동안 MS-5 공급자 세포와 배양된다. 특정 구현예에서, 변형된 HSPC 세포는 33일 동안 MS-5 공급자 세포와 배양된다.
유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드
본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 훨씬 덜 면역원성이기 때문에, 기존의 유도성 폴리펩티드보다 우수하다. 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이고, 따라서 비-자연적으로 발생하지만, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 생성하도록 재조합된 서열들은 숙주 인간 면역계가 "비-자기"로서 인식하여, 그 결과 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 포함하는 세포, 또는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드, 또는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 수여하는 대상체에서 면역 반응을 유도시킬 수 있는 비인간 서열을 포함하지 않는다.
본 개시 내용은 리간드 결합 영역, 링커 및 세포자멸촉진 펩티드를 포함하는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 제공하며, 이때 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 세포자멸촉진 펩티드는 카스파아제 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 카스파아제 폴리펩티드는 카스파아제 9 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 카스파아제 9 폴리펩티드는 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드이다. 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 비-자연 발생적일 수 있다.
본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드는 비제한적으로 카스파아제 1, 카스파아제 2, 카스파아제 3, 카스파아제 4, 카스파아제 5, 카스파아제 6, 카스파아제 7, 카스파아제 8, 카스파아제 9, 카스파아제 10, 카스파아제 11, 카스파아제 12, 및 카스파아제 14를 포함한다. 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드는 비제한적으로 카스파아제 2, 카스파아제 3, 카스파아제 6, 카스파아제 7, 카스파아제 8, 카스파아제 9, 및 카스파아제 10를 포함하는 세포자멸과 연관된 카스파아제 폴리펩티드를 포함한다. 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드는 비제한적으로 카스파아제 2, 카스파아제 8, 카스파아제 9, 및 카스파아제 10를 포함하는 세포자멸을 개시하는 카스파아제 폴리펩티드를 포함한다. 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드는 비제한적으로 카스파아제 3, 카스파아제 6, 및 카스파아제 7를 포함하는 세포자멸을 실행하는 카스파아제 폴리펩티드를 포함한다.
본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드는 야생형 아미노산 또는 핵산 서열과 비교 시 하나 이상의 변형을 갖는 아미노산 또는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드의 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 하나 이상의 변형은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열과 비교 시 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드의 상호작용, 가교, 가교-활성화 또는 활성화를 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드의 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 하나 이상의 변형은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열과 비교 시 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드는 야생형 카스파아제 폴리펩티드와 비교 시 절단될 수 있다. 예를 들어, 카스파아제 폴리펩티드는 카스파아제 활성화 및 모집 도메인(Caspase Activation and Recruitment Domain; CARD)을 코딩하는 서열을 제거하도록 절단되어 본 개시 내용의 유도성 카스파아제 폴리펩티드를 포함하는 세포에서 세포자멸을 개시하는 것 외에도 국소 염증 반응을 활성화할 가능성을 제거하거나 최소화할 수 있다. 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 스플라이싱되어 야생형 카스파아제 폴리펩티드와 비교되는 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드의 변이체 아미노산 서열을 형성할 수 있다. 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드는 재조합 및/또는 키메라 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 개시 내용의 재조합 및/또는 키메라 카스파아제 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 카스파아제 폴리펩티드로부터의 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 개시 내용의 재조합 및/또는 키메라 카스파아제 폴리펩티드는 하나 이상의 종으로부터의 서열(예, 인간 서열 및 비인간 서열)을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 카스파아제 폴리펩티드는 비-자연적으로 발생할 수 있다.
본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 리간드 결합 영역은 본 개시 내용의 제1 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 본 개시 내용의 제2 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드와의 다이머화를 용이하게 하거나 촉진하는 임의의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기의 다이머화는 세포자멸촉진 폴리펩티드의 가교 및 세포 내 세포자멸의 개시를 유도한다.
리간드-결합("다이머화") 영역은 내인성 또는 비-자연적 발생 리간드(즉, 및 유도제), 예를 들어 비-자연 발생 합성 리간드를 이용한 유도를 허용하는 임의의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 도메인을 포함할 수 있다. 리간드-결합 영역은 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 본성 및 리간드(즉, 유도제)의 선택에 따라 세포막의 내부 또는 외부에 있을 수 있다. 수용체를 포함하여 매우 다양한 리간드-결합 폴리펩티드 및 그의 기능 도메인이 공지되어 있다. 본 개시 내용의 리간드-결합 영역은 수용체로부터의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 특히 흥미로운 것은 리간드(예를 들어, 소형 유기 리간드)가 공지되어 있거나 손쉽게 생성될 수 있는 리간드-결합 영역이다. 이들 리간드-결합 영역 또는 수용체는 비제한적으로 FKBP 및 사이클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체, 등뿐 아니라 "비-자연 발생" 수용체를 포함할 수 있으며, 이는 항체, 특히 중쇄 또는 경쇄 서브유닛, 그의 돌연변이된 서열, 확률적 절차, 조합 합성 등에 의해 수득된 랜덤 아미노산 서열로부터 수득될 수 있다. 특정 구현예에서, 리간드-결합 영역은 FKBP 리간드-결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드-결합 영역, 스테로이드 수용체 리간드-결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드-결합 영역, 및 테트라사이클린 수용체 리간드-결합 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 수용체 도메인(들)을 포함하는 리간드-결합 영역은 내인성 도메인 또는 이의 절단된 활성 부위로서 적어도 약 50개의 아미노산 및 약 350개 미만의 아미노산, 통상적으로는 200개 미만의 아미노산일 수 있다. 결합 영역은 예를 들어 작을 수 있고(< 25 kDa, 바이러스 벡터에서 효율적인 트랜스펙션을 허용하도록), 모노머, 비면역원성이며, 합성적으로 접근가능하고, 세포 투과성이며, 다이머화를 위해 구성될 수 있는 비독성 리간드를 가질 수 있다.
하나 이상의 수용체 도메인(들)을 포함하는 리간드-결합 영역은 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 설계 및 적절한 리간드(즉, 유도제)의 이용가능성에 따라 세포내 또는 세포외에 있을 수 있다. 소수성 리간드의 경우, 결합 영역은 막의 양쪽에 있을 수 있으나, 친수성 리간드의 경우, 특히 단백질 리간드의 경우, 결합 영역은 결합에 이용가능한 형태로 리간드를 내재화하기 위한 수송 시스템이 존재하지 않는 한, 통상적으로 세포막에 대해 외부에 있을 것이다. 세포내 수용체의 경우, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드, 또는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존 또는 벡터는 신호 펩티드 및 수용체 도메인 서열의 막횡단 도메인 5' 또는 3'을 코딩할 수 있거나, 수용체 도메인 서열의 지질 부착 신호 서열 5'를 가질 수 있다. 수용체 도메인이 신호 펩티드와 막횡단 도메인 사이에 존재하는 경우, 수용체 도메인은 세포외에 있을 수 있다.
항체 및 항체 서브유닛, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄, 특히 단편, 보다 특히 가변 영역의 전부 또는 일부, 또는 고친화성 결합을 생성하기 위한 중쇄 및 경쇄의 융합부는 본 개시 내용의 리간드 결합 영역으로서 이용될 수 있다. 고려되는 항체는 면역 반응을 유발하지 않고 일반적으로 말초(즉, CNS/뇌 영역의 외부)에서 발현되지 않는 세포외 도메인과 같은 이소성 발현된 인간 생성물인 것을 포함한다. 이러한 예는 비제한적으로 저친화성 신경 성장 인자 수용체(LNGFR), 및 배아 표면 단백질(즉, 암배아 항원)을 포함한다. 또한 나아가, 항체는 생리학적으로 허용가능한 합텐 분자 및 결합 친화도에 대해 스크리닝된 개별 항체 서브유닛에 대해 제조될 수 있다. 서브유닛을 코딩하는 cDNA는 불변 영역, 가변 영역의 일부의 결실, 가변 영역의 돌연변이 등에 의해 단리되고 변형될 수 있어 리간드에 대해 적절한 친화도를 갖는 결합 단백질 도메인이 수득될 수 있다. 이러한 방식으로, 거의 모든 임의의 생리학적으로 허용가능한 합텐 화합물이 리간드로서 사용될 수 있거나, 리간드에 대한 에피토프를 제공할 수 있다. 항체 단위 대신에, 결합 영역 또는 도메인이 공지되어 있고, 결합에 유용하거나 공지되어진 리간드가 존재하는 내인성 수용체가 이용될 수 있다.
수용체를 멀티머화하기 위해, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 리간드-결합 영역/수용체 도메인에 대한 리간드는 리간드가 2개 이상의 결합 부위를 가질 수 있고, 결합 부위 각각이 리간드 수용체 영역과 결합할 수 있다는 점(즉, 제1 결합 부위를 가진 리간드는 제1 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 리간드-결합 영역에 결합할 수 있고, 제2 결합 부위는 제2 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 리간드-결합 영역에 결합할 수 있으며, 이때 제1 및 제2 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 리간드-결합 영역은 동일하거나 뚜렷하게 구별됨)에서 멀티머일 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "멀티머 리간드 결합 영역"은 멀티머 리간드에 결합하는 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 리간드-결합 영역을 지칭한다. 본 개시 내용의 멀티머 리간드는 다이머 리간드를 포함한다. 본 개시 내용의 다이머 리간드는 리간드 수용체 도메인에 결합할 수 있는 2개의 결합 부위를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 멀티머 리간드는 작은 합성 유기 분자의 다이머 또는 고차 올리고머, 통상적으로는 대략 테트라머 이하로, 개별 분자는 전형적으로 적어도 약 150 Da 및 약 5 kDa 미만, 통상적으로 약 3 kDa 미만이다. 합성 리간드 및 수용체의 각종 쌍이 활용될 수 있다. 예를 들어, 내인성 수용체를 포함하는 구현예에서, 다이머 FK506은 FKBP12 수용체와 함께 사용될 수 있고, 다이머화 사이클로스포린 A는 사이클로필린 수용체와 사용될 수 있고, 다이머화 에스트로겐은 에스테로겐 수용체, 다이머화 글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체와, 다이머화 테트라사이클린은 테트라사이클린 수용체와, 다이머화 비타민 D는 비타민 D 수용체와, 기타 등등이 사용될 수 있다. 대안적으로 고차원의 리간드, 예컨대 트라이머가 사용될 수 있다. 비-자연적으로 발생하는 수용체, 예를 들어 항체 서브유닛, 변형된 항체 서브유닛, 가요성 링커에 의해 분리되어진, 텐덤의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이루어진 단일 사슬 항체, 또는 변형된 수용체 및 이의 돌연변이 서열 등을 포함하는 구현예의 경우, 임의의 다양한 화합물이 이용될 수 있다. 본 개시 내용의 멀티머 리간드를 포함하는 단위의 유의미한 특징은 각각의 결합 부위가 고 친화도로 수용체에 결합할 수 있고, 바람직하게는 이들이 화학적으로 다이머화될 수 있다는 점이다. 또한, 리간드의 소수성/친수성의 균형을 맞추는 방법을 이용가능할 수 있어, 이들은 기능 수준에서 혈청에 용해될 수 있지만, 대부분의 응용 분야에서 원형질막을 통해 확산될 수 있다.
본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 활성화는 예를 들어 조건적으로 제어된 단백질 또는 폴리펩티드를 생성하기 위해 유도제에 의해 매개되는 화학적으로 유도된 다이머화(CID)를 통해 달성될 수 있다. 본 개시 내용의 세포자멸촉진 폴리펩티드는 유도성일뿐 아니라, 불안정성 다이머화제의 분해 또는 다이머 경쟁 저해제의 투여로 인해 이들 폴리펩티드의 유도도 가역적이다.
특정 구현예에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 리간드 결합 영역은 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩티드를 포함한다. 리간드 결합 영역이 위치 36에서 페닐알라닌(F)에 대한 발린(V)의 치환(F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩티드를 포함하는 특정 구현예에서, 유도제는 AP1903, 합성 약물 (CAS 인덱스 명칭: 2-피페리딘카르복실산, 1-[(2S)-1-옥소-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부틸]-, 1,2-에탄디일비스[이미노(2-옥소-2,1-에탄디일)옥시-3,1-페닐렌[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로필리덴]]에스테르, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS 등록 번호: 195514-63-7; 분자식: C78H98N4O20; 분자량: 1411.65))을 포함할 수 있다. 리간드 결합 영역이 위치 36에서 페닐알라닌(F)에 대한 발린(V)의 치환(F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩티드를 포함하는 특정 구현예에서, 유도제는 AP20187 (CAS 등록 번호: 195514-80-8 및 분자식: C82H107N5O20)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 유도제는 예를 들어 AP1510과 같은 AP20187 유사체이다. 본원에서 이용되는 바와 같이, 유도제 AP20187, AP1903 및 AP1510는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
AP1903 API는 Alphora Research Inc.에서 제작되고, AP1903 주사용 약물 제품은 Formatech Inc.에서 제조된다. 이는 비이온성 가용화제인 Solutol HS 15 (250 mg/mL, BASF)의 25% 용액 중 AP1903의 5mg/mL 용액으로서 제형화된다. 실온에서, 이 제형물은 투명하고, 약간 황색 용액이다. 냉장 시, 이 제형물은 가역적 상 전이를 겪어 유백색(milky) 용액이 된다. 이러한 상 전이는 실온으로 다시 가온되면 반전된다. 충전물은 3 mL 유리 바이알에서 2.33 mL이다(대략적으로 바이알 당 총 주입에 대해 10 mg AP1903). AP1903을 투여할 필요성이 결정되면, 환자는 예를 들어 비-DEHP, 비-에틸렌 옥시드 멸균 주입 세트를 이용하여, 2시간에 걸쳐 IV 투입을 통해 주입용 AP1903의 단일 고정 용량(0.4 mg/kg)이 투여될 수 있다. AP1903의 용량은 모든 환자에 대해 개별적으로 계산되며, 체중이 10% 이상 변동되지 않는 한 다시 계산되지 않는다. 계산된 용량은 투입 전 0.9% 생리식염수에서 100 mL로 희석된다. AP1903의 이전 1상 연구에서, 24명의 건강한 지원자는 2시간에 걸쳐 IV 투입되는 주입용 AP1903을 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mg/kg의 용량 수준에서 단일 용량으로 치료되었다. AP1903 혈장 수준은 용량에 정비례하였으며, 평균 Cmax 값은 0.01-1.0 mg/kg 용량 범위에 걸쳐 약 10-1275 ng/mL 범위였다. 초기 투입 기간 후, 혈장 수준이 각각 투약 후 0.5, 2 및 10 시간에 최대 농도의 대략 18, 7, 및 1%로 감소된 혈액 농도는 빠른 분포 상을 보였다. 주입용 AP1903은 모든 용량 수준에서 안정하고 잘 용인된 것으로 보여졌으며, 유리한 약동학적 프로파일을 보여주었다. 문헌[Iuliucci J D, et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001].
사용된 주입용 AP1903의 고정된 용량은 예를 들어 2시간에 걸쳐 정맥 투입되는 0.4 mg/kg일 수 있다. 세포의 효과적인 시그널링을 위해 시험관 내 필요한 AP1903의 양은 10-100 nM (1600 Da MW)이다. 이는 16-160 μg/L 또는 약 0.016-1.6 μg/kg (1.6-160 μg/kg)에 해당한다. 1 mg/kg까지의 용량이 상기 기술된 AP1903의 1상 연구에서 잘 용인되었다. 따라서, 0.4 mg/kg은 치료 세포와 조합된 상기 1상 연구를 위해 AP1903의 안전하고 효과적인 용량일 수 있다.
본 개시 내용의 리간드 결합을 코딩하는 아미노산 및/또는 핵산 서열은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열과 비교시 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 개시 내용의 리간드 결합을 코딩하는 아미노산 및/또는 핵산 서열은 코돈-최적화 서열일 수 있다. 하나 이상의 변형은 야생형 폴리펩티드에 비해 본 개시 내용의 리간드 결합 영역에 대한 리간드(예, 유도제)의 결합 친화성을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 하나 이상의 변형은 야생형 폴리펩티드에 비해 본 개시 내용의 리간드 결합 영역의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 본 개시 내용의 리간드 결합 영역 및/또는 본 개시 내용의 유도제는 비-자연적으로 발생할 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 세포, 트랜스포존 및/또는 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 세포자멸촉진 펩티드를 포함하는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이때 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 리간드 결합 영역은 멀티머 리간드 결합 영역일 수 있다. 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 "iC9 안전 스위치"로서 지칭될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 세포 및/또는 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 카스파아제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파아제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이때 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 세포 및/또는 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 카스파아제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파아제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이때 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파아제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이때 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드, 유도성 카스파아제 폴리펩티드 또는 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드의 특정 구현예에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함할 수 있다. 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다.
특정 구현예에서, FKBP12 폴리펩티드는 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE (SEQ ID NO: 14635)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다.
특정 구현예에서, FKBP12 폴리펩티드는 GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG (SEQ ID NO: 14636)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 구현예에서, 리간드 결합 영역에 대해 특이적인 유도제는 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)을 갖는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 두 합성 약물 AP20187 및/또는 AP1903을 포함한다.
본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드, 유도성 카스파아제 폴리펩티드 또는 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드의 특정 구현예에서, 링커 영역은 GGGGS (SEQ ID NO: 14637)를 포함하는 아미노산, 또는 GGAGGAGGAGGATCC (SEQ ID NO: 14638)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 구현예에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 개시 내용의 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드의 특정 구현예에서, 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 87에서 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드, 유도성 카스파아제 폴리펩티드 또는 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드의 특정 구현예에서, 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드는 위치 282 서열에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드, 유도성 카스파아제 폴리펩티드 또는 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드의 특정 구현예에서, 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드는 GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 14639)를 포함하는 아미노산, 또는 TTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC (SEQ ID NO: 14640)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
폴리펩티드가 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 특정 구현예에서, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS (SEQ ID NO: 14641)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc (SEQ ID NO: 14642)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 세포에서 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 발현을 개시 및/또는 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절 하에서 그 세포에서 발현될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "프로모터"는 유전자를 전사하기 위해 RNA 폴리머라아제에 대한 초기 결합 부위로서 작용하는 프로모터를 지칭한다. 예를 들어, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 비제한적으로 천연, 내인성, 외인성 및 이종 프로모터를 포함하는 포유동물 세포에서 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 발현을 개시 및/또는 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절 하에서 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 바람직한 포유동물 세포는 인간 세포를 포함한다. 따라서, 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 이에 제한되는 것은 아니나 인간 프로모터 또는 바이러스 프로모터를 포함하는, 인간 세포에서 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 발현을 개시 및/또는 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절 하에서, 인간 세포에서 발현될 수 있다. 인간 세포에서 발현을 위한 예시적인 프로모터는 이에 제한되는 것은 아니나, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉각적 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복, β-액틴 프로모터, 래트 인슐린 프로모터 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 프로모터를 포함하고, 이들 각각은 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 고수준 발현을 수득하는 데 사용될 수 있다. 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 발현을 달성하기 위해 당업계에 익히 공지되어진 다른 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 박테리아 파지 프로모터의 사용도 또한 고려되나, 단 발현 수준은 세포에서 세포자멸을 개시하기에 충분하다. 익히 공지된 특성을 가진 프로모터를 활용함으로써, 트랜스펙션 또는 형질전환 후 관심 단백질의 발현 수준 및 패턴이 최적화될 수 있다.
특정 생리적 또는 합성 신호에 반응하여 조절되는 프로모터의 선택은 본 개시 내용의 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드의 유도성 발현을 허용할 수 있다. 엑디손 시스템(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)이 그러한 한 시스템이다. 이 시스템은 포유동물 세포에서 관심 유전자의 조절된 발현을 허용하도록 설계된다. 이것은 사실상 전이유전자의 기본 수준 발현을 허용하지 않지만 200배 이상의 유도성을 허용하는 단단하게 조절된 발현 메카니즘으로 이루어진다. 시스템은 초파리(Drosophila)의 헤테로다이머 엑디손 수용체를 기반으로 하며, 엑디손 또는 유사체, 예컨대 뮤리스테론 A가 상기 수용체에 결합할 때, 수용체는 프로모터를 활성화시켜 하류 전이유전자의 발현을 켜 고수준의 mRNA 전사체가 얻어진다. 이 시스템에서, 헤테로다이머 수용체의 두 모노머는 하나의 벡터로부터 구성적으로 발현되는 반면에 관심 유전자의 발현을 구동시키는 엑디손-반응적 프로모터는 또 다른 플라스미드 상에 존재한다. 이러한 유형의 시스템의 관심 벡터로의 조작이 그리하여 유용할 수 있다. 유용할 수 있는 또 다른 유도성 시스템은 Gossen 및 Bujard가 원래 개발한 Tet-Off™ 또는 Tet-On™ 시스템(Clontech, Palo Alto, Calif.)이다(Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossen et al., Science, 268:1766-1769, 1995). 이 시스템은 또한 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유도체, 예컨대 독시사이클린에 대한 반응으로 높은 수준의 유전자 발현이 조절되도록 한다. Tet-On™ 시스템에서, 독시사이클린의 존재 하에서는 유전자 발현이 켜지는 반면에, Tet-Off™ 시스템에서 유전자 발현은 독시사이클린의 부재 하에서 켜진다. 이들 시스템은 이. 콜라이(E. coli; 대장균)의 테트라사이클린 저항성 오페론으로부터 유래된 2개의 조절 요소, 즉 테트라사이클린 작동자 서열(여기에 테트라사이클린 리프레서가 결합함) 및 테트라사이클린 리프레서 단백질을 기반으로 한다. 관심 유전자는 테트라사이클린-반응성 요소가 존재하는 프로모터 뒤의 플라스미드로 클로닝된다. 제2 플라스미드는 Tet-Off™에서 단순 헤르페스 바이러스로부터의 VP16 도메인 및 야생형 테트라사이클린 리프레서로 이루어진 테트라사이클린-제어 트랜스활성화제(transactivator)라고 불리우는 조절 요소를 함유한다. 따라서, 독시사이클린의 부재 하에서, 전사는 구성적으로 켜진다. Tet-On™ 시스템에서, 테트라사이클린 리프레서는 야생형이 아니며, 독시사이클린의 존재 하에서 전사를 활성화시킨다. 유전자 치료 벡터 생성을 위해, Tet-Off™ 시스템이 이용되어 생성자 세포가 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 하에서 성장될 수 있고, 잠재적으로 독성인 전이유전자의 발현을 방지할 수 있지만, 벡터가 환자에 도입될 때 유전자 발현은 구성적으로 켜질 것이다.
일부 상황에서, 유전자 치료 벡터에서 전이유전자의 발현을 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 다양한 강도의 활성을 지닌 상이한 바이러스 프로모터들이 원하는 발현 수준에 따라 사용된다. 포유동물 세포에서, CMV 즉각적 초기 프로모터가 종종 사용되어 강력한 전사 활성화를 제공한다. CMV 프로모터는 문헌[Donnelly, J. J., et al., 1997. Annu. Rev. Immunol. 15:617-48]에서 검토된다. 덜 강력한 CMV 프로모터의 변형된 버전은 전이유전자의 감소된 수준의 발현이 요구되는 경우에 사용되어 왔다. 조혈 세포에서 전이유전자의 발현이 요구되는 경우, 레트로바이러스 프로모터, 예컨대 MLV 또는 MMTV로부터의 LTR이 종종 사용된다. 원하는 효과에 따라 사용되는 기타 바이러스 프로모터는 SV40, RSV LTR, HIV-1 및 HIV-2 LTR, 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 E1A, E2A, 또는 MLP 영역의 것, AAV LTR, HSV-TK, 및 조류 육종 바이러스를 포함한다.
다른 예에서, 발달적으로 조절되고 특히 분화된 세포에서 활성인 프로모터가 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프로모터는 다능성 줄기 세포에서 활성이 아닐 수 있지만, 예를 들어 다능성 줄기 세포가 더 성숙한 세포 내로 분화되는 경우, 프로모터는 활성화될 수 있다.
유사하게 조직 특이적 프로모터는 비표적화된 조직에 대한 잠재적인 독성 또는 바람직하지 않은 효과를 감소시키기 위해 특정 조직 또는 세포에서 전사를 수행하는 데 사용된다. 이들 프로모터는 CMV 프로모터와 같은 더 강한 프로모터와 비교 시 발현이 감소될 수 있지만, 또한 더욱 제한된 발현 및 면역원성을 초래할 수 있다(Bojak, A., et al., 2002. Vaccine. 20:1975-79; Cazeaux, N., et al., 2002. Vaccine 20:3322-31). 예를 들어, 조직 특이적 프로모터, 예컨대 PSA 관련 프로모터 또는 전립선-특이적 샘 칼리크레인, 또는 근육 크레아틴 키나아제 유전자가 적절한 경우 이용될 수 있다.
조직 특이적 또는 분화 특이적 프로모터의 예는 비제한적으로 B29 (B 세포); CD14 (단핵구 세포); CD43 (백혈구 및 혈소판); CD45 (조혈 세포); CD68 (대식세포); 데스민 (근육); 엘라스타아제-1 (이자외분비세포); 엔도글린 (내피 세포); 피브로넥틴 (분화 세포, 치유 조직); 및 Flt-1 (내피 세포); GFAP (성상 세포)를 포함한다.
특정 적응증에서, 유전자 치료 벡터의 투여 후 특정 시간에 전사를 활성화하는 것이 바람직하다. 이것은 호르몬 또는 사이토카인 조절가능한 것으로서 이러한 프로모터를 이용하여 수행된다. 사용될 수 있는 사이토카인 및 염증성 단백질 반응성 프로모터는 K 및 T 키니노겐 (Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351), c-fos, TNF-알파, C-반응성 단백질 (Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(8), 3195-3207), 합토글로빈 (Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912), 혈청 아밀로이드 A2, C/EBP 알파, IL-1, IL-6 (Poli 및 Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 8202-8206), 보체 C3 (Wilson et al., (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191), IL-8, 알파-1 산 글리코단백질 (Prowse 및 Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51), 알파-1 안티트립신, 리포단백질 리파아제 (Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988), 안지오텐시노겐 (Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895), 피브리노겐, c-jun (TNF-알파, UV 방사선, 레티노산, 및 과산화수소, 포르볼 에스테르에 의해 유도가능), 콜라게나아제(포르볼 에스테르 및 레티노산에 의해 유도됨), 메탈로티오네인 (중금속 및 글루코코르티코이드 유도성), 스트로멜리신 (인터류킨-1, EGF 및 포르볼 에스테르에 의해 유도가능), 알파-2 마크로글로불린 및 알파-1 안티-키모트립신을 포함한다. 기타 프로모터는 예를 들어 SV40, MMTV, 인간 면역결핍 바이러스 (MV), 몰로니 바이러스, ALV, 엡스타인 바 바이러스, 라우스 육종 바이러스 인간 액틴, 미오신, 헤모글로빈 및 크레아틴을 포함한다.
상기 프로모터들 중 임의의 프로모터는 단독으로 또는 또 다른 프로모터와 함께 원하는 작용에 따라 유용할 수 있을 것으로 예상된다. 프로모터 및 다른 조절 요소는 이들이 원하는 세포 또는 조직에서 기능하도록 선택된다. 추가로, 프로모터의 이 목록은 완전한 또는 제한적인 것으로 해석되어서는 안 되고; 다른 프로모터가 본원에 개시된 프로모터 및 방법과 함께 사용된다.
항원 수용체
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 자가 세포는 항원 수용체를 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 벡터는 키메라 항원 수용체 또는 그 일부를 코딩하는 서열을 포함한다. 본 개시 내용의 예시적인 벡터는 비제한적으로 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 플라스미드, 나노플라스미드, 미니써클, 전위 시스템, 리포좀, 폴리머좀, 마이셀, 및 나노입자를 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 또는 그 일부를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스포존은 트랜스포사아제에 의해 자가 세포의 게놈 서열 내로 혼입된다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 공여자 올리고뉴클레오티드 또는 공여자 플라스미드는 키메라 항원 수용체 또는 그 일부를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 공여자 올리고뉴클레오티드 또는 공여자 플라스미드는 단일 또는 이중-가닥 절단 및 선택적으로는 세포-매개 복구 후에 자가 세포의 염색체 서열 내로 완전히 또는 부분적으로 혼입된다.
예시적인 항원 수용체는 세포외 도메인의 부위에서 항원에 결합하고 세포내 도메인을 통해 세포내 신호를 전달 또는 유도하는 비-자연 발생 막횡단 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 비-자연 발생 항원 수용체는 비제한적으로 재조합 변이체, 키메라, 또는 합성 T-세포 수용체(TCR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이체 TCR은 야생형 TCR과 비교 시 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서 하나 이상의 서열 변이를 함유한다. 일부 구현예에서, 합성 TCR은 TCR을 코딩하는 적어도 하나의 합성 또는 변형된 핵산 또는 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 및/또는 키메라 TCR은 서열이 하나 이상의 공급원 서열로부터 단리되거나 유래되기 때문에 전체 길이 또는 그의 일부에 걸쳐 비-자연적으로 발생하는 핵산 또는 아미노산 서열에 의해 코딩된다.
일부 구현예에서, 비-자연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
키메라 항원 수용체
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 자가 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 트랜스포존은 키메라 항원 수용체 또는 그 일부를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 키메라 항원 수용체(CAR)는 (a) 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 하나 이상의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 특정 구현예에서, 엑토도메인은 항원 인식 영역과 막횡단 도메인 사이의 힌지를 추가로 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 신호 펩티드는 인간 CD8α 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8α 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 CD28 및/또는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4, 및/또는 CD4 서열로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다.
CD28 공동자극 도메인은 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 14477)을 포함하는 아미노산 서열 또는 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 14477)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. CD28 공동자극 도메인은 cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg (SEQ ID NO: 14478)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 공동자극 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 14479)을 포함하는 아미노산 서열, 또는 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 14479)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. 4-1BB 공동자극 도메인은 aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg (SEQ ID NO: 14480)을 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 공동자극 도메인은 막횡단 도메인과 CD28 공동자극 도메인 사이에 위치될 수 있다.
본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4, 및/또는 CD4 서열로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 CAR의 특정 구현예에서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 힌지는 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 14481)을 포함하는 인간 CD8α 아미노산 서열, 또는 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 14481)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 가진 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 힌지 아미노산 서열은actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac (SEQ ID NO: 14482)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
ScFv
본 개시 내용은 단일 사슬 가변 단편(scFv) 조성물, 및 특정 표적 단백질을 인식하고 이에 결합하기 위한 이들 조성물의 이용 방법을 제공한다. ScFv 조성물은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. ScFv 조성물은 본 개시 내용의 키메라 항원 수용체의 항원 인식 영역으로 혼입될 수 있다. ScFv는 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이며, VH 및 VL 도메인은 짧은 펩티드 링커로 연결된다. ScFv는 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고 원래 면역글로불린의 특이성을 유지한다. 예시적인 링커는 GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 14483)의 서열을 포함한다.
센티린(Centyrin)
본 개시 내용의 센티린은 항원에 특이적으로 결합한다. 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 센티린을 포함하는 본 개시 내용의 키메라 항원 수용체는 특정 항원에 대해 세포(예, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 지시하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 센티린은 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있고, 이때 스캐폴드는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 개시 내용의 센티린은 하나 이상의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있고, 이때 스캐폴드는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 하나 이상의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인을 인간 단백질로부터 유래될 수 있다. 인간 단백질은 테나신-C일 수 있다. 공통 서열은 LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 14488) 또는 MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 14489)을 포함할 수 있다. 공통 서열은 LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 14488) 또는 MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 14489)과 적어도 74% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 공통 서열은atgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcatcgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctgacagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgtccgcaatcttcaccaca (SEQ ID NO: 14490)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 공통 서열은 (a) 공통 서열의 위치 13-16에서의 아미노산 잔기 TEDS (SEQ ID NO: 14491)를 포함하거나 이로 이루어진 A-B 루프; (b) 공통 서열의 위치 22-28에서의 아미노산 잔기 TAPDAAF (SEQ ID NO: 14492)를 포함하거나 이로 이루어진 B-C 루프; (c) 공통 서열의 위치 38-43에서의 아미노산 잔기 SEKVGE (SEQ ID NO: 14493)를 포함하거나 이로 이루어진 C-D 루프; (d) 공통 서열의 위치 51-54에서의 아미노산 잔기 GSER(SEQ ID NO: 14494)를 포함하거나 이로 이루어진 D-E 루프; (e) 공통 서열의 위치 60-64에서의 아미노산 잔기 GLKPG (SEQ ID NO: 14495)를 포함하거나 이로 이루어진 E-F 루프; (f) 공통 서열의 위치 75-81에서의 아미노산 잔기 KGGHRSN (SEQ ID NO: 14496)를 포함하거나 이로 이루어진 F-G 루프; 또는 (g) (a)-(f)의 임의의 조합 내에 하나 이상의 위치에서 변형될 수 있다. 본 개시 내용의 센티린은 적어도 5개의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인, 적어도 10개의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인 또는 적어도 15개의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함할 수 있다. 스캐폴드는 10-9M 이하, 10-10M 이하, 10-11M 이하, 10-12M 이하, 10-13M 이하, 10-14M 이하, 및 10-15M 이하의 KD로부터 선택된 하나 이상의 친화도를 갖는 항원에 결합할 수 있다. KD는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
용어 "항체 모방체"는 표적 서열에 특이적으로 결합하고 자연적 발생 항체와 구별되는 구조를 갖는 유기 화합물을 설명하기 위한 것이다. 항체 모방체는 단백질, 핵산 또는 소분자를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 항체 모방체가 특이적으로 결합하는 표적 서열은 항원일 수 있다. 항체 모방체는 우수한 용해도, 조직 침투, 열 및 효소에 대한 안정성(예, 효소 분해에 대한 저항성), 및 낮은 제조 비용을 포함하는 그러나 이에 제한되지 않는, 항체보다 우수한 특징을 제공할 수 있다. 예시적인 항체 모방체는 애피바디(affibody), 애필린(afflilin), 애피머(affimer), 애피틴(affitin), 알파바디(alphabody), 안티칼린(anticalin), 및 아비머(avimer; 결합력(avidity) 멀티머로서도 공지됨), DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein), 피노머(Fynomer), Kunitz 도메인 펩티드 및 모노바디(monobody)를 포함한다.
본 개시 내용의 애피바디 분자는 임의의 디술파이드 가교 없이 하나 이상의 알파 나선을 포함하거나 이로 이루어진 단백질 스캐폴드를 포함한다. 바람직하게는, 본 개시 내용의 애피바디 분자는 3개의 알파 나선을 포함하거나 이로 이루어진다. 예를 들어, 본 개시 내용의 애피바디 분자는 면역글로불린 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 애피바디 분자는 단백질 A의 Z 도메인을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 애필린 분자는 예를 들어 감마-B 결정질 또는 유비퀴틴의 노출된 아미노산의 변형에 의해 생성된 단백질 스캐폴드를 포함한다. 애필린 분자는 작용적으로 항원에 대한 항체의 친화성을 모방하지만, 구조적으로 항체를 모방하지 않는다. 애필린을 제조하는 데 사용된 임의의 단백질 스캐폴드에서, 적절하게-폴딩된 단백질 분자에서 용매 또는 가능한 결합 파트너에 접근할 수 있는 아미노산은 노출된 아미노산으로 간주된다. 이들 노출된 아미노산 중 임의의 하나 이상은 표적 서열 또는 항원에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다.
본 개시 내용의 애피머 분자는 특정 표적 서열에 대한 고 친화성 결합 부위를 제공하는 펩티드 루프를 나타내도록 조작된 고도로 안정한 단백질을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 본 개시 내용의 예시적인 애피머 분자는 시스타틴 단백질 또는 이의 3차 구조에 기초한 단백질 스캐폴드를 포함한다. 본 개시 내용의 예시적인 애피머 분자는 역-평행 베타-시트 위에 놓인 알파-나선을 포함하는 공통 3차 구조를 공유할 수 있다.
본 개시 내용의 애피틴 분자는 인공 단백질 스캐폴드를 포함하고, 이의 구조는 예를 들어 DNA 결합 단백질(예를 들어, DNA 결합 단백질 Sac7d)로부터 유래될 수 있다. 본 개시 내용의 애피틴은 항원의 전체 또는 일부일 수 있는 표적 서열을 선택적으로 결합한다. 본 개시 내용의 예시적인 애피틴은 DNA 결합 단백질의 결합 표면 상의 하나 이상의 아미노산 서열을 무작위화하고 생성된 단백질을 리보솜 전시 및 선택에 적용함으로써 제조된다. 본 개시 내용의 애피틴의 표적 서열은 예를 들어 게놈에서, 또는 펩티드, 단백질, 바이러스 또는 박테리아의 표면 상에서 발견될 수 있다. 본 개시 내용의 특정 구현예에서, 애피틴 분자는 효소의 특정 저해제로서 이용될 수 있다. 본 개시 내용의 애피틴 분자는 열-저항성 단백질 또는 그 유도체를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 알파바디 분자는 또한 세포-통과 알파바디(Cell-Penetrating Alphabody; CPAB)로서 지칭될 수 있다. 본 개시 내용의 알파바디 분자는 각종 표적 서열(항원 포함)에 결합하는 작은 단백질(전형적으로 10 kDa 미만)을 포함한다. 알파바디 분자는 세포내 표적 서열에 도달 및 결합할 수 있다. 구조적으로, 본 개시 내용의 알파바디 분자는 단일 사슬 알파 나선(자연 발생 코일형 코일 구조와 유사함)을 형성하는 인공 서열을 포함한다. 본 개시 내용의 알파바디 분자는 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 변형된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 분자의 결합 특이성에 관계 없이, 본 개시 내용의 알파바디 분자는 정확한 폴딩 및 열안정성을 유지한다.
본 개시 내용의 안티칼린 분자는 단백질 또는 소분자에서 표적 서열 또는 부위에 결합하는 인위적인 단백질을 포함한다. 본 개시 내용의 안티칼린 분자는 인간 리포칼린으로부터 유래된 인위적인 단백질을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 안티칼린 분자는 예를 들어 모노클로날 항체 또는 그 단편을 대신하여 사용될 수 있다. 안티칼린 분자는 모노클로날 항체 또는 그 단편보다 더 우수한 조직 침투 및 열안정성을 나타낼 수 있다. 예시적인 본 개시 내용의 안티칼린 분자는 약 20 kDa의 질량을 갖는 약 180개의 아미노산을 포함할 수 있다. 구조적으로, 본 개시 내용의 안티칼린 분자는 루프 및 부착된 알파 나선에 의해 쌍으로 연결된 역평행 베타-가닥을 포함하는 배럴 구조를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 개시 내용의 안티칼린 분자는 루프 및 부착된 알파 나선에 의해 쌍으로 연결된 8개의 역평행 베타-가닥을 포함하는 배럴 구조를 포함한다.
본 개시 내용의 아비머 분자는 (또한 항원일 수 있는) 표적 서열에 특이적으로 결합된 인위적인 단백질을 포함한다. 본 개시 내용의 아비머는 동일한 표적 내 또는 구별되는 표적 내 다중 결합 부위를 인식할 수 있다. 본 개시 내용의 아비머가 하나 초과의 표적을 인식하는 경우, 아비머는 이중특이적 항체의 기능을 모방한다. 인위적인 단백질 아비머는 각각 약 30-35개의 아미노산의 2개 이상의 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 이들 펩티드는 하나 이상의 링커 펩티드를 통해 연결될 수 있다. 아비머의 펩티드의 하나 이상의 아미노산 서열은 막 수용체의 A 도메인으로부터 유래될 수 있다. 아비머는 디술파이드 결합 및/또는 칼슘을 선택적으로 포함할 수 있는 단단한 구조를 갖는다. 본 개시 내용의 아비머는 항체에 비해 더 큰 열 안정성을 나타낼 수 있다.
본 개시 내용의 DARPin(Designed Ankyrin Repeat Protein)은 표적 서열의 고 특이성 및 고 친화성을 가진 유전적으로-조작된, 재조합체, 또는 키메라 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 DARPin은 안키린 단백질로부터 유래되고, 선택적으로 안키린 단백질의 3개 이상의 반복 모티프(또한 반복적 구조 단위로서 지칭됨)를 포함한다. 안키린 단백질은 고-친화성 단백질-단백질 상호작용을 매개한다. 본 개시 내용의 DARPin은 큰 표적 상호작용 표면을 포함한다.
본 개시 내용의 피노머는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래되고 항체와 동일한 친화성 및 동일한 특이성을 가진 표적 서열 및 분자에 결합하도록 조작된 작은 결합 단백질(약 7 kDa)을 포함한다.
본 개시 내용의 Kunitz 도메인 펩티드는 Kunitz 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. Kunitz 도메인은 프로테아제 활성을 저해하기 위한 활성 부위를 포함한다. 구조적으로, 본 개시 내용의 Kunitz 도메인은 디술파이드-풍부 알파+베타 폴드를 포함한다. 이 구조는 소 췌장 트립신 저해제에 의해 예시된다. Kunitz 도메인 펩티드는 특정 단백질 구조를 인식하고 경쟁적 프로테아제 저해제로서 역할한다. 본 개시 내용의 Kunitz 도메인은 엑칼란티드(Ecallantide)(인간 리포단백질-연관 응고 저해제(LACI)로부터 유래됨)를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 모노바디는 단일 사슬 항체와 크기면에서 필적할만한 작은 단백질이다(약 94개의 아미노산을 포함하고, 약 10 kDa의 질량을 가짐). 이들 유전적으로 조작된 단백질은 항원을 포함해 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 본 개시 내용의 모노바디는 하나 이상의 구별되는 단백질 또는 표적 서열을 특이적으로 표적화할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시 내용의 모노바디는 인간 피브로넥틴의 구조를 모방하는 단백질 스캐폴드를 포함하고, 더욱 바람직하게는 피브로넥틴의 제10의 세포외 유형 III 도메인의 구조를 모방하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 피브로넥틴의 제10의 세포외 유형 III 도메인뿐 아니라 그의 모노바디 모방체는 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 해당하는 배럴을 형성하는 7개의 베타 시트 및 각 면에 3개의 노출된 루프를 함유한다. 항체의 가변 도메인의 구조에 대조적으로, 모노바디는 금속 이온에 대한 임의의 결합 부위뿐 아니라 중앙 디술파이드 결합이 결여된다. 다중특이적 모노바디는 루프 BC 및 FG를 변형시킴으로써 최적화될 수 있다. 본 개시 내용의 모노바디는 애드넥틴을 포함할 수 있다.
VHH
특정 구현예에서, CAR은 단일 도메인 항체(SdAb)를 포함한다. 특정 구현예에서, SdAb는 VHH이다.
본 개시 내용은 적어도 하나의 VHH를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다(VCAR). 본 개시 내용의 키메라 항원 수용체는 1개 초과의 VHH를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 VCAR은 2개의 별개의 항원을 특이적으로 결합하는 2개의 VHH를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 VHH 단백질은 항원에 특이적으로 결합한다. 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 VHH을 포함하는 본 개시 내용의 키메라 항원 수용체는 특정 항원에 대해 세포(예, 세포독성 면역 세포)의 특이성을 지시하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시 내용의 하나 이상의 VHH 단백질 또는 VCAR은 당업계에 익히 공지되어 있는 바와 같이, 세포주, 혼합된 세포주, 불멸화 세포 또는 불멸화 세포의 클로날 집단에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]을 참조한다.
VHH 단백질로부터의 아미노산은 당업계에 공지된 바와 같이, 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화성, 온-속도, 오프-속도, 결합력, 특이성, 반감기, 안정성, 용해도 또는 임의의 기타 적합한 특성을 감소, 향상 또는 수정하도록 변경, 부가 및/또는 결실될 수 있다.
선택적으로는, VHH 단백질은 항원에 대한 고 친화성 및 기타 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 조작될 수 있다. 상기 목표를 달성하기 위해, VHH 단백질은 모 서열 및 조작된 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적 조작 생성물의 분석 과정에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 3차원 모델은 시판중에 있으며, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 예시하고 표시하며, 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다(예를 들어, 캘리포니아주 먼로비아 소재 Xencor, Inc.의 Immunofilter 프로그램). 이들 디스플레이를 검사하면 후보 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할, 즉 후보 VHH 단백질의 이것의 항원에 대한 결합 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이 방식으로, 잔기는 표적 항원(들)에 대한 친화도와 같은 원하는 특성이 달성되도록 잔기가 모 및 참조 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 대안적으로, 또는 상기 절차에 부가하여, 다른 적절한 조작 방법이 사용될 수 있다.
유사한 단백질 또는 단편에 대한 특정 결합에 대해 VHH를 스크리닝하는 것은 뉴클레오티드(DNA 또는 RNA 전시) 또는 펩티드 전시 라이브러리, 예를 들어 시험관 내 디스플레이를 이용하여 편리하게 달성될 수 있다. 이 방법은 원하는 기능 또는 구조를 가진 개별 멤버에 대한 펩티드의 대규모 수집품의 스크리닝을 포함한다. 표시된 뉴클레오티드 또는 펩티드 서열은 길이가 3 내지 5000개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산, 흔히 5-100개의 아미노산 길이, 종종 약 8 내지 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 직접적인 화학적 방법 외에도 몇 가지 재조합 DNA 방법이 설명되어 있다. 한 유형은 박테리오파지 또는 세포의 표면에 펩티드 서열의 전시를 포함한다. 세포의 각 박테리오파지 또는 세포는 특정 전시된 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 개시 내용의 VHH 단백질은 광범위한 친화도(KD)로 인간 또는 기타 포유동물 단백질을 결합할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시 내용의 적어도 하나의 VHH는 당업자에 의해 실행되는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명 또는 Kinexa 방법에 의해 결정된 바, 높은 친화도로, 예를 들어 약 10-7 M 이하, 예컨대 비제한적으로 0.1-9.9 (또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의 KD로 표적 단백질에 선택적으로 결합할 수 있다.
항원에 대한 VHH 또는 VCAR의 친화도 또는 결합력은 임의의 적합한 방법을 이용하여 실험적으로 결정될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)]; 및 본원에 기재된 방법 참조). 특정 VHH-항원 또는 VCAR-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예, 염 농도, pH) 하에서 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원-결합 매개변수(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게 VHH 또는 VCAR 및 항원의 표준화된 용액 및 표준화된 버퍼, 예컨대 본원에 기재된 버퍼로 수행된다.
어떤 단백질, 항체 및 기타 안타고니스트(antagonist)가 본 개시 내용의 VHH 또는 VCAR과 표적 단백질과의 결합에 대해 경쟁하고/하거나 에피토프 영역을 공유하는지 결정하기 위해, 본 개시 내용의 VHH 또는 VCAR로 경쟁적 어세이가 수행될 수 있다. 당업자에게 쉽게 알려진 이러한 어세이는 단백질 상 제한된 수의 결합 부위에 대한 안타고니스트 또는 리간드 간의 경쟁을 평가한다. 단백질 및/또는 항체는 경쟁 전 또는 후에 고정되거나 불용화되고, 표적 단백질에 결합된 샘플은 예를 들어 디캔팅(단백질/항체가 사전불용화된 경우) 또는 원심분리(단백질/항체가 경쟁적 반응 후에 침전되는 경우)에 의해 비결합된 샘플로부터 분리된다. 또한, 경쟁적 결합은 VHH 또는 VCAR의 표적 단백질에 대한 결합, 또는 그 결합의 결여에 의해 기능이 변경되는지 여부, 예를 들어 VCAR 분자가 예를 들어 표지의 효소적 활성을 저해 또는 강력하게 하는지 여부에 의해 결정될 수 있다. ELISA 및 기타 기능적 어세이가 당업계에 익히 공지된 바 이용될 수 있다.
VH
특정 구현예에서, CAR은 단일 도메인 항체(SdAb)를 포함한다. 특정 구현예에서, SdAb는 VH이다.
본 개시 내용은 단일 도메인 항체(VCAR)를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 특정 구현예에서, 단일 도메인 항체는 VH를 포함한다. 특정 구현예에서, VH는 인간 서열로부터 단리되거나 유래된다. 특정 구현예에서, VH는 인간 CDR 서열 및/또는 인간 골격부 서열 및 비인간 또는 인간화 서열(예, 래트 Fc 도메인)을 포함한다. 특정 구현예에서, VH는 완전 인간화된 VH이다. 특정 구현예에서, VH는 자연 발생 항체도 아니고 자연 발생 항체의 단편도 아니다. 특정 구현예에서, VH는 모노클로날 항체의 단편이 아니다. 특정 구현예에서, VH는 UniDabTM 항체(TeneoBio)이다.
특정 구현예에서, VH는 VH를 생성하기 위해 UniRatTM (TeneoBio) 시스템 및 "NGS-기반 발견"을 이용하여 완전히 조작된다. 이 방법을 이용하여, 특정 VH는 자연적으로 발생하지 않으며, 완전히 조작된 시스템을 이용하여 생성된다. VH는 숙주(예를 들어, 마우스, 래트 또는 인간)로부터 직접 또는 세포 또는 세포주의 단일 클론(하이브리도마)으로부터 직접 분리된 자연-발생 단일클론 항체(mAb)로부터 유래되지 않는다. 이들 VH는 상기 세포주로부터 후속적으로 클로닝되지 않았다. 대신, VH 서열은 래트 Fc 도메인을 갖는 인간 가변 영역(VH 도메인)을 포함하는 전이유전자로서 UniRat™ 시스템을 이용하여 완전히-조작된, 그리하여 경쇄가 없는 인간/래트 키메라이며, 표준 mAb 포맷과 다르다. 천연 래트 유전자는 녹아웃되고, 래트에서 발현된 항체만이 래트 Fc에 연결된 VH 도메인을 가진 전이유전자에서 온 것이다(UniAb). 이것들은 UniRat에서 발현된 독점적인 Ab이다. 차세대 시퀀싱(NGS) 및 생물정보학이 면역화 후 UniRat™에 의해 생성된 중쇄 항체의 전체 항원-특이적 레퍼토리를 식별하는 데 사용된다. 이어서, 고유의 유전자 어셈블리 방법이 항체 레퍼토리 서열 정보를 다양한 기능에 대해 시험관 내 스크링될 수 있는 완전-인간 중쇄 항체의 대규모 수집품으로 전환시키는 데 이용된다. 특정 구현예에서, 완전 인간화 VH는 (비-자연 발생 재조합 VH 항체를 제조하기 위해) 인간 VH 도메인을 시험관 내 인간 Fc와 융합함으로써 생성된다. 특정 구현예에서, VH는 완전히 인간화되지만, 이들은 인간/래트 키메라로서(인간 VH, 래트 Fc) 경쇄 없이 생체 내 발현된다. 완전히 인간화된 VH는 인간/래트 키메라(인간 VH, 래트 Fc)가 경쇄 없이 약 80 kDa (vs 150 kDa)이므로 생체 내에서 발현된다.
본 개시 내용의 VCAR은 본 개시 내용의 하나 이상의 VH를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 VH는 변형되어 Fc 도메인 또는 그 부분을 제거할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 VH의 골격부 서열은 예를 들어 발현을 개선시키거나, 면역원성을 감소시키거나 기능을 개선시키도록 변형될 수 있다.
본 개시 내용 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 다수의 이러한 방법을 포함하고, "용량"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 용량 및 이의 등가물에 대한 언급 등을 포함한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용가능한 오류 범위 내를 의미하고, 이는 예를 들어 측정 시스템의 한계와 같이 값을 측정 또는 결정하는 방법에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 1개 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 또는 최대 10%, 또는 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 열배 내, 바람직하게는 5배 내, 더욱 바람직하게는 2배 내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구 범위에서 기술되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내에서 의마한다고 가정되어져야 한다.
본 개시 내용은 단리되거나 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 조성물을 제공한다. "단리된" 또는 "정제된" 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 부분은 이것의 자연 발생 환경에서 발견되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 정상적으로 동반되거나 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없다. 따라서, 단리된 또는 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질은, 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다. 최적으로, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 그 폴리뉴클레오티드가 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 폴리뉴클레오티드(즉, 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단 위치에 있는 서열)에 자연적으로 플랭킹하는 서열(최적으로 단백질 코딩 서열)이 없다. 예를 들어, 각종 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 그 폴리뉴클레오티드가 유래된 세포의 게놈 DNA에서 이 폴리뉴클레오티드를 자연적으로 플랭킹하는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 실질적으로 세포 물질이 없는 단백질은 오염 단백질이 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% (건조 중량 기준) 미만인 단백질 제제를 포함한다. 본 개시 내용의 단백질 또는 생물학적으로 활성인 이의 부분이 재조합적으로 제조될 때, 최적으로 배양 배지는 화학적 전구체 또는 관심 화학물질의 비단백질의 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% (건조 중량 기준) 미만을 나타낸다.
본 개시 내용은 개시된 DNA 서열의 단편 및 변이체 및 이들 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질을 제공한다. 본 개시 내용을 통해 사용된 바, 용어 "단편"은 DNA 서열의 일부 또는 아미노산 서열의 일부를 지칭하고, 그리하여 이로써 코딩되는 단백질을 지칭한다. 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열의 단편은 천연 단백질의 생물학적 활성 및 이에 따라 본원에 기재된 바와 같은 표적 DNA 서열에 대한 DNA 인식 또는 결합 활성을 보유하는 단백질 단편을 코딩할 수 있다. 대안적으로, 하이브리드화 프로브로서 유용한 DNA 서열의 단편은 일반적으로 생물학적 활성을 보유하거나 프로모터 활성을 보유하지 않는 단백질을 코딩하지 않는다. 따라서, DNA 서열의 단편은 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 및 최대로는 전장인 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드 범위일 수 있다.
본 개시 내용의 핵산 또는 단백질은 후속적으로 최종 목적지 벡터로 어셈블리될 수 있는 표적 벡터에서 모노머 단위 및/또는 반복 단위를 사전어셈블링하는 것을 포함하는 모듈식 접근법에 의해 구축될 수 있다. 본 개시 내용의 폴리펩티드는 본 개시 내용의 반복 모노머를 포함할 수 있고, 후속적으로 최종 목적지 벡터로 어셈블리될 수 있는 표적 벡터에서 반복 단위를 사전어셈블링에 의한 모듈식 접근법에 의해 구축될 수 있다. 본 개시 내용은 이 방법에 의해 생성된 폴리펩티드뿐 아니라 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시 내용은 상기 모듈식 접근법에 의해 생성된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 유기체 및 세포를 제공한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 특히 단일 모노클로날 항체(아고니스트 및 안타고니스트 항체를 포함) 및 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물을 포함한다. 본원에서 정의된 바와 같은 항체의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이, 변이체, 대립유전자, 상동체 및 이종상동체(본원에서는 총칭하여 "유사체"로 지칭됨)를 이용하는 것은 또한 본원의 범위 내에 존재한다. 따라서, 본원에서 하나의 구현예에 따르면, 용어 "본원의 항체"는 이것의 가장 넓은 의미에서 이러한 유사체를 포함한다. 일반적으로, 이러한 유사체에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 항체와 비교할 때 대체, 결실 및/또는 부가되어져 있을 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같은 "항체 단편" 및 이의 모든 문법적 변이체는 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부로서 정의되고, 이때 상기 일부는 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 아이소타입에 따라 CH2, CH3, 및 CH4)이 결여되어 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 비제한적으로 하기를 포함하는, 연속의 아미노산 잔기의 중단되지 않는 서열로 이루어진 1차 구조를 가진 폴리펩티드인 임의의 항체 단편(본원에서 "단일-사슬 항체 단편" 또는 "단일 사슬 폴리펩티드"): (1) 단일-사슬 Fv(scFv) 분자 (2) 연관된 중쇄 모이어티 없이 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 포함하는 오직 하나의 경쇄 가변 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 단일 사슬 폴리펩티드, 및 (3) 연관된 경쇄 모이어티 없이, 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 포함하는 오직 하나의 중쇄 가변 영역 또는 그 단편을 함유하는 단일 사슬 폴리펩티드; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 또는 다가 구조를 포함한다. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편에서, 중쇄(들)는 온전한 항체의 비-Fc 영역에서 발견된 임의의 불변 도메인 서열(예, IgG 아이소타입에서 CHI)을 포함할 수 있고/있거나 온전한 항체에서 발견된 임의의 힌지 영역 서열을 포함할 수 있고/있거나 중쇄(들)의 불변 도메인 서열 또는 힌지 영역 서열에 융합되어 있거나 위치된 류신 지퍼 서열을 포함할 수 있다. 용어는 (예를 들어, 낙타류로부터의 것인) 일반적으로 단일 모노머 가변 항체 도메인을 가진 항체 단편으로 지칭되는 단일 도메인 항체("sdAB")를 추가로 포함한다. 이러한 항체 단편 유형은 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다.
"결합"은 거대분자들 사이(예를 들어, 단백질과 핵산 사이)의 서열-특이적, 비공유 상호작용을 지칭한다. 결합 상호작용의 모든 구성요소는 전체로서의 상호작용이 서열-특이적인 한 서열-특이적일 필요는 없다(예를 들어, DNA 백본 내 포스페이트 잔기와의 접촉).
용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소들을 포함하지만 다른 것들을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용 시 "본질적으로 이루어진"이란, 의도된 목적을 위해 사용 시 조합에 임의의 필수적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같은 요소를 본질적으로 이루는 조성물은 미량의 오염물질 또는 불활성 담체를 배제하지 않는다. "로 이루어진"이란 다른 성분들 및 실질적인 방법 단계의 미량 요소 이상을 배제하는 것을 의미한다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의된 구현예는 본 개시 내용의 범위 내에 있다.
용어 "에피토프"는 폴리펩티드의 항원성 결정인자를 지칭한다. 에피토프는 에피토프에 고유한 공간적 형태로 3개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산으로 이루어지고, 및 더욱 통상적으로 적어도 8, 9, 또는 10개의 이러한 아미노산으로 이루어진다. 아미노산의 공간적 형태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다.
본원에서 이용된 바, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속해서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA에서 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보의 유전자 생성물로의 전환을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, shRNA, 마이크로 RNA, 구조적 RNA 또는 RNA의 임의의 기타 유형) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조정" 또는 "조절"은 유전자의 활성에서 변화를 지칭한다. 발현의 조절은 이에 제한되는 것은 아니나 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된" 또는 그 등가물(예를 들어, "작동적으로 연결되어진")은 둘 이상의 분자가 하나 또는 둘 모두의 분자 또는 그 조합에 기인하는 기능에 영향을 미치도록 상호작용할 수 있도록 서로에 대해 위치되어 있음을 의미한다.
비공유적으로 연결된 성분 및 비공유적으로 연결된 성분을 제조하고 이용하는 방법이 개시된다. 다양한 성분들은 본원에서 설명된 바와 같이 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 비공유적으로 연결된(즉, 작동적으로 연결된) 단백질은 당업계에서 하나 이상의 문제를 피하는 일시적인 상호작용을 허용하기 위해 사용될 수 있다. 비공유적으로 연결된 성분, 예컨대 단백질의 결합 및 해리하는 능력은 기능적 연관을 가능하게 하는데, 이러한 연관이 원하는 활성에 요구되는 상황 하에서만 또는 주로 가능하게 한다. 연결은 원하는 효과를 허용하기에 충분한 기간일 수 있다.
유기체의 게놈에서 특정 유전자좌로 단백질을 지시하는 방법이 개시되어 있다. 방법은 DNA 국소화 성분을 제공하고 이펙터 분자를 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 DNA 국소화 성분 및 이펙터 분자는 비공유 연결을 통해 작동적으로 연결될 수 있다.
용어 "scFv"는 단일-사슬 가변 단편이다. scFv는 링커 펩티드로 연결된, 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커 펩티드는 약 5 내지 40개의 아미노산, 또는 약 10 내지 30개의 아미노산 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개의 아미노산 길이일 수 있다. 단일-사슬 가변 단편은 완전 항체 분자에서 발견된 불변 Fc 영역이 결여되어 있고, 따라서 항체를 정제하는 데 사용되는 공통 결합 부위(예, 단백질 G)가 결여되어 있다. 상기 용어는 세포의 세포질에서 안정적이고, 세포내 단백질에 결합할 수 있는 항체인 인트라바디인 scFv를 포함한다.
용어 "단일 도메인 항체"는 특정 항원에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 단일 모노머 가변 항체 도메인을 가진 항체 단편을 의미한다. 단일-도메인 항체는 일반적으로 전체 항체와 유사한 항원 친화성을 가지나, 내열성이 높고 세제 및 고농도 우레아에 대해 안정적인 공통 IgG 또는 중쇄 항체의 하나의 가변 도메인(VH)를 포함하는 약 110개의 아미노산 길이의 펩티드 사슬이다. 예는 낙타류 또는 어류 항체로부터 유래된 것이다. 대안적으로, 단일-도메인 항체는 4개의 사슬을 가진 통상의 뮤린 또는 인간 IgG로부터 제조될 수 있다.
유전자 전달 방법
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 전달 또는 도입 단계 동안 버퍼 또는 기타 배지 1 밀리리터 당 250x106개의 1차 인간 T 세포의 확장가능 비율을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 전기천공 또는 뉴클레오펙션에 의해 세포로 전달 또는 도입된다. 일부 구현예에서, 전달 또는 도입 단계는 전기천공 또는 뉴클레오펙션을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 전기천공 또는 뉴클레오펙션 외의 방법에 의해 세포로 전달 또는 도입된다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기천공, 스핀-펙션(spin-fection), 공동-배양, 트랜스펙션, 기계적 전달, 음파 전달, 진동 전달, 마그네토펙션 중 하나 이상에 의해, 또는 나노입자-매개 전달에 의해 전달 또는 도입된다. 일부 구현예에서, 전달 또는 도입 단계는 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기천공, 스핀-펙션, 공동-배양, 트랜스펙션, 기계적 전달, 음파 전달, 진동 전달, 마그네토펙션 중 하나 이상, 또는 나노입자-매개 전달을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 리포좀 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 푸진 트랜스펙션 및 덴드리머-매개 트랜스펙션에 의해 전달 또는 도입된다. 일부 구현예에서, 전달 또는 도입 단계는 리포좀 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 푸진 트랜스펙션 및 덴드리머-매개 트랜스펙션 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 기계적 트랜스펙션에 의해 전달 또는 도입되며, 세포 압착, 세포 충격(bombardment) 또는 유전자 총 기술을 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 또는 도입 단계는 기계적 트랜스펙션, 세포 압착, 세포 충격 또는 유전자 총 기술 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 조성물은 리포좀 전달, 마이셀에 의한 전달 및 폴리머로솜에 의한 전달을 포함하는 나노입자-매개 트랜스펙션에 의해 전달 또는 도입된다. 일부 구현예에서, 전달 또는 도입 단계는 리포좀 전달, 마이셀에 의한 전달 및 폴리머로솜에 의한 전달 중 하나 이상을 포함한다.
핵산의 구축
본 개시 내용의 단리된 핵산은 당분야에서 잘 공지된 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기법, (c) 정제 기법 및/또는 (d) 이들의 조합을 이용함으로써 제조될 수 있다.
핵산은 편리하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 이외의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 핵산 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중클로닝 부위를 핵산 내로 삽입하여 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열을 삽입하여 본 개시 내용의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 예를 들면, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 개시 내용의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 개시 내용의 핵산은 임의적으로 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
추가 서열을 이러한 클로닝 및/또는 발현 서열에 추가하여 클로닝 및/또는 발현에 있어서 이들의 작용을 최적화함으로써, 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있거나, 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 도입을 개선할 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 당분야에서 잘 공지되어 있다. (예를 들면, 상기 문헌[Ausubel]; 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
핵산을 구축하는 재조합 방법
본 개시 내용의 단리된 핵산 조성물, 예컨대, RNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합은 당분야에서 숙련된 자에게 공지된 임의의 수의 클로닝 방법을 이용함으로써 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 엄격한 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 프로브는 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 확인하는 데 사용된다. RNA의 단리, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 잘 공지되어 있다. (예를 들면, 상기 문헌[Ausubel]; 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
핵산 스크리닝 및 단리 방법
본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드의 서열에 기반한 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 하이브리드화시켜 동일한 또는 상이한 유기체에서 상동성 유전자를 단리하는 데 사용될 수 있다. 당분야에서 숙련된 자는 하이브리드화의 다양한 엄격도가 어세이에서 사용될 수 있고, 하이브리드화 또는 세척 매질이 엄격할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 하이브리드화를 위한 조건이 더 엄격해질수록, 이중체 형성이 일어나기 위해서는 프로브와 표적 사이에 더 큰 정도의 상보성이 있어야 한다. 엄격도는 온도, 이온 강도, pH 및 부분적 변성 용매, 예컨대, 포름아미드의 존재 중 하나 이상에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 하이브리드화의 엄격도는 예를 들면, 포름아미드의 농도를 0% 내지 50%의 범위 내에서 조작하여 반응물 용액의 극성을 변화시킴으로써 편리하게 변경된다. 검출 가능한 결합을 위해 요구되는 상보성(서열 동일성)의 정도는 하이브리드화 매질 및/또는 세척 매질의 엄격도에 따라 달라질 것이다. 상보성의 정도는 최적으로 100%, 또는 70% 내지 100%, 또는 이 범위 내의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머의 미미한 서열 변이는 하이브리드화 및/또는 세척 매질의 엄격도를 감소시킴으로써 보상될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
RNA 또는 DNA 증폭 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있고, 본원에 제시된 교시 및 지침에 기반하여, 과도한 실험 없이 본 개시에 따라 이용될 수 있다.
공지된 DNA 또는 RNA 증폭 방법은 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 및 관련 증폭 방법(예를 들면, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호(Mullis, et al.); 미국 특허 제4,795,699호 및 제4,921,794호(Tabor, et al); 미국 특허 제5,142,033호(Innis); 미국 특허 제5,122,464호(Wilson, et al.); 미국 특허 제5,091,310호(Innis); 미국 특허 제5,066,584호(Gyllensten, et al); 미국 특허 제4,889,818호(Gelfand, et al); 미국 특허 제4,994,370호(Silver, et al); 미국 특허 제4,766,067호(Biswas); 미국 특허 제4,656,134호(Ringold) 참조), 및 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭(미국 특허 제5,130,238호(Malek, et al), 상표명 NASBA)을 포함하나, 이들로 제한되지 않고, 이 참고문헌들의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. (예를 들면, 상기 문헌[Ausubel]; 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
예를 들면, 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR) 기술은 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드 및 관련 유전자의 서열을 직접적으로 증폭하는 데 이용될 수 있다. PCR 및 다른 시험관내 증폭 방법은 예를 들면, 발현될 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 클로닝, 샘플에서 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용할 핵산의 제조, 핵산 서열분석, 또는 다른 목적에 유용할 수도 있다. 시험관내 증폭 방법을 통해 숙련된 자를 안내하기에 충분한 기법의 예는 상기 문헌[Berger], 상기 문헌[Sambrook] 및 상기 문헌[Ausubel]뿐만 아니라, 미국 특허 제4,683,202호(Mullis, et al.)(1987) 및 문헌[Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods 및 Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)]에서도 확인된다. 상업적으로 입수가능한 게놈 PCR 증폭용 키트는 당분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 어드밴티지(Advantage)-GC 게놈 PCR 키트(Clontech)를 참조한다. 추가로, 예를 들면, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)을 사용하여 긴 PCR 생성물의 수율을 개선할 수 있다.
핵산 구축을 위한 합성 방법
본 개시 방법의 단리된 핵산은 공지된 방법에 의한 직접적인 화학적 합성에 의해 제조될 수도 있다(예를 들면, 상기 문헌[Ausubel, et al.,] 참조). 화학적 합성은 일반적으로 상보적 서열과의 하이브리드화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하는 DNA 폴리머라아제에 의한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 당분야에서 숙련된 자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개 이상의 염기의 서열로 제한될 수 있지만, 더 긴 서열이 더 짧은 서열의 라이게이션에 의해 수득될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트
본 개시 내용은 본 개시 내용의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트도 제공한다. 본 개시 내용의 핵산 서열, 예를 들면, 본 개시 내용의 CARTyrin을 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 구축하는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도된 숙주 세포에서 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드의 전사를 유도할 전사 개시 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 이종 프로모터 및 비-이종(즉, 내인성) 프로모터 둘 다가 본 개시 내용의 핵산의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터, 인핸서 또는 다른 요소로서 사용되는 단리된 핵산을 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드의 비-이종 형태의 적절한 위치(업스트림, 다운스트림 또는 인트론)에 도입하여, 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향 또는 하향 조절할 수 있다. 예를 들면, 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체내 또는 시험관내에서 변경될 수 있다.
벡터 및 숙주 세포
본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전적으로 조작된 숙주 세포, 및 당업계에 익히 공지된 바와 같은 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 서열의 제조에 관한 것이다. 예를 들어 상기 문헌[Sambrook, et al.]; 상기 문헌[Ausubel, et al.]을 참조하며, 이들 각각은 본원에서 참조로 통합되어 있다.
예를 들어, PB-EF1a 벡터가 이용될 수 있다. 벡터는 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
Figure pct00110
Figure pct00111
폴리뉴클레오티드는 선택적으로 숙주에서 증식을 위한 선택 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 칼슘 포스페이트 침전물과 같은 침전물에서, 또는 하전된 지질을 가진 복합체에서 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 이것은 적절한 패키징 세포주를 이용하여 시험관 내 패키징된 다음 숙주 세포내로 도입될 수 있다.
DNA 삽입물은 적절한 프로모터에 작동적으로 연결되어져야 한다. 발현 구축물은 전사 개시, 종결을 위한 부위, 및 전사된 영역 내의 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 포함할 것이다. 상기 구축물에 의해 발현된 성숙 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 시작 부위의 번역 개시 코돈, 및 번역될 mRNA의 말단에 적절하게 위치된 종결 코돈(예를 들면, UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 것이고, 이때 UAA 및 UAG가 포유동물 또는 진핵생물 세포 발현을 위해 바람직하다.
발현 벡터는 바람직하게는, 그러나 선택적으로 적어도 하나의 선택 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커는 예를 들면, 앰피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 마이코페놀산 또는 글루타민 신테타아제(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 및 제5,827,739호), 블라스티시딘(blasticidin)(bsd 유전자), 진핵생물 세포 배양을 위한 내성 유전자뿐만 아니라, 앰피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리트로마이신, 폴리믹신 B, 또는 이. 콜라이 및 다른 세균 또는 원핵생물에서의 배양을 위한 테트라사이클린 내성 유전자도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다(상기 특허들은 전체적으로 본원에 참고로 포함됨). 전술된 숙주 세포에 적합한 배양 배지 및 조건은 당분야에서 공지되어 있다. 적합한 벡터는 숙련된 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 숙주 세포 내로의 벡터 구축물의 도입은 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 양이온성 지질 매개 트랜스펙션, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 당분야, 예컨대, 상기 문헌[Sambrook]의 제1장 내지 제4장 및 제16장 내지 제18장; 상기 문헌[Ausubel]의 제1장, 제9장, 제13장, 제15장 및 제16장에 기재되어 있다.
발현 벡터는 바람직하게는, 그러나 선택적으로 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선택 세포 표면 마커를 포함할 것이다. 본 개시 내용의 선택 세포 표면 마커는 표면 단백질, 당단백질, 또는 세포 또는 세포의 서브세트를 세포의 또 다른 한정된 서브세트와 구별하는 일군의 단백질들을 포함한다. 바람직하게는, 선택 세포 표면 마커는 본 개시 내용의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를, 본 개시 내용의 조성물 또는 방법에 의해 비변형된 세포와 구별한다. 이러한 세포 표면 마커는 예를 들면, "지정의 클러스터" 또는 "분류 결정인자" 단백질(종종 "CD"로서 약칭됨), 예컨대, 절단형 또는 전체 길이 형태의 CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 세포 표면 마커는 자살 유전자 마커 RQR8(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87)을 추가로 포함한다.
발현 벡터는 바람직하게는, 그러나 선택적으로 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포의 단리를 위한 적어도 하나의 선택 약물 내성 마커를 포함할 것이다. 본 개시 내용의 선택 약물 내성 마커는 야생형 또는 돌연변이체 Neo, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 적어도 하나의 서열은 변형된 형태, 예컨대, 융합 단백질로 발현될 수 있고, 분비 신호뿐만 아니라 추가 이종 기능 영역도 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역을 서열의 N-말단에 추가하여, 정제 동안 또는 후속 취급 및 저장 동안 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 개선할 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티를 본 개시 내용의 서열에 추가하여 정제를 용이하게 할 수 있다. 이러한 영역은 서열 또는 이의 적어도 하나의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 많은 표준 실험실 매뉴얼들, 예컨대, 상기 문헌[Sambrook]의 제17.29장 내지 제17.42장 및 제18.1장 내지 제18.74장; 및 상기 문헌[Ausubel]의 제16장, 제17장 및 제18장에 기재되어 있다.
당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 본 개시 내용의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 위해 사용될 수 있는 다수의 발현 시스템들을 잘 알고 있다. 대안적으로, 본 개시 내용의 핵산은 본 개시 내용의 내인성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 (조작에 의해) 켜짐으로써 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호 및 제5,733,761호에 기재되어 있는 바와 같이 당분야에서 잘 공지되어 있다.
단백질, 이의 특정된 부분 또는 변이체의 생성에 유용한 예시적 세포 배양물은 당분야에서 공지된 세균, 효모 및 포유동물 세포이다. 포유동물 세포 시스템은 종종 세포의 단층의 형태로 존재할 것이지만, 포유동물 세포 현탁액 또는 생물반응기도 사용될 수 있다. 온전한 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주들은 당분야에서 개발되었고, 예를 들면, 버지니아주 마나사스 소재의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(www.atcc.org)으로부터 용이하게 입수될 수 있는 COS-1(예를 들면, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들면, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들면, ATCC CRL-10), CHO(예를 들면, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들면, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 림프 유래 세포, 예컨대, 골수종 및 림프종 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 수탁번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 수탁번호 CRL-1851)이다. 특히 바람직한 구현예에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.
이 세포들을 위한 발현 벡터는 하기 발현 조절 서열들, 예컨대, 복제 기점; 프로모터(예를 들면, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호 및 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 프로모터; 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예컨대, 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들면, SV40 큰 T Ag 폴리A 추가 부위); 및 전사 터미네이터 서열(그러나, 이들로 제한되지 않음) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌[Ausubel et al.]; 및 상기 문헌[Sambrook, et al.]을 참조한다. 본 개시 내용의 핵산 또는 단백질의 생성에 유용한 다른 세포는 예를 들면, 세포주 및 하이브리도마의 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 카탈로그(www.atcc.org), 또는 다른 공지된 또는 상업적 공급원으로부터 공지되어 있고/있거나 입수될 수 있다.
진핵생물 숙주 세포가 사용될 때, 폴리아데닐화 또는 전사 터미네이터 서열이 전형적으로 벡터 내에 포함된다. 터미네이터 서열의 일례는 소 성장 호르몬 유전자로부터의 폴리아데닐화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 일례는 SV40으로부터의 VP1 인트론이다(Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). 추가로, 당분야에서 공지된 바와 같이, 숙주 세포에서 복제를 조절하는 유전자 서열이 벡터 내에 포함될 수 있다.
아미노산 코드
본 개시 내용의 조성물을 구성하는 아미노산은 종종 약칭된다. 아미노산 표기는 당분야에서 잘 이해되는 바와 같이 아미노산을 그의 단일 문자 코드, 그의 세 문자 코드, 명칭, 또는 3개 뉴클레오티드 코돈(들)으로 표기함으로써 표시될 수 있다(문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994] 참조). 본 개시 내용의 CARTyrin은 본원에 특정된 바와 같이 자연발생적 또는 돌연변이 및/또는 인간 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 추가를 포함할 수 있다. 기능을 위해 필수적인, 본 개시 내용의 조성물의 아미노산은 당분야에서 공지된 방법, 예컨대, 부위 지정 돌연변이유발 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 확인될 수 있다(예를 들면, 상기 문헌[Ausubel], 제8장 및 제15장; 문헌[Cunningham 및 Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]). 후자 절차인 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 분자의 모든 잔기에서 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그 다음, 생물학적 활성, 예컨대, 적어도 하나의 중화 활성(그러나, 이것으로 제한되지 않음)에 대해 생성된 돌연변이체 분자를 시험한다. CSR 또는 CAR 결합에 결정적인 부위도 구조 분석, 예컨대, 결정화, 핵 자기 공명 또는 광친화성 라벨링에 의해 확인될 수 있다(문헌[Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992)] 및 문헌[de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)]).
숙련된 자가 인식할 바와 같이, 본 개시 내용은 적어도 하나의 본 개시 내용의 생물학적 활성 단백질을 포함한다. 생물학적 활성 단백질은 천연(비-합성), 내인성 또는 관련 공지된 단백질의 비활성의 적어도 20%, 30% 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90% 또는 95% 내지 99% 이상의 비활성을 가진다. 효소 활성 및 기질 특이성의 측정치를 어세이하고 정량하는 방법은 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 유기 모이어티의 공유 부착에 의해 변형된, 본원에 기재된 센티린 및 단편에 관한 것이다. 이러한 변형은 개선된 약동학적 성질(예를 들면, 증가된 생체내 혈청 반감기)를 가진 단백질 단편을 생성할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지된 친수성 중합체 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 특정 구현예에서, 친수성 중합체 기는 약 800 내지 약 120,000 달톤의 분자량을 가질 수 있고 폴리알칸 글리콜(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG)), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 기는 약 8개 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 서열 및 단편은 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 공유결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 서열 또는 이의 단편에 결합된 각각의 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노카르복실산 및 디카르복실산을 포괄한다. 본원에서 사용된 용어 "친수성 중합체 기"는 옥탄보다 물에서 더 잘 용해될 수 있는 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들면, 폴리리신은 옥탄보다 물에서 더 잘 용해될 수 있다. 따라서, 폴리리신의 공유부착에 의해 변형된 서열은 본 개시 내용에 의해 포괄된다. 본 개시 내용의 서열을 변형시키기에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지된 친수성 중합체일 수 있고, 예를 들면, 폴리알칸 글리콜(예를 들면, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물(예를 들면, 덱스트란, 셀룰로스, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 등), 친수성 아미노산의 중합체(예를 들면, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파르테이트 등), 폴리알칸 옥시드(예를 들면, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는 본 개시 내용의 서열을 변형시키는 친수성 중합체는 별개의 분자 독립체로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 가진다. 예를 들면, 숫자가 달톤 단위의 중합체 평균 분자량인 PEG5000 및 PEG20,000이 사용될 수 있다. 친수성 중합체 기는 1개 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환된 친수성 중합체는 적합한 방법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 아민 기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예를 들면, N,N-카르보닐 디이미다졸에 의해 활성화됨)는 중합체 상의 히드록실 기에 커플링될 수 있다.
백혈구성분채집술 생성물로부터의 T 세포 단리
백혈구성분채집술 생성물 또는 혈액은 폐쇄된 시스템 및 표준 방법(예를 들면, COBE 스펙트라 성분채집술 시스템)을 이용함으로써 임상 장소에서 대상체로부터 수집될 수 있다. 바람직하게는, 상기 생성물은 표준 병원 또는 기관 백혈구성분채집술 절차에 따라 표준 백혈구성분채집술 수집 백 내에 수집된다. 예를 들면, 본 개시 내용의 방법의 바람직한 구현예에서, 백혈구성분채집술 동안 통상적으로 사용되는 항응고제 또는 혈액 첨가제 이외의 추가 항응고제 또는 혈액 첨가제(헤파린 등)는 포함되지 않는다.
대안적으로, 백혈구 세포(WBC)/말초 혈액 단핵 세포(PBMC)(바이오세이프 세팍스(Biosafe Sepax) 2(폐쇄/자동화됨)를 이용함) 또는 T 세포(CliniMACS® 프로디지(Prodigy)(폐쇄/자동화됨)를 이용함)는 전혈로부터 직접적으로 단리될 수 있다. 그러나, 일부 대상체들(예를 들면, 암으로 진단되고/되거나 암 치료를 받은 대상체들)에서, WBC/PBMC 수율은 백혈구성분채집술에 의해 단리된 때보다 전혈로부터 단리된 때 유의미하게 더 낮을 수 있다.
백혈구성분채집술 절차 및/또는 직접적인 세포 단리 절차 중 어느 하나가 본 개시 내용의 임의의 대상체를 위해 이용될 수 있다.
백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 절연된 용기 내에 채워 넣어져야 하고 임상 프로토콜과 함께 사용되도록 승인된 표준 병원 기관 혈액 수집 절차에 따라 조절된 실온(+19℃ 내지 +25℃)에서 보관되어야 한다. 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 냉장되지 않아야 한다.
백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 세포 농도는 수송 동안 ml당 0.2x109개 세포를 초과하지 않아야 한다. 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 강력한 혼합은 피해져야 한다.
백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 예를 들면, 하룻밤 동안 저장되어야 하는 경우, 조절된 실온(전술된 바와 동일한 온도)에서 보관되어야 한다. 저장 동안, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 농도는 ml당 0.2x109개 세포를 초과하지 않아야 한다.
바람직하게는, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 세포는 자가 혈장에 저장되어야 한다. 특정 구현예에서, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 세포 농도가 ml당 0.2x109개 세포보다 더 높은 경우, 상기 생성물은 자가 혈장에 의해 희석되어야 한다.
바람직하게는, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 라벨링 및 분리 절차를 시작할 때 24시간보다 더 오래되지 않아야 한다. 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 폐쇄되고/되거나 자동화된 시스템(예를 들면, CliniMACS 프로디지)을 이용함으로써 세포 라벨링을 위해 프로세싱될 수 있고/있거나 준비될 수 있다.
자동화된 시스템은 가능하게는 피콜레이션(ficolation)에 의한 추가 버피 코트 단리, 및/또는 세포 생성물(예를 들면, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물)의 세척을 수행할 수 있다.
폐쇄되고/되거나 자동화된 시스템은 (예를 들면, 백혈구성분채집술 생성물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물로부터의) T 세포 단리를 위해 세포를 준비하고 라벨링시키는 데 이용될 수 있다.
WBC/PBMC가 직접적으로 뉴클레오펙션될 수 있을지라도(더 용이하고 추가 단계를 피하게 함), 본 개시 내용의 방법은 뉴클레오펙션 전에 먼저 T 세포를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 더 용이한 전략인 PBMC의 직접적인 뉴클레오펙션은 T 세포를 작용적으로 소진되게 만듦으로써 생성물의 생체내 효율을 직접적으로 감소시키는 좋지 않은 확장 방법임을 그 자체로 입증하는, CSR 또는 CAR 시그널링을 통해 매개되는 변형된 세포의 선택적 확장을 요구한다. 생성물은 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 변형된 세포의 불균질한 조성물일 수 있고, 이 점은 환자와 환자 사이의 생성물의 가변성을 증가시키고 투약 및 CRS 관리를 더 어렵게 만든다. T 세포가 종양 억제 및 사멸에 있어서 일차 이펙터인 것으로 생각되기 때문에, 자가 생성물의 제조를 위한 T 세포 단리는 다른 더 불균질한 조성물에 비해 상당한 이점을 야기할 수 있다.
T 세포는 일방향 표지 절차에서 표지된 세포의 농축 또는 표지된 세포의 고갈에 의해 직접적으로 단리될 수 있거나, 2-단계 표지 절차에서 간접적으로 단리될 수 있다. 본 개시 내용의 일부 농축 전략에 따라, T 세포는 세포 수집 백 내에 수집될 수 있고, 라벨링되지 않은 세포(비-표적 세포)는 음성 분획 백 내에 수집될 수 있다. 본 개시 내용의 농축 전략과 대조적으로, 라벨링되지 않은 세포(표적 세포)는 세포 수집 백 내에 수집되고, 라벨링된 세포(비-표적 세포)는 음성 분획 백 또는 비-표적 세포 백 내에 수집된다. 선택 물질은 항체-코팅된 비드를 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되지 않는다. 항체-코팅된 비드는 변형 및/또는 확장 단계 전에 제거될 수 있거나, 변형 및/또는 확장 단계 전에 세포 상에 보유될 수 있다. 세포 마커의 하기 비제한적 예들 중 하나 이상을 사용하여 T 세포를 단리할 수 있다: CD3, CD4, CD8, CD25, 항-바이오틴, CD1c, CD3/CD19, CD3/CD56, CD14, CD19, CD34, CD45RA, CD56, CD62L, CD133, CD137, CD271, CD304, IFN-감마, TCR 알파/베타, 및/또는 이들의 임의의 조합. T 세포를 단리하는 방법은 T 세포를 단리하는 데 사용될 수 있는 세포 마커의 하기 비제한적 예들 중 하나 이상의 세포 마커에 특이적으로 결합하고/하거나 이러한 세포 마커를 검출 가능하게 라벨링시키는 하나 이상의 물질을 포함할 수 있다: CD3, CD4, CD8, CD25, 항-바이오틴, CD1c, CD3/CD19, CD3/CD56, CD14, CD19, CD34, CD45RA, CD56, CD62L, CD133, CD137, CD271, CD304, IFN-감마, TCR 알파/베타, 및/또는 이들의 임의의 조합. 이 물질은 "우수 제조관리 기준"("GMP") 등급일 수 있거나 이러한 등급이 아닐 수 있다. 물질은 써모(Thermo) DynaBead 및 밀테니이(Miltenyi) CliniMACS 제품을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시 내용의 T 세포 단리 방법은 라벨링 및/또는 단리 단계의 다회 반복을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 T 세포 단리 방법에 있어서 임의의 시점에서 원치 않는 세포 및/또는 원치 않는 세포 유형에 대한 양성 또는 음성 선택으로 본 개시 내용의 T 세포 생성물 조성물로부터 원치 않는 세포 및/또는 원치 않는 세포 유형을 고갈시킬 수 있다. 본 개시 내용의 T 세포 생성물 조성물은 CD4, CD8 및/또는 또 다른 T 세포 마커(들)를 발현할 수 있는 추가 세포 유형을 함유할 수 있다.
본 개시 내용의 T 세포 뉴클레오펙션 방법은 예를 들면, 뉴클레오펙션 후 단리 단계 또는 TCR 신호전달을 통한 선택적 확장 단계를 포함하는, WBC/PBMC의 집단 또는 조성물 중의 T 세포를 뉴클레오펙션시키는 과정으로 T 세포 단리 단계를 제거할 수 있다.
일부 세포 집단들은 T 세포 농축 및/또는 분류 전 또는 후에 양성 또는 음성 선택에 의해 고갈될 수 있다. 세포 생성물 조성물로부터 고갈될 수 있는 세포 조성물의 예는 골수 세포, CD25+ 조절 T 세포(T Reg), 수지상 세포, 대식세포, 적혈구, 비만 세포, 감마-델타 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해(NK) 유사 세포(예를 들면, 사이토카인 유도된 살해(CIK) 세포), 유도된 자연 살해(iNK) T 세포, NK T 세포, B 세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 T 세포 생성물 조성물은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 단리 또는 선택 절차 동안 별개의 수집 백 내로 단리될 수 있다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 따로 추가 처리될 수 있거나, 특정 비로 재구성된(동일한 조성물로 조합된) 후 처리될 수 있다.
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 재구성될 수 있는 특정 비는 이용된 확장 기술의 유형 및 효능, 세포 배지, 및/또는 T 세포 생성물 조성물의 확장을 위해 사용된 성장 조건에 의해 좌우될 수 있다. 가능한 CD4+:CD8+ 비의 예는 50%:50%, 60%:40%, 40%:60%, 75%:25% 및 25%:75%를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
CD8+ T 세포는 강력한 종양 세포 사멸 능력을 나타내는 반면, CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포 증식 능력 및 기능을 뒷받침하는 데 요구되는 사이토카인들의 대부분을 제공한다. 정상 공여자로부터 단리된 T 세포는 주로 CD4+ T 세포이기 때문에, T 세포 생성물 조성물은 생체내에 존재할 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비를 개선하기 위해 CD4+:CD8+ 비에 대하여 시험관내에서 인위적으로 조절된다. 최적화된 비는 자가 T 세포 생성물 조성물의 생체외 확장을 위해 이용될 수도 있다. T 세포 생성물 조성물의 인위적으로 조절된 CD4+:CD8+ 비에 비추어 볼 때, 본 개시 내용의 생성물 조성물은 임의의 내생적으로 생성된 T 세포 집단과 상당히 상이할 수 있고 이 집단보다 상당히 더 큰 장점을 제공할 수 있다.
바람직한 T 세포 단리 방법은 본래 그대로의 pan T 세포를 수득하기 위한 음성 선택 전략을 포함할 수 있는데, 이것은 생성된 T 세포 조성물이 내인적으로 생성된 변종/비의 T 세포를 함유하는, 조작되지 않은 T 세포를 포함한다는 것을 의미한다.
양성 또는 음성 선택을 위해 사용될 수 있는 물질은 자기 세포 분리 비드를 포함하나, 이것으로 제한되지 않는다. 자기 세포 분리 비드는 본 개시 내용의 T 세포 단리 방법에서 다음 단계를 수행하기 전에 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 선택된 집단, 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다의 혼합된 집단으로부터 제거 또는 고갈될 수 있거나, 제거 또는 고갈되지 않을 수 있다.
T 세포 조성물 및 T 세포 생성물 조성물은 냉동보존, 표준 T 세포 배양 배지에서의 저장, 및/또는 유전자 변형을 위해 준비될 수 있다.
T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 높은 회수, 생존능, 표현형 및/또는 기능 능력을 가진 인간 세포를 저장하고 회수하도록 최적화된 표준 냉동보존 방법을 이용함으로써 냉동보존될 수 있다. 상업적으로 입수 가능한 냉동보존 배지 및/또는 프로토콜이 이용될 수 있다. 본 개시 내용의 냉동보존 방법은 냉동 관련 독성을 감소시키는 DMSO 무함유 냉동보존제(예를 들면, CryoSOfree™ DMSO 무함유 냉동보존 배지)를 포함할 수 있다.
T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 배양 배지에 저장될 수 있다. 본 개시 내용의 T 세포 배양 배지는 세포 저장, 세포 유전자 변형, 세포 표현형 및/또는 세포 확장을 위해 최적화될 수 있다. 본 개시 내용의 T 세포 배양 배지는 하나 이상의 항생제를 포함할 수 있다. 세포 배양 배지 내로의 항생제의 포함이 뉴클레오펙션을 통한 유전자 변형 후 트랜스펙션 효율 및/또는 세포 수율을 감소시킬 수 있기 때문에, 특정 항생제들(또는 이들의 조합) 및 이들 각각의 농도(들)는 뉴클레오펙션을 통한 유전자 변형 후 최적 트랜스펙션 효율 및/또는 세포 수율을 위해 변경될 수 있다.
본 개시 내용의 T 세포 배양 배지는 혈청을 포함할 수 있고, 게다가 혈청 조성 및 농도는 최적 세포 결과를 위해 변경될 수 있다. FBS/FCS는 본 개시 내용의 T 세포 배양 배지에서 사용될 것으로 예상되지만 제노-단백질을 도입할 수 있기 때문에, 인간 AB 혈청이 T 세포의 배양에 있어서 FBS/FCS보다 선호된다. 혈청은 배양물 중의 T 세포 조성물을 투여받을 대상체의 혈액으로부터 단리될 수 있으므로, 본 개시 내용의 T 세포 배양 배지는 자가 혈청을 포함할 수 있다. 무혈청 배지 또는 혈청 대용물도 본 개시 내용의 T 세포 배양 배지에서 사용될 수 있다. 본 개시 내용의 T 세포 배양 배지 및 방법의 일부 구현예에서, 무혈청 배지 또는 혈청 대용물은, 제노-혈청을 사용한 배지의 보충에 비해 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 더 건강한 세포라는 장점을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 장점을 제공할 수 있다.
T 세포 배양 배지는 상업적으로 입수 가능한 세포 성장 배지를 포함할 수 있다. 예시적 상업적으로 입수 가능한 세포 성장 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 유전자 변형을 위해 준비될 수 있다. 유전자 변형을 위한 T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분의 준비는 원하는 뉴클레오펙션 버퍼를 사용한 세포 세척 및/또는 재현탁을 포함할 수 있다. 냉동보존된 T 세포 조성물은 해동될 수 있고 뉴클레오펙션에 의한 유전자 변형을 위해 준비될 수 있다. 냉동보존된 세포는 표준 또는 공지된 프로토콜에 따라 해동될 수 있다. 냉동보존된 세포의 해동 및 준비는, 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다. 예를 들면, 그리폴스 알부테인(Grifols Albutein)(25% 인간 알부민)은 해동 및/또는 준비 과정에서 사용될 수 있다.
자가 T 세포 생성물 조성물의 변형
T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 예를 들면, 뉴클레오펙션 전략, 예컨대, 전기천공을 이용함으로써 변형될 수 있다. 뉴클레오펙션될 세포의 총 수, 뉴클레오펙션 반응의 총 부피, 및 샘플의 준비의 정확한 시간은, 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다.
뉴클레오펙션 및/또는 전기천공은 예를 들면, 론자(Lonza) 아막사, 맥스사이트(MaxCyte) 펄스애자일(PulseAgile), 하바드 어패라터스(Apparatus) BTX 및/또는 인비트로겐(Invitrogen) 네온(Neon)을 이용함으로써 달성될 수 있다. 플라스틱 중합체 전극을 포함하나 이것으로 제한되지 않는 비-금속 전극 시스템이 뉴클레오펙션을 위해 바람직할 수 있다.
뉴클레오펙션에 의한 유전자 변형 전, T 세포 조성물, T 세포 생성물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴면 T 세포 조성물 또는 이들의 임의의 부분은 뉴클레오펙션 버퍼에 재현탁될 수 있다. 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 버퍼는 상업적으로 입수 가능한 뉴클레오펙션 버퍼를 포함한다. 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 버퍼는, 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고 /내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다. 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 버퍼는 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사뉴클레오펙터, 인간 T 세포 뉴클레오펙션 버퍼 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 버퍼는, 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션되고/되거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고/내거나, 더 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하기 위해 하나 이상의 보충 인자를 포함할 수 있다. 예시적 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 사이토카인, 케모카인 및 인터류킨은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 헤테로다이머, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 염, 광물 및 대사물질은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼(Earle)의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코오스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 배지, 예컨대, PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 세포자멸 경로 및 이들의 조합의 저해제들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 저해제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파아제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt 또는 Wnt3A의 저해제, 글리코겐 신타아제 키나아제-3β(GSK-3β)의 저해제(예를 들면, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/시키거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/시키거나, 핵 내로의 핵산의 용이해진 수송을 향상시키고/시키거나, 에피-염색체 핵산의 분해를 향상시키고/시키거나, DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 물질들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 예시적 물질은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
트랜스포존 및 트랜스포사아제를 비롯한 전위 물질은 세포를 (임의적으로 뉴클레오펙션 반응 바이알 또는 큐벳 내에 함유된) 뉴클레오펙션 버퍼에 첨가하기 전에, 첨가함과 동시에 또는 첨가한 후에 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 반응에 첨가될 수 있다. 본 개시 내용의 트랜스포존은 플라스미드 DNA, 선형화된 플라스미드 DNA, PCR 생성물, 나노플라스미드, DOGGYBONE™ DNA, mRNA 주형, 단일 또는 이중 가닥 DNA, 단백질-핵산 조합 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 트랜스포존은 하나 이상의 TTAA 부위(들), 하나 이상의 역위 말단 반복부(ITR)(들), 하나 이상의 긴 말단 반복부(LTR)(들), 하나 이상의 인슐레이터(들), 하나 이상의 프로모터(들), 하나 이상의 전체 길이 또는 절단형 유전자(들), 하나 이상의 폴리A 신호(들), 하나 이상의 자가-절단 2A 펩티드 절단 부위(들), 하나 이상의 내부 리보좀 진입 부위(들)(IRES), 하나 이상의 인핸서(들), 하나 이상의 조절제(들), 하나 이상의 복제 기점(들) 및 이들의 임의의 조합을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 트랜스포존은 하나 이상의 전체 길이 또는 절단형 유전자(들)을 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 트랜스포존에 의해 도입된 전체 길이 및/또는 절단형 유전자(들)는 신호 펩티드, 힌지, 막횡단 도메인, 공동자극 도메인, 키메라 항체 수용체(CAR), 키메라 T-세포 수용체(CAR-T, CARTyrin 또는 VCAR), 수용체, 리간드, 사이토카인, 약물 내성 유전자, 종양 항원, 동종 또는 자가 항원, 효소, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 형광 단백질, 뮤테인 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상을 코딩할 수 있다.
본 개시 내용의 트랜스포존은 물, TAE, TBE, PBS, HBSS, 배지, 본 개시 내용의 보충 인자 또는 이들의 임의의 조합에서 제조될 수 있다.
본 개시 내용의 트랜스포존은 임상 안전성을 최적화하고/하거나 제조 가능성을 개선하도록 설계될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 개시 내용의 트랜스포존은 불필요한 서열 또는 영역을 제거하고/하거나 비-항생제 선택 마커를 포함시킴으로써 임상 안전성을 최적화하고/하거나 제조 가능성을 개선하도록 디자인될 수 있다. 본 개시 내용의 트랜스포존은 GMP 등급일 수 있거나 GMP 등급이 아닐 수 있다.
본 개시 내용의 트랜스포사아제는 플라스미드 DNA, mRNA, 단백질, 단백질-핵산 조합 또는 이들의 임의의 조합의 하나 이상의 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 개시 내용의 트랜스포사아제는 물, TAE, TBE, PBS, HBSS, 배지, 본 개시 내용의 보충 인자 또는 이들의 임의의 조합에서 제조될 수 있다. 본 개시 내용의 트랜스포사아제 또는 이를 코딩하거나 전달하는 서열/구축물은 GMP 등급일 수 있거나 GMP 등급이 아닐 수 있다.
본 개시 내용의 트랜스포존 및 트랜스포사아제는 임의의 수단에 의해 세포에게 전달될 수 있다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법은 플라스미드 DNA(pDNA)로 본 개시 내용의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사아제를 세포에게 전달하는 단계를 포함하지만, 전달을 위한 플라스미드의 사용은 트랜스포존 및/또는 트랜스포사아제가 세포의 염색체 내로 통합될 수 있게 함으로써, 연속된 트랜스포사아제 발현을 유발할 수 있다. 따라서, 본 개시 내용의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사아제는 임의의 염색체 통합 가능성을 제거하기 위해 mRNA 또는 단백질로서 세포에게 전달될 수 있다.
본 개시 내용의 트랜스포존 및 트랜스포사아제는 트랜스포존 및/또는 트랜스포사아제를 뉴클레오펙션 반응 내로 도입하기 전에 단독으로, 또는 서로 함께 미리 항온처리될 수 있다. 트랜스포존 및 트랜스포사아제 각각의 절대적 양뿐만 아니라, 상대적 양, 예를 들면, 트랜스포존 대 트랜스포사아제의 비도 최적화될 수 있다.
선택적으로, 바이알 또는 큐벳 내에서의 뉴클레오펙션 반응의 준비 후, 반응물은 뉴클레오펙터 장치 내로 로딩될 수 있고 제조자의 프로토콜에 따라 전기 펄스의 전달을 위해 활성화될 수 있다. 본 개시 내용의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사아제(또는 본 개시 내용의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사아제를 코딩하는 서열)을 세포에게 전달하는 데 사용되는 전기 펄스 조건은 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 바람직한 세포 표현형 및/또는 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 가진 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다. 아막사 뉴클레오펙터 기술을 이용할 때, 아막사 2B 또는 4D 뉴클레오펙터를 위한 다양한 뉴클레오펙션 프로그램들 각각이 고려된다.
본 개시 내용의 뉴클레오펙션 반응 후, 세포는 세포 배지에 조심스럽게 첨가될 수 있다. 예를 들면, T 세포가 뉴클레오펙션 반응을 겪을 때, T 세포는 T 세포 배지에 첨가될 수 있다. 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 임의의 하나 이상의 상업적으로 입수 가능한 배지를 포함할 수 있다. (본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 더 큰 생존능 및 더 높은 뉴클레오펙션 효율을 갖고/갖거나, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 갖고/갖거나, 바람직한 세포 표현형을 표시하고/하거나 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 나타내는 세포를 제공하도록 최적화될 수 있다. (본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. (본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 생존능, 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 생존능, 세포 표현형 및/또는 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 향상시키기 위해 본 개시 내용의 하나 이상의 보충 인자를 포함할 수 있다. 예시적 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터류킨 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 사이토카인, 케모카인 및 인터류킨은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 헤테로다이머, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 염, 광물, 대사물질 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 염, 광물 및 대사물질은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코오스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 배지, 예컨대, PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 세포자멸 경로 및 이들의 조합의 저해제들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 저해제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파아제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt 또는 Wnt3A의 저해제, 글리코겐 신타아제 키나아제-3β(GSK-3β)의 저해제(예를 들면, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예시적 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/시키거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/시키거나, 핵 내로의 핵산의 용이해진 수송을 향상시키고/시키거나, 에피-염색체 핵산의 분해를 향상시키고/시키거나, DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 물질들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 하나 이상의 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 예시적 물질은 pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소, 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
(본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 실온에서 사용될 수 있거나, 예를 들면, 종점을 포함하는 32℃ 내지 37℃까지 미리 가온될 수 있다. (본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 본 개시 내용의 트랜스포존 또는 이의 부분의 세포 생존능 및/또는 발현을 유지하거나 향상시키는 임의의 온도까지 미리 가온될 수 있다.
(본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 비롯한) 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 조직 배양 플라스크 또는 접시, G-렉스 플라스크, 생물반응기 또는 세포 배양 백, 또는 임의의 다른 표준 용기 내에 함유될 수 있다. (본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배양물을 비롯한) 본 개시 내용의 뉴클레오펙션 후 세포 배양물은 정지된 상태로 유지될 수 있거나, 대안적으로 교란될 수 있다(예를 들면, 흔들릴 수 있거나, 휘저어질 수 있거나 진탕될 수 있다).
뉴클레오펙션 후 세포 배양물은 변형된 세포를 포함할 수 있다. 뉴클레오펙션 후 T 세포 배양물은 변형된 T 세포를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 소정의 시간 동안 휴면될 수 있거나, 예를 들면, T 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 자극될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 세포는 소정의 시간 동안 휴면될 수 있거나, 예를 들면, T 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 즉시 자극될 수 있다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 적응하기에 충분한 시간, 전위가 일어나기에 충분한 시간, 및/또는 양성 또는 음성 선택을 위한 충분한 시간을 이 세포에게 허용하여, 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 바람직한 세포 표현형, 및/또는 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 가진 세포를 생성하도록 휴면될 수 있다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 예를 들면, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 이상 동안 휴면될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 유전적으로 변형된 세포는 예를 들면, 하룻밤 동안 휴면될 수 있다. 특정 양태에서, 하룻밤은 약 12시간이다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 이상 동안 휴면될 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 세포는 뉴클레오펙션 반응 후 및 확장제 기술의 추가 전에 선택될 수 있다. 변형된 세포의 최적 선택을 위해, 세포는 변형된 세포의 확인(예를 들면, 변형된 세포와 비변형된 세포의 구별)을 용이하게 하기 위해 적어도 2일 내지 14일 동안 뉴클레오펙션 후 세포 배지에서 휴면하도록 허용될 수 있다.
본 개시 내용의 센티린 또는 CARTyrin 및 선택 마커의 발현은 본 개시 내용의 트랜스포존의 성공적인 뉴클레오펙션 시 변형된 T 세포에서 뉴클레오펙션 후 24시간만큼 일찍 검출될 수 있다. 트랜스포존의 에피-염색체 발현으로 인해, 선택 마커 단독의 발현은 변형된 T 세포(트랜스포존이 성공적으로 통합된 세포)와 비변형된 T 세포(트랜스포존이 성공적으로 통합되지 않은 세포)를 구별할 수 없다. 트랜스포존의 에피-염색체 발현이 선택 마커에 의한 변형된 세포의 검출을 모호하게 할 때, 뉴클레오펙션된 세포(변형된 세포 및 비변형된 세포 둘 다)는 세포가 발현을 중단할 수 있거나 모든 에피-염색체 트랜스포존 발현을 상실할 수 있도록 소정의 시간(예를 들면, 2일 내지 14일) 동안 휴면될 수 있다. 이 연장된 휴면 기간 후, 변형된 T 세포만이 선택 마커의 발현에 대해 양성을 유지해야 한다. 이 연장된 휴면 기간의 길이는 각각의 뉴클레오펙션 반응 및 선택 과정에 대해 최적화될 수 있다. 트랜스포존의 에피-염색체 발현이 선택 마커에 의한 변형된 세포의 검출을 모호하게 할 때, 선택은 이 연장된 휴면 기간 없이 수행될 수 있으나, 추가 선택 단계가 추후 시점에서(예를 들면, 확장 단계 동안 또는 후에) 포함될 수 있다.
본 개시 내용의 변형된 세포의 선택은 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 세포의 선택은 특정 선택 마커를 발현하는 세포를 단리함으로써 수행될 수 있다. 본 개시 방법의 선택 마커는 트랜스포존 내의 하나 이상의 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 개시 방법의 선택 마커는 성공적인 전위의 결과로서 변형된 세포에 의해 발현될 수 있다(즉, 트랜스포존 내의 하나 이상의 서열에 의해 코딩되지 않을 수 있다). 일부 구현예에서, 본 개시 방법의 변형된 세포는 뉴클레오펙션 후 세포 배지의 유해한 화합물에 대한 내성을 부여하는 선택 마커를 함유한다. 상기 유해한 화합물은 예를 들면, 선택 마커에 의해 변형된 세포에게 부여된 내성이 부재할 때 세포 사멸을 초래할 항생제 또는 약물을 포함할 수 있다. 예시적 선택 마커는 야생형(WT) 또는 돌연변이체 형태의 하기 유전자들 중 하나 이상의 유전자를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다: neo, DHFR, TYMS, ALDH, MDR1, MGMT, FANCF, RAD51C, GCS 및 NKX2.2. 예시적 선택 마커는 Ab-코팅된 자기 비드 기술 또는 컬럼 선택에 의해 표적화될 수 있는 각각 표면-발현된 선택 마커 또 는 표면-발현된 태그를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 절단 가능한 태그, 예컨대, 단백질 정제에 사용되는 절단 가능한 태그는 효율적인 컬럼 선택, 세척 및 용출을 위해 본 개시 내용의 선택 마커에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시 방법의 선택 마커는 (변형된 T 세포를 포함하는) 변형된 세포에 의해 내인적으로 발현되지 않으므로, (예를 들면, 세포 분류 기법에 의한) 변형된 세포의 물리적 단리에 유용할 수 있다. 본 개시 방법의 예시적 선택 마커는 (변형된 T 세포를 포함하는) 변형된 세포에 의해 내인적으로 발현되지 않고, 전체 길이, 돌연변이된 또는 절단된 형태의 CD271, CD19, CD52, CD34, RQR8, CD22, CD20, CD33 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시 내용의 변형된 세포의 일부 구현예에서, 선택 마커는 분열 세포에서 활성이고 비분열 세포에서는 활성이 아닌 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 신진대사 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 디히드로폴레이트 리덕타아제(DHFR) 뮤테인 효소를 포함한다. 일부 구현예에서, DHFR 뮤테인 효소는 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
Figure pct00112
. 일부 구현예에서, DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80, 113, 또는 153 중 하나 이상에서 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, DHFR 뮤테인 효소의 아미노산 서열은 위치 80에서 페닐알라닌(F) 또는 류신(L)의 치환, 위치 113에서 류신(L) 또는 발린(V)의 치환, 및 위치 153에서 발린(V) 또는 아스파르트산(D)의 치환 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 변형된 세포는 뉴클레오펙션 반응 후 선택적으로 확장될 수 있다. 특정 구현예에서, CARTyrin을 포함하는 변형된 T 세포는 CARTyrin 자극에 의해 선택적으로 확장될 수 있다. CARTyrin을 포함하는 변형된 T 세포는 표적에 의해 덮인 물질(예를 들면, 표적을 발현하는 종양 세포주 또는 정상 세포주, 또는 표적에 의해 덮인 확장제 비드)과 접촉함으로써 자극될 수 있다. 대안적으로, CARTyrin을 포함하는 변형된 T 세포는 방사선조사된 종양 세포, 방사선조사된 동종이계 정상 세포 또는 방사선조사된 자가 PBMC와 접촉함으로써 자극될 수 있다. 자극을 위해 사용된 표적 발현 세포에 의한 본 개시 내용의 세포 생성물 조성물의 오염을 최소화하기 위해, 예를 들면, 상기 세포 생성물 조성물이 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있을 때, CARTyrin 표적 단백질로 코팅된 확장제 비드를 사용하여 자극을 수행할 수 있다. CARTyrin 자극에 의한 CARTyrin을 포함하는 변형된 T 세포의 선택적 확장은 작용적으로 소진된 변형된 T 세포를 피하도록 최적화될 수 있다.
본 개시 내용의 선택된 변형된 세포는 냉동보존될 수 있거나, 소정의 시간 동안 휴면될 수 있거나, 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 자극될 수 있다. 본 개시 내용의 선택된 변형된 세포는 냉동보존될 수 있거나, 소정의 시간 동안 휴면될 수 있거나, 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 즉시 자극될 수 있다. 선택된 변형된 세포가 T 세포일 때, T 세포는 T 세포 확장제 기술의 추가에 의해 확장되도록 자극될 수 있다. 본 개시 방법의 선택된 변형된 세포는 예를 들면, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 또는 그 이상 동안 휴면될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 선택된 변형된 세포는 예를 들면, 하룻밤 동안 휴면될 수 있다. 특정 양태에서, 하룻밤은 약 12시간이다. 본 개시 방법의 선택된 변형된 세포는 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 또는 그 이상 동안 휴면될 수 있다. 본 개시 방법의 선택된 변형된 세포는 임의의 시간 동안 휴면되어, 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 바람직한 세포 표현형, 및/또는 확장 기술의 추가 시 더 큰/더 빠른 확장을 가진 세포를 생성할 수 있다.
(본 개시 방법의 선택된 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 변형된 세포는 높은 회수, 생존능, 표현형 및/또는 작용 능력을 가진 인간 세포를 저장하고/하거나 회수하도록 최적화될 수 있는 임의의 표준 냉동보존 방법을 이용함으로써 냉동보존될 수 있다. 본 개시 방법의 냉동보존 방법은 상업적으로 입수 가능한 냉동보존 배지 및/또는 프로토콜을 포함할 수 있다.
(본 개시 방법의 선택된 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 변형된 세포의 전위 효율은 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, 확장제 기술의 적용 전, (본 개시 방법의 선택된 변형된 T 포를 포함하는) 선택된 변형된 세포에 의한 트랜스포존의 발현은 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 측정될 수 있다. (본 개시 방법의 선택된 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 변형된 세포의 전위 효율의 측정은 트랜스포존(예를 들면, CARTyrin)을 발현하는 선택된 세포의 퍼센트를 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, T 세포의 순도, 트랜스포존 발현(예를 들면, CARTyrin 발현)의 평균 형광 강도(MFI), CARTyrin 리간드를 발현하는 표적 세포의 탈과립화 및/또는 사멸을 매개하는 (트랜스포존에 의해 전달된) CARTyrin의 능력, 및/또는 (본 개시 방법의 선택된 변형된 T 세포를 포함하는) 선택된 변형된 세포의 표현형은 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다.
본 개시 방법의 세포 생성물 조성물은 일부 방출 기준을 충족시킬 때 대상체에게 투여되도록 방출될 수 있다. 예시적 방출 기준은 세포 표면 상에서 검출 가능한 수준의 CARTyrin을 발현하는, 변형된, 선택된 및/또는 확장된 T 세포의 특정 퍼센트를 포함할 수 있으나, 이것으로 제한되지 않는다.
자가 T 세포 생성물 조성물의 변형
본 개시 내용의 (변형된 T 세포를 포함하는) 변형된 세포는 확장제 기술을 이용함으로써 확장될 수 있다. 본 개시 내용의 확장제 기술은 상업적으로 입수 가능한 확장제 기술을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 예시적 확장제 기술은 TCR을 통한 본 개시 내용의 변형된 T 세포의 자극을 포함한다. 본 개시 방법의 변형된 T 세포를 자극하기 위한 모든 수단들이 고려되지만, TCR을 통한 본 개시 내용의 변형된 T 세포의 자극은 더 우수한 수준의 사멸 능력을 가진 생성물을 제공하는 바람직한 방법이다.
TCR을 통해 본 개시 내용의 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 써모(Thermo) 확장제 DynaBead를 T 세포에 대한 비드의 3:1 비로 사용할 수 있다. 확장제 비드가 생체분해될 수 없는 경우, 비드는 확장제 조성물로부터 제거될 수 있다. 예를 들면, 상기 비드는 약 5일 후 확장제 조성물로부터 제거될 수 있다. TCR을 통해 본 개시 내용의 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 밀테니이 T 세포 활성화/확장제를 사용할 수 있다. TCR을 통해 본 개시 내용의 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 스템셀 테크놀로지스(StemCell Technologies)의 이뮤노컬트 인간 CD3/CD28 또는 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화제를 사용할 수 있다. 이 기술은 가용성 테트라머 항체 복합체가 소정의 시간 후 분해될 것이고 과정으로부터의 제거를 요구하지 않을 것이기 때문에 바람직할 수 있다.
인공 항원 제시 세포(APC)는 표적 항원을 공-발현하도록 조작될 수 있고, 본 개시 내용의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 인공 APC는 (예를 들면, 불멸화된 골수성 백혈병 세포주 K562를 포함하는) 종양 세포주를 포함할 수 있거나 이 종양 세포주로부터 유래할 수 있고, 기술에 의해 다수의 보조자극 분자들 또는 기술들(예컨대, CD28, 4-1BBL, CD64, mbIL-21, mbIL-15, CAR 표적 분자 등)을 공-발현하도록 조작될 수 있다. 본 개시 내용의 인공 APC가 공동자극 분자와 조합될 때, 조건은 바람직하지 않은 표현형 및 작용 능력, 즉 말기 분화된 이펙터 T 세포의 발생 또는 출현을 방지하도록 최적화될 수 있다.
방사선조사된 (자가 또는 동종) PBMC는 일부 표적 항원들, 예컨대, CD19를 발현할 수 있고, 본 개시 내용의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 방사선조사된 종양 세포는 일부 표적 항원들을 발현할 수 있고, 본 개시 내용의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다.
플레이트에 결합된 항-CD3, 항-CD2 및/또는 항-CD28, 및/또는 가용성 항-CD3, 항-CD2 및/또는 항-CD28 자극은 본 개시 내용의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다.
항원으로 코팅된 비드는 표적 단백질을 표시할 수 있고 본 개시 내용의 TCR 및/또는 CAR을 통해 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, CARTyrin 표적 단백질로 코팅된 확장제 비드는 본 개시 내용의 TCR 및/또는 CARTyrin을 통해 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포를 자극하는 데 사용될 수 있다.
확장 방법은 TCR 또는 CARTyrin, 및 변형된 T 세포의 표면에 발현된 CD2, CD3, CD28, 4-1BB 및/또는 다른 마커를 통해 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포의 자극을 이끌어낸다.
확장 기술은 뉴클레오펙션 후 대략 24시간까지 뉴클레오펙션 직후 본 개시 내용의 세포에 적용될 수 있다. 다양한 세포 배지들이 확장 절차 동안 사용될 수 있지만, 본 개시 내용의 바람직한 T 세포 확장 배지는 예를 들면, 더 큰 생존능, 세포 표현형, 총 확장 또는 더 큰 생체내 존속 능력, 생착 및/또는 CAR 매개 사멸을 가진 세포를 제공할 수 있다. 본 개시 내용의 세포 배지는 본 개시 내용의 변형된 세포의 확장, 표현형 및 작용을 개선/향상시키도록 최적화될 수 있다. 확장된 T 세포의 바람직한 표현형은 T 줄기 세포 기억 세포, T 중심 세포 및 T 이펙터 기억 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. 확장제 Dynabead는 주로 중심 기억 T 세포를 제공할 수 있고, 이것은 임상에서 더 우수한 성능으로 이어질 수 있다.
본 개시 내용의 예시적 T 세포 확장 배지는 부분적으로 또는 전체적으로 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 확장 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 확장 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 확장 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 T 세포 확장 배지는 하나 이상의 보충 인자를 추가로 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 생존능, 세포 표현형, 총 확장을 향상시키거나, 생체내 존속 능력, 생착 및/또는 CARTyrin 매개 사멸을 증가시킨다. 본 개시 내용의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인 및/또는 인터류킨, 예컨대, IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 헤테로다이머, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림프독소-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시 내용의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 염, 광물 및/또는 대사물질, 예컨대, HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산나트륨, L-글루타민, MEM 비-필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오사이드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼의 염, 2-머캡토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 PLUS 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코오스, Ca(NO3)2, Tris/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시 내용의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달 및/또는 세포자멸 경로의 억제제, 예컨대, TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파아제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt 또는 Wnt3A의 저해제, 글리코겐 신타아제 키나아제-3β(GSK-3β)의 저해제(예를 들면, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시 내용의 T 세포 확장 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/시키거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/시키거나, 핵 내로의 핵산의 용이해진 수송을 향상시키고/시키거나, 에피-염색체 핵산의 분해를 향상시키고/시키거나, DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 핵산을 변형시키거나 안정화시키는 물질, 예컨대, pH 변형제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소 또는 이들의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시 내용의 변형된 세포는 선택 약물 또는 화합물의 사용에 의해 확장 과정 동안 선택될 수 있다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 트랜스포존이 배양 배지에 첨가된 약물에 대한 내성을 변형된 세포에게 부여하는 선택 마커를 코딩할 수 있을 때, 선택은 확장 과정 동안 일어날 수 있고 선택이 일어나기 위해 대략 1일 내지 14일의 배양을 요구할 수 있다. 본 개시 내용의 트랜스포존에 의해 코딩된 선택 마커로서 사용될 수 있는 약물 내성 유전자의 예는 야생형(WT) 또는 돌연변이체 형태의 유전자 neo, DHFR, TYMS, ALDH, MDR1, MGMT, FANCF, RAD51C, GCS, NKX2.2 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 선택 마커가 내성을 부여할 수 있는, 배양 배지에 첨가될 수 있는 상응하는 약물 또는 화합물의 예는 G418, 푸로마이신(Puromycin), 앰피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin), 메토트렉세이트(Methotrexate), 멜팔란(Mephalan), 테모졸로마이드(Temozolomide), 빈크리스틴(Vincristine), 에토포사이드(Etoposide), 독소루비신(Doxorubicin), 벤다무스틴(Bendamustine), 플루다라빈(Fludarabine), 아레디아(Aredia)(파미드로네이트 이나트륨), 베세눔(Becenum)(카르무스틴(Carmustine)), BiCNU(카르무스틴), 보르테조밉(Bortezomib), 카르필조밉(Carfilzomib), 카르무브리스(Carmubris)(카르무스틴), 카르무스틴, 클라펜(Clafen)(사이클로포스파미드), 사이클로포스파미드, 사이톡산(Cytoxan)(사이클로포스파미드), 다라투무맙(Daratumumab), 다르잘렉스(Darzalex)(다라투무맙), 독실(Doxil)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀, 독스-SL(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 엘로투주맙(Elotuzumab), 엠플리시티(Empliciti)(엘로투주맙), 에바세트(Evacet)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 파리닥(Farydak)(파노비노스타트(Panobinostat)), 익사조밉(Ixazomib) 구연산염, 키프롤리스(Kyprolis)(카르필조밉(Carfilzomib)), 레날리도마이드(Lenalidomide), 리포독스(LipoDox)(독소루비신 하이드로클로라이드 리포좀), 모조빌(Mozobil)(플레릭사포르(Plerixafor)), 네오사르(Neosar)(사이클로포스파미드), 닌라로(Ninlaro)(익사조밉 구연산염), 파미드로네이트 이나트륨, 파노비노스타트, 플레릭사포르, 포말리도마이드(Pomalidomide), 포말리스트(Pomalyst)(포말리도마이드), 레블리미드(Revlimid)(레날리도마이드), 시노비르(Synovir)(탈리도마이드), 탈리도마이드, 탈로미드(Thalomid)(탈리도마이드), 벨케이드(Velcade)(보르테조밉), 졸레드론산, 조메타(Zometa)(졸레드론산) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시 내용의 T 세포 확장 과정은 WAVE 생물반응기, G-렉스 플라스크, 또는 임의의 다른 적합한 용기 및/또는 반응기 내의 세포 배양 백에서 일어날 수 있다.
본 개시 내용의 세포 또는 T 세포 배양물은 정지된 상태, 흔들리는 상태, 휘저어지는 상태 또는 진탕되는 상태로 보관될 수 있다.
본 개시 내용의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 배양 지속시간, 세포 농도, T 세포 배지 첨가/제거를 위한 일정, 세포 크기, 총 세포 수, 세포 표현형, 세포 집단의 순도, 성장하는 세포 집단 내의 변형된 세포의 퍼센트, 보충제의 사용 및 조성, 확장제 기술의 추가/제거, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 일부 조건들을 최적화할 수 있다.
본 개시 내용의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 생성된 확장된 세포 집단의 제형화 전에 소정의 종점까지 계속될 수 있다. 예를 들면, 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 소정의 시간, 즉 적어도 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간; 적어도 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일, 30일; 적어도 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주; 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월; 또는 적어도 1년 동안 계속될 수 있다. 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 생성된 배양물이 소정의 총 세포 밀도, 즉 부피(μl, ml, L)당 1개, 10개, 100개, 1000개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개 세포, 또는 임의의 중간치 밀도에 도달할 때까지 계속될 수 있다. 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 생성된 배양물의 변형된 세포가 본 개시 내용의 트랜스포존의 소정의 발현 수준, 즉 역치 발현 수준(생성된 변형된 세포가 임상적으로 효과적임을 표시하는 최소치, 최대치 또는 평균 발현 수준)의 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%, 또는 임의의 중간치 퍼센트를 나타낼 때까지 계속될 수 있다. 본 개시 내용의 세포 또는 T 세포 확장 과정은 비변형된 세포의 비율에 대한 생성된 배양물의 변형된 세포의 비율이 소정의 역치, 즉 적어도 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 2:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 또는 임의의 중간치 비에 도달할 때까지 계속될 수 있다.
방출을 위한 변형된 자가 T 세포의 분석
변형된 세포의 퍼센트는 본 개시 내용의 확장 과정 동안 또는 후에 평가될 수 있다. 본 개시 내용의 변형된 세포에 의한 트랜스포존의 세포 발현은 형광-활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, FACS를 이용하여 본 개시 내용의 CARTyrin을 발현하는 세포 또는 T 세포의 퍼센트를 측정할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 변형된 세포 또는 T 세포의 순도, 본 개시 내용의 변형된 세포 또는 T 세포에 의해 발현된 CARTyrin의 평균 형광 강도(MFI), CARTyrin 리간드를 발현하는 표적 세포의 탈과립화 및/또는 사멸을 매개하는 CARTyrin의 능력, 및/또는 CARTyrin+ T 세포의 표현형이 평가될 수 있다.
대상체에게 투여될 본 개시 내용의 조성물은 조성물이 약학 제품으로서의 제형화 및/또는 대상체에게의 투여를 위해 안전하고 효과적임을 표시하는 하나 이상의 "방출 기준"을 충족시킬 것을 요구받을 수 있다. 방출 기준은 본 개시 내용의 조성물(예를 들면, 본 개시 내용의 T 세포 생성물)이 세포 표면 상에서 검출 가능한 수준의 본 개시 내용의 CARTyrin을 발현하는 특정 퍼센트의 T 세포를 포함해야 한다는 요건을 포함할 수 있다.
확장 과정은 특정 기준(예를 들면, 특정 총 세포 수의 달성, 특정 기억 세포 집단의 달성, 특정 크기의 집단의 달성)이 충족될 때까지 계속되어야 한다.
특정 기준은 확장 과정이 종결되어야 하는 점을 신호로 보낸다. 예를 들면, 세포는 일단 300fL의 세포 크기에 도달하면 제형화되거나, 재활성화되거나 냉동보존되어야 한다(그렇지 않으면, 이 역치를 초과하는 크기에 도달한 세포는 사멸하기 시작할 수 있다). 일단 세포의 집단이 300 fL 미만의 평균 세포 크기에 도달하면 즉시 냉동보존은 해동 및 배양 시 더 우수한 세포 회수를 제공할 수 있는데, 이는 세포가 냉동보존 전에 완전한 휴면 상태에 아직 도달하지 못하였기 때문이다(완전한 휴면 상태 크기는 대략 180 fL이다). 확장 전, 본 개시 내용의 T 세포는 약 180 fL의 세포 크기를 가질 수 있으나, 그의 세포 크기를 확장 후 3일째 날 대략 900 fL까지 4배 이상 증가시킬 수 있다. T 세포의 집단은 다음 6일 내지 12일에 걸쳐 세포 크기를 180 fL의 완전한 휴면 상태 크기까지 서서히 감소시킬 것이다.
제형화를 위해 세포 집단을 준비하는 과정은 세포 집단의 세포를 농축시키는 단계, 세포를 세척하는 단계, 및/또는 약물 내성 또는 자기 비드 분류를 통해 표면에 발현된 특정 마커에 대해 세포를 추가 선택하는 단계를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 제형화를 위해 세포 집단을 준비하는 과정은 최종 생성물의 안전성 및 순도를 보장하기 위한 분류 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 환자로부터의 종양 세포가 본 개시 내용의 변형된 T 세포를 자극하는 데 사용되었거나, 제형화를 위해 준비되고 있는 본 개시 내용의 변형된 T 세포를 자극하기 위해 변형된 경우, 환자로부터의 종양 세포가 최종 생성물에 포함되지 않는 것이 매우 중요하다.
세포 생성물 주입 및/또는 주입을 위한 냉동보존
본 개시 내용의 약학적 제형물은 주입, 냉동보존 및/또는 저장을 위해 백 내에 분배될 수 있다.
본 개시 내용의 약학적 제형물은 표준 프로토콜 및 임의적으로 주입 가능한 냉동보존 배지를 사용함으로써 냉동보존될 수 있다. 예를 들면, DMSO 무함유 냉동보존제(예를 들면, CryoSOfree™ DMSO 무함유 냉동보존 배지)가 냉동 관련 독성을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 본 개시 내용의 냉동보존된 약학적 제형물은 나중에 환자에게 주입하기 위해 저장될 수 있다. 효과적인 치료는 본 개시 내용의 약학적 제형물의 다회 투여를 요구할 수 있으므로, 약학적 제형물은 냉동된 상태로 저장될 수 있으나 개별 용량의 해동을 위해 분리될 수 있는 미리 분취된 "용량"으로 포장될 수 있다.
본 개시 내용의 약학적 제형물은 실온에서 저장될 수 있다. 효과적인 치료는 본 개시 내용의 약학적 제형물의 다회 투여를 요구할 수 있으므로, 약학적 제형물은 함께 저장될 수 있으나 개별 용량의 투여를 위해 분리될 수 있는 미리 분취된 "용량"으로 포장될 수 있다.
본 개시 내용의 약학적 제형물은 동종이계 요법의 경우, 예를 들면, 질병의 관해 및 재발 후 나중에 투여를 필요로 할 수 있는 동일한 환자를 위한 추가 용량을 생성하기 위한 후속 재확장 및/또는 선택을 위해 보관될 수 있다.
제형물
상기 인지된 바와 같이, 본 개시 내용은 바람직하게는 식염수 또는 선택된 염을 가진 인산염 버퍼뿐만 아니라, 보존제를 함유하는 보존된 용액 및 제형물도 포함하는 안정한 제형물뿐만 아니라, 약학적으로 허용가능한 제형물 중에 적어도 하나의 변형된 세포를 포함하는, 약학 또는 수의학 용도에 적합한 다용도 보존된 제형물도 제공한다. 보존된 제형물은 수성 희석제 중에 임의적으로 적어도 하나의 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 아질산페닐수은, 페녹시에탄올, 포름알데하이드, 클로로부탄올, 염화마그네슘(예를 들면, 육수화물), 알킬파라벤(메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 염화벤즈알코늄, 염화벤즈에토늄, 데하이드로아세트산나트륨 및 티메로살로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 공지된 보존제, 또는 이들의 중합체 또는 혼합물을 함유한다. 임의의 적합한 농도 또는 혼합물, 예컨대, 약 0.0015%, 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분획은 당분야에서 공지된 바와 같이 사용될 수 있다. 비제한적 예는 보존제 부재, 약 0.1% 내지 2% m-크레졸(예를 들면, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.9%, 1.0%), 약 0.1% 내지 3% 벤질 알코올(예를 들면, 0.5%, 0.9%, 1.1%, 1.5%, 1.9%, 2.0%, 2.5%), 약 0.001% 내지 0.5% 티메로살(예를 들면, 0.005%, 0.01%), 약 0.001% 내지 2.0% 페놀(예를 들면, 0.05%, 0.25%, 0.28%, 0.5%, 0.9%, 1.0%), 0.0005% 내지 1.0% 알킬파라벤(들)(예를 들면, 0.00075%, 0.0009%, 0.001%, 0.002%, 0.005%, 0.0075%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.05%, 0.075%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.5%, 0.75%, 0.9%, 1.0%) 등을 포함한다.
상기 인지된 바와 같이, 본 개시 내용은 포장재, 및 선택적으로 수성 희석제 중에 규정된 버퍼 및/또는 보존제와 함께 적어도 하나의 변형된 세포를 포함하는 적어도 하나의 바이알을 포함하는 제조 물품을 제공하고, 이때 상기 포장재는 이러한 용액이 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간, 18시간, 20시간, 24시간, 30시간, 36시간, 40시간, 48시간, 54시간, 60시간, 66시간, 72시간, 또는 그 이상의 시간에 걸쳐 유지될 수 있음을 표시하는 표지를 포함한다.
본 청구된 제조 물품은 즉시 내지 24시간 또는 그 이상의 범위에 걸친 기간에 투여하는 것에 유용하다. 따라서, 현재 청구된 제조 물품은 환자에게 상당한 이점을 제공한다. 본 개시 내용의 제형물은 선택적으로 약 2℃ 내지 약 40℃의 온도에서 안전하게 저장될 수 있고, 장기간 동안 단백질의 생물학적 활성을 보유할 수 있으므로, 용액이 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 또는 96시간 이상의 기간에 걸쳐 유지되고/되거나 사용될 수 있다는 점을 지시하는 포장 라벨을 허용한다.
현재 청구된 제품은 포장재를 포함한다. 포장재는 규제 기관에서 요구하는 정보 외에도 제품을 사용할 수 있는 조건을 제공한다.
치료 적용
본 개시 내용은 또한 당분야에서 공지되어 있거나 본원에 기재된 바와 같이 본 개시 내용의 적어도 하나의 조성물을 사용하여, 예를 들면, 치료 유효량의 본 개시 내용의 조성물을 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하거나 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자와 접촉시킴으로써 상기 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 질환을 조절하거나 치료하는 방법도 제공한다. 본 개시 내용은 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 악성 질환을 포함하나 이것으로 제한되지 않는 질환을 조절하거나 치료하는 방법도 제공한다.
본 개시 내용은 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에서 하기 악성 질환들 중 적어도 하나의 악성 질환을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 적어도 하나의 악성 질환을 조절하거나 치료하는 방법도 제공한다: 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 림프구성 백혈병, B 세포, T 세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 골수성 백혈병, 만성 골수구성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발 세포 백혈병, 골수형성이상 증후군(MDS), 림프종, 호지킨병, 악성 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 대장암종, 췌장암종, 비인두암종, 악성 조직구증, 부신생물성 증후군/악성 고칼슘혈증, 고형 종양, 방광암, 유방암, 대장암, 자궁내막암, 두부암, 경부암, 유전성 비용종성 암, 호지킨 림프종, 간암, 폐암, 비-소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 신장세포암종, 고환암, 선암종, 육종, 악성 흑색종, 혈관종, 전이성 질환, 암 관련 골 재흡수, 암 관련 골 통증 등.
본 개시 내용의 임의의 방법은 유효량의 조성물 또는 약학적 조성물을, 이러한 조절, 치료 또는 요법을 필요로 하는 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 선택적으로 이러한 질환 또는 장애를 치료하기 위해 공-투여 또는 조합 요법을 추가로 포함할 수 있고, 이때 상기 적어도 하나의 조성물의 투여는 이전에, 동시에 및/또는 후에 제2 치료제 중 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 적합한 용량은 당분야에서 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 각각 참고로 포함된 문헌[Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2nd Edition, Appleton 및 Lange, Stamford, Conn. (2000)]; 문헌[PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000)]; 문헌[Nursing 2001 Handbook of Drugs, 21st edition, Springhouse Corp., Springhouse, Pa., 2001]; 문헌[Health Professional's Drug Guide 2001, ed., Shannon, Wilson, Stang, Prentice-Hall, Inc, Upper Saddle River, N.J.]을 참조한다.
입양 세포 요법으로서 변형된 세포의 주입
본 개시 내용은 선택된 및/또는 확장된 본 개시 내용의 하나 이상의 CSR 및/또는 CAR을 발현하는 변형된 세포로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 변형된 세포를 제공한다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 실온 및 체온을 포함하는 임의의 온도에서 저장되도록 제형화될 수 있다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 냉동보존 및 후속 해동을 위해 제형화될 수 있다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 멸균 포장물로부터 대상체에게 직접적으로 투여되도록 약학적으로 허용 가능한 담체에 제형화될 수 있다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 최소 수준의 세포 작용 및 단백질 발현을 보장하기 위해 세포 생존능 및/또는 단백질 발현 수준의 표시자와 함께 약학적으로 허용 가능한 담체에 제형화될 수 있다. 본 개시 내용의 변형된 세포는 추가 확장을 억제하고/하거나 세포 사멸을 예방하는 하나 이상의 물질과 함께 규정된 밀도로 약학적으로 허용 가능한 담체에 제형화될 수 있다.
강화된(armored) T 세포 "녹다운" 전략
본 개시 내용의 T 세포는 그의 치료 잠재력을 향상시키도록 변형될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시 내용의 T 세포는 이 세포를 면역학적 및/또는 대사적 체크포인트에 덜 민감하게 만들도록 변형될 수 있다. 이 유형의 변형은 본 개시 내용의 T 세포를 "강화"시키고, 이 변형 후 상기 T 세포는 본원에서 "강화된" T 세포로서 지칭될 수 있다. 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 예를 들면, 종양 면역억제 미세환경 내의 T 세포에게 전달되는 특정 내인성 체크포인트 신호를 차단하고/하거나 희석함으로써(즉, 체크포인트 저해) 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 T 세포, NK 세포, 조혈 조상 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포(G-CSF-동원된 말초 혈액으로부터 단리되거나 유래한 T 세포를 포함함), 또는 제대혈(UCB) 유래 T 세포로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 본 개시 내용의 키메라 리간드 수용체(단백질 스캐폴드, 항체, ScFv 또는 항체 모방체를 포함하는 CLR)/키메라 항원 수용체(단백질 스캐폴드, 항체, ScFv 또는 항체 모방체를 포함하는 CAR), CARTyrin(센티린을 포함하는 CAR) 및/또는 VCAR(낙타과 VHH 또는 단일 도메인 VH를 포함하는 CAR) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커 및 (c) 절단된 카스파아제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드를 포함하며, 이때 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 비인간 서열은 제한 부위이다. 일부 구현예에서, 리간드 결합 영역 유도성 카스파아제 폴리펩티드는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)의 발린(V)으로의 치환(F36V)이다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 강화된 T-세포는 외인성 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 외인성 서열은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 예시적 치료 단백질은 핵 단백질, 세포질 단백질, 세포내 단백질, 막횡단 단백질, 세포 표면에 결합된 단백질 또는 분비된 단백질일 수 있다. 강화된 T 세포에 의해 발현되는 예시적 치료 단백질은 강화된 T 세포의 활성을 변형시킬 수 있거나 제2 세포의 활성을 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 선택 유전자 또는 선택 마커를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 (본원에서 유도성 전이유전자 구축물로서도 지칭되는) 합성 유전자 발현 카세트를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 저해 체크포인트 신호의 수용체(들)를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시 내용의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 저해 체크포인트 신호의 예는 본 개시 내용의 CAR-T 세포 상의 PD-1 수용체에 결합하는 PD-L1 리간드, 또는 CAR-T 세포 상의 TGFβRII 수용체에 결합하는 TGFβ 사이토카인을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 저해 체크포인트 신호의 수용체는 T 세포의 세포 표면 상에서 또는 세포질 내에서 발현된다. 저해 체크포인트 신호의 수용체를 코딩하는 유전자의 발현의 침묵 또는 감소는 본 개시 내용의 강화된 T 세포의 표면 상에서 또는 세포질 내에서의 저해 체크포인트 수용체의 단백질 발현의 손실을 야기한다. 따라서, 저해 체크포인트 수용체를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 침묵된 또는 감소된 발현을 가진 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 체크포인트 신호에 대한 내성, 비-수용성 또는 불감성을 가진다. 저해 체크포인트 신호에 대한 강화된 T 세포의 내성 또는 감소된 민감성은 이 저해 체크포인트 신호의 존재 하에서 강화된 T 세포의 치료 잠재력을 향상시킨다. 저해 체크포인트 신호는 표 1에 나열된 예를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시 내용의 강화된 T 세포에서 침묵될 수 있는 예시적 저해 체크포인트 신호는 PD-1 및 TGFβRII를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00113
Figure pct00114
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 체크포인트 시그널링에 관여하는 세포내 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시 내용의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 본 개시 내용의 T 세포의 활성은 체크포인트 시그널링 경로에 관여하는 임의의 세포내 시그널링 단백질을 표적화함으로써, 하나 이상의 체크포인트 경로에 대한 체크포인트 저해 또는 간섭을 달성함으로써 향상될 수 있다. 체크포인트 시그널링에 관여하는 세포내 시그널링 단백질은 표 2에 나열된 예시적 세포내 시그널링 단백질들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00115
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 요법의 효능을 방해하는 전사 인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시 내용의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 강화된 T 세포의 활성은 요법의 효능을 방해하는 전사 인자의 발현을 침묵시키거나 감소시킴으로써(또는 작용을 억제함으로써) 향상될 수 있거나 조절될 수 있다. 발현을 침묵시키거나 감소시키거나 그의 작용을 억제하도록 변형될 수 있는 예시적 전사 인자는 표 3에 나열된 예시적 전사 인자들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들면, 본 개시 내용의 강화된 T 세포에서 FOXP3 유전자의 발현을 침묵시키거나 감소시켜, 요법의 효능을 감소시킬 수 있는 발현 또는 활성을 가진 T 조절 CAR-T 세포(CAR-Treg 세포)의 형성을 방해할 수 있거나 감소시킬 수 있다.
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
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Figure pct00156
Figure pct00157
Figure pct00158
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 세포 사멸 또는 세포 자멸 수용체를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시 내용의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 사멸 수용체와 그의 내인성 리간드의 상호작용은 세포자멸의 개시를 야기한다. 세포 사멸 및/또는 세포 자멸 수용체 및/또는 리간드의 발현, 활성 또는 상호작용의 파괴는 본 개시 내용의 강화된 T 세포가 사멸 신호를 덜 수용하게 만듦으로써, 본 개시 내용의 강화된 T 세포가 종양 환경에서 더 우수한 효능을 갖게 만든다. 본 개시 내용의 강화된 T 세포에서 변형될 수 있는 예시적 세포 사멸 수용체는 Fas(CD95)이다. 본 개시 내용의 예시적 세포 사멸 및/또는 세포 세포자멸 수용체 및 리간드는 표 4에 제공된 예시적 수용체들 및 리간드들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00159
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 대사 감지 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시 내용의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 본 개시 내용의 강화된 T 세포에 의한 면역억제종양 미세환경(저수준의 산소, pH, 글루코오스 및 다른 분자를 특징으로 함)의 대사 감지의 파괴는 T 세포 작용의 연장된 보유를 유발함으로써, 강화된 T 세포당 더 많은 종양 세포가 사멸되게 한다. 예를 들면, HIF1a 및 VHL은 저산소 환경에서 T 세포 작용에 있어서 역할을 한다. 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 HIF1a 또는 VHL을 코딩하는 하나 이상의 유전자의 침묵된 또는 감소된 발현을 가질 수 있다. 대사 감지에 관여하는 유전자 및 단백질은 표 5에 제공된 예시적 유전자들 및 단백질들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00160
Figure pct00161
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 모노클로날 항체를 비롯해서 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 본 개시 내용의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 따라서, 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 암 요법(예를 들면, 화학요법, 모노클로날 항체 요법 또는 또 다른 항-종양 치료)의 존재 하에서 작용할 수 있고 더 우수한 작용 또는 효능을 나타낼 수 있다. 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 데 관여하는 단백질은 표 6에 제공된 예시적 단백질들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00162
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 성장 이점 인자를 코딩하는 하나 이상의 유전자(들)의 발현을 침묵시키거나 감소시켜 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 발암유전자의 발현의 침묵 또는 감소는 본 개시 내용의 강화된 T 세포에게 성장 이점을 부여할 수 있다. 예를 들면, CAR-T 제조 과정 동안 TET2 유전자의 발현의 침묵 또는 감소(예를 들면, 발현의 파괴)는 확장 능력을 결여하는 비-강화된 CAR-T에 비해 유의미한 확장 및 후속 종양 박멸 능력을 가진 강화된 CAR-T의 생성을 야기한다. 이 전략은 대상체로부터의 불리한 반응 또는 강화된 CAR-T의 조절되지 않은 성장의 경우 강화된 CAR-T 세포의 표적화된 파괴를 가능하게 하는 안전성 스위치(예를 들면, 본 개시 내용의 iC9 안전성 스위치)에 커플링될 수 있다. 예시적 성장 이점 인자는 표 7에 제공된 인자들을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00163
강화된 T 세포 "널 또는 스위치 수용체" 전략
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 변형된/키메라 체크포인트 수용체를 발현하여 본 개시 내용의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다.
일부 구현예에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 널 수용체, 미끼(decoy) 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다. 본 개시 내용의 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체는 변형된/키메라 수용체/단백질일 수 있다. 본 개시 내용의 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체는 세포내 시그널링 도메인의 발현을 위해 단축될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 개시 내용의 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체는 효과적인 시그널링을 위해 결정적인 또는 요구되는 하나 이상의 아미노산 위치에서 세포내 시그널링 도메인 내에서 돌연변이될 수 있다. 본 개시 내용의 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체의 단축 또는 돌연변이는 체크포인트 신호를 세포에게 또는 세포 내에서 전달하거나 전달하는 수용체의 능력의 손실을 야기할 수 있다.
예를 들면, 종양 세포의 표면 상에서 발현된 PD-L1 수용체로부터의 면역억제 체크포인트 신호의 희석 또는 차단은 강화된 T 세포의 표면 상에서 발현된 내인성(비변형된) PD-1 수용체와 효과적으로 경쟁하여, 상기 강화된 T 세포의 내인성 PD-1 수용체를 통한 면역억제 체크포인트 신호의 전달을 감소시키거나 억제하는 변형된/키메라 PD-1 널 수용체를 본 개시 내용의 강화된 T 세포의 표면 상에서 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 이 예시적 구현예에서, 종양 세포 상에서 발현된 PD-L1에의 결합에 대한 2개의 상이한 수용체들 사이의 경쟁은 효과적인 체크포인트 신호전달의 수준을 감소시키거나 경감시킴으로써, PD-1 널 수용체를 발현하는 강화된 T 세포의 치료 잠재력을 향상시킨다.
일부 구현예에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 막횡단 수용체인 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 막-회합된 또는 막-결합된 수용체/단백질인 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 세포내 수용체/단백질인 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 세포내 수용체/단백질인 널 수용체, 미끼 수용체 또는 우성 음성 수용체를 포함한다. 본 개시 내용의 예시적 널, 미끼 또는 우성 음성 세포내 수용체/단백질은 억제 체크포인트 신호의 다운스트림에 있는 신호전달 성분(예를 들면, 표 1 및 2에 제공됨), 전사 인자(예를 들면, 표 3에 제공됨), 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 세포자멸 수용체/리간드(예를 들면, 표 4에 제공됨), 대사 감지 분자(예를 들면, 표 5에 제공됨), 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 단백질(예를 들면, 표 6에 제공됨), 및 발암유전자 또는 종양 서프레서 유전자(예를 들면, 표 7에 제공됨)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시 내용의 예시적 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체는 표 8에 제공된 사이토카인 및 사이토카인 수용체뿐만 아니라 케모카인 및 케모카인 수용체도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00164
Figure pct00165
Figure pct00166
Figure pct00167
Figure pct00168
일부 구현예에서, 변형된/키메라 체크포인트 수용체는 스위치 수용체를 포함한다. 예시적 스위치 수용체는 본 개시 내용의 변형된/키메라 수용체/단백질을 포함할 수 있고, 이때 천연 또는 야생형 세포내 시그널링 도메인은 상기 단백질에 비-천연적이고/이거나 야생형 도메인이 아닌 상이한 세포내 시그널링 도메인으로 교체되거나 대체된다. 예를 들면, 자극 시그널링 도메인에 의한 저해 시그널링 도메인의 대체는 면역억제 신호를 면역자극 시그널로 교체할 것이다. 대안적으로, 상이한 저해 도메인에 의한 저해 시그널링 도메인의 대체는 저해 시그널링의 수준을 감소시킬 수 있거나 향상시킬 수 있다. 스위치 수용체의 발현 또는 과다발현은 면역억제 종양 미세환경 내에서 발현된 동족 체크포인트 수용체에의 결합에 대해 내인성 야생형 체크포인트 수용체(스위치 수용체가 아님)와 경쟁함으로써 동족 체크포인트 신호의 희석 및/또는 차단을 야기할 수 있다. 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 본 개시 내용의 스위치 수용체를 코딩하는 서열을 포함하여, 본 개시 내용의 하나 이상의 스위치 수용체의 발현을 유발함으로써, 본 개시 내용의 강화된 T 세포의 활성을 변경시킬 수 있다. 본 개시 내용의 강화된 T 세포는 본 개시 내용의 체크포인트 수용체, 전사 인자, 사이토카인 수용체, 사멸 수용체, 대사 감지 분자, 암 요법, 발암유전자, 및/또는 종양 서프레서 단백질 또는 유전자의 다운스트림에 있는 세포내 발현된 단백질을 표적화하는 본 개시 내용의 스위치 수용체를 발현할 수 있다.
본 개시 내용의 예시적 스위치 수용체는 저해 체크포인트 신호의 다운스트림에 있는 시그널링 성분(예를 들면, 표 1 및 2에 제공됨), 전사 인자(예를 들면, 표 3에 제공됨), 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포 사멸 또는 세포자멸 수용체/리간드(예를 들면, 표 4에 제공됨), 대사 감지 분자(예를 들면, 표 5에 제공됨), 암 요법에 대한 민감성을 부여하는 단백질(예를 들면, 표 6에 제공됨), 및 발암유전자 또는 종양 서프레서 유전자(예를 들면, 표 7에 제공됨)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 단백질을 포함할 수 있거나 이러한 단백질로부터 유래할 수 있다. 본 개시 내용의 예시적 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체는 표 8에 제공된 사이토카인 및 사이토카인 수용체뿐만 아니라 케모카인 및 케모카인 수용체도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
강화된 T 세포 "합성 유전자 발현" 전략
일부 구현예에서, 본 개시 내용의 T 세포는 조건부 유전자 발현을 매개하는 키메라 리간드 수용체(CLR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하여 본 개시 내용의 강화된 T 세포를 생성하도록 변형된다. 강화된 T 세포의 핵에서 CLR/CAR과 조건부 유전자 발현 시스템의 조합은 동족 리간드(들)와 CLR 또는 동족 항원(들)과 CAR의 결합 시 조건에 따라 활성화되는 합성 유전자 발현 시스템을 구성한다. 이 시스템은 예를 들면, 리간드 또는 항원 결합의 부위에서, 종양 환경에서, 또는 종양 환경 내에서 합성 유전자 발현을 감소시키거나 제한함으로써 변형된 T 세포의 치료 잠재력을 '강화시키거나' 향상시키는 데 도움을 줄 수 있다.
외인성 수용체
일부 구현예에서, 강화된 T 세포는 (a) 유도성 프로모터를 코딩하는 서열 및 전이유전자를 코딩하는 서열을 포함하는 유도성 전이유전자 구축물, 및 (b) 항시성 프로모터를 코딩하는 서열 및 외인성 수용체, 예컨대, CLR 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 수용체 구축물을 포함하는 조성물을 포함하고, 이때 상기 외인성 수용체는 (a)의 구축물 및 (b)의 구축물이 세포의 게놈 서열 내로 통합될 때 발현되고, 상기 외인성 수용체는 리간드 또는 항원에 결합될 때 (a)의 유도성 전이유전자의 발현을 조절하는 유도성 프로모터를 직접적으로 또는 간접적으로 표적화하여 유전자 발현을 변형시키는 세포내 신호를 전달한다.
본 개시 내용의 합성 유전자 발현 시스템의 일부 구현예에서, 상기 조성물은 유전자 발현을 감소시킴으로써 유전자 발현을 변형시킨다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 (예를 들면, 리간드와 외인성 수용체의 결합의 지속시간 동안) 유전자 발현을 일시적으로 변형시킴으로써 유전자 발현을 변형시킨다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 유전자 발현을 급성으로 변형시킨다(예를 들면, 리간드는 외인성 수용체에 가역적으로 결합한다). 일부 구현예에서, 상기 조성물은 유전자 발현을 만성으로 변형시킨다(예를 들면, 리간드는 외인성 수용체에 비가역적으로 결합한다).
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, (b)의 외인성 수용체는 세포의 게놈 서열에 대하여 내인성 수용체를 포함한다. 예시적 수용체는 세포내 수용체, 세포 표면 수용체, 막횡단 수용체, 리간드-게이팅된 이온 채널 및 G-단백질 커플링된 수용체를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, (b)의 외인성 수용체는 비-자연 발생 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 합성, 변형된, 재조합, 돌연변이체 또는 키메라 수용체이다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 T 세포 수용체(TCR)로부터 단리되거나 유래한 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 스캐폴드 단백질로부터 단리되거나 유래한 하나 이상의 서열을 포함한다. 비-자연 발생 수용체가 막횡단 도메인을 포함하지 않는 구현예를 비롯한 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 비-자연 발생 수용체와 접촉한 후 세포내 신호를 전달하는 제2 막횡단, 막-결합된 및/또는 세포내 수용체와 상호작용한다.
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, (b)의 외인성 수용체는 비-자연 발생 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 합성, 변형된, 재조합, 돌연변이체 또는 키메라 수용체이다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 T 세포 수용체(TCR)로부터 단리되거나 유래한 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 스캐폴드 단백질로부터 단리되거나 유래한 하나 이상의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 세포내 신호를 전달하는 세포내 수용체와 상호작용한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자연 발생 수용체는 키메라 리간드 수용체(CLR)이다. 일부 구현예에서, CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, (b)의 외인성 수용체는 비-자연 발생 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 키메라 리간드 수용체는 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 리간드 인식 영역이 적어도 스캐폴드 단백질을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다.
본 개시 내용의 CLR/CAR의 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 인간 CD8α 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 17037)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca (SEQ ID NO: 17039)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 개시 내용의 CLR/CAR의 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8α 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 17038)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 막횡단 도메인은 atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc (SEQ ID NO: 17040)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 개시 내용의 CLR/CAR의 특정 구현예에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포내 분절, 또는 임의의 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공동자극 도메인은 인간 CD28 및/또는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 공동자극 도메인은 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 14477)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CD3ζ 공동자극 도메인은 cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg (SEQ ID NO: 14478)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 14479)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg (SEQ ID NO: 14480)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 4-1BB 공동자극 도메인은 막횡단 도메인과 CD28 공동자극 도메인 사이에 위치된다.
본 개시 내용의 CLR/CAR의 일부 구현예에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4, 및/또는 CD4 서열로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지는 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 14481)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 힌지는 actaccacaccagcacctagaccaccaactccagctccaaccatcgcgagtcagcccctgagtctgagacctgaggcctgcaggccagctgcaggaggagctgtgcacaccaggggcctggacttcgcctgcgac (SEQ ID NO: 14482) 또는 ACCACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCCACACCCGCCCCTACCATCGCGAGTCAGCCCCTGAGTCTGAGACCTGAGGCCTGCAGGCCAGCTGCAGGAGGAGCTGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC (SEQ ID NO: 17047)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 스캐폴드는 특이적으로 리간드에 결합한다.
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, (b)의 외인성 수용체는 비-자연 발생 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 키메라 리간드 수용체는 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 리간드 인식 영역이 적어도 스캐폴드 단백질을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 스캐폴드는 항체, 항체 단편, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 항체, 항체 모방체, 또는 센티린(본원에서는 CARTyrin으로도 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드 인식 영역은 항체, 항체 단편, 단일 도메인 항체, 단일 사슬 항체, 항체 모방체, 및 센티린 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 VHH 또는 VH(본원에서는 VCAR로 지칭)을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항체는 인간 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 VH 또는 VHH를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, VH는 재조합체 또는 키메라 단백질이다. 일부 구현예에서, VH는 재조합체 또는 키메라 인간 단백질이다. 예시적인 항체 모방체는 애피바디, 애필린, 애피머, 애피틴, 알파바디, 안티칼린, 및 아비머, DARPin, 피노머, Kunitz 도메인 펩티드 또는 모노바디를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 센티린은 하나 이상의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, (b)의 외인성 수용체는 비-자연 발생 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, CLR은 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 일부 구현예에서, 키메라 리간드 수용체는 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 리간드 인식 영역이 적어도 스캐폴드 단백질을 포함하는 것인 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 공동자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 센티린은 하나 이상의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인을 인간 단백질로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 인간 단백질은 테나신-C이다. 일부 구현예에서, 공통 서열은 LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 14488)을 포함한다. 일부 구현예에서, 공통 서열은 MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 14489)을 포함한다. 일부 구현예에서, 공통 서열은 (a) 공통 서열의 위치 13-16에서의 아미노산 잔기 TEDS를 포함하거나 이로 이루어진 A-B 루프; (b) 공통 서열의 위치 22-28에서의 아미노산 잔기 TAPDAAF를 포함하거나 이로 이루어진 B-C 루프; (c) 공통 서열의 위치 38-43에서의 아미노산 잔기 SEKVGE를 포함하거나 이로 이루어진 C-D 루프; (d) 공통 서열의 위치 51-54에서의 아미노산 잔기 GSER를 포함하거나 이로 이루어진 D-E 루프; (e) 공통 서열의 위치 60-64에서의 아미노산 잔기 GLKPG를 포함하거나 이로 이루어진 E-F 루프; (f) 공통 서열의 위치 75-81에서의 아미노산 잔기 KGGHRSN를 포함하거나 이로 이루어진 F-G 루프; 또는 (g) (a)-(f)의 임의의 조합 내에 하나 이상의 위치에서 변형된다. 일부 구현예에서, 센티린은 5개 이상의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센티린은 10개 이상의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 센티린은 15개 이상의 피브로넥틴 유형 III(FN3) 도메인의 공통 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스캐폴드는 10-9M 이하, 10-10M 이하, 10-11M 이하, 10-12M 이하, 10-13M 이하, 10-14M 이하, 및 10-15M 이하의 KD로부터 선택된 하나 이상의 친화도를 갖는 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, KD는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다.
유도성 프로모터
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, (a)의 유도성 프로모터를 코딩하는 서열은 NFκB 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, (a)의 유도성 프로모터를 코딩하는 서열은 인터페론(IFN) 프로모터를 코딩하는 서열 또는 인터류킨-2 프로모터를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인터페론(IFN) 프로모터는 IFNγ 프로모터이다. 본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 사이토카인 또는 케모카인의 프로모터로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 사이토카인 또는 케모카인은 IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12, IL13, IL17A/F, IL21, IL22, IL23, 형질전환 성장 인자 베타 (TGFβ), 콜로니 자극 인자 2(GM-CSF), 인터페론 감마(IFNγ), 종양 괴사 인자(TNFα), LTα, 퍼포린, 그랜자임(Granzyme) C (Gzmc), 그랜자임 B (Gzmb), C-C 모티프 케모카인 리간드 5 (CCL5), C-C 모티프 케모카인 리간드 4 (Ccl4), C-C 모티프 케모카인 리간드 3 (Ccl3), X-C 모티프 케모카인 리간드 1 (Xcl1) 및 LIF 인터류킨 6 패밀리 사이토카인(Lif)을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 세포 분화, 활성화, 고갈 및 기능에 관여하는 표면 단백질을 포함하는 유전자의 프로모터로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 유전자는 CD69, CD71, CTLA4, PD-1, TIGIT, LAG3, TIM-3, GITR, MHCII, COX-2, FASL 및 4-1BB을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 CD 대사 및 분화에 관여하는 유전자로부터 단리되거나 유래된다. 본 개시 내용의 조성물의 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 Nr4a1, Nr4a3, Tnfrsf9 (4-1BB), Sema7a, Zfp36l2, Gadd45b, Dusp5, Dusp6 및 Neto2의 프로모터로부터 단리되거나 유래된다.
유도성 전이유전자
일부 구현예에서, 유도성 전이유전자 구축물은 저해 체크포인트 신호(예를 들어, 표 1 및 2에서 제공된 바와 같음), 전사 인자(예를 들어, 표 3에서 제공된 바와 같음), 사이토카인 또는 사이토카인 수용체, 케모카인 또는 케모카인 수용체, 세포사멸 또는 세포자멸 수용체/리간드 (예를 들어 표 4에서 제공된 바와 같음), 대사 감지 분자(예를 들어, 표 5에서 제공된 바와 같음), 암 요법에 대한 감수성을 부여하는 단백질(예를 들어, 표 6 및/또는 9에서 제공된 바와 같음), 및 종양유전자 또는 종양 서프레서 유전자(예를 들어 표 7에서 제공된 바와 같음)의 다운스트림의 시그널링 성분의 발현을 포함하거나 유도한다. 본 개시 내용의 예시적 사이토카인, 사이토카인 수용체, 케모카인 및 케모카인 수용체는 표 8에 제공된 사이토카인 및 사이토카인 수용체뿐만 아니라 케모카인 및 케모카인 수용체도 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
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Cas-Clover
본 개시 내용은 가이드 RNA 및 융합 단백질 또는 이 융합 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 제공하고, 이때 상기 융합 단백질은 dCas9 및 Clo051 엔도뉴클레아제 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함한다.
작은 Cas9(SaCas9)
본 개시 내용은 이펙터에 작동 가능하게 연결된 작은 Cas9(Cas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용은 DNA 국소화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 본질적으로 이러한 성분 및 분자로 이루어지거나, 이러한 성분 및 분자로 이루어진 융합 단백질을 제공하고, 이때 상기 이펙터는 작은 Cas9(Cas9)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 작은 Cas9 구축물은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다.
활성 촉매 부위를 가진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) Cas9의 아미노산 서열.
Figure pct00252
불활성화된 작은 Cas9(dSaCas9)
본 개시 내용은 이펙터에 작동 가능하게 연결된 불활성화된 작은 Cas9(dSaCas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용은 DNA 국소화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 본질적으로 이러한 성분 및 분자로 이루어지거나, 이러한 성분 및 분자로 이루어진 융합 단백질을 제공하고, 이때 상기 이펙터는 작은 불활성화된 Cas9(dSaCas9)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 작은 불활성화된 Cas9(dSaCas9) 구축물은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다.
dSaCas9 서열: D10A 및 N580A 돌연변이(굵은 대문자 및 밑줄로 표시됨)는 촉매 부위를 불활성화시킨다.
Figure pct00253
불활성화된 Cas9(dCas9)
본 개시 내용은 이펙터에 작동 가능하게 연결된 불활성화된 Cas9(dCas9)를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용은 DNA 국소화 성분 및 이펙터 분자를 포함하거나, 본질적으로 이러한 성분 및 분자로 이루어지거나, 이러한 성분 및 분자로 이루어진 융합 단백질을 제공하고, 이때 상기 이펙터는 불활성화된 Cas9(dCas9)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 불활성화된 Cas9(dCas9) 구축물은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하는 이펙터를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 개시 내용의 dCas9는 스타필로코커스 피오게네스(Staphyloccocus pyogenes)로부터 단리되거나 유래한 dCas9를 포함한다. 특정 구현예에서, dCas9는 dCas9의 아미노산 서열의 위치 10 및 840에서 촉매 부위를 불활성화시키는 치환을 가진 dCas9를 포함한다. 특정 구현예에서, 이 치환은 D10A 및 H840A이다. 특정 구현예에서, dCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00254
특정 구현예에서, dCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00255
Clo051 엔도뉴클레아제
예시적 Clo051 뉴클레아제 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00256
Cas-Clover 융합 단백질
특정 구현예에서, 예시적 dCas9-Clo051 융합 단백질(구현예 1)은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다(밑줄로 표시된 Clo051 서열, 굵은 이탤릭체로 표시된 링커, 이탤릭체로 표시된 dCas9 서열(스타필로코커스 피오게네스)):
Figure pct00257
특정 구현예에서, 예시적 dCas9-Clo051 융합 단백질(구현예 1)은 하기 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다(스타필로코커스 피오게네스로부터 유래한 dCas9 서열):
Figure pct00258
Figure pct00259
특정 구현예에서, 본 개시 내용의 dCas9-Clo051 융합 단백질(구현예 1)을 코딩하는 핵산 서열은 DNA를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 dCas9-Clo051 융합 단백질(구현예 1)을 코딩하는 핵산 서열은 RNA를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 예시적 dCas9-Clo051 융합 단백질(구현예 2)은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다(밑줄로 표시된 Clo051 서열, 굵은 이탤릭체로 표시된 링커, 이탤릭체로 표시된 dCas9 서열(스타필로코커스 피오게네스)):
Figure pct00260
특정 구현예에서, 예시적 dCas9-Clo051 융합 단백질(구현예 2)은 하기 핵산 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다(스타필로코커스 피오게네스로부터 유래한 dCas9 서열):
Figure pct00261
Figure pct00262
특정 구현예에서, 본 개시 내용의 dCas9-Clo051 융합 단백질(구현예 2)을 코딩하는 핵산 서열은 DNA를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 dCas9-Clo051 융합 단백질(구현예 2)을 코딩하는 핵산 서열은 RNA를 포함할 수 있다.
전위 시스템
본 개시 내용의 예시적 트랜스포존/트랜스포사아제 시스템은 piggyBac® 트랜스포존 및 트랜스포사아제, 슬립핑 뷰티 트랜스포존 및 트랜스포사아제, 헬라이저 트랜스포존 및 트랜스포사아제, 및 Tol2 트랜스포존 및 트랜스포사아제를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
piggyBac® 트랜스포사아제는 트랜스포존의 말단 상의 트랜스포존 특이적 역위 말단 반복부 서열(ITR)을 인식하고, ITR들 사이의 내용물을 TTAA 염색체 부위로 이동시킨다. piggyBac® 트랜스포존 시스템은 ITR들 사이에 포함될 수 있는 관심 있는 유전자에 대한 페이로드(payload) 한계를 갖지 않는다. 특정 구현예, 구체적으로 트랜스포존이 piggyBac 트랜스포존인 구현예에서, 트랜스포사아제는 piggyBac® 또는 Super piggyBac™(SPB) 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 구체적으로 트랜스포사아제가 Super piggyBac™(SPB) 트랜스포사아제인 구현예에서, 트랜스포사아제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® (PB) 트랜스포사아제 효소이다. piggyBac® (PB) 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00263
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제는 하기 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 piggyBac® (PB) 트랜스포사아제이다:
Figure pct00264
특정 구현예에서, 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 2개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 piggyBac® (PB) 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 3개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 piggyBac® (PB) 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14487의 서열의 하기 위치 30, 165, 282 및 538 각각에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 piggyBac® (PB) 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 538에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 Super piggyBac™ (SPB) 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 Super piggyBac™(SPB) 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14487의 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있고, 이때 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이고, 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이고, 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이고, 위치 538에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 특정 구현예에서, Super piggyBac™(SPB) 트랜스포사아제는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00265
트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는, 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 Super piggyBac™ 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 Super piggyBac™ 트랜스포사아제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 3에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 46에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 46에서의 아미노산 치환은 트레오닌(T)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 82에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 103에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 119에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 125에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 125에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 177에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 177에서의 아미노산 치환은 히스티딘(H)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 185에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 187에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 200에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 페닐알리닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 207에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 209에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 226에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 235에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 240에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 241에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 243에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 258에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 티로신(Y)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 311에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 311에서의 아미노산 치환은 발린에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 315에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 319에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 트레오닌(T)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 327에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 328에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 340에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 340에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 421에서의 아미노산 치환은 히스티딘(H)에 의한 아스파르트산(D)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 436에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 456에서의 아미노산 치환은 티로신(Y)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 470에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 485에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 503에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 503에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 552에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 570에서의 아미노산 치환은 트레오닌(T)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 591에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 글루타민(Q)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 591에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 글루타민(Q)의 치환이다.
트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는, 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, piggyBac® 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, Super piggyBac™트랜스포사아제 효소는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는, 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, piggyBac® 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, Super piggyBac™트랜스포사아제 효소는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는, 특정 구현예에서, piggyBac® 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, Super piggyBac™트랜스포사아제 효소는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 103에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 194에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 372에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 375에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 리신(K)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 450에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 의한 아스파르트산(D)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 509에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 570에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환을 포함할 수 있다. piggyBac® 트랜스포사아제 효소가 SEQ ID NO: 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환을 포함할 수 있는 것인 구현예를 비롯한 특정 구현예에서, piggyBac® 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, piggyBac® 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환, SEQ ID NO: 14487의 위치 372에서 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환, 및 SEQ ID NO: 14487의 위치 375에서 알라닌(A)에 의한 리신(K)의 치환을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, piggyBac® 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환, SEQ ID NO: 14487의 위치 372에서 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환, SEQ ID NO: 14487의 위치 375에서 알라닌(A)에 의한 리신(K)의 치환 및 SEQ ID NO: 14487의 위치 450에서 아스파라긴(N)에 의한 아스파르트산(D)의 치환을 포함할 수 있다.
슬립핑 뷰티 트랜스포존은 ITR을 인식하고 ITR들 사이의 내용물을 TA 염색체 부위로 이동시키는 슬립핑 뷰티 트랜스포사아제에 의해 표적 게놈 내로 전위된다. 다양한 구현예에서, SB 트랜스포존 매개 유전자 전달, 또는 다수의 유사한 트랜스포존들 중 임의의 트랜스포존을 사용한 유전자 전달은 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
특정 구현예, 구체적으로 트랜스포존이 슬립핑 뷰티 트랜스포존인 구현예에서, 트랜스포사아제는 슬립핑 뷰티 트랜스포사아제 또는 과활성 슬립핑 뷰티 트랜스포사아제(SB100X)이다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 슬립핑 뷰티 트랜스포사아제는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00266
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 과활성 슬립핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사아제는 하기 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00267
헬라이저 트랜스포존은 헬리트론(Helitron) 트랜스포사아제에 의해 전위된다. 헬리트론 트랜스포사아제는 약 3000만년 내지 3600만년 전에 활성을 나타내었던, 박쥐 게놈으로부터의 고대 요소인 헬라이저 트랜스포존을 이동시킨다. 본 개시 내용의 예시적 헬라이저 트랜스포존은 하기 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 Helibat1를 포함한다:
Figure pct00268
Figure pct00269
Figure pct00270
다른 트랜스포사아제와 달리, 헬리트론 트랜스포사아제는 RNase-H 유사 촉매 도메인을 함유하지 않으나, 그 대신 복제 개시자 도메인(Rep) 및 DNA 헬리카제(helicase) 도메인으로 구성된 RepHel 모티프를 포함한다. Rep 도메인은 뉴클레아제의 HUH 수퍼패밀리의 뉴클레아제 도메인이다.
본 개시 내용의 예시적 헬리트론 트랜스포사아제는 하기 서열을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00271
헬리트론 전위에서, 트랜스포존의 3' 말단에 가까운 헤어핀은 터미네이터로서 작용한다. 그러나, 이 헤어핀은 트랜스포사아제에 의해 우회되어, 플랭킹 서열의 전달을 초래할 수 있다. 추가로, 헬라이저 전위는 공유폐쇄된 원형 중간체를 생성한다. 나아가, 헬리트론 전위는 표적 부위 중복을 결여할 수 있다. 헬라이저 서열에서, 트랜스포사아제는 LTS 및 RTS로 지칭되는 좌측 말단 서열 및 우측 말단 서열에 의해 플랭킹된다. 이 서열들은 보존된 5'-TC/CTAG-3' 모티프로 종결된다. 헤어핀 종결 구조를 형성하는 잠재력을 가진 19 bp 팔린드로믹(palindromic) 서열은 RTS의 11개 뉴클레오티드 업스트림에 위치되고 서열 GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG (SEQ ID NO: 14500)로 이루어진다.
Tol2 트랜스포존은 메다카(medaka) 물고기의 게놈으로부터 단리될 수 있거나 유래할 수 있고, hAT 패밀리의 트랜스포존과 유사할 수 있다. 본 개시 내용의 예시적 Tol2 트랜스포존은 약 4.7 킬로염기를 포함하는 서열에 의해 코딩되고, 4개의 엑손들을 함유하는 Tol2 트랜스포사아제를 코딩하는 유전자를 함유한다. 본 개시 내용의 예시적 Tol2 트랜스포사아제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00272
역위 반복부, 하위말단 서열 및 Tol2 트랜스포사아제를 포함하는, 본 개시 내용의 예시적 Tol2 트랜스포존은 하기를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00273
Figure pct00274
본 개시 내용의 예시적 트랜스포존/트랜스포사아제 시스템은 piggyBac® 및 piggyBac 유사 트랜스포존 및 트랜스포사아제를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
piggyBac® 및 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 트랜스포존의 말단 상의 트랜스포존 특이적 역위 말단 반복부 서열(ITR)을 인식하고, ITR들 사이의 내용물을 TTAA 또는 TTAT 염색체 부위로 이동시킨다. piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 시스템은 ITR들 사이에 포함될 수 있는 관심 있는 유전자에 대한 페이로드 한계를 갖지 않는다.
특정 구현예, 구체적으로 트랜스포존이 piggyBac® 트랜스포존인 구현예에서, 트랜스포사아제는 piggyBac®, Super piggyBac™(SPB) 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 구체적으로 트랜스포사아제가 piggyBac®, Super piggyBac™(SPB)인 구현예에서, 트랜스포사아제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00275
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제는 하기 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소이다:
Figure pct00276
특정 구현예에서, 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 2개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 30, 165, 282 또는 538 중 3개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14487의 서열의 하기 위치 30, 165, 282 및 538 각각에서 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487의 서열의 위치 538에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 Super piggyBac™ (SPB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 Super piggyBac™(SPB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14487의 서열의 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이러한 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 이때 위치 30에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 이소류신(I)의 치환이고, 위치 165에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 글리신(G)의 치환이고, 위치 282에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이고, 위치 538에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 특정 구현예에서, Super piggyBac™(SPB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00277
트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는, 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, piggyBac®, Super piggyBac™ 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는 특정 구현예에서, piggyBac®, Super piggyBac™ 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 3에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 46에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 46에서의 아미노산 치환은 트레오닌(T)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 82에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 이소류신(I)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 103에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 119에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 125에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 125에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 177에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 177에서의 아미노산 치환은 히스티딘(H)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 180에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 185에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 187에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 200에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 페닐알리닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 207에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 209에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 226에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 235에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 240에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 241에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 페닐알라닌(F)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 243에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 258에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 트립토판(W)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 티로신(Y)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 296에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 298에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 311에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 311에서의 아미노산 치환은 발린에 의한 프롤린(P)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 315에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 319에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 트레오닌(T)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 327에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 328에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 티로신(Y)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 340에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 340에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 시스테인(C)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 421에서의 아미노산 치환은 히스티딘(H)에 의한 아스파르트산(D)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 436에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 456에서의 아미노산 치환은 티로신(Y)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 470에서의 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에 의한 류신(L)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 485에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 503에서의 아미노산 치환은 류신(L)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 503에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 552에서의 아미노산 치환은 리신(K)에 의한 발린(V)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 570에서의 아미노산 치환은 트레오닌(T)에 의한 알라닌(A)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 591에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 글루타민(Q)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 591에서의 아미노산 치환은 아르기닌(R)에 의한 글루타민(Q)의 치환이다.
트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는, 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, Super piggyBac™트랜스포사아제 효소는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는, 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, Super piggyBac™트랜스포사아제 효소는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사아제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 전술된 돌연변이를 포함하는 것인 구현예를 포함하는, 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570의 위치에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나, Super piggyBac™트랜스포사아제 효소는 이러한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 103에서의 아미노산 치환은 프롤린(P)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 194에서의 아미노산 치환은 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 372에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 375에서의 아미노산 치환은 알라닌(A)에 의한 리신(K)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 450에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에 의한 아스파르트산(D)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 509에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에 의한 세린(S)의 치환이다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 위치 570에서의 아미노산 치환은 세린(S)에 의한 아스파라긴(N)의 치환이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환을 포함할 수 있다. piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소가 SEQ ID NO: 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환을 포함할 수 있는 것인 구현예를 비롯한 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487 또는 SEQ ID NO: 14484의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환, SEQ ID NO: 14487의 위치 372에서 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환, 및 SEQ ID NO: 14487의 위치 375에서 알라닌(A)에 의한 리신(K)의 치환을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, piggyBac™ 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제 효소는 SEQ ID NO: 14487의 위치 194에서 발린(V)에 의한 메티오닌(M)의 치환, SEQ ID NO: 14487의 위치 372에서 알라닌(A)에 의한 아르기닌(R)의 치환, SEQ ID NO: 14487의 위치 375에서 알라닌(A)에 의한 리신(K)의 치환 및 SEQ ID NO: 14487의 위치 450에서 아스파라긴(N)에 의한 아스파르트산(D)의 치환을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 곤충으로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, 곤충은 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni)(GenBank 등록번호 AAA87375; SEQ ID NO: 16796), 아르기로그라마 아그나타(Argyrogramma agnata)(GenBank 등록번호 GU477713; SEQ ID NO: 14534, SEQ ID NO: 16797), 아노펠레스 감비아(Anopheles gambiae)(GenBank 등록번호 XP_312615(SEQ ID NO: 16798); GenBank 등록번호 XP_320414(SEQ ID NO: 16799); GenBank 등록번호 XP_310729(SEQ ID NO: 16800)), 아피스 고시피이(Aphis gossypii)(GenBank 등록번호 GU329918; SEQ ID NO: 16801, SEQ ID NO: 16802), 아시르토시폰 피숨(Acyrthosiphon pisum)(GenBank 등록번호 XP_001948139; SEQ ID NO: 16803), 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon)(GenBank 등록번호 GU477714; SEQ ID NO: 14537, SEQ ID NO: 16804), 봄빅스 모리(Bombyx mori)(GenBank 등록번호 BAD11135; SEQ ID NO: 14505), 칠로 수프레살리스(Chilo suppressalis)(GenBank 등록번호 JX294476; SEQ ID NO: 16805, SEQ ID NO: 16806), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(GenBank 등록번호 AAL39784; SEQ ID NO: 16807), 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera)(GenBank 등록번호 ABS18391; SEQ ID NO: 14525), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens)(GenBank 등록번호 ABD76335; SEQ ID NO: 16808), 맥둔노기아 크라시시그나(Macdunnoughia crassisigna)(GenBank 등록번호 EU287451; SEQ ID NO: 16809, SEQ ID NO: 16810), 펙티노포라 고시피엘라(Pectinophora gossypiella)(GenBank 등록번호 GU270322; SEQ ID NO: 14530, SEQ ID NO: 16811), 트리볼리움 카스타네움(Tribolium castaneum)(GenBank 등록번호 XP_001814566; SEQ ID NO: 16812), 크테노플루시아 아그나타(Ctenoplusia agnata)(아르기로그라마 아그나타(Argyrogramma agnata)로서도 지칭됨), 메소르 보우비에리(Messour bouvieri), 메가칠레 로툰다타(Megachile rotundata), 봄부스 임파티엔스(Bombus impatiens), 마메스트라 브라시카(Mamestra brassicae), 메이에티올라 데스럭토르(Mayetiola destructor) 또는 아피스 멜리페라(Apis mellifera)이다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 곤충으로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, 곤충은 트리코플루시아 니(AAA87375)이다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 곤충으로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, 곤충은 봄빅스 모리(BAD11135)이다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 갑각류로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, 갑각류는 다프니아 풀리카리아(Daphnia pulicaria)(AAM76342, SEQ ID NO: 16813)이다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 척추동물로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, 척추동물은 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis)(GenBank 등록번호 BAF82026; SEQ ID NO: 14518), 호모 사피엔스(Homo sapiens)(GenBank 등록번호 NP_689808; SEQ ID NO: 16814), 무스 무스쿨루스(Mus musculus)(GenBank 등록번호 NP_741958; SEQ ID NO: 16815), 마카카 파스시쿨라리스(Macaca fascicularis)(GenBank 등록번호 AB179012; SEQ ID NO: 16816, SEQ ID NO: 16817), 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus)(GenBank 등록번호 XP_220453; SEQ ID NO: 16818) 또는 미요티스 루시푸구스(Myotis lucifugus)이다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 미삭동물로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, 미삭동물은 시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis)(GenBank 등록번호 XP_002123602; SEQ ID NO: 16819)이다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 염색체 부위 내의 서열 5'-TTAT-3'(TTAT 표적 서열)에서 트랜스포존을 삽입한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 염색체 부위 내의 서열 5'-TTAA-3'(TTAA 표적 서열)에서 트랜스포존을 삽입한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포존의 표적 서열은 5'-CTAA-3', 5'-TTAG-3', 5'-ATAA-3', 5'-TCAA-3', 5'AGTT-3', 5'-ATTA-3', 5'-GTTA-3', 5'-TTGA-3', 5'-TTTA-3', 5'-TTAC-3', 5'-ACTA-3', 5'-AGGG-3', 5'-CTAG-3', 5'-TGAA-3', 5'-AGGT-3', 5'-ATCA-3', 5'-CTCC-3', 5'-TAAA-3', 5'-TCTC-3', 5'TGAA-3', 5'-AAAT-3', 5'-AATC-3', 5'-ACAA-3', 5'-ACAT-3', 5'-ACTC-3', 5'-AGTG-3', 5'-ATAG-3', 5'-CAAA-3', 5'-CACA-3', 5'-CATA-3', 5'-CCAG-3', 5'-CCCA-3', 5'-CGTA-3', 5'-GTCC-3', 5'-TAAG-3', 5'-TCTA-3', 5'-TGAG-3', 5'-TGTT-3', 5'-TTCA-3'5'-TTCT-3' 및 5'-TTTT-3'을 포함하거나, 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 봄빅스 모리로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00278
piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00279
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 핵 국소화 신호에 융합된다. 특정 구현예에서, 핵 국소화 신호에 융합된 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제의 아미노산 서열은 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00280
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 과활성이다. 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 그 자신의 기원이 되는 자연 발생 변이체보다 더 높은 활성을 나타내는 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 봄빅스 모리로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14505의 과활성 변이체이다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00281
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14576를 포함한다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00282
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00283
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00284
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00285
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00286
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14505의 트랜스포사아제보다 더 높은 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14505와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%, 또는 임의의 이들 사이의 퍼센트 동일하다.
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 (SEQ ID NO: 14505에 대해) 92, 93, 96, 97, 165, 178, 189, 196, 200, 201, 211, 215, 235, 238, 246, 253, 258, 261, 263, 271, 303, 321, 324, 330, 373, 389, 399, 402, 403, 404, 448, 473, 484, 507,5 23, 527, 528, 543, 549, 550, 557,6 01, 605, 607, 609, 610 또는 이들의 조합으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 아미노산 치환 Q92A, V93L, V93M, P96G, F97H, F97C, H165E, H165W, E178S, E178H, C189P, A196G, L200I, A201Q, L211A, W215Y, G219S, Q235Y, Q235G, Q238L, K246I, K253V, M258V, F261L, S263K, C271S, N303R, F321W, F321D, V324K, V324H, A330V, L373C, L373V, V389L, S399N, R402K, T403L, D404Q, D404S, D404M, N441R, G448W, E449A, V469T, C473Q, R484K T507C, G523A, I527M, Y528K Y543I, E549A, K550M, P557S, E601V, E605H, E605W, D607H, S609H, L610I 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 아미노산 치환 Q92A, V93L, V93M, P96G, F97H, F97C, H165E, H165W, E178S, E178H, C189P, A196G, L200I, A201Q, L211A, W215Y, G219S, Q235Y, Q235G, Q238L, K246I, K253V, M258V, F261L, S263K, C271S, N303R, F321W, F321D, V324K, V324H, A330V, L373C, L373V, V389L, S399N, R402K, T403L, D404Q, D404S, D404M, N441R, G448W, E449A, V469T, C473Q, R484K T507C, G523A, I527M, Y528K Y543I, E549A, K550M, P557S, E601V, E605H, E605W, D607H, S609H, 및 L610I을 포함한다.
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 야생형이 아닌 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하고, 이때 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 치환은 (SEQ ID NO: 14505에 대해) 치환 E4X, A12X, M13X, L14X, E15X, D20X, E24X, S25X, S26X, S27X, D32X, H33X, E36X, E44X, E45X, E46X, I48X, D49X, R58X, A62X, N63X, A64X, I65X, I66X, N68X, E69X, D71X, S72X, D76X, P79X, R84X, Q85X, A87X, S88X, Q92X, V93X, S94X, G95X, P96X, F97X, Y98X, T99X, I145X, S149X, D150X, L152X, E154X, T157X, N160X, S161X, S162X, H165X, R166X, T168X, K169X, T170X, A171X, E173X, S175X, S176X, E178X, T179X, M183X, Q184X, T186X, T187X, L188X, C189X, L194X, I195X, A196X, L198X, L200X, A201X, L203X, I204X, K205X, A206X, N207X, Q209X, S210X, L211X, K212X, D213X, L214X, W215X, R216X, T217X, G219X, V222X, D223X, I224X, T227X, M229X, Q235X, L237X, Q238X, N239X, N240X, P302X, N303X, P305X, A306X, K307X, Y308X, I310X, K311X, I312X, L313X, A314X, L315X, V316X, D317X, A318X, K319X, N320X, F321X, Y322X, V323X, V324X, L326X, E327X, V328X, A330X, Q333X, P334X, S335X, G336X, P337X, A339X, V340X, S341X, N342X, R343X, P344X, F345X, E346X, V347X, E349X, I352X, Q353X, V355X, A356X, R357X, N361X, D365X, W367X, T369X, G370X, L373X, M374X, L375X, H376X, N379X, E380X, R382X, V386X, V389X, N392X, R394X, Q395X, S399X, F400X, I401X, R402XT403X, D404X, R405X, Q406X, P407X, N408X, S409X, S410X, V411X, F412X, F414X, Q415X, I418X, T419X, L420X, N428XV432X, M434X, D440X, N441X, S442X, I443X, D444X, E445X, G448X, E449X, Q451X, K452X, M455X, I456X, T457X, F458X, S461X, A464X, V466X, Q468X, V469X, E471X, L472X, C473X, A474X, K483X, W485X, T488X, L489X, Y491X, G492X, V493X, M496X, I499X, C502X, I503X, T507X, K509X, N510X, V511X, T512X, I513X, R515X, E517X, S521X, G523X, L524X, S525X, I527X, Y528X, E529X, H532X, S533X, N535X, K536X, K537X, N539X, I540X, T542X, Y543X, Q546X, E549X, K550X, Q551X, G553X, E554X, P555X, S556X, P557X, R558X, H559X, V560X, N561X, V562X, P563X, G564X, R565X, Y566X, V567X, Q570X, D571X, P573X, Y574X, K576X, K581X, S583X, A586X, A588X, E594X, F598X, L599X, E601X, N602X, C603X, A604X, E605X, L606X, D607X, S608X, S609X 또는 L610X를 포함한다. 과활성 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에서 확인될 수 있고, 이 특허의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 통합 결핍 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 그의 상응하는 트랜스포존을 절제할 수 있으나, 절제된 트랜스포존을 상응하는 야생형 트랜스포사아제보다 더 낮은 빈도로 통합시키는 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14505의 통합 결핍 변이체이다.
특정 구현예에서, 절제 능력을 가진 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 야생형이 아닌 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하고, 이때 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 치환은 (SEQ ID NO: 14505에 대해) 치환 R9X, A12X, M13X, D20X, Y21K, D23X, E24X, S25X, S26X, S27X, E28X, E30X, D32X, H33X, E36X, H37X, A39X, Y41X, D42X, T43X, E44X, E45X, E46X, R47X, D49X, S50X, S55X, A62X, N63X, A64X, I66X, A67X, N68X, E69X, D70X, D71X, S72X, D73X, P74X, D75X, D76X, D77X, I78X, S81X, V83X, R84X, Q85X, A87X, S88X, A89X, S90X, R91X, Q92X, V93X, S94X, G95X, P96X, F97X, Y98X, T99X, W012X, G103X, Y107X, K108X, L117X, I122X, Q128X, I312X, D135X, S137X, E139X, Y140X, I145X, S149X, D150X, Q153X, E154X, T157X, S161X, S162X, R164X, H165X, R166X, Q167X, T168X, K169X, T170X, A171X, A172X, E173X, R174X, S175X, S176X, A177X, E178X, T179X, S180X, Y182X, Q184X, E185X, T187X, L188X, C189X, L194X, I195X, A196X, L198X, L200X, A201X, L203X, I204X, K205X, N207X, Q209X, L211X, D213X, L214X, W215X, R216X, T217X, G219X, T220X, V222X, D223X, I224X, T227X, T228X, F234X, Q235X, L237X, Q238X, N239X, N240X, N303X, K304X, I310X, I312X, L313X, A314X, L315X, V316X, D317X, A318X, K319X, N320X, F321X, Y322X, V323X, V324X, N325X, L326X, E327X, V328X, A330X, G331X, K332X, Q333X, S335X, P337X, P344X, F345X, E349X, H359X, N361X, V362X, D365X, F368X, Y371X, E372X, L373X, H376X, E380X, R382X, R382X, V386X, G387X, T388X, V389X, K391X, N392X, R394X, Q395X, E398X, S399X, F400X, I401X, R402XT403X, D404X, R405X, Q406X, P407X, N408X, S409X, S410X, Q415X, K416X, A424X, K426X, N428X, V430X, V432X, V433X, M434X, D436X, D440X, N441X, S442X, I443X, D444X, E445X, S446X, T447X, G448X, E449X, K450X, Q451X, E454X, M455X, I456X, T457X, F458X, S461X, A464X, V466X, Q468X, V469X, C473X, A474X, N475X, N477X, K483X, R484X, P486X, T488X, L489X, G492X, V493X, M496X, I499X, I503X, Y505X, T507X, N510X, V511X, T512X, I513X, K514X, T516X, E517X, S521X, G523X, L524X, S525X, I527X, Y528X, L531X, H532X, S533X, N535X, I540X, T542X, Y543X, R545X, Q546X, E549X, L552X, G553X, E554X, P555X, S556X, P557X, R558X, H559X, V560X, N561X, V562X, P563X, G564X, V567X, Q570X, D571X, P573X, Y574X, K575X, K576X, N585X, A586X, M593X, K596X, E601X, N602X, A604X, E605X, L606X, D607X, S608X, S609X 또는 L610X를 포함한다. 통합 결핍 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에서 확인될 수 있고, 이 특허의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00287
특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00288
특정 구현예에서, 통합 결핍인 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00289
특정 구현예에서, 통합 결핍 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14608과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 봄빅스 모리로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00290
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00291
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00292
특정 구현예에서, piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00293
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14506에 상응하는 좌측 서열 및 SEQ ID NO: 14507에 상응하는 우측 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 한 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14506과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 임의의 이들 사이의 퍼센트 동일하고, 다른 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14507과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 임의의 이들 사이의 퍼센트 동일하다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14506 및 SEQ ID NO: 14507 또는 SEQ ID NO: 14509를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14508 및 SEQ ID NO: 14507 또는 SEQ ID NO: 14509를 포함한다. 특정 구현예에서, 좌측 및 우측 트랜스포존 말단은 양 말단들에서 배향이 역위된 5'-TTAT-3 표적 삽입 부위에 바로 인접한 CCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14510)의 16 bp 반복부 서열을 그들의 말단에서 공유한다. 특정 구현예에서, 좌측 트랜스포존 말단은 5'-TTATCCCGGCGAGCATGAGG-3 (SEQ ID NO: 14511)을 포함하는 서열로 시작되고, 우측 트랜스포존은 이 서열의 역 상보체인 5'-CCTCATGCTCGCCGGGTTAT-3' (SEQ ID NO: 14512)를 포함하는 서열로 종결된다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14506 또는 SEQ ID NO: 14508의 적어도 14개, 16개, 18개, 20개, 30개 또는 40개의 연속 뉴클레오티드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14507 또는 SEQ ID NO: 14509의 적어도 14개, 16개, 18개, 20개, 30개 또는 40개의 연속 뉴클레오티드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14506 또는 SEQ ID NO: 14508과 적어도 90% 동일한 한 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14507 또는 SEQ ID NO: 14509과 적어도 90% 동일한 한 말단을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00294
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00295
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14510)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14510의 ITR 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 TTATCCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14511)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14511로부터 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCTCATGCTCGCCGGGTTAT (SEQ ID NO: 14512)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14512로부터 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14511로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 한 말단 및 SEQ ID NO: 14512로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 한 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14511 및 SEQ ID NO: 14512를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 TTAACCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14513)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCTCATGCTCGCCGGGTTAA (SEQ ID NO: 14514)의 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14506 및 SEQ ID NO: 14507을 포함하는 말단들, 또는 SEQ ID NO: 14506 또는 SEQ ID NO: 14507과 적어도 90% 서열 동일성을 가진, 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 변이체를 가질 수 있고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14504 또는 SEQ ID NO: 14505의 서열, 또는 SEQ ID NO: 14504 또는 SEQ ID NO: 14505과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 한 쌍의 역위 반복부들 사이에 삽입된 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이때 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14504 또는 SEQ ID NO: 14505와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제에 의해 전위될 수 있다. 특정 구현예에서, 트랜스포존은 2개의 트랜스포존 말단들을 포함하고, 이 말단들 각각은 2개의 트랜스포존 말단들에서 역위 배향으로 SEQ ID NO: 14510을 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 역위된 말단 반복부(ITR)는 SEQ ID NO: 14510과 적어도 90% 동일하다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 표적 핵산 내의 서열 5'-TTAT-3'에서 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제에 의해 삽입될 수 있다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 말단은 SEQ ID NO: 14506로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14507로부터의 적어도 16개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 말단은 SEQ ID NO: 14506으로부터의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개, 적어도 30개의 연속 뉴클레오티드들을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14507로부터의 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개, 적어도 30개의 연속 뉴클레오티드들을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14506 및 SEQ ID NO: 14507에 상응하는 트랜스포존 말단들(각각의 말단은 ITR을 포함함)을 포함하고, 5'-TTAT-3'에 상응하는 표적 서열을 가진다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 또한 트랜스포사아제(예를 들어, SEQ ID NO: 14505)를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14506에 상응하는 한 트랜스포존 말단 및 SEQ ID NO: 14516에 상응하는 제2 트랜스포존 말단을 포함한다. SEQ ID NO: 14516은 SEQ ID NO: 14507과 매우 유사하나, ITR 바로 앞에 큰 삽입을 가진다. 2개의 트랜스포존 말단들에 대한 ITR 서열들이 동일할지라도(이들은 둘 다 SEQ ID NO: 14510과 동일함), 이들은 상이한 표적 서열을 가진다: 제2 트랜스포존은 5'-TTAA-3'에 상응하는 표적 서열을 가짐으로써, ITR 서열의 변화 부재가 표적 서열 특이성을 변형시키는 데 필요하다는 증거를 제공한다. 5'-TTAA-3' 표적 부위와 관련된 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제(SEQ ID NO: 14504)는 4개의 아미노산 변화(D322Y, S473C, A507T, H582R)에 의해서만 5'-TTAT-3' 관련 트랜스포사아제(SEQ ID NO: 14505)와 상이하다. 특정 구현예에서, 5'-TTAA-3' 표적 부위와 관련된 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제(SEQ ID NO: 14504)는 5'-TTAT-3' 말단을 가진 트랜스포존에 대해 5'-TTAT-3' 관련 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제(SEQ ID NO: 14505)보다 더 낮은 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 5'-TTAA-3' 표적 부위를 가진 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 5'-TTAA-3' 표적 부위를 5'-TTAT-3'로 대체함으로써 5'-TTAT-3 표적 부위를 가진 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제로 전환될 수 있다. 이러한 트랜스포존은 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제, 예컨대, 5'-TTAT-3' 표적 서열을 인식하는 SEQ ID NO: 14504, 또는 5'-TTAA-3' 트랜스포존과 원래 관련된 트랜스포사아제의 변이체와 함께 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 5'-TTAA-3' piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제와 5'-TTAT-3' piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 사이의 높은 유사성은 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제의 아미노산 서열에 대한 매우 적은 변화가 표적 서열 특이성을 변경시킨다는 것을 입증한다. 특정 구현예에서, 임의의 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존-트랜스포사아제 유전자 전달 시스템의 변형에서, 5'-TTAA-3' 표적 서열은 5'-TTAT-3'- 표적 서열로 대체되고, ITR은 동일하게 유지되고, 트랜스포사아제는 원래의 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제, 또는 돌연변이를 트랜스포사아제 내로 도입하기 위한 저수준 돌연변이유발의 이용으로부터 비롯된 이의 변이체이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 트랜스포사아제 전달 시스템은 5'-TTAT-3' 활성 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존-트랜스포사아제 유전자 전달 시스템의 변형에 의해 형성될 수 있고, 이때 5'-TTAT-3' 표적 서열은 5'-TTAA-3'-표적 서열로 대체되고, ITR은 동일하게 유지되고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 원래의 트랜스포사아제 또는 이의 변이체이다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 봄빅스 모리로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00296
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00297
특정 구현예에서, 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14577로부터의 적어도 16개의 연속 염기들 및 SEQ ID NO: 14578로부터의 적어도 16개의 연속 염기들, 및 CCCGGCGAGCATGAGG (SEQ ID NO: 14510)과 적어도 87% 동일한 역위 말단 반복부를 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00298
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00299
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14595 및 SEQ ID NO: 14596을 포함하고, SEQ ID NO: 14505의 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제에 의해 전위된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14595 및 SEQ ID: 14596의 ITR은 5'-TTAA-3' 서열에 의해 플랭킹되지 않는다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14595 및 SEQ ID: 14596의 ITR은 5'-TTAT-3' 서열에 의해 플랭킹된다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00300
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00301
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00302
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 좌측 말단은 SEQ ID NO: 14577, SEQ ID NO: 14595, 또는 SEQ ID NO: 14597-14599의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제의 좌측 말단 앞에 좌측 표적 서열이 있다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00303
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00304
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00305
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 우측 말단은 SEQ ID NO: 14578, SEQ ID NO: 14596, 또는 SEQ ID NO: 14600-14601의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 우측 말단은 우측 표적 서열 앞에 있다. 특정 구현예에서, 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14505의 트랜스포사아제에 의해 전위된다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 좌측 말단과 우측 말단은 역위 배향으로 표적 서열에 바로 인접한 SEQ ID NO: 14510의 16 bp 반복부 서열을 공유한다. 특정 구현예에서, 좌측 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14510으로 시작되고, 우측 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14510의 역 상보체인, 5'- CCTCATGCTCGCCGGG-3' (SEQ ID NO: 14603)로 종결된다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14510 또는 SEQ ID NO: 14603과 적어도 93%, 적어도 87%, 또는 적어도 81%, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 ITR을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 표적 서열 다음에 SEQ ID NO: 88, 105 또는 107로부터 선택된 서열을 포함하는 좌측 트랜스포존 말단, 및 SEQ ID NO: 14578 또는 106을 포함하는 우측 트랜스포존 말단을 포함하고, 그 다음에 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14577과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 서열을 포함하는 한 말단, 및 SEQ ID NO: 14578과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 서열을 포함하는 한 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14577로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개의 연속 염기를 포함하고, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14578로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개의 연속 염기를 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 2개의 트랜스포존 말단들을 포함하고, 이때 각각의 트랜스포존 말단은 상기 2개의 트랜스포존 말단들에서 역위 배향으로 SEQ ID NO: 14510과 적어도 81% 동일하거나, 적어도 87% 동일하거나, 적어도 93% 동일하거나, 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 서열을 포함한다. 한 말단은 SEQ ID NO: 14599로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개의 연속 염기를 추가로 포함할 수 있고, 다른 말단은 SEQ ID NO: 14601로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개 또는 적어도 20개의 연속 염기를 추가로 포함할 수 있다. piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14505의 트랜스포사아제에 의해 전위될 수 있고, 트랜스포사아제는 선택적으로 핵 국소화 신호에 융합될 수 있다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14595 및 SEQ ID NO: 14596을 포함하고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14504 또는 SEQ ID NO: 14505를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14597 및 SEQ ID NO: 14596을 포함하고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14504 또는 SEQ ID NO: 14505를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14595 및 SEQ ID NO: 14578을 포함하고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14504 또는 SEQ ID NO: 14505를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14602 및 SEQ ID NO: 14600을 포함하고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14504 또는 SEQ ID NO: 14505를 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 ATGAGGCAGGGTAT (SEQ ID NO: 14614), ATACCCTGCCTCAT (SEQ ID NO: 14615), GGCAGGGTAT (SEQ ID NO: 14616), ATACCCTGCC (SEQ ID NO: 14617), TAAAATTTTA (SEQ ID NO: 14618), ATTTTATAAAAT (SEQ ID NO: 14619), TCATACCCTG (SEQ ID NO: 14620) 및 TAAATAATAATAA (SEQ ID NO: 14621)로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 서열을 포함하는 좌측 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14617, SEQ ID NO: 14620 및 SEQ ID NO: 14621로부터 선택된 1개, 2개, 또는 3개의 서열을 포함하는 우측 말단을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 제노푸스 트로피칼리스(Xenopus tropicalis)로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00306
일부 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14517의 과활성 변이체이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14517의 통합 결함 변이체이다. piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00307
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 제노푸스 트로피칼리스로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00308
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제이다. 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 그 자신의 기원이 되는 자연 발생 변이체보다 더 높은 활성을 나타내는 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14517의 트랜스포사아제보다 더 높은 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00309
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00310
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00311
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00312
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00313
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00314
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 (SEQ ID NO: 14517에 대해) 아미노산 6, 7, 16, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 31, 34, 67, 73, 76, 77, 88, 91, 141, 145, 146, 148, 150, 157, 162, 179, 182, 189, 192, 193, 196, 198, 200, 210, 212, 218, 248, 263, 270, 294, 297, 308, 310, 333, 336, 354, 357, 358, 359, 377, 423, 426, 428, 438, 447, 450, 462, 469, 472, 498, 502, 517, 520, 523, 533, 534, 576, 577, 582, 583 또는 587로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 (SEQ ID NO: 14517에 대해) 아미노산 치환 Y6C, S7G, M16S, S19G, S20Q, S20G, S20D, E21D, E22Q, F23T, F23P, S24Y, S26V, S28Q, V31K, A34E, L67A, G73H, A76V, D77N, P88A, N91D, Yl41Q, Y141A, N145E, N145V, P146T, P146V, P146K, P148T, P148H, Y150G, Y150S, Y150C, H157Y, A162C, A179K, L182I, L182V, T189G, L192H, S193N, S193K, V196I, S198G, T200W, L210H, F212N, N218E, A248N, L263M, Q270L, S294T, T297M, S308R, L310R, L333M, Q336M, A354H, C357V, L358F, D359N, L377I, V 423H, P426K, K428R, S438A, T447G, T447A, L450V, A462H, A462Q, I469V, I472L, Q498M, L502V, E5171, P520D, P520G, N523S, I533E, D534A, F576R, F576E, K577I, I582R, Y583F, L587Y 또는 L587W, 또는 이 돌연변이들 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 전부를 포함하는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 과활성 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 야생형이 아닌 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하고, 이때 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 치환은 (SEQ ID NO: 14517에 대해) 치환 A2X, K3X, R4X, F5X, Y6X, S7X, A11X, A13X, C15X, M16X, A17X, S18X, S19X, S20X, E21X, E22X, F23X, S24X, G25X, 26X, D27X, S28X, E29X, E42X, E43X, S44X, C46X, S47X, S48X, S49X, T50X, V51X, S52X, A53X, L54X, E55X, E56X, P57X, M58X, E59X, E62X, D63X, V64X, D65X, D66X, L67X, E68X, D69X, Q70X, E71X, A72X, G73X, D74X, R75X, A76X, D77X, A78X, A79X, A80X, G81X, G82X, E83X, P84X, A85X, W86X, G87X, P88X, P89X, C90X, N91X, F92X, P93X, E95X, I96X, P97X, P98X, F99X, T100X, T101X, P103X, G104X, V105X, K106X, V107X, D108X, T109X, N111X, P114X, I115X, N116X, F117X, F118X, Q119X, M122X, T123X, E124X, A125X, I126X, L127X, Q128X, D129X, M130X, L132X, Y133X, V126X, Y127X, A138X, E139X, Q140X, Y141X, L142X, Q144X, N145X, P146X, L147X, P148X, Y150X, A151X, A155X, H157X, P158X , I161X, A162X, V168X, T171X, L172X, A173X, M174X, I177X, A179X, L182X, D187X, T188X, T189X, T190X, L192X, S193X, I194X, P195X, V196X, S198X, A199X, T200X, S202X, L208X, L209X, L210X, R211X, F212X, F215X, N217X, N218X, A219X, T220X, A221X, V222X, P224X, D225X, Q226X, P227X, H229X, R231X, H233X, L235X, P237X, I239X, D240X, L242X, S243X, E244X, R244X, F246X, A247X, A248X, V249X, Y250X, T251X, P252X, C253X, Q254X, I256X, C257X, I258X, D259X, E260X, S261X, L262X, L263X, L264X, F265X, K266X, G267X, R268X, L269X, Q270X, F271X, R272X, Q273X, Y274X, I275X, P276X, S277X, K278X, R279X, A280X, R281X, Y282X, G283X, I284X, K285X, F286X, Y287X, K288X, L289X, C290X, E291X, S292X, S293XS294X, G295X, Y296X, T297X, S298X, Y299X, F300X, E304X, L310X, P313X, G314X, P316X, P317X, D318X, L319X, T320X, V321X, K324X, E328X, I330X, S331X, P332X, L333X, L334X, G335X, Q336X, F338X, L340X, D343X, N344X, F345X, Y346X, S347X, L351X, F352X, A354X, L355X, Y356X, C357X, L358X, D359X, T360X, R422X, Y423X, G424X, P426X, K428X, N429X, K430X, P431X, L432X, S434X, K435X, E436X, S438X, K439X, Y440X, G443X, R446X, T447X, L450X, Q451X, N455X, T460X, R461X, A462X, K465X, V467X, G468X, I469X, Y470X, L471X, I472X, M474X, A475X, L476X, R477X, S479X, Y480X, V482XY483X, K484X, A485X, A486X, V487X, P488X, P490X, K491X, S493X, Y494X, Y495X, K496X, Y497T, Q498X, L499X, Q500X, I501X, L502X, P503X, A504X, L505X, L506X, F507X, G508X, G509X, V510X, E511X, E512X, Q513X, T514X, V515X, E517X, M518X, P519X, P520X, S521X, D522X, N523X, V524X, A525X, L527X, I528X, K530X, H531X, F532X, I533X, D534X, T535X, L536X, T539X, P540X, Q546X, K550X, R553X, K554X, R555X, G556X, I557X, R558X, R559X, D560X, T561X, Y564X, P566X, K567X, P569X, R570X, N571X, L574X, C575X, F576X, K577X, P578X, F580X, E581X, I582X, Y583X, T585X, Q586X, L587X, H588X 또는 Y589X을 포함한다. 과활성 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에서 확인될 수 있고, 이 특허의 내용은 전체적으로 참고로 포함된다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 통합 결핍 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 그의 상응하는 트랜스포존을 절제할 수 있으나, 절제된 트랜스포존을 상응하는 자연 발생 트랜스포사아제보다 더 낮은 빈도로 통합시키는 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14517의 통합 결핍 변이체이다. 특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14517에 비해 결핍되어 있다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 절제에 대한 활성을 나타내나, 통합 결핍 트랜스포사아제이다. 특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00315
특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00316
특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00317
특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14611를 포함한다. 특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00318
특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14612를 포함한다. 특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 하기의 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다:
Figure pct00319
특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14613를 포함한다. 특정 구현예에서, 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 아미노산 치환을 포함하고, 이때 위치 218의 Asn은 (SEQ ID NO: 14517에 대해) Glu 또는 Asp로 대체된다(N218D 또는 N218E).
특정 구현예에서, 절제 능력을 가진 통합 결핍 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 야생형이 아닌 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하고, 이때 야생형 아미노산에 대한 하나 이상의 치환은 (SEQ ID NO: 14517에 대해) 치환 A2X, K3X, R4X, F5X, Y6X, S7X, A8X, E9X, E10X, A11X, A12X, A13X, H14X, C15X, M16X, A17X, S18X, S19X, S20X, E21X, E22X, F23X, S24X, G25X, 26X, D27X, S28X, E29X, V31X, P32X, P33X, A34X, S35X, E36X, S37X, D38X, S39X, S40X, T41X, E42X, E43X, S44X, W45X, C46X, S47X, S48X, S49X, T50X, V51X, S52X, A53X, L54X, E55X, E56X, P57X, M58X, E59X, V60X, M122X, T123X, E124X, A125X, L127X, Q128X, D129X, L132X, Y133X, V126X, Y127X, E139X, Q140X, Y141X, L142X, T143X, Q144X, N145X, P146X, L147X, P148X, R149X, Y150X, A151X, H154X, H157X, P158X, T159X, D160X, I161X, A162X, E163X, M164X, K165X, R166X, F167X, V168X, G169X, L170X, T171X, L172X, A173X, M174X, G175X, L176X, I177X, K178X, A179X, N180X, S181X, L182X, S184X, Y185X, D187X, T188X, T189X, T190X, V191X, L192X, S193X, I194X, P195X, V196X, F197X, S198X, A199X, T200X, M201X, S202X, R203X, N204X, R205X, Y206X, Q207X, L208X, L209X, L210X, R211X, F212X, L213X, H241X, F215X, N216X, N217X, N218X, A219X, T220X, A221X, V222X, P223X, P224X, D225X, Q226X, P227X, G228X, H229X, D230X, R231X, H233X, K234X, L235X, R236X, L238X, I239X, D240X, L242X, S243X, E244X, R244X, F246X, A247X, A248X, V249X, Y250X, T251X, P252X, C253X, Q254X, N255X, I256X, C257X, I258X, D259X, E260X, S261X, L262X, L263X, L264X, F265X, K266X, G267X, R268X, L269X, Q270X, F271X, R272X, Q273X, Y274X, I275X, P276X, S277X, K278X, R279X, A280X, R281X, Y282X, G283X, I284X, K285X, F286X, Y287X, K288X, L289X, C290X, E291X, S292X, S293X, S294X, G295X, Y296X, T297X, S298X, Y299X, F300X, I302X, E304X, G305X, K306X, D307X, S308X, K309X, L310X, D311X, P312X, P313X, G314X, C315X, P316X, P317X, D318X, L319X, T320X, V321X, S322X, G323X, K324X, I325X, V326X, W327X, E328X, L329X, I330X, S331X, P332X, L333X, L334X, G335X, Q336X, F338X, H339X, L340X, V342X, N344X, F345X, Y346X, S347X, S348X, I349X, L351X, T353X, A354X, Y356X, C357X, L358X, D359X, T360X, P361X, A362X, C363X, G364X, I366X, N367X, R368X, D369X, K371X, G372X, L373X, R375X, A376X, L377X, L378X, D379X, K380X, K381X, L382X, N383X, R384XG385X, T387X, Y388X, A389X, L390X, K392X, N393X, E394X, A397X, K399X, F400X, F401X, D402X, N405X, L406X, L409X, R422X, Y423X, G424X, E425X, P426X, K428X, N429X, K430X, P431X, L432X, S434X, K435X, E436X, S438X, K439X, Y440X, G442X, G443X, V444X, R446X, T447X, L450X, Q451X, H452X, N455X, T457X, R458X, T460X, R461X, A462X, Y464X, K465X, V467X, G468X, I469X, L471X, I472X, Q473X, M474X, L476X, R477X, N478X, S479X, Y480X, V482XY483X, K484X, A485X, A486X, V487X, P488X, G489X, P490X, K491X, L492X, S493X, Y494X, Y495X, K496X, Q498X, L499X, Q500X, I501X, L502X, P503X, A504X, L505X, L506X, F507X, G508X, G509X, V510X, E511X, E512X, Q513X, T514X, V515X, E517X, M518X, P519X, P520X, S521X, D522X, N523X, V524X, A525X, L527X, I528X, G529X, K530X, F532X, I533X, D534X, T535X, L536X, P537X, P538X, T539X, P540X, G541X, F542X, Q543X, R544X, P545X, Q546X, K547X, G548X, C549X, K550X, V551X, C552X, R553X, K554X, R555X, G556X, I557X, R558X, R559X, D560X, T561X, R562X, Y563X, Y564X, C565X, P566X, K567X, C568X, P569X, R570X, N571X, P572X, G573X, L574X, C575X, F576X, K577X, P578X, C579X, F580X, E581X, I582X, Y583X, H584X, T585X, Q586X, L587X, H588X 또는 Y589X를 포함한다. 절제 능력을 가진 통합 결핍 아미노산 치환의 목록은 미국 특허 제10,041,077호에서 확인될 수 있고, 이 특허의 내용은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 핵 국소화 신호에 융합된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 14517 또는 SEQ ID NO: 14518는 핵 국소화 신호에 융합된다. 특정 구현예에서, 핵 국소화 신호에 융합된 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제의 아미노산 서열은 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00320
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 제노푸스 트로피칼리스로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00321
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00322
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14519 및 SEQ ID NO: 14520를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00323
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00324
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00325
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14520 및 SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 또는 SEQ ID NO: 14523를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14522 및 SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 또는 SEQ ID NO: 14523를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 또는 SEQ ID NO: 14523로부터의 적어도 14개, 16개, 18개, 20개, 30개 또는 40개의 연속 뉴클레오티드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14520 또는 SEQ ID NO: 14522로부터의 적어도 14개, 16개, 18개, 20개, 30개 또는 40개의 연속 뉴클레오티드들을 포함하는 한 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 또는 SEQ ID NO: 14523과 적어도 90% 동일한 한 말단을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14520 또는 SEQ ID NO: 14522과 적어도 90% 동일한 한 말단을 포함한다. 한 구현예에서, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14519와 적어도 90% 동일하고, 다른 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14520과 적어도 90% 동일하다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 TTAACCTTTTTACTGCCA (SEQ ID NO: 14524)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 TTAACCCTTTGCCTGCCA (SEQ ID NO: 14526)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 TTAACCYTTTTACTGCCA (SEQ ID NO: 14527)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 TGGCAGTAAAAGGGTTAA (SEQ ID NO: 14529)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 TGGCAGTGAAAGGGTTAA (SEQ ID NO: 14531)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 TTAACCYTTTKMCTGCCA (SEQ ID NO: 14533)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 말단은 SEQ ID NO: 14524, SEQ ID NO: 14526 및 SEQ ID NO: 14527로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 말단은 SEQ ID NO: 14529 및 SEQ ID NO: 14531로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 각각의 역위 말단 반복부는 ITR 서열CCYTTTKMCTGCCA (SEQ ID NO: 14563)의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 각각의 말단은 역위 방향으로 SEQ ID NO: 14563을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 ITR은 SEQ ID NO: 14524, SEQ ID NO: 14526 및 SEQ ID NO: 14527로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 한 ITR은 SEQ ID NO: 14529 및 SEQ ID NO: 14531로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 2개의 트랜스포존 말단들에서 역위 배향으로 SEQ ID NO: 14533을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14519 및 SEQ ID NO: 14520을 포함하는 말단들, 또는 SEQ ID NO: 14519 또는 SEQ ID NO: 14520과 적어도 90% 서열 동일성을 가진, 이들 중 어느 하나 또는 둘 다의 변이체를 가질 수 있고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14517의 서열, 또는 SEQ ID NO: 14517 또는 SEQ ID NO: 14518과 적어도 %, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 서열 동일성을 보이는 변이체를 가진다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 또는 SEQ ID NO: 14523으로부터의 적어도 14개의 연속 뉴클레오티드들을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14520 또는 SEQ ID NO: 14522로부터의 적어도 14개의 연속 뉴클레오티드들을 포함한다. 특정 구현예에서, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14519, SEQ ID NO: 14521 또는 SEQ ID NO: 14523으로부터의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개 적어도 30개의 연속 뉴클레오티드들을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14520 또는 SEQ ID NO: 14522로부터의 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개 또는 적어도 30개의 연속 뉴클레오티드들을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14519에 상응하는 좌측 서열 및 SEQ ID NO: 14520에 상응하는 우측 서열을 가진 트랜스포존 말단을 인식한다. 한 트랜스포존 말단의 좌측 말단에 있는 5'-TTAA-3' 서열에서 제2 트랜스포존 말단의 우측 말단에 있는 5'-TTAA-3'까지 DNA를 절단함으로써, 이들 사이에 배치된 임의의 이종 DNA를 포함하는 트랜스포존을 한 DNA 분자로부터 절제할 것이고, 절제된 서열을 제2 DNA 분자 내로 삽입할 것이다. 특정 구현예에서, 트랜스포존 말단의 좌측 및 우측 트랜스포존의 절단된 및 변형된 버전도 또한 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제에 의해 전위될 수 있는 트랜스포존의 부분으로서 작용할 것이다. 예를 들면, 좌측 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14521 또는 SEQ ID NO: 14523에 상응하는 서열로 대체될 수 있고, 우측 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14522에 상응하는 더 짧은 서열로 대체될 수 있다. 특정 구현예에서, 좌측 및 우측 트랜스포존 말단은 5'-TTAA-3' 삽입 부위를 포함하는 그의 말단(5'-TTAACCYTTTKMCTGCCA: SEQ ID NO: 14533)에서 18bp 거의 완벽하게 반복되는 서열을 공유하며, 이 서열은 양 말단들에서 배향이 역위된다. 즉, (SEQ ID NO: 14519) 및 SEQ ID NO: 14523에서, 좌측 트랜스포존 말단은 서열 5'-TTAACCTTTTTACTGCCA-3' (SEQ ID NO: 14524)로 시작되거나, (SEQ ID NO: 14521)에서, 좌측 트랜스포존 말단은 서열 5'-TTAACCCTTTGCCTGCCA-3' (SEQ ID NO: 14526)로 시작되고; 우측 트랜스포존은 이 서열의 대략 역 상보체로 종결된다: SEQ ID NO: 14520에서, 이것은 5' TGGCAGTAAAAGGGTTAA-3' (SEQ ID NO: 14529)로 종결되고, (SEQ ID NO: 14522)에서, 이것은 5'-TGGCAGTGAAAGGGTTAA-3' (SEQ ID NO: 14531.)로 종결된다. 본 발명의 한 구현예는 2개의 트랜스포존 말단들에서 역위 배향으로 SEQ ID NO: 14533을 각각 포함하는 2개의 트랜스포존 말단들 사이에 삽입된 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스포존이다. 특정 구현예에서, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14524, SEQ ID NO: 14526 및 SEQ ID NO: 14527로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14529 및 SEQ ID NO: 14531로부터 선택된 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 제노푸스 트로피칼리스로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00326
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00327
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14573 또는 SEQ ID NO: 14574로부터의 적어도 16개의 연속 염기들, 및 역위 말단 반복부인 CCYTTTBMCTGCCA (SEQ ID NO: 14575)를 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00328
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00329
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00330
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00331
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00332
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00333
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00334
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00335
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14573 및 SEQ ID NO: 14579-14585로부터 선택된 좌측 트랜스포존 말단 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 좌측 트랜스포존 말단 서열 앞에 좌측 표적 서열이 있다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00336
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00337
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00338
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00339
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14574 및 SEQ ID NO: 14587-14590로부터 선택된 우측 트랜스포존 말단 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 우측 트랜스포존 말단 서열 뒤에 우측 표적 서열이 있다. 특정 구현예에서, 좌측 및 우측 트랜스포존 말단은 표적 서열에 인접한 양 말단들에서 배향이 역위된 14개의 반복부 서열(SEQ ID NO: 14575)을 공유한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 표적 서열 및 SEQ ID NO: 14582-14584 및 14573으로부터 선택된 서열을 포함하는 좌측 트랜스포존 말단, 및 SEQ ID NO: 14588-14590 및 14574로부터 선택된 서열 다음에 우측 표적 서열을 포함하는 우측 트랜스포존 말단을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 좌측 트랜스포존 말단은 하기 서열 및 ITR을 포함한다:
Figure pct00340
(SEQ ID NO: 14591). 특정 구현예에서, 좌측 트랜스포존 말단은 하기 서열 및 ITR을 포함한다:
Figure pct00341
(SEQ ID NO: 14592). 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존의 우측 트랜스포존 말단은 하기 서열 및 ITR을 포함한다:
Figure pct00342
(SEQ ID NO: 14593). 특정 구현예에서, 우측 트랜스포존 말단은 하기 서열 및 ITR을 포함한다:
Figure pct00343
(SEQ ID NO: 14594).
특정 구현예에서, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14573과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 서열을 포함하고, 다른 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14574과 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99%, 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14573로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 적어도 20개 또는 적어도 25개의 연속 뉴클레오티드를 포함하고, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14574로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 적어도 20개 또는 적어도 25개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 한 트랜스포존 말단은 SEQ ID NO: 14591로부터 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 적어도 20개를 포함하고, 다른 말단은 SEQ ID NO: 14593로부터의 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 적어도 20개를 포함한다. 특정 구현예에서, 각각의 트랜스포존 말단은 역위 방향으로 SEQ ID NO: 14575을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14573, SEQ ID NO: 14579, SEQ ID NO: 14581, SEQ ID NO: 14582, SEQ ID NO: 14583, 및 SEQ ID NO: 14588로부터 선택된 서열, 및 SEQ ID NO: 14587, SEQ ID NO: 14588, SEQ ID NO: 14589 및 SEQ ID NO: 14586로부터 선택된 서열을 포함하고, piggyBac® 또는 piggyBac-유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14517 또는 SEQ ID NO: 14518를 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 표적 서열에 인접한 ITR인 CCCTTTGCCTGCCA (SEQ ID NO: 14622) (좌측 ITR) 및 TGGCAGTGAAAGGG (SEQ ID NO: 14623) (우측 ITR)을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 헬리코베르파 아르미게라로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00344
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 헬리코베르파 아르미게라로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00345
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00346
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 펙티노포라 고시피엘라로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00347
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 펙티노포라 고시피엘라로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00348
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00349
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 크테노플루시아 아그나타로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00350
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 크테노플루시아 아그나타로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00351
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00352
특정 구현예에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCCTAGAAGCCCAATC (SEQ ID NO: 14564)의 ITR 서열을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 아그로티스 입실론으로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00353
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 아그로티스 입실론으로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00354
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00355
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 메가칠레 로툰다타로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00356
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 메가칠레 로툰다타로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00357
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00358
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 봄부스 임파티엔스로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00359
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 봄부스 임파티엔스로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00360
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00361
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 마메스트라 브라시카로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00362
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 마메스트라 브라시카로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00363
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00364
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 메이에티올라 데스럭토르로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00365
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 메이에티올라 데스럭토르로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00366
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00367
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 아피스 멜리페라로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00368
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 아피스 멜리페라로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00369
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00370
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 메소르 보우비에리로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00371
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 메소르 보우비에리로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00372
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00373
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 트랜스포사아제 효소는 piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소이다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 트리코플루시아 니로부터 단리되거나 유래한다. piggyBac® (PB) 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제 효소는 하기 서열과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00374
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 트리코플루시아 니로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00375
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00376
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00377
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00378
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00379
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 하기의 서열을 포함한다:
Figure pct00380
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14561 및 SEQ ID NO: 14562을 포함하고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14558를 포함한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 SEQ ID NO: 14609 및 SEQ ID NO: 14610을 포함하고, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 14558를 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 아피스 고시피이로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCTTCCAGCGGGCGCGC (SEQ ID NO: 14565)의 ITR 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 칠로 수프레살리스로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCCAGATTAGCCT (SEQ ID NO: 14566)의 ITR 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 헬리오티스 비레센스로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCCTTAATTACTCGCG (SEQ ID NO: 14567)의 ITR 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 펙티노포라 고시피엘라로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCCTAGATAACTAAAC (SEQ ID NO: 14568)의 ITR 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 아노펠레스 스테펜시(Anopheles stephensi)로부터 단리되거나 유래한다. 특정 구현예에서, piggyBac® 또는 piggyBac 유사 트랜스포존은 CCCTAGAAAGATA (SEQ ID NO: 14569)의 ITR 서열을 포함한다.
hAT 패밀리 내의 DNA 트랜스포존은 식물 및 동물에서 널리 퍼져있다. 헤르메스(Hermes) 트랜스포존, Ac 트랜스포존, 호보(hobo) 트랜스포존 및 Tol2 트랜스포존을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 다수의 활성 hAT 트랜스포존 시스템들이 확인되었고 작용하는 것으로 밝혀졌다. hAT 패밀리는 그의 트랜스포사아제의 일차 서열에 근거하여 AC 서브패밀리와 Buster 서브패밀리로서 분류된 2개의 패밀리들로 구성된다. hAT 패밀리의 멤버들은 클래스 II 전위 가능한 요소에 속한다. 클래스 II 이동성 요소는 전위의 절단 및 붙이기 기작을 이용한다. hAT 요소들은 유사한 트랜스포사아제, 짧은 말단 역위 반복부, 및 게놈 표적의 8개 염기쌍 중복을 공유한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법은 TcBuster 트랜스포존 및/또는 TcBuster 트랜스포사아제를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법은 TcBuster 트랜스포존 및/또는 과활성 TcBuster 트랜스포사아제를 포함할 수 있다. 과활성 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제의 절제 및/또는 삽입 빈도에 비해 증가된 절제 및/또는 증가된 삽입 빈도를 나타낸다. 과활성 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제의 전위 빈도에 비해 증가된 전위 빈도를 나타낸다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사아제는 하기의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
Figure pct00381
(GenBank 등록번호 ABF20545 및 SEQ ID NO: 17090).
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 하기 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 야생형 TcBuster 트랜스포사아제와 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
Figure pct00382
(GenBank 등록번호 ABF20545 및 SEQ ID NO: 17090).
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사아제는 하기를 포함하거나, 이로 이루어진 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00383
(GenBank 등록번호 DQ481197 및 SEQ ID NO: 17091).
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 하기를 포함하거나 이로 이루어진 핵산 서열에 의해 코딩된 야생형 TcBuster 트랜스포사아제와 적어도 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
Figure pct00384
(GenBank 등록번호 DQ481197 및 SEQ ID NO: 17091).
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 자연 발생 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 비-자연 발생 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 자연 발생 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 서열에 의해 코딩된다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 비-자연 발생 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 서열에 의해 코딩된다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17090의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17091의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 치환, 역위, 삽입, 결실, 전위 및 프레임시프트 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 변형된, 합성, 인공 또는 비-자연 발생 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 변형된, 합성, 인공 또는 비-자연 발생 핵산을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 DNA 결합 및 올리고머화 도메인, 삽입 도메인 및 Zn-BED 도메인 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 순 전하 중성 pH를 증가시키는 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17090의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 야생형 TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17091의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 서열에 의해 코딩된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 223의 아스파르트산(D)(D223), 위치 289의 아스파르트산(D)(D289) 및 위치 589의 아스파르트산(E)(E289)의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 223, 289 및/또는 289에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 이들 사이의 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 223, 289 및/또는 289에서 70개 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 223, 289 및/또는 289에서 80개 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 중성 아미노산, 리신(L) 또는 아르기닌(R)으로의 아스파르트산(D) 또는 아스파르트산(E)의 아미노산 치환을 포함한다(예를 들면, SEQ ID NO: 17090의 D223L, D223R, D289L, D289R, E289L, E289R).
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 Q82E, N85S, D99A, D132A, Q151S, Q151A, E153K, E153R, A154P, Y155H, E159A, T171K, T171R, K177E, D183K, D183R, D189A, T191E, S193K, S193R, Y201A, F202D, F202K, C203I, C203V, Q221T, M222L, I223Q, E224G, S225W, D227A, R239H, E243A, E247K, P257K, P257R, Q258T, E263A, E263K, E263R, E274K, E274R, S278K, N281E, L282K, L282R, K292P, V297K, K299S, A303T, H322E, A332S, A358E, A358K, A358S, D376A, V377T, L380N, I398D, I398S, I398K, F400L, V431L, S447E, N450K, N450R, I452F, E469K, K469K, P510D, P510N, E517R, R536S, V553S, P554T, P559D, P559S, P559K, K573E, E578L, K590T, Y595L, V596A, T598I, K599A, Q615A, T618K, T618K, T618R, D622K 및 D622R 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 154, 155, 159, 171, 177, 183, 189, 191, 193, 201, 202, 203, 221, 223, 224, 225, 227, 239, 243, 247, 257, 258, 263, 274, 278, 281, 282, 292, 297, 299, 303, 322, 332, 358, 376, 377, 380, 398, 400, 431, 447, 450, 452, 469, 510, 517, 536, 553, 554, 559, 573, 578, 590, 595, 596, 598, 599, 615, 618, 및 622에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 이들 사이의 임의의 개수의 아미노산 내에서 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 E247K, V297K, A358K, S278K, E247R, E274R, V297R, A358R, S278R, T171R, D183R, S193R, P257K, E263R, L282K, T618K, D622R, E153K, N450K, T171K, D183K, S193K, P257R, E263K, L282R, T618R, D622K, E153R 및 N450R 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 153, 171, 183, 193, 247, 257, 263, 274, 278, 282, 297, 358, 450, 618, 622에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 이들 사이의 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변이는 SEQ ID NO: 17090의 V377T/E469K, V377T/E469K/R536S, A332S, V553S/P554T, E517R, K299S, Q615A/T618K, S278K, A303T, P510D, P510N, N281S, N281E, K590T, Q258T, E247K, S447E, N85S, V297K, A358K, I452F, V377T/E469K/D189A, K573E/E578L, I452F/V377T/E469K/D189A, A358K/V377T/E469K/D189A, K573E/E578L/V377T/E469K/D189A, T171R, D183R, S193R, P257K, E263R, L282K, T618K, D622R, E153K, N450K, T171K, D183K, S193K, P257R, E263K, L282R, T618R, D622K, E153R, N450R, E247K/E274K/V297K/A358K 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 85, 153, 171, 189, 193, 247, 257, 258, 263, 274, 278, 281, 282, 297, 299, 303, 332, 358, 377, 450, 469, 447, 452, 469, 510, 517, 536, 553, 554, 573, 578, 590, 615, 618, 622에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 이들 사이의 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 V377T/E469K, V377T/E469K/R536S, V553S/P554T, Q615A/T618K, S278K, A303T, P510D, P510N, N281S, N281E, K590T, Q258T, E247K, S447E, N85S, V297K, A358K, I452F, V377T/E469K/D189A 및 K573E/E578L 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 85, 189, 247, 258, 278, 281, 297, 303, 358, 377, 447, 452, 469, 510, 536, 553, 554, 573, 578, 590, 615, 618에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 이들 사이의 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 Q151S, Q151A, A154P, Q615A, V553S, Y155H, Y201A, F202D, F202K, C203I, C203V, F400L, I398D, I398S, I398K, V431L, P559D, P559S, P559K, M222L 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090의 위치 151, 154, 615, 553, 155, 201, 202, 203, 400, 398, 431, 559, 222에서 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 임의의 이들 사이의 수의 아미노산 이내의 아미노산 치환을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090에 따라 넘버링될 때, V377T, E469K, 및 D189A 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 1090에 따라 넘버링될 때, K573E 및 E578L 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17090에 따라 넘버링될 때, 아미노산 치환 I452K을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090에 따라 넘버링될 때, A358K 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090에 따라 넘버링될 때, V297K 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090에 따라 넘버링될 때, N85S 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090에 따라 넘버링될 때, I452F, V377T, E469K, 및 D189A 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090에 따라 넘버링될 때, A358K, V377T, E469K, 및 D189A 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, 돌연변이체 TcBuster 트랜스포사아제는 야생형 TcBuster 트랜스포사아제에 비해 하나 이상의 서열 변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 서열 변이는 SEQ ID NO: 17090에 따라 넘버링될 때, V377T, E469K, D189A, K573E 및 E578L 중 하나 이상을 포함한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 하기 서열을 포함하거나 하기로 이루어진 5' 역위 반복부를 인식한다:
Figure pct00385
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 하기 서열을 포함하거나 하기로 이루어진 3' 역위 반복부를 인식한다:
Figure pct00386
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17092의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 역위 반복부 및 SEQ ID NO: 17093의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 3' 역위 반복부를 인식한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 하기 서열을 포함하거나 하기로 이루어진 5' 역위 반복부를 인식한다:
Figure pct00387
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 하기 서열을 포함하거나 하기로 이루어진 3' 역위 반복부를 인식한다:
Figure pct00388
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17094의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5' 역위 반복부 및 SEQ ID NO: 17095의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 3' 역위 반복부를 인식한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17092, 17093, 17094 or 17095 중 하나 이상과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95,% 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트 동일성을 가진 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역위 반복부를 인식한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역위 반복부를 인식하고, 본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17092, 17093, 17094 또는 17095, 또는 이들의 임의의 부분과 90% 내지 100% 동일성을 가진 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 97개, 99개 또는 임의의 이들 사이의 수의 연속 뉴클레오티드들을 가진 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역위 반복부를 인식한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17092, 17093, 17094 또는 17095, 또는 이들의 임의의 부분과 90% 내지 100% 동일성을 가진 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 97개, 99개 또는 임의의 이들 사이의 수의 불연속 뉴클레오티드들을 가진 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역위 반복부를 인식한다.
본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포존은 3' 역위 반복부 및 5' 역위 반복부를 포함한다. 본 개시 내용의 조성물 및 방법의 일부 구현예에서, TcBuster 트랜스포사아제는 SEQ ID NO: 17092, 17093, 17094 또는 17095, 또는 이들의 임의의 부분과 90% 내지 100% 동일성을 가진 적어도 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 97개, 99개 또는 임의의 이들 사이의 수의 불연속 뉴클레오티드들을 가진 서열을 포함하거나 이로 이루어진 3' 역위 반복부 및 5' 역위 반복부를 포함하는 TcBuster 트랜스포존을 인식한다.
본 개시 내용 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 다수의 이러한 방법을 포함하고, "용량"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 용량 및 이의 등가물에 대한 언급 등을 포함한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용가능한 오류 범위 내를 의미하고, 이는 예를 들어 측정 시스템의 한계와 같이 값을 측정 또는 결정하는 방법에 따라 부분적으로 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 1개 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 또는 최대 10%, 또는 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 열배 내, 바람직하게는 5배 내, 더욱 바람직하게는 2배 내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구 범위에서 기술되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내에서 의마한다고 가정되어져야 한다.
본 개시 내용은 단리되거나 실질적으로 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질 조성물을 제공한다. "단리된" 또는 "정제된" 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 또는 이의 생물학적 활성 부분은 이것의 자연 발생 환경에서 발견되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 정상적으로 동반되거나 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없다. 따라서, 단리된 또는 정제된 폴리뉴클레오티드 또는 단백질은, 재조합 기술에 의해 생산될 때 다른 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다. 최적으로, "단리된" 폴리뉴클레오티드는 그 폴리뉴클레오티드가 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 폴리뉴클레오티드(즉, 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단 위치에 있는 서열)에 자연적으로 플랭킹하는 서열(최적으로 단백질 코딩 서열)이 없다. 예를 들어, 각종 구현예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 그 폴리뉴클레오티드가 유래된 세포의 게놈 DNA에서 이 폴리뉴클레오티드를 자연적으로 플랭킹하는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 실질적으로 세포 물질이 없는 단백질은 오염 단백질이 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% (건조 중량 기준) 미만인 단백질 제제를 포함한다. 본 개시 내용의 단백질 또는 생물학적으로 활성인 이의 부분이 재조합적으로 제조될 때, 최적으로 배양 배지는 화학적 전구체 또는 관심 화학물질의 비단백질의 약 30%, 20%, 10%, 5%, 또는 1% (건조 중량 기준) 미만을 나타낸다.
본 개시 내용은 개시된 DNA 서열의 단편 및 변이체 및 이들 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질을 제공한다. 본 개시 내용을 통해 사용된 바, 용어 "단편"은 DNA 서열의 일부 또는 아미노산 서열의 일부를 지칭하고, 그리하여 이로써 코딩되는 단백질을 지칭한다. 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열의 단편은 천연 단백질의 생물학적 활성 및 이에 따라 본원에 기재된 바와 같은 표적 DNA 서열에 대한 DNA 인식 또는 결합 활성을 보유하는 단백질 단편을 코딩할 수 있다. 대안적으로, 하이브리드화 프로브로서 유용한 DNA 서열의 단편은 일반적으로 생물학적 활성을 보유하거나 프로모터 활성을 보유하지 않는 단백질을 코딩하지 않는다. 따라서, DNA 서열의 단편은 적어도 약 20개의 뉴클레오티드, 약 50개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드 및 최대로는 전장인 본 개시 내용의 폴리뉴클레오티드 범위일 수 있다.
본 개시 내용의 핵산 또는 단백질은 후속적으로 최종 목적지 벡터로 어셈블리될 수 있는 표적 벡터에서 모노머 단위 및/또는 반복 단위를 사전어셈블링하는 것을 포함하는 모듈식 접근법에 의해 구축될 수 있다. 본 개시 내용의 폴리펩티드는 본 개시 내용의 반복 모노머를 포함할 수 있고, 후속적으로 최종 목적지 벡터로 어셈블리될 수 있는 표적 벡터에서 반복 단위를 사전어셈블링에 의한 모듈식 접근법에 의해 구축될 수 있다. 본 개시 내용은 이 방법에 의해 생성된 폴리펩티드뿐 아니라 이들 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 본 개시 내용은 상기 모듈식 접근법에 의해 생성된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 유기체 및 세포를 제공한다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 특히 단일 모노클로날 항체(아고니스트 및 안타고니스트 항체를 포함) 및 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물을 포함한다. 본원에서 정의된 바와 같은 항체의 천연 또는 합성 유사체, 돌연변이, 변이체, 대립유전자, 상동체 및 이종상동체(본원에서는 총칭하여 "유사체"로 지칭됨)를 이용하는 것은 또한 본원의 범위 내에 존재한다. 따라서, 본원에서 하나의 구현예에 따르면, 용어 "본원의 항체"는 이것의 가장 넓은 의미에서 이러한 유사체를 포함한다. 일반적으로, 이러한 유사체에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 항체와 비교할 때 대체, 결실 및/또는 부가되어져 있을 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같은 "항체 단편" 및 이의 모든 문법적 변이체는 온전한 항체의 항원 결합 부위 또는 가변 영역을 포함하는 온전한 항체의 일부로서 정의되고, 이때 상기 일부는 온전한 항체의 Fc 영역의 불변 중쇄 도메인(즉, 항체 아이소타입에 따라 CH2, CH3, 및 CH4)이 결여되어 있다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'- SH, F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 제한 없이 하기를 포함하는, 연속의 아미노산 잔기의 중단되지 않는 서열로 이루어진 1차 구조를 가진 폴리펩티드인 임의의 항체 단편(본원에서 "단일-사슬 항체 단편" 또는 "단일 사슬 폴리펩티드"): (1) 단일-사슬 Fv(scFv) 분자 (2) 연관된 중쇄 모이어티 없이 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 포함하는 오직 하나의 경쇄 가변 도메인 또는 그의 단편을 포함하는 단일 사슬 폴리펩티드, 및 (3) 연관된 경쇄 모이어티 없이, 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 포함하는 오직 하나의 중쇄 가변 영역 또는 그 단편을 함유하는 단일 사슬 폴리펩티드; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 또는 다가 구조를 포함한다. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편에서, 중쇄(들)는 온전한 항체의 비-Fc 영역에서 발견된 임의의 불변 도메인 서열(예, IgG 아이소타입에서 CHI)을 포함할 수 있고/있거나 온전한 항체에서 발견된 임의의 힌지 영역 서열을 포함할 수 있고/있거나 중쇄(들)의 불변 도메인 서열 또는 힌지 영역 서열에 융합되어 있거나 위치된 류신 지퍼 서열을 포함할 수 있다. 용어는 (예를 들어, 낙타류로부터의 것인) 일반적으로 단일 모노머 가변 항체 도메인을 가진 항체 단편으로 지칭되는 단일 도메인 항체("sdAB")를 추가로 포함한다. 이러한 항체 단편 유형은 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다.
"결합"은 거대분자들 사이(예를 들어, 단백질과 핵산 사이)의 서열-특이적, 비공유 상호작용을 지칭한다. 결합 상호작용의 모든 구성요소는 전체로서의 상호작용이 서열-특이적인 한 서열-특이적일 필요는 없다(예를 들어, DNA 백본 내 포스페이트 잔기와의 접촉).
용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 인용된 요소들을 포함하지만 다른 것들을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는 데 사용시 "본질적으로 이루어진"이란, 의도된 목적을 위해 사용시 조합에 임의의 필수적으로 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본원에서 정의된 바와 같은 요소를 본질적으로 이루는 조성물은 미량의 오염물질 또는 불활성 담체를 배제하지 않는다. "로 이루어진"이란 다른 성분들 및 실질적인 방법 단계의 미량 요소 이상을 배제하는 것을 의미한다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의된 구현예는 본 개시 내용의 범위 내에 있다.
용어 "에피토프"는 폴리펩티드의 항원성 결정인자를 지칭한다. 에피토프는 에피토프에 고유한 공간적 형태로 3개의 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 4, 5, 6, 또는 7개의 아미노산으로 이루어지고, 및 더욱 통상적으로 적어도 8, 9, 또는 10개의 이러한 아미노산으로 이루어진다. 아미노산의 공간적 형태를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다.
본원에서 이용된 바, "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 후속해서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA에서 유래되는 경우, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"유전자 발현"은 유전자에 포함된 정보의 유전자 생성물로의 전환을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, 리보자임, shRNA, 마이크로 RNA, 구조적 RNA 또는 RNA의 임의의 기타 유형) 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 편집과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 및 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조정" 또는 "조절"은 유전자의 활성에서 변화를 지칭한다. 발현의 조절은 이에 제한되는 것은 아니나 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된" 또는 그 등가물(예를 들어, "작동적으로 연결되어진")은 둘 이상의 분자가 하나 또는 둘 모두의 분자 또는 그 조합에 기인하는 기능에 영향을 미치도록 상호작용할 수 있도록 서로에 대해 위치되어 있음을 의미한다.
비공유적으로 연결된 성분 및 비공유적으로 연결된 성분을 제조하고 이용하는 방법이 개시된다. 다양한 성분들은 본원에서 설명된 바와 같이 다양한 상이한 형태를 취할 수 있다. 예를 들어, 비공유적으로 연결된(즉, 작동적으로 연결된) 단백질은 당업계에서 하나 이상의 문제를 피하는 일시적인 상호작용을 허용하기 위해 사용될 수 있다. 비공유적으로 연결된 성분, 예컨대 단백질의 결합 및 해리하는 능력은 기능적 연관을 가능하게 하는데, 이러한 연관이 원하는 활성에 요구되는 상황 하에서만 또는 주로 가능하게 한다. 연결은 원하는 효과를 허용하기에 충분한 기간일 수 있다.
유기체의 게놈에서 특정 유전자좌로 단백질을 지시하는 방법이 개시되어 있다. 방법은 DNA 국소화 성분을 제공하고 이펙터 분자를 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 DNA 국소화 성분 및 이펙터 분자는 비공유 연결을 통해 작동적으로 연결될 수 있다.
용어 "scFv"는 단일-사슬 가변 단편이다. scFv는 링커 펩티드로 연결된, 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합 단백질이다. 링커 펩티드는 약 5 내지 40개의 아미노산, 또는 약 10 내지 30개의 아미노산 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 또는 40개의 아미노산 길이일 수 있다. 단일-사슬 가변 단편은 완전 항체 분자에서 발견된 불변 Fc 영역이 결여되어 있고, 따라서 항체를 정제하는 데 사용되는 공통 결합 부위(예, 단백질 G)가 결여되어 있다. 상기 용어는 세포의 세포질에서 안정적이고, 세포내 단백질에 결합할 수 있는 항체인 인트라바디인 scFv를 포함한다.
용어 "단일 도메인 항체"는 특정 항원에 대해 선택적으로 결합할 수 있는 단일 모노머 가변 항체 도메인을 가진 항체 단편을 의미한다. 단일-도메인 항체는 일반적으로 전체 항체와 유사한 항원 친화성을 가지나, 내열성이 높고 세제 및 고농도 우레아에 대해 안정적인 공통 IgG 또는 중쇄 항체의 하나의 가변 도메인(VH)를 포함하는 약 110개의 아미노산 길이의 펩티드 사슬이다. 예는 낙타류 또는 어류 항체로부터 유래된 것이다. 대안적으로, 단일-도메인 항체는 4개의 사슬을 가진 통상의 뮤린 또는 인간 IgG로부터 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합한다" 및 "특이적 결합"은 상이한 항원들의 균질한 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하는 항체, 항체 단편 또는 나노바디의 능력을 의미한다. 특정 구현예에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플에서 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원을 구별할 것이다. 특정 구현예에서, 약 10배 내지 100배 또는 이상(예를 들어, 약 1000배 또는 10,000배 초과)로 구별할 것이다. "특이성"은 상이한 항원성 표적에 비해 한 항원성 표적에 우선적으로 결합하는 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편, 예컨대, 나노바디의 능력을 의미하고 반드시 고친화성을 암시하지는 않는다.
결합에 충분한 조건이 존재하는 한, "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 정의하는 핵산 서열이다.
용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드들을 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 상보적 가닥의 서열도 정의한다. 따라서, 핵산은 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥도 포괄할 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 동일한 구조를 보유하거나 동일한 단백질을 코딩하는 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 상보체도 포괄한다.
본 개시 내용의 프로브는 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 표적 서열에 하이브리드화할 수 있는 단일 가닥 핵산을 포함할 수 있다. 따라서, 본 개시 내용의 핵산은 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화하는 프로브를 지칭할 수 있다.
본 개시 내용의 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 분자의 대부분이 단일 가닥일 때조차도 이중 가닥 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 분자의 대부분이 이중 가닥일 때조차도 단일 가닥 서열을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 게놈 DNA, cDNA, RNA 또는 이들의 하이브리드를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 데옥시리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드의 조합을 함유할 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 우라실, 아데닌, 타이민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 이소사이토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 비-자연 아미노산 및 변형을 포함하도록 합성될 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 개시 내용의 핵산은 그의 전체 서열이든 아니면 이의 임의의 일부이든 관계없이 비-자연 생성 핵산일 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 자연적으로 생성되지 않아, 전체 핵산 서열을 비-자연 생성 핵산 서열로 만드는 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있다. 본 개시 내용의 핵산은 하나 이상의 중복된, 역위된 또는 반복된 서열을 포함할 수 있고, 이의 결과로 생긴 서열은 자연적으로 생성되지 않아, 전체 핵산 서열을 비-자연 생성 핵산 서열로 만든다. 본 개시 내용의 핵산은 자연적으로 생성되지 않아, 전체 핵산 서열을 비천연 생성 핵산 서열로 만드는 변형된, 인공 또는 합성 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
유전 코드에서의 중복을 고려할 때, 복수의 뉴클레오티드 서열들이 임의의 특정 단백질을 코딩할 수 있다. 모든 이러한 뉴클레오티드 서열들이 본원에서 고려된다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 공간적으로 연결되어 있는 프로모터의 조절 하에 있는 유전자의 발현을 의미한다. 프로모터는 그의 조절 하에 있는 유전자의 5'(업스트림) 또는 3'(다운스트림)에 위치될 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 프로모터가 유래된 유전자에서 프로모터와 그에 의해 조절되는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리의 변경은 프로모터 기능의 손실 없이 허용될 수 있다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여할 수 있거나, 활성화시킬 수 있거나 향상시킬 수 있는 합성 또는 자연 유래의 분자를 의미한다. 프로모터는 발현을 더 향상시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특정 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 전사의 시작 부위로부터 수천 개 염기쌍만큼 멀리 위치될 수 있는 원위 인핸서 및 리프레서 요소도 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 장기에 대하여, 또는 발현이 일어나는 발생 단계에 대하여, 또는 외부 자극, 예컨대, 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제에 대한 반응으로 유전자 성분의 발현을 항시적으로 또는 차등적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예로는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 오퍼레이터-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, EF-1 알파 프로모터, CAG 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터가 있다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 상보적인"은 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 180개, 270개, 360개, 450개 또는 540개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 제2 서열의 상보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 제1 서열을 의미하거나, 2개의 서열들이 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 하이브리드화한다는 것을 의미한다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일한"은 제1 서열과 제2 서열이 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 180개, 270개, 360개, 450개 또는 540개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것, 또는 핵산에 대하여 제1 서열이 제2 서열의 상보체에 실질적으로 상보적인 경우를 의미한다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 핵산을 기술하기 위해 사용될 때 용어 "변이체"는 (i) 언급된 뉴클레오티드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 언급된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 언급된 핵산 또는 이의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에서 언급된 핵산, 이의 상보체 또는 이와 실질적으로 동일한 서열에 하이브리드화하는 핵산을 의미한다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을 의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다. 벡터는 아미노산과 DNA 서열, RNA 서열, 또는 DNA 및 RNA 서열 둘 다의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 펩티드 또는 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용될 때 용어 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 상이한 아미노산 서열을 갖되 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 변이체는 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산 서열을 가진 언급된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질도 의미할 수 있다.
아미노산의 보존적 치환, 즉 아미노산을 유사한 성질(예를 들면, 하전된 영역의 친수성, 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은 전형적으로 약간의 변화를 수반하는 것으로서 당분야에서 인정된다. 이 약간의 변화는 당분야에서 이해되는 바와 같이 부분적으로 아미노산의 하이드로패틱 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 확인될 수 있다(Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982)). 아미노산의 하이드로패틱 지수는 그의 소수성 및 전하의 고려에 기반을 둔다. 유사한 하이드로패틱 지수의 아미노산은 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유할 수 있다. 한 양태에서, ±2의 하이드로패틱 지수를 가진 아미노산은 치환된다. 아미노산의 친수성은 생물학적 기능을 보유하는 단백질이라는 결과를 가져올 치환을 보여주는 데 사용될 수도 있다. 펩티드와 관련하여 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 잘 상호관련되어 있는 것으로 보고되어 있는 유용한 척도인, 그 펩티드의 가장 큰 국소 평균 친수성의 계산을 가능하게 한다. (전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제4,554,101호)
유사한 친수성 값을 가진 아미노산의 치환은 생물학적 활성, 예를 들면, 면역원성을 보유하는 펩티드라는 결과를 가져올 수 있다. 치환은 서로 ±2 내의 친수성 값을 가진 아미노산에 의해 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성 값 둘 다가 그 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그 관찰결과와 일치하여, 생물학적 기능과 양립될 수 있는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 성질에 의해 확인되는, 아미노산 및 특히 아미노산의 측쇄의 상대적 유사성에 의존하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "보존적" 아미노산 치환은 하기 표 A, B 또는 C에 기재된 바와 같이 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 폴리펩티드 및/또는 이러한 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 본 개시 내용의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변형에 의해 도입된 보존적 치환을 포함한다. 아미노산은 물리적 성질, 및 이차 및 삼차 단백질 구조에의 기여에 따라 분류될 수 있다. 보존적 치환은 유사한 성질을 가진 또 다른 아미노산에 의한 한 아미노산의 치환이다. 예시적 보존적 치환은 하기 표 A에 기재되어 있다.
Figure pct00389
대안적으로, 하기 표 B에 기재된 보존적 아미노산은 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY, N.Y. (1975), pp. 71-77]에 기재된 바와 같이 나누어질 수 있다.
Figure pct00390
대안적으로, 예시적 보존적 치환은 표 C에 기재되어 있다.
Figure pct00391
본 개시 내용의 폴리펩티드는 아미노산 잔기의 하나 이상의 삽입, 결실 또는 치환, 또는 이들의 임의의 조합을 가진 폴리펩티드뿐만 아니라, 아미노산 잔기의 삽입, 결실 또는 치환 이외의 변형을 가진 폴리펩티드도 포함하기 위한 것이라는 것을 이해해야 한다. 본 개시 내용의 폴리펩티드 또는 핵산은 하나 이상의 보존적 치환을 함유할 수 있다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "하나 초과의" 상기 언급된 아미노산 치환은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상의 언급된 아미노산 치환을 의미한다. 용어 "하나 초과"는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 언급된 아미노산 치환을 의미할 수 있다.
본 개시 내용의 폴리펩티드 및 단백질은 그의 전체 서열이든 아니면 이의 임의의 일부이든 관계없이 비-자연 생성 폴리펩티드 및 단백질일 수 있다. 본 개시 내용의 폴리펩티드 및 단백질은 자연적으로 생성되지 않아, 전체 아미노산 서열을 비-자연 생성 아미노산 서열로 만드는 하나 이상의 돌연변이, 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 수 있다. 본 개시 내용의 폴리펩티드 및 단백질은 하나 이상의 중복된, 역위된 또는 반복된 서열을 포함할 수 있고, 이의 결과로 생긴 서열은 자연적으로 생성되지 않아, 전체 아미노산 서열을 비-자연 생성 아미노산 서열로 만든다. 본 개시 내용의 폴리펩티드 및 단백질은 자연적으로 생성되지 않아, 전체 아미노산 서열을 비천연 생성 아미노산 서열로 만드는 변형된, 인공 또는 합성 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, "서열 동일성"은 디폴트 파라미터를 사용하는, 2개의 서열들을 블라스팅하는 독립형 실행가능한 BLAST 엔진 프로그램(bl2seq)(국립 생명공학 정보 센터(NCBI) ftp 사이트로부터 검색될 수 있음)을 사용함으로써 측정될 수 있다(Tatusova and Madden, FEMS Microbiol Lett., 1999, 174, 247-250; 전체로서 본원에 참고로 도입됨). 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열들과 관련하여 사용될 때 용어 "동일한" 또는 "동일성"은 각각의 서열의 특정된 영역에 걸쳐 동일한 잔기의 특정된 퍼센트를 의미한다. 이 퍼센트는 2개의 서열들을 최적으로 정렬하고, 특정된 영역에 걸쳐 상기 2개의 서열들을 비교하고, 동일한 잔기가 상기 서열들 둘 다에 존재하는 위치의 수를 확인하여 일치된 위치의 수를 수득하고, 일치된 위치의 수를 특정된 영역 내의 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 퍼센트를 수득함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열들이 상이한 길이를 갖거나 정렬이 하나 이상의 엇갈린(staggered) 말단을 생성하고 특정된 비교 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 잔기는 상기 계산의 분모에 포함되나 분자에는 포함되지 않는다. DNA와 RNA를 비교할 때, 타이민(T)과 우라실(U)은 동등한 것으로서 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 수행될 수 있거나, 컴퓨터 서열 알고리즘, 예컨대, BLAST 또는 BLAST 2.0을 사용함으로써 수행될 수 있다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "내인성"은 핵산 또는 단백질 서열이 그가 도입되는 표적 유전자 또는 숙주 세포와 자연적으로 관련되어 있다는 것을 의미한다.
본 개시 내용 전체에서 사용된 바와 같이, 용어 "외인성"은 자연 발생 핵산, 예를 들어 DNA 서열의 비-자연적으로 발생하는 다중 카피, 또는 비-자연 발생 게놈 위치에 위치된 자연 발생 핵산 서열을 포함하는, 표적 유전자 또는 그것이 도입되는 숙주 세포와 자연적으로 연관되지 않은 핵산 또는 단백질 서열을 지칭한다.
본 개시 내용은 DNA 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 숙주 세포 내로 도입하는 방법을 제공한다. "도입하는"은 상기 구축물이 숙주 세포의 내부로 들어가는 방식으로 폴리뉴클레오티드 구축물을 식물에게 제공하는 것을 의미한다. 본 개시 내용의 방법은 폴리뉴클레오티드 구축물이 숙주의 한 세포의 내부로 들어간다는 점만을 제외하고 폴리뉴클레오티드 구축물을 숙주 세포 내로 도입하는 특정 방법에 의존하지 않는다. 안정한 형질전환 방법, 일시적인 형질전환 방법 및 바이러스 매개 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는, 폴리뉴클레오티드 구축물을 박테리아, 식물, 진균 및 동물 내로 도입하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
상동성 재조합
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 CAR-TSCM 또는 CAR-TCM은 상동성 재조합에 의해 항원 수용체를 본 개시 내용의 1차 인간 T 세포에 도입함으로써 생산된다. 본 개시 내용의 특정 구현예에서, 상동성 재조합은 본 개시 내용의 게놈 편집 조성물 또는 구축물에 의해 유도되는 단일 또는 이중 가닥 절단에 의해 유도된다. 본 개시 내용의 상동성 재조합 방법은 게놈 서열에 본 개시 내용의 게놈 편집 조성물 또는 구축물을 접촉시켜 서열에 하나 이상의 절단을 유도하고 외인성 공여 서열 조성물에 게놈 서열 내 진입 지점을 제공하는 단계를 포함한다. 본 개시 내용의 공여 서열 조성물은 세포의 고유 DNA 복구 기구에 의해 유도된 진입 지점에서 게놈 서열에 통합된다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 상동성 재조합은 본 개시 내용의 항원 수용체 및/또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열을 "게놈 세이프 하버(genomic safe harbor)" 부위에 도입한다. 특정 구현예에서, 포유동물 게놈 서열은 게놈 세이프 하버 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 영장류 게놈 서열은 게놈 세이프 하버 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 인간 게놈 서열은 게놈 세이프 하버 부위를 포함한다.
게놈 세이프 하버 부위는 반드시 새로 삽입된 유전 요소가 신뢰성 있게 기능을 하고(예를 들어, 치료 유효한 발현 수준으로 발현되고) 숙주 생물체에 위험을 일으키는 해로운 변화를 숙주 게놈에 일으키지 않게 하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있다. 가능한 게놈 세이프 하버는 인간 알부민 유전자의 인트론 서열, 아데노 관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 염색체 19 상의 AAV 바이러스의 자연 발생적 통합 부위, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자의 부위 및 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 오르토 로그 부위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 상동성 재조합은 본 개시 내용의 항원 수용체 및/또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열을 내인성 T 세포 수용체 또는 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 중 하나 이상의 구성요소를 코딩하는 서열에 도입한다. 특정 구현예에서, 내인성 T 세포 수용체 또는 MHC를 코딩하는 게놈 서열 내에 상동성 재조합을 유도하는 것은 내인성 유전자를 파괴하고, 경우에 따라 내인성 유전자의 코딩 서열의 일부분을 본 개시 내용의 공여 서열 조성물로 대체시킨다. 특정 구현예에서, 내인성 T 세포 수용체 또는 MHC를 코딩하는 게놈 서열 내에 상동성 재조합을 유도하는 것은 내인성 유전자를 파괴하고, 경우에 따라 내인성 유전자의 전체 코딩 서열을 본 개시 내용의 공여 서열 조성물로 대체시킨다. 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 상동성 재조합에 의한 본 개시 내용의 항원 수용체 또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열의 도입은 항원 수용체를 내인성 T 세포 프로모터에 작동 가능하게 연결시킨다. 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 상동성 재조합에 의한 본 개시 내용의 항원 수용체 또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열의 도입은 항원 수용체 또는 치료 단백질을 전사 또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결시킨다. 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 상동성 재조합에 의한 본 개시 내용의 항원 수용체 또는 공여 서열 조성물을 코딩하는 서열의 도입은 항원 수용체 또는 치료 단백질을 전사 조절 요소에 작동 가능하게 연결시킨다. 특정 구현예에서, 전사 조절 요소는 내인성 T 세포 5'UTR을 포함한다.
상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 적어도 하나의 1차 T 세포의 게놈 서열과 접촉한다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 1차 T 세포의 일부분의 게놈 서열과 접촉한다. 특정 구현예에서, 1차 T 세포의 일부분은 다수의 T 세포 중 총 1차 T 세포 수의 적어도 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트이다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물은 다수의 T 세포 중 각각의 1차 T 세포의 게놈 서열과 접촉한다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물은 단일 가닥 절단을 유도한다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물은 이중 가닥 절단을 유도한다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 도입 단계는 공여 서열 조성물을 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 공여 서열 조성물은 항원 수용체를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 구현예서, 공여 서열 조성물은 항원 수용체, 5' 게놈 서열 및 3 '게놈 서열을 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 5' 게놈 서열은 게놈 편집 조성물에 의해 유도된 절단 지점의 5'에 있는 1차 T 세포의 게놈 서열과 상동이거나 동일하고 상기 3' 게놈 서열은 게놈 편집 조성물에 의해 유도된 절단 지점의 3'에 있는 1차 T 세포의 게놈 서열과 상동이거나 동일하다. 특정 구현예에서, 5' 게놈 서열 및/또는 3' 게놈 서열은 적어도 50 bp, 100 bp, 적어도 200 bp, 적어도 300 bp, 적어도 400 bp, 적어도 500 bp, 적어도 600 bp, 적어도 700 bp, 적어도 800 bp, 적어도 900 bp, 적어도 1000 bp, 적어도 1100 bp, 적어도 1200 bp, 적어도 1300 bp, 적어도 1400, 또는 적어도 1500 bp, 적어도 1600 bp, 적어도 1700 bp, 적어도 1800 bp, 적어도 1900 bp, 적어도 2000 bp 길이 또는 종점을 포함하여 이들 중 임의의 염기쌍(bp) 길이를 포함한다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물 및 공여 서열 조성물은 게놈 서열과 동시에 또는 순차적으로 접촉된다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물 및 공여 서열 조성물은 게놈 서열과 순차적으로 접촉되고, 게놈 편집 조성물이 먼저 제공된다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물은 DNA 결합 도메인을 코딩하는 서열 및 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물은 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, DNA 결합 도메인은 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, DNA 결합 도메인은 TALEN의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, DNA 결합 도메인은 ZFN의 DNA 결합 도메인을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 Cas9 뉴클레아제 또는 이의 서열을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 불활성 Cas9(SEQ ID NO: 17009, 위치 10에서 아스파르트산(D)에서 알라닌(A)으로의 치환(D10A) 및 위치 840에서 히스티딘(H)에서 알라닌(A)으로의 치환(H840A)을 포함)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 짧은 불활성 Cas9(SEQ ID NO: 17008, 위치 10에서 아스파르트산(D)에서 알라닌(A)으로의 치환(D10A) 및 위치 540의 아스파라긴(N)에서 알라닌(A)으로의 치환(N540A)을 포함)를 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하거나 추가로 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함한다. 특정 구현예에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051을 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 TALEN 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함하거나 추가로 포함한다. 게놈 편집 조성물의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 ZFN 또는 이의 뉴클레아제 도메인을 포함하거나 추가로 포함한다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물은 게놈 서열 내 절단을 유도하고, 공여 서열 조성물은 1차 T 세포의 내인성 DNA 복구 기전을 사용하여 삽입된다. 상동성 재조합을 포함하는 도입 단계의 특정 구현예에서, 공여 서열 조성물의 삽입은 게놈 편집 조성물의 DNA 결합 부위를 제거함으로써 게놈 편집 조성물의 추가 활성을 방지한다.
본 개시 내용의 상동성 재조합 방법의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물 또는 구조물의 뉴클레아제 도메인은 1차 인간 T 세포의 게놈 서열 내 한정된 위치에서 절단을 도입할 수 있고, 호모다이머 또는 헤테로다이머를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제이다. 호모다이머 또는 헤테로다이머를 포함하는 이펙터 분자를 비롯한 이펙터 분자는 Cas9, Cas9 뉴클레아제 도메인 또는 이의 단편을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, Cas9는 촉매 불활성이거나 "불활성화된" Cas9(dCas9)이다. 특정 구현예에서, Cas9는 Cas9의 촉매 불활성 또는 "불활성화된" 뉴클레아제 도메인이다. 특정 구현예에서, dCas9는 본원에서 "작은" dCas9 또는 dSaCas9로 지칭되는, 전장의 촉매 불활성화된 Cas9로부터 유래된 더 짧은 서열에 의해 코딩된다.
특정 구현예에서, 불활성된 작은 Cas9(dSaCas9)는 활성의 뉴클레아제에 작동 가능하게 연결된다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용은 DNA 결합 도메인 및 분자 뉴클레아제를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진 융합 단백질을 제공하며, 상기 뉴클레아제는 작은 불활성화된 Cas9(dSaCas9)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 dSaCas9는 촉매 부위를 불활성화하는 돌연변이 D10A 및 N580A(밑줄 및 굵은체)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 개시 내용의 dSaCas9는 하기 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00392
특정 구현예에서, 본 개시 내용의 dCas9는 스타필로코커스 피오게네스로부터 단리되거나 또는 유래한 dCas9를 포함한다. 특정 구현예에서, dCas9는 dCas9의 아미노산 서열의 위치 10 및 840에서 촉매 부위를 불활성화시키는 치환을 가진 dCas9를 포함한다. 특정 구현예에서, 이 치환은 D10A 및 H840A이다. 특정 구현예에서, dCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
Figure pct00393
본 개시 내용의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 dCas9 또는 dSaCas9 및 IIS형 엔도뉴클레아제를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 개시 내용의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 IIS형 엔도뉴클레아제 및 dSaCas9를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 개시 내용의 특정 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 dSaCas9 및 Clo051을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 예시적 Clo051 뉴클레아제 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있거나, 이로 이루어질 수 있다: EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKY (SEQ ID NO: 17010).
예시적 dCas9-Clo051 뉴클레아제 도메인은 하기 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다(Clo051 서열은 밑줄, 링커는 굵은 이탤릭체, dCas9 서열은 이탤릭체로 나타냄):
Figure pct00394
특정 구현예에서, 1차 인간 T 세포의 게놈 DNA 내 한정된 위치에서 절단을 도입할 수 있는 뉴클레아제는 호모다이머 또는 헤테로다이머를 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 개시 내용의 게놈 편집 조성물 또는 구축물의 뉴클레아제 도메인은 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)로부터 단리, 유래 또는 재조합된 뉴클레아제 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. TALEN은 예정된 DNA 서열 또는 개별 핵산에 결합하는 디자이너 단백질을 만드는 방법을 제공하는 프로그램 가능한 DNA 결합 도메인을 가진 전사 인자이다. 모듈 DNA 결합 도메인은 전사 활성화제 유사(TAL: transcriptional activator-like) 단백질, 또는 더 구체적으로 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)에서 확인되어 관심의 DNA 서열에 결합하는 합성 전사 인자의 새로운(de novo) 생성을 가능하게 하며, 바람직할 경우, 단백질 또는 폴리펩티드 상에 존재하는 제2 도메인이 DNA와 관련된 활성을 수행할 수 있게 한다. TAL 단백질은 생물체 산토모나스(Xanthomonas)와 랄스토니아(Ralstonia)에서 유래하였다.
본 개시 내용의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물 또는 구축물의 뉴클레아제 도메인은 TALEN 및 IIS형 엔도뉴클레아제로부터 단리, 유도 또는 재조합된 뉴클레아제 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 개시 내용의 특정 구현예에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 개시 내용의 특정 구현예에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051(SEQ ID NO: 17010)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시 내용의 특정 구현예에서, 게놈 편집 조성물 또는 구축물의 뉴클레아제 도메인은 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 IIS형 엔도뉴클레아제로부터 단리, 유도 또는 재조합된 뉴클레아제 도메인을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 개시 내용의 특정 구현예에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다. 본 개시 내용의 특정 구현예에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051(SEQ ID NO: 17010)을 포함하거나, 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어질 수 있다.
본 개시 내용의 게놈 편집 조성물 또는 구축물의 특정 구현예에서, DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인은 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 게놈 편집 조성물 또는 구축물의 특정 구현예에서, DNA 결합 도메인 및 뉴클레아제 도메인은 비공유 결합을 통해 작동 가능하게 연결될 수 있다.
비-전위 기반 변형 방법
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 본 개시 내용의 변형된 HSC 또는 변형된 HSC 자손 세포는 전이유전자를 본 개시 내용의 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입함으로써 생성될 수 있다. 도입 단계는 비-전위 전달 시스템을 통한 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물의 전달을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기천공, 스핀-펙션, 공-배양, 트랜스펙션, 기계적 전달, 음파 전달, 진동 전달, 마그네토펙션 또는 나노입자 매개 전달 중 하나 이상을 포함한다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 리포좀 트랜스펙션, 인산칼슘 트랜스펙션, 푸진 트랜스펙션 및 덴드리머 매개 트랜스펙션을 포함한다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 기계적 트랜스펙션으로 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 세포 압착, 세포 충격 또는 유전자총 기법을 포함한다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 나노입자 매개 트랜스펙션으로 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 리포좀 전달, 마이셀에 의한 전달 및 폴리머로좀에 의한 전달을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 비-바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 이중 가닥 DNA(dsDNA), 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA), DoggyBone™ DNA, 나노플라스미드, 미니서클 DNA, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN), DDNA 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 mRNA(ssRNA), 및 이중 가닥 mRNA(dsRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 본 개시 내용의 트랜스포존을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 비-통합 비-염색체 벡터이다. 예시적 비-통합 비-염색체 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 통합 염색체 벡터이다. 통합 염색체 벡터는 아데노 관련 벡터(AAV), 렌티바이러스 및 감마-레트로바이러스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계는 벡터의 조합을 포함한다. 예시적 비제한적 벡터 조합은 바이러스 벡터와 비-바이러스 벡터, 복수의 비-바이러스 벡터들, 또는 복수의 바이러스 벡터들을 포함한다. 예시적 비제한적 벡터 조합은 DNA 유래 벡터와 RNA 유래 벡터의 조합, RNA와 역전사효소의 조합, 트랜스포존과 트랜스포사아제의 조합, 비-바이러스 벡터와 엔도뉴클레아제의 조합, 및 바이러스 벡터와 엔도뉴클레아제의 조합을 포함한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 게놈 변형은 핵산 서열을 안정적으로 통합시키거나, 핵산 서열을 일시적으로 통합시키거나, 핵산 서열의 부위 특이적 통합을 일으키거나, 핵산 서열의 편향된 통합을 일으킨다. 일부 구현예에서, 핵산 서열은 전이유전자이다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체외, 생체내, 시험관내 또는 제자리에서 핵산 서열 및/또는 게놈 편집 구축물을 HSC 또는 HSC 자손 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 게놈 변형은 핵산 서열을 안정적으로 통합시킨다. 일부 구현예에서, 안정한 염색체 통합은 무작위 통합, 부위 특이적 통합 또는 편향된 통합일 수 있다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 통합은 보조되지 않을 수 있거나 보조될 수 있다. 일부 구현예에서, 보조된 부위 특이적 통합은 부위 지정 뉴클레아제와 공-전달된다. 일부 구현예에서, 부위 지정 뉴클레아제는 게놈 통합 부위의 업스트림 및 다운스트림 영역에 대한 퍼센트 상동성을 함유하는 5' 및 3' 뉴클레오티드 서열 연장을 가진 전이유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 상동성 뉴클레오티드 연장을 가진 전이유전자는 상동성 재조합, 마이크로상동성 매개 말단 연결 또는 비상동성 말단 연결에 의한 게놈 통합을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 통합은 세이프 하버 부위에서 일어난다. 게놈 세이프 하버 부위는 반드시 새로 삽입된 유전 요소가 신뢰성 있게 기능을 하고(예를 들어, 치료 유효한 발현 수준으로 발현되고) 숙주 생물체에 위험을 일으키는 해로운 변화를 숙주 게놈에 일으키지 않게 하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있다. 가능한 게놈 세이프 하버는 인간 알부민 유전자의 인트론 서열, 아데노 관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 염색체 19 상의 AAV 바이러스의 자연 발생적 통합 부위, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자의 부위 및 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 오르토 로그 부위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 파괴하는 부위에서 일어난다. 일부 구현예에서, 표적 유전자 발현의 파괴는 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 서프레서, 출발 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서 부위 특이적 통합에 의해 일어난다. 일부 구현예에서, 부위 특이적 통합에 의해 표적화된 예시적 표적 유전자는 TRAC, TRAB, PDI, 임의의 면역억제 유전자, 및 동종 거부에 관여된 유전자를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 향상시키는 부위에서 일어난다. 일부 구현예에서, 표적 유전자 발현의 향상은 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 서프레서, 출발 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서 부위 특이적 통합에 의해 일어난다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 효소는 숙주 게놈에서 가닥 절단을 생성하여 전이유전자의 전달 또는 통합을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소는 단일 가단 절단을 생성한다. 일부 구현예에서, 효소는 이중 가단 절단을 생성한다. 일부 구현예에서, 절단 유도 효소의 예는 트랜스포사아제, 통합효소(integrase), 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas9, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), Cas-CLOVER™ 및 CPF1을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 절단 유도 효소는 DNA에 코딩된 상태로, mRNA에 코딩된 상태로, 단백질로서, 또는 가이드 RNA(gRNA)를 가진 핵단백질 복합체로서 세포에 전달될 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 벡터 매개 통합 부위 편향에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 렌티바이러스 벡터에 의해 조절된다. 일부 구현예에서, 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 감마-레트로바이러스 벡터에 의해 조절된다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 부위 특이적 전이유전자 통합 부위는 불안정한 염색체 삽입이다. 일부 구현예에서, 통합된 전이유전자는 침묵될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 절제될 수 있거나 추가 변형될 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자의 불안정한 통합이다. 일부 구현예에서, 불안정한 통합은 일시적인 비-염색체 통합, 반안정한 비-염색체 통합, 반영구적인 비-염색체 삽입 또는 불안정한 염색체 삽입일 수 있다. 일부 구현예에서, 일시적인 비-염색체 삽입은 에피-염색체 또는 세포질 삽입일 수 있다.
일부 구현예에서, 전이유전자의 일시적인 비-염색체 삽입은 염색체 내로 통합되지 않고, 변형된 유전 물질은 세포 분열 동안 복제되지 않는다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자의 반안정한 또는 영구적인 비-염색체 통합이다. 일부 구현예에서, DNA 벡터는 분열 세포의 핵에서의 자율 복제를 가능하게 하는 비-바이러스 벡터의 에피좀 보유를 위해 핵 매트릭스 단백질에 결합하는 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S-MAR) 모듈을 코딩한다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자의 불안정한 염색체 통합이다. 일부 구현예에서, 통합된 전이유전자는 침묵될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 절제될 수 있거나 추가 변형될 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 상동성 재조합(HR)에 의한 숙주 세포 유도 이중 가닥 절단 복구(상동성 유도 복구), 마이크로상동성 매개 말단 연결(MMEJ), 비상동성 말단 연결(NHEJ), 트랜스포사아제 매개 변형, 통합효소 매개 변형, 엔도뉴클레아제 효소 매개 변형 또는 재조합 효소 매개 변형을 통해 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 CRISPR-Cas9, TALEN, ZFN, Cas-CLOVER 및 cpf1을 통해 일어날 수 있다.
나노입자 전달
폴리(히스티딘)(즉, 폴리(L-히스티딘))은 불포화 질소 상에 고립전자쌍을 제공하는 이미다졸 고리로 인해 pH-민감성 중합체이다. 즉, 폴리(히스티딘)은 양성자화(protonation)-탈양성자화(deprotonation)를 통해 양쪽성 특성을 가진다. 다양한 구현예는 폴리(히스티딘)-기반 마이셀과 복합체화함으로써 유전자 편집 도구의 세포내 전달을 가능하게 한다. 특히, 다양한 구현예는 친수성 블록, 소수성 블록 및 하전된 블록으로 이루어진 트리블록 공중합체를 제공한다. 일부 구현예에서, 친수성 블록은 폴리(에틸렌 옥시드)(PEO)일 수 있고, 하전된 블록은 폴리(L-히스티딘)일 수 있다. 다양한 구현예에서 사용될 수 있는 예시적인 트리블록 공중합체는 PEO-b-PLA-b-PHIS이며, 각 블록에서 반복 단위의 가변 개수가 설계에 따라 달라진다. 유전자 편집 도구는 다양한 세포에서 유전자를 변형, 복구, 부가 및/또는 침묵시킬 수 있는 것으로서 인식된 다양한 분자일 수 있다. DNA에서 이중 가닥 절단(DSB)을 정확하고 효율적으로 복구하는 것은 세포에서 게놈 안정성을 유지하는 데 중요하다. DNA에 대한 구조적인 손상은 여러 세포 내 인자(예, 뉴클레아제, 반응성 산소 종 등)뿐 아니라 외부의 힘(예, 이온화 방사선, 자외선(UV) 방사선, 등) 중 임의의 것으로 인해 게놈에서 무작위로 및 예측불가능하게 일어날 수 있다. 특히, DNA에서 이중-가닥 절단(DSB)의 정확하고 효율적인 복구는 게놈 안정성을 유지하는 데 중요하다. 따라서, 세포는 자연적으로 여러 DNA 복구 메커니즘을 보유하며, 이는 특정 부위에서 제어된 DSB를 통해 DNA 서열을 변경하는 데 활용될 수 있다. 그러므로, 유전자 변형 도구는 DSB를 게놈에 도입하는 비특이적 DNA 뉴클레아제와 관련된 프로그래밍 가능한 서열-특이적 DNA 결합 모듈로 구성될 수 있다. 예를 들어, 주로 박테리아에서 발견되는 CRISPR은 짧은 직접 반복부를 함유하는 유전자좌이며, 후천성 원핵 면역계의 일부이며, 플라스미드 및 파지와 같은 외인성 서열에 대한 내성을 부여한다. RNA-가이드된 엔도뉴클레아제는 원핵 선천 면역의 구성요소인 CRISPR/CRISPR-관련 단백질 9(Cas9) 시스템에서 채택된 프로그래밍 가능한 유전 공학 도구이다.
구현예 마이셀의 트리블록 공중합체를 제조하기 위한 중간체로서 이용될 수 있는 디블록 공중합체는, 폴리(락티드)(PLA), 폴리(글리콜리드)(PLGA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) 및 폴리(트리메틸렌 카르보네이트)(PTMC)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌, 다양한 소수성 지방족 폴리(무수물), 폴리(핵산), 폴리(에스테르), 폴리(오르토 에스테르), 폴리(펩티드), 폴리(포스파젠) 및 폴리(사카라이드)에 결합된, PEG와 화학적으로 동의어인 친수성 생체적합 폴리(에틸렌 옥시드)(PEO)일 수 있다. 100% 페길화된 표면을 포함하는 중합체성 마이셀은 향상된 시험관 내 화학 안정성, 증가된 생체 내 생체이용률, 및 연장된 혈액 순환 반감기를 보유한다. 예를 들어, 중합체성 마이셀의 막 부분을 구성하는 지방족 폴리에스테르는 인체와 같은 생리적 조건에서 이들의 에스테르 결합의 가수분해에 의해 분해된다. 이들의 생분해성 성질로 인해, 지방족 폴리에스테르는 약물 전달 장치의 이식가능한 생체 재료, 생체흡수성 봉합사, 접착 장벽 및 조직 공학을 통한 부상 복구용 스캐폴드로서 사용되는 데 있어서 많은 관심을 받아왔다.
각종 구현예에서, 유전자 편집에 요구되는 분자(즉, 유전자 편집 도구)는 폴리(히스티딘)을 함유하는 자가-조립된 트리블록 공중합체로부터 형성된 하나 이상의 마이셀을 이용하여 세포에 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자 편집"은 유전자에 의해 코딩되는 생성물의 기능을 부가, 파괴 또는 변형시키기 위해 게놈 DNA에서의 핵산의 삽입, 결실 또는 교체를 지칭한다. 다양한 유전자 편집 시스템은 유전자 기능을 파괴하거나 활성화하기 위해 게놈 DNA를 절단하는 절단 효소(예, 뉴클레아제 또는 재조합효소)의 도입을 최소한도로 요구한다.
나아가, 새로운 또는 기존 뉴클레오티드/핵산의 삽입을 수반하는 유전자 편집 시스템에서, 절단 효소(예를 들면, 뉴클레아제, 재조합효소, 통합효소 또는 트랜스포사아제) 이외에 삽입 수단(예를 들면, DNA 주형 벡터, 전위 가능한 요소(트랜스포존 또는 레트로트랜스포존))을 세포에게 전달해야 한다. 재조합효소의 경우 이러한 삽입 수단의 예는 DNA 벡터를 포함할 수 있다. 다른 유전자 편집 시스템은 삽입 벡터와 함께 통합효소, 트랜스포존/레트로트랜스포존과 함께 트랜스포사아제 등의 전달을 요구한다. 일부 구현예에서, 절단 효소로서 사용될 수 있는 재조합효소의 예는 CRE 재조합효소이다. 다양한 구현예에서, 삽입 수단에서 사용될 수 있는 예시적 통합효소는 AAV, 감마 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 다수의 바이러스들 중 임의의 바이러스로부터 수득된 바이러스 기반 효소를 포함한다. 삽입 수단에서 사용될 수 있는 예시적 트랜스포존/레트로트랜스포존은 piggyBac® 트랜스포존, 슬립핑 뷰티 트랜스포존 및 L1 레트로트랜스포존을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 전이유전자는 생체내로 전달된다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체내 전이유전자 전달은 국소 전달, 흡착, 흡수, 전기천공, 스핀-펙션, 공동-배양, 트랜스펙션, 기계적 전달, 음파 전달, 진동 전달, 마그네토펙션에 의해, 또는 나노입자-매개 전달에 의해 일어날 수 있다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 트랜스펙션에 의한 생체내 전이유전자 전달은 리포좀 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 푸진 트랜스펙션 및 덴드리머-매개 트랜스펙션에 의해 일어날 수 있다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체내 기계적 전이유전자 전달은 세포 압착, 충격 및 유전자총에 의해 일어날 수 있다. 본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 생체내 나노입자 매개 전이유전자 전달은 리포좀 전달, 마이셀에 의한 전달 및 폴리머로좀에 의한 전달에 의해 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 효소로서 사용될 수 있는 뉴클레아제는 Cas9, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN) 및 징크 핑거 뉴클레아제를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
다양한 구현예에서, 본원에서 기재된 유전자 편집 시스템, 특히 단백질 및/또는 핵산은 폴리(히스티딘)-기반 마이셀인 나노입자와 복합체화될 수 있다. 특히, 특정 pH에서, 폴리(히스티딘)-함유 트리블록 공중합체는 표면에 양전하를 띤 폴리(히스티딘) 단위를 가진 마이셀로 조립될 수 있어, 음전하를 띤 유전자 편집 분자(들)와 복합체를 형성할 수 있다. 이들 나노입자를 이용하여 단백질 및/또는 핵산을 pH 의존적 방식으로 결합 및 방출하면 원하는 유전자 변형을 수행하기 위한 효율적이고 선택적인 메카니즘을 제공할 수 있다. 특히, 상기 마이셀-기반 전달 시스템은 하전 물질에 대해 상당한 유연성을 제공할 뿐 아니라, 큰 페이로드 용량 및 나노입자 페이로드의 표적 방출을 제공한다. 한 예에서, 이중 가닥 DNA의 부위-특이적 절단은 폴리(히스티딘)-기반 마이셀을 이용하는 뉴클레아제의 전달에 의해 가능해질 수 있다.
다양한 구현예는 폴리(히스티딘)-기반 마이셀과 복합체화함으로써 유전자 편집 도구의 세포내 전달을 가능하게 한다. 특히, 다양한 구현예는 친수성 블록, 소수성 블록 및 하전된 블록으로 이루어진 트리블록 공중합체를 제공한다. 일부 구현예에서, 친수성 블록은 폴리(에틸렌 옥시드)(PEO)일 수 있고, 하전된 블록은 폴리(L-히스티딘)일 수 있다. 다양한 구현예에서 사용될 수 있는 예시적인 트리블록 공중합체는 PEO-b-PLA-b-PHIS이며, 각 블록에서 반복 단위의 가변 개수가 설계에 따라 달라진다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 다양한 구현예의 트리블록 공중합체에 의해 형성된 마이셀에서 소수성 블록은 응집하여 코어를 형성하고, 말단에 친수성 블록 및 폴리(히스티딘) 블록을 남겨 하나 이상의 주위 층을 형성한다고 여겨진다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 전이유전자 전달에 사용된다. 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 핵산이다. 특정 구현예에서, 핵산 비-바이러스 벡터는 플라스미드 DNA, 선형 이중 가닥 DNA(dsDNA), 선형 단일 가닥 DNA(ssDNA), DoggyBone™ DNA, 나노플라스미드, 미니서클 DNA, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN), DDNA 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 mRNA(ssRNA), 및 이중 가닥 mRNA(dsRNA)이다. 특정 구현예에서, 비-바이러스 벡터는 트랜스포존이다. 특정 구현예에서, 트랜스포존은 piggyBac®이다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 전이유전자 전달은 바이러스 벡터를 통해 일어날 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 비-통합 비-염색체 벡터이다. 비-통합 비-염색체 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV), 아데노바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 통합 염색체 벡터이다. 통합 염색체 벡터는 아데노 관련 벡터(AAV), 렌티바이러스 및 감마-레트로바이러스를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 전이유전자 전달은 벡터의 조합에 의해 일어날 수 있다. 예시적이지만 비제한적인 벡터 조합은 바이러스와 비바이러스 벡터, 하나 초과의 비바이러스 벡터, 또는 하나 초과의 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 예시적이지만 비제한적 벡터 조합은 DNA 유래 벡터와 RNA 유래 벡터, RNA와 역전사효소, 트랜스포존과 트랜스포사아제, 비-바이러스 벡터와 엔도뉴클레아제, 및 바이러스 벡터와 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 일부 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자의 안정한 통합, 전이유전자의 일시적 통합, 전이유전자의 부위-특이적 통합, 또는 전이유전자의 편향된 통합일 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자의 안정한 염색체 통합일 수 있다. 특정 구현예에서, 안정한 염색체 통합은 무작위 통합, 부위 특이적 통합 또는 편향된 통합일 수 있다. 특정 구현예에서, 부위 특이적 통합은 보조되지 않을 수 있거나 보조될 수 있다. 특정 구현예에서, 보조된 부위 특이적 통합은 부위 지정 뉴클레아제와 공-전달된다. 특정 구현예에서, 부위 지정 뉴클레아제는 게놈 통합 부위의 업스트림 및 다운스트림 영역에 대한 상동성을 함유하는 5' 및 3' 뉴클레오티드 서열 연장을 가진 전이유전자를 포함한다. 특정 구현예에서, 상동성 뉴클레오티드 연장을 가진 전이유전자는 상동성 재조합, 마이크로상동성 매개 말단 연결 또는 비상동성 말단 연결에 의한 게놈 통합을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 부위 특이적 통합은 세이프 하버 부위에서 일어난다. 게놈 세이프 하버 부위는 반드시 새로 삽입된 유전 요소가 신뢰성 있게 기능을 하고(예를 들어, 치료 유효한 발현 수준으로 발현되고) 숙주 생물체에 위험을 일으키는 해로운 변화를 숙주 게놈에 일으키지 않게 하는 방식으로 새로운 유전 물질의 통합을 수용할 수 있다. 가능한 게놈 세이프 하버는 인간 알부민 유전자의 인트론 서열, 아데노 관련 바이러스 부위 1(AAVS1), 염색체 19 상의 AAV 바이러스의 자연 발생적 통합 부위, 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(CCR5) 유전자의 부위 및 마우스 Rosa26 유전자좌의 인간 오르토 로그 부위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 구현예에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 파괴하는 부위에서 일어난다. 특정 구현예에서, 표적 유전자 발현의 파괴는 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 서프레서, 출발 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서 부위 특이적 통합에 의해 일어난다. 특정 구현예에서, 부위 특이적 통합에 의해 표적화된 예시적 표적 유전자는 TRAC, TRAB, PDI, 임의의 면역억제 유전자, 및 동종 거부에 관여된 유전자를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 표적 유전자의 발현을 향상시키는 부위에서 일어난다. 특정 구현예에서, 표적 유전자 발현의 향상은 인트론, 엑손, 프로모터, 유전 요소, 인핸서, 서프레서, 출발 코돈, 정지 코돈 및 반응 요소에서 부위 특이적 통합에 의해 일어난다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 효소는 숙주 게놈에서 가닥 절단을 생성하여 전이유전자의 전달 또는 통합을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소는 단일 가단 절단을 생성한다. 특정 구현예에서, 효소는 이중 가단 절단을 생성한다. 특정 구현예에서, 절단 유도 효소의 예는 트랜스포사아제, 통합효소, 엔도뉴클레아제, CRISPR-Cas9, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), Cas-CLOVER™ 및 cpf1을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 절단 유도 효소는 DNA에 코딩된 상태로, mRNA에 코딩된 상태로, 단백질로서, 또는 가이드 RNA(gRNA)를 가진 핵단백질 복합체로서 세포에 전달될 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 부위 특이적 전이유전자 통합은 벡터 매개 통합 부위 편향에 의해 조절된다. 특정 구현예에서, 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 렌티바이러스 벡터에 의해 조절된다. 특정 구현예에서, 벡터 매개 통합 부위 편향은 선택된 감마-레트로바이러스 벡터에 의해 조절된다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 부위 특이적 전이유전자 통합 부위는 불안정한 염색체 삽입이다. 특정 구현예에서, 통합된 전이유전자는 침묵될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 절제될 수 있거나 추가 변형될 수 있다. 본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자의 불안정한 통합이다. 특정 구현예에서, 불안정한 통합은 일시적인 비-염색체 통합, 반안정한 비-염색체 통합, 반영구적인 비-염색체 삽입 또는 불안정한 염색체 삽입일 수 있다. 특정 구현예에서, 일시적인 비-염색체 삽입은 에피-염색체 또는 세포질 삽입일 수 있다. 특정 구현예에서, 전이유전자의 일시적인 비-염색체 삽입은 염색체 내로 통합되지 않고, 변형된 유전 물질은 세포 분열 동안 복제되지 않는다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자의 반안정한 또는 영구적인 비-염색체 통합이다. 특정 구현예에서, DNA 벡터는 분열 세포의 핵에서의 자율 복제를 가능하게 하는 비-바이러스 벡터의 에피좀 보유를 위해 핵 매트릭스 단백질에 결합하는 스캐폴드/매트릭스 부착 영역(S-MAR) 모듈을 코딩한다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 게놈 변형은 전이유전자의 불안정한 염색체 통합이다. 특정 구현예에서, 통합된 전이유전자는 침묵될 수 있거나, 제거될 수 있거나, 절제될 수 있거나 추가 변형될 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 상동성 재조합(HR)에 의한 숙주 세포 유도 이중 가닥 절단 복구(상동성 유도 복구), 마이크로상동성 매개 말단 연결(MMEJ), 비상동성 말단 연결(NHEJ), 트랜스포사아제 매개 변형, 통합효소 매개 변형, 엔도뉴클레아제 효소 매개 변형 또는 재조합 효소 매개 변형을 통해 일어날 수 있다. 특정 구현예에서, 전이유전자 삽입에 의한 게놈 변형은 CRISPR-Cas9, TALEN, ZFN, Cas-CLOVER 및 cpf1을 통해 일어날 수 있다.
본 개시 내용의 방법의 특정 구현예에서, 생체내 또는 생체외 게놈 변형을 갖는 세포는 생식 세포 또는 체세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 세포는 인간, 비인간, 포유동물, 래트, 마우스 또는 개 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 세포는 분화되거나, 미분화되거나 불멸화될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 미분화 세포는 줄기 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 세포는 분화되거나, 미분화되거나 불멸화될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 미분화 세포는 유도된 다능성 줄기 세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 세포는 T 세포, 조혈 줄기 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 수지상 세포, 단핵구, 거핵 세포 또는 파골세포일 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 세포는 세포가 정지 상태, 활성화된 상태, 휴면 상태, 중간기, 전조기, 중기, 후기 또는 말기인 동안 변형될 수 있다. 특정 구현예에서, 변형된 세포는 신선하고, 냉동보존되고, 벌크일 수 있고, 전혈, 백혈구성분채집 또는 불멸화된 세포주로부터 하위-집단으로 분류될 수 있다.
기타 구현예
본 개시 내용의 특정 구현예가 예시되고 기재되었지만, 본 개시 내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 다른 변경 및 수정이 행해질 수 있다. 첨부된 청구 범위의 영역은 본 개시 내용의 범위 내에 있는 그러한 모든 변경 및 수정을 포함한다.

Claims (120)

  1. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)로서,
    (a) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인(ectodomain)으로서, 여기서 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래된, 엑토도메인;
    (b) 막횡단(transmembrane) 도메인; 및
    (c) 하나 이상의 신호 전달(signal transduction) 도메인을 포함하는 엔도도메인(endodomain)으로서, 여기서 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래된, 엔도도메인을 포함하고;
    여기서, 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않는, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR).
  2. 제1항에 있어서, 활성화 성분은 활성화 성분의 아고니스트(agonist)가 결합하는 T-세포 수용체(TCR)의 성분, TCR 복합체의 성분, TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 저해 단백질의 성분, 사이토카인 수용체, 및 케모카인 수용체 중 하나 이상의 부분을 포함하는, CSR.
  3. 제1항에 있어서, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분을 포함하는, CSR.
  4. 제1항에 있어서, 신호 전달 도메인은 인간 신호 전달 도메인의 성분, T-세포 수용체(TCR), TCR 복합체의 성분, TCR 공동-수용체의 성분, TCR 공동-자극 단백질의 성분, TCR 저해 단백질의 성분, 사이토카인 수용체 및 케모카인 수용체 중 하나 이상을 포함하는, CSR.
  5. 제1항에 있어서, 신호 전달 도메인은 CD3 단백질 또는 그의 부분을 포함하는, CSR.
  6. 제5항에 있어서, CD3 단백질은 CD3ζ 단백질 또는 그의 부분을 포함하는, CSR.
  7. 제1항에 있어서, 엔도도메인은 세포질 도메인을 추가로 포함하는, CSR.
  8. 제7항에 있어서, 세포질 도메인은 제3 단백질로부터 단리되거나 유래되는, CSR.
  9. 제8항에 있어서, 제1 단백질 및 제3 단백질은 동일한, CSR.
  10. 제1항에 있어서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함하는, CSR.
  11. 제10항에 있어서, 신호 펩티드는 제4 단백질로부터 유래되는, CSR.
  12. 제11항에 있어서, 제1 단백질 및 제4 단백질은 동일한, CSR.
  13. 제1항에 있어서, 막횡단 도메인은 제5 단백질로부터 단리되거나 유래되는, CSR.
  14. 제13항에 있어서, 제1 단백질 및 제5 단백질은 동일한, CSR.
  15. 제1항에 있어서, 활성화 성분은 자연-발생 분자에 결합하지 않는, CSR.
  16. 제1항에 있어서, CSR은 활성화 성분의 자연-발생 분자와의 결합 시 신호를 전달하지 않는, CSR.
  17. 제1항에 있어서, 활성화 성분은 비-자연 발생 분자에 결합하는, CSR.
  18. 제1항에 있어서, CSR은 활성화 성분의 비-자연 발생 분자와의 결합 시 신호를 선택적으로 전달하는, CSR.
  19. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)로서,
    (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 여기서 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 그의 부분을 포함하고, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분을 포함하는, 엑토도메인;
    (b) 막횡단 도메인으로서, 여기서 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 그의 부분을 포함하는, 막횡단 도메인; 및
    (c) 세포질 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 여기서 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 하나 이상의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 그의 부분을 포함하는, 엔도도메인을 포함하는, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR).
  20. 제19항에 있어서, SEQ ID NO:17062와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  21. 제19항에 있어서, SEQ ID NO:17062와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  22. 제19항에 있어서, SEQ ID NO:17062와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  23. 제19항에 있어서, SEQ ID NO:17062와 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  24. 제19항에 있어서, SEQ ID NO:17062의 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  25. 제1항에 있어서, 엑토도메인은 변형을 포함하는, CSR.
  26. 제25항에 있어서, 변형은 활성화 성분 또는 제1 단백질의 야생형 서열과 비교시 활성화 성분 또는 제1 단백질의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 절단(truncation)을 포함하는, CSR.
  27. 제26항에 있어서, 활성화 성분의 아미노산 서열의 돌연변이 또는 절단은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분의 돌연변이 또는 절단을 포함하는, CSR.
  28. 제27항에 있어서, 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분의 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CSR은 CD58에 결합하지 않는, CSR.
  29. 제27항에 있어서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 세포 도메인은 SEQ ID NO:17119와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  30. 제27항에 있어서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 세포 도메인은 SEQ ID NO:17119와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  31. 제27항에 있어서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 세포 도메인은 SEQ ID NO:17119와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  32. 제27항에 있어서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 세포 도메인은 SEQ ID NO:17119와 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  33. 제27항에 있어서, 돌연변이 또는 절단을 포함하는 CD2 세포외 세포 도메인은 SEQ ID NO:17119의 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  34. 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR)로서,
    (a) 신호 펩티드 및 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 여기서 신호 펩티드는 CD2 신호 펩티드 또는 그의 부분을 포함하고, 활성화 성분은 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 아고니스트가 결합하는 CD2 세포외 도메인 또는 그의 부분은 돌연변이 또는 절단을 포함하는, 엑토도메인;
    (b) 막횡단 도메인으로서, 여기서 막횡단 도메인은 CD2 막횡단 도메인 또는 그의 부분을 포함하는, 막횡단 도메인; 및
    (c) 세포질 도메인 및 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 여기서 세포질 도메인은 CD2 세포질 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 하나 이상의 신호 전달 도메인은 CD3ζ 단백질 또는 그의 부분을 포함하는, 엔도도메인을 포함하는, 비-자연 발생 키메라 자극 수용체(CSR).
  35. 제34항에 있어서, SEQ ID NO:17118와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  36. 제34항에 있어서, SEQ ID NO:17118와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  37. 제34항에 있어서, SEQ ID NO:17118와 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  38. 제34항에 있어서, SEQ ID NO:17118와 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  39. 제34항에 있어서, SEQ ID NO: 17118의 아미노산 서열을 포함하는, CSR.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 CSR을 코딩하는 핵산 서열.
  41. 제40항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  42. 제40항의 핵산 서열을 포함하는 트랜스포존(transposon).
  43. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 CSR을 포함하는 세포.
  44. 제40항의 핵산 서열을 포함하는 세포.
  45. 제41항의 벡터를 포함하는 세포.
  46. 제42항의 트랜스포존을 포함하는 세포.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 동종이계 세포인, 세포.
  48. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 자가 세포인, 세포.
  49. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 CSR을 포함하는 조성물.
  50. 제40항의 핵산 서열을 포함하는 조성물.
  51. 제41항의 벡터를 포함하는 조성물.
  52. 제42항의 트랜스포존을 포함하는 조성물.
  53. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 조성물.
  54. 다수의 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 조성물.
  55. 변형된 T 림프구(T-세포)로서,
    (a) T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형으로서, 여기서 변형은 TCR의 발현 또는 활성 수준을 감소하거나 제거하는, T-세포 수용체(TCR)를 코딩하는 내인성 서열의 변형; 및
    (b) 키메라 자극 수용체(CSR)로서,
    (i) 활성화 성분을 포함하는 엑토도메인으로서, 여기서 활성화 성분은 제1 단백질로부터 단리되거나 유래된, 엑토도메인;
    (ii) 막횡단 도메인; 및
    (iii) 하나 이상의 신호 전달 도메인을 포함하는 엔도도메인으로서, 여기서 하나 이상의 신호 전달 도메인은 제2 단백질로부터 단리되거나 유래된, 엔도도메인을 포함하고, 이때 제1 단백질 및 제2 단백질은 동일하지 않는, 키메라 자극 수용체(CSR)를 포함하는, 변형된 T 림프구(T-세포).
  56. 제55항에 있어서, 유도성 세포자멸촉진(proapoptotic) 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 변형된 T-세포.
  57. 제55항에 있어서, 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 코딩하는 내인성 서열의 변형을 추가로 포함하고, 여기서 변형은 주 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I(MHC-I)의 발현 또는 활성 수준을 감소하거나 제거하는, 변형된 T-세포.
  58. 제55항에 있어서, HLA 클래스 I 조직적합성 항원, 알파 사슬 E(HLA-E) 폴리펩티드를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 변형된 T-세포.
  59. 제58항에 있어서, HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 신호 펩티드를 추가로 포함하는, 변형된 T-세포.
  60. 제59항에 있어서, HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 변형된 T-세포.
  61. 제60항에 있어서, HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 B2M 폴리펩티드와 HLA-E 폴리펩티드 사이에 위치된 링커를 추가로 포함하는, 변형된 T-세포.
  62. 제61항에 있어서, HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는 펩티드 및 B2M 폴리펩티드를 추가로 포함하는, 변형된 T-세포.
  63. 제62항에 있어서, HLA-E를 포함하는 비-자연 발생 폴리펩티드는,
    B2M 신호 펩티드와 펩티드 사이에 위치된 제1 링커, 및
    B2M 폴리펩티드와 HLA-E를 코딩하는 펩티드 사이에 위치된 제2 링커를 추가로 포함하는, 변형된 T-세포.
  64. 제55항에 있어서, 비-자연 발생 항원 수용체, 치료적 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 그의 조합을 추가로 포함하는, 변형된 T-세포.
  65. 제64항에 있어서, 비-자연 발생 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는, 변형된 T-세포.
  66. 제55항에 있어서, CSR은 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현되는, 변형된 T-세포.
  67. 제55항에 있어서, CSR은 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현되는, 변형된 T-세포.
  68. 제58항에 있어서, HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 일시적으로 발현되는, 변형된 T-세포.
  69. 제58항에 있어서, HLA-E 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현되는, 변형된 T-세포.
  70. 제56항에 있어서, 유도성 세포자멸촉진 폴리펩티드는 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현되는, 변형된 T-세포.
  71. 제64항에 있어서, 비-자연 발생 항원 수용체 또는 치료적 단백질을 코딩하는 서열은 변형된 T-세포에서 안정적으로 발현되는, 변형된 T-세포.
  72. 제55항에 있어서, 변형된 T-세포는 동종이계 세포인, 변형된 T-세포.
  73. 제55항에 있어서, 변형된 T-세포는 자가 세포인, 변형된 T-세포.
  74. 제55항에 있어서, 변형된 T-세포는 초기 기억 T-세포, 줄기 세포-유사 T 세포, 줄기 기억 T 세포(TSCM), 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 줄기 세포-유사 T 세포인, 변형된 T-세포.
  75. 제55항 내지 제74항 중 어느 한 항에 따른 변형된 T-세포를 포함하는 조성물.
  76. 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 여기서 집단의 복수의 변형된 T-세포는 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 따른 CSR을 포함하는, 조성물.
  77. 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물로서, 여기서 집단의 복수의 변형된 T-세포는 제55항 내지 제74항 중 어느 한 항에 따른 변형된 T-세포를 포함하는, 조성물.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 25% 이상이 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는, 조성물.
  79. 제76항 또는 제77항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 50% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 조성물.
  80. 제76항 또는 제77항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 75% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 조성물.
  81. 제76항 또는 제77항에 있어서, 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  82. 질병 또는 장애의 치료를 위한 제76항 또는 제77항에 따른 조성물의 용도.
  83. 치료적 유효량의 제76항 또는 제77항에 따른 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법.
  84. 치료적 유효량의 제76항 또는 제77항에 따른 조성물 및 CSR에 결합하는 하나 이상의 비-자연 발생 분자를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법.
  85. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 CSR 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 안정적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하는 변형된 T-세포 집단의 제조 방법.
  86. 제85항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 25% 이상이 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는, 제조 방법.
  87. 제85항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 50% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 제조 방법.
  88. 제85항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 75% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 제조 방법.
  89. 제85항의 제조 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물.
  90. 제89항에 있어서, 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  91. 질병 또는 장애의 치료를 위한 제89항의 조성물의 용도.
  92. 치료적 유효량의 제89항의 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법.
  93. 제92항에 있어서, 활성화제 조성물을 대상체에 투여하여 생체 내 변형된 T-세포의 집단을 활성화시키는 단계, 생체 내 변형된 T-세포의 집단의 세포 분열을 유도하는 단계, 또는 그 조합을 추가로 포함하는, 치료 방법.
  94. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 CSR 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 일시적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하는 변형된 T-세포 집단의 제조 방법.
  95. 제94항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 25% 이상이 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는, 제조 방법.
  96. 제94항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 50% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 제조 방법.
  97. 제94항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 75% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 제조 방법.
  98. 제94항의 제조 방법에 의해 제조된 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물.
  99. 제98항에 있어서, 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  100. 질병 또는 장애의 치료를 위한 제98항의 조성물의 용도.
  101. 치료적 유효량의 제98항의 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법.
  102. 제101항에 있어서, 대상체에 투여된 변형된 T-세포의 집단 내 변형된 T-세포는 더이상 CSR을 발현하지 않는, 치료 방법.
  103. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 CSR 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 안정적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계 및 세포를 활성화제 조성물과 접촉시켜 복수의 활성화된 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하는 변형된 T-세포의 집단의 확장 방법으로서, 여기서 복수의 변형된 T-세포의 확장은 동일한 조건 하에서 CSR을 안정적으로 발현하지 않는 복수의 야생형 T-세포의 확장보다 2배 이상 더 높은, 확장 방법.
  104. 제103항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 25% 이상이 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는, 확장 방법.
  105. 제103항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 50% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 확장 방법.
  106. 제103항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 75% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 확장 방법.
  107. 제103항의 확장 방법에 의해 확장된 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물.
  108. 제107항에 있어서, 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  109. 질병 또는 장애의 치료를 위한 제107항의 조성물의 용도.
  110. 치료적 유효량의 제107항의 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법.
  111. 제110항에 있어서, 활성화제 조성물을 대상체에 투여하여 생체 내 변형된 T-세포의 집단을 활성화시키는 단계, 생체 내 변형된 T-세포의 집단의 세포 분열을 유도하는 단계, 또는 그 조합을 추가로 포함하는, 치료 방법.
  112. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항의 CSR 또는 이를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물을 복수의 1차 인간 T-세포에 도입하여 복수의 변형된 T-세포 내 CSR을 일시적으로 발현하고 복수의 변형된 T-세포의 바람직한 줄기-유사 특성을 보존하는 조건 하에서 복수의 변형된 T-세포를 생성하는 단계 및 세포를 활성화제 조성물과 접촉시켜 복수의 활성화된 변형된 T-세포를 생성하는 단계를 포함하는 변형된 T-세포의 집단의 확장 방법으로서, 여기서 복수의 변형된 T-세포의 확장은 동일한 조건 하에서 CSR을 일시적으로 발현하지 않는 복수의 야생형 T-세포의 확장보다 2배 이상 더 높은, 확장 방법.
  113. 제112항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 25% 이상이 줄기 기억 T 세포(TSCM) 또는 TSCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RA 및 CD62L을 포함하는, 확장 방법.
  114. 제112항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 50% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 확장 방법.
  115. 제112항에 있어서, 집단의 복수의 변형된 T-세포의 75% 이상이 중심 기억 T 세포(TCM) 또는 TCM-유사 세포의 하나 이상의 세포-표면 마커(들)를 발현하고; 하나 이상의 세포-표면 마커(들)는 CD45RO 및 CD62L을 포함하는, 확장 방법.
  116. 제112항의 확장 방법에 의해 확장된 변형된 T-세포의 집단을 포함하는 조성물.
  117. 제116항에 있어서, 질병 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  118. 질병 또는 장애의 치료를 위한 제116항의 조성물의 용도.
  119. 치료적 유효량의 제116항의 조성물을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 질병 또는 장애의 치료 방법.
  120. 제119항에 있어서, 대상체에 투여된 변형된 T-세포의 집단 내 변형된 T-세포는 더이상 CSR을 발현하지 않는, 치료 방법.
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