CN112375138B - 一种重组载脂蛋白e和应用 - Google Patents

一种重组载脂蛋白e和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112375138B
CN112375138B CN202011272982.1A CN202011272982A CN112375138B CN 112375138 B CN112375138 B CN 112375138B CN 202011272982 A CN202011272982 A CN 202011272982A CN 112375138 B CN112375138 B CN 112375138B
Authority
CN
China
Prior art keywords
apo
quality control
recombinant
freeze
dried
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011272982.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112375138A (zh
Inventor
赵忠颢
段念
任燕斌
米前芬
胥安庆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd filed Critical Zhongyuan Huiji Biotechnology Co Ltd
Priority to CN202011272982.1A priority Critical patent/CN112375138B/zh
Publication of CN112375138A publication Critical patent/CN112375138A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112375138B publication Critical patent/CN112375138B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N2001/2893—Preparing calibration standards
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/775—Apolipopeptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2871—Cerebrovascular disorders, e.g. stroke, cerebral infarct, cerebral haemorrhage, transient ischemic event
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/323—Arteriosclerosis, Stenosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种重组载脂蛋白E(Apo E)和应用，通过截短天然Apo E序列，使Apo E的性能得到提升，从而得到适用于Apo E检测试剂盒中的质控品。

Description

一种重组载脂蛋白E和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组载脂蛋白E和应用。
背景技术
载脂蛋白E(Apo E)是一种多态性蛋白，参与脂蛋白的转化与代谢过程，可与乳糜微粒、乳糜微粒残体、极低密度脂蛋白(VLDL)和中密度脂蛋白(IDL)结合；血浆中的Apo E水平与心肌梗死、高脂蛋白血症、动脉粥样硬化等相关；而脑中的Apo E的水平则与老年痴呆症和脑梗死等相关。且Apo E的浓度与血浆甘油三脂的含量有关，因此Apo E在人体中的含量可作为心脑血管疾病的重要指标。
现有的Apo E的测定方法很多，包括：放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫测定法(ELISA)、乳胶凝集试验和免疫比浊法、荧光免疫测定法等，基本都是通过抗原抗体结合的免疫手段进行检测，而Apo E免疫检测试中通常需要Apo E抗原作为校准质控品，因此性能优良的Apo E在Apo E的测定试剂盒中至关重要。
目前商业化检测试剂盒中的Apo E为天然提取，并制成冻干粉，但是开瓶稳定性差，复溶后4℃、24h活性下降约50％，检测试剂盒质量无法得到保证。
发明内容
为了解决天然Apo E抗原稳定性差的问题，本发明提供一种重组Apo E，为Apo E检测试剂盒开发提供质量稳定的校准质控品。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
一种重组载脂蛋白E(Apo E)，其是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白。
一种多核苷酸，其选自编码上述重组Apo E的多核苷酸；或与所述多核苷酸互补的互补多核苷酸。
优选地，所述多核苷酸编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种重组载体，所述重组载体包含所述的多核苷酸。
优选地，所述重组载体的原始载体选自pGEX-4t-1、pColdI、pET-11a、pET-22b、pET-28a、pET-30c、pET-32a中的一种。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述载体，或宿主细胞的基因组中整合有所述的多核苷酸。
优选地，所述宿主细胞为BL21(DE3)或BL21 PlysS(DE3)。
另一方面，本发明还提供一种储存液，其特征在于，用于保存上述的重组载脂蛋白，包括10～50mM的缓冲液、2～10％的保护剂和0.1～10mM的还原剂，所述缓冲液选自PBS、Tris、MES、His或醋酸缓冲液；所述保护剂选自蔗糖或海藻糖。
本发明的Apo E序列中具有半胱氨酸，所以溶液中游离的蛋白会通过半胱氨酸中的巯基结合成二聚体，导致溶液状态的质控品不稳定，还原剂的添加可以使蛋白保持单体结构，不易变性，本发明储存液中添加的还原剂可以为任意可溶的具有还原性的试剂。
储存液中还原剂和糖类对蛋白结构的影响不大，但三种溶质的配比对储存液的稳定性有明显的影响。
优选地，还原剂选自β-巯基乙醇、TCEP(三-(2-甲酰乙基))膦盐酸盐或DTT(二硫苏糖醇)。
本发明所述储存液可以直接用来稳定保存纯化的重组Apo E，经验证，可以在-20℃～40℃条件下保存一个月，重组Apo E的性能不会改变，也可以将储存液冻存，更长期的保存，且冻存的储存液再次溶解，也可以在-20℃～40℃条件下保存一个月，性能并不会受影响。
另一方面，本发明还提供一种Apo E的质控品，包括，所述重组Apo E和上述储存液，所述重组Apo E的浓度为0.1～5mg/mL，即，质控品包括0.1～5mg/mL的重组Apo E、10～50mM的缓冲液、2～10％的保护剂和0.1～10mM的还原剂，所述缓冲液选自PBS、Tris、MES、His或醋酸缓冲液；所述保护剂选自蔗糖或海藻糖；还原剂可以为任意可溶的具有还原性的试剂，所述还原剂优选自β-巯基乙醇、TCEP(三-(2-甲酰乙基))膦盐酸盐或DTT(二硫苏糖醇)。
所述质控品可以为液体也可以为冻干试剂。
另一方面，本发明还提供一种Apo E的冻干质控品，包括0.1～5mg/mL所述的重组Apo E、10～50mM的缓冲液、2～10％的冻干保护剂和0.1～10mM的还原剂，所述缓冲液选自PBS、Tris、MES、His或醋酸缓冲液中的一种，所述冻干保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘露糖、肌醇或BSA中的一种或几种；还原剂可以为任意可溶的具有还原性的试剂，所述还原剂优选自β-巯基乙醇、TCEP(三-(2-甲酰乙基))膦盐酸盐或DTT(二硫苏糖醇)；本质控品同样可以为液体或者冻干试剂，所述质控品与上述质控品的区别在于，冻干之后的形态更为美观，适合用到商用的试剂盒中。
本发明还提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括上述重组Apo E、所述的质控品或所述冻干质控品。
本发明还提供一种生产所述重组Apo E的方法，包括步骤：
(1)设计并合成上述SEQ ID NO：1序列；
(2)利用基因工程技术将其连接到载体上,通过测序验证正确后，转化表达宿主菌；
(3)进行自诱导表达到重组Apo E；
优选地，所述生产方法还包括GE Niexcel柱纯化过程，经过此过程可以获得纯度大于95％的蛋白。
优选地，纯化的重组Apo E可以转入上述储存液中进行保存，在溶液状态，还原剂的添加可以保证重组Apo E性能的稳定。
本发明的有益效果在于：通过对Apo E进行截短，在大肠杆菌中表达纯化后，获得目的蛋白。本发明所生产的重组蛋白Apo E与Apo E多抗结合的活性高、稳定性良好，由本发明生产的重组蛋白Apo E制备的质控品，37℃加速30天，活性下降不超过10％，高于市售天然Apo E制备质控品的稳定性，具有较大的应用价值与潜力。
附图说明
图1是自诱导表达电泳图；
图2是重组Apo E纯化电泳图；
图3是重组Apo E的线性验证图。
具体实施例
本发明提供一种重组Apo E，以解决现有天然抗体冻干试剂稳定性不好的问题。
实施例1：重组Apo E的生产和纯化
生产：
(1)对天然Apo E蛋白序列进行设计，具体是N端截短18个氨基酸，C端截短个100氨基酸并委托北京擎科兴业公司合成核酸序列。
(2)将合成的序列连接到载体pET-22b上，测序验证正确后，转化表达宿主菌BL21(DE3)
(3)自诱导表达：pET-22b APOE/BL21(DE3)平板上挑取单克隆到LB培养基中，37℃振荡培养至菌夜OD600＝0.6～1之间，加入终浓度为0.5mM IPTG进行诱导，4小时后收集菌体，用PBS重悬菌体后，超声破碎，分别取全菌和上清用SDS-PAGE胶分析。
结果如图1所示，其中M为Marker，泳道1为转化表达后的宿主菌BL21(即用10mMPBS重悬菌体，超声破碎后的溶液)，泳道2为转化表达后离心的上清液(即用10mM PBS重悬菌体，超声破碎后离心，收集上清)，泳道3为未诱导的BL21。
试验结果显示，在全菌和上清中明显多了一条蛋白条带，大小在(25-35Kd)范围内，表明成功表达出了重组Apo E。
纯化：
利用GE Niexcel柱纯化，用10mM PBS、300mM NaCl溶解菌体，超声破碎后离心，收集上清，上GE Niexcel挂柱，10mM PBS、300mM NaCl、25mM咪唑洗杂，最后用10mM PBS、300mMNaCl、300mM咪唑洗脱，纯化结果如图2所示，其中M为marker，泳道a为Apo E纯化的流穿液，泳道b为Apo E纯化上样前溶液(即，上述收集的上清液)，可以看出上清含有大量重组ApoE，流穿液中只有少量被洗出去了，大量重组Apo E被捕获到层析柱上，泳道c为洗脱下的杂蛋白，可以看出此时层析柱上几乎没有杂蛋白，泳道d为洗脱下来的重组Apo E，可以看出蛋白纯度大于95％，可以用于后续试验。
实施例2：重组Apo E性能验证
线性验证，Apo E的初始浓度测定方法为：首先用保存缓冲液在280nm下的吸光值进行调零，然后取重组Apo E在A280 nm处测定吸光值，读出浓度值。使用前用生理盐水将重组Apo E浓度稀释到162ng/ml,按照1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释，并测量浓度，每个样本测量3次求平均值。
具体方法
表1重组Apo E性能验证
Figure BDA0002778242840000041
结果如表1所示，偏差的绝对值在5％以内，且如图3所示，测量均值的R2＝0.999，证明线性良好，适合作为质控品的制备试剂。
实施例3：储存液和重组Apo E构成的的质控品稳定性研究
A：质控品稳定性研究
所有缓冲液均保存在37℃。
表2储存液的配方
Figure BDA0002778242840000051
表3稳定性研究
Figure BDA0002778242840000052
结果如表2、表3所示，实验证明，在37℃保存条件下，质控品1-3可以在60天内稳定保存。而未添加还原剂的保存液，从第7天开始就有明显下降，到一个月左右活性已经下降40％左右，不能继续使用。
B、储存液和重组Apo E冻干复溶后稳定性研究
冻干试剂可以长期稳定保存，且方便运输，但一旦加水复溶，稳定性就会受到影响，在常规的实验操作中，加水溶解一管冻干试剂，一般需要使用多次，所以复溶之后能够稳定保存的质控品十分重要。
对储存液和重组Apo E冻干后的试剂加水溶解，在不同温度条件下保存不同时间，测量重组Apo E的活性，使用中元汇吉的载脂蛋白E免疫比浊检测试剂盒，按照说明书进行活性检测，所用检测仪器为贝克曼AU480，每个温度测量3次取平均值。
其中0天为冻干试剂加水在不同温度下溶解后测量的结果，7～90天为冻干试剂加水复溶后在不同温度下保存不同时间后测量的结果。
表4质控品1冻干状态稳定性研究
Figure BDA0002778242840000061
表5质控品2冻干状态稳定性研究
Figure BDA0002778242840000062
表6质控品3冻干状态稳定性研究
Figure BDA0002778242840000063
表7质控品4冻干状态稳定性研究
Figure BDA0002778242840000071
结果如表4-7所示，可以看出，冻干复溶之后，质控品1-3在-20℃～40℃可以稳定保存半个月，在60天内标准偏差在5％以内。
国际标准认为标准偏差在10％以内，质控品是稳定的，在90天时会有明显下降较，标准偏差大于10％，已经开始不稳定了，说明冻干复溶的质控品应该在在一个月左右用完，最迟不能超过一个月。
质控品4因为没有添加还原剂，所以复溶7天就已经下降得很明显了，只有在-20℃还能保存7天，但到14天再拿出来检测，活性就明显降低，不适合使用。
实施例4：冻干质控品稳定性试验
这一种质控品主要用于商用，所以多数情况下采用冻干保存，因此本实施例不探究其溶液状态下的稳定性，直接探究冻干试剂加水溶解之后的稳定性。
质控品为冻干试剂，冻干试剂保存在37℃，包括：0.1mg/mL的重组Apo E、20mM的醋酸缓冲液、10％甘油、2％蔗糖和2mM EDTA
稳定性检测：将冻干试剂加水溶解之后在不同时间条件下测量，每个温度测量3次取平均值。
其中0天为冻干试剂加水在溶解后在不同温度下测量的结果。
表8冻干质控品稳定性试验
Figure BDA0002778242840000072
Figure BDA0002778242840000081
从表8可以看出，复溶之后两个月内在-20℃～40℃都是稳定的，方便使用。
实施例5：市售Apo E质控品稳定性
本实施例所用Apo E购自江苏麦得科生物科技有限公司。
稳定性检测：将冻干试剂加水溶解之后在不同时间条件下测量，每个温度测量3次取平均值。
表9天然质控品稳定性试验
Figure BDA0002778242840000082
结果如表9显示，冻干试剂复溶之后特别不稳定，活性一直呈现下降的趋势，不能稳定保存使用。
实施例6质控品和冻干质控品的保存时间
本实施例测量液体和冻干状态保存的质控品以及冻干质控品长时间保存的活力。
液体状态保存的质控品，即储存液和重组Apo E的混合液；
冻干的质控品：即储存液和重组Apo E冻干后保存的质控品。
液体状态的质控品，在2～8℃保存，每隔一年去处测量，测量三次取平均值；
冻干质控品和冻干的质控品，始终以冻干状态保存在2～8℃，每隔一年取出部分，加水溶解后测量活性，测量三次取平均值。
表10长期保存的稳定性验证
Figure BDA0002778242840000083
Figure BDA0002778242840000091
从表10可以看出，液体状态的质控品能稳定保存一年左右，到第二年活性明显下降，已经不适合使用。冻干状态的质控品和冻干质控品比液体状态保存更久，可以稳定保存三年，到第四年活性下降，适合商用。
综上所述，本发明的重组Apo E性能良好，适合用于制备质控品，质控品在液体状态和冻干状态都很稳定，冻干之后复溶也能保持一个月的活性稳定，具有较大的商业价值。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司
<120> 一种重组载脂蛋白E和应用
<130> 2020.10.21
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 217
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1 5 10 15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20 25 30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35 40 45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50 55 60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65 70 75 80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85 90 95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Cys
100 105 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115 120 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130 135 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145 150 155 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165 170 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180 185 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195 200 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg
210 215

Claims (3)

1. 一种Apo E的质控品，其特征在于，所述Apo E的质控品为浓度为0.1mg/mL的重组Apo E和储存液，所述重组Apo E为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白；所述储存液为20mM的缓冲液、3％的保护剂和2 mM的还原剂，所述缓冲液选自PBS、Tris或醋酸缓冲液；所述保护剂选自蔗糖或海藻糖；所述还原剂选自TCEP或DTT。
2.一种Apo E的冻干质控品，其特征在于，所述Apo E的冻干质控品为0.1mg/mL的重组Apo E、20mM的醋酸缓冲液、10％甘油、2％蔗糖和2mM EDTA ，所述重组Apo E为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的蛋白。
3.一种检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的质控品或冻干质控品。
CN202011272982.1A 2020-11-13 2020-11-13 一种重组载脂蛋白e和应用 Active CN112375138B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011272982.1A CN112375138B (zh) 2020-11-13 2020-11-13 一种重组载脂蛋白e和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011272982.1A CN112375138B (zh) 2020-11-13 2020-11-13 一种重组载脂蛋白e和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112375138A CN112375138A (zh) 2021-02-19
CN112375138B true CN112375138B (zh) 2022-12-13

Family

ID=74583959

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011272982.1A Active CN112375138B (zh) 2020-11-13 2020-11-13 一种重组载脂蛋白e和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112375138B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1553794A (zh) * 2000-12-28 2004-12-08 含有类维生素a增效剂的稳定的皮肤调节组合物
CN102229642A (zh) * 2011-05-30 2011-11-02 吉权 一种蛋白质稳定剂及其制备方法
US20140315823A1 (en) * 2011-03-18 2014-10-23 Duke University Peptide compounds for suppressing inflammation
CN106890315A (zh) * 2017-03-16 2017-06-27 北京热休生物技术有限公司 Apo‑e蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用
CN107002289A (zh) * 2014-02-03 2017-08-01 芝加哥大学 用于定量评价dna‑蛋白质复合物密度的组合物和方法
CN108700593A (zh) * 2015-11-02 2018-10-23 拜奥克罗斯公司 载脂蛋白检测方法
CN113383018A (zh) * 2018-09-05 2021-09-10 波赛达治疗公司 同种异体细胞组合物和使用方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5168045A (en) * 1989-08-18 1992-12-01 The Scripps Research Institute Diagnostic systems and methods using polypeptide analogs of apolipoprotein e
US20070166765A1 (en) * 2006-01-16 2007-07-19 Christian Rohlff Protein isoforms and uses thereof
WO2015157546A1 (en) * 2014-04-09 2015-10-15 The Regents Of The University Of California Protein biomarkers for immune assessment and prediction of transplant rejection

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1553794A (zh) * 2000-12-28 2004-12-08 含有类维生素a增效剂的稳定的皮肤调节组合物
US20140315823A1 (en) * 2011-03-18 2014-10-23 Duke University Peptide compounds for suppressing inflammation
CN102229642A (zh) * 2011-05-30 2011-11-02 吉权 一种蛋白质稳定剂及其制备方法
CN107002289A (zh) * 2014-02-03 2017-08-01 芝加哥大学 用于定量评价dna‑蛋白质复合物密度的组合物和方法
CN108700593A (zh) * 2015-11-02 2018-10-23 拜奥克罗斯公司 载脂蛋白检测方法
CN106890315A (zh) * 2017-03-16 2017-06-27 北京热休生物技术有限公司 Apo‑e蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用
CN113383018A (zh) * 2018-09-05 2021-09-10 波赛达治疗公司 同种异体细胞组合物和使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
apolipoprotein E isoform a precursor [Homo sapiens];Poursadegh Zonouzi 等;《GENBANK》;20150315;ACCESSION NO. NP_001289617 *
一文教你如何保存纯化后的蛋白质？;于浩然;《知乎》;20170725;https://zhuanlan.zhihu.com/p/28084946 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112375138A (zh) 2021-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102559311B1 (ko) 재조합 인간 xvii형 콜라겐, 제조방법 및 응용
Le Du et al. 1.9-A resolution structure of fasciculin 1, an anti-acetylcholinesterase toxin from green mamba snake venom.
Nikulin et al. Structure of Pseudomonas aeruginosa Hfq protein
Van Aalten et al. Binding site differences revealed by crystal structures of Plasmodium falciparum and bovine acyl-CoA binding protein
Boon et al. Isolation and functional analysis of histidine‐tagged elongation factor Tu
Islam et al. Analysis of amino acid contributions to protein solubility using short peptide tags fused to a simplified BPTI variant
US6197495B1 (en) Methods using the staphylococcus aureus glycyl tRNA synthetase crystalline structure
JP6967002B2 (ja) トランスグルタミナーゼ認識部位を有するｆｋｂｐドメイン
Bieniossek et al. The crystal structure of the carboxy-terminal domain of human translation initiation factor eIF5
Schiefner et al. Structural and biochemical analyses reveal a monomeric state of the bacterial lipocalin Blc
WO2019091918A1 (en) Fusion proteins with specificity for ed-b and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer
Nardone et al. Biochemical characterization and crystal structure of a recombinant hen avidin and its acidic mutant expressed in Escherichia coli
Schlatter et al. Crystal engineering yields crystals of cyclophilin D diffracting to 1.7 Å resolution
Cheng et al. Structural analysis of the transcriptional activation region on Fis: crystal structures of six Fis mutants with different activation properties
Charbonnier et al. Overexpression, refolding, and purification of the histidine-tagged outer membrane efflux protein OprM of Pseudomonas aeruginosa
CN104610443B (zh) 一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途
CN112375138B (zh) 一种重组载脂蛋白e和应用
Thoden et al. Structure of the β2 homodimer of bacterial luciferase from Vibrio harveyi: X‐ray analysis of a kinetic protein folding trap
CN112094355A (zh) 一种用于临床诊断的复合质控品及其制备方法
US20220025355A1 (en) Method for screening protease variant and obtained protease variant
US9493547B2 (en) Binding proteins to the constant region of immunoglobulin G
Zhang et al. Preparation of selenocysteine-containing forms of human selenok and selenos
Jiang et al. Expression and purification of human WWP2 HECT domain in Escherichia coli
ES2305273T3 (es) Fragmentos del receptor huerfano relacionado con el acido retinoico (ror) que comprenden el dominio de union al ligando (lbd), la estructura cristalina del lbd de ror-beta y sus aplicaciones.
Sviridova et al. Crystallization and preliminary crystallographic characterization of the iron-regulated outer membrane lipoprotein FrpD from Neisseria meningitidis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 400037 1st-4th floor, building 30, No.6 Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing

Applicant after: Zhongyuan Huiji Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 400037 1st-4th floor, building 30, No.6 Taikang Road, Zone C, Jianqiao Industrial Park, Dadukou District, Chongqing

Applicant before: CHONGQING ZHONGYUAN HUIJI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant