CN106890315A - Apo‑e蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种APO‑E蛋白及其多肽的用途，属于蛋白质工程与生物医药应用技术领域。本发明的APO‑E蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO.2所示或其特异性片段，本发明发现APO‑E蛋白及其多肽，以及它们与热休蛋白gp96通过热击或自然吸附的方式形成的复合物能够预防和治疗包括乳腺癌、肝癌在内的肿瘤性疾病，可用于制备用于预防和治疗癌症的药物，具有广阔的应用前景。

Description

APO-E蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用

技术领域

本发明涉及蛋白质工程与生物医药应用技术领域，具体地说，涉及APO-E蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据资料统计，乳腺癌发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在很多地区已经超过子宫癌，成为严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的肿瘤之一。乳腺癌的发病与患者的遗传基因、生活习惯、常用食物、生育状况等紧密相关，不同人种、地域的乳腺癌发病率有着明显的区别。乳腺癌的高发地区，主要集中在北美、北欧和大洋洲，尤其白种女性居多。乳腺癌的中发地区，集中在南美、南欧和以色列。亚洲则是乳腺癌的低发地区。举例来说，美国白种女性一生乳腺癌发病率为13.1％，即平均每8-9人就有1人可能会患上乳腺癌，而亚洲女性的乳腺癌发病率为4-7％。WHO统计，全球每年新发乳腺癌达130万人左右，死亡50万人左右。在我国北京、上海、天津等大城市的乳腺癌发病已跃居女性各种癌瘤首位,而且有明显上升的趋势。

肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。在世界范围内男性癌症患者中，肝癌比例排第六，死亡率排在第二；在女性癌症患者中，肝癌比例排第七，死亡率排第六。2008年，全世界共有748,300个新增肝癌病例，有695,900例肝癌患者死亡。而这些新增肝癌病例和死亡病例中有一半在中国。肝癌发生率最高的区域主要在东亚，东南亚，中非和西非国家。亚洲部分地区和非洲撒哈拉以南地区之所以肝癌发生率较高，可能是因为这些地区HBV盛行，因为这些地区8％的居民慢性感染HBV，在发展中国家60％的肝癌患者感染过HBV。

载脂蛋白(apolipoprotein，apo)是血浆脂蛋白的主要组分，其中脂蛋白E(apo E)是载脂蛋白家族成员中重要的一种。血浆中60％-80％的apo E主要由肝脏分泌。apo作为一种多功能的血浆脂蛋白，在维持脂蛋白的结构，脂类代谢调节以及神经退行性疾病中发挥重要的作用。此外，研究显示apo E在免疫调节以及肿瘤发生中也起到关键作用。某些癌症组织，如肝癌组织中apo E的表达明显升高，此外apo E的表达与肿瘤的预后有着密切的联系。

热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。HSP根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)gp96属于HSP90亚家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。热休克蛋白gp96蛋白具有多肽结合特性，在内质网内其能接受来自TAP复合体的多肽片段，协助将其组装至MHC I类分子，递呈于细胞膜上。不同组织来源的热休克蛋白gp96能携带有其来源组织内特异性表达的多肽片段。

发明内容

本发明的目的是提供一种能预防及治疗癌症的靶标蛋白及其多肽的应用方法。

本发明首先提供了一种APO-E蛋白，所述APO-E蛋白的氨基酸序列含有如下：

i)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

ii)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列自N端起第2位至最后一位氨基酸序列；或

iii)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。

本发明提供了上述APO-E蛋白在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用，

本发明提供了编码APO-E蛋白的基因，该基因的核苷酸序列含有如下：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸具有75％及以上同源性的核苷酸序列；或

iv)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

本发明提供了编码APO-E蛋白的基因在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。

本发明提供了含有编码APO-E蛋白的基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞、转基因细胞系、工程菌、昆虫或酵母。

进一步地，本发明提供了上述生物材料在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。

所述药物为治疗或预防乳腺癌或肝癌的药物，具有以下至少一种的功能：

(1)降低化学物诱导的乳腺癌的发生率；

(2)降低化学物诱导的肝癌发生率；

(3)减缓或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的生长；

(4)减缓或停止已建立的肝癌肿瘤灶的生长；

(5)减少或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的转移；

(6)减少或停止已建立的肝癌肿瘤灶的转移；

(7)诱导产生乳腺癌特异性的CTL细胞并对乳腺癌细胞杀伤；

(8)诱导产生肝癌特异性的CTL细胞并对肝癌细胞杀伤。

本发明提供了含有APO-E蛋白或其多肽的药物。

本发明提供了含有APO-E蛋白与热休克蛋白gp96组成的复合物或含有APO-E蛋白的多肽与热休克蛋白gp96组成的复合物的药物。

所述热休克蛋白gp96的氨基酸序列含有SEQ ID NO.4所述的序列或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。

所述热休克蛋白gp96的获得方式为以下任一：

(1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；

(2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养，包括利用酵母、哺乳动物细胞表达体系表达，纯化得到。

所述离体哺乳动物可为人、鼠来源。所述鼠包括但不限于C57BL/6及BALB/c小鼠。

所述复合物是通过以下方式获得：

(1)将APO-E蛋白或其多肽与热休克蛋白gp96在体外以自然吸附或热击方式形成复合物；或

(2)将编码APO-E蛋白或其多肽与编码热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养、纯化获得复合物。

所述“将编码APO-E蛋白或其多肽与编码热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中”可通过汉逊酵母表达。

所述“将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中”可通过向受体中导入重组载体实现；所述重组载体可为将所述热休克蛋白gp96的编码基因插入出发质粒得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pFastBac1-gp96。所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为在质粒pFastBac1的多克隆位点插入序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述重组质粒pFastBac1-gp96具体可为将质粒pFastBac1的EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为SEQ ID NO.1所示的DNA分子得到的重组质粒。

所述受体可为Sf9细胞。

本发明提供了上述APO-E蛋白及其多肽与热休克蛋白gp96组成的复合物在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用。

所述药物为治疗或预防乳腺癌或肝癌的药物，具有以下至少一种的功能：

(1)降低化学物诱导的乳腺癌的发生率；

(2)降低化学物诱导的肝癌发生率；

(3)减缓或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的生长；

(4)减缓或停止已建立的肝癌肿瘤灶的生长；

(5)减少或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的转移；

(6)减少或停止已建立的肝癌肿瘤灶的转移；

(7)诱导产生乳腺癌特异性的CTL细胞并对乳腺癌细胞杀伤；

(8)诱导产生肝癌特异性的CTL细胞并对肝癌细胞杀伤。

应用本发明的上述药物，针对免疫对象，免疫剂量为每次不少于10μg，总共不少于3次，采取皮下注射、皮内注射或腹腔注射方式进行免疫。本发明的药物(疫苗)免疫数周后，可引发机体的特异免疫反应，清除体内肿瘤干细胞和/或肿瘤休眠细胞，以及癌变的细胞，从而达到预防和治疗癌症的目的。本发明可作为肿瘤预防性疫苗，用于自体或异体肿瘤防治，降低健康人群中癌症的发生率，也可作为肿瘤治疗性疫苗，患者术后即时施治能有效防转移防复发，或作为化学疗法的辅助治疗。本发明的也可以用于异体肿瘤的免疫防治。

附图说明

图1为胎盘gp96的SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。

图2为酵母表达gp96的SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果，图中，1：分子量标准；2：步骤2的发酵液；3：亲和层析后的洗脱液；4：离子交换层析后的洗脱液；5：western blot鉴定图。。

图3为昆虫表达gp96的SDS-PAGE和Western Blot的鉴定结果。

图4为多肽-gp96复合物对乳腺癌的治疗作用(肿瘤体积)。

图5为多肽-gp96复合物对肝癌的治疗作用(肿瘤体积)。

图6为多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人乳腺癌细胞杀伤作用。

图7位多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人乳肝癌细胞杀伤作用。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

雌性C57BL/6与雌性BALB/C小鼠为北京维通利华实验动物有限责任公司产品；在下文中简称小鼠。多肽由上海吉尔生化有限公司合成。HepG2细胞(人肝癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HB-8065^TM。MCF-7细胞(人乳腺癌细胞)为ATCC公司产品，产品目录号为HTB-22^TM。H22及HHCC细胞购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，资源号分别为3111C0001CCC000309、3111C0002000000069。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。Cellfectin II reagent为Life technologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBac^TM1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。gp96单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。HiTrap-QSepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。Insect-XPRESS^TM Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine为LONZA公司产品，产品目录号为12-730Q。BSA、PMSF、NaHCO₃、MnCl₂、CaCl₂、NaCl₂、Tris、甲基α-D-吡喃甘露糖苷均为Sigma-Aldrich公司产品，产品目录号分别为V900933、P7626、792519、V900197、793639、746398、T1378、M6882。

溶液A：溶质及其浓度为PMSF 1mM和NaHCO₃ 30mM；溶剂为蒸馏水；pH值为7.4。

溶液B：溶质及其浓度为2mM MnCl₂、2mM CaCl₂、500mM NaCl和PMSF 1mM；溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。

溶液C：溶质及其浓度为10％(质量体积比)甲基α-D-吡喃甘露糖苷、500mM NaCl和1mM PMSF；溶剂为pH7.4、20mM Tris-HCl缓冲液。

清洗液：用蒸馏水将溶液B稀释至10倍体积。

ConA琼脂糖凝胶柱为GE公司产品，产品目录号为17-0440-01，该柱的规格为1.6×2.5cm，填充介质为Con A-Sepharose 4B。Hitrap Q阴离子交换柱为GE公司产品，产品目录号为17-1153-01，该柱的规格为0.7×2.5cm。HRP标记的IgG抗体为SEROTEC公司产品，产品目录号为STAR117P。1×洗涤液为含0.1％(体积百分比)Triton-X100的pH7.4、0.01mol/LPBS缓冲液。50kD与3kD超滤管为Merck Millipore公司产品，产品目录号分别为UFC905096、UFC500324。

实施例1胎盘中gp96的提取

组织中热休克蛋白gp96(以下简称pgp96)的提取步骤如下：

(1)分离分娩前的小鼠的胎盘组织，得到小鼠离体胎盘组织。取小鼠离体胎盘组织或人离体胎盘组织，剪碎，按质量体积比1g：4mL加入溶液A，然后用玻璃匀浆器磨碎。

(2)完成步骤(1)后，16500g离心1h，得到上清液甲。

(3)完成步骤(2)后，取上清液甲，16500g离心50min，得到上清液乙。

(4)完成步骤(3)后，取上清液乙，按体积比9：1加入溶液B，混匀后得到上样液。

(5)完成步骤(4)后，将上样液上样至ConA琼脂糖凝胶柱。

(6)完成步骤(5)后，用清洗液洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，洗脱过程中实时监测紫外吸收值，检测波长为280nm，直至洗脱产物的紫外吸收值低于0.01。

(7)完成步骤(6)后，用溶液C洗脱所述ConA琼脂糖凝胶柱，弃去首先流出的过柱后溶液0.5个柱体积，然后收集之后流出的过柱后溶液1个柱体积；将所述ConA琼脂糖凝胶柱孵育50min后，再收集过柱后溶液1.5个柱体积。将两次收集的过柱后溶液合并，即为ConA洗脱液。

(8)完成步骤(7)后，将ConA洗脱液上样至Hitrap Q阴离子交换柱。

(9)完成步骤(8)后，用含NaCl的pH7.4、12mM的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min。梯度洗脱程序：在pH7.4 12mM的PBS缓冲液中使NaCl含量由300mM匀速增至800mM，线性梯度洗脱20个柱体积。收集合并NaCl含量为400～450mM的洗脱液，即为洗脱液甲。

(10)完成步骤(9)后，取洗脱液甲，用超滤管进行超滤浓缩，得到pgp96的溶液。pgp96的溶液中，pgp96浓度为5mg/mL。

将pgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，HRP标记的IgG抗体作为二抗)，实验结果见图1(箭头所指为pgp96)。结果表明，pgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量为96kDa。

实施例2利用汉逊酵母表达的重组gp96蛋白制备

一、重组质粒pHFMDZ-R1L2GAmy-gp96的构建

1、提取人肝癌细胞HepG2的mRNA，反转录合成cDNA。

2、以步骤1的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

PCR引物如下：

Fp(5'-CCGgaattcATGGACGATGAAGTTGATG-3')

Rp(5'-CCGctcgagCTATTAGAATTCATCTTTTTCAGCTGTAG-3')

3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切质粒pHFMDZ-R1A(购自Invitrogen公司，产品号为V20520)，回收载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pHFMDZ-R1-gp96并测序。测序结果表明，重组质粒pHFMDZ-R1-gp96的骨架载体为pHFMDZ-R1A，在EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了gp96蛋白的编码序列。

二、gp96蛋白的表达

1、采用电转化法将步骤1得到的重组质粒pHFMDZ-R1-gp96导入汉逊酵母(购自ATCC，产品号为MYA-335)细胞，得到重组菌。

2、将重组菌接种于5mL SD液体培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12117.7)，37℃培养48h，然后转接到100mL SYN6培养基(购自上海杰美基因医药公司，产品号为GMS12116.1)，30℃培养48h，得到种子培养液。

3、将两瓶种子培养液接种于含有2L SYN6培养基的5L发酵罐中，30℃培养。使用氨水控制pH维持在5.5，每4h检测1次发酵液中甘油含量，根据发酵液中甘油的浓度补加甘油，控制甘油终浓度在0.5％左右，同时控制溶氧在20％以上。根据菌体的生成情况检测菌体湿重，等菌体湿重达到180-200g/L的时候停止补加甘油，开始诱导重组gp96蛋白产生(补加甲醇，使甲醇浓度维持在0.5-0.8％左右)，诱导开始72小时后停止发酵，得到发酵液。

三、gp96蛋白的分离纯化

将步骤2得到的发酵液离心，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤细胞2次，在球磨机(DYNO-MILL model KDL)中，按照厂家提供的操作手册使用玻璃珠球磨的方法破碎细胞，破碎后的细胞12000rpm/min离心20min，收集上清液。上清液用0.45μm滤膜进行过滤，得到滤液。将滤液进行浓缩，得到浓缩液。

将滤液进行亲和层析，具体步骤如下：采用英俊公司(Invitrogen Corporation)的Ni-NTA Purification System进行亲和层析，主要步骤为：先用PBS平衡柱子2h，然后用PBS(含20mM咪唑)平衡柱子2h。将浓缩液用PBS(含20mM咪唑)稀释后上样，用PBS(含20mM咪唑)冲洗柱子至OD值<0.01，用PBS(含200mM咪唑)洗脱1.5h，收集洗脱液。所有操作均在4℃下进行，流速为0.5mL/min。

每升步骤2得到的发酵液纯化后可以获得50毫克纯度90％以上的gp96蛋白。如果蛋白洗脱液中含有异源杂蛋白，可将亲和层析的洗脱液再进行离子交换层析，主要步骤为：200mM NaCl的PBS液平衡柱子，上样，300mM NaCl的PBS液洗杂质，800mM NaCl的PBS液洗脱目的蛋白。

将步骤2的发酵液、亲和层析后的洗脱液和离子交换层析后的洗脱液进行10％SDS-PAGE，然后考马斯亮蓝染色。将gp96蛋白进行western blot，一抗为大鼠抗gp96抗体(购自santa cruz，产品号为sc-56399)，结果见图2。图2显示，离子交换层析后的洗脱液中的gp96蛋白纯度很高。

实施例3昆虫细胞表达的重组热休克蛋白gp96的制备

一、重组质粒pFastBac^TM1-gp96的构建

1、采用Trizol法提取HepG2细胞的RNA，然后进行反转录获得cDNA。

2、根据人gp96基因(GenBank号为AY040226.1)的序列，人工合成引物F1：5’-GGAATTCATGGACGATGAAGTTGAT-3’(下划线为限制性内切酶EcoR Ⅰ识别序列)和R1：5’-GCTCTAGACTATTAGAATTCATCTTTTTC-3’(下划线为限制性内切酶Xba Ⅰ识别序列)。

3、完成步骤1和2后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤2合成的F1和R1为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

4、用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

5、用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ酶切质粒pFastBac^TM1，回收约4700bp的载体骨架。

6、将酶切产物与载体骨架连接，得到连接产物。

7、将步骤6获得的连接产物转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，得到重组大肠杆菌，然后提取该重组大肠杆菌的质粒，获得重组质粒pFastBac1-gp96。

根据测序结果，对重组质粒pFastBac1-gp96进行结构描述如下：将质粒pFastBac1的EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ识别序列间的片段(质粒pFastBac1被限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中SEQ ID NO.3所示的双链DNA分子。重组质粒pFastBac 1-gp96表达重组热休克蛋白gp96(以下简称rgp96)，rgp96的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

二、rgp96的表达

1、将步骤一构建的重组质粒pFastBac1-gp96共转染Sf9细胞(每1×10⁶个Sf9细胞约转染4μg重组质粒pFastBac1-gp96；共转染过程中，转染试剂为Cellfectin II reagent，培养基为Insect-XPRESS^TM Protein-free Insect Cells medium with L-Glutamine，27℃孵育72h，离心，上清液即为P1代病毒。

2、将Sf9细胞悬浮液1(含1×10⁸个Sf9细胞)27℃培养8～10h，得到培养细胞；然后向所述培养细胞中加入P1代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃孵育72h，4000rpm离心5min，上清液即为P2代病毒。

3、向Sf9细胞悬浮液2(含1.6×10⁸个Sf9细胞)中加入P2代病毒(剂量为0.05～0.1MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，4000rpm离心5min，上清液即为P3代病毒。

以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗，对P3代病毒进行western杂交，western杂交具体步骤参考如下文献：张悦鸣，段跃强，罗德炎，姚惠娟，王希良，李志奎.小鼠可溶性IL-5α受体在Bac-to-Bac系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志，2013，26：5。western杂交实验结果表明，rgp96在Sf9细胞中表达。

三、rgp96的纯化

1、向300ml的Sf9细胞悬浮液3(含4.5×10⁸个Sf9细胞)中加入P3代病毒(剂量为5MOI)，27℃、100～120rpm培养72h，得到悬浮液。

2、取所述悬浮液，7000rpm离心20min，获得上清液1。

3、取所述上清液1，经0.22mm滤膜过滤，获得上样液。

4、将所述上样液上样于HiTrap-Q Sepharose离子交换层析柱(流速为1mL/min)，然后先用5mL的pH7.5、200mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；再用10mL的pH7.5、300mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)；最后用3mL的pH7.5、600mM的PBS缓冲液冲洗(流速为1mL/min)，收集过柱后溶液并采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到1mL左右的浓缩液。所述浓缩液即含有rgp96。

5、将步骤4得到的浓缩液上样于Superdex 200 10/300GL分子筛层析柱(流速为0.25mL/min)，然后用pH7.5、150mM的PBS缓冲液洗涤(流速为0.25mL/min)，收集为9～12mL处的穿透液，进一步采用截留分子量为50KD的超滤管进行超滤浓缩，得到rgp96的溶液。采用BCA法测定rgp96的溶液中的蛋白浓度，最后分装，贮存于-80℃。

将步骤5得到的rgp96的溶液进行SDS-PAGE电泳分析，实验结果见图2中左图(泳道1为高分子量标准蛋白质，泳道2为rgp96，箭头为rgp96)。将步骤5得到的重组热休克蛋白gp96的溶液进行Western blot(以gp96单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体作为二抗)，实验结果见图3。结果表明，rgp96的溶液显示单一分子量条带，对应的分子量与预期一致。

实施例4 APO-E多肽与胎盘gp96结合的复合物制备与鉴定

一、小鼠胎盘gp96结合的多肽鉴定

1、多肽洗脱：取5mg实施例1提取的浓度为10mg/mL小鼠胎盘pgp96，加入5μL含有20％(体积比)三氟乙酸的水溶液，4℃中孵育1h。

2、将步骤1中的孵育液加入3kD超滤管中，12,000rpm离心30min，取穿透液。

3、将步骤2中的穿透液注入Agilent 1200高压液相色谱仪进行脱盐纯化(色谱柱型号SB-C182.1mm×250mm)，程序如下：A相：5％(体积比)乙腈水溶液，含0.1％三氟乙酸；B相：乙腈，含0.1％三氟乙酸；0-30min 100％A，30-70min 100％B。

4、收集步骤3中30-70分钟的洗脱液，冻干。

5、将步骤4的冻干粉末用0.1％(体积比)的甲酸水溶液重溶，注入OrbitrapFusion高分辨率质谱仪，分析多肽序列，并从数据库中进行匹配。匹配结果见表1。

表1与小鼠胎盘gp96结合的蛋白多肽匹配结果

二、APOE多肽-gp96复合物制备

1、将表1得到的APO-E蛋白结果氨基酸序列输入该网址http://tools.immuneepitope.org/mhci/进行MHC I类分子的表位预测，分别选取最优的H-2K^d、H-2K^b及HLA-A2限制性表位并化学合成，预测HLA-A2表位时所选用的氨基酸序列应为人类中的同源蛋白。表位筛选结果见表2。

表2 APO-E蛋白多肽的表位筛选结果

MHC I限制型	多肽序列	多肽位置
				VYKAGAREGAERGV	171-184
	TMLGQSTEEIRARL	134-147
			HLA-A2	FLAGCQAKV	12-20

2、分别化学合成以上多肽(上海吉尔生化有限公司)，将合成的多肽用细胞级DMSO(Sigma-Aldrich公司，目录号D2650)复溶为20mg/mL浓度，分别取1mg多肽与1mg实施例3中制备的重组rgp96，用pH7.4 0.01mol/L PBS缓冲液稀释至4mL体积。55℃热击10分钟，在室温冷却30分钟。然后采用50kD超滤管洗去未结合的多肽，分别制备获得不同限制性表位的APOE多肽-gp96复合物。

实施例5 APOE多肽-gp96复合物对乳腺癌的预防与治疗作用

一、APOE多肽-gp96复合物对原发性乳腺癌的预防作用

取8周龄C57BL/6小鼠20只分成两组，每组10只，分别进行如下处理：

第一组：腹部皮下注射实施例4制备的APOE多肽H-2K^b-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；

第二组：腹部皮下注射实施例3制备的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；

以上两组中：实验第1天进行第一次免疫；第8天进行第二次免疫；第22天进行第三次免疫。

免疫完成后1周开始每只小鼠按50mg/kg剂量口服灌胃食用橄榄油配制的DMBA(Sigma-Aldrich公司，目录号D3254)溶液，每周1次，连续5周，诱导乳腺癌发病。

自有小鼠产生乳腺癌肿瘤开始(约造模后14周左右)每周检测肿瘤生长，并统计肿瘤发生率与计算肿瘤体积。肿瘤体积计算公式V＝ab²/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。一直观察到34周，计算肿瘤发生率、肿瘤个数与平均肿瘤大小。统计结果见表3。从结果可以看出，APOE多肽-gp96复合物对DMBA诱导的乳腺癌有明显的预防作用。免疫APOE多肽-gp96复合物后乳腺癌的发病率明显降低，发病时间推迟，肿瘤个数及肿瘤体积均减小。

表3 DMBA诱导的小鼠乳腺癌肿瘤统计结果

二、APOE多肽-gp96复合物对诱导乳腺癌模型的治疗作用

取20只6-8周的雌性Balb/c小鼠，每只皮下分别接种6×10⁵TUBO细胞，第2天将小鼠分成两组，每组10只，分别进行如下处理：

第一组：腹部皮下注射实施例4制备的APOE多肽(H-2K^d)-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；

第二组：腹部皮下注射实施例3制备的gp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；

以上两组中：接种肿瘤细胞后第2天进行第一次免疫；第5天进行第二次免疫；第8天进行第三次免疫。从第一天免疫开始，每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积：V＝ab²/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。肿瘤体积变化见图4。从结果可以看出，APOE多肽-gp96复合物对皮下接种的诱导型乳腺癌模型有明显的治疗作用。APOE多肽-gp96复合物治疗后皮下肿瘤的生长速度明显减慢，肿瘤体积变小。

实施例6 APOE多肽-gp96复合物对肝癌的预防与治疗作用

一、多肽-gp96复合物对原发性肝癌的预防作用

取20只6周龄雌性C57BL/6小鼠，平均分为两组，每组10只，分别进行如下处理：

第一组：腹部皮下注射实施例4制备的APOE多肽(H-2K^b)-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；

第二组：腹部皮下注射实施例3制备的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；

以上两组中：实验第1天进行第一次免疫；第8天进行第二次免疫；第22天进行第三次免疫。

最后一次免疫结束后1周，将两组小鼠每日饮水换为含30μg/mL DEN(Sigma-Aldrich公司，目录号73861)的无菌蒸馏水，连续饲养40周，至第40周时处死小鼠，取出肝脏进行比较分析比较。比较结果见表4。从结果可以看出，APOE多肽-gp96复合物对DEN诱导的肝癌有明显的预防作用。免疫APOE多肽-gp96复合物后肝癌的发病率明显降低，发病时间推迟，肿瘤个数及肿瘤体积均减小。

表4 DEN诱导的小鼠肝癌统计结果

二、APOE多肽-gp96复合物对诱导肝癌模型的治疗作用

将液氮冻存的小鼠肝癌H22细胞于37℃水浴锅中快速解冻，细胞密度调至1×10⁷/mL，腹腔接种2只BALB/c小鼠，每只0.2mL。待小鼠腹部胀大后，将小鼠颈椎脱臼处死，消毒腹部，抽取腹水合并，用PBS调整细胞密度至1×10⁷/mL，皮下接种20只BALB/c小鼠，每只0.2mL。12天后将小鼠分成两组，每组10只，分别进行如下处理：

第一组：腹部皮下注射实施例4制备的APOE多肽(H-2K^d)-gp96复合物，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；

第二组：腹部皮下注射实施例3制备的rgp96，免疫三次(每次0.2ml)，单次免疫剂量为20ug/只；

以上两组中：接种肿瘤细胞后第12天进行第一次免疫；第15天进行第二次免疫；第18天进行第三次免疫。从第一天免疫开始，每天观察肿瘤生长情况，记录肿瘤大小，按以下公式计算肿瘤体积：V＝ab²/2(V—体积,a—肿瘤长径,b—肿瘤短径)。肿瘤体积变化见图5。从结果可以看出，APOE多肽-gp96复合物对皮下接种的诱导型肝癌模型有明显的治疗作用。APOE多肽-gp96复合物治疗后皮下肿瘤的生长速度明显减慢，肿瘤体积变小。

实施例7 APOE多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人乳腺癌细胞杀伤效应

一、人源多肽特异性效应细胞的制备

1、使用人淋巴细胞分离液(Cellgro,25-072-CI)分离HLA-A2阳性志愿者的抗凝新鲜全血，获得外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％胎牛血清(Gibco，10099-141-FBS)的RPMI-1640完全培养基(Gibco，12633012)调整细胞浓度为1.0X10⁶/ml，接种于24孔板，每孔1ml。

2、次日每组分别加入APOE多肽(HLA-A2)-gp96复合物至终浓度为10μg/ml。

3、第三天每孔加入IL-2(PeproTech公司，目录号212-12)至终浓度为50U/ml，每2-3天半量换液并补充IL-2至终浓度为50U/ml。

4、分别于第七天、第十四天进行第二轮、第三轮APOE多肽-gp96复合物刺激，次日加入IL-2至终浓度为50U/ml。

5、第三轮刺激后3天，得到人源多肽效应细胞CTL。

二、靶细胞

人乳腺癌细胞系MCF-7(HLA-A2表达阳性)，多肽孵育的T2细胞(HLA-A2表达阳性)、T2细胞。

三、乳腺癌细胞特异性杀伤效应的检测

使用非放射性细胞毒性检测(Promega，目录号G1780)进行细胞毒活性检测，主要步骤如下(详见试剂盒使用说明书)：

1、以MCF-7细胞、多肽孵育的T2细胞、Τ2细胞作为靶细胞，接种靶细胞数目为5×10³/孔，按照效靶比10:1的比例加入上述效应细胞，效应细胞以50μ1/孔接种于96孔培养板中，终体积100μ1；

此外另设效应细胞自发LDH释放组，用来校准效应细胞自发释放出来的LDH(各组效应细胞以50μ1/孔加入96孔板，补充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基至终体积100μ1)。靶细胞自发LDH释放组，用来校正靶细胞自发释放出来的LDH(各组靶细胞以50μ1/孔加入96孔板，补充50μ1含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基至终浓度100μ1)。靶细胞最大LDH释放组,用来计算时作为确定100％的LDH释放的参照(细胞上样同靶细胞自发释放组)。体积校正对照组，用来校正由于加入裂解液引起的体积变化(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基100μ1)。培养基背景对照组，用来校正由培养基中血清产生的LDH活性以及酚红造成的背景吸收(加入含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基100μ1)。

2、细胞接种后，使用250g离心4min，接着于37℃培养箱中孵育4h；在收获上清前45min，向靶细胞最大LDH释放组中加入裂解液(10×)，10μ1/孔；接着使用250g离心4min，收获上清；

3、转移50μ1上清至酶标板中，用检测缓冲液配制底物，把配好的底物50μ1/孔加到酶标板中，盖好平板，室温避光反应30min，向每空加入50μ1终止液，1h内于酶标仪检测490nm吸光值OD。

4、计算细胞杀伤率

杀伤率(％)＝[(实验组OD值-效应细胞自发释放组OD值-靶细胞自发释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自发释放组OD值)]×100％

细胞杀伤结果见图6。结果表明APOE多肽-gp96复合物可以从人的外周血淋巴细胞(PBMC)中诱导出表位特异性的细胞毒性T细胞(CTL)，该细胞可对人乳腺癌细胞MCF-7杀伤，表明APOE多肽-gp96复合物有预防和治疗人乳腺癌的能力。

实施例8 APOE多肽-gp96复合物诱导的特异性CTL对于人肝癌细胞杀伤效应

一、人源多肽特异性效应细胞的制备

APOE多肽(HLA-A2)-gp96复合物诱导的特异性CTL制备方法同实施例7，用含5％胎牛血清的RPMI-1640培养基调整至适当浓度，作为效应细胞。

二、靶细胞

人肝癌细胞HHCC(HLA-A2表达阳性)，多肽孵育的T2细胞(HLA-A2表达阳性)、T2细胞

三、肝癌细胞特异性杀伤效应的检测

检测方法同实施例7，将靶细胞换为人肝癌细胞HHCC，实验组按效靶比10:1的比例加入效应细胞与靶细胞，同时设立效应细胞自发释放组、靶细胞自发释放组、靶细胞最大释放组、背景对照组、体积校正对照组。37℃条件下孵育4h后加入细胞裂解液，收获上清做LDH检测。细胞杀伤结果见图7。结果表明APOE多肽-gp96复合物可以从人的外周血淋巴细胞(PBMC)中诱导出表位特异性的细胞毒性T细胞(CTL)，该细胞可对人肝癌细胞HHCC杀伤，表明APOE多肽-gp96复合物有预防和治疗人肝癌的能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京热休生物技术有限公司

<120> APO-E蛋白及其多肽在治疗与预防癌症中的应用

<130> KHP171110223.8

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 951

<212> DNA

<213> APO-E蛋白

<400> 1

atgaaggttc tgtgggctgc gttgctggtc acattcctgg caggatgcca ggccaaggtg 60

gagcaagcgg tggagacaga gccggagccc gagctgcgcc agcagaccga gtggcagagc 120

ggccagcgct gggaactggc actgggtcgc ttttgggatt acctgcgctg ggtgcagaca 180

ctgtctgagc aggtgcagga ggagctgctc agctcccagg tcacccagga actgagggcg 240

ctgatggacg agaccatgaa ggagttgaag gcctacaaat cggaactgga ggaacaactg 300

accccggtgg cggaggagac gcgggcacgg ctgtccaagg agctgcaggc ggcgcaggcc 360

cggctgggcg cggacatgga ggacgtgtgc ggccgcctgg tgcagtaccg cggcgaggtg 420

caggccatgc tcggccagag caccgaggag ctgcgggtgc gcctcgcctc ccacctgcgc 480

aagctgcgta agcggctcct ccgcgatgcc gatgacctgc agaagcgcct ggcagtgtac 540

caggccgggg cccgcgaggg cgccgagcgc ggcctcagcg ccatccgcga gcgcctgggg 600

cccctggtgg aacagggccg cgtgcgggcc gccactgtgg gctccctggc cggccagccg 660

ctacaggagc gggcccaggc ctggggcgag cggctgcgcg cgcggatgga ggagatgggc 720

agccggaccc gcgaccgcct ggacgaggtg aaggagcagg tggcggaggt gcgcgccaag 780

ctggaggagc aggcccagca gatacgcctg caggccgagg ccttccaggc ccgcctcaag 840

agctggttcg agcccctggt ggaagacatg cagcgccagt gggccgggct ggtggagaag 900

gtgcaggctg ccgtgggcac cagcgccgcc cctgtgccca gcgacaatca c 951

<210> 2

<211> 317

<212> PRT

<213> APO-E蛋白

<400> 2

Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys

1 5 10 15

Gln Ala Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu

20 25 30

Arg Gln Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu

35 40 45

Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln

50 55 60

Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala

65 70 75 80

Leu Met Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu

85 90 95

Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser

100 105 110

Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp

115 120 125

Val Cys Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu

130 135 140

Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg

145 150 155 160

Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg

165 170 175

Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu

180 185 190

Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val

195 200 205

Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg

210 215 220

Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly

225 230 235 240

Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu

245 250 255

Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala

260 265 270

Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu

275 280 285

Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala

290 295 300

Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His

305 310 315

<210> 3

<211> 2409

<212> DNA

<213> 热休克蛋白gp96

<400> 3

atgagggccc tgtgggtgct gggcctctgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtcggtcaga 60

gctgacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa 120

ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 180

ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 240

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 300

ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 360

actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 420

gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 480

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 540

gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 600

tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 660

cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 720

ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 780

ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 840

gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 900

gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 960

ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 1020

ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa 1080

tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa 1140

gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa 1200

tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcacagac 1260

gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat 1320

gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt 1380

aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac 1440

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac 1500

tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac 1560

attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc 1620

atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1680

aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt 1740

cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa 1800

agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat 1860

tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg 1920

acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga 1980

atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt 2040

cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga 2100

attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2160

gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa 2220

agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa 2280

gaagaacctg aagagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa 2340

gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa 2400

gatgaattg 2409

<210> 4

<211> 803

<212> PRT

<213> 热休克蛋白gp96

<400> 4

Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe

1 5 10 15

Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu

20 25 30

Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val

35 40 45

Val Gln Arg Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser

50 55 60

Gln Ile Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala

65 70 75 80

Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn

85 90 95

Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu

100 105 110

Asp Lys Ile Arg Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly

115 120 125

Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu

130 135 140

Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val

145 150 155 160

Lys Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn

165 170 175

Lys Met Thr Glu Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile

180 185 190

Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys

195 200 205

Val Ile Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu

210 215 220

Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr

225 230 235 240

Leu Gly Arg Gly Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser

245 250 255

Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser

260 265 270

Gln Phe Ile Asn Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr

275 280 285

Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu

290 295 300

Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys

305 310 315 320

Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met

325 330 335

Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu

340 345 350

Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp

355 360 365

Pro Met Ala Tyr Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys

370 375 380

Ser Ile Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu

385 390 395 400

Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val

405 410 415

Phe Ile Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe

420 425 430

Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg

435 440 445

Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu

450 455 460

Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr

465 470 475 480

Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val

485 490 495

Ile Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe

500 505 510

Gln Ser Ser His His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val

515 520 525

Glu Arg Met Lys Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser

530 535 540

Ser Arg Lys Glu Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys

545 550 555 560

Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys

565 570 575

Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala

580 585 590

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595 600 605

Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp

610 615 620

Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu

625 630 635 640

Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly

645 650 655

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660 665 670

Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn

675 680 685

Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp

690 695 700

Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr

705 710 715 720

Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly

725 730 735

Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp

740 745 750

Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu

755 760 765

Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val

770 775 780

Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys

785 790 795 800

Asp Glu Leu

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccggaattca tggacgatga agttgatg 28

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccgctcgagc tattagaatt catctttttc agctgtag 38

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggaattcatg gacgatgaag ttgat 25

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gctctagact attagaattc atctttttc 29

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> H-2Kd

<400> 9

Val Tyr Lys Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Val

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> H-2Kb

<400> 10

Thr Met Leu Gly Gln Ser Thr Glu Glu Ile Arg Ala Arg Leu

1 5 10

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> HLA-A2

<400> 11

Phe Leu Ala Gly Cys Gln Ala Lys Val

1 5

Claims (10)

1.APO-E蛋白在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用，所述APO-E蛋白其氨基酸序列含有如下：

i)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

ii)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列自N端起第2位至第783位氨基酸序列；或

iii)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。

2.编码APO-E蛋白的基因在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用，所述编码APO-E蛋白的基因的核苷酸序列含有如下：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸具有75％及以上同源性的核苷酸序列；或

iv)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

3.含有编码APO-E蛋白的基因的生物材料在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用，所述生物材料为载体、宿主细胞、转基因细胞系、工程菌、昆虫或酵母；

所述编码APO-E蛋白的基因的核苷酸序列含有如下：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸具有75％及以上同源性的核苷酸序列；或

iv)在严格条件下与Seq ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述药物具有以下至少一种的功能：

(1)降低化学物诱导的乳腺癌的发生率；

(2)降低化学物诱导的肝癌发生率；

(3)减缓或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的生长；

(4)减缓或停止已建立的肝癌肿瘤灶的生长；

(5)减少或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的转移；

(6)减少或停止已建立的肝癌肿瘤灶的转移；

(7)诱导产生乳腺癌特异性的CTL细胞并对乳腺癌细胞杀伤；

(8)诱导产生肝癌特异性的CTL细胞并对肝癌细胞杀伤。

5.含有APO-E蛋白或其多肽的药物，所述APO-E蛋白其氨基酸序列含有如下：

i)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

ii)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列自N端起第2位至最后一位氨基酸序列；或

iii)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。

6.一种药物，其特征在于，含有APO-E蛋白与热休克蛋白gp96组成的复合物或含有APO-E蛋白的多肽与热休克蛋白gp96组成的复合物；

所述APO-E蛋白其氨基酸序列含有如下：

i)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；或

ii)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列自N端起第2位至最后一位氨基酸序列；或

iii)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列；

所述热休克蛋白gp96的氨基酸序列含有SEQ ID NO.4所述的序列或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述热休克蛋白gp96的获得方式为以下任一：

(1)从离体哺乳动物的胎盘组织中提取；

(2)将编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养，包括利用酵母、哺乳动物细胞表达体系表达，纯化得到。

8.如权利要求6或7所述的药物，其特征在于，所述复合物是通过以下方式获得：

(1)将APO-E蛋白或其多肽与热休克蛋白gp96在体外以自然吸附或热击方式形成复合物；或

(2)将编码APO-E蛋白或其多肽与编码热休克蛋白gp96的核酸分子导入受体中，培养、纯化获得复合物。

9.APO-E蛋白及其多肽与热休克蛋白gp96组成的复合物在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物具有以下至少一种的功能：

(1)降低化学物诱导的乳腺癌的发生率；

(2)降低化学物诱导的肝癌发生率；

(3)减缓或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的生长；

(4)减缓或停止已建立的肝癌肿瘤灶的生长；

(5)减少或停止已建立的乳腺癌肿瘤灶的转移；

(6)减少或停止已建立的肝癌肿瘤灶的转移；

(7)诱导产生乳腺癌特异性的CTL细胞并对乳腺癌细胞杀伤；

(8)诱导产生肝癌特异性的CTL细胞并对肝癌细胞杀伤。