CN110616189A - 通用型靶向cd19抗原嵌合受体t细胞的制备及其应用 - Google Patents

通用型靶向cd19抗原嵌合受体t细胞的制备及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通用型靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的制备及其应用。本发明具体涉及一种制备靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的方法，所述方法包括将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和B2M基因；和将靶向CD19 CAR和B2M‑HLA‑E融合基因克隆至修复模板载体中以同时向T细胞导入靶向CD19 CAR和B2M‑HLA‑E融合基因同源重组修复模板。所述通用型靶向CD19抗原嵌合受体T细胞具有异体移植排斥反应小、产量高、安全性高、即时可用和适用范围广等优点。

Description

通用型靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的制备及其应用
技术领域
本发明涉及细胞治疗领域，特别涉及包括通用型靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的细胞治疗领域。
背景技术
CAR-T治疗
传统肿瘤治疗药物包括化疗药、靶向药，虽然它们在一定程度上提高了癌症患者的生存期，但同时也带来了严重的副作用，极大地降低了病人的生存质量。更不幸的是，大部分患者在接受这些传统治疗后仍旧会复发，而一旦复发，无药可救是大概率事件。
近年来，随着免疫治疗的发展，免疫检验点抑制剂药物(如CTLA-4、PD-1/PD-L1抗体)的出现，彻底改变了肿瘤治疗的方式。但这类药物在不同癌症病人中的有效率只有20％-40％，仍然有大部分的癌症患者等待新的有效治疗方式的出现。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗技术是通过体外转导一个识别癌细胞的人工基因于人体T细胞上，使人T细胞具有特异杀伤肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞治疗属于过继性免疫疗法(adoptive cell transfer，ACT)，它利用人体免疫细胞来对抗肿瘤，被称为“活体药物”。这种ACT疗法在近年已应用于临床实验当中，特别是在儿童白血病方面的有效探索，为研究者以及医生开辟了一条治疗肿瘤的新路径。2017年末，两款CAR-T药物获得美国FDA的许可上市，这种ACT疗法与传统药物相比具有如下创新点：
首先，精确靶向肿瘤，且副作用可逆。CAR-T细胞治疗相比化疗药、靶向药具有更特异的肿瘤细胞杀伤能力。在输入病人体内后，虽然短时间内会产生细胞因子效应，但该副反应可控，病人在获得完全缓解的情况下基本上能和健康人一样生活。
其次，持续缓解时间长。CAR-T细胞部分属于记忆T细胞，在输入病人体内后能长期存在于病人身体中，时刻监视身体中是否出现肿瘤细胞，一旦有新的肿瘤细胞出现就会立刻将其杀灭。
其中，靶向CD19 CAR-T细胞治疗已在临床实验阶段被用于复发难治的急性淋巴白血病、慢行淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤，也有见报道称用于多发性骨髓瘤。在上述适应症中，靶向CD19 CAR-T取得了极高的完全缓解率，特别是在急性淋巴白血病中取得了超过80％的完全缓解率。在靶向CD19 CAR-T治疗中也出现了一些问题：首先是短时间副作用大，主要是细胞因子风暴和神经毒性，超过一半的病人都有不同程度的上述副作用；其次是复发问题，据不同研究结果分析，有超过一半的病人在经过靶向CD19 CAR-T细胞治疗一年后会复发，复发的原因包括肿瘤抗原逃逸和输入CAR-T细胞耗竭等。
虽然，自体CAR-T在我国已如火如荼地进行着临床研究以及产业化的进程，但因特殊的技术特点，其在商业化的道路上仍有一些障碍：
首先，价格高昂。“私人订制”式的生产导致高昂的价格，诺华上市的CD19 CAR-T细胞制品Kymirah售价高达47.5万美金，风筝制药上市的Yescarta售价34.7万美金，对于中国患者是难以承受的负担。
其次，订制时间长。订制式的CAR-T细胞需要15～20天的培养时间，对于晚期恶性肿瘤患者，病情紧急，无法及时给药，病人可能在药品制备的等待中去世。
再次，具有使用限制自体CAR-T的制备非常依赖于病人自身的T细胞状态，往往对于经过多次化疗的病人，其T细胞并不适合用来制作CAR-T，其使用受到限制。据不完全统计，有10％左右的血液肿瘤患者其T细胞不具备订制自体CAR-T的条件，因此无法使用。
通用型CAR-T治疗
通用型CAR-T(Universal CAR-T，UCAR-T)取自健康人血液，提取T细胞，经过工程改造，回输给不同患者。通用型CAR-T是基于基因编辑、病毒转染技术与电转技术改造人体免疫T细胞而来的。它在已有T细胞上敲除某些基因，使得外来的健康人T细胞不会攻击患者体内细胞引起抗宿主排异反应(GvHD效应)，以及不会被患者免疫系统清除，从而存活在患者体内发挥肿瘤杀伤的作用。通用型CAR-T是摆放在货架的药物，因为它取自已有健康人T细胞，可按照生产药物的严格标准大规模量产。并且，每个不同CAR的靶点可针对不同癌症适应症，也可做到用不同UCAR-T治疗具有不同“分子标记”的肿瘤，极具多样性。通用型CAR-T相比较自体CAR-T，具备“摆在货架上(off-the-shelf)”的特点：
首先，随时可用，因无需使用患者T细胞，可提前制备，因此是一种“摆在货架上的药品”，可随时取用，病人无需等待。
其次，可规模化量产，成本大幅降低。不是“私人订制”，可大规模批量生产。一个健康人采血400ml，即可制备满足上百位患者的UCAR-T细胞制品。初步预测单剂量的UCAR-T，其成本将是自体CAR-T成本的1/10。
第三，无使用限制。因采用健康人血液提取T细胞制备，无需患者自身提供，因此不受患者身体状况(T细胞状态)左右，没有使用限制。
然而，通用型CAR-T治疗仍需克服以下问题：
1)同种异体T细胞移植相容问题
虽然通用型CAR-T治疗有诸多的优势，但是其生产制作和研发难度要大大高于自体CAR-T治疗。其中最影响其疗效的是同种异体排异问题：不同的个体，其组织相容性抗原存在差异，从而导致了受体T细胞对移植物的攻击和排异。为解决这个问题，通常利用基因编辑的方法(如ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9)将CAR-T细胞中的B2M基因敲除，从而使HLA-ABC蛋白无法在细胞表面展示，进而可以避免被受体T细胞攻击。也有一些研究者将CIITA基因一并敲除，来降低二类组织相容性抗原的表达。
2)移植物抗宿主反应(GvHD)
移植物抗宿主反应(graft versus host disease，GVHD)是由移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应。其产生的条件是移植物中包含T淋巴细胞及移植物与宿主的主要组织相容性抗原不一致。在骨髓移植中，GvHD是主要的障碍，其会杀伤宿主体内的细胞而导致多器官功能衰竭，进而引起其他并发症。在通用型CAR-T细胞治疗中，GvHD是最需要避免的一个问题，否则宿主有严重的副作用。TCR是T淋巴细胞识别靶细胞主要基因，敲除TCR基因可以避免异体T细胞对宿主细胞的攻击，所以异体移植的通用型CAR-T细胞必须将TCR基因敲除才能避免GvHD。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明首先提供：
本发明的第一个方面，提供一种制备靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的方法，所述方法包括将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和B2M基因；和
将靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因克隆至修复模板载体中以同时导入靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因同源重组修复模板。
本发明的第二个方面，提供根据第一个方面所述的方法，所述方法还包括：
从健康受试者血中提取PBMC并激活T细胞；和/或
T细胞培养扩增，收集TCR或CD3阴性细胞。
本发明的第三个方面，提供根据第一个方面所述的方法，其中所述基因编辑物质包括ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、megaTAL，优选CRISPR-Cas9，其中Cas9包括SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9、cpf1，优选SpCas9，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其中SpCas9mRNA含有入核信号，所述入核信号优选SV40NLS和核质蛋白NLS，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
本发明的第四个方面，提供根据第一个方面所述的方法，其中将所述基因编辑物质递送至T细胞的方式包括质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、mRNA或RNA蛋白复合体。
本发明的第五个方面，提供根据第四个方面所述的方法，其中mRNA递送方式使用SpCas9mRNA和修饰的sgRNA。
本发明的第六个方面，提供根据第五个方面所述的方法，其中sgRNA修饰方式为：5’和3’端1-10个碱基进行(i)2’-O-甲基化修饰；(ii)2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰；或(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。
本发明的第七个方面，提供根据第五个方面所述的方法，其中靶向TRAC基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:4所示，靶向B2M基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明的第八个方面，提供根据第一个方面所述的方法，其中所述修复模版载体包括腺相关病毒、非整合型慢病毒、单链DNA、双链DNA、质粒DNA，优选腺相关病毒载体，其中腺相关病毒载体的血清型包括：1、2、3、4、5、6、7、8、9、DJ，优选血清型6，所述修复模版载体的核心序列从5’到3’端依次包括同源序列左臂、敲入基因、同源序列右臂。
本发明的第九个方面，提供根据第八个方面所述方法，其中靶向CD19CAR基因修复模版同源臂的长度为300-1200bp，和/或B2M-HLA-E融合基因同源臂的长度为300-1200bp。
本发明的第十个方面，提供根据第一个和第八个方面所述的方法，其中敲入的基因包括以下元件或其组合：剪切肽、靶向CD19 CAR、Poly A，其中剪切肽优选是T2A、P2A、IRES，Poly A优选包括BGHpA，靶向CD19CAR优选包含信号肽、靶向CD19抗体scFv、铰链区、跨膜区、一个或两个共刺激信号区、信号传导区。
本发明的第十一个方面，提供根据第十个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的跨膜结构选自以下蛋白：CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。
本发明的第十二个方面，提供根据第十个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的跨膜结构选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
本发明的第十三个方面，提供根据第十个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的铰链结构选自以下蛋白：IgG1、IgG4、IgD或CD8。
本发明的第十四个方面，提供根据第十三个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的铰链结构选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
本发明的第十五个方面，提供根据第十个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的共刺激信号选自以下蛋白：CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、CD137、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、CARD11、NKD2C、DAP10、LAT、SLP76或ZAP70。
本发明的第十六个方面，提供根据第十五个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的共刺激信号选自CD137，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
本发明的第十七个方面，提供根据第十五个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的共刺激信号选自CD28，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
本发明的第十八个方面，提供根据第十五个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的共刺激信号选自CD28和CD137。
本发明的第十九个方面，提供根据第十个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的信号传导区选自CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所述。
本发明的第二十个方面，提供根据第十个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR信号肽选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
本发明的第二十一个方面，提供根据第十个方面所述的方法，其中靶向CD19 CAR的抗体scFv序列如SEQ ID NO:24所示，靶向CD19 CAR序列优选SEQ ID NO:25，T2A DNA序列如SEQ ID NO:26所示，P2A DNA序列如SEQ ID NO:27所示，IRES DNA序列如SEQ ID NO:28所示，BGHpA DNA序列如SEQ ID NO:29所示，敲入的基因序列优选SEQ ID NO:30。
本发明的第二十二个方面，提供根据第一个方面所述的方法，其中敲入的B2M-HLA-E融合基因第一种形式B2M-HLA-E-1包括以下元件的组合：B2M信号区DNA、提呈的多肽DNA、接头DNA、B2M基因、接头DNA、HLA-E基因；或B2M-HLA-E融合基因第二种形式B2M-HLA-E-2包括以下元件的组合：B2M信号区DNA、B2M基因、接头DNA、HLA-E基因。
本发明的第二十三个方面，提供根据第二十二个方面所述方法，其中B2M信号区DNA序列如SEQ ID NO:31所示，B2M DNA序列如SEQ ID NO:32所示。
本发明的第二十四个方面，提供根据第二十二个方面所述方法，其中提呈的多肽序列为：VN2APRTN7N8L，N2为除了苏氨酸以外的氨基酸，N7为缬氨酸或亮氨酸、N8为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
本发明的第二十五个方面，提供根据第二十二个方面所述方法，其中提呈的多肽序列为SEQ ID NO:33。
本发明的第二十六个方面，提供根据第二十二个方面所述，其中HLA-E基因包括如下形式：HLA-E*0101、HLA-E*0102、HLA-E*0103、HLA-E*0104。
本发明的第二十七个方面，提供根据第二十六个方面所述，其中HLA-E基因为HLA-E*0103，其氨基酸序列为SEQ ID NO:34。
本发明的第二十八个方面，提供根据第二十二个方面所述，其中B2M-HLA-E融合基因第一种形式B2M-HLA-E-1的DNA序列如SEQ ID NO:35所示，第二种形式B2M-HLA-E-2的DNA序列如SEQ ID NO:36所示。
本发明的第二十九个方面，提供根据第一个方面所述的方法，其中在步骤4)中将辐照K562-CD19细胞或全长的CD19蛋白或胞外区CD19蛋白用于激活靶向CD19通用型CAR-T细胞，并且其中采用抗-人-TCR-生物素和抗-生物素微珠纯化TCR阴性靶向CD19 CAR-T细胞。
本发明的第三十个方面，提供一种靶向CD19通用型CAR-T细胞，所述细胞敲除了TCR和B2M基因，同时表达靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E基因，其中TCR基因优选包括TRAC和TRBC基因，B2M-HLA-E基因优选包括B2M-HLA-E-1和B2M-HLA-E-2基因。
本发明的第三十一个方面，提供根据第三十个方面所述的靶向CD19通用型CAR-T细胞在制备用于异体治疗的细胞的用途。
本发明的第三十二个方面，提供根据第三十个方面所述的靶向CD19通用型CAR-T细胞在制备用于治疗白血病的药物的用途，所述白血病优选包括急性淋巴白血病、慢性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
附图说明
图1：总体技术方案示意图。1.TRAC、B2M基因剪切(利用ZFN/TALEN/CRISPR-Cas9/megaTAL等基因编辑工具)。2.TRAC、B2M基因被剪切后发生断裂。3.靶向CD19 CAR、B2M-HLA-E融合基因同源重组修复模板同时导入(以腺相关病毒/非整合型慢病毒/单链DNA/双链DNA/质粒DNA等形式导入)。4.靶向CD19 CAR基因、B2M-HLA-E融合基因同源重组修复后分别插入TRAC、B2M基因位点，造成TRAC、B2M基因插入失活，使TCR蛋白被敲除、HLAI类蛋白无法和B2M蛋白形成异源二聚体而无法展示在细胞表面。
图2：靶向CD19 CAR基因敲入过程示意图。1.靶向CD19 CAR基因通过同源重组方式替换TRAC基因组外显子1中的5’端部分。2.插入的靶向CD19 CAR基因受TCR基因启动子调控转录和翻译成CAR蛋白展示在T细胞表面。
图3：B2M-HLA-E融合基因敲入过程示意图。1和3.B2M-HLA-E融合基因通过同源重组方式替换B2M基因组外显子1中的起始密码子ATG后的部分。2和4.插入的B2M-HLA-E融合基因。
图4：敲入靶向CD19 CAR基因结构示意图。
图5：B2M-HLA-E融合基因的两种形式示意图。
图6：pAAV-MCS质粒图谱。
图7：腺相关病毒滴度计算的标准曲线。
图8：靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因敲入T细胞的效率检测结果。
图9：通用型靶向CD19 CAR-T细胞培养过程示意图。
图10：两种通用型靶向CD19 CAR-T细胞体外扩增曲线。
图11：两种通用型靶向CD19 CAR-T细胞对靶细胞的杀伤检测。
图12：从人PBMC分离出的NK细胞流式检测图。
图13：NK细胞对两种通用型靶向CD19 CAR-T细胞的杀伤分析结果。
具体实施方式
定义
CAR-T：嵌合抗原受体T细胞。
免疫检验点抑制剂：目前肿瘤免疫治疗药物最主要方面，通过抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，调动自身免疫系统功能消除肿瘤。
ZFN：锌指核酸酶，由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成(一般3～4个)，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。ZFN是一种较早的基因编辑方法。
TALEN：转录激活因子样效应因子核酸酶，是一种新的基因编辑工具，原理是：通过DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合，然后在FokI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切，并借助于细胞内固有的同源定向修复(HDR)或非同源末端连接途径(NHEJ)修复过程完成特定序列的插入(或倒置)、删失及基因融合。
CRISPR：是一种细菌免疫系统，今年来被科学家改造为最热门的基因编辑工具。
本发明涉及一种制备通用型靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的方法，所述方法包括一：
步骤1)：从健康人血中提取PBMC并激活T细胞；
步骤2)：将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和B2M基因；
步骤3)：将靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因克隆至修复模板载体中以同时导入靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因同源重组修复模板；和
步骤4)：T细胞培养扩增，收集TCR或CD3阴性细胞。
或二：
步骤1)：从健康人血中提取PBMC并激活T细胞；
步骤2)：将靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因克隆至修复模板载体中以同时导入靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因同源重组修复模板；
步骤3)：将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC、B2M基因；和
步骤4)：T细胞培养扩增，收集TCR或CD3阴性细胞。
在步骤1)中，可选择分离纯化T淋巴细胞或者不分离T淋巴细胞。此外，可以采用如下方法激活T细胞：单独的抗CD3抗体包被、抗CD3抗体/抗CD28抗体包被、直接添加单独的抗CD3抗体、直接添加抗CD3抗体/抗CD28抗体、抗CD3抗体/抗CD28抗体磁珠激活。激活时间为2到3天。如果采用抗CD3抗体/抗CD28抗体磁珠激活，需去除磁珠。
在一些实施方案中，采用ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、megaTAL等基因编辑的方法剪切TRAC、B2M基因，优选CRISPR-Cas9。在一些实施方案中，CRISPR-Cas9基因编辑方法中的Cas9包括SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9、cpf1，优选SpCas9，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在一些实施方案中，其中SpCas9mRNA含有入核信号，所述入核信号优选SV40NLS和核质蛋白NLS，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas9基因编辑方法使用Cas9mRNA和修饰的sgRNA。在一些实施方案中，sgRNA修饰方式为：5’和3’端1-10个(诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)碱基进行(i)2’-O-甲基化修饰；(ii)2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰；或(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。在一些实施方案中，靶向TRAC基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:4所示，靶向B2M基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:5所示
将基因编辑物质递送至T细胞的方式包括质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、mRNA、RNA蛋白复合体等，其中质粒载体、mRNA、RNA蛋白复合体等方式需采用电穿孔、脂质体或者其它转染物质递送。
靶向CD19 CAR、B2M-HLA-E融合基因两端DNA序列与敲入的目的区域同源。修复模版载体包括：腺相关病毒、非整合型慢病毒、单链DNA、双链DNA、质粒DNA等，其中单链DNA、双链DNA、质粒DNA等修复模版载体需要与TRAC、B2M基因剪切同时完成，即将这些载体与基因编辑物质同时电穿孔。腺相关病毒、非整合型慢病毒需在TRAC、B2M基因剪切后2到5小时内完成，或者先感染腺相关病毒或非整合型慢病毒后48小时内进行TRAC、B2M基因剪切。在一些实施方案中，腺相关病毒载体的血清型包括：1、2、3、4、5、6、7、8、9、DJ，优选血清型6。在一些实施方案中，修复模版载体的核心序列从5’到3’端依次包括同源序列左臂、敲入基因、同源序列右臂。
在一些实施方案中，敲入的CAR基因包括以下元件的组合：剪切肽、靶向CD19 CAR、Poly A，其中剪切肽可以是T2A、P2A、IRES，Poly A结构包括BGHpA等结构。在一些实施方案中，靶向CD19 CAR包含信号肽、靶向CD19抗体scFv、铰链区、跨膜区、一个或两个共刺激信号区、传导信号区。
在一些实施方案中，靶向CD19 CAR的跨膜结构选自以下蛋白：CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。在一些实施方案中，靶向CD19 CAR的跨膜结构选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
在一些实施方案中，靶向CD19 CAR的铰链结构选自以下蛋白：IgG1、IgG4、IgD或CD8。在一些实施方案中，靶向CD19 CAR的铰链结构选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
在一些实施方案中，靶向CD19 CAR的共刺激信号选自以下蛋白：CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、CD137、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、CARD11、NKD2C、DAP10、LAT、SLP76或ZAP70。在一些实施方案中，靶向CD19 CAR的共刺激信号选自CD137，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。在一些实施方案中，靶向CD19 CAR的共刺激信号选自CD28，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。在一些实施方案中，靶向CD19CAR的共刺激信号选自CD28和CD137。
在一些实施方案中，靶向CD19 CAR的信号传导区选自CD3ζ，其氨基酸序列如SEQID NO:22所述。在一些实施方案中，靶向CD19 CAR信号肽选自CD8，其氨基酸序列如SEQ IDNO:23所示。
在一些实施方案中，敲入的B2M-HLA-E融合基因包括以下元件的组合：B2M信号DNA、HLA-E提呈的多肽DNA、接头、B2M DNA、接头、HLA-E。在一些实施方案中，敲入的B2M-HLA-E融合基因包括以下元件的组合：B2M信号DNA、B2M DNA、接头、HLA-E。其中HLA-E提呈的多肽序列为：VN2APRT N7N8L，N2为除了苏氨酸以外的氨基酸，N7为缬氨酸或亮氨酸、N8为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。不同种类的HLA-E包括：HLA-E*0101、HLA-E*0102、HLA-E*0103、HLA-E*0104。
在步骤4)中，培养采用1640培养基+10％胎牛血清或者其它专用于T细胞培养的无血清培养基，如X-VIVO-15。将其放于培养瓶、培养皿或者培养袋中培养，每隔1天换一次液，保证T细胞密度在1×106个/ml左右。在第10至第15天，利用磁珠分选方法收集TCR或者CD3阴性细胞。后续可再引入一个新的刺激，如辐照的CD19阳性细胞或CD19胞外结构域蛋白等，持续激活3天左右，再分装冻存。
在一些实施方案中，辐照K562-CD19细胞用于激活靶向CD19通用型CAR-T细胞。在一些实施方案中，全长的CD19蛋白或胞外区CD19蛋白用于激活靶向CD19通用型CAR-T细胞。
在一些实施方案中，采用抗-人-TCR-生物素和抗-生物素微珠纯化TCR阴性靶向CD19 CAR-T细胞。
本发明还涉及根据上述方法制备的靶向CD19通用型CAR-T细胞。
本发明还涉及一种靶向CD19通用型CAR-T细胞，所述细胞敲除了TCR和B2M基因，同时表达靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E基因。在一些实施方案中，TCR基因包括TRAC和TRBC基因，B2M-HLA-E基因包括B2M-HLA-E-1和B2M-HLA-E-2基因。
本发明还涉及靶向CD19通用型CAR-T细胞在制备用于异体治疗的药物的用途。
本发明还涉及靶向CD19通用型CAR-T细胞在制备用于治疗白血病的药物的用途。在一些实施方案中，白血病包括成人或儿童白血病。在一些实施方案中，白血病包括急性淋巴白血病、慢行淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤等。
本发明的有益技术效果在于：
1)排异反应小、杀伤靶细胞活力良好。本发明中制备的靶向CD19通用型CAR-T细胞可以克服同种异体T细胞排斥反应。本发明利用基因编辑技术将B2M基因在T细胞中敲除，而B2M蛋白与MHC I类分子可以形成异源二聚体，从而使MHC I类蛋白无法展示在T细胞表面，最终使敲除B2M基因的T细胞不被异体T细胞识别杀伤。此外，本发明中制备的靶向CD19通用型CAR-T细胞可以克服同种异体NK细胞排斥反应。NK细胞可以杀伤MHC I类蛋白缺失或者不表达在细胞表面的细胞。但为了不被同种异体T细胞杀伤，需要使MHC I类蛋白不表达在T细胞表面，而这会招致异体NK细胞的攻击。本发明采用了基因敲入技术将B2M-HLA-E融合基因敲入B2M基因位点，从而使HLA-E表达在细胞表面而其他I类HLA蛋白无法展示在细胞表面。另外，本发明中制备的靶向CD19通用型CAR-T细胞在克服排斥反应的同时保持了良好的杀伤靶细胞的活力。
2)产量高。本发明在很短的时间内(几个小时)将两个基因导入，同时敲除两个基因，并且细胞状态未受大的影响。特别地，本发明中单基因敲入效率超过50％，比慢病毒或逆转录病毒转导效率高，所以得到的有效细胞更多。此外，在第12天采用了辐照的K562-CD19细胞刺激，进一步提升了产量，比法国的Cellectis公司要高出不少。
3)安全性更高。本发明采用基因敲入的方式，可以精确插入目的区域，保证制备的通用型CAR-T细胞没有癌变的风险。相比于目前大部分公司所用的随机插入方式，精确敲入的方式更加安全、更加高效。此外，制备的靶向CD19通用CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞更加温和，产生的细胞因子更少，在临床上应用也将更安全。
4)即时可用。本发明中制备的靶向CD19通用型CAR-T细胞是以健康人血为原料，通过规模化生产将其摆在“货架上”，可供病情紧急病人使用，不需要漫长的定制时间。
5)适用范围广。存在约10％的白血病患者，其体内的T细胞并不适合做为CAR-T细胞的原料，而本发明中制备的靶向CD19通用型CAR-T取自健康人血，可供病人无限制使用。
以下以实施例的方式描述本发明的某些具体实施方式，但是这些实施例仅用于说明目的，而不是用于限制本发明的范围。
实施例
实施例1：PBMC提取
招募健康志愿者甲(不便透露信息)，无感冒发烧症状。由专业医务人员在人肘正中静脉处取血100ml到BD抗凝血管。采完血后，血液与等量的PBS缓冲液(含2％的胎牛血清)混合。取PBMC分离管Sepmate-50，小心加入15ml的Ficoll缓冲液，再加入血液PBS的混合液，每管小心加入30ml左右。1200g离心10分钟后迅速将上清倒入新50ml管中，200g离心8分钟，弃上清，加入10ml PBS缓冲液重悬沉淀，再弃上清后加20ml PBS缓冲液重悬，离心弃上清后加入10ml上清PBS缓冲液重悬所有沉淀。对重悬细胞计数，取10μl混悬液加入10μl 0.1％的台盼蓝混匀，上机计细胞数和存活率，结果显示于表1中。
表1：
PBMC细胞密度 3.99×10<sup>6</sup>个/ml
细胞活率 93％
实施例2：T细胞激活
取实施例1中的PBMC细胞2.5ml，200g离心5分钟后，去除上清，用6ml X-VIVO-15培养基重悬。抗-CD3/抗-CD28抗体磁珠(Life Technology)用PBS缓冲液(含2mM的EDTA和1％的胎牛血清)重悬后，加入磁极中静置2分钟后小心弃去上清。重复4次上述过程。取洗后磁珠，将6×106个磁珠加入PBMC细胞中，混匀，放入37度培养箱培养3天。3天后取出磁珠，首先将T细胞用移液枪重悬多次。将细胞悬液置于磁极中，静置两分钟后，弃去管壁上的磁珠。重新计数，计数结果显示于表2中。
表2：
细胞密度 1.88×10<sup>6</sup>个/ml
细胞活率 88％
实施例3：腺相关病毒包装
(1)腺相关病毒载体构建：
本发明中靶向CD19 CAR基因敲入TRAC基因位点采用了CRISPR-Cas9技术结合腺相关病毒载体转导的方法。首先用CRISPR-Cas9对TRAC基因位点产生一个切口，进而利用腺相关病毒递送的CAR基因模版对缺口进行同源重组修复，最终将CAR基因敲入目的位点。
本发明中B2M-HLA-E融合基因敲入B2M基因位点采用了CRISPR-Cas9技术结合腺相关病毒载体转导的方法。首先用CRISPR-Cas9对B2M上基因位点产生一个切口，进而利用腺相关病毒递送的B2M-HLA-E融合基因模版对缺口进行同源重组修复，最终将B2M-HLA-E基因敲入目的位点。受B2M基因启动子调控转录和翻译成异源二聚体形式展示在T细胞表面。
该腺相关病毒载体包含了两个部分：
a.左右同源臂。
靶向CD19 CAR敲入TRAC位点部分：左右同源臂用于识别目的DNA，并进行重组交换，为了使敲入基因能正确表达，将敲入的靶向CD19 CAR基因“登陆”到TRAC基因外显子1的5’端区域，具体示意图见图2。根据碱基序列的长短，分别设计了以下几对同源臂：
左右分别为1170bp的同源臂，左臂序列如SEQ ID NO:6，右臂序列如SEQ ID NO:7；左右分别为600bp的同源臂，左臂序列如SEQ ID NO:8，右臂序列如SEQ ID NO:9；左右分别为300bp的同源臂，左臂序列如SEQ ID NO:10，右臂序列如SEQ ID NO:11。
B2M-HLA-E融合基因敲入B2M基因位点部分：左右同源臂用于识别目的DNA，并进行重组交换，为了使敲入基因能正确表达，将敲入基因“登陆”到B2M基因起始密码子区，使敲入基因从ATG开始替换B2M基因的ATG，具体示意图见图3。根据碱基序列的长短，分别设计了以下几对同源臂：
左右分别为1200bp的同源臂，左臂序列如SEQ ID NO:12，右臂序列如SEQ ID NO:13；左右分别为600bp的同源臂，左臂序列如SEQ ID NO:14，右臂序列如SEQ ID NO:15；左右分别为300bp的同源臂，左臂序列如SEQ ID NO:16，右臂序列如SEQ ID NO:17。
b.敲入的基因。
敲入靶向CD19 CAR基因依次融合了剪切肽P2A DNA、靶向CD19scFv DNA、CD8铰链区DNA、CD8跨膜区DNA、CD137共刺激信号区DNA、CD3ζ信号传导区DNA和BGHpA DNA，如图4所示。具体序列如下：P2A DNA序列如SEQ ID NO:27；靶向CD19scFv序列如SEQ ID NO:24；CD8铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO:19；CD8跨膜区氨基酸序列如SEQ ID NO:18；CD137共刺激信号区氨基酸序列如SEQ ID NO:20；CD3ζ信号传导区氨基酸序列如SEQ ID NO:22；BGHpADNA序列如SEQ ID NO:29。
敲入B2M-HLA-E融合基因共有两种形式，如图5所示。第一种形式B2M-HLA-E-1将B2M基因信号区DNA、HLA-G信号肽DNA、接头DNA、B2M基因、接头DNA、HLA-E基因依次融合，第二种形式B2M-HLA-E-2是将B2M基因、接头DNA、HLA-E基因依次融合。其中B2M基因信号区DNA如SEQ ID NO:31；HLA-G信号肽序列如SEQ ID NO:33；B2M基因序列如SEQ ID NO:32；HLA-E基因选自HLA-E*0103，其氨基酸序列如SEQ ID NO:34，另外，为了避免CRISPR-Cas9对T细胞B2M基因组位点和敲入基因HLA-E-B2M同时进行剪切，对敲入基因的B2M序列区进行了突变改造，使sgRNA无法识别突变的B2M-HLA-E融合基因。具体序列分别如下：B2M-HLA-E-1如SEQID NO:35；B2M-HLA-E-2如SEQ ID NO:36。
在合成重组臂和敲入基因DNA序列后，将其克隆至腺相关病毒载体中，腺相关病毒载体采用pAAV-MCS质粒，使用时将ITR中间的碱基全部用Not1酶切删除，重组臂和敲入基因连接克隆至pAAV载体两个ITR序列中间，pAAV-MCS质粒图谱见图6。
(2)腺相关病毒包装、纯化和滴度测定
包装：293T细胞在转染前一天在225cm2培养皿中长满，按1:3传代，每个培养皿培养基为40ml，每个腺相关病毒包装5个225cm2培养皿。转染按照Lipo3000的厂家步骤进行，先配制转染体系(针对1个225cm2培养皿)，转染体系显示于表3中。
表3：
混匀体系1和2，静置5分钟后将二者混匀，再静置10分钟。小心加入293T细胞中。6小时后换新鲜培养基。72小时后分别收取培养基和细胞。
纯化：首先用高速离心机将培养基用50000g离心2小时，离心后去除培养基上清，加入1ml PBS重悬所有病毒沉淀，放置于4度冰箱备用。然后将收取的细胞用10ml PBS重悬，反复在液氮和37度水浴锅冻融4次，加入上清病毒后，2000rpm 4度离心30分钟去除细胞碎片。取上清，加入全能核酸酶后37度处理30分钟。按一定的比例配制不同浓度的碘克沙醇，分别为：60％、40％、25％、15％。取一13.2ml PP超速离心管，逐层加入60％层2ml、40％层2ml、25％层2ml、15％层2ml，最后小心加入样品3ml。250000g超速离心3小时，离心完毕后，用注射器在40％和60％交界层吸取2ml，然后加入PBS 18ml稀释并用0.45um滤器过滤，去除污染。最后将过滤的病毒用100KDa超滤管离心，弃掉离下的液体，重新加入PBS进行离心，最后得到约0.5ml的病毒量。
滴度测定：0.5ul病毒液检测(稀释40倍)，第一步先用DNA酶消化，体系如表4。
表4：
病毒液 0.5μl
去离子水 16.5μl
10X DNase缓冲液 2μl
DNase 1μl
混匀后放置于37度水浴锅反应10分钟，再在75度水浴锅放置10分钟终止反应。第二步用蛋白酶K消化腺相关病毒外壳(进一步稀释5倍)，配制表5反应体系。
表5：
第一步反应 20μl
去离子水 79μl
蛋白酶K 1μl
混匀后放置于55度水浴锅反应30分钟，再在95度水浴锅放置10分钟终止反应。第三步，配制荧光定量PCR反应体系，如表6。
表6：
混用后放置在荧光定量PCR仪上(IT-TS)，进行表7反应。
表7：
反应结束后得到Ct值，如表8。
表8：
样品名称 Ct值
标准品10<sup>8</sup> 7.26
标准品10<sup>7</sup> 15.49
标准品10<sup>6</sup> 22.51
标准品10<sup>5</sup> 26.32
B2M-HLA-E打靶载体1腺相关病毒 7.47
B2M-HLA-E打靶载体2腺相关病毒 7.53
抗-CD19 CAR打靶载体腺相关病毒 7.82
最后根据Ct值结果计算腺相关病毒滴度，先用标准品制作散点图，如图7所示。
根据公式得出：
B2M-HLA-E打靶载体1腺相关病毒滴度为：1×108.085vg/μl
B2M-HLA-E打靶载体2腺相关病毒滴度为：1×108.086vg/μl
靶向CD19 CAR打靶载体腺相关病毒滴度为：1×108.032vg/μl
加上DNase消化和蛋白酶K反应时总稀释的200倍，最终的滴度为：
B2M-HLA-E打靶载体1腺相关病毒：2.432×1013vg/ml
B2M-HLA-E打靶载体2腺相关病毒：2.381×1013vg/ml
靶向CD19 CAR打靶载体腺相关病毒：2.151×1013vg/ml
实施例4：基因敲入
T细胞用抗-CD3/抗-CD28抗体磁珠激活三天后，将磁珠去除，并对细胞进行计数，得到细胞密度为：1.88×106个/ml，存活率88％，共约5ml细胞体积，取其中3ml细胞悬液置于离心管中进行离心，转速为200g，5分钟。离心后完全去除培养基，并用Lonza电穿孔缓冲液进行重悬，然后加入SpCas9mRNA 5μg和设计合成的针对TRAC和B2M基因的sgRNA各1μg至T细胞悬液，混匀后加入电转杯中并用LONZA 4D电穿孔仪中的E0-115程序电击，完成后放置于37度培养箱5分钟，后加入5ml预热的细胞培养基中。
针对TRAC基因sgRNA序列如SEQ ID NO:4；其中针对B2M基因sgRNA序列如SEQ IDNO:5。
以上两种sgRNA 5’和3’端各三个碱基同时进行2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰，该修饰sgRNA由Sythego公司合成。
电穿孔后2小时，将5ml电击的T细胞分成三份。其中1ml做一个基因敲入，敲入靶向CD19 CAR，加入靶向CD19 CAR修复模版腺相关病毒1×1012VG，使MOI值为106；另外2个2ml细胞做两个基因敲入，其中一个敲入靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E-1；另一个敲入靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E-2，这两个敲入孔分别加入相关腺相关病毒2×1012VG，使MOI值为106。16小时后将感染腺相关病毒的三种细胞200g离心5分钟，完全去除培养基和病毒后加入新的培养基重悬，37度继续培养。
实施例5：靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因敲入T细胞效率测定
腺相关病毒感染后继续培养3天，其中第二天给细胞换液并调整至密度为1×106个/ml。取2×105个相应细胞做流式细胞分析，具体步骤为：取相应细胞加入1.5ml离心管中，用PBS+1％胎牛血清缓冲液洗2遍，完全弃去上清，加入100μl缓冲液重悬细胞后加入FITC-抗-小鼠-Fab、PerCP-Cy5.5-抗-人-CD3、APC-抗-人-HLA-ABC、PE-抗-人-HLA-E抗体各2μl，混匀后室温避光静置15分钟，加入缓冲液洗2遍后上机检测，结果如图8所示。
可以看出靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E基因敲入效率都超过50％；敲入的HLA-E蛋白表达阳性时，超过70％细胞是HLA-ABC蛋白阴性，说明B2M-HLA-E基因确实敲入到了B2M基因位点，敲入的同时导致B2M基因编码破坏，且敲入的纯合子细胞超过70％。
以往CAR基因的导入利用的是慢病毒或者逆转录病毒，转导的效率通常在10％至50％之间，而本专利采用的敲入方法效率可以稳定在50％以上。且采用慢病毒或逆转录病毒方法容易造成导入基因的随机插入而增加细胞癌变的风险，而本专利采用的定点敲入手段不存在这个问题。
以往在T细胞大片段的基因敲入是很难实现的，而本专利采用的敲入方法实现了超过50％的效率。
实施例6：靶向CD19通用型CAR-T细胞培养扩增
靶向CD19通用型CAR-T细胞培养分为几个阶段，具体如图9所示。
靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E基因敲入后，细胞密度调整成1×106个/ml，隔天换液，培养基为X-VIVO-15(添加10ng/ml的重组白介素2)，在TCR阴性细胞分选后一天加入辐照的K562-CD19细胞(加入的细胞数为CAR-T细胞的1/2)，激活培养至第16天后分装冻存。分别在第4、7、10、12、14、16天计数，得到扩增曲线如图10。可以看出靶向CD19通用型CAR-T细胞在辐照的K562-CD19细胞刺激后，细胞扩增速度明显高于未刺激组，而未刺激细胞由于TRAC和B2M基因的敲除导致细胞扩增速度缓慢。
实施例7：TCR阴性靶向CD19 CAR-T细胞分选
靶向CD19 CAR-T细胞在培养至10天后进行TCR阴性细胞富集。首先取5×107个细胞200g离心5分钟。用PBS缓冲液(含2mM的EDTA和1％胎牛血清)洗涤两遍后加入500μl PBS缓冲液重悬，然后加入50μl的抗-人-TCR-生物素抗体，4℃避光孵育10分钟。用PBS缓冲液洗涤一遍后加入500μl PBS缓冲液重悬，再加入100μl抗-生物素微珠，放4℃避光15分钟。PBS缓冲液洗涤一遍后用500μl的PBS缓冲液重悬。LD柱放置于磁极中用2ml的PBS缓冲液润洗1遍后，加入500μl的细胞悬液，目的细胞从LD柱底下流出收集，待细胞悬液流完后反复2次加入2ml PBS缓冲液于LD柱上。接收的细胞悬液300g离心5分钟。重悬于预热的培养基中。
实施例8：通用型靶向CD19 CAR-T细胞体外对肿瘤细胞的杀伤实验
首先将T细胞、靶向CD19 CAR-T细胞及通用型靶向CD19 CAR-T细胞与Raji细胞按照5:1混合，其中T细胞数量为2.5×105个/孔，Raji细胞数量为5×104个/孔，每个样品做两个副孔，体积为180μl/孔，在培养基1640+1％胎牛血清中37℃孵育8小时。在检测信号前，加入10×裂解缓冲液20μl至Raji细胞最大释放孔，200g离心5分钟，吸取50μl培养基加入96孔板中，再加入50μl/孔的LDH底物，室温反应20分钟后，酶标仪检测492nm波长激发光信号，结果表9所示。
表9：
*Anti-CD19 CAR-T-1为靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E-1基因同时敲入T细胞组；Anti-CD19CAR-T-2为靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E-2基因同时敲入T细胞组。
根据LDH试剂盒说明书指示，％细胞毒性的计算公式为：
分析结果如图11。图11结果显示TCR阴性的通用型靶向CD19 CAR-T细胞可以特异性杀伤靶细胞，且两种B2M-HLA-E融合基因敲入后对靶细胞杀伤影响不大。
实施例9：同种异体NK细胞对通用型靶向CD19 CAR-T细胞排异反应的体外分析
(1)NK细胞提取
取志愿者乙血液100ml，并提取PBMC，此步骤与实施例1一致，提取PBMC共10ml，重悬于PBS+2％胎牛血清缓冲液中，取少量细胞悬液进行细胞计数，测得细胞密度为：5.7×106个/ml，存活率为94.5％。取5×107个PBMC细胞用PBS缓冲液(含2mM的EDTA和1％胎牛血清)洗涤两遍。加入200μl PBS缓冲液重悬5×107个PBMC细胞，然后加入50μl NK细胞生物素-抗体混合物，4℃孵育5分钟，加入PBS缓冲液150μl后再加入100μl NK细胞微珠混合物，放于4℃冰箱孵育10分钟。PBS缓冲液洗涤一遍后用500μl的缓冲液重悬。LS柱放置于磁极中用2ml的PBS缓冲液润洗1遍后，加入500μl的细胞悬液，目的细胞从LS柱底下流出收集，待细胞悬液流完后反复2次加入1ml PBS缓冲液于LS柱上，其中细胞密度为2.6×106个/ml，200g进行离心5分钟，之后去除上清并重悬于预热的X-VIVO-15培养基中。
(2)流式细胞技术鉴定提取的NK细胞。
取1×105个NK细胞做流式细胞分析，具体步骤为：取NK细胞加入1.5ml离心管中，用PBS+1％胎牛血清缓冲液洗2遍，完全弃去上清，加入100μl缓冲液重悬细胞后加入PerCP-Cy5.5-抗-人-CD3和FITC-抗-人-CD56抗体各2μl，混匀后室温避光静置15分钟，加入缓冲液洗2遍后上机检测，结果如图12所示，从细胞表面表达的CD3和CD56蛋白看，本次纯化的NK细胞是比较纯的。
(3)LDH实验检测NK细胞对通用型靶向CD19 CAR-T细胞的杀伤
将4×104个靶细胞铺于96孔板中(100μl体积)，铺4×104个效应细胞(100μl体积)，另做一组空培养基孔，一组效应细胞自发LDH释放孔，一组靶细胞自发LDH释放对照孔，一组靶细胞最大释放孔。于37度培养箱孵育48小时。在离心前45分钟，向靶细胞最大LDH释放对照孔加入裂解液(10×)。250g离心5分钟，取50μl上清于96孔分析板中，用检测缓冲液配制底物,把配好的底物50μl/孔加到96孔板中，盖好平板，室温孵育30分钟，避光，向每孔中加入50μl终止液，在492nm波长记录吸光值，结果如表10。
表10：
*Anti-CD19 CAR-T B2M-KO为靶向CD19 CAR敲入同时敲除B2M基因的T细胞；Anti-CD19CAR-T-1为靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E-1基因同时敲入T细胞组；Anti-CD19 CAR-T-2为靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E-2基因同时敲入T细胞组。
根据LDH实验的计算公式，分析本次结果，如图13所示，可以看出NK细胞具有很强的杀伤B2M基因敲除CAR-T细胞能力，这是因为在B2M基因敲除后，HLA-ABC及其他一类HLA蛋白无法展示在CAR-T细胞表面，从而被NK细胞识别并杀伤。本专利技术采用基因敲入的方式使B2M-HLA-E基因敲入B2M基因位点，既破坏了B2M基因又保留了HLA-E在细胞内的表达，从而避免敲除B2M基因时，目的细胞被NK杀伤，从图13可以看出NK细胞杀伤靶向CD19 CAR-T-1和靶向CD19 CAR-T-2细胞(1和2代表两种方式的B2M-HLA-E基因敲入)，明显低于B2M基因敲除的靶向CD19 CAR-T细胞，说明了B2M-HLA-E基因敲入B2M位点可以抑制NK细胞的攻击。
有研究单位直接采用HLA-E基因随机导入并B2M基因敲除的方式来规避异体T和NK细胞攻击，然而当把B2M基因敲除后，外源的HLA-E基因无法长时间表达在目的细胞表面，最后还是会被NK细胞攻击，我们采用B2M-HLA-E融合基因，外源的HLA-E基因和融合的B2M基因直接形成异源二聚体，不依赖内源的B2M基因来形成异源二聚体，可以避免敲除内源B2M基因后，目的细胞被NK细胞攻击。

Claims (32)

1.一种制备靶向CD19抗原嵌合受体T细胞的方法，所述方法包括将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和B2M基因；和
将靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因克隆至修复模板载体中以同时向T细胞导入靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E融合基因同源重组修复模板。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：
从健康受试者血中提取PBMC并激活T细胞；和/或
T细胞培养扩增，收集TCR或CD3阴性细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑物质包括ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、megaTAL，优选CRISPR-Cas9，其中Cas9包括SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9、cpf1，优选SpCas9，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其中SpCas9 mRNA含有入核信号，所述入核信号优选SV40 NLS和核质蛋白NLS，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
4.根据权利要求1所述的方法，其中将所述基因编辑物质递送至T细胞的方式包括质粒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、mRNA或RNA蛋白复合体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中mRNA递送方式使用SpCas9 mRNA和修饰的sgRNA。
6.根据权利要求5所述的方法，其中sgRNA修饰方式为：5’和3’端1-10个碱基进行(i)2’-O-甲基化修饰；(ii)2’-O-甲基化和3’硫代磷酸化修饰；或(iii)能够稳定sgRNA的其它修饰。
7.根据权利要求5所述的方法，其中靶向TRAC基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:4所示，靶向B2M基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:5所示。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述修复模版载体包括腺相关病毒、非整合型慢病毒、单链DNA、双链DNA、质粒DNA，优选腺相关病毒载体，其中腺相关病毒载体的血清型包括：1、2、3、4、5、6、7、8、9、DJ，优选血清型6，所述修复模版载体的核心序列从5’到3’端依次包括同源序列左臂、敲入基因、同源序列右臂。
9.根据权利要求8所述方法，其中靶向CD19 CAR基因修复模版同源臂的长度为300-1200bp，和/或B2M-HLA-E融合基因同源臂的长度为300-1200bp。
10.根据权利要求1和8所述的方法，其中敲入的基因包括以下元件或其组合：剪切肽、靶向CD19 CAR、Poly A，其中剪切肽优选是T2A、P2A、IRES，Poly A优选包括BGHpA，靶向CD19CAR优选包含信号肽、靶向CD19抗体scFv、铰链区、跨膜区、一个或两个共刺激信号区、信号传导区。
11.根据权利要求10所述的方法，其中靶向CD19 CAR的跨膜结构选自以下蛋白：CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154和PD1。
12.根据权利要求10所述的方法，其中靶向CD19 CAR的跨膜结构选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示。
13.根据权利要求10所述的方法，其中靶向CD19 CAR的铰链结构选自以下蛋白：IgG1、IgG4、IgD或CD8。
14.根据权利要求13所述的方法，其中靶向CD19 CAR的铰链结构选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
15.根据权利要求10所述的方法，其中靶向CD19 CAR的共刺激信号选自以下蛋白：CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、CD137、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、CARD11、NKD2C、DAP10、LAT、SLP76或ZAP70。
16.根据权利要求15所述的方法，其中靶向CD19 CAR的共刺激信号选自CD137，其氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
17.根据权利要求15所述的方法，其中靶向CD19 CAR的共刺激信号选自CD28，其氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。
18.根据权利要求15所述的方法，其中靶向CD19 CAR的共刺激信号选自CD28和CD137。
19.根据权利要求10所述的方法，其中靶向CD19 CAR的信号传导区选自CD3ζ，其氨基酸序列如SEQ ID NO:22所述。
20.根据权利要求10所述的方法，其中靶向CD19 CAR信号肽选自CD8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。
21.根据权利要求10所述的方法，其中靶向CD19 CAR的抗体scFv序列如SEQ ID NO:24所示，靶向CD19 CAR序列优选SEQ ID NO:25，T2A DNA序列如SEQ ID NO:26所示，P2A DNA序列如SEQ ID NO:27所示，IRES DNA序列如SEQ ID NO:28所示，BGHpA DNA序列如SEQ ID NO:29所示，敲入的基因序列优选SEQ ID NO:30。
22.根据权利要求1所述的方法，其中敲入的B2M-HLA-E融合基因第一种形式B2M-HLA-E-1包括以下元件的组合：B2M信号区DNA、提呈的多肽DNA、接头DNA、B2M基因、接头DNA、HLA-E基因；或B2M-HLA-E融合基因第二种形式B2M-HLA-E-2包括以下元件的组合：B2M信号区DNA、B2M基因、接头DNA、HLA-E基因。
23.根据权利要求22所述方法，其中B2M信号区DNA序列如SEQ ID NO:31所示，B2M DNA序列如SEQ ID NO:32所示。
24.根据权利要求22所述方法，其中提呈的多肽序列为：VN2APRTN7N8L，N2为除了苏氨酸以外的氨基酸，N7为缬氨酸或亮氨酸、N8为缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
25.根据权利要求22所述方法，其中提呈的多肽序列为SEQ ID NO:33。
26.根据权利要求22所述，其中HLA-E基因包括如下形式：HLA-E*0101、HLA-E*0102、HLA-E*0103、HLA-E*0104。
27.根据权利要求26所述，其中HLA-E基因为HLA-E*0103，其氨基酸序列为SEQ ID NO:34。
28.根据权利要求22所述，其中B2M-HLA-E融合基因第一种形式B2M-HLA-E-1的DNA序列如SEQ ID NO:35所示，第二种形式B2M-HLA-E-2的DNA序列如SEQ ID NO:36所示。
29.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤4)中将辐照K562-CD19细胞或全长的CD19蛋白或胞外区CD19蛋白用于激活靶向CD19通用型CAR-T细胞，并且其中采用抗-人-TCR-生物素和抗-生物素微珠纯化TCR阴性靶向CD19 CAR-T细胞。
30.一种靶向CD19通用型CAR-T细胞，所述细胞敲除了TCR和B2M基因，同时表达靶向CD19 CAR和B2M-HLA-E基因，其中TCR基因优选包括TRAC和TRBC基因，B2M-HLA-E基因优选包括B2M-HLA-E-1和B2M-HLA-E-2基因。
31.根据权利要求30所述的靶向CD19通用型CAR-T细胞在制备用于异体治疗的细胞的用途。
32.根据权利要求30所述的靶向CD19通用型CAR-T细胞在制备用于治疗白血病的药物的用途，所述白血病优选包括急性淋巴白血病、慢性淋巴白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤。
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