WO2019237388A1 - 用于敲除人BTDC基因的gRNA序列及其应用 - Google Patents

用于敲除人BTDC基因的gRNA序列及其应用 Download PDF

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease

Definitions

  • the invention belongs to the technical field of genetic engineering and gene editing, and particularly relates to a gRNA sequence for knocking out a human BTDC gene and an application thereof.
  • the genomic DNA of the cells collected in Example 2 was extracted, and then sequencing primers were designed based on the sequence of human BTDC DNA 558-703 bp position to sequence the genomic DNA at the target position.

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Abstract

提供了一种用于敲除人细胞BTDC基因的gRNA序列。在细胞中该gRNA能够特异结合于人BTDC DNA正义链第605-624bp，并与Cas9形成复合物，对BTDC基因核酸序列进行特异切割，利用细胞非重组末端连接修复机制，造成BTDC基因移码突变，进而获得BTDC基因敲除细胞。

Description

用于敲除人BTDC基因的gRNA序列及其应用 技术领域
本发明属于基因工程和基因编辑技术领域，尤其涉及一种用于敲除人BTDC基因的gRNA序列及其应用。
 背景技术
非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是当前世界的常见恶性肿瘤，其发病率有逐年增加的趋势。研究NSCLC肿瘤复发因素及肿瘤免疫逃逸机制，具有重要的理论意义和临床应用价值。T淋巴细胞是介导肿瘤免疫应答的重要效应细胞，T细胞活化需要TCR介导的抗原特异性信号和共刺激分子介导的共刺激信号。
 技术问题
BTDC/B7-H1是B7家族中一个负性T细胞共刺激分子，BTDC通过与其受体PD-1结合，抑制CD4和CD8T细胞的增殖和活化，负性调控机体免疫应答过程，从而介导肿瘤免疫逃逸，促进肿瘤生长，因此对BTDC在肿瘤逃逸中作用的研究对于肿瘤的防治具有重要的作用，但现有技术中缺乏敲除BTDC基因表达的手段，对相关研究的进展造成了一定的阻碍。
规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）是一系列成簇排列的DNA 序列，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。Cas基因编码的蛋白包含核酸酶、聚合酶、解旋酶以及与核糖核酸结合的结构域。
CRISPR转录出的RNA与Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物协同行使CRISPR/Cas系统的免疫功能，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA（guide RNA）。当入侵的病毒DNA 和gRNA 序列一致时，复合物中的Cas蛋白就能够切割入侵的病毒DNA，达到防御的目的。因此，只需针对需要编辑的DNA 序列合成一段导向RNA的DNA序列，在转入宿主细胞后，产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白精准地切割宿主细胞特定的DNA 序列，从而起到基因编辑的作用。
 技术解决方案
本发明的目的在于克服现有技术中的存在的缺陷，提供一种敲除人BTDC基因的gRNA序列，并构建相应基因敲除载体px458-BTDC，为后续研究人BTDC基因功能奠定基础。
其具体技术方案为：
一种敲除人细胞BTDC基因的gRNA序列及其应用，包括以下步骤：
（1）人工合成所述靶DNA序列及其互补链，退火后将核酸片段重组至px458质粒中获得px458-BTDC重组质粒，转化大肠杆菌NEBStable，氨苄青霉素筛选培养并挑单克隆菌株，测序鉴定；
（2）大量培养测序正确的大肠杆菌，无内毒素提取px458-BTDC重组质粒；
（3）将转染细胞培养基换为无血清培养基，将px458-BTDC重组质粒用Opti-MEM培养基和PEI配制成转染混合液，加入到转染细胞培养基中，5 h后换液；转染细胞培养基替换为血清培养基继续培养48 h后，即得敲除BTDC基因的转染细胞。
 有益效果
本发明提供的敲除人BTDC基因的gRNA序列及其应用，可在BTDC相关的药物研究和开发中将起重要作用。
 附图说明
图1 为px458载体的质粒图谱；
图2 为对照组和实验组K562细胞的BTDC蛋白的Western Blot检测结果图。
 本发明的实施方式
下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。
大肠杆菌NEBStable和T4 DNA连接酶购自NEB，px458质粒购自Addgene，Bbs I内切酶购自Fermentas，PEI购自四川贝思特，Opti-MEM培养基购自Invitrogen，无内毒素质粒提取试剂盒Endo-Free Plasmid Mini Kit 购自Omega bio-tek公司。
实施例一 px458-BTDC 质粒构建
合成核苷酸序列5’- CACCCACAAACAGATGTCAGTCAT -3’，及其反向互补序列5’- AAACATGACTGACATCTGTTTGTG -3’。将两种核苷酸序列各自用去离子菌水配成100 μmol/l，置600 ml 沸水，自然室温冷却退火，形成双链gRNA序列。
Bbs I双酶切px458 质粒，回收后将其与所述gRNA序列按1:5混合后，T4 DNA连接酶16℃连接过夜。转化大肠杆菌NEBStable，氨苄青霉素筛选培养并挑单克隆菌株，测序鉴定。
实施例二 K562 细胞转导
用含100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃大量培养测序正确的大肠杆菌，无内毒素提取px458-BTDC重组质粒。
转染前一天将K562细胞接种至六孔板，接种密度50%。转导：取1 μg px458-BTDC重组质粒和3 μl PEI（1 μg/μl）溶于100 μl Opti-MEM培养基，涡旋混匀。将六孔板内培养基换成无血清培养基，每孔2 ml，每孔600 μl加入转染混合液，5 h换成37℃预热有10% 胎牛血清的DMEM培养基。置37℃ 5% CO2，90% 湿度培养48 h，收集细胞。
实施例三   细胞 BTDC 突变鉴定
提取实施例二中收集细胞的基因组DNA，然后根据人BTDC DNA 558-703 bp位置的序列设计测序引物对基因组DNA进行测序，在靶点位置。
实施例四   细胞 BTDC 蛋白表达的检测
以未经任何处理的K562细胞作为对照组，实施例二中收集的K562细胞为实验组，分别加入100-200 μl 5 × SDS-PAGE上样缓冲液，沸水煮5 min，取15 μl 上样SDS-PAGE 蛋白电泳。电泳完毕后，按照常规蛋白半干转，10%脱脂奶粉封闭2 h，将封闭后的PVDF膜置于小鼠抗人BTDC 抗体，缓冲液为10%脱脂奶粉，冰上孵育过夜，然后用漂洗缓冲液漂洗四次，每次5 分钟，再将膜转移至0.05M PBS、PH 7.2、0.2% Tween-20、1:50000稀释兔抗小鼠二抗缓冲液，室温孵育60 min，再用漂洗缓冲漂洗四次，每次5min。漂洗完毕后将蛋白印迹膜用ECL显影检测，结果如图2所示。可以看到，BTDC移码基因突变K562细胞中Western Blot检测不到BTDC蛋白条带，而对照组则有BTDC蛋白条带出现，说明所述用于敲除人细胞BTDC基因的gRNA序列可以实现BTDC基因的敲除。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
 工业实用性
本发明提供的敲除人BTDC基因的gRNA序列及其应用，可在BTDC相关的药物研究和开发中将起重要作用。

Claims (3)

  1. 一种用于敲除人细胞BTDC基因的CRISPR/Cas9 guide RNA的靶DNA序列，所述序列为5’- CACAAACAGATGTCAGTCAT -3’。
  2. 一种采用权利要求1 所述DNA 序列敲除人细胞BTDC基因的方法，具体步骤如下：
    （1）人工合成所述靶DNA序列及其互补链，退火后将核酸片段重组至px458质粒中获得px458-BTDC重组质粒，转化大肠杆菌NEBStable，氨苄青霉素筛选培养并挑单克隆菌株，测序鉴定；
    （2）大量培养测序正确的大肠杆菌，无内毒素提取px458-BTDC重组质粒；
    （3）将转染细胞培养基换为无血清培养基，将px458-BTDC重组质粒用Opti-MEM培养基和PEI配制成转染混合液，加入到转染细胞培养基中，5 h后换液；转染细胞培养基替换为血清培养基继续培养48 h后，即得敲除BTDC基因的转染细胞。
  3. 权利要求1 所述DNA 序列在敲除BTDC基因中的应用。
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