CN103124787A - 制造病毒载体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供制造病毒载体的方法，包括在含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制物质作为活性成分的培养基中培养能够制造所述病毒载体的细胞的步骤；以及用于制造病毒载体的培养基，其特征在于含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制物质作为活性成分。

Description

制造病毒载体的方法

技术领域

本发明涉及制造病毒载体的方法和用于制造病毒载体的培养基。

 

发明背景

已经开发了使用病毒载体的基因疗法用于治疗癌症和传染病以及先天的遗传性疾病，并已进行了许多临床试验。特别地，对于使用反转录病毒载体或腺病毒载体的基因疗法已经进行了许多尝试。

用于制造重组反转录病毒载体（其用于整合所需基因）的转移载体的实例包括衍生自野生莫洛尼鼠白血病病毒（MoMLV）的pLXSN（Genbank Accession M28248）和pMFG，其中从该基因组中取出病毒粒子结构蛋白基因（gag、pol、env）。此外，进一步改性的载体用于人类临床试验。

重组反转录病毒载体通过以下方法制造：用DNA载体转染包装细胞（Psi-Crip、GP+E86、GP+envAm12、PG13等等），其中插入所需基因以诱发病毒生产细胞，培养该病毒生产细胞，并随后收获含有所需病毒载体的上清液。随后，包装细胞可以用上清液再次感染，并且可以从感染的细胞中选择能够稳定制造用于表达所需基因的反转录病毒载体的生产细胞的克隆。通过此类方法，制备主细胞库（MCB）并随后制备工作细胞库，并由此稳定地制造用于基因疗法的重组反转录病毒载体。

反转录病毒生产细胞的培养对提高由反转录病毒生产细胞制得的病毒的效价是非常重要的。换句话说，需要检查达到更高的病毒效价的培养条件。目前已知的提高病毒效价的方法包括多重感染（例如非专利文献1），或添加丁酸钠或曲古霉素A（其为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂）（例如非专利文献2和3）。但是，这些已知方法不能产生显著的效果。

 

引文列表

非专利文献

非专利文献1：J. Hum. Gene Ther., 第6卷, 第1195-1202页（1995）

非专利文献2：-Gene Therapy, 第3卷, 第756-760页（1996）

非专利文献3：BioTechniques, 第29卷, 第884-890页（2000）

发明概述

技术问题

本发明的目标是开发一种用于制造病毒载体的培养基，特别是用于培养可以保持更高病毒效价的病毒生产细胞的培养基，并提供制造病毒载体的方法，其包括使用所述培养基，以及制造转化细胞群体的方法，其包括使用通过制造病毒载体的方法制得的病毒载体。

 

问题的解决方案

本发明人进行了深入研究以解决上述问题，结果发现，当使用含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分的培养基培养病毒生产细胞时，提高的病毒生产可以持续很长一段时间并获得具有令人惊讶的高病毒效价的病毒上清液。

具体而言，本发明涉及：

[1]制造病毒载体的方法，包括在含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分的培养基中培养能够制造所述病毒载体的细胞的步骤；

[2]根据上文[1]的方法，其中所述培养基进一步含有脂质作为活性成分；

[3]根据上文[1]或[2]的方法，其中所述细胞是能够连续制造所述病毒载体的细胞；

[4]根据上文[1]至[3]任一项的方法，其中所述病毒载体是反转录病毒载体；

[5]根据上文[1]至[4]任一项的方法，其中所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是选自曲古霉素A和丁酸钠的至少一种物质；

[6]通过根据上文[1]至[5]任一项的方法制得的病毒载体；

[7]制造转化细胞群体的方法，包括用根据上文[6]的病毒载体转化细胞；

[8]通过根据上文[7]的方法获得的转化细胞群体；

[9]用于药物的根据上文[8]的细胞群体；

[10]用于制造药物的根据上文[8]的细胞群体；

[11]含有根据上文[8]的细胞群体作为活性成分的药物组合物；

[12]治疗或预防疾病的方法，其包括向对象施用有效量的根据上文[11]的药物组合物；和

[13]用于制造病毒载体的培养基，含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分。

 

发明效果

根据本发明的制造病毒载体的方法，与常规方法相比，病毒生产可以持续很长一段时间，并可以获得高病毒效价。因此，根据本发明的方法，可以通过一轮培养准备收集大量病毒。此外，由本发明的培养基中培养的病毒生产细胞所制备的病毒载体具有高病毒效价，并因此表现出比通过常规方法获得的病毒载体更高的基因转导效率。

 

附图概述

图1显示了使用培养基A、组B、组C等等获得的具有反转录病毒载体的UP-T1细胞中的基因转导效率。

图2显示了已经转导到使用培养基A、组B、组C等等获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因的表达强度。

图3显示了使用培养基A、组F、组G等等获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因转导效率。

图4显示了已经转导到使用培养基A、组F、组G等等获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因的表达强度。

图5显示了使用培养基A、组I、组J等等获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因转导效率。

图6显示了使用培养基H、F-1、K、L和B-1获得的具有反转录病毒载体的PBMC中的基因转导效率。

图7显示了使用培养基H、F-1、K、L和B-1获得的反转录病毒载体的RNA复制数。

图8显示了使用培养基组M、组D、H和N获得的具有反转录病毒载体的PBMC中的基因转导效率。

图9显示了使用培养基组M、组D、H和N获得的反转录病毒载体的RNA复制数。

图10显示了使用培养基A、组O、D、组E、H和F-1获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因转导效率。

图11显示了已经转导到使用培养基A、组O、D、组E、H和F-1获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因的表达强度。

图12显示了使用培养基A、组P、组Q、组R、组S、E、H和F-1获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因转导效率。

图13显示了使用培养基A、组T、组U、E-2和H获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因转导效率。

图14显示了使用培养基V、W、X和Y获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因转导效率。

图15显示了已经转导到使用培养基V、W、X和Y获得的具有反转录病毒载体的SUP-T1细胞中的基因的表达强度。

 

实施本发明的方式

下面，详细解释本发明。

本发明公开了适于培养制造病毒载体的细胞的培养基。该培养基包含通过混合细胞培养所必需的成分制备的基础培养基，并进一步含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分。该培养基可以进一步含有脂质。

在本发明中，“视黄酸”也称为维生素A酸，并可以是其中在链部分上的所有双键均为反式的全反式视黄酸，或其中在9-位置处的双键为顺式的9-顺式-视黄酸。其它视黄酸异构体、视黄酸衍生物和人工合成的合成类维生素A也可用于本发明。如本文中所用，上述视黄酸、视黄酸异构体、视黄酸衍生物、人工合成的合成类维生素A以及它们的盐统称为视黄酸。本发明中使用的视黄酸可以是一种视黄酸或多种视黄酸的组合。

本发明中使用的视黄酸在所述培养基中的浓度没有特别限制，只要是使得视黄酸充当活性成分的浓度。当使用全反式视黄酸（下文中称为ATRA）时，该浓度为例如优选1nM至10μM，更优选5nM至200nM，再更优选10至100nM。

在本发明中，“组蛋白脱乙酰基酶抑制剂”可以是具有组蛋白脱乙酰基酶活性的任何物质。可用于本发明的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的实例包括（1）脂肪酸，如丁酸、苯基丁酸、丙戊酸和它们的盐、衍生物等等；（2）异羟肟酸，如曲古霉素A、Oxamflatin、辛二酰苯胺和它们的盐、衍生物等等；（3）环肽，如trapoxin、apicidin、FK228和它们的盐、衍生物等等；和（4）苯甲酰胺及其盐、衍生物等等。

组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的优选实例包括但不限于丁酸钠（下文中称为NaB）和曲古霉素A（下文中称为TSA），其可以抑制宽范围的组蛋白脱乙酰基酶的异构体。

本发明中使用的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂在所述培养基中的浓度没有特别限制，只要是使得组蛋白脱乙酰基酶抑制剂充当活性成分的浓度。当使用TSA时，该浓度为例如优选10nM至50μM，更优选20nM至10μM，再更优选100nM至3μM。当使用NaB时，该浓度为例如优选1nM至50mM，更优选1mM至10mM。

本发明的含有视黄酸与组蛋白脱乙酰基酶抑制剂的培养基可以进一步含有脂质。可用于本发明的脂质的实例包括脂肪酸（花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酰酸（palmitoylic acid）、棕榈酸和它们的盐等等）；类固醇，如胆固醇和地塞米松；生育酚乙酸酯；甘油三酸酯；和磷脂（甘油磷脂、鞘磷脂、肌醇磷脂等等）。一种如上所述的脂质或多种如上所述的脂质的组合可以添加到所述培养基中。例如，所述培养基可以含有原样脂肪酸浓缩物，其是市售用作介质添加剂以取代血清成分。

可用于本发明的选自上述脂质的任何脂质在所述培养基中的浓度没有特别限制，只要是使得脂质充当活性成分的浓度。培养基中的总脂质浓度优选为0.01毫克/升至8.0毫克/升，更优选0.03毫克/升至5.0毫克/升，再更优选0.1毫克/升至4.0毫克/升。例如，当使用脂肪酸浓缩物时，所述按体积比计算的浓度优选为1/10,000至1/50（V/V）、更优选1/3,000至1/75（V/V），再更优选1/1,000至1/100（V/V）。

所述基础培养基的成分的实例包括能量源，如氨基酸、糖类和有机酸、维生素、用于pH调节的缓冲成分，和无机盐。该基础培养基还可以含有pH指示剂，如酚红。可以使用的基础培养基的实例包括已知的不含血清的培养基，如DMEM、IMDM和Ham’s F12介质，其可购自Invitrogen、Sigma等等。市售培养基，如Opti-ProSF、VP-SFM、293SFMII（其由Invitrogen制造）和HyQ SFM4MegaVir（其由HyClone Laboratories Inc制造）也可使用。尽管可以使用补充血清的培养基，但是优选使用不含血清的培养基以防止血清来源的未知病毒的污染。当使用不含血清的培养基时，优选使用含有由人类血液高度纯化的血清白蛋白（例如作为药物核准的血清白蛋白制剂）、衍生自动物的高度纯化的血清白蛋白、或重组血清白蛋白的不含血清的培养基（JP-A 2007-105033）。

要在本发明的培养基中培养的病毒生产细胞没有特别限制，并且例如，优选的是反转录病毒生产细胞。

本发明涉及制造病毒载体的方法，其包括使用如上所述的培养基。

可以根据本发明制得的病毒载体没有特别限制。所述病毒载体的实例包括反转录病毒载体（包括肿瘤病毒载体、慢病毒载体和它们的修饰形式）、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、猿猴病毒载体、牛痘病毒载体和仙台病毒载体。所述病毒载体的优选实例包括反转录病毒载体，即重组反转录病毒载体。特别地，缺乏复制能力以防止无限制的传染或基因转移的反转录病毒载体优选用于本发明。已知的缺乏复制能力的反转录病毒载体的实例包括反转录病毒载体，如MFG载体、α-SGC载体（WO92/07943）、pBabe [Nucleic Acids Research, 第18卷, 第12期, 第3587-3596页(1990)]、LXIN（由Clontech制造）和DON-AI（由TAKARA BIO INC制造）、慢病毒载体[人类免疫缺陷病毒（HIV）衍生载体、猿猴免疫缺陷病毒（SIV）衍生载体等等]和通过修饰它们获得的载体（例如假型载体）。

可以将任何外源基因引入所述病毒载体。待引入的外源基因没有特别限制，取决于用如下所述根据本发明制造的病毒载体转化的细胞群体的预期用途，可以使用任何基因[编码蛋白质的基因，如酶、细胞因子或受体，以及编码细胞内抗体的基因、反义核酸、siRNA（小干扰RNA）或核糖酶]。所述外源基因的实例包括（出于细胞的医疗用途）表达MazF的基因，MazF是序列特异性核糖核酸酶（例如WO 2007/020873和WO 2008/133137）、编码识别肿瘤抗原或病毒抗原的抗体可变区或T细胞受体的基因，以及在患者体内缺乏或其功能丧失的基因。同时，允许选择基因转导细胞的合适的标记基因，如低亲和力神经生长因子受体（ΔLNGFR）的胞外区基因、新霉素抗性基因或荧光蛋白基因可以引入到该病毒载体中。

例如，该外源基因可以以使得该基因在合适的启动子控制下表达的方式插入到所述病毒载体中。在所述载体中还可以存在增强子序列、终止序列或内含子系列。

在本发明中，所述病毒载体的制造通过将编码该病毒载体的DNA转染到包装细胞系中以制备病毒生产细胞并在本发明的培养基中培养该病毒生产细胞来进行。

所述包装细胞系没有特别限制，可以使用已知的包装细胞系，如PG13（ATCC CRL-10686）、PA317（ATCC CRL-9078）、GP+E-86或GP+envAm-12（USP 5,278,056）或Psi-Crip [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 第85卷, 第6460-6464页（1988）]。携带制造反转录病毒颗粒所需基因的包装质粒（由TAKARA BIO INC.制造的Retrovirus Packaging Kit等）也可以转染到具有高转染效率的293细胞或293 T细胞中以制备反转录病毒生产细胞。

本发明的方法可用于制备以瞬时制造重组病毒载体的病毒生产细胞系，或能够连续制造病毒的病毒生产细胞系。在其中使用后一种病毒生产细胞系的情况下，通过适当的方法将病毒生产细胞系的冷冻库存，如主细胞库（MCB）或工作细胞库（WCB）解冻，并随后直接在培养基中接种以开始培育，细胞生长以使得该细胞生产病毒。为了大规模制备重组病毒载体，优选的是进一步增加用于使该病毒生产细胞系适合于该培养基的驯化步骤。

所述病毒生产细胞可以在常规培养条件下培养。该培养条件的实例包括但不限于在95%的湿度和5%的CO₂下培养。该病毒生产细胞的培养可以例如在30至37℃下进行。但是，该病毒生产细胞的培养可以在上述范围之外的温度下进行，只要所述温度是可以获得所需细胞的生长和病毒载体的制造的温度。在本发明中，从由此获得的培养液收获上清液，并从中获得病毒载体。在本发明中，该病毒载体可以是原样的上述上清液，或通过过滤该上清液获得的滤液，或者可以通过已知方法浓缩或提纯。所述病毒载体通过适当方式，例如通过冷冻直到使用来保存。根据如上所述的在本发明的培养基中培养所述病毒生产细胞，可以获得与常规培养方法相比具有更高效价的病毒载体。

本发明还提供了制造含有转化细胞的细胞群体的方法，所述方法包括用通过本发明的方法制造的病毒载体转化靶细胞。待通过该病毒载体转导到细胞中的所需基因的数量没有限制。一种基因或两种或多种基因可以通过该病毒载体转导。可以通过适于该病毒载体的已知方法用所述病毒载体对靶细胞进行转导。例如，当使用反转录病毒载体时，可以在进行基因转导的时候还使用能够提高基因转导效率的物质，如RetroNectin（注册商标；由TAKARA BIO INC.制造）。

由于根据本发明可以获得具有高病毒效价的病毒载体，所以通过使用所述病毒载体可以获得包含高百分比的保留所需基因的细胞的细胞群体。

本发明提供通过制造本发明的细胞群体的方法获得的细胞群体，以及所述细胞群体的用途。通过本发明的方法获得的细胞群体可用于多种用途，例如用于制造可用物质。所述细胞群体本身也可用于治疗疾病。

根据本发明的方法，可以获得含有保留医疗可用外源基因的细胞的细胞群体。所述细胞群体可用于治疗多种疾病，如癌症、白血病、恶性肿瘤、肝炎、感染性疾病[例如流行性感冒、结核、HIV（人类免疫缺陷病毒）感染性疾病、MRSA感染性疾病、VRE感染性疾病和深部真菌病]等等。通过本发明的方法制造的细胞群体也可以与常规治疗方法结合使用，例如为了防止在骨髓移植、暴露于辐射等等之后处于免疫缺陷状态下的感染性疾病的供者淋巴细胞输注，或缓解复发性白血病、抗癌药物疗法、放射疗法、抗体疗法、温热疗法或其它免疫疗法。

当含有根据本发明获得的转化细胞的细胞群体用于治疗或预防疾病时，将有效量的所述细胞施用于治疗或预防的对象，即人类或非人类的动物。施用所述细胞群体的方法可以根据疾病合适地选择。施用方法的实例包括静脉内给药、动脉内给药、皮下给药和腹腔内给药，通过注射或输液。

根据本发明获得的细胞群体可以调配成药物组合物，也就是说，疾病的治疗剂或预防剂，并可以通过将所述药物组合物施用于对象来治疗或预防疾病。所述药物组合物可以通过根据药物领域已知的方法调配所述细胞群体来制造。例如，作为活性成分的通过本发明的方法制得的细胞群体可以与适于非消化道给药的已知的有机或无机载体、赋形剂或稳定剂等等混合以制备输注剂或注射剂。

 

实施例

下面，借助实施例进一步具体解释本发明，本发明不限于所述实施例。

实施例1  制备补充了曲古霉素A的培养基

用于病毒生产细胞培养的不含血清的培养基，GT-T-RetroI（由TAKARA BIO INC.制造，下文中称为RetroI）用作基础培养基A（培养基A）。向该培养基A中以10nM和100nM的最终浓度加入视黄酸（ATRA）（由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造）并以500nM的最终浓度加入曲古霉素A（TSA）（由Sigma制造）以分别制备培养基B-1和B-2（下文中称为培养基组B）。此外，向培养基B-1中以1/100、1/250和1/1000的体积比（V/V）添加脂肪酸浓缩物（由Gibco制造，下文中称为脂质）以分别制备培养基C-1、C-2和C-3（下文中称为培养基组C）。此外，制备仅用TSA补充培养基A（最终浓度：500nM）的培养基D，和仅用ATRA补充培养基A（最终浓度：10nM）的培养基E。各培养基的组成显示在表1中。

[表1]

实施例2

1．培养反转录病毒生产细胞

将能够制造携带荧光报告蛋白质（ZsGreen）基因（PG13：ATCC CRL-10686用作包装细胞）的家鼠衍生（mouse-derived）重组反转录病毒载体的反转录病毒生产细胞的工作细胞库（WCB）在37℃下在水浴中解冻。将由此解冻的细胞溶液放置到15毫升离心管中。加入10毫升的完全培养基[DMEM介质（由Gibco制造），含有10%的胎牛血清（10%FBS，由SAFC Biosciences制造）]后，对该管施以离心（500 × g，5分钟，20℃）。在离心后，取出上清液，细胞悬浮在10毫升的完全培养基中，并随后计数。细胞计数后，用完全培养基将所述细胞悬浮液调节至78.5×10⁴个细胞/毫升。向用于细胞培养的100毫米碟（由IWAKI制造）中加入1毫升该细胞悬浮液和14.7毫升的完全培养基。细胞培养在CO₂培养箱（37℃，95%的湿度，5%的CO₂）中进行。该细胞以3天的间隔传代培养。在第一次传代时，该细胞悬浮液以1×104个细胞/厘米2的细胞密度和0.2毫升/厘米2的体积接种。在第二次传代时，以0.9×104个细胞/厘米2的细胞密度和0.2毫升/厘米2的体积将2毫升/孔的细胞悬浮液接种到6孔的处理过的用于细胞培养的板（由BD Falcon制造）上。在第二次传代时，在培养开始后三天，取出培养上清液，并代之以实施例1中所述的培养基A、B-1、B-2、C-1、C-2、C-3、D或E（体积：0.1毫升/厘米2）。第二天，收集该培养基并代之以与收集的培养基种类相同的新鲜培养基。在第二次传代的3天后，在32℃、95%的湿度和5%的CO₂下进行细胞培养。连续4天进行4次培养基的收集和替换，条件是第4次时仅收集培养基而不加入新鲜的培养基。将各收集的培养上清液（第1、第2、第3和第4次）经孔径为0.22微米的过滤器（由Millipore制造）过滤。将各培养上清液的滤液分装并随后储存在-80℃下作为每次的反转录病毒上清液。

 

2．用反转录病毒上清液评价基因转导

测定如上所述使用培养基A至E收集的反转录病毒上清液的基因转导效率。将使用培养基A至E收集的各反转录病毒上清液稀释以制备5倍稀释的溶液。为了稀释该反转录病毒上清液，使用ACD-A（由Terumo Corporation制造）和人血清白蛋白“Albuminar 25%”（由CSL Behring制造）的5倍和12.5倍稀释溶液——其添加生理盐水制得以分别具有5%或2%的最终白蛋白浓度（下文中称为5%白蛋白溶液或2%白蛋白溶液）。作为基因转导的容器，使用未处理的24孔板（由BD Falcon制造）。所述未处理的24孔板加入0.5毫升/孔的预先用ACD-A稀释以具有20微克/毫升的最终浓度的RetroNectin（注册商标，由TAKARA BIO INC. 制造）溶液在4℃下处理整夜。在从板中除去RetroNectin溶液后，通过向每个孔中添加0.5毫升的ACD-A并随后除去该ACD-A洗涤所述板2次。向洗涤过的板的各孔中加入1毫升各病毒稀释溶液。对该板施以离心（32℃，2000×g，2小时）。离心后，将病毒稀释溶液的上清液从各孔中取出。各孔用0.5毫升的人血清白蛋白“Albuminar 25%”的16.67倍稀释溶液洗涤3次，所述16.67倍稀释溶液通过添加生理盐水制备以具有1.5%的最终白蛋白浓度（下文中称为1.5%白蛋白溶液）。人T淋巴细胞白血病细胞SUP-T1（ATCC CRL-1942）以1×10⁶个细胞/毫升悬浮在用于培养SUP-T1细胞的培养基[RPMI1640培养基（由Sigma制造），含有10%的胎牛血清]中。向如上所述的洗涤过但未处理的24孔板的各孔中加入1毫升的SUP-T1细胞悬浮液（0.5×10⁶个细胞/厘米²）。对该板施以离心（32℃，1000×g，10分钟）。在离心后，细胞在CO₂培养箱（37℃，95%的湿度，5%的CO₂）中培养1天。第二天，向各孔中加入1毫升的用于培养SUP-T1细胞的培养基，细胞进一步培养1天。在培养后，检查荧光报告蛋白质（ZsGreen）的表达以测定该反转录病毒的基因转导效率。随后，将受染并培养的细胞的0.5×10⁶个细胞放入Eppendorf管中，并随后通过离心（4℃，500×g，5分钟）沉淀。在取出上清液后，沉淀的细胞悬浮在用BSA（胎牛血清白蛋白, 由Sigma制造）以0.5%的最终浓度补充的950微升的磷酸盐缓冲液（由Gibco制造）（下文中称为0.5%BSA/PBS）中。随后，细胞再次通过离心（4℃，500×g，5分钟）沉淀。在取出上清液后，沉淀的细胞悬浮在400微升0.5%的BSA/PBS中，其是用0.5%的BSA（由Sigma制造）补充的磷酸盐缓冲液（由Gibco制造）。对该细胞悬浮液施以流式细胞计数测量。

 

3．流式细胞计数分析

按照设备所附说明书使用BD FACSCanto II流式细胞计（Becton, Dickinson and Company）进行流式细胞计数分析。如下测定ZsGreen的表达率。在向前散射光（FSC）和侧面散射光（SSC）的2参数直方图（x轴：FSC，y轴：SSC）上门控所述细胞群体。用GFP检测参数的直方图（x轴：GFP的荧光强度，y轴：细胞计数）显影门中的细胞群体。具有比同种型对照物更高的GFP荧光强度的细胞定义为ZsGreen阳性细胞。ZsGreen阳性细胞数量相对于上述门控细胞群体中细胞总数量的比率（%）定义为基因转导效率（GT%），并测量平均荧光强度（MFI）。

基因转导效率的测定结果显示在图1中。

评价通过实施例2-2的培养方法每天获得的病毒上清液的基因转导效率，并计算经4天获得的病毒上清液的平均值。如图1中所示，使用培养基组B和C收集的反转录病毒上清液的基因转导效率比使用培养基A（其为基础培养基）的情况高至少2倍。换句话说，当使用培养基组B和C时，与使用培养基A的情况相比，获得具有更高效价的病毒，并且ZsGreen基因通过该病毒以更高的效率转导。与使用培养基D或E的情况相比，使用培养基组B和C也产生了比仅加入TSA或ATRA的情况下更大的上述效果。

在图中，“NGMC”是指没有用基因转导的细胞，并代表阴性对照物。在图2至15中，“NGMC”具有相同的含义。

荧光强度的测量结果（在下文中，这意味着基因表达强度）显示在图2中。

评价通过实施例2-2的培养方法每天获得的病毒上清液的荧光强度，并计算经4天获得的病毒上清液的平均值。如图2中所示，使用培养基组B和C收集的反转录病毒上清液的荧光强度比使用培养基A的情况高大约2倍。换句话说，当使用培养基组B和C时，与使用培养基A的情况相比，获得具有更高效价的病毒，并且该基因通过该病毒以更高的效率转导，由此更高度表达该荧光报告蛋白质（ZsGreen）。与使用培养基D或E的情况相比，使用培养基组B和C也产生了比仅加入TSA或ATRA的情况下更大的上述效果。

 

实施例3  制备补充了NaB的培养基

向如实施例1中所述的培养基A中以10nM和100nM的最终浓度加入ATRA并以5mM的最终浓度加入丁酸钠（NaB）以分别制备培养基F-1和F-2。此外，向培养基F中以1/100、1/250和1/1000的体积比（V/V）添加脂质以分别制备培养基G-1、G-2和G-3。此外，制备仅用NaB补充培养基A（最终浓度：5mM）的培养基H，和仅用ATRA补充培养基A（最终浓度：10nM）的培养基E。各培养基的组成显示在表2中。

[表2]

实施例4  培养反转录病毒生产细胞

使用如实施例2中所述的反转录病毒生产细胞制备病毒上清液。在本实施例中，以与实施例2-1相同的方式获得病毒上清液，除了使用如实施例3中所述的培养基A、组F、组G、H和E。以与实施例2-2相同的方式进行基因转导。以与实施例2-3相同的方式进行基因转导效率的评价。

基因转导效率的测定结果显示在图3中。

如图3中所示，使用培养基组F和G收集的反转录病毒上清液的基因转导效率比使用培养基A的情况高大约2倍。换句话说，当使用培养基组F和G时，与使用培养基A的情况相比，获得具有更高效价的病毒，并且ZsGreen基因通过该病毒以更高的效率转导。与使用培养基H或E（仅添加NaB或ATRA）的情况相比，使用培养基组F和G还产生了更高的效果。

荧光强度的测定结果显示在图4中。

评价通过实施例2-2的培养方法每天获得的病毒上清液的荧光强度，并计算经4天获得的病毒上清液的平均值。如图4中所示，使用培养基组F和G收集的反转录病毒上清液的荧光强度比使用培养基A的情况高大约2倍。换句话说，当使用培养基组F和G时，与使用培养基A的情况相比，获得具有更高效价的病毒，并且该基因通过该病毒以更高的效率转导，由此更高度表达该荧光报告蛋白质（ZsGreen）。与使用培养基H或E的情况相比，使用培养基组F和G还产生了更高的荧光强度。

 

实施例5  制备补充了VPA的培养基

向如实施例1中所述的培养基A中以10nM的最终浓度加入视黄酸（ATRA）并以500μM、1mM和2mM的最终浓度加入丙戊酸（VPA）（由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造）以分别制备培养基I-1、I-2和I-3（下文中称为培养基组I）。此外，作为对比对照物，向培养基A中以500μM、1mM和2mM的最终浓度加入VPA以分别制备培养基J-1、J-2和J-3（下文中称为培养基组J）。此外，制备仅用NaB补充培养基A（最终浓度：5mM）的培养基H，和用NaB（最终浓度：5mM）和ATRA（最终浓度：10nM）补充培养基A的培养基F-1。各培养基的组成显示在表3中。

[表3]

实施例6  培养反转录病毒生产细胞

使用如实施例2中所述的反转录病毒生产细胞制备病毒上清液。在本实施例中，以与实施例2-1相同的方式获得病毒上清液，除了使用如实施例5中所述的培养基A、组I、组J、H和F-1。但是，在本实施例中混合并评价经3天收集的病毒上清液，而在实施例2-1中经4天收集病毒上清液。以与实施例2-2相同的方式进行基因转导，除了所述病毒上清液稀释10倍。以与实施例2-3相同的方式进行基因转导效率的评价。

基因转导效率的测定结果显示在图5中。

如图5中所示，使用培养基组I收集的反转录病毒上清液的基因转导效率比使用培养基A的情况高大约2倍。换句话说，当使用培养基组I时，与使用培养基A的情况相比，获得具有更高效价的病毒，并且ZsGreen基因通过该病毒以更高的效率转导。与使用培养基J（仅添加VPA）的情况相比，使用培养基组I还产生了更高的效果。此外，与使用培养基H（仅添加NaB）的情况相比，使用培养基组F-1还产生了更高的效果，这与图2中所示的实施例4的结果相同。

 

实施例7

1．培养反转录病毒生产细胞

根据生产商的规定使用Retrovirus Packaging Kit Eco（由TAKARA BIO INC.制造）用WO 2008/153029中描述的密码子修饰的TCR和siRNA-共表达反转录病毒载体（MS-MA24-siTCR）转染HEK 293 T细胞（ATCC CRL-11268）以获得嗜同反转录病毒上清液。所述病毒上清液用0.45微米的过滤器（Milex HV, 由Millipore制造）过滤。通过使用聚凝胺的方法用该滤液感染PG13细胞，并随后通过有限稀释法克隆。

 

2．反转录病毒生产细胞的中试规模培养

由实施例7-1中获得的克隆细胞制备的工作细胞库（WCB）在37℃下在水浴中解冻。将由此解冻的细胞溶液放置到15毫升离心管中。加入完全培养基[DMEM培养基（由Gibco制造），含有10%的胎牛血清（10%FBS，由SAFC Biosciences制造）]后，对该管施以离心（500×g，5分钟，20℃）。在离心后，取出上清液，细胞悬浮在10毫升的完全培养基中，并随后计数。细胞计数后，用完全培养基将所述细胞悬浮液调节至78.5×10⁴个细胞/毫升。向用于细胞培养的100毫米碟（由IWAKI制造）中加入1毫升该细胞悬浮液和14.7毫升的完全培养基。细胞培养在CO₂培养箱（37℃，95%的湿度，5%的CO₂）中进行。该细胞以3天的间隔传代培养。在第一次传代时，该细胞悬浮液以1×10⁴个细胞/厘米²的细胞密度和0.2毫升/厘米²的体积接种。在第二次传代时，以1.0×10⁴个细胞/厘米²的细胞密度和0.2毫升/厘米²的体积将45.0毫升/烧瓶的细胞悬浮液接种到CELLBIND处理过的用于细胞培养的T225烧瓶（由CORNING制造）中。在第二次传代时，在培养开始后三天，取出培养上清液，并代之以表4中显示的培养基H、F-1、K、L或B-1（体积：0.1毫升/厘米²）。在本文中，以100nM的最终浓度向培养基K和L中添加地塞米松（DEX）（由Nacalai tesque制造）。在培养基替换后的次日，收集该培养基并代之以与收集的培养基种类相同的新鲜培养基。在第二次传代的3天后，在32℃、95%的湿度和5%的CO₂下进行细胞培养。连续3天进行总计3次的培养基的收集和替换，条件是第3次时仅收集培养基而不加入其新鲜的培养基。将收集的培养上清液（第1、第2和第3次）经孔径为0.22微米的过滤器（由Millipore制造）过滤。将滤液分装并随后储存在-80℃下作为反转录病毒上清液。

[表4]

培养基	ATRA	NaB	TSA	DEX
					H	-	5mM	-	-
F-1	10nM	5mM	-	-
					K	-	5mM	-	100nM
L	10nM	5mM	-	100nM
					B-1	10nM	-	500nM	-

3．用反转录病毒上清液评价基因转导

测定该反转录病毒上清液的基因转导效率。

分别以25微克/毫升和5微克/毫升将RetroNectin和抗CD3抗体（OKT3，Janssen Pharmaceutical Companies）溶解在PBS中。将该溶液以1毫升/孔的量添加到组织培养的处理过的6孔板中，并保持在37℃下5小时。随后，将该溶液取出，各孔用1毫升的GT-T-RetroIII（由TAKARA BIO INC. 制造，下文中称为RetroIII）洗涤两次。随后，各孔用1毫升通过用最终浓度为600IU/毫升的IL-2（由制造NOVARTIS）、最终浓度为0.5微克/毫升的Fungizone（由Bristol-Myers Squibb制造）和0.6%的自体同源血浆（下文中称为CM）补充RetroIII所制备的培养基洗涤以制备RetroNectin/抗CD3抗体固定板。

从人外周血分离的外周血单核细胞（PBMC）以0.2×10⁶个细胞/毫升悬浮在CM中。向所述RetroNectin/抗CD3抗体固定板中以0.7毫升/厘米²加入6.7毫升的细胞悬浮液，并开始培养（0.14×10⁶毫升/厘米²）。

在培养的第4天，如下进行基因转导。对使用培养基H、F-1、K、L和B-1收集的各反转录病毒上清液，制备未稀释的溶液和5倍稀释的溶液。为了稀释该反转录病毒上清液，使用ACD-A，5%白蛋白溶液和2%白蛋白溶液。作为用于基因转导的容器，使用未处理的24孔板。所述未处理的24孔板加入0.5毫升/孔的预先用ACD-A稀释以具有20微克/毫升的最终浓度的RetroNectin（注册商标，由TAKARA BIO INC. 制造）溶液在4℃下处理整夜。在从板中除去RetroNectin的溶液后，用0.5毫升/孔的ACD-A洗涤所述板2次。向板的各孔中加入1毫升各病毒稀释溶液。对该板施以离心（32℃，2000×g，2小时）。离心后，将病毒稀释溶液的上清液从各孔中取出。各孔用0.5毫升的1.5%白蛋白溶液洗涤3次。收集培养后的细胞悬浮液，并以0.145×10⁶个细胞/毫升悬浮在CM中。向如上所述的洗涤过的未处理的24孔板的各孔中加入1毫升的所述细胞悬浮液（0.0725×10⁶个细胞/厘米²）。对该板施以离心（32℃，1000×g，10分钟）。在离心后，细胞在CO₂培养箱（37℃，95%的湿度，5%的CO₂）中培养4小时。随后，所述细胞悬浮液用CM稀释5倍并加入到组织培养处理的6孔板，并继续进行细胞培养。在培养的第7天，用等量的CM将所述细胞悬浮液稀释2倍，并进一步继续进行细胞培养。

在培养的第10天，为了检查所述反转录病毒的基因转导效率，细胞用MAGE-A4四聚体-PE（由制造Ludwig）和Human CD8-APC-Cy7（由Becton Dickinson制造）染色，并施以流式细胞计数以测定其为CD8阳性和四聚体阳性的细胞的百分比。具体而言，将感染并培养的细胞的0.3×10⁶个细胞放入Eppendorf管中，并随后通过离心（4℃，500×g，5分钟）沉淀。在取出上清液后，沉淀的细胞悬浮在950微升的0.5%的BSA/PBS中。随后，细胞再次通过离心（4℃，500×g，5分钟）沉淀。在取出上清液后，沉淀的细胞悬浮在1微升的MAGE-A4四聚体-PE和8微升的0.5％ BSA的混合物中，并在4℃下反应30分钟。随后，向所述细胞悬浮液中加入1微升的Human CD8-APC-Cy7，并在4℃下反应30分钟。在反应后，将950微升0.5%的BSA/PBS加入到所述细胞悬浮液中。在通过离心（4℃，500×g，5分钟）取出上清液进行2次后，将该细胞悬浮在400微升0.5%的BSA/PBS中。对该细胞悬浮液施以流式细胞计数测量。

 

4．流式细胞计数分析

按照设备所附说明书使用BD FACSCanto II流式细胞计进行流式细胞计数分析。如下测定CD8阳性细胞中存在的四聚体阳性细胞的百分比。在APC-Cy7和PE-检测参数的2参数直方图（x轴：APC-Cy7的荧光强度，y轴：PE的荧光强度）上，通过使用同种型对照物检查显示没有表达APC-Cy7（CD8）和PE（MAGE-A4四聚体）的细胞的荧光强度的区域。

当在该区域周围限定边界时，该直方图分成4个象限。确定显示表达APC-Cy7和PE的细胞的荧光强度的象限区域，并测量所述象限区域中细胞数量的百分比（%）。在测量后，通过下列等式确定基因转导效率（GT%）。

GT% = CD8和四聚体阳性细胞的数量/CD8阳性细胞的数量

基因转导效率的定结果显示在图6中。如图6中所示，使用培养基F-1、K、L和B-1收集的反转录病毒上清液的基因转导效率显著高于使用培养基H（其是用NaB补充的基础培养基A）的情况。换句话说，当本发明的方法不仅如实施例2和4中所述应用于表达荧光蛋白质的病毒载体，还应用于其它病毒载体时，并且当以大于实验室规模的中试规模实施本发明的方法时，获得具有高效价的病毒，并以高效率实现所需基因的转导。

 

5．评价反转录病毒上清液中的RNA复制数

测量所述反转录病毒上清液中的RNA复制数。

按照产品所附使用说明书中描述的标准方法使用反转录病毒滴定度装置（Retrovirus Titer Set）（用于实时（Real Time） PCR）（由TAKARA BIO INC. 制造）测定该RNA复制数。如图7中所示，测量结果表明，与实施例7-4的基因传导效率相同的方式，与使用培养基H（其是用NaB补充的基础培养基A）的情况相比，通过NaB与ATRA和/或DEX的组合显著提高了该RNA复制数（在图中称为RNA COPY）。

 

实施例8  制备2补充了TSA的培养基

向培养基A中以100nM的最终浓度加入地塞米松（DEX）、以1μM的最终浓度加入视黄酸（ATRA）并以50nM和500nM的最终浓度加入曲古霉素A（TSA）以分别制备培养基M-1和M-2（下文中，称为培养基组M）。制备其为分别以50nM和500nM的最终浓度用TSA补充的培养基A的培养基D-1和D-2（下文中称为培养基组D）、其为仅用NaB（最终浓度：5mM）补充的培养基A的培养基H和其为用NaB（最终浓度：5mM）、以100nM的最终浓度用视黄酸（ATRA）和以100nM的最终浓度用地塞米松（DEX）补充的培养基A的培养基N。各培养基的组成显示在表5中。

[表5]

实施例9

1．培养反转录病毒生产细胞

使用如实施例7-1中所述的反转录病毒生产细胞制备病毒上清液。在本实施例中，以与实施例2-1相同的方式获得病毒上清液，除了使用如实施例8中所述的培养基。但是，在本实施例中混合并评价经3天收集的病毒上清液，而在实施例2-1中经4天收集病毒上清液。

 

2．用反转录病毒上清液评价基因转导

以与实施例7-3相同的方式进行基因转导，除了使用Human CD8-FITC（由Becton Dickinson制造）作为CD8抗体。以与实施例7-4相同的方式进行基因转导效率的评价。

基因转导效率的测量结果显示在图8中。如图8中所示，在M1与D-1、M2与D-2和H与N之间比较，使用含有ATRA、DEX和NaB或TSA的组合的培养基收集的反转录病毒上清液的基因转导效率显著高于使用其为仅用NaB或TSA补充的培养基A的培养基组D和培养基H的情况。关于TSA，500nM的浓度比50nM更有效。

 

3．反转录病毒上清液中RNA复制数的评价

测量所述反转录病毒上清液中的RNA复制数。

按照产品所附使用说明书中描述的标准方法使用Retrovirus Titer Set（用于实时 PCR）（由TAKARA BIO INC. 制造）测定该RNA复制数。如图9中所示，测量结果表明，在M1与D-1、M-2与D-2和H与N之间比较，与实施例9-2的基因传导效率结果相同的方式，与使用仅用NaB或TSA补充的培养基的情况相比，ATRA和DEX与NaB或TSA的组合显著提高了该RNA复制数。关于TSA，500nM的浓度比50nM更有效。

 

实施例10  制备3补充了 TSA的培养基

以与实施例1相同的方式制备培养基以具有表6中显示的最终浓度。

[表6]

实施例11  培养反转录病毒生产细胞

使用如实施例2中所述的反转录病毒生产细胞制备病毒上清液。以与实施例2-1相同的方式获得病毒上清液，除了使用如实施例10中所述的培养基。但是，在本实施例中，混合并评价经4天收集的病毒上清液和混合并评价经3天收集的病毒上清液。以与实施例2-2相同的方式进行基因转导，除了所述病毒上清液稀释10倍。以与实施例2-3相同的方式进行基因转导效率与荧光强度的评价。

基因转导效率的测量结果显示在图10中。

如图10中所示，使用培养基组O收集的反转录病毒上清液的基因转导效率比使用培养基A的情况高大约6至8倍。与经3天收集的反转录病毒上清液相比，经4天收集的反转录病毒上清液在与对照物组相比提高基因转导效率方面具有更大的效果。

荧光强度的测量结果显示在图11中。

如图11中所示，使用培养基组O收集的反转录病毒上清液的荧光强度比使用培养基A的情况高大约2至3.5倍。

 

实施例12  制备补充了9-顺式视黄酸（9-cis）（由Nacalai tesque制造）或AM80的培养基

以与实施例1相同的方式制备培养基以具有表7中所示的最终浓度。他米巴罗汀（由Sigma制造）用作AM80。

[表7]

实施例13  培养反转录病毒生产细胞

使用如实施例2中所述的反转录病毒生产细胞制备病毒上清液。以与实施例2-1相同的方式获得病毒上清液，除了使用如实施例12中所述的培养基。但是，在本实施例中，混合并评价经3天收集的病毒上清液，而在实施例2-1中经四天收集病毒上清液。以与实施例2-2相同的方式进行基因转导，除了所述病毒上清液稀释10倍。以与实施例2-3相同的方式进行基因转导效率的评价。

基因转导效率的测量结果显示在图12中。

如图12中所示，使用培养基组P和R收集的反转录病毒上清液的基因转导效率比使用培养基A的情况高大约1.5至2倍。使用其中仅加入9-cis或AM80的培养基组Q和S收集的反转录病毒上清液的基因转导效率与使用培养基A的情况相同或低于使用培养基A的情况。

 

实施例14  制备补充了辛二酰苯胺(suberoylanilide)异羟肟酸（SAHA）（由CAYMAN制造）的培养基

以与实施例1相同的方式制备培养基以具有表8中显示的最终浓度。

[表8]

实施例15  培养反转录病毒生产细胞

使用如实施例2中所述的反转录病毒生产细胞制备病毒上清液。以与实施例2-1相同的方式获得病毒上清液，除了使用如实施例14中所述的培养基。但是，在本实施例中，混合并评价经3天收集的病毒上清液，而在实施例2-1中经四天收集病毒上清液。以与实施例2-2相同的方式进行基因转导，除了所述病毒上清液稀释10倍。以与实施例2-3相同的方式进行基因转导效率的评价。

基因转导效率的测量结果显示在图13中。

如图13中所示，使用培养基组T收集的反转录病毒上清液的基因转导效率比使用培养基A的情况高大约1.4至1.9倍。此外，使用培养基组T收集的反转录病毒上清液的基因转导效率高于使用组U（其以相同浓度含有SAHA）的相应培养基的情况。

 

实施例16  制备2补充了NaB的培养基

向DMEM（其是用于细胞培养的介质）中以1/10的体积比（V/V）加入灭活的FBS以制备基础培养基（培养基V）。向该培养基V中以100 nM的最终浓度加入视黄酸（ATRA）和以5mM的最终浓度加入丁酸钠（NaB）以制备培养基W。此外，制备其为仅用NaB（最终浓度：5mM）补充的培养基V的培养基X和其为仅用ATRA（最终浓度：100nM）补充的培养基V的培养基Y。各培养基的组成显示在表9中。

[表9]

培养基	ATRA	NaB
			V	-	-
W	100nM	5mM
			X	-	5mM
Y	100nM	-

实施例17 培养反转录病毒生产细胞

使用如实施例2中所述的反转录病毒生产细胞制备病毒上清液。以与实施例2-1相同的方式获得病毒上清液，除了使用如实施例16中所述的培养基。但是，在本实施例中，混合并评价经3天收集的病毒上清液，而在实施例2-1中经四天收集病毒上清液。以与实施例2-2相同的方式进行基因转导，除了所述病毒上清液稀释10倍。以与实施例2-3相同的方式进行基因转导效率和荧光强度的评价。

基因转导效率的测量结果显示在图14中。

如图14中所示，使用培养基组W收集的反转录病毒上清液的基因转导效率比使用培养基V的情况高大约1.2倍。

荧光强度的测量结果显示在图15中。

如图15中所示，使用培养基组W收集的反转录病毒上清液的荧光强度比使用培养基V的情况高大约1.5倍。

 

工业实用性

通过使用本发明的培养基可以容易地获得具有高效价的病毒上清液，因此，可以容易地制备病毒载体和含有该病毒载体的高效价组合物。通过使用本发明的培养基获得的所述病毒载体或上述组合物在基因疗法领域非常有用。

Claims (13)

1.制造病毒载体的方法，所述方法包括在含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分的培养基中培养能够制造所述病毒载体的细胞的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基进一步含有脂质作为活性成分。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞是能够连续制造所述病毒载体的细胞。

4.根据权利要求1至3的任一项所述的方法，其中所述病毒载体是反转录病毒载体。

5.根据权利要求1至4的任一项所述的方法，其中所述组蛋白脱乙酰基酶抑制剂是选自曲古霉素A和丁酸钠的至少一种物质。

6.通过根据权利要求1至5的任一项所述的方法制得的病毒载体。

7.制造转化细胞群体的方法，所述方法包括用根据权利要求6所述的病毒载体转化细胞。

8.通过根据权利要求7所述的方法获得的转化细胞群体。

9.用于药物的根据权利要求8所述的细胞群体。

10.用于制造药物的根据权利要求8所述的细胞群体。

11.含有根据权利要求8所述的细胞群体作为活性成分的药物组合物。

12.治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向对象施用有效量的根据权利要求11所述的药物组合物。

13.用于制造病毒载体的培养基，所述培养基含有视黄酸和组蛋白脱乙酰基酶抑制剂作为活性成分。

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