KR20130069796A

KR20130069796A - 바이러스 벡터의 제조방법

Info

Publication number: KR20130069796A
Application number: KR1020137009301A
Authority: KR
Inventors: 카즈히사 신무라; 요시노리 카타야마; 켄스케 사카이; 토시히로 쇼다이; 히로후미 요시오카; 준이치 미네노
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2010-10-05
Filing date: 2011-10-04
Publication date: 2013-06-26
Also published as: EP2612909A1; CN103124787B; JP5010760B2; EP2612909A4; US20130183719A1; KR101362111B1; EP2612909B1; WO2012046727A1; JPWO2012046727A1; US9102943B2; CN103124787A

Abstract

본 발명은 바이러스 벡터를 생산하는 능력을 가지는 세포를, 레티노산류 및 히스톤 탈아세틸화 효소 저해물질을 유효성분으로 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는 바이러스 벡터의 제조방법, 및 유효성분으로, 레티노산류 및 히스톤 탈아세틸화 효소 저해물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 벡터 제조용 배지를 제공한다.

Description

바이러스 벡터의 제조방법{METHOD FOR PRODUCING VIRUS VECTOR}

본 발명은 바이러스 벡터의 제조방법, 및 바이러스 벡터 제조를 위한 배지에 관한 것이다.

선천성 유전자 질병의 치료 외에 암이나 감염증의 치료를 목적으로 해서 바이러스 벡터를 사용한 유전자치료가 개발되고, 임상적으로 많은 시험이 실시되고 있다. 특히, 레트로바이러스 벡터나 아데노바이러스 벡터를 이용한 유전자 치료에 대해서 많은 시도가 이루어지고 있다.

목적유전자를 통합하기 위해서 사용되는 유전자 재조합 레트로바이러스 벡터 제작을 위해서 사용되는 트랜스퍼 벡터의 예로서는 야생형 몰로니 백혈병 바이러스(MoMLV)의 게놈으로부터 바이러스 입자 구조단백질 유전자(gag, pol, env)가 제거된 pLXSN(Genbank Accession M28248)이나 pMFG 등이 있다. 이들 이외에 추가로 개변된 벡터가 인간을 대상으로 한 임상시험에 사용되고 있다.

유전자 재조합 레트로바이러스 벡터의 제조는 목적유전자를 삽입한 DNA벡터의 패키징 세포(Psi-Crip, GP+E86, GP+envAm12, PG13 등)로의 트랜스펙션에 의해 유도된 바이러스 생산세포를 배양하고, 소망하는 바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 채취하는 것에 의해 실시된다. 또, 이 상청액을 재차 패키징 세포에 감염시키는 등의 방법으로, 감염세포 중에서 목적유전자 발현용 레트로바이러스 벡터를 안정적으로 생산하는 생산세포 클론을 선택하는 것도 수행되고 있다. 이러한 공정에서, Master Cell Bank(MCB), 그리고 Working Cell Bank(WCB)가 조제되고, 유전자 치료용 유전자 재조합 레트로바이러스 벡터가 안정되게 제조된다.

레트로바이러스 생산세포가 생산하는 바이러스의 역가를 향상시키기 위해서는 레트로바이러스 생산세포의 배양은 매우 중요하다. 즉, 높은 바이러스 역가(이하, '바이러스타이터' 라고 언급하기도 한다.)가 수득되는 배양조건의 검토가 필요하다. 현재까지 역가를 올리는 방법으로서, 중복 감염(예를 들면, 비특허문헌 1)이나, 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제인 부티르산 나트륨, 또는 트리코스타틴A(Trichostatin A)의 첨가(예를 들면, 비특허문헌 2 및 3)가 있다. 그러나, 이들 모두는 현저한 효과는 수득되고 있지 않다.

J. Hum. Gene Ther., Vol.6, pp.1195-1202 (1995) Gene Therapy., Vol.3, pp.756-760 (1996) BioTechniques., Vol.29, pp.884-890 (2000)

본 발명의 목적은 바이러스 벡터의 제조에 사용되는 배지, 특히 높은 바이러스타이터를 유지하는 것을 가능하게 하는 바이러스 생산세포의 배양에 사용되는 배지를 개발하고, 당해 배지를 사용한 바이러스 벡터의 제조방법, 및 당해 방법으로 제조되는 바이러스 벡터를 사용한 형질전환 세포집단의 제조방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 노력한 결과, 유효성분으로서, 레티노산류 및 히스톤 탈아세틸화 효소(이하, '히스톤 데아세틸라아제' 라고 언급하기도 한다.) 저해물질을 포함하는 배지를 사용하고, 바이러스 생산세포를 배양함으로써, 장기간에 걸쳐서 높은 바이러스 생산을 계속할 수 있고, 놀랍게도 높은 바이러스 역가의 바이러스 상청액이 수득되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

본 발명을 개략적으로 설명하면 본 발명은 하기에 관한 것이다.

[1] 바이러스 벡터를 생산하는 능력을 가지는 세포를, 레티노산류 및 히스톤 탈아세틸화 효소 저해물질을 유효성분으로서 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는 바이러스 벡터의 제조방법.

[2] 상기 [1]에서, 배지가 유효성분으로서, 추가로 지질류를 포함하는 제조방법.

[3] 상기 [1] 또는 [2]에서, 세포가 계속적으로 바이러스 벡터를 생산하는 능력이 있는 세포인 제조방법.

[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 제조방법,

[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에서, 히스톤 탈아세틸화 효소저해물질이 트리코스타틴A 및 부티르산 나트륨으로부터 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1종의 물질인 제조방법.

[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조된 바이러스 벡터.

[7] 상기 [6]에 기재된 바이러스 벡터를 사용해서 세포를 형질전환하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포집단의 제조방법.

[8] 상기 [7]에 기재된 제조방법으로 수득된 형질전환된 세포집단.

[9] 상기 [8]에서 의약에 사용하기 위한 세포집단.

[10] 상기 [8]에서, 의약의 제조에 사용하는 세포집단.

[11] 상기 [8]에 기재된 세포집단을 유효성분으로서 함유하는 의약.

[12] 대상에, 유효량의 상기 [11]에 기재된 의약을 투여하는 공정을 포함하는 질병의 치료방법 또는 예방방법.

[13] 유효성분으로서, 레티노산류 및 히스톤 탈아세틸화 효소 저해물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 벡터 제조용 배지.

본 발명의 바이러스 벡터의 제조방법에 의하면, 종래법과 비교해서, 장기간 바이러스 생산을 계속할 수 있으며, 또한 높은 바이러스 역가를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 방법에서는 1회의 배양조제로 바이러스 양을 많이 회수할 수 있다. 또, 본 발명의 배지에서 배양한 바이러스 생산세포로부터 조제된 바이러스 벡터는 높은 바이러스 역가를 가지므로, 종래법보다 높은 유전자 도입효율을 나타낸다.

도 1은 배지A, B군, C군 등을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 2는 배지A, B군, C군 등을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로 도입한 유전자 발현강도를 나타내는 도면이다.
도 3은 배지A, F군, G군 등을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 4는 배지A, F군, G군 등을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로 도입한 유전자 발현강도를 나타내는 도면이다.
도 5는 배지A, I군, J군 등을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 6은 배지H, F-1, K, L, B-1을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, PBMC로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 7은 배지H, F-1, K, L, B-1을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터의, RNA 카피 수를 나타내는 도면이다.
도 8은 배지M군, D군, H, N을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, PBMC로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 9는 배지M군, D군, H, N을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터의, 레트로바이러스 벡터의, RNA 카피 수를 나타내는 도면이다.
도 10은 배지A, O군, D, E군, H, F-1을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 11은 배지A, O군, D, E군, H, F-1을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로 도입한 유전자 발현강도를 나타내는 도면이다.
도 12는 배지A, P군, Q군, R군, S군, E, H, F-1을 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 13은 배지A, T군, U군, E-2, H를 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 14는 배지V, W, X, Y를 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로의 유전자 도입효율을 나타내는 도면이다.
도 15는 배지V, W, X, Y를 사용해서 수득된 레트로바이러스 벡터에서의, SUP-T1 세포로 도입한 유전자 발현강도를 나타내는 도면이다.

이하에 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.

본 발명은 바이러스 벡터를 생산하는 세포의 배양에 적합한 배지를 개시한다. 상기의 배지는 세포의 배양에 필요한 성분을 혼합해서 제작된 기본배지에, 유효성분으로서 레티노산류 및 히스톤 데아세틸라아제 저해물질이 함유되어 이루어지는 것이다. 당해 배지에는 추가로 지질류가 포함될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 「레티노산」은 비타민A산 라고도 불리며, 쇄부의 이중결합이 전부 trans의 all-trans-레티노산 또는 9번 위치가 cis구조를 가지는 9-cis-레티노산의 어느 것일 수 있다. 또, 기타 레티노산 이성체, 레티노산 유도체, 및 인위적으로 합성한 합성 레치노이드도 본 발명에 있어서 사용할 수 있다. 상기의 레티노산, 레티노산 이성체, 레티노산 유도체 및 인위적으로 합성한 합성 레치노이드 또는 그것들의 염을 본 명세서에서는 레티노산류라고 총칭한다. 또, 본 발명에 있어서, 사용하는 레티노산류는 1종류일 수 있고, 복수종류를 조합시켜서 사용할 수 있다.

본 발명에 사용되는 레티노산류의 배지 중의 농도로서는 유효성분으로 작용하는 농도를 사용할 수 있고, 특별하게 한정은 없지만, all-trans-레티노산(이하, 'ATRA' 라고 언급한다.)의 경우, 예를 들면, 바람직하게는 1nM∼10㎛, 더 바람직하게는 5nM∼200nM이며, 특히 바람직하게는 10∼100nM이다.

본 발명에 있어서, 「히스톤 탈아세틸화 효소(히스톤 데아세틸라아제) 저해물질」로서는 히스톤 데아세틸라아제 저해활성을 가지는 것일 수 있고, (1) 지방족산류, 예를 들면 부티르산, 페닐부티르산, 밸프로산, 이것들의 염, 유도체 등, (2) 하이드록삼산류, 예를 들면 트리코스타틴(Trichostatin)A, 옥삼플라틴, 수베로일아닐라이드(suberoylanilide), 이것들의 염, 유도체 등, (3) 환상펩티드, 예를 들면 트라폭신(trapoxin), 아피시딘(apicidin), FK228, 이것들의 염, 유도체 등, (4) 벤즈아미드, 그 염, 유도체 등을 사용할 수 있다.

본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 히스톤 데아세틸라아제 저해물질로서, 부티르산 나트륨(이하, 'NaB' 라고 언급한다.) 또는 히스톤 데아세틸라아제의 아이소폼 저해 레인지가 넓은 트리코스타틴A(이하, 'TSA' 라고 언급한다.)이 바람직하게 사용된다.

본 발명에 사용되는 히스톤 데아세틸라아제 저해물질의 배지 중의 농도로서는 유효성분으로 작용하는 농도를 사용할 수 있고, 특별하게 한정은 없지만, TSA의 경우, 예를 들면, 바람직하게는 10nM∼50㎛, 더 바람직하게는 20nM∼10㎛, 특히 바람직하게는 100nM∼3㎛이다. NaB의 경우, 예를 들면, 바람직하게는 1nM∼50mM, 더 바람직하게는 1mM∼10mM이다.

본 발명의 레티노산류 및 데아세틸라아제 저해물질을 포함하는 배지에, 추가로 지질류를 함유시킬 수 있다. 지질류로서는 지방산류(아라키돈산, 리놀산, 리놀렌산, 미리스틴산, 올레산, 팔미토일산, 팔미트산이나 그것들의 염 등), 콜레스테롤, 덱사메타손 등의 스테로이드류, 토코페롤아세트산, 트리글리셀라이드, 인 지질류(글리셀로 인지질, 스핑고 인지질, 이노시톨 인지질 등) 등을 사용 할 수 있다. 이것들의 성분은 단독으로 혹은 복수의 것을 조합시켜서 배지에 첨가할 수 있다. 예를 들면, 혈청성분을 대체하는 것을 목적으로 배지 첨가제로서 시판되고 있는 지방산 농축액을 그대로 함유시킬 수도 있다.

본 발명에 사용되는 상기 지질류로부터 임의로 선택되는 지질류의 배지 중의 농도로서는 유효성분으로 작용하는 농도를 사용하면 되고, 특별하게 한정은 없지만, 바람직하게는 지질류의 총량으로서 0.01mM/ℓ∼8.0mM/ℓ, 더 바람직하게는 0.03mM/ℓ∼5.0mM/ℓ, 특히 바람직하게는 0.1mM/ℓ∼4.0mM/ℓ이다. 예를 들면, 지방산 농축액에서는 용액비로 바람직하게는 1/10,000∼1/50(V/V), 더 바람직하게는 1/3, 000∼1/75(V/V)이며, 특히 바람직하게는 1/1,000∼1/100(V/V)이다.

상기 기본배지의 성분으로서는 아미노산, 당류, 유기산과 같은 에너지원, 비타민류, pH 조정을 위한 완충 성분, 무기염류 등을 들 수 있다. 또, 페놀 레드와 같은 pH 지시약을 함유할 수도 있다. 이러한 기본배지로서 혈청을 함유하지 않는 공지의 배지, 예를 들면, DMEM, IMDM, Ham's F12 배지 등을 사용하여도 좋고, 이것들은 Invitrogen Corporation, Sigma Corporation 등으로부터 시판품으로서 입수할 수 있다. Opti-ProSFM, VP-SFM, 293SFMII(모두, Invitrogen Corporation), HyQ SFM4MegaVir(HyClone Laboratories Inc.) 등의 시판의 배지도 사용할 수 있다. 혈청 첨가 배지를 사용할 수 있지만, 혈청유래의 미지의 바이러스의 혼입을 방지하기 위해서, 무혈청 배지의 사용이 바람직하다. 무혈청 배지를 사용하는 경우에는, 인간 혈액보다 고도로 정제된 혈청알부민(예를 들면 의약품으로서 인가된 혈청알부민 제제)이나 동물유래의 고도로 정제된 혈청알부민, 또는 재조합 혈청알부민을 함유하는 무혈청배지가 바람직하게 사용된다(일본 공개특허공보 2007-105033호).

본 발명의 배지에 의해 배양되는 바이러스 생산세포에는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 레트로바이러스 생산세포가 바람직하다.

본 발명은 상기의 배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 바이러스 벡터의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해 제조되는 바이러스 벡터에는 특별하게 한정은 없다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터(온코바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터나 그것들의 변이체를 포함한다.), 아데노바이러스 벡터, 아데노수반바이러스 벡터, 시미안바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터 또는 센다이바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 즉 유전자 재조합 레트로바이러스 벡터가 예시된다. 특히, 무제한의 감염, 유전자 도입을 방지된 복제능 결손 레트로바이러스 벡터가 본 발명에 바람직하게 사용된다. 공지의 복제능 결손 레트로바이러스 벡터로서는 MFG벡터나 α-SGC벡터(국제공개 제92/07943호 팸플릿), pBabe[Nucleic Acids Research., Vol.18, pp.3587-3596 (1990)], LXIN(Clontech사), DON-AI(TAKARA BIO INC.) 등의 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터[인간 면역부전 바이러스(HIV) 유래 벡터, 원숭이 면역부전 바이러스(SIV) 유래 벡터 등] 혹은 이것들을 개변한 벡터(예를 들면, 슈도타입 벡터)가 예시된다.

상기의 바이러스 벡터에는 임의의 외래유전자를 도입할 수도 있다. 도입되는 외래유전자에는 특별하게 한정은 없고, 하기에 기재된 본 발명에 의해 제조된 바이러스 벡터에 의해 형질전환되는 세포집단의 용도에 따라서, 임의의 유전자[효소, 사이토카인류, 또는 리셉터류 등의 단백질을 코딩한 것 이외에, 세포내 항체, 안티센스 핵산이나 siRNA(small interfering RNA), 리보자임을 코딩하는 것]을 사용할 수 있다. 이들 외래유전자로서는 예를 들면, 세포의 의료로의 이용을 목적으로 하는 것으로서, 서열특이적 RNA 분해효소인 MazF를 발현하는 유전자(예를 들면, 국제공개 제2007/020873호 팸플릿 및 국제공개 제2008/133137호 팸플릿), 종양항원이나 바이러스항원을 인식하는 항체 가변영역 또는 T세포 리셉터를 코딩하는 유전자, 환자에 있어서 결실 혹은 기능 상실하고 있는 유전자 등을 들 수 있다. 또, Low affinity Nerve Growth Factor Receptor의 세포외 도메인 유전자(ΔLNGFR), 네오마이신 내성유전자, 형광 단백질 유전자 등의, 유전자도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자를 동시에 도입할 수도 있다.

상기 외래유전자는 예를 들면, 적당한 프로모터의 제어 하에 발현되도록 바이러스 벡터에 삽입해서 사용할 수 있다. 또, 인핸서 서열, 터미네이터 서열, 또는 인트론 서열이 벡터 내에 존재하고 있어도 좋다.

본 발명에서는 상기의 바이러스 벡터를 코딩하는 DNA를 바이러스 패키징 세포주에 도입해서 제작된 바이러스 생산세포를 본 발명의 배지 중에서 배양하는 것에 의해, 바이러스 벡터의 제조가 실시된다.

상기의 패키징 세포주에는 특별하게 한정은 없고, 공지의 패키징 세포주, 예를 들면 PG13(ATCC CRL-10686), PA317(ATCC CRL-9078), GP+E-86이나 GP+envAm-12(미국특허 제5, 278, 056호), Psi-Crip[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.85, pp.6460-6464 (1988)] 등을 사용할 수 있다. 또, 트랜스펙션 효율이 높은 293세포나 293T세포에 레트로바이러스 입자생산에 필요한 유전자가 탑재된 패키징 플라스미드(레트로바이러스 패키징 키트: TAKARA BIO INC. 등)를 도입해서 레트로바이러스 생산세포를 제작할 수도 있다.

본 발명의 방법은 일과성으로 재조합 바이러스 벡터를 생산하도록 제작된 바이러스 생산세포, 계속적으로 바이러스를 생산하는 능력을 가지는 바이러스 생산세포주의 어느 쪽에도 이용할 수 있다. 후자를 사용하는 경우에는, 바이러스 생산세포주의 Master Cell Bank(MCB)이나 Working Cell Bank(WCB)와 같은 동결보존물을 적절한 수단으로 해동 후, 상기의 배지에 직접 심어서 배양을 개시하고, 상기 세포를 증식시키고, 바이러스를 생산시킨다. 재조합 바이러스 벡터의 대량조제를 위해서는, 추가로 상기의 배지에 바이러스 생산 세포주를 적응시키는 순화의 공정을 첨가하는 것이 바람직하다.

바이러스 생산세포의 배양은 통상의 배양조건으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 습도 95%, CO₂농도 5%에서의 배양이 예시되지만, 본 발명은 이러한 조건에 한정되는 것은 아니다. 배양은 예를 들면 30∼37℃에서 실시할 수 있지만, 소망의 세포의 증식, 바이러스 벡터의 생산을 달성할 수 있는 온도라면 상기의 범위 이외의 온도에서 실시할 수도 있다. 본 발명에서는, 이렇게 해서 수득되는 배양액에서 상청액을 채취하고, 바이러스 벡터를 얻는다. 본 발명에 있어서, 바이러스 벡터는 상기의 상청액인 채로, 상청액을 필터 여과해서 수득된 여과액, 공지의 방법에 의해 농축 혹은 정제된 바이러스 벡터로서 제조되고, 적절한 방법에 의해, 예를 들면 동결하고, 사용할 때까지 보존된다. 상기의 본 발명의 배지를 사용한 바이러스 생산세포의 배양에 의하면, 종래의 배양방법보다 높은 역가의 바이러스 벡터를 얻을 수 있다.

또, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 바이러스 벡터에 의해 표적세포를 형질전환하는 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포를 함유하는 세포집단의 제조방법도 제공한다. 또, 상기 바이러스 벡터에 의해 세포에 도입되는 소망하는 유전자의 수에 한정은 없고, 1개의 유전자일 수도 있고, 복수의 유전자일 수도 있다. 바이러스 벡터에 의한 표적세포의 형질전환은 당해 바이러스 벡터에 적합한 공지의 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면 레트로바이러스 벡터를 사용하는 경우에는, 유전자도입 시에 레트로넥틴(RetroNectin, 등록상표, TAKARA BIO INC.) 등의 유전자 도입효율을 향상시키는 물질을 사용할 수도 있다.

본 발명에서는 높은 바이러스 역가의 바이러스 벡터를 수득할 수 있기 때문에, 당해 벡터를 사용하는 것에 의해, 소망하는 유전자를 유지하는 세포를 높은 비율로 포함하는 세포집단을 얻을 수 있다.

본 발명은 상기의 본 발명의 세포집단의 제조방법에 의해 수득되는 세포집단, 및 당해 세포집단의 용도를 제공한다. 본 발명의 방법에 의해 수득되는 세포집단은 여러 용도, 예를 들면 유용물질의 생산에 사용할 수 있고, 또, 당해 세포집단자체를 질병의 치료에 사용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 의해, 치료상 유용한 외래유전자를 유지는 세포를 함유하는 세포집단을 얻을 수 있다. 상기의 세포집단은 유지하는 유전자에 의해 부여되는 형질에 따라 여러 질병, 예를 들면, 암, 백혈병, 악성 종양, 간염, 또는 감염증 질병(예를 들면 인플루엔자, 결핵, HIV(Human Immunodeficiency Virus, 인간 면역부전 바이러스)감염증, AIDS, MRSA 감염증, VRE 감염증, 혹은 심재성 진균증) 등의 치료에 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포집단은 골수이식, 방사선 조사후 등의 면역 부전상태에서의 감염증 예방 또는 재발 백혈병의 관해를 목적으로 한 도너 림프구 수주, 항암제치료, 방사선치료, 항체치료, 온열치료, 다른 면역요법 등, 종래의 치료법과 조합시켜서 이용할 수 있다.

본 발명에서 수득되는 형질전환 세포를 함유하는 세포집단을 질병의 치료 또는 예방에 사용하는 경우에는, 당해 세포의 유효량이 치료 또는 예방의 대상, 즉 인간 또는 비인간 동물에 투여된다. 세포집단의 투여방법은 질병에 따라 적절한 것을 선택할 수 있고, 예를 들면 주사 또는 점적에 의한 정맥, 동맥, 피하, 또는 복강내로의 투여가 예시된다.

본 발명에서 수득되는 세포집단은 의약, 즉 질병의 치료제 또는 예방제로 할 수 있고, 당해 의약을 대상으로 투여하는 것에 의해, 질병을 치료 또는 예방할 수 있다. 당해 의약은 제약 분야에서 공지의 방법에 따라서, 상기의 세포집단을 제제화해서 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 세포집단을 유효성분으로서, 비경구 투여에 적합한 공지의 유기 또는 무기의 담체, 부형제 또는 안정제 등과 혼합하고, 점적제 또는 주사제로서 조제할 수 있다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 트리코스타틴A 첨가배지의 조제

바이러스 생산세포배양용 무혈청배지인 GT-T-RetroI(TAKARA BIO INC., 이하, 'RetroI'라고 언급한다.)를 기본배지A(배지A)로 해서, 레티노산(ATRA)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 최종농도 10nM 또는 100nM이 되도록 첨가하고, 추가로 트리코스타틴A(TSA)(Sigma Corporation)를 각각 최종농도 500nM가 되도록 첨가 한 배지B-1 및 B-2(이하, '배지B군'이라고 언급한다.)를 제작했다. 추가로, 배지B-1에 지방산 농축액(Gibco사, 이하 'lipid' 라고 언급한다.)을 용액비(V/V)로 1/100, 1/250, 1/1000이 되도록 각각 첨가하고, 배지C-1, C-2, C-3(이하, '배지C군' 이라고 언급한다.)을 제작했다. 추가로 배지A에 TSA만 첨가(최종농도 500nM)한 배지D, 및 ATRA만 첨가(최종농도 10nM)한 배지E를 제작했다. 각 배지의 조성을 표 1에 나타낸다.

실시예 2

1. 레트로바이러스 생산세포의 배양

형광 리포터 단백질(ZsGreen) 유전자를 탑재한 마우스 유래 재조합 레트로바이러스 벡터를 생산하는 레트로바이러스 생산세포(PG13: ATCC CRL-10686:을 패키징 세포로 했다.)의 Working Cell Bank(WCB)를 37℃의 워터배스에서 해동했다. 해동된 세포액을 15㎖ 원심튜브로 옮기고, 완전배지[10% 소태아혈청(10% FBS, SAFC Biosciences사)을 포함하는 DMEM배지(Gibco사)]를 10㎖ 첨가하고, 원심처리(500×g, 5분간, 20℃)을 실시했다. 원심 후, 상청액을 제거하고, 10㎖의 완전배지에 현탁하고 셀 카운트를 실시했다. 셀 카운트 후, 완전배지를 사용해서, 세포현탁액을 78.5×10⁴cells/㎖로 조제하고, 세포배양용의 100㎜ dish(IWAKI사)에 상기의 세포현탁액 1㎖, 및 완전배지 14.7㎖를 첨가하고, CO₂ 인큐베이터(37℃, 습도95%, CO₂농도 5%)에서 배양을 실시했다. 계대간격은 3일로 하고, 1계대째의 파종 세포밀도를 1×10⁴cells/㎠, 액량을 0.2㎖/㎠로 해서 계대 조작을 실시했다. 2계대째는 파종 세포밀도를 0.9×10⁴cells/㎠, 액량을 0.2㎖/㎠로 해서, 세포배양용의 6구-트리트먼트 플레이트(BDFalcon사)의 각 웰에 2㎖씩 첨가했다. 2계대째 실시 3일 후, 배양 상청액을 제거하고, 실시예 1에 기재된 배지A, B-1, B-2, C-1, C-2, C-3, D, E로 각각 치환했다(액량은 0.1㎖/㎠). 그 다음날에, 각 배지를 회수하고, 각각 새로운 동일 배지로 교환했다. 또, 2계대의 3일후부터는 32℃, 습도 95%, CO₂ 농도 5%로 배양을 실시했다. 상기한 배지의 교환과 횟수를 4일간 연속으로 합계 4회 실시하고, 4회째는 배지의 첨가를 실시하지 않고 배지의 회수만 실시했다. 회수한 배양 상청액(1회째, 2회째, 3회째, 4회째)은 0.22㎛의 구멍 직경의 필터(Millipore사)로 여과하고, 각 회별로 레트로바이러스 상청액으로서 소구분 분주후 -80℃ 보존했다.

2. 레트로바이러스 상청액의 유전자 도입평가

상기한 바와 같이, 배지A∼E를 사용해서 회수한 각 레트로바이러스 상청액에 대해서 유전자 도입효율의 측정을 실시했다. 배지A∼E를 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액 각각에 대해서 5배 희석액을 조제했다. 이때 희석에는 ACD-A(TERUMO CORPORATION사) 및 인간 혈청알부민 「Albuminar 25%」(CSL Behring사)을 각각 5배 희석, 및 12.5배 희석해서 알부민의 최종농도가 각각 5%, 2%가 되도록 생리식염수에 첨가한 것(이하, 5%알부민 용액, 및 2%알부민 용액이라고 한다.)을 사용했다. 유전자 도입용 용기는 24구-nontreated plate(BDFalcon사)를 사용했다. 24구-nontreated plate는 미리 ACD-A로 최종농도 20㎍/㎖가 되도록 희석한 RetroNectin(등록상표, TAKARA BIO INC.)을 각 웰에 0.5㎖ 첨가해서 4℃에서 하룻밤 처리하고, 플레이트로부터 레트로넥틴 용액을 제거한 후, ACD-A를 각 웰에 0.5㎖ 첨가해서 제거하는 세정작업을 2회 실시한 것을 사용했다. 이 플레이트의 각 웰에 각 바이러스 희석액을 1㎖ 첨가하고, 원심처리(32℃, 2000×g, 2시간)했다. 원심후, 각 웰에서 바이러스 희석액 상청액을 제거하고, 인간 혈청알부민 「Albuminar 25%」을 16.67배 희석해서 알부민의 최종농도가 1.5%가 되도록 생리식염수에 첨가한 것(이하, 1.5%알부민 용액이라고 한다.) 0.5㎖씩으로 각 웰을 3회 세정했다. 인간 T임파구성 백혈병세포 SUP-T1(ATCC CRL-1942)을, SUP-T1용의 배양용 배지[10% 소태아혈청을 포함하는 RPMI1640 배지(Sigma Corporation)]에, 1×10⁶cells/㎖이 되도록 현탁했다. 상기의 세정후의 24구-nontreated plate의 각웰에 이 현탁액 1㎖(0.5×10⁶cells/㎠)을 첨가하고, 원심처리(32℃, 1000×g, 10분)했다. 원심후, CO₂ 인큐베이터(37℃, 습도 95%, CO₂농도 5%)에서 1일간 배양을 실시했다. 다음날, SUP-T1용의 배양용 배지를 1㎖ 각각 첨가하고, 추가로 1일간 배양했다. 배양후, 레트로바이러스에 의한 유전자 도입효율을 조사하기 위해서, 형광 리포터 단백질(ZsGreen)의 발현을 조사했다. 감염 배양후의 세포 0.5×10⁶cells를 에펜도르프 튜브로 옮기고, 원심처리(4℃, 500×g, 5분간)로 세포를 침전시켰다. 상청액을 제거한 후, 침전한 세포는 최종농도가 0.5%가 되도록 BSA(소태아혈청알부민, Sigma Corporation사)를 첨가한 인산 버퍼(Gibco사)(이하, '0.5% BSA/PBS' 라고 언급한다.) 950㎕에 현탁하고, 원심처리(4℃, 500×g, 5분간)로 재차 세포를 침전시켰다. 상청액을 재차 제거한 후, 0.5% BSA(Sigma Corporation사)을 첨가한 인산 버퍼(Gibco사) 400㎕의 0.5% BSA/PBS에 현탁하고, 이 현탁액을 플로우 사이타머트리(Flow cytometry) 측정에 적용했다.

3. 플로우 사이타머트리(Flow cytometry) 해석

플로우 사이타머트리 해석은 BD FACSCanto II 플로우 사이타미터(Becton, Dickinson and Compnay)을 사용해서 기기 지시서에 따라서 실시했다. ZsGreen의 발현율의 산출방법은 전방 산란광(FSC), 옆쪽 산란광(SSC)의 2파라미터 히스토그램(x축: FSC, y축: SSC)상에서, 목적세포집단을 게이트로 통제하고, 그 게이트 중의 세포집단을 GFP검출 파라미터의 히스토그램(x축: GFP의 형광강도, y축: 세포수를 나타냄)으로 전개하고, 아이소타입 컨트롤과 비교해서 GFP형광강도가 높은 세포를 ZsGreen양성세포로 정의하고, 전술의 게이트 중 전체 세포수에 대한 ZsGreen 양성세포수의 비율(%)을 유전자 도입율(GT%: Gene Transduction efficiency)로 하고, 및 형광강도(MFI: Mean Fluorescence Intensity)를 측정했다.

유전자 도입효율의 측정결과를 도 1에 나타낸다.

실시예 2-2의 배양방법에 의해 취득한 각 날짜의 바이러스 상청액을 평가하고, 4일간의 바이러스 상청액의 평균값을 산출했다. 도 1에 나타나 있는 바와 같이, 배지B군, C군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액의 유전자 도입효율은 기본배지인 배지A보다도 2배 이상의 유전자 도입효율을 나타냈다. 즉, 배지A보다도 고타이터의 바이러스가 수득되어 고효율로 ZsGreen 유전자가 도입되었다. 또, 배지B군, C군 함께 배지D, E와 비교해도, TSA 또는 ATRA단독보다도 높은 상기 효과가 수득되었다.

또, 도면 중, 「NGMC」는 비유전자 도입세포를 의미하고, 음성대조를 나타낸다. 이하 도 2∼도 15에서도 동일한 의미이다.

형광강도(이하, 유전자 발현강도를 의미함.)의 측정결과를 도 2에 나타낸다.

실시예 2-2의 배양방법에 의해 취득한 각 날짜의 바이러스 상청액을 평가하고, 4일간의 바이러스 상청액의 평균값을 산출했다. 도 2에 나타나 있는 바와 같이, 배지B군, C군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액의 형광강도는 배지A보다도 2배 정도 높은 형광강도를 나타냈다. 즉, 배지A보다도 고타이터의 바이러스가 수득되어 고효율로 유전자가 도입되는 것에 의해 형광 리포터 단백질(ZsGreen)이 고발현되었다. 또, 배지D, E와 비교해도, TSA 또는 ATRA단독보다도 높은 상기 효과가 수득되었다.

실시예 3: NaB 첨가배지의 조제

실시예 1에 기재된 배지A에, ATRA를 최종농도 10nM, 및 100nM이 되도록 첨가하고, 추가로 부티르산 나트륨(NaB)을 최종농도 5mM이 되도록 첨가하고, 배지F-1, F-2를 각각 제작했다. 또, 배지F에 lipid를 용액비(V/V)로 1/100, 1/250, 1/1000이 되도록 첨가하고, 배지G-1, G-2, G-3을 각각 제작했다. 또 배지A에 NaB만 첨가(최종농도 5mM)한 배지H, 및 ATRA만 첨가(최종농도 10nM)한 배지E를 제작했다. 이것들의 배지조성을 표 2에 나타낸다.

실시예 4: 레트로바이러스 생산세포의 배양

실시예 2에 기재된 레트로바이러스 생산세포를 사용해서 바이러스 상청액의 조제를 실시했다. 본 실시예에서는 실시예 3의 배지A, F군, G군, H 및 E를 사용해서, 실시예 2-1과 동일하게 해서 바이러스 상청액을 취득했다. 유전자 도입은 실시예 2-2와 동일하게 수행하고, 유전자 도입효율의 평가는 실시예 2-3과 동일하게 실시했다.

유전자 도입효율의 측정결과를 도 3에 나타낸다.

도 3에 나타나 있는 바와 같이, 배지F군, G군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서의 유전자 도입효율은 배지A보다도 2배 정도 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 즉, 배지F군, G군에서는 배지A보다도 고타이터의 바이러스가 수득되어 고효율고 ZsGreen 유전자가 도입되었다. 또, 배지H, E(NaB 또는 ATRA단독)와 비교해도, 높은 효과가 수득되었다.

형광강도의 측정결과를 도 4에 나타낸다.

실시예 2-2의 배양방법에 의해 취득한 각 날짜의 바이러스 상청액을 평가하고, 4일간의 바이러스 상청액의 평균값을 산출했다. 도 4에 나타나 있는 바와 같이, 배지F군, G군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서 수득된 유전자 도입세포는 배지A를 사용했을 경우보다도 2배 정도 높은 형광강도를 나타냈다. 즉, 배지A보다도 고타이터의 바이러스가 수득되어 고효율로 유전자가 도입되는 것에 의해 형광 리포터 단백질(ZsGreen)이 고발현되었다. 또, 배지H, E를 사용했을 경우와 비교해도 세포의 형광강도는 높았다.

실시예 5: VPA 첨가배지의 조제

실시예 1에 기재된 배지A에, 레티노산(ATRA)을 최종농도 10nM이 되도록 첨가하고, 추가로 밸프로산(VPA)(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)을 최종농도 500㎛, 1mM, 2mM이 되도록 첨가한 배지I-1, I-2, 및 I-3(이하, '배지I군' 이라고 언급한다.)을 제작했다. 또, 비교대조로서, 배지A에 VPA를 최종농도 500㎛, 1mM, 2mM가 되도록 첨가한 배지J-1, J-2,및 J-3(이하, '배지J군' 이라고 언급한다.)을 제작했다. 또, 배지A에 NaB만 첨가(최종농도 5mM)한 배지H, 및 NaB(최종농도 5mM)와 ATRA(최종농도 10nM)를 첨가한 배지F-1을 제작했다. 이것들의 배지조성을 표 3에 나타낸다.

실시예 6: 레트로바이러스 생산세포의 배양

실시예 2에 기재된 레트로바이러스 생산세포를 사용해서 바이러스 상청액의 조제를 실시했다. 본 실시예에서는 실시예 5의 배지A, I군, J군, H, 및 F-1을 사용해서, 실시예 2-1의 방법으로 바이러스 상청액을 취득했다. 단, 바이러스 회수 일수를 실시예 2-1에서는 4일간으로 하고 있지만, 본 실시예에서는 3일간으로 회수한 바이러스 상청액을 혼합해서 평가하고 있다. 유전자 도입은 바이러스 희석을 10배로 한 이외는 실시예 2-2와 동일하게 실시하고, 유전자 도입효율의 평가는 실시예2-3과 동일하게 실시했다.

유전자 도입효율의 측정결과를 도 5에 나타낸다.

도 5에 나타나 있는 바와 같이, 배지I군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서의 유전자 도입효율은 배지A보다도 2배 정도 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 즉, 배지I군에서는 배지A보다도 고타이터의 바이러스가 수득되어 고효율로 ZsGreen 유전자가 도입되었다. 또, 배지J군(VPA 단독)과 비교해도, 높은 효과가 수득되었다. 또, 실시예 4의 도 2의 결과와 같이 배지F-1은 배지H(NaB 단독)과 비교해도, 높은 효과가 수득되었다.

실시예 7

1. 레트로바이러스 생산세포의 제작

국제공개 제2008/153029호 팸플릿에 기재된 코돈 변환형 TCR 및 siRNA 공발현 레트로바이러스 벡터(MS-MA24-siTCR)을 사용해서, HEK293T세포(ATCC CRL-11268)에, Retorovirus Packaging Kit Eco(TAKARA BIO INC.)를 사용해서 제품 프로토콜에 따라 트랜스펙션하고, 각종 에코트로픽 레트로바이러스 상청액을 획득했다. 이 바이러스 상청액을 0.45㎛ 필터(Milex HV, Millipore사)로 여과하고, PG13 세포에 폴리브렌을 사용하는 방법에 의해 감염시키고, 한계희석법에 의해 세포의 클론화를 실시했다.

2. 레트로바이러스 생산세포의 파일럿 스케일 배양

실시예 7-1에서 수득된 클론 세포로부터 제작한 Working Cell Bank(WCB)를 37℃의 워터배스에서 해동했다. 해동된 세포액을 15㎖ 원심튜브로 옮기고, 완전배지[10% 소태아혈청(10% FBS, SAFC Bioscience사)을 포함하는 DMEM 배지(Gibco사)]을 10㎖ 첨가하고, 원심처리(500×g, 5분간, 20℃)를 실시했다. 원심후, 상청액을 제거하고, 10㎖의 완전배지에 현탁해서 셀 카운트를 실시했다. 셀 카운트후, 완전배지를 사용해서, 세포현탁액을 78.5×10⁴cells/㎖로 조제하고, 세포배양용의 100㎜ dish(IWAKI사)에 상기의 세포현탁액 1㎖, 및 완전배지 14.7㎖를 첨가하고, CO₂ 인큐베이터(37℃, 습도 95%, CO₂농도 5%)에서 배양을 실시했다. 계대 간격은 3일로 하고, 1계대째의 파종 세포밀도를 1×10⁴cells/㎠, 액량을 0.2㎖/㎠로 해서 계대 조작을 실시했다. 2계대째는 파종 세포밀도를 1.0×10⁴cells/㎠, 액량을 0.2㎖/㎠로 해서, 세포배양용의 CELLBIND처리 T225플라스크(CORNING사) 1개당에 45.0㎖씩 첨가했다. 2계대째 실시의 3일후, 배양 상청액을 제거하고, 표 4에 기재된 배지H, F-1, K, L,및 B-1로 각각 치환했다(액량은 0.1㎖/㎠). 또, 덱사메타손(DEX)(Nacalai Tesque, Inc.)은 배지K, L에 최종농도 100nM이 되도록 첨가했다. 배지치환 다음날에, 각 배지를 회수하고, 각각 새로운 동일 배지로 교환했다. 또, 2계대의 3일후부터는, 32℃, 습도 95%, CO₂농도 5%로 배양을 실시했다.상 기의 배지의 교환과 횟수를 3일간 연속으로 합계3회 실시하고, 3회째는 배지의 첨가를 실시하지 않고 배지의 회수만 실시했다. 회수한 배양 상청액(1회째, 2회째, 3회째 )은 혼합한 후 0.22㎛의 구멍 직경의 필터(Millipore사)로 여과하고, 레트로바이러스 상청액으로서 소구분 분주후 -80℃ 보존했다

3. 레트로바이러스 상청액의 유전자 도입평가

레트로바이러스 상청액에 대해서 유전자 도입효율의 측정을 실시했다.

레트로넥틴을 25㎍/㎖, 항CD3항체(OKT3, Janssen Pharmaceutical Companies)를 5㎍/㎖가 되도록 PBS에 용해했다. 이 용액을 표면처리한 (tissue culture treated) 6구-플레이트에 각 웰 1㎖씩 첨가하고, 37℃에서 5시간 방치했다. 그 후 용액을 제거하고, GT-T-RetroIII( TAKARA BIO INC., 이하, 'RetroIII' 이라고 언급한다.)을 사용해서 1㎖씩 각 웰을 2회 세정했다. 다음에, RetroIII에 IL-2(NOVARTIS사)를 최종농도 600IU/㎖, 펀지존(fungizon)(Bristol-Myers Squibb사)을 최종농도0.5㎍/㎖, 자기혈장 0.6%가 되도록 조제한 배양용 배지(이하, CM라고 한다.)를 1㎖씩으로 각 웰을 세정하고, 레트로넥틴/항CD3항체 고정화 플레이트를 제작했다.

인간 말초혈에서 분리한 말초혈 단핵구(PBMC)를 0.2×10⁶개/㎖가 되도록, CM에서 조제하고, 이 현탁액 6.7㎖를 피브로넥틴 프래그먼트/항CD3항체 고정화 플레이트에 0.7㎖/㎠가 되도록 첨가하고, 배양을 개시했다(0.14×10⁶㎖/㎠).

배양개시에서 4일째에 유전자 도입조작을 아래와 같이 실시했다. 배지H, F-1, K, L, 및 B-1을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액 각각에 대해서 원액, 5배 희석액을 조제했다. 이 때 희석에는 ACD-A, 5% 알부민 용액 및 2% 알부민 용액을 사용했다. 유전자 도입용 용기는 24구-nontreated plate를 사용했다. 24구-nontreated plate는 미리 ACD-A로 최종농도 20㎍/㎖가 되도록 희석한 RetroNectin을 각 웰에 0.5㎖ 첨가해서 4℃에서 하룻밤 처리하고, 플레이트로부터 RetroNectin 용액을 제거한 후, ACD-A를 사용해서 0.5㎖씩으로 각 웰의 세정을 2회 실시한 것을 사용했다. 이 플레이트의 각 웰에 각 바이러스 희석액을 1㎖ 첨가하고, 원심처리(32℃, 2000×g, 2시간)했다. 원심후, 각 웰에서 바이러스 희석액 상청액을 제거하고, 1.5% 알부민 용액 0.5㎖씩으로 각 웰을 3회 세정했다. 배양세포 현탁액을 회수하고, CM에, 0.145×10⁶cells/㎖가 되도록 현탁했다. 상기의 세정후의 24구-nontreated plate의 각 웰에 이 현탁액 1㎖(0.0725×10⁶cells/㎠)를 첨가하고, 원심처리(32℃, 1000×g, 10분)했다. 원심후, CO2인큐베이터(37℃, 습도 95%, CO₂농도 5%)에서 4시간 배양을 실시했다. 그 후에 세포 현탁액을 CM으로 5배 희석하고, 표면처리한(tissue culture treated) 6웰-플레이트에 첨가해서 배양을 계속했다. 배양개시로부터 7일째에 세포현탁액과 등량의 CM을 첨가하고, 2배 희석해서 배양을 추가로 계속했다.

배양 개시로부터 10일째에, 레트로바이러스에 의한 유전자 도입효율을 조사하기 위해서, MAGE-A4테트라머-PE(Ludwiq사), 및 Human CD8-APCcy7(Becton, Dickinson and Compnay)로 염색하고, 플로우 사이타미터에 의해 CD8양성이며, 또한 테트라머 양성인 세포의 비율을 측정했다. 구체적으로는, 감염 배양후의 세포 0.3×10⁶cells를 에펜도르프 튜브로 이동하고, 원심처리(4℃, 500×g, 5분간)로 세포를 침전시켰다. 상청액을 제거한 후, 침전한 세포는 950㎕의 0.5%BSA/PBS에 현탁하고, 원심처리(4℃, 500×g, 5분간)로 재차 세포를 침전시켰다. 상청액을 재차 제거한 후, MAGE-A4테트라머-PE 1㎕에 0.5% BSA를 8㎕ 첨가한 혼합액으로 현탁하고, 30분, 4℃에서 반응시켰다. 그 후에 Human CD8-APCcy7을 1㎕ 첨가하고, 30분, 4℃에서 반응시켰다. 반응 후, 950㎕의 0.5% BSA/PBS를 첨가하고, 원심처리(4℃, 500×g, 5분간)로 상청액을 제거하는 공정을 2회 실시한 후, 400㎕의 0.5% BSA/PBS에 현탁하고, 이 현탁액을 플로우 사이타머트리 측정에 적용했다.

4. 플로우 사이타머트리 (Flow cytometry) 해석

플로우 사이타머트리 해석은 BDFACSCanto II 플로우 사이타미터를 사용해서 기기 지시서에 따라서 실시했다. CD8 양성세포 중의 테트라머 양성세포의 존재비율의 산출방법은 APCcy7, PE검출 파라미터의 2파라미터 히스토그램(x축: APCcy7의 형광강도, y축: PE의 형광강도를 나타냄.) 상에서, 아이소타입 컨트롤에 의해 APCcy7(CD8), PE(MAGE-A4테트라머) 비발현 세포의 형광강도 영역을 확인 후, 그 영역을 경계로 4분할하고, APCcy7, PE발현세포의 형광강도 영역을 정하고, 그 세포수의 비율(%)을 측정했다. 측정후, 유전자 도입효율(GT%: Gene Transduction efficiency)은 하기의 식에 의해 산출했다.

GT%= CD8, 및 테트라머 양성세포 수 / CD8 양성세포 수

유전자 도입효율의 측정결과를 도 6에 나타낸다. 도 6에 나타나 있는 바와 같이, F-1, K, L, 및 B-1을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액의 도입효율은 기본배지인 배지A에 NaB을 첨가한 배지H보다도 현저하게 높은 유전자 도입효율을 나타냈다 .즉, 실시예 2 및 4에 기재된 형광 단백질발현 바이러스 벡터에 한하지 않고, 또, 실험 스케일이상의 파일럿 스케일에 있어서도, 고타이터의 바이러스가 수득되어 고효율로 목적유전자가 도입되었다.

5. 레트로바이러스 상청액의 RNA 카피 수 평가

레트로바이러스 상청액에 대해서 RNA 카피 수의 측정을 실시했다.

측정은 Retrovirus Titer Set(for Real TIME PCR)(TAKARA BIO INC.)을 사용해서, 취급 설명서의 표준적인 사용방법에 따라서 RNA 카피 수를 산출했다. 결과에 대해서는, 도 7에 나타나 있는 바와 같이 실시예 7-4의 유전자 도입효율의 결과와 같이 ATRA, DEX의 한쪽, 또는 양쪽을 NaB와 조합시키는 것에 의해, 기본배지인 배지A에 NaB를 첨가한 배지H보다도 현저하게 높은 RNA 카피 수(이하, 도면 중 RNA COPY라고 한다.)를 나타냈다.

실시예 8: TSA 첨가배지의 조제 2

배지A에 덱사메타손(DEX)을 최종농도 100nM, 레티노산(ATRA)을 최종농도 1㎛이 되도록 첨가하고, 또한 트리코스타틴A(TSA)를 각각 최종농도 50nM, 500nM가 되도록 첨가한 배지M-1, 및 M-2(이하, '배지M군' 이라고 언급한다.)를 제작했다. 또 배지A에 TSA를 최종농도 50nM, 500nM가 되도록 첨가한 배지D-1,및 D-2(이하, '배지D군' 이라고 언급한다.), NaB만 첨가(최종농도 5mM)한 배지H, 및 NaB(최종농도 5mM), 레티노산(ATRA)을 최종농도 100nM, 덱사메타손(DEX)을 최종농도 100nM 첨가한 배지N을 제작했다. 각 배지의 조성을 표 5에 나타낸다.

실시예 9

1. 레트로바이러스 생산세포의 배양

실시예 7-1에 기재된 레트로바이러스 생산세포를 사용해서 바이러스 상청액의 조제를 실시했다. 본 실시예에서는 실시예 8에 기재된 배지를 사용해서, 실시예 2-1의 방법으로 바이러스 상청액을 취득했다. 단, 바이러스 회수 일수를 실시예 2-1에서는 4일간으로 하고 있지만, 본 실시예에서는 3일간으로 회수한 바이러스 상청액을 혼합해서 평가하고 있다.

2. 레트로바이러스 상청액의 유전자 도입평가

유전자도입은 CD8항체를 Human CD8-FITC(Becton, Dickinson and Compnay)를 사용해서 실시한 이외는 실시예 7-3과 동일하게 실시했다. 유전자 도입효율의 평가는 실시예 7-4과 동일하게 실시했다.

유전자 도입효율의 측정결과를 도 8에 나타낸다. 도 8에 나타나 있는 바와 같이, M-1과 D-1, M-2과 D-2, 및 H와 N을 비교하면, NaB 또는 TSA와, ATRA, DEX를 병용한 배지를 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액의 도입효율은 NaB, TSA 단독첨가 배지인 D군, 및 H보다도 현저하게 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 또, TSA는 50nM보다 500nM에서 효과가 있었다.

3. 레트로바이러스 상청액의 RNA 카피 수 평가

측정은 Retrovirus TiterS et(for Real TIME PCR)을 사용해서, 취급 설명서의 표준적인 사용방법에 따라서 RNA 카피 수를 산출했다. 결과에 대해서는, 도 9에 나타나 있는 바와 같이 실시예 9-2의 유전자 도입효율의 결과와 같이 M-1과 D-1, M-2과 D-2, 및 H와 N을 비교하면, ATRA, DEX의 양쪽을 NaB, 또는 ＴSA와 조합시키는 것에 의해, NaB, 또는 ＴSA 단독첨가 배지보다도 현저하게 높은 RNA 카피 수를 나타냈다. 또, TSA는 50nM보다 500nM에서 효과가 있었다.

실시예 10: TSA 첨가배지의 조제 3

실시예 1과 동일한 방법으로 표 6에 기재된 최종농도가 되도록 배지를 조제했다.

실시예 11: 레트로바이러스 생산세포의 배양

실시예 2에 기재된 레트로바이러스 생산세포를 사용해서 바이러스 상청액의 조제를 실시했다. 실시예 10에 기재된 배지를 사용해서, 실시예 2-1의 방법으로 바이러스 상청액을 취득했다.단, 바이러스 회수 일수를 본실시예에서는 4일간으로 회수해서 혼합한 바이러스 상청액과, 3일간으로 회수해서 혼합한 바이러스 상청액을 평가하고 있다. 유전자도입은 바이러스 희석을 10배로 한 이외는 실시예 2-2와 동일하게 실시하고, 유전자 도입효율 및 형광강도의 평가는 실시예 2-3과 동일하게 실시했다.

유전자 도입효율의 측정결과를 도 10에 나타낸다.

도 10에 나타나 있는 바와 같이, 배지O군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서의 유전자 도입효율은 배지A보다도 6∼8배 정도 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 또, 유전자 도입효율은 3일간보다 4일간 쪽이 대조군으로부터의 상승 효과가 컸었다.

형광강도의 측정결과를 도 11에 나타낸다.

도 11에 나타나 있는 바와 같이, 배지O군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서의 형광강도는 배지A보다도 2∼3.5배 정도 높은 형광강도를 나타냈다.

실시예 12: 9-cis 레티노산(9-cis)(Nacalai Tesque, Inc.), AM80 첨가배지의 조제

실시예 1과 동일한 방법으로 표 7에 기재된 최종농도가 되도록 배지를 조제했다. 여기에서, AM80에 Tamibarotene(Sigma Corporation)을 사용했다.

실시예 13: 레트로바이러스 생산세포의 배양

실시예 2에 기재된 레트로바이러스 생산세포를 사용해서 바이러스 상청액의 조제를 실시했다. 실시예 12에 기재된 배지를 사용해서, 실시예 2-1의 방법으로 바이러스 상청액을 취득했다. 단, 바이러스 회수 일수를 실시예 2-1에서는 4일간으로 하고 있지만, 본 실시예에서는 3일간으로 회수한 바이러스 상청액을 혼합해서 평가하고 있다. 유전자도입은 바이러스 희석을 10배로 한 이외는 실시예 2-2와 동일하게 실시하고, 유전자 도입효율의 평가는 실시예 2-3과 동일하게 실시했다.

유전자 도입효율의 측정결과를 도 12에 나타낸다.

도 12에 나타나 있는 바와 같이, 배지P군, R군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서의 유전자 도입효율은 배지A보다도 1.5∼2배 정도 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 또, 9-cis, AM80 단독의 배지Q군, S군의 유전자 도입효율은 배지A와 동일 정도이거나 감소한다.

실시예 14: 수베로일아닐라이드(suberoylanilide) 하이드록삼산(SAHA)(CAYMAＮ사) 첨가배지의 조제

실시예 1과 동일한 방법으로 표8기재의 최종농도가 되도록 배지를 조제했다.

실시예 15: 레트로바이러스 생산세포의 배양

실시예 2에 기재된 레트로바이러스 생산세포를 사용해서 바이러스 상청액의 조제를 실시했다. 실시예 14에 기재된 배지를 사용해서, 실시예 2-1의 방법으로 바이러스 상청액을 취득했다. 단, 바이러스 회수 일수를 실시예 2-1에서는 4일간으로 하고 있지만, 본 실시예에서는3일간으로 회수한 바이러스 상청액을 혼합해서 평가하고 있다. 유전자도입은 바이러스 희석을 10배로 한 이외는 실시예 2-2와 동일하게 실시하고, 유전자 도입효율의 평가는 실시예 2-3과 동일하게 실시했다.

유전자 도입효율의 측정결과를 도13에 나타낸다.

도 13에 나타나 있는 바와 같이, 배지T군을 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서의 유전자 도입효율은 배지A보다도 1.4∼1.9배 정도 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 또, SAHA농도가 대응하는 U군배지보다도 높은 유전자 도입효율을 나타냈다.

실시예 16: NaB 첨가배지의 조제 2

세포배양용 배지인 DMEM에 비활성화 FBS를 용액비(V/V)로 1/10 첨가한 기본배지(배지V)로 해서, 레티노산(ATRA)을 최종농도 100nM이 되도록 첨가하고, 추가로 부티르산 나트륨(NaB)을 최종농도 5mM가 되도록 첨가하고, 배지W를 제작했다. 또 배지V에 NaB만 첨가(최종농도 5mM)한 배지X, 및 ATRA만 첨가(최종농도 100nM)한 배지Y를 제작했다. 각 배지의 조성을 표 9에 나타낸다.

실시예 17: 레트로바이러스 생산세포의 배양

실시예 2에 기재된 레트로바이러스 생산세포를 사용해서 바이러스 상청액의 조제를 실시했다. 실시예 16에 기재된 배지를 사용해서, 실시예 2-1의 방법으로 바이러스 상청액을 취득했다. 단, 바이러스 회수 일수를 실시예 2-1에서는 4일간으로 하고 있지만, 본 실시예에서는 3일간으로 회수한 바이러스 상청액을 혼합해서 평가하고 있다. 유전자도입은 바이러스 희석을 10배로 한 이외는 실시예 2-2와 동일하게 실시하고, 유전자 도입효율, 형광강도의 평가는 실시예 2-3과 동일하게 실시했다.

유전자 도입효율의 측정결과를 도 14에 나타낸다.

도 14에 나타나 있는 바와 같이, 배지W를 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서의 유전자 도입효율은 배지V보다도 1.2배 정도 높은 유전자 도입효율을 나타냈다.

형광강도의 측정결과를 도 15에 나타낸다.

도 15에 나타나 있는 바와 같이, 배지W를 사용해서 회수한 레트로바이러스 상청액에서의 형광강도는 배지V보다도 1.5배 정도 높은 형광강도를 나타냈다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명의 배지를 사용하는 것에 의해, 높은 바이러스 역가의 바이러스 상청액이 용이하게 수득할 수 있기 때문에, 바이러스 벡터 및 당해 벡터를 함유하는 고역가 조성물을 용이하게 조제하는 것이 가능하게 된다. 본 발명의 배지를 사용해서 수득된 바이러스 벡터나 상기 조성물은 유전자 치료의 분야에서 매우 유용하다.

Claims

바이러스 벡터를 생산하는 능력을 가지는 세포를, 레티노산류 및 히스톤 탈아세틸화 효소 저해물질을 유효성분으로서 포함하는 배지에서 배양하는 공정을 포함하는, 바이러스 벡터의 제조방법.
제1 항에 있어서, 배지가 유효성분으로서 지질류를 추가로 포함하는 제조방법.
제1 항 또는 제2 항에 있어서, 세포가 계속적으로 바이러스 벡터를 생산하는 능력이 있는 세포인 제조방법.
제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터인 제조방법.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 히스톤 탈아세틸화 효소 저해물질이 트리코스타틴A 및 부티르산 나트륨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 적어도 1종의 물질인 제조방법.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 바이러스 벡터.
제6 항에 기재된 바이이러스 벡터를 사용해서 세포를 형질전환하는 것을 특징으로 하는, 형질전환된 세포집단의 제조방법.
제7 항에 기재된 제조방법으로 수득된 형질전환된 세포집단.
제8 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 세포집단.
제8 항에 있어서, 의약의 제조에 사용하는 세포집단.
제8 항에 기재된 세포집단을 유효성분으로서 함유하는 의약.
대상에, 유효량의 제11 항에 기재된 의약을 투여하는 공정을 포함하는, 질병의 치료방법 또는 예방방법.
유효성분으로, 레티노산류 및 히스톤 탈아세틸화 효소 저해물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 벡터 제조용 배지.