CN109206524A - 抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方法和用途，其中抗Claudin18A2嵌合抗原受体，包括依序连接的CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4‑1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区。发明人经过长期的试验，创造性的选择Claudin18A2靶点，同时结合敲除T细胞中的PD‑1蛋白，使得改造后的T细胞提高对消化系统肿瘤，尤其是对胃癌的治疗效果。

Description

抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方 法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方法和用途。

背景技术

PD-1(程序性死亡受体1，programmed death 1)是55KD的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。其胞外区只有1个IgV样区，胞浆区有2个酪氨酸残基，尾部有1个ITIM(immunoreceptor tryosine-based inhibitory motif)。PD-1可表达于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞，以及CD4-CD8-胸腺细胞。PD-1有两个配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，均为B7家族中的新成员。PD-1是免疫抑制性受体，与其配体PD-L1、PD-L2相互作用传递抑制性信号，在免疫应答中发挥负向调控作用。T细胞上的PD-1与肿瘤细胞中的PD-L1/PD-L2的结合，可抑制活化的T细胞攻击肿瘤细胞，导致免疫系统不能发挥全部作用，使肿瘤细胞逃逸。

由于PD-1蛋白在免疫应答中发挥负向调控作用，使得部分肿瘤细胞逃避T细胞的攻击，造成肿瘤细胞的扩散。敲除T细胞中的PD-1蛋白，可扩大T细胞的攻击范围，增强T细胞的免疫能力。本研究中利用Crispr/Cas9系统，敲除T细胞中的PD-1基因，使其不表达PD-1蛋白，打开免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。

申请人进行了深入的研究，并于2017年5月9日提交了申请号为201710322510.4的中国发明专利，公开了一种敲除PD-1的T细胞制备方法，该技术是利用Crispr/Cas9系统来敲除PD-1基因。本发明还涉及Crispr/Cas9技术修饰的T细胞，所述T细胞表面含有PD-1蛋白，可与癌细胞表面的PD-L1蛋白结合，阻碍活化T细胞攻击癌细胞。敲除T细胞中的PD-1基因，打开了免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。

目前，在全球范围内，胃癌占据肿瘤中的第五位，其致死率占据第三位。在东亚和东欧最常见，男性发病率约为女性的2倍。胃癌的发病原因有很多，最常见原因是幽门螺杆菌的感染，占病例总数的60％以上。吸烟、腌制蔬菜和肥胖等饮食因素也是引发胃癌的危险因素。大约10％的病例发生在家庭中，1％到3％的病例是由遗传病引起的遗传综合症，如遗传性弥漫性胃癌。申请人在长期的研究中发现，单纯敲除T细胞中的PD-1基因而制备得到的基因药物，对消化系统肿瘤，尤其是胃癌效果有待于进一步的提升，但是，处于瓶颈阶段的技术提升难度极大，也是本领域的技术难题。

因此，在以上技术的基础上研究一种抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方法和用途，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方法和用途，以提高对消化系统肿瘤，尤其是对胃癌的治疗效果。

第一方面，本发明提供的抗Claudin18A2嵌合抗原受体，包括依序连接的CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述CD8αLeader核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；Claudin18A2抗原结合区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；CD8Hinge区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；CD8跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；CD28共刺激区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；4-1BB共刺激区核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；CD3ζ信号传导区核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为一种优选的技术方案，所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体采用包括如下步骤的方法制备得到：

(1)分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区合成其整个表达框并插入克隆载体pUC57上得到pUC-Claudin18A2；

(2)将pUC-Claudin18A2进行双酶切，利用琼胶电泳将含有Claudin18A2DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Claudin18A2DNA片段，即本发明所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体。

第二方面，本发明提供的抗Claudin18A2嵌合抗原受体修饰的T细胞，所述T细胞含有表达如上所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体的重组表达载体(及抗Claudin18A2嵌合抗原受体修饰的)、且该T细胞敲除了PD-1基因。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述T细胞是自体的T细胞；所用T细胞的数量为0.5×10⁶-1×10⁹/Kg。通常所用的T细胞的剂量为0.5×10⁶-1.0×10⁷/kg。

重组表达载体采用如下步骤制备得到：分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区合成其整个表达框并插入pLent-EF1α载体(购自Vigene公司)BamHI-NotI位点(如图2)，转化到E.coli(Top10)，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2。

第三方面，本发明提供T细胞制备方法，包括如下步骤：

S1、将T细胞的PD-1基因进行敲除后，利用磁珠分选；

S2、将获得的敲除PD-1的T细胞大量扩增后，利用CAR-Claudin18A2慢病毒颗粒进行对上述T细胞进行病毒感染，获得表达CAR-Claudin18A2的T细胞。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述步骤S1更具体为：(1)用pH为7.2的PBS(购自Miltenyi公司)配置0.5％的BSA(购自Miltenyi公司)和2mM的EDTA(购自Miltenyi公司)，1:20稀释分选缓冲液。(2)用缓冲液重悬2×107个敲除PD-1的T细胞，用30um的尼龙网(避免堵塞柱子)过滤，300g离心10min，弃上清。(3)加入缓冲液重悬细胞，重复上述操作一次，离心后弃掉上清，加入100uL的缓冲液，加入10uL的人源化单克隆抗体PD-1-APC(抗体购自Miltenyi公司)，混匀，4℃静置15min。(4)加入2mL的细胞缓冲液清洗，300g离心10min，加入100uL的缓冲液重悬细胞。(5)加入10uL连接磁珠的APC抗体，混匀，4℃静置15min。(6)加入2mL的细胞缓冲液清洗，300g离心10min，加入100uL的缓冲液重悬细胞。(7)准备好MS分离柱(购自德国Miltenyi公司)，放置在MASC分离器上，并用500uL的缓冲液清洗MS柱子，把细胞悬液倒入柱子中，收集流出的液体。(8)用500uL的缓冲液冲洗柱子，重复三次，收集流出的液体，即液体中含有的细胞均为敲除PD-1的T细胞。

本发明中，作为一种优选的技术方案，步骤S2中，所述CAR-Claudin18A2慢病毒颗粒采用包括如下步骤的方法制备得到：复苏293T细胞，一定培养后加入重组质粒pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2、与慢病毒包装质粒psPAX2、pMDNA2G转染293T细胞，得到CAR-Claudin18A2慢病毒颗粒。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述重组质粒pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2采用包括如下步骤的方法制备得到：将抗Claudin18A2嵌合抗原受体插入pLent-EF1α载体，转化到E.coli，经测序正确后，提取质粒，获得重组表达载体pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2。

重组质粒pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2的详细步骤为：

分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区委托北京博迈德基因技术有限公司合成其整个表达框(Claudin18A2模块示意见图1(完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1))并连接到克隆载体pUC57上，因此命名为pUC-Claudin18A2，同时将pUC-Claudin18A2和pLent-EF1α载体进行Fast Digest AsiSI(购自NEB公司)和Fast Digest NotI(购自NEB公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有Claudin18A2DNA片段和线性化的pLent-EF1αDNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500ml DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500ml WashBuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉，重复一次。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Claudin18A2DNA片段和线性化的pLent-EF1αDNA片段。

将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Claudin18A2质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Claudin18A2DNA：6μl；线性化的pLent-EF1αDNA：2μl。

将上述pLent-Claudin18A2转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-Claudin18A2质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl HBC Buffer，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。

将上述的pLent-Claudin18A2质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述病毒感染包括如下步骤：将PD-1慢病毒颗粒重悬培养状态良好的T细胞，将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为3:1，CO2培养箱中培养后，再用新鲜培养基稀释一倍，继续培养后收集细胞去除剩余的病毒颗粒进行正常培养即得到利用抗Claudin18A2嵌合抗原受体修饰、且敲除PD-1的T细胞。

第四方面，本发明提供了抗Claudin18A2嵌合抗原受体修饰的T细胞用途，是指抗Claudin18A2嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备治疗消化道肿瘤(尤其是胃癌)的药物中能够得以应用。所述药物形式包括但不限于试剂盒。

试剂盒，包括

(1)获得如上所述的稳定表达抗Claudin18A2嵌合抗原受体、且敲除PD-1基因的T细胞；

(2)稀释液。

由于采用以上技术方案，本发明具有如下有益效果：

本发明首先采用了敲除T细胞中的PD-1蛋白的方法，由于PD-1蛋白在免疫应答中发挥负向调控作用，使得部分肿瘤细胞逃避T细胞的攻击，造成肿瘤细胞的扩散，而敲除T细胞中的PD-1蛋白，使其不表达PD-1蛋白，打开免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能，可扩大T细胞的攻击范围，增强T细胞的免疫能力。本发明采用更简单的方法实现T细胞中PD-1基因的敲除，简化了程序。

如背景技术所述，申请人在长期的研究中发现，单纯敲除T细胞中的PD-1基因而制备得到的基因药物，对消化系统肿瘤，尤其是胃癌效果有待于进一步的提升，但是，处于瓶颈阶段的技术提升难度极大，也是本领域的技术难题。发明人经过大量反复的试验，最终确定，本发明采用了宿主细胞为一种异质T淋巴细胞，T细胞的优势很多，包括增殖速度快、具有识别肿瘤的机制、杀瘤谱广、典型的个性化生物治疗模型。而封闭蛋白18(Claudin 18)是位于上皮和内皮的紧密连接处的内在膜蛋白，分子量为27.9KD。封闭蛋白包含4个跨膜区、2个胞外连接环，N端和C端均在胞内。根据氨基酸序列的不同，分为Claudin18A1和Claudin18A2两个剪接变体。Claudin18A1蛋白在正常肺细胞中有选择性的表达，而Claudin18A2蛋白只在胃细胞中表达，而且只在有差异的短寿命的胃细胞中表达。但是，在各种肿瘤组织中发现了Claudin18A2的表达，例如胃癌、食道癌、胰腺癌、肺癌、胆囊癌、卵巢癌等。因此，选择对胃正常细胞无毒副作用的Claudin18A2靶点对治疗胃癌有重要意义。

发明人经过长期的试验，创造性的选择Claudin18A2靶点，同时结合敲除T细胞中的PD-1蛋白，使得改造后的T细胞提高对消化系统肿瘤，尤其是对胃癌的治疗效果。

附图说明

图1为本发明所述的嵌合抗原受体CAR-Claudin18A2融合基因片段的设计图。

图2为本发明所述的慢病毒表达载体pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2的图谱。

图3为本发明所述的流式细胞术检测CAR-Claudin18A2分别感染T细胞(上)和敲除PD-1的T细胞(下)的效率图。

图4为本发明中CAR-T细胞对胃癌细胞系KATOⅢ的杀伤率。

图5为本发明中CAR-T细胞对SCID小鼠肿瘤生长的抑制效率。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明技术方案进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

抗Claudin18A2嵌合抗原受体，包括依序连接的CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区，完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1。

CAR-Claudin18A2各模块序列

(1)CD8αLeader(SEQ ID NO.2)

(2)Claudin18A2抗原结合区(SEQ ID NO.3)

(3)CD8Hinge区(SEQ ID NO.4)

(4)CD8跨膜区(SEQ ID NO.5)

(5)CD28共刺激区(SEQ ID NO.6)

(6)4-1BB共刺激区(SEQ ID NO.7)

(7)CD3ζ信号传导区(SEQ ID NO.8)。

实施例2

所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体采用包括如下步骤的方法制备得到：

(1)分别按实施例1CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区的顺序委托北京博迈德基因技术有限公司合成其整个表达框(Claudin18A2模块示意见图1)，并插入克隆载体pUC57上，得到的产物命名为pUC-Claudin18A2，；

(2)将pUC-Claudin18A2进行双酶切，利用琼胶电泳将含有Claudin18A2DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Claudin18A2DNA片段。本实施例中，步骤(2)的详细步骤如下：将pUC-Claudin18A2进行Fast Digest AsiSI(购自NEB公司)和Fast Digest NotI(购自NEB公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将把含有Claudin18A2DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500ml DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500ml Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉，重复一次。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体，为纯化的Claudin18A2DNA片段，即本发明所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体。

实施例3

pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2表达载体的构建

重组表达载体采用如下步骤制备得到：分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区合成其整个表达框并插入pLent-EF1α载体(购自Vigene公司)BamHI-NotI位点(如图2)，转化到E.coli(Top10)，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2。

重组质粒pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2的详细步骤为：

分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区委托北京博迈德基因技术有限公司合成其整个表达框(Claudin18A2模块示意见图1、完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1))并连接到克隆载体pUC57上，因此命名为pUC-Claudin18A2，同时将pUC-Claudin18A2和pLent-EF1α载体进行Fast Digest AsiSI(购自NEB公司)和Fast Digest NotI(购自NEB公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有Claudin18A2DNA片段和线性化的pLent-EF1αDNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500ml DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500ml WashBuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉，重复一次。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Claudin18A2DNA片段和线性化的pLent-EF1αDNA片段。

将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Claudin18A2质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Claudin18A2DNA：6μl；线性化的pLent-EF1αDNA：2μl。

将上述pLent-Claudin18A2转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-Claudin18A2质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl HBC Buffer，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。

将上述的pLent-Claudin18A2质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。

实施例4

表达抗Claudin18A2嵌合抗原受体的T细胞，T细胞含有如实施例3所述的重组表达载体pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2，用以表达抗Claudin18A2嵌合抗原受体，同时，该T细胞敲除了PD-1基因。

所述T细胞是自体的T细胞；所用T细胞的数量为0.5×10⁶-1×10⁹/Kg。通常所用的T细胞的剂量为0.5×10⁶-1.0×10⁷/kg。

实施例5

T细胞制备方法，包括如下步骤：

S1、将T细胞的PD-1基因进行敲除后，利用磁珠分选；

本实施例中，更详细的步骤为：(1)用pH为7.2的PBS(购自Miltenyi公司)配置0.5％的BSA(购自Miltenyi公司)和2mM的EDTA(购自Miltenyi公司)，1:20稀释分选缓冲液。(2)用缓冲液重悬2×107个敲除PD-1的T细胞，用30um的尼龙网(避免堵塞柱子)过滤，300g离心10min，弃上清。(3)加入缓冲液重悬细胞，重复上述操作一次，离心后弃掉上清，加入100uL的缓冲液，加入10uL的人源化单克隆抗体PD-1-APC(抗体购自Miltenyi公司)，混匀，4℃静置15min。(4)加入2mL的细胞缓冲液清洗，300g离心10min，加入100uL的缓冲液重悬细胞。(5)加入10uL连接磁珠的APC抗体，混匀，4℃静置15min。(6)加入2mL的细胞缓冲液清洗，300g离心10min，加入100uL的缓冲液重悬细胞。(7)准备好MS分离柱(购自德国Miltenyi公司)，放置在MASC分离器上，并用500uL的缓冲液清洗MS柱子，把细胞悬液倒入柱子中，收集流出的液体。(8)用500uL的缓冲液冲洗柱子，重复三次，收集流出的液体，即液体中含有的细胞均为敲除PD-1的T细胞。

S2、将获得的敲除PD-1的T细胞大量扩增后，利用CAR-Claudin18A2慢病毒颗粒进行对上述T细胞进行病毒感染，获得表达CAR-Claudin18A2的T细胞；该步骤更详细为：将收集到的敲除PD-1的T细胞加入细胞培养基进行扩增培养，每隔三天进行倍比加液，细胞状态良好时进行慢病毒感染；复苏293T细胞，培养2天，使其细胞状态达到最佳。取6×105个细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备。转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养基(购自Gibco公司)，37℃温箱中培养1h。重组质粒pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2、与慢病毒包装质粒psPAX2、pMDNA2G采用脂质体转染法转染293T细胞。48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化。72h后将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存；用上述慢病毒分别感染T细胞和敲除PD-1的T细胞。从-80℃拿出2ml病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺(购自Sigma公司)加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml。用该病毒液重悬1×106个T细胞和敲除PD-1的T细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为3:1，400g，90min。37℃，5％的CO2培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒进行正常培养，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。通过流式细胞术检测嵌合抗原受体表达。分别以未感染的T淋巴细胞和敲除PD-1的T细胞作为阴性对照，重组pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2慢病毒感染T细胞其阳性率44.1％，感染敲除PD-1的T细胞其阳性率为41.0％。

实施例6

CAR-Claudin18A2修饰敲除PD-1的T细胞对人胃癌细胞KATOⅢ的杀伤活性研究

体外毒性实验使用的材料如下：

以人胃癌细胞系KATOⅢ作为靶细胞，效应细胞为CAR-Claudin18A2修饰敲除PD-1的T细胞、CAR-Claudin18A2修饰的T细胞、敲除PD-1的T细胞。

效靶比视情况分别为20:1，10:1和5:1，靶细胞数量为1×104/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。检测时间为第4h。

其中各实验组和各对照组如下：

各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的效应细胞，

对照组1：靶细胞最大释放LDH，

对照组2：靶细胞自发释放LDH，

对照组3：效应细胞自发释放LDH。

检测方法：采用非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。

细胞毒性计算公式为：

实验结果表明：

具体如图4所示，本发明的表达嵌合抗原受体CAR-Claudin18A2的敲除PD-1的T细胞、表达CAR-Claudin18A2的T细胞和敲除PD-1的T细胞对人胃癌细胞系KATOⅢ均表现出特异性细胞毒性作用，但是前者的细胞毒性作用要明显高于后两者，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强。其中CAR-Claudin18A2修饰敲除PD-1的T细胞在效靶比20:1时对胃癌细胞KATOⅢ的细胞毒性高达93.2％，而CAR-Claudin18A2修饰的T细胞和敲除PD-1的T细胞对胃癌细胞KATOⅢ的细胞毒性分别为42％、39％。

效靶比依赖性的数据进一步显示本发明的表达嵌合抗原受体CAR-Claudin18A2的敲除PD-1的T细胞对胃癌细胞KATOⅢ的特异性细胞毒性作用。

实施例7

CAR-T细胞对SCID小鼠肿瘤生长抑制作用

18-22g雄性SCID小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，收集对数期的胃癌细胞KATOⅢ细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至2×10⁵个/mL。无菌条件下，小鼠左腋下接种0.2mL胃癌细胞KATOⅢ细胞悬浮液，观察3-5d，待腋下出现米粒大小较硬的结节作为建模成功的标准。

SCID胃癌模型小鼠(游标卡尺量取皮下肿瘤组织块的大小为90-100mm³)随机分成5组，每组20只，开始注射治疗实验。实验组分别为：

a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；

b.治疗一组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只正常T细胞；

c.治疗二组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只敲除PD-1的T细胞；

d.治疗三组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只CAR-Claudin18A2修饰的T细胞。

e.治疗四组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只CAR-Claudin18A2修饰的敲除PD-1的T细胞。

每周免疫上述各组小鼠一次，连续免疫两周，每天通过游标卡尺量取各个实验组小鼠皮下肿瘤组织块大，并记录，用肿块均值绘制肿瘤生长曲线图，结果如图5所示。从第一次免疫CAR-Claudin18A2修饰的敲除PD-1的T细胞起10天内，91％小鼠几乎触摸不到肿瘤。同时从第一次免疫CAR-Claudin18A2修饰的T细胞起10天内，40％的小鼠触摸到的肿瘤在缩小；从第一次免疫敲除PD-1的T细胞起10天内，35％的小鼠触摸到的肿瘤在缩小。说明本发明中的CAR-Claudin18A2修饰敲除PD-1的T细胞打开了免疫系统的抑制作用，起到了强强联合的效果。

实施例8

试剂盒，包括

(1)获得如上所述的稳定表达抗Claudin18A2嵌合抗原受体、且敲除PD-1基因的T细胞；

(2)稀释液。

使用说明书，包括如实施例6所述的步骤。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120>抗Claudin18A2嵌合抗原受体、其修饰的T细胞及T细胞制备方法和用途

<130> 2017

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 1

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccccaggtgc agctggtgca atctgggtct gagttgaaga agcctggggc ctcagtgaag 120

gtttcctgca aggcttctgg atacaccttc actaattatg gtatgaattg ggtgcgacag 180

gcccctggac aagggcttga gtggatggga tggatcaaca ccaacactgg ggaaccaacg 240

tatgcccagg gcttcacagg acggtttgtc ttctccttgg acacctctgt cagcacggca 300

tatctgcaga tcagcagcct aaaggctgag gacactgccg tgtattactg tgcgagactt 360

ggattcggga atgctatgga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagga 420

ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgga ggaggaggaa gcgacatcgt gatgacccag 480

tctccagact ccctggctgt gtctctgggc gagagggcca ccatcaactg caagtccagc 540

cagagtcttt taaatagcgg aaaccaaaag aactacttag cttggtacca gcagaaacca 600

ggacagcctc ctaagctgct catttactgg gcatctaccc gggaatccgg ggtccctgac 660

cgattcagtg gcagcgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaggct 720

gaagatgtgg cagtttatta ctgtcagaat gattatagtt atcctctcac tttcggcgga 780

gggaccaagg tggagatcaa aaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcag taagaggagc 1020

aggctcctgc acagtgacta catgaacact ccccgccgcc ccgggcccac cagcaagcat 1080

taccagccct atgccccacg cgacttcgca gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa 1140

ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1200

ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1260

agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1320

aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1380

atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1440

gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1500

gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1560

cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1584

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 2

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccc 63

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 3

caggtgcagc tggtgcaatc tgggtctgag ttgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcact aattatggta tgaattgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacacca acactgggga accaacgtat 180

gcccagggct tcacaggacg gtttgtcttc tccttggaca cctctgtcag cacggcatat 240

ctgcagatca gcagcctaaa ggctgaggac actgccgtgt attactgtgc gagacttgga 300

ttcgggaatg ctatggacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcaggagga 360

ggaggaagcg gaggaggagg aagcggagga ggaggaagcg acatcgtgat gacccagtct 420

ccagactccc tggctgtgtc tctgggcgag agggccacca tcaactgcaa gtccagccag 480

agtcttttaa atagcggaaa ccaaaagaac tacttagctt ggtaccagca gaaaccagga 540

cagcctccta agctgctcat ttactgggca tctacccggg aatccggggt ccctgaccga 600

ttcagtggca gcgggtctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct gcaggctgaa 660

gatgtggcag tttattactg tcagaatgat tatagttatc ctctcacttt cggcggaggg 720

accaaggtgg agatcaaa 738

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 4

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 5

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 6

<211> 114

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 6

agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca ctccccgccg ccccgggccc 60

accagcaagc attaccagcc ctatgcccca cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 114

<210> 7

<211> 126

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 7

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210>8

<211> 336

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 8

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims (10)

1.抗Claudin18A2嵌合抗原受体，其特征在于，包括依序连接的CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区。

2.如权利要求1所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8αLeader核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；Claudin18A2抗原结合区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；CD8 Hinge区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；CD8跨膜区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；CD28共刺激区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；4-1BB共刺激区核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；CD3ζ信号传导区核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.如权利要求2所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求1所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体采用包括如下步骤的方法制备得到：

(1)分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区合成其整个表达框并插入克隆载体pUC57上得到pUC-Claudin18A2；

(2)将pUC-Claudin18A2进行双酶切，利用琼胶电泳将含有Claudin18A2DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Claudin18A2 DNA片段，即本发明所述的抗Claudin18A2嵌合抗原受体。

5.表达抗Claudin18A2嵌合抗原受体的T细胞，其特征在于：所述T细胞含有如上所述抗Claudin18A2嵌合抗原受体的重组表达载体、且该T细胞敲除了PD-1基因。

6.如权利要求5所述的T细胞，其特征在于，所述T细胞是自体的T细胞；所用T细胞的数量为0.5×10⁶-1×10⁹/Kg。通常所用的T细胞的剂量为0.5×10⁶-1.0×10⁷/kg。

7.如权利要求5所述的T细胞，其特征在于，重组表达载体采用如下步骤制备得到：分别按CD8αLeader、Claudin18A2抗原结合区、CD8的Hinge区和跨膜区、4-1BB和CD28的共刺激区、CD3ζ的信号传导区合成其整个表达框并插入pLent-EF1α载体BamHI-NotI位点，转化到E.coli，经测序正确后，提取质粒，获得重组表达载体pLent-EF1α-CAR-Claudin18A2。

8.T细胞制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将T细胞的PD-1基因进行敲除后，利用磁珠分选；

S2、将获得的敲除PD-1的T细胞大量扩增后，利用CAR-Claudin18A2慢病毒颗粒进行对上述T细胞进行病毒感染，获得表达CAR-Claudin18A2的T细胞。

9.抗Claudin18A2嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备治疗消化道肿瘤的药物方面的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：所述药物的形式包括试剂盒，所述试剂盒，包括

(1)获得如上所述的稳定表达抗Claudin18A2嵌合抗原受体、且敲除PD-1基因的T细胞；

(2)稀释液。