CN112079932A

CN112079932A - 一种用于肝癌治疗的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN112079932A
Application number: CN202011000749.8A
Authority: CN
Inventors: 朱建高; 杨文君
Original assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2040-09-22
Also published as: CN112079932B

Abstract

本发明公开了一种用于肝癌治疗的嵌合抗原受体及其应用。所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、抗GPC3单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4‑1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、信号肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人IFN全长。本发明以GPC3作为抗原靶点设计开发新一代CAR‑T细胞治疗产品，并在GPC3‑CAR的C末端增加基因优化的人全长干扰素(IFN)片段。与仅表达GPC3‑CAR的CAR‑T细胞相比，表达GPC3‑CAR‑IFN的CAR‑T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力，进一步提高了CAR‑T细胞治疗肿瘤的安全性和有效性。

Description

一种用于肝癌治疗的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于肝癌治疗的嵌合抗原受体及其应用，特别涉及一种包含GPC3-CAR并且分泌细胞因子的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

肝癌(HCC)是全世界范围发病率和死亡率最高的几种恶性肿瘤之一，发病率排名第五，而死亡率排名第三。目前肝癌的主要治疗方式仍然以手术切除为主。而肝癌的术后复发率极高，5年生存率仅有10％左右。靶向治疗药物(如索拉非尼)也仅能延长患者平均生存期2到3个月。事实上，至今仍没有更有效的肝癌治疗手段。

肿瘤免疫治疗由于其副作用小、治疗效果明显，正逐渐成为未来肿瘤治疗的发展方向，被称为继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。其中，嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗由于在血液肿瘤中取得了显著疗效，正在成为一种富有前景的免疫治疗策略。CAR-T细胞指的是一种经过人工基因改造的在细胞表面表达嵌合型抗原受体(CAR)的T细胞。CAR是CAR-T的核心部件，赋予T细胞以组织相容性抗原(HLA)非依赖的方式识别肿瘤表面肿瘤相关抗原(TAA)的能力。因此，CAR-T细胞在体内能特异性靶向表达有TAA表面标记的肿瘤细胞，并通过激活T细胞免疫反应杀伤肿瘤细胞。

CAR-T技术最早在1993年由以色列科学家Eshhar Zelig设计并报道，并在之后的二十多年中不断优化和完善。在抗原存在情况下，T细胞需要按照一定顺序依次接受三种信号才能完全激活，并且正常的增殖和分化。这三种信号分别是：第一信号，抗原结合的T细胞受体(TCR)和CD3胞内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)转导信号(CD3ζ)；第二信号，协同刺激信号，包括CD28、CD137、CD134等表面受体；第三信号，细胞因子，例如I型干扰素、白介素12(IL-12)等。CAR-T设计考虑到了T细胞激活的免疫学特性，CAR的结构包含胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8、CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。目前市场主流的CAR设计为第二代CAR，即在CAR的胞内信号区提供T细胞激活所必须的第一信号(ITAM结构域)和第二信号(B7/CD28或4-1BB/CD137胞内结构域)，能够引起T淋巴细胞的持续增殖，提高T细胞的细胞毒性、增殖活性等。

CAR的设计过程中，靶点的选择尤为关键。作为CAR的靶点，必须同时满足以下几个条件：在肿瘤细胞中高表达；在正常组织中不表达或低表达；在肿瘤细胞表面表达。如果靶点选择不当，可能造成CAR T淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤，造成脱靶毒性。

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3，又称DGSX，GTR2-2，MXR7，OCI-5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白，通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚依附在细胞膜上，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被蛋白酶剪切产生40kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的C末端肽。GPC3高度表达于胎儿肝脏以及HCC，而不表达于正常成年人的肝组织和其他正常组织，其表达水平与肝癌的发生发展有十分密切的关系。因此，GPC3被认为是肝癌治疗的绝佳靶点。目前，已有研究组开发出靶向GPC3的CAR-T用于HCC治疗。临床前研究证实，靶向GPC3的CAR-T细胞能特异性杀伤GPC3阳性的肿瘤细胞，并且有效抑制小鼠体内病人来源HCC移植物的生长。该结果提示GPC3有望成为CAR-T治疗HCC的有效靶点。

除了靶点本身的适用性和脱靶风险以外，CAR本身的设计也需要有利于在病人体内长期存留并发挥抗肿瘤活性，以提高肿瘤治疗的有效性。尤其对有些T细胞活性较差的病人，CAR-T设计就应当考虑增加CAR-T的持续增殖能力。现有大多数CAR-T普遍表现出体内持续存活能力不足的缺陷。而盲目加大CAR-T细胞的使用剂量，容易造成较强的毒副作用，如炎症因子风暴和中枢神经系统毒性，反过来降低CAR-T疗法的安全性。另外，对于实体瘤的肿瘤免疫疗法来说，免疫抑制性微环境通常是限制免疫细胞对肿瘤有效杀伤的主要原因之一。因此，仍然迫切需要对CAR的设计进行改造，克服肿瘤的免疫抑制微环境，并且进一步提高CAR-T细胞的活性和增殖能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于肝癌治疗的嵌合抗原受体及其应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种嵌合抗原受体。

本发明提供的嵌合抗原受体依次包括抗GPC3单链抗体(简称GPC3 scFv)、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人IFN全长。

进一步的，所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、GPC3 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、信号肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人IFN全长。

所述先导肽可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。在本发明的一个具体实施例中，所述先导肽为人CD8先导肽。

所述自切割肽可为本领域常见的任何一种自切割肽，包括E2A、F2A、P2A、T2A等。所述自切割肽是一种来源于病毒的“自裂解”小肽，其平均长度可为18-22个氨基酸。所述自切割肽作用机理如下：在翻译过程中会形成独特的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。基因工程中利用2A元件可以实现不同蛋白的串联表达。在本发明的一个具体实施例中，所述自切割肽为P2A肽。

所述信号肽可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。在本发明的一个具体实施例中，所述信号肽为CSF2RA信号肽。

所述人IFN全长可为人IFNα2a全长或人IFNα2b全长或人IFNβ全长。在本发明的一个具体实施例中通过实验证明：较GPC3-CAR相比，在GPC3-CAR的C末端增加人IFNα2b全长片段后表达GPC3-CAR-IFNα2b的CAR-T细胞在动物体内具有更强的肿瘤杀伤能力。由于本领域技术人员公知，人IFNα2a和人IFNα2b的氨基酸序列高度相似，仅在第23位氨基酸不同(人IFNα2a第23位氨基酸是K，人IFNα2b第23位氨基酸是R，属于保守性取代)。而人IFNβ同样属于I型干扰素，与上述二者相比生物学功能相近，均具有诱导肿瘤细胞凋亡和调节免疫细胞活性的作用。临床研究中常常将IFNα2和IFNβ互相替代使用。因此申请人认为上述三种基因(人IFNα2a全长、人IFNα2b全长和人IFNβ全长)的任一种均具有对CAR-T细胞增效的作用，均属于本发明的保护范围。

所述人CD8先导肽为如下A1)或A2)中的任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第1-21位所示的多肽或蛋白质；

A2)将SEQ ID No.4第1-21位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述GPC3 scFv为如下B1)或B2)中的任一种：

B1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第22-263位所示的蛋白质；

B2)将SEQ ID No.4第22-263位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人CD8铰链跨膜区为如下C1)或C2)中的任一种：

C1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第264-332位所示的蛋白质；

C2)将SEQ ID No.4第264-332位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人4-1BB胞内区为如下D1)或D2)中的任一种：

D1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第333-379位所示的蛋白质；

D2)将SEQ ID No.4第333-379位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人CD3ζ胞内区为如下E1)或E2)中的任一种：

E1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第380-491位所示的蛋白质；

E2)将SEQ ID No.4第380-491位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述P2A肽为如下F1)或F2)中的任一种：

F1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第492-517位所示的多肽或蛋白质；

F2)将SEQ ID No.4第492-517位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述CSF2RA信号肽为如下G1)或G2)中的任一种：

G1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第518-539位所示的多肽或蛋白质；

G2)将SEQ ID No.4第518-539位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。

所述EGFRt蛋白为如下H1)或H2)中的任一种：

H1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第540-874位所示的蛋白质；

H2)将SEQ ID No.4第570-874位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人IFNα2b全长为如下I1)或I2)中的任一种：

I1)氨基酸序列是SEQ ID No.4第901-1088位所示的蛋白质；

I2)将SEQ ID No.4第901-1088位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人IFNα2a全长为如下J1)或J2)中的任一种：

J1)氨基酸序列是SEQ ID No.5第901-1088位所示的蛋白质；

J2)将SEQ ID No.5第901-1088位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

所述人IFNβ全长为如下K1)或K2)中的任一种：

K1)氨基酸序列是SEQ ID No.6第901-1087位所示的蛋白质；

K2)将SEQ ID No.6第901-1087位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。

更进一步的，所述嵌合抗原受体为如下(1)-(4)中的任一种：

(1)氨基酸序列是SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的蛋白质；

(2)在SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

(3)将SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

(4)与(1)-(3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述任一所述蛋白质中，所述标签具体如表1所示。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

为了实现上述目的，本发明又提供了与上述嵌合抗原受体相关的生物材料。

本发明提供的与上述嵌合抗原受体相关的生物材料为下述1)至8)中的任一种：

1)编码上述嵌合抗原受体的核酸分子；

2)含有1)所述核酸分子的表达盒；

3)含有1)所述核酸分子的重组载体；

4)含有2)所述表达盒的重组载体；

5)含有1)所述核酸分子的细胞系；

6)含有2)所述表达盒的细胞系；

7)含有3)所述重组载体的细胞系；

8)含有4)所述重组载体的细胞系。

上述1)中，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括GPC3 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、自切割肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列、自切割肽的编码基因序列和人IFN全长的编码基因序列。

进一步的，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、GPC3 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、CSF2RA信号肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、人IFN全长的编码基因序列。所述人IFN全长的编码基因序列可为人IFNα2a全长的编码基因序列或人IFNα2b全长的编码基因序列或人IFNβ全长的编码基因序列。

所述人CD8先导肽的编码基因序列为如下a1)-a3)任一所示的基因：

a1)SEQ ID No.1第1-63位所示的DNA分子；

a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD8先导肽的DNA分子；

a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD8先导肽的DNA分子。

所述GPC3 scFv的编码基因序列为如下b1)-b3)任一所示的基因：

b1)SEQ ID No.1第64-789位所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述GPC3 scFv的DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述GPC3 scFv的DNA分子。

所述人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为如下c1)-c3)任一所示的基因：

c1)SEQ ID No.1第790-996位所示的DNA分子；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD8铰链跨膜区的DNA分子；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD8铰链跨膜区的DNA分子。

所述人4-1BB胞内区的编码基因序列为如下d1)-d3)任一所示的基因：

d1)SEQ ID No.1第997-1137位所示的DNA分子；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人4-1BB胞内区的DNA分子；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人4-1BB胞内区的DNA分子。

所述人CD3ζ胞内区的编码基因序列为如下e1)-e3)任一所示的基因：

e1)SEQ ID No.1第1138-1473位所示的DNA分子；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD3ζ胞内区的DNA分子；

e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD3ζ胞内区的DNA分子。

所述P2A肽的编码基因序列为如下f1)-f3)任一所示的基因：

f1)SEQ ID No.1第1474-1551位所示的DNA分子；

f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述P2A肽的DNA分子；

f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述P2A肽的DNA分子。

所述CSF2RA信号肽的编码基因序列为如下g1)-g3)任一所示的基因：

g1)SEQ ID No.1第1552-1617位所示的DNA分子；

g2)与g1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述CSF2RA信号肽的DNA分子；

g3)在严格条件下与g1)或g2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述CSF2RA信号肽的DNA分子。

所述EGFRt蛋白的编码基因序列为如下h1)-h3)任一所示的基因：

h1)SEQ ID No.1第1618-2622位所示的DNA分子；

h2)与h1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述EGFRt蛋白的DNA分子；

h3)在严格条件下与h1)或h2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述EGFRt蛋白的DNA分子。

所述人IFNα2b全长的编码基因序列为如下i1)-i3)任一所示的基因：

i1)SEQ ID No.1第2701-3264位所示的DNA分子；

i2)与i1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人IFNα2b全长的DNA分子；

i3)在严格条件下与i1)或i2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人IFNα2b全长的DNA分子。

所述人IFNα2a全长的编码基因序列为如下j1)-j3)任一所示的基因：

j1)SEQ ID No.2第2701-3264位所示的DNA分子；

j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人IFNα2a全长的DNA分子；

j3)在严格条件下与j1)或j2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人IFNα2a全长的DNA分子。

所述人IFNβ全长的编码基因序列为如下k1)-k3)任一所示的基因：

k1)SEQ ID No.3第2701-3261位所示的DNA分子；

k2)与k1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人IFNβ全长的DNA分子；

k3)在严格条件下与k1)或k2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人IFNβ全长的DNA分子。

更进一步的，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子为如下Ⅰ)-Ⅲ)任一所示的基因：

Ⅰ)SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

Ⅱ)与Ⅰ)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子；

Ⅲ)在严格条件下与Ⅰ)或Ⅱ)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述人CD8先导肽、GPC3 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2RA信号肽、EGFRt蛋白、人IFNα2a全长、人IFNα2b全长、人IFNβ全长或嵌合抗原受体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述人CD8先导肽、GPC3 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2RA信号肽、EGFRt蛋白、人IFNα2a全长、人IFNα2b全长、人IFNβ全长或嵌合抗原受体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码上述人CD8先导肽、GPC3 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2RA信号肽、EGFRt蛋白、人IFNα2a全长、人IFNα2b全长、人IFNβ全长或嵌合抗原受体的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗。

上述2)中，所述表达盒依次由启动子、编码上述嵌合抗原受体的核酸分子和终止子组成。

上述3)或4)中，所述载体可为病毒载体。进一步的，所述病毒载体可为逆转录病毒载体或慢病毒载体。更进一步的，所述逆转录病毒载体为逆转录病毒载体(MP71)。所述重组载体是将上述嵌合抗原受体的核酸分子插入病毒载体中，得到表达上述嵌合抗原受体的重组病毒载体。

上述5)或6)或7)或8)中，所述细胞系可为用于病毒包装的细胞系或用于病毒传代培养的细胞系。所述用于病毒包装的细胞系具体为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞，所述用于病毒传代培养的细胞系具体为HY268细胞。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种CAR-T细胞的制备方法。

本发明提供的CAR-T细胞的制备方法包括如下步骤：将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。

进一步的，所述嵌合抗原受体的编码基因可通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中。

更进一步的，所述将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：

所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的。

所述方法(二)包括如下步骤：用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。

上述方法(一)中，所述将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后还包括如下步骤：收集细胞培养上清中的病毒液，将所述病毒液转染传代细胞，并进行克隆筛选和培养，得到病毒滴度最高的产毒细胞株。该病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清中的病毒即为上述方法(一)中的逆转录病毒。

在本发明的一个具体实施例中，所述嵌合抗原受体的编码基因通过逆转录病毒表达系统导入T细胞中。所述逆转录病毒载体具体为逆转录病毒载体(MP71)。所述重组逆转录病毒载体具体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变得到的载体。所述逆转录病毒包装细胞具体为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞。所述传代细胞具体为HY268细胞。

上述方法制备得到的CAR-T细胞或上述方法中的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体也属于本发明的保护范围。

上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述方法中的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在如下M1)-M6)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：

M1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；

M2)治疗或辅助治疗肿瘤；

M3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；

M4)杀伤肿瘤细胞；

M5)制备生产CAR-T细胞的产品；

M6)生产CAR-T细胞。

为了实现上述目的，本发明还提供了一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品。

本发明提供的治疗或辅助治疗肿瘤的产品的活性成分为上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述CAR-T细胞或上述逆转录病毒或上述重组逆转录病毒载体或上述慢病毒或上述重组慢病毒载体。

上述任一所述应用或产品中，所述肿瘤为GPC3阳性的肿瘤；所述GPC3阳性的肿瘤包括但不限于肝癌(HCC)等实体肿瘤。在本发明的一个具体实施例中，所述肿瘤为肝癌(HCC)，所述肿瘤细胞为HepG2细胞。

与现有技术对比，本发明的创新之处及有益效果在于：本发明首次在CAR的C末端增加人IFN全长基因，获得同时表达CAR和释放分泌型人IFN蛋白的CAR-T细胞。要提高CAR-T的抗肿瘤效果，一种思路是在肿瘤部位增加细胞因子的表达。细胞因子可以调节肿瘤组织周围的免疫微环境，同时作为第三信号，进一步提高CAR-T细胞的应答水平。细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等，种类多达数百种。而选择I型干扰素作为第三信号，是基于已有的研究成果和申请人的大量前期研究工作。首先，I型干扰素是目前研究最早的干扰素类型，对其生理功能和潜在副作用已有较深入和全面的认识；其次，I型干扰素具有多重调节作用，一方面可以直接诱导肿瘤细胞凋亡，另一方面也能调控T细胞活性；最后，人工制备的I型干扰素重组蛋白，例如INFα2a、IFNα2b和IFNβ等，在临床上已应用于多种类型肿瘤治疗，但是由于直接注射的干扰素重组蛋白在体内半衰期短，且不易到达病灶部位，因此，I型干扰素与CAR-T细胞疗法联合使用有利于在正确的时间和地点最大限度发挥IFN的生物学功能。

本发明申请人经过大量的前期研究发现，在CAR的C末端串联表达人IFN全长基因，可以显著提高CAR-T细胞的应答水平。人IFN基因序列可以是人IFNα2a、人IFNα2b和人IFNβ三者之中任一基因的全长序列。该设计的精妙之处在于，CAR基因和IFN基因之间用P2A肽分隔，因此可以同时表达CAR和分泌型的IFN蛋白。在CAR-T细胞到达肿瘤病灶并激活CAR基因的同时，P2A肽在细胞内的蛋白酶的作用下水解，释放游离的IFN，分泌到胞外发挥免疫激活功能。IFN的表达受到CAR基因的调控，因此可以在病灶部位释放IFN活性，起到精准增效的作用。

本发明首先通过全基因合成嵌合抗原受体GPC3 scFv-CD8铰链跨膜区-4-1BB-CD3ζ-oIFN的基因片段，并将其插入到逆转录病毒载体中，构建得到重组逆转录病毒载体；重组逆转录病毒载体在ECO细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体，得到CAR-T细胞。通过流式细胞术检测CAR-T细胞表面EGFR的含量，计算逆转录病毒感染的T淋巴细胞的CAR阳性率超过70％。体外通过酶联免疫法(ELISA)检测发现，CAR-T细胞能分泌大量的IFN至培养基上清，说明逆转录病毒成功转导至T细胞并表达分泌型的IFN。通过CFSE标记法检测CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞的杀伤功能发现：本发明制备的CAR-T细胞对GPC3阳性的肿瘤细胞具有强烈的杀伤功能，在效靶比是1比1的情况下，杀伤效率超过90％。在效靶比1比81的情况下，杀伤效率仍超过50％。动物体内的研究结果证明，GPC3 CAR-IFN T的设计可显著提高CAR-T细胞对GPC3阳性的肿瘤细胞杀伤效率，并延长动物生命。本发明设计的GPC3 CAR-IFN T增强了CAR-T细胞在GPC3阳性肿瘤中的应用效果，进一步提高了CAR-T细胞治疗肿瘤的安全性和有效性。

附图说明

图1为CAR基因结构示意图。A为GPC3-CAR的结构示意图；B为GPC3-CAR-IFN的结构示意图。ScFv：单链抗体可变区；Hinge：CD8铰链区；TM：CD8跨膜区；IFN：人干扰素全长序列，包括IFNα2a，IFNα2b和IFNβ三者中任一序列。

图2为流式细胞术分析显示逆转录病毒感染T细胞3天后CD4+亚群和CD8+亚群的T细胞表面EGFR的阳性率，即CAR的表达效率。其中，GPC3 CAR-IFN T细胞为表达GPC3-CAR-IFNα2b的T细胞；GPC3 CAR T细胞为表达GPC3-CAR的T细胞；NO CAR T为未转导CAR的T细胞；CTR CAR T为转导了非靶向GPC3的T细胞。

图3为酶联免疫反应(ELISA)检测GPC3 CAR-IFN T、GPC3 CAR T和CTR CAR T细胞分泌到培养上清中的IFNα2含量。其中，GPC3 CAR-IFN T细胞为表达GPC3-CAR-IFNα2b的T细胞；GPC3 CAR T细胞为表达GPC3-CAR的T细胞；CTR CAR T为转导了非靶向GPC3的T细胞。

图4为使用CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后，用CFSE标记法检测靶细胞裂解率。其中，GPC3 CAR-IFN T细胞为表达GPC3-CAR-IFNα2b的T细胞；GPC3 CAR T细胞为表达GPC3-CAR的T细胞；CTR CAR T为转导了非靶向GPC3的T细胞。

图5为HepG2肿瘤移植模型中皮下注射CAR-T细胞后，测量小鼠体内肿瘤体积大小和生存时间变化。A为主要实验流程；B为统计不同时间点各组别小鼠体内的肿瘤体积；C为各组别小鼠的生存曲线。其中，GPC3 CAR-IFN T细胞为表达GPC3-CAR-IFNα2b的T细胞；GPC3CAR T细胞为表达GPC3-CAR的T细胞；CTR CAR T为转导了非靶向GPC3的T细胞。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的逆转录病毒载体(MP71)记载于文献“Engels,B.,et al.,Retroviral vectorsfor high-level transgene expression in T lymphocytes.HumGene Ther,2003.14(12):p.1155-68.”中，公众可从浙江康佰裕生物科技有限公司获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、CAR-T细胞的制备

一、逆转录病毒载体的构建

1、野生型人IFNα2b基因cDNA全长序列的优化

将野生型人IFNα2b基因cDNA全长序列称为nIFNα2b。为了使nIFNα2b更适合在人类细胞中表达，在保证nIFNα2b编码的氨基酸序列不变的情况下，将nIFNα2b序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行了密码子优化，得到oIFNα2b，oIFNα2b的核苷酸序列如SEQ IDNO.1第2701-3264位所示。

2、GPC3-CAR-IFN基因序列的设计及合成

GPC3-CAR-IFN基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、GPC3 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽(记作P2A肽-1)的编码基因序列、CSF2RA信号肽的编码基因序列、EGFRt的编码基因序列、P2A肽(记作P2A肽-2)的编码基因序列和oIFNα2b基因序列。GPC3-CAR-IFNα2b基因序列如SEQ ID NO.1所示，其中，人CD8先导肽的编码基因序列为SEQ IDNO.1第1-63位，GPC3 scFv的编码基因序列为SEQ ID NO.1第64-789位、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第790-996位、人4-1BB胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第997-1137位、人CD3ζ胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1138-1473位、P2A肽-1的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1474-1551位、CSF2RA信号肽的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1552-1617位、EGFRt的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1618-2622位、P2A肽-2的编码基因序列为SEQ ID NO.1第2623-2700位、oIFNα2b基因序列为SEQ ID NO.1第2701-3264位。GPC3-CAR-IFN基因序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

GPC3-CAR基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、GPC3 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、CSF2RA信号肽的编码基因序列、EGFRt的编码基因序列。GPC3-CAR基因序列为SEQ ID NO.1第1-2622位。

GPC3-CAR-IFN基因序列和GPC3-CAR基因序列中的主要元件结构示意图如图1所示。

委托擎科生物科技有限公司合成GPC3-CAR-IFN基因序列和GPC3-CAR基因序列。将合成的基因序列克隆在pUC57载体上进行测序鉴定。

3、逆转录病毒载体的构建

将GPC3-CAR-IFN基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体GPC3-CAR-IFN。

将GPC3-CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体GPC3-CAR。

将SEQ ID NO.7所示的非靶向GPC3的CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到对照逆转录病毒载体。

二、逆转录病毒包装和产毒株的建立

将步骤一中制备得到的重组逆转录病毒载体GPC3-CAR-IFN和GPC3-CAR及对照逆转录病毒载体，按照以下方法分别包装得到两种逆转录病毒及对照逆转录病毒：

1、包装细胞的培养

每10cm细胞培养皿中添加0.6×10⁶个Phoenix Ecotropic(ECO)细胞(ATCC，CRL-3214)(小于20代，不过分长满)和10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜。

2、包装细胞的转染

待ECO细胞融合度达到90％左右进行转染(通常是铺板14-18h左右)；在一个管中添加目的质粒12.5μg，1.25M CaCl₂ 250μl，H₂O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加与质粒复合物等体积的2×HBS溶液，将质粒复合物加入2×HBS溶液中，边加质粒复合物边涡旋震荡20s，得到混合物。轻柔地将混合物沿着边加入到ECO细胞培养皿中，37℃培养4h，去除培养基，重新加入预热的新鲜培养基。

3、病毒液的获得

转染48h后收集上清并用0.45μm滤器过滤后，得到病毒液，分装保存于-80℃。将由重组逆转录病毒载体GPC3-CAR-IFN获得的逆转录病毒液记作GPC3-CAR-IFN病毒液。将由重组逆转录病毒载体GPC3-CAR获得的逆转录病毒液记作GPC3-CAR病毒液。将由对照逆转录病毒载体获得的逆转录病毒液记作对照逆转录病毒液。

4、产毒细胞株的建立

将步骤3获得的逆转录病毒液感染HY268细胞，感染两天后，用EGFR抗体(Biolegend)染色，洗涤后，应用流式分选仪分选CAR强阳性细胞至96孔板，每孔一个细胞，将在96孔板培养后单克隆孔的上清作为逆转录病毒液，进一步通过感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度。筛选出96孔板中病毒滴度最高的三至五个CAR⁺细胞克隆，接种至24孔板中继续培养，进行二次筛选。培养上清感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度，选择病毒滴度最高的细胞克隆作为稳产株，在液氮中长期保存。利用此细胞株可以大规模制备病毒上清用于基因转导制备CAR-T细胞。

三、CAR-T细胞的制备

1、复苏冻存的健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为(1-2)×10⁶个/ml。

2、用Ficoll分离液(达科为公司，DKW-KLSH-0100)收集PBMC，采用磁珠法从PBMC中分离获得较纯的CD3⁺T细胞，按磁珠:CD3⁺细胞体积比为3:1的比例加入临床级DynabeadsHuman T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。

3、T细胞活化后第二天，用浓度为15μg/ml的Retronectin溶液(Takara)包被含有CD3⁺T细胞的6孔板，6孔板每孔加入1.2ml Retronectin溶液，避光，4℃过夜备用。

4、T细胞活化培养两天后，取出包被Retronectin的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。

5、将步骤二制备的逆转录病毒液(病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清)加入孔内，每孔加5-6ml，32℃、2000×g离心2h，弃未结合的病毒上清液，每孔加入3ml含hIL-2(上海华新生物高技术有限公司)(500U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，初始细胞密度大约为2×10⁶个/ml，继续培养1天。

6、细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含hIL-2(100U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，细胞密度控制在5×10⁵个/ml，便于细胞扩增。

收集感染病毒液72小时后的T细胞，得到感染逆转录病毒的CAR-T细胞。将感染GPC3-CAR-IFN病毒液的T细胞记作GPC3 CAR-IFN T细胞。将感染GPC3-CAR病毒液的T细胞记作GPC3 CAR T细胞。

按照上述步骤，将逆转录病毒液替换为等体积PBS溶液或对照逆转录病毒液，分别得到NO CAR T细胞或CTR CAR T细胞。

四、流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的CAR表达效率

由于CAR基因载体共同表达EGFRt片段，该片段在信号肽引导下能定位到T细胞膜表面，其表达水平与CAR基因的表达水平呈正比。因此采用FACS方法通过EGFR抗体检测EGFRt基因表达，来说明CAR阳性T淋巴细胞的比例和CAR蛋白的表达效率。以步骤三获得的GPC3 CAR-IFN T细胞、GPC3 CAR T细胞、CTR CAR T细胞及No CAR T细胞为供试细胞，按照如下步骤进行操作：分别离心收集感染后72小时的供试细胞，1％BSA-PBS洗涤1次后弃上清，加入FITC标记的EGFR抗体(Biolegend)，流式细胞仪检测FITC的荧光强度。

结果如图2所示。结果显示：使用步骤二制备得到的逆转录病毒感染T细胞3天后，CD4⁺T细胞和CD8+T细胞中EGFR(CAR)的阳性率均超过49.9％。其中，逆转录病毒GPC3-CAR-IFN感染T细胞3天后，CD4⁺T细胞和CD8+T细胞中EGFR(CAR)的阳性率均超过70％。

五、ELISA检测感染后T淋巴细胞培养基上清中IFNα2的含量

IFNα2b是GPC3 CAR-IFN T的主要增效因子。IFNα2b和IFNα2a同属于IFNα2亚家族，具有高度的序列同源性，通过ELISA检测上清中IFNα2的含量，可以验证GPC3 CAR-IFN T细胞中IFNα2b的表达水平。以步骤三获得的GPC3 CAR-IFN T细胞、GPC3 CAR T细胞、CTR CART细胞为供试细胞，按照如下步骤进行操作：分别离心收集感染后72小时的供试细胞，收集培养后的上清液，ELISA(Biolegend)检测上清液中IFNα2的含量。

结果如图3所示。结果显示：GPC3 CAR-IFN T细胞上清中的IFNα2含量显著高于CTRCAR T和GPC3 CAR T细胞。该结果确证GPC3 CAR-IFN T细胞可以表达分泌型的IFNα2b。

实施例2、CFSE标记法检测CAR-T细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用

CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。可以利用CFSE标记活细胞的原理对肿瘤细胞进行标记和定量，从而检测CAR-T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率。具体方法为：靶细胞等量分成两个组，调整至相同的细胞密度。分别用低浓度和高浓度CFSE染色，其中高浓度染色的靶细胞与不染色的免疫细胞按照一定比例共培养。孵育一段时间后，将高浓度染色的靶细胞管(连同免疫细胞)与低浓度染色的靶细胞管等量混合。最后，通过比较CFSE低浓度标记组和CFSE高浓度标记组的靶细胞百分比，计算CART细胞对靶细胞的杀伤率。具体步骤如下：

1、将对数期的HepG2细胞300-500g离心1-5min，去上清。用PBS重悬细胞，调整细胞密度至(1-2)×10⁷个/ml。

2、将细胞密度为(1-2)×10⁷个/ml的HepG2细胞悬液等量分成两份，一份记作CFSE高标记细胞，另一份记作CFSE低标记细胞。CFSE低标记细胞用低浓度CFSE(0.5μM)染色，CFSE高标记细胞用高浓度CFSE(5μM)标记。染色方法具体如下：在管内按照既定浓度加入CFSE染料(Invitrogen)，避光37℃孵育10min。

3、加入至少2倍体积冷的完全培养基终止标记，300-500g离心5min。

4、去上清，收集细胞沉淀，用完全培养基洗2遍。

5、将染色的HepG2细胞接种至96孔板中，CFSE高标记组(CFSE高标记细胞+T细胞)：每个孔接种HepG2细胞(5×10⁴个/100μl)，加入不同数量的CAR-T细胞(GPC3 CAR-IFN T细胞、GPC3 CAR T细胞或CTR CAR T细胞)，使CAR-T细胞与HepG2细胞的个数比分别为1:1、1:3、1:9、1:81；CFSE低标记组(只有CFSE低标记细胞)：每个孔接种HepG2细胞(5×10⁴个/100μl)单独培养，并用完全培养基补足至相同体积。同时设置未与T细胞共培养的CFSE高标记细胞孔作为对照组。

6、37℃孵育6小时后，CFSE高标记组与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作实验组混合细胞。同时收集对照组(只有CFSE高标记细胞)与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作对照组混合细胞。

7、流式上机，检测各个组FITC单通道的荧光值。

8、靶细胞裂解率分析：流式上机后，应检测出两个FITC阳性峰，分别是CFSE高标记和低标记细胞峰，测得CFSE高标记组和低标记组靶细胞比例。然后按照以下公式计算T细胞对靶细胞杀伤率(％)：

T细胞对靶细胞的杀伤率(％)＝100％-[(实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/实验组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)/(对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/对照组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)]×100％。

例如，测得实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比42.5％，CFSE低标记细胞占比57.5％；测得对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比49.5％，CFSE低标记细胞占比51.5％，那么特异性裂解率(％)＝100％-(42.5％/57.5％)/(49.5％/51.5％)×100％。

实验结果如图4和表2所示。结果显示：使用GPC3 CAR-IFN T细胞和靶细胞HepG2按照不同效靶比共培养后，在效靶比为1:1时，细胞裂解率达到90％以上；效靶比为1:81时，细胞裂解率仍有50％左右。

表2、CAR T细胞的细胞裂解率(％)

实施例3、肿瘤移植模型检测CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用

实验材料：5-6周龄、体重为18-22 g的B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠(百奥赛图基因生物技术有限公司)。

实验分组：将实验材料随机分为3个实验组，每组各5只小鼠。每组处理方法具体如下：

GPC3 CAR-IFN T组：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种HepG2肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含1×10⁷个HepG2细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的GPC3 CAR-IFN T细胞溶液(溶剂为PBS)，注射量为0.2ml(含5×10⁶个GPC3 CAR-IFN T细胞)。

GPC3 CAR T组：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种HepG2肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含1×10⁷个HepG2细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的GPC3 CAR T细胞溶液(溶剂为PBS)，注射量为0.2ml(含5×10⁶个GPC3 CART细胞)。

CTR CAR T组：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠皮下接种HepG2肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含1×10⁷个HepG2细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的CTR CAR T细胞溶液(溶剂为PBS溶液)，CTR CAR T细胞注射量为0.2ml(含5×10⁶个CTR CAR T细胞)。

实验方法：在注射CAR-T细胞之后的42天之内，每三天测量一次小鼠肿瘤直径。统计各个时间点的肿瘤直径并计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积变化曲线。在注射CAR-T细胞之后的60天之内，统计小鼠的存活数量，绘制存活曲线。

结果如图5所示。结果显示：与GPC3 CAR T组相比，GPC3 CAR-IFN T组小鼠的肿瘤体积明显减小，生存时间明显延长。说明GPC3 CAR-IFN T组小鼠体内的HepG2肿瘤细胞残留明显减少，GPC3 CAR-IFN T细胞杀伤肿瘤的效果更好更持久。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江康佰裕生物科技有限公司

<120> 一种用于肝癌治疗的嵌合抗原受体及其应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3267

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacgtgg tgatgaccca gacccccctg agcctgcccg tgagcctggg agaccaggcc 120

agcattagct gcagaagcag ccagagcctg gtgcacagca acggaaacac atatctgcac 180

tggtatctgc agaagcccgg acagagcccc aaactgctga tctataaggt gagcaataga 240

ttcagcggcg tgccagacag attctccgga agcggaagcg gaacagactt caccctgaag 300

attagcagag tggaagccga ggacctgggc gtgtacttct gcagccagaa cacccacgtg 360

ccacccacct tcggcagcgg cacaaaactg gagatcaagg gcggcggagg cagcggcgga 420

ggaggaagcg gaggaggagg atcacaggtg cagctgcagc agagcggcgc cgaactggtg 480

agacccgggg ctagcgtgaa gctgagctgt aaggcaagtg gatatacatt cacagactac 540

gagatgcact gggtgaagca gacacccgtg cacggactga agtggattgg agccctggac 600

cctaagaccg gcgataccgc ctacagccag aaattcaagg gcaaagctac cctgaccgca 660

gacaaaagca gcagcaccgc ctatatggaa ctgagatcac tgaccagcga agacagcgcc 720

gtgtactact gcaccagatt ctacagctac acctactggg gccagggcac cctggtgaca 780

gtgagcgcca ctacaactcc agcacccaga ccccctacac ctgctccaac tatcgcaagt 840

cagcccctgt cactgcgccc tgaagcctgt cgccctgctg ccgggggagc tgtgcatact 900

cggggactgg actttgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 1020

cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1080

gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgagctgaga 1140

gtgaagttct cccgaagcgc agatgcccca gcctatcagc agggacagaa tcagctgtac 1200

aacgagctga acctgggaag acgggaggaa tacgatgtgc tggacaaaag gcggggcaga 1260

gatcctgaga tgggcggcaa accaagacgg aagaaccccc aggaaggtct gtataatgag 1320

ctgcagaaag acaagatggc tgaggcctac tcagaaatcg ggatgaaggg cgaaagaagg 1380

agaggaaaag gccacgacgg actgtaccag gggctgagta cagcaacaaa agacacctat 1440

gacgctctgc acatgcaggc tctgccacca agacgagcta aacgaggctc aggcgcgacg 1500

aactttagtt tgctgaagca agctggggat gtagaggaaa atccgggtcc catgttgctc 1560

cttgtgacga gcctcctgct ctgcgagctg ccccatccag ccttcctcct catcccgcgg 1620

aaggtgtgca atggcatagg cattggcgag tttaaagatt ctctgagcat aaatgctacg 1680

aatattaagc atttcaagaa ttgtacttct attagtggcg acctccatat tcttccggtt 1740

gccttcaggg gtgactcttt cacccacaca cctccattgg atccacaaga acttgacatc 1800

ctgaagacgg ttaaagagat tacaggcttc ctccttatcc aagcgtggcc cgagaacaga 1860

acggacttgc acgcctttga gaacctcgaa ataatacggg gtcggacgaa gcaacacggc 1920

caatttagcc ttgcggttgt tagtctgaac attacttctc tcggccttcg ctctttgaaa 1980

gaaatcagcg acggagatgt catcattagt ggaaacaaga acctgtgcta cgcgaacaca 2040

atcaactgga agaagctctt cggtacttca ggccaaaaga caaagattat tagtaacaga 2100

ggagagaata gctgtaaggc taccggacaa gtttgtcacg ccttgtgtag tccagagggt 2160

tgctggggac cggaaccaag ggattgcgtc agttgccgga acgtgagtcg cggacgcgag 2220

tgtgtggata agtgcaatct tctggaaggg gaaccgcgag agtttgtaga aaattccgaa 2280

tgtatacagt gtcatcccga gtgtcttcca caagcaatga atatcacatg tacagggagg 2340

ggtcctgata actgtatcca atgtgcacac tacatagatg gtcctcactg tgtaaagacg 2400

tgccccgccg gagtaatggg tgaaaacaac accctcgtgt ggaagtacgc cgatgccggg 2460

catgtctgtc atttgtgtca tcccaactgc acatatggct gtaccggtcc tggattggag 2520

ggctgtccaa caaacgggcc gaaaataccg agtatcgcaa caggcatggt gggagcactt 2580

ttgcttctcc tcgttgtcgc cctgggcatc ggcttgttca tgcgagctaa acgaggctca 2640

ggcgcgacga actttagttt gctgaagcaa gctggggatg tagaggaaaa tccgggtccc 2700

atggccctga ccttcgccct gctggtggcc ctgctggtcc tgagctgcaa gagctcctgc 2760

agcgtggggt gcgacctgcc ccagacccac agcctgggct ccagaagaac cctgatgctg 2820

ctggcccaga tgagaagaat cagtctgttc agctgcctga aagacagaca cgactttggc 2880

ttccctcagg aggaatttgg aaaccagttc cagaaggccg aaaccatccc cgtgctgcac 2940

gagatgatcc agcagatctt caacctgttc tccaccaaag atagcagcgc agcctgggac 3000

gaaaccctgc tggacaagtt ctacaccgag ctgtaccagc agctgaacga cctggaggcc 3060

tgcgtgatcc agggcgtggg agtgaccgag acaccactga tgaaagagga tagcattctg 3120

gccgtgagga aatacttcca gagaatcacc ctgtacctga aagagaaaaa gtacagtccc 3180

tgcgcctggg aggtggtgag agccgagatc atgagaagct tcagcctgag caccaatctg 3240

caggaaagcc tgagaagcaa ggagtga 3267

<210> 2

<211> 3267

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacgtgg tgatgaccca gacccccctg agcctgcccg tgagcctggg agaccaggcc 120

agcattagct gcagaagcag ccagagcctg gtgcacagca acggaaacac atatctgcac 180

tggtatctgc agaagcccgg acagagcccc aaactgctga tctataaggt gagcaataga 240

ttcagcggcg tgccagacag attctccgga agcggaagcg gaacagactt caccctgaag 300

attagcagag tggaagccga ggacctgggc gtgtacttct gcagccagaa cacccacgtg 360

ccacccacct tcggcagcgg cacaaaactg gagatcaagg gcggcggagg cagcggcgga 420

ggaggaagcg gaggaggagg atcacaggtg cagctgcagc agagcggcgc cgaactggtg 480

agacccgggg ctagcgtgaa gctgagctgt aaggcaagtg gatatacatt cacagactac 540

gagatgcact gggtgaagca gacacccgtg cacggactga agtggattgg agccctggac 600

cctaagaccg gcgataccgc ctacagccag aaattcaagg gcaaagctac cctgaccgca 660

gacaaaagca gcagcaccgc ctatatggaa ctgagatcac tgaccagcga agacagcgcc 720

gtgtactact gcaccagatt ctacagctac acctactggg gccagggcac cctggtgaca 780

gtgagcgcca ctacaactcc agcacccaga ccccctacac ctgctccaac tatcgcaagt 840

cagcccctgt cactgcgccc tgaagcctgt cgccctgctg ccgggggagc tgtgcatact 900

cggggactgg actttgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 1020

cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1080

gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgagctgaga 1140

gtgaagttct cccgaagcgc agatgcccca gcctatcagc agggacagaa tcagctgtac 1200

aacgagctga acctgggaag acgggaggaa tacgatgtgc tggacaaaag gcggggcaga 1260

gatcctgaga tgggcggcaa accaagacgg aagaaccccc aggaaggtct gtataatgag 1320

ctgcagaaag acaagatggc tgaggcctac tcagaaatcg ggatgaaggg cgaaagaagg 1380

agaggaaaag gccacgacgg actgtaccag gggctgagta cagcaacaaa agacacctat 1440

gacgctctgc acatgcaggc tctgccacca agacgagcta aacgaggctc aggcgcgacg 1500

aactttagtt tgctgaagca agctggggat gtagaggaaa atccgggtcc catgttgctc 1560

cttgtgacga gcctcctgct ctgcgagctg ccccatccag ccttcctcct catcccgcgg 1620

aaggtgtgca atggcatagg cattggcgag tttaaagatt ctctgagcat aaatgctacg 1680

aatattaagc atttcaagaa ttgtacttct attagtggcg acctccatat tcttccggtt 1740

gccttcaggg gtgactcttt cacccacaca cctccattgg atccacaaga acttgacatc 1800

ctgaagacgg ttaaagagat tacaggcttc ctccttatcc aagcgtggcc cgagaacaga 1860

acggacttgc acgcctttga gaacctcgaa ataatacggg gtcggacgaa gcaacacggc 1920

caatttagcc ttgcggttgt tagtctgaac attacttctc tcggccttcg ctctttgaaa 1980

gaaatcagcg acggagatgt catcattagt ggaaacaaga acctgtgcta cgcgaacaca 2040

atcaactgga agaagctctt cggtacttca ggccaaaaga caaagattat tagtaacaga 2100

ggagagaata gctgtaaggc taccggacaa gtttgtcacg ccttgtgtag tccagagggt 2160

tgctggggac cggaaccaag ggattgcgtc agttgccgga acgtgagtcg cggacgcgag 2220

tgtgtggata agtgcaatct tctggaaggg gaaccgcgag agtttgtaga aaattccgaa 2280

tgtatacagt gtcatcccga gtgtcttcca caagcaatga atatcacatg tacagggagg 2340

ggtcctgata actgtatcca atgtgcacac tacatagatg gtcctcactg tgtaaagacg 2400

tgccccgccg gagtaatggg tgaaaacaac accctcgtgt ggaagtacgc cgatgccggg 2460

catgtctgtc atttgtgtca tcccaactgc acatatggct gtaccggtcc tggattggag 2520

ggctgtccaa caaacgggcc gaaaataccg agtatcgcaa caggcatggt gggagcactt 2580

ttgcttctcc tcgttgtcgc cctgggcatc ggcttgttca tgcgagctaa acgaggctca 2640

ggcgcgacga actttagttt gctgaagcaa gctggggatg tagaggaaaa tccgggtccc 2700

atggccctga ccttcgccct gctggtggcc ctgctggtcc tgagctgcaa gagctcctgc 2760

agcgtggggt gcgacctgcc ccagacccac agcctgggct ccagaagaac cctgatgctg 2820

ctggcccaga tgagaaaaat cagtctgttc agctgcctga aagacagaca cgactttggc 2880

ttccctcagg aggaatttgg aaaccagttc cagaaggccg aaaccatccc cgtgctgcac 2940

gagatgatcc agcagatctt caacctgttc tccaccaaag atagcagcgc agcctgggac 3000

gaaaccctgc tggacaagtt ctacaccgag ctgtaccagc agctgaacga cctggaggcc 3060

tgcgtgatcc agggcgtggg agtgaccgag acaccactga tgaaagagga tagcattctg 3120

gccgtgagga aatacttcca gagaatcacc ctgtacctga aagagaaaaa gtacagtccc 3180

tgcgcctggg aggtggtgag agccgagatc atgagaagct tcagcctgag caccaatctg 3240

caggaaagcc tgagaagcaa ggagtga 3267

<210> 3

<211> 3264

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacgtgg tgatgaccca gacccccctg agcctgcccg tgagcctggg agaccaggcc 120

agcattagct gcagaagcag ccagagcctg gtgcacagca acggaaacac atatctgcac 180

tggtatctgc agaagcccgg acagagcccc aaactgctga tctataaggt gagcaataga 240

ttcagcggcg tgccagacag attctccgga agcggaagcg gaacagactt caccctgaag 300

attagcagag tggaagccga ggacctgggc gtgtacttct gcagccagaa cacccacgtg 360

ccacccacct tcggcagcgg cacaaaactg gagatcaagg gcggcggagg cagcggcgga 420

ggaggaagcg gaggaggagg atcacaggtg cagctgcagc agagcggcgc cgaactggtg 480

agacccgggg ctagcgtgaa gctgagctgt aaggcaagtg gatatacatt cacagactac 540

gagatgcact gggtgaagca gacacccgtg cacggactga agtggattgg agccctggac 600

cctaagaccg gcgataccgc ctacagccag aaattcaagg gcaaagctac cctgaccgca 660

gacaaaagca gcagcaccgc ctatatggaa ctgagatcac tgaccagcga agacagcgcc 720

gtgtactact gcaccagatt ctacagctac acctactggg gccagggcac cctggtgaca 780

gtgagcgcca ctacaactcc agcacccaga ccccctacac ctgctccaac tatcgcaagt 840

cagcccctgt cactgcgccc tgaagcctgt cgccctgctg ccgggggagc tgtgcatact 900

cggggactgg actttgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 1020

cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1080

gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgagctgaga 1140

gtgaagttct cccgaagcgc agatgcccca gcctatcagc agggacagaa tcagctgtac 1200

aacgagctga acctgggaag acgggaggaa tacgatgtgc tggacaaaag gcggggcaga 1260

gatcctgaga tgggcggcaa accaagacgg aagaaccccc aggaaggtct gtataatgag 1320

ctgcagaaag acaagatggc tgaggcctac tcagaaatcg ggatgaaggg cgaaagaagg 1380

agaggaaaag gccacgacgg actgtaccag gggctgagta cagcaacaaa agacacctat 1440

gacgctctgc acatgcaggc tctgccacca agacgagcta aacgaggctc aggcgcgacg 1500

aactttagtt tgctgaagca agctggggat gtagaggaaa atccgggtcc catgttgctc 1560

cttgtgacga gcctcctgct ctgcgagctg ccccatccag ccttcctcct catcccgcgg 1620

aaggtgtgca atggcatagg cattggcgag tttaaagatt ctctgagcat aaatgctacg 1680

aatattaagc atttcaagaa ttgtacttct attagtggcg acctccatat tcttccggtt 1740

gccttcaggg gtgactcttt cacccacaca cctccattgg atccacaaga acttgacatc 1800

ctgaagacgg ttaaagagat tacaggcttc ctccttatcc aagcgtggcc cgagaacaga 1860

acggacttgc acgcctttga gaacctcgaa ataatacggg gtcggacgaa gcaacacggc 1920

caatttagcc ttgcggttgt tagtctgaac attacttctc tcggccttcg ctctttgaaa 1980

gaaatcagcg acggagatgt catcattagt ggaaacaaga acctgtgcta cgcgaacaca 2040

atcaactgga agaagctctt cggtacttca ggccaaaaga caaagattat tagtaacaga 2100

ggagagaata gctgtaaggc taccggacaa gtttgtcacg ccttgtgtag tccagagggt 2160

tgctggggac cggaaccaag ggattgcgtc agttgccgga acgtgagtcg cggacgcgag 2220

tgtgtggata agtgcaatct tctggaaggg gaaccgcgag agtttgtaga aaattccgaa 2280

tgtatacagt gtcatcccga gtgtcttcca caagcaatga atatcacatg tacagggagg 2340

ggtcctgata actgtatcca atgtgcacac tacatagatg gtcctcactg tgtaaagacg 2400

tgccccgccg gagtaatggg tgaaaacaac accctcgtgt ggaagtacgc cgatgccggg 2460

catgtctgtc atttgtgtca tcccaactgc acatatggct gtaccggtcc tggattggag 2520

ggctgtccaa caaacgggcc gaaaataccg agtatcgcaa caggcatggt gggagcactt 2580

ttgcttctcc tcgttgtcgc cctgggcatc ggcttgttca tgcgagctaa acgaggctca 2640

ggcgcgacga actttagttt gctgaagcaa gctggggatg tagaggaaaa tccgggtccc 2700

atgactaata aatgcctgct tcagatcgcc ttgctgcttt gtttcagcac aactgcactg 2760

tcaatgtctt ataacctgct cgggtttctc cagagaagct ccaattttca gtgtcagaaa 2820

ctgctttggc agctgaacgg ccgcttggaa tactgcctga aagacagaat gaacttcgat 2880

atcccggaag agataaaaca gctgcagcaa tttcagaagg aggatgcggc cttgaccatt 2940

tacgagatgc ttcaaaacat atttgcaatc ttccggcagg actcttcctc aaccgggtgg 3000

aatgaaacca tcgtggaaaa tctcctcgcg aatgtctacc accagatcaa ccatcttaag 3060

accgttttgg aggagaagct tgagaaggag gacttcaccc gcgggaaact tatgtcttca 3120

ctgcacttga agcgctacta cggtcggatt ctccattacc tgaaagccaa ggagtactcc 3180

cactgcgcct ggacaatcgt ccgggtggag atcctgagga acttctactt cattaatcgc 3240

ctgactgggt atctgaggaa ctga 3264

<210> 4

<211> 1088

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln

35 40 45

Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr

100 105 110

Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val

145 150 155 160

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

165 170 175

Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly

180 185 190

Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr

195 200 205

Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser

210 215 220

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val

325 330 335

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

340 345 350

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

355 360 365

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

370 375 380

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

405 410 415

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

420 425 430

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

435 440 445

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

450 455 460

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Gly

485 490 495

Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu

500 505 510

Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys

515 520 525

Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn

530 535 540

Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr

545 550 555 560

Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His

565 570 575

Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro

580 585 590

Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr

595 600 605

Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His

610 615 620

Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly

625 630 635 640

Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu

645 650 655

Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn

660 665 670

Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly

675 680 685

Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser

690 695 700

Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly

705 710 715 720

Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser

725 730 735

Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro

740 745 750

Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys

755 760 765

Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn

770 775 780

Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr

785 790 795 800

Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr

805 810 815

Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr

820 825 830

Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys

835 840 845

Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu

850 855 860

Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Ala Lys Arg Gly Ser

865 870 875 880

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

885 890 895

Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu

900 905 910

Val Leu Ser Cys Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln

915 920 925

Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met

930 935 940

Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly

945 950 955 960

Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile

965 970 975

Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr

980 985 990

Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr

995 1000 1005

Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile

1010 1015 1020

Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser

1025 1030 1035

Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu

1040 1045 1050

Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala

1055 1060 1065

Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

1070 1075 1080

Leu Arg Ser Lys Glu

1085

<210> 5

<211> 1088

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln

35 40 45

Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr

100 105 110

Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val

145 150 155 160

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

165 170 175

Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly

180 185 190

Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr

195 200 205

Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser

210 215 220

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val

325 330 335

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

340 345 350

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

355 360 365

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

370 375 380

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

405 410 415

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

420 425 430

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

435 440 445

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

450 455 460

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Gly

485 490 495

Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu

500 505 510

Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys

515 520 525

Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn

530 535 540

Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr

545 550 555 560

Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His

565 570 575

Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro

580 585 590

Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr

595 600 605

Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His

610 615 620

Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly

625 630 635 640

Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu

645 650 655

Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn

660 665 670

Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly

675 680 685

Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser

690 695 700

Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly

705 710 715 720

Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser

725 730 735

Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro

740 745 750

Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys

755 760 765

Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn

770 775 780

Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr

785 790 795 800

Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr

805 810 815

Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr

820 825 830

Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys

835 840 845

Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu

850 855 860

Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Ala Lys Arg Gly Ser

865 870 875 880

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

885 890 895

Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Thr Phe Ala Leu Leu Val Ala Leu Leu

900 905 910

Val Leu Ser Cys Lys Ser Ser Cys Ser Val Gly Cys Asp Leu Pro Gln

915 920 925

Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met

930 935 940

Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly

945 950 955 960

Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile

965 970 975

Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr

980 985 990

Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr

995 1000 1005

Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile

1010 1015 1020

Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser

1025 1030 1035

Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu

1040 1045 1050

Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala

1055 1060 1065

Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser

1070 1075 1080

Leu Arg Ser Lys Glu

1085

<210> 6

<211> 1087

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln

35 40 45

Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr

100 105 110

Phe Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val

145 150 155 160

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

165 170 175

Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly

180 185 190

Leu Lys Trp Ile Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr

195 200 205

Ser Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser

210 215 220

Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val

325 330 335

Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe

340 345 350

Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg

355 360 365

Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser

370 375 380

Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

385 390 395 400

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys

405 410 415

Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn

420 425 430

Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu

435 440 445

Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

450 455 460

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Gly

485 490 495

Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu

500 505 510

Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys

515 520 525

Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn

530 535 540

Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr

545 550 555 560

Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His

565 570 575

Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro

580 585 590

Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr

595 600 605

Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His

610 615 620

Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly

625 630 635 640

Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu

645 650 655

Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn

660 665 670

Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly

675 680 685

Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser

690 695 700

Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly

705 710 715 720

Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser

725 730 735

Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro

740 745 750

Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys

755 760 765

Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn

770 775 780

Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr

785 790 795 800

Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr

805 810 815

Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr

820 825 830

Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys

835 840 845

Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu

850 855 860

Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Ala Lys Arg Gly Ser

865 870 875 880

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

885 890 895

Asn Pro Gly Pro Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu

900 905 910

Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly

915 920 925

Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln

930 935 940

Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp

945 950 955 960

Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala

965 970 975

Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg

980 985 990

Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu

995 1000 1005

Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu

1010 1015 1020

Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met

1025 1030 1035

Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr

1040 1045 1050

Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg

1055 1060 1065

Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly

1070 1075 1080

Tyr Leu Arg Asn

1085

<210> 7

<211> 2634

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctagctacg tgctgaccca gcccccctcc gtgagcgtgg cacctggaaa aacagccaga 120

atctcctgcg gaggaaacaa catcggaacc aagaacgtgc actggtacca gcagaaaccc 180

ggacaggccc ccgtgctggt ggtgtacgcc gacagcgacc gccccagcgg aatcccagag 240

agattcagcg gcagcaacag cggaaacacc gccaccctga ccatcagcag agtggaagtg 300

ggagacgaag ccgactatta ttgccaggtg tgggactccg tgagctatca cgtggtgttc 360

ggcggaggaa caacactgac agtgctgggg ggcggcgggg gttctggtgg cggcggcagc 420

ggcggtggag gatcacaggt gcagctggtg gaaagtggcg gcggcgtggt gcagcccgga 480

ggaagcctga gactgagctg cgcccccagc ggcttcgtgt tcagatccta tggcatgcac 540

tgggtgagac agacacctgg caaagggctg gagtgggtga gtctgatttg gcacgacggc 600

agcaaccggt tctacgccga cagcgtgaag ggcagattca ccattagcag agacaacagc 660

aaaaacacac tgtatctgca gatgaacagc ctgagagccg aagacaccgc catgtatttc 720

tgcgctaggg agagactgat cgccgcccct gccgccttcg acctgtgggg acagggcacc 780

ctggtgaccg tgtccagcac tacaactcca gcacccagac cccctacacc tgctccaact 840

atcgcaagtc agcccctgtc actgcgccct gaagcctgtc gccctgctgc cgggggagct 900

gtgcatactc ggggactgga ctttgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960

acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaggtt cagtgtcgtg 1020

aagagaggcc ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgag gcccgtgcag 1080

actacccagg aggaagatgg atgcagctgt agattccctg aagaggagga aggaggctgt 1140

gagctgagag tgaagttctc ccgaagcgca gatgccccag cctatcagca gggacagaat 1200

cagctgtaca acgagctgaa cctgggaaga cgggaggaat acgatgtgct ggacaaaagg 1260

cggggcagag atcctgagat gggcggcaaa ccaagacgga agaaccccca ggaaggtctg 1320

tataatgagc tgcagaaaga caagatggct gaggcctact cagaaatcgg gatgaagggc 1380

gaaagaagga gaggaaaagg ccacgacgga ctgtaccagg ggctgagtac agcaacaaaa 1440

gacacctatg acgctctgca catgcaggct ctgccaccaa gacgagctaa acgaggctca 1500

ggcgcgacga actttagttt gctgaagcaa gctggggatg tagaggaaaa tccgggtccc 1560

atgttgctcc ttgtgacgag cctcctgctc tgcgagctgc cccatccagc cttcctcctc 1620

atcccgcgga aggtgtgcaa tggcataggc attggcgagt ttaaagattc tctgagcata 1680

aatgctacga atattaagca tttcaagaat tgtacttcta ttagtggcga cctccatatt 1740

cttccggttg ccttcagggg tgactctttc acccacacac ctccattgga tccacaagaa 1800

cttgacatcc tgaagacggt taaagagatt acaggcttcc tccttatcca agcgtggccc 1860

gagaacagaa cggacttgca cgcctttgag aacctcgaaa taatacgggg tcggacgaag 1920

caacacggcc aatttagcct tgcggttgtt agtctgaaca ttacttctct cggccttcgc 1980

tctttgaaag aaatcagcga cggagatgtc atcattagtg gaaacaagaa cctgtgctac 2040

gcgaacacaa tcaactggaa gaagctcttc ggtacttcag gccaaaagac aaagattatt 2100

agtaacagag gagagaatag ctgtaaggct accggacaag tttgtcacgc cttgtgtagt 2160

ccagagggtt gctggggacc ggaaccaagg gattgcgtca gttgccggaa cgtgagtcgc 2220

ggacgcgagt gtgtggataa gtgcaatctt ctggaagggg aaccgcgaga gtttgtagaa 2280

aattccgaat gtatacagtg tcatcccgag tgtcttccac aagcaatgaa tatcacatgt 2340

acagggaggg gtcctgataa ctgtatccaa tgtgcacact acatagatgg tcctcactgt 2400

gtaaagacgt gccccgccgg agtaatgggt gaaaacaaca ccctcgtgtg gaagtacgcc 2460

gatgccgggc atgtctgtca tttgtgtcat cccaactgca catatggctg taccggtcct 2520

ggattggagg gctgtccaac aaacgggccg aaaataccga gtatcgcaac aggcatggtg 2580

ggagcacttt tgcttctcct cgttgtcgcc ctgggcatcg gcttgttcat gtga 2634

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其依次包括抗GPC3单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人IFN全长。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、抗GPC3单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、信号肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人IFN全长；

或，所述人IFN全长为人IFNα2a全长或人IFNα2b全长或人IFNβ全长；

或，所述自切割肽为P2A肽；

或，所述嵌合抗原受体为如下A1)-A3)中的任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.4或SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

3.与权利要求1或2所述的嵌合抗原受体相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：

B1)编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系；

B6)含有B2)所述表达盒的细胞系；

B7)含有B3)所述重组载体的细胞系；

B8)含有B4)所述重组载体的细胞系。

4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下C1)-C3)任一所示的基因：

C1)其编码序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的DNA分子；

C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的DNA分子；

C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的DNA分子。

5.一种CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中；

或，将权利要求1或2所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：

所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的；

7.按照权利要求5或6所述的方法制备得到的CAR-T细胞；

或，权利要求6中所述的逆转录病毒；

或，权利要求6中所述的重组逆转录病毒载体；

或，权利要求6中所述的慢病毒；

或，权利要求6中所述的重组慢病毒载体。

8.权利要求1或2所述的嵌合抗原受体或权利要求3或4所述的生物材料或权利要求7所述的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在如下M1)-M6)中任一种中的应用：

M1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；

M2)治疗或辅助治疗肿瘤；

M3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；

M4)杀伤肿瘤细胞；

M5)制备生产CAR-T细胞的产品；

M6)生产CAR-T细胞。

9.一种治疗或辅助治疗肿瘤的产品，其活性成分为权利要求1或2所述的嵌合抗原受体或权利要求3或4所述的生物材料或权利要求7所述的CAR-T细胞或逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体。

10.根据权利要求8所述的应用或权利要求9所述的产品，其特征在于：所述肿瘤为GPC3阳性的肿瘤；

或，所述肿瘤为肝癌。