CN116948033A - 猪rig-i样受体mda5特异性单克隆抗体和应用 - Google Patents
猪rig-i样受体mda5特异性单克隆抗体和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116948033A CN116948033A CN202310939294.3A CN202310939294A CN116948033A CN 116948033 A CN116948033 A CN 116948033A CN 202310939294 A CN202310939294 A CN 202310939294A CN 116948033 A CN116948033 A CN 116948033A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pig
- protein
- monoclonal antibody
- mda5
- rig
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001082073 Homo sapiens Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 102100027353 Interferon-induced helicase C domain-containing protein 1 Human genes 0.000 title claims abstract description 42
- 101000952095 Sus scrofa Antiviral innate immune response receptor RIG-I Proteins 0.000 title claims abstract description 23
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 28
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108091005685 RIG-I-like receptors Proteins 0.000 claims description 59
- 102100030090 Probable ATP-dependent RNA helicase DHX58 Human genes 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 23
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 8
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 claims description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 4
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 claims description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 61
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 101000864662 Homo sapiens Probable ATP-dependent RNA helicase DHX58 Proteins 0.000 description 38
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 23
- 102100037435 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Human genes 0.000 description 22
- 101710127675 Antiviral innate immune response receptor RIG-I Proteins 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 17
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 14
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 102100039087 Peptidyl-alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyase Human genes 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 8
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 6
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 6
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150002750 IFIT1 gene Proteins 0.000 description 5
- 102100027355 Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 Human genes 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 101100522829 Rattus norvegicus Pygl gene Proteins 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 4
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 4
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 4
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 3
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102000040617 RLR family Human genes 0.000 description 3
- 108091070665 RLR family Proteins 0.000 description 3
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000952099 Homo sapiens Antiviral innate immune response receptor RIG-I Proteins 0.000 description 2
- 101001054334 Homo sapiens Interferon beta Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 2
- QFVOYBUQQBFCRH-UHFFFAOYSA-N Steviol Natural products C1CC2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C)C1C(C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 2
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 102000046062 human DDX58 Human genes 0.000 description 2
- 102000052564 human DHX58 Human genes 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 108010089193 pattern recognition receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000007863 pattern recognition receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 2
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 2
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N steviol Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)CC1)C[C@H]2[C@@]2(C)[C@H]1[C@](C)(C(O)=O)CCC2 QFVOYBUQQBFCRH-VQSWZGCSSA-N 0.000 description 2
- 229940032084 steviol Drugs 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 238000006418 Brown reaction Methods 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101001082065 Homo sapiens Interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1 Proteins 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 241000711931 Rhabdoviridae Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 102000046020 human IFIH1 Human genes 0.000 description 1
- 102000049452 human IFIT1 Human genes 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了猪RIG‑I样受体MDA5特异性单克隆抗体，该抗体为猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pMDA5 mAb产生，所述杂交瘤细胞株pMDA5 mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022134。
Description
本发明专利申请是分案申请，原案的申请号为202210680936.8，申请日为2022-06-15，发明名称为猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体及其制备方法和应用。
技术领域
本发明属于医学和生物学技术领域，具体涉及猪RIG-I样受体MDA5特异性单克隆抗体和应用。
背景技术
据了解，单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要技术，其在蛋白质的结构与功能研究方面、在人类和动植物的免疫学诊断方面都发挥着无可代替的重要作用。单克隆抗体在疾病预防、临床治疗、疾病诊断及检测中均有众多应用，同时单克隆抗体在生物学研究领域作为研究工具也得到广泛使用。天然免疫是机体防御感染的第一道防线，天然免疫通过一系列模式识别受体(PRR)家族识别来自病原体的各种保守分子从而启动细胞信号和免疫应答。天然免疫RIG-I样受体(RLR)家族是胞浆内的双链RNA(dsRNA)识别受体，在识别和防御病毒尤其是RNA病毒感染中发挥关键作用。RLR家族包括RIG-I、MDA5和LGP2三个成员。
RIG-I是最早发现的RLR原型受体，包括N端的两个半胱天冬酶活化募集结构域(CARDs)；中间的RNA解旋酶结构域，能够和C端结构域一起结合RNA；C端的编码自身活化抑制域(RD)或被称为调节结构域(RD)，负责识别并结合病毒RNA。没有病毒感染时，RIG-I呈静息状态，活性区CARDs与CTD和RNA解旋酶结构域结合，后者阻止CARDs与修饰蛋白接触活化。RIG-I能够识别5'-三磷酸dsRNA(5'-ppp-dsRNA)和短链dsRNA(＜300bp)。RIG-I在抗病毒免疫中发挥重要作用，这些病毒包括大多数单负链RNA病毒，如副粘病毒家族的新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、正粘病毒科的流感病毒、弹状病毒科的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)和狂犬病病毒(Rabies virus，RV)，单正链RNA病毒如日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，以及一些DNA病毒如腺病毒和痘苗病毒等。
MDA5与RIG-I具有相似的分子结构，包括N端的两个半胱天冬酶活化募集结构域(CARDs)；中间的RNA解旋酶结构域，能够和C端结构域一起结合RNA；C端的编码自身活化抑制域(RD)或被称为调节结构域(RD)，负责识别并结合病毒RNA。没有病毒感染时，MDA5呈静息状态，活性区CARDs与CTD和RNA解旋酶结构域结合，后者阻止CARDs发生活化。MDA5优先识别长的双链RNA(dsRNA)(＞1000bp)。MDA5同样在抗病毒免疫中发挥重要作用，这些病毒主要为小核糖核酸病毒科的病毒如脑心肌炎病毒(EMCV)，还有呼肠孤病毒科病毒如轮状病毒(Rotavirus)等。
LGP2缺少N端的信号活性区域(CARDs)，但其能够与配体dsRNA高亲和力结合，发挥重要的调控功能。在RIG-I和MDA5信号介导的抗病毒免疫中，LGP2发挥的确切调控功能和作用机制尚未明晰，另外LGP2在细胞免疫应答中的作用及机制研究更需要进一步深入。
猪是非常重要的经济动物，但由于缺乏商业化的猪RLR蛋白RIG-I、MDA5和LGP2抗体工具，也没有猪RLR单克隆抗体的文献报道(现有RLR蛋白抗体都是人和鼠RLR的抗体，与猪RLR蛋白的交叉反应性没有测试数据，并不能与猪RLR蛋白进行反应)，猪RLR蛋白功能相关研究非常缺乏。此外，猪还是包括传染病在内的多种人类疾病非常有前途的动物模型，因此研制出能区分猪和人RLR的特异抗体来研究其种属差异显得非常必要。
发明内容
本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种猪RIG-I样受体MDA5特异性单克隆抗体和应用。
本发明鉴于RLR包括猪RLR在抗病毒中的关键作用，为了弥补猪RLR商业化抗体的空白，使用细胞融合杂交瘤技术制备猪RLR所有三种蛋白的特异性单克隆抗体，将获得的猪RLR单克隆抗体成功用于各种免疫学试验，并可以用于猪和人RLR的比较免疫学研究。
本发明提供了猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体，所述猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体为猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pMDA5 mAb产生，所述杂交瘤细胞株pMDA5 mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022134，。
本发明提供了猪RLR家族三种蛋白的特异性单克隆抗体，与人RLR无交叉反应，只与猪RLR发生反应。本发明针对猪RIG-I样受体(RLR)家族成员RIG-I、MDA5和LGP2的特异单克隆抗体为猪RLR研究提供特定有用工具。已经成功地应用于各种免疫学试验，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(WB)、免疫荧光(IFA)和免疫组织化学(IHC)实验，可以应用于猪RLR蛋白的检测和RLR蛋白抗病毒功能研究。此外，猪特异性RLR蛋白单克隆抗体还可以用于猪和人RLR的种属特异性比较免疫学研究。
本发明进一步的技术方案如下：
优选地，所述猪RIG-I蛋白特异性单克隆抗体能够识别RIG-I蛋白的C端Δ2CARDs片段(201-943aa)，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体能够识别MDA5蛋白的C端Δ2CARDs片段(201-1023aa)，所述猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体能够识别LGP2蛋白的N端L1(1-200aa)片段。
优选地，所述猪RIG-I蛋白特异性单克隆抗体、猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体、猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体均为IgG2b的同型免疫球蛋白。
本发明还提供一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、从猪肺泡巨噬细胞中提取总RNA，经反转录扩增得到猪RIG-I、猪MDA5、猪LGP2的编码基因，猪RIG-I、猪MDA5、猪LGP2的编码基因分别经过原核表达、纯化后获得猪pRIG-I蛋白、猪pMDA5蛋白、猪LGP2蛋白；
步骤2、利用猪pRIG-I蛋白、猪pMDA5蛋白、猪LGP2蛋白分别对动物进行免疫，分离出脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出阳性的杂交瘤细胞株pRIG-I mAb、pMDA5mAb、pLGP2 mAb A1-3、pLGP2 mAb B9-2；
步骤3、在动物腹腔内分别接种杂交瘤细胞株pRIG-I mAb、pMDA5 mAb、pLGP2 mAbA1-3、pLGP2 mAb B9-2，将动物腹水液分离、纯化制备猪RIG-I蛋白、猪MDA5蛋白、猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体。
本发明利用细胞融合杂交瘤技术制备猪RLR家族RIG-I、MDA5和LGP2蛋白的单克隆抗体，用来研究猪RLR在免疫信号中的作用和功能。
本发明进一步提供了一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体在免疫学检测中的应用。
上述猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体在免疫学检测中的应用，具体包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(WB)、免疫荧光(IFA)和免疫组织化学(IHC)。
本发明的有益效果如下：本发明提供四株猪RLR蛋白单克隆抗体，其中三株特异性单克隆抗体只与猪RLR(RIG-I、MDA5和LGP2)反应，与人RLR无交叉反应，用于特异性检测猪RLR，可用于猪RLR蛋白的检测和RLR蛋白抗病毒功能研究以及猪和人RLR的种属特异性比较免疫学研究。
保藏证明和存活证明说明
(1)保藏菌株：杂交瘤细胞株pRIG-I mAb，保藏编号：CCTCC NO:C2022133，保藏日期：2022-5-12收到，2022-5-18检测完毕，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学；
(2)保藏菌株：杂交瘤细胞株pMDA5 mAb，保藏编号：CCTCC NO:C2022134，保藏日期：2022-5-12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学；
(3)保藏菌株：杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1-3，保藏编号：CCTCC NO:C2022135，保藏日期：2022-5-12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学；
(4)保藏菌株：杂交瘤细胞株pLGP2 mAb B9-2，保藏编号：CCTCC NO:C2022136，保藏日期：2022-5-12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
附图说明
图1为本发明中重组猪RLR纯化蛋白的SDS-PAGE考马染色鉴定示意图。
图2为本发明中Western-blot分析纯化猪RLR蛋白与标签HA抗体的反应性的示意图。
图3为本发明中猪RLR三种蛋白4株单抗的亚类鉴定示意图。
图4为本发明中Western-blot分析猪RLR单克隆抗体与外源和内源猪RLR蛋白的反应性的示意图。
图5为本发明中Western-blot分析猪RLR单克隆抗体识别抗原区域的示意图。
图6为本发明中Western-blot分析猪RLR单克隆抗体种属反应特异性的示意图。
图7为本发明中猪RLR单抗间接免疫荧光检测猪RLR蛋白在细胞中的表达和定位的示意图。
图8为本发明中猪RLR单抗免疫组化检测PRRSV感染猪组织中RLR蛋白分布与表达的示意图。图中：将呼吸繁殖综合征病毒(PRRSV)感染猪的心，肝，脾，肺，肾，淋巴结组织切片进行免疫组化染色分析，在放大200X显微镜下观察染色结果。局部方框内组织染色放大结果图附于对应图片右侧。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。
实施例所涉及试剂及材料的来源如下：猪肺泡巨噬细胞(PAM，3D4/21，购自美国菌种保存中心，ATCC Cat#CRL-2843)，中间载体pENTR4-MCS-2HA(扬州大学兽医学院实验室构建保存，构建方法见论文Front Immunol.2020 Aug 14；11:1669.doi:10.3389/fimmu.2020.01669)，真核目的表达载体pcDNA-DEST47(购自Addgene)，原核目的表达载体pDSET-527(购自Addgene)，IPTG诱导剂(购自TransGen生物技术公司)，Ni-TEDPacked Columns镍柱(购自MACHEREY-NAGEL)，BALB/c小鼠(购自扬州大学实验动物中心)，福氏不完全佐剂(购自Roche)，PEG1500(购自Roche)，人IFN-β(购自BBI，C600038)，ISG56兔抗(扬州大学兽医学院实验室制备保存，将人ISG56纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得血清多抗，具体制备方法见论文Virulence.2022 Dec；13(1):740-756.doi:10.1080/21505594.2022.2065962)，HA鼠抗(购自TransGen)，pCAGGS-2HA(扬州大学兽医学院实验室构建保存，合成2HA标签编码序列至pCAGGS质粒的EcoRV和BglII位点获得，申请人在此承诺自申请日起二十年内可向公众发放该材料)，Triton X100(购自索来宝)，多聚甲醛(购自索来宝)，驴抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 488(购自ThermoFisher Scientific)，HRP偶联山羊抗小鼠(购自TransGen)。
除了上述特殊说明的生物材料及试剂外，本发明中所提及的其余材料及试剂为市购，公众能从国内外商业渠道购买到，此处不再一一说明。
本发明中的“％”为体积百分比。
实施例1猪RIG-I、MDA5和LGP2基因序列、单克隆抗体制备工艺
(1)猪RIG-I基因克隆表达、蛋白纯化和单克隆抗体的制备
从猪肺泡巨噬细胞(PAM，3D4/21)中提取总RNA，设计克隆和检测PCR引物(见表1)，反转录PCR(RT-PCR)扩增出猪RIG-I(pRIG-I的编码基因(pRIG-I编码基因序列的GenBank登录号为MF358966，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；pRIG-I蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示)。将pRIG-I基因与中间载体pENTR4-MCS-2HA连接获得重组中间质粒pENTR4-pRIG-I-2HA。将上述重组中间质粒分别与真核目的表达载体pcDNA-DEST47和原核目的表达载体pDSET-527进行特异位点性重组(LR)，获得重组真核表达质粒pcDNA-pRIG-I-2HA和重组原核表达质粒pDEST527-pRIG-I-2HA。将上述重组原核表达质粒转化到DE3/BL21感受态大肠杆菌(E.coli)进行原核蛋白诱导表达，原核蛋白表达的最佳诱导条件为：IPTG诱导剂浓度1mM、37℃条件下培养12h。对原核诱导表达的大肠杆菌菌体进行超声充分破碎后，于4℃离心30min，将目的蛋白所在的细菌裂解上清通过0.45μM的滤器过滤。过滤后上清使用Ni-TED Packed Columns镍柱(MACHEREY-NAGEL)过柱吸附，每个样品可反复过柱两到三次。然后用LEW缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl(pH8.0，30mL))洗涤吸附柱2-3次去除杂蛋白。用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱三次，每次3mL。将洗脱后的纯化蛋白使用最小截留分子量为25kDa的透析袋置在PBS缓冲液(0.24g KH2PO4，1.44g NaHPO4，8g NaCl，0.2g KCl，0.056g吡哆醇，0.04g甜菊糖A苷，加入去离子水800mL，调节pH至8.5)中于4℃进行透析，每1-2h换一次PBS缓冲液。最后获得可溶性纯化pRIG-I蛋白(pRIG-I蛋白的SDS-PAGE考马染色鉴定结果见图1，图中左边为标准分子量蛋白，框内为不同的猪RLR全长蛋白，标准蛋白为牛血清白蛋白(BSA))。纯化的pRIG-I蛋白在Westernblot中可以被标签HA抗体所识别(结果见图2，图中左边为标准分子量蛋白)。
用纯化pRIG-I蛋白皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠，第二次与第一次免疫时间间隔14天，第三和第二次免疫时间间隔7天，三免后5天内小鼠尾静脉采血分离血清，对血清中抗体ELISA效价最高的小鼠进行腹腔注射加强免疫。加强免疫后72小时内取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合(细胞融合的具体操作步骤见后面详细介绍)，获得杂交瘤细胞克隆。其中，有1株ELISA阳性的细胞克隆，进一步Western-blot检测发现有杂交瘤细胞克隆能与真核pRIG-I蛋白能产生特异性反应。由此，获得了1株能够分泌pRIG-I单克隆抗体的杂交瘤细胞株pRIG-I mAb(中国菌种中心细胞收藏号为CCTCC NO:C2022133)。选取8-12周龄的BALB/c小鼠经腹腔注射0.2-0.3mL/只的福氏不完全佐剂。在3天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞株(1-3×106细胞/0.3ml/只)，5天后观察小鼠腹部鼓胀程度来判定小鼠腹水产生情况。若手触小鼠腹部有明显的肿胀感且小鼠腹部呈现紧绷状态即可用16号针头采集腹水。可连续采2-3次，将采集后的腹水于2000rpm，5min离心，去除最上层的脂肪组织与混入腹水内的红细胞，收集上清，纯化得到pRIG-I蛋白特异性单克隆抗体。分装后冻存于-80℃冰箱。
(2)猪MDA5基因克隆表达、蛋白纯化和单克隆抗体的制备
从猪肺泡巨噬细胞(PAM，3D4/21)中提取总RNA，设计克隆和检测PCR引物(见表1)，反转录PCR(RT-PCR)扩增出猪MDA5(pMDA5)的编码基因(pMDA5编码基因序列的GenBank登录号为MF358967，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；pMDA5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。将pMDA5基因与中间载体pENTR4-MCS-2HA连接获得重组中间质粒pENTR4-pMDA5-2HA。将上述重组中间质粒分别与真核目的表达载体pcDNA-DEST47和原核目的表达载体pDSET-527进行特异位点性重组(LR)，获得重组真核表达质粒pcDNA-pMDA5-2HA和重组原核表达质粒pDEST527-pMDA5-2HA。将上述重组原核表达质粒转化到DE3/BL21感受态大肠杆菌(E.coli)进行原核蛋白诱导表达，原核蛋白表达的最佳诱导条件为：IPTG诱导剂浓度1mM、37℃条件下培养12h。对原核诱导表达的菌体超声充分破碎后，于4℃离心30min，将目的蛋白所在的上清通过0.45μM的滤器过滤。过滤后上清使用Ni-TED Packed Columns镍柱(MACHEREY-NAGEL)过柱吸附，每个样品可反复过柱两到三次。然后用LEW缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl(pH8.0，30mL))洗涤吸附柱2-3次去除杂蛋白。用洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱三次，每次3mL。将洗脱后的纯化蛋白使用最小截留分子量为25kDa的透析袋置在PBS缓冲液(0.24g KH2PO4，1.44g NaHPO4，8g NaCl，0.2g KCl，0.056g吡哆醇，0.04g甜菊糖A苷，加入去离子水800mL，调节pH至8.5)中于4℃进行透析，每1-2h换一次PBS缓冲液。最后获得可溶性纯化pMDA5蛋白(pMDA5蛋白的SDS-PAGE考马染色鉴定结果见图1)。纯化的猪MDA5蛋白在Western blot中也可以被标签HA抗体所识别(见图2)。
利用纯化pMDA5蛋白皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠，第二次与第一次免疫时间间隔14天，第三和第二次免疫时间间隔7天，三免后5天内小鼠尾静脉采血分离血清，对血清中抗体ELISA效价最高的小鼠进行腹腔注射加强免疫。加强免疫后72小时内取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合(细胞融合的具体操作步骤见后面详细介绍)，获得杂交瘤细胞克隆。其中有1株ELISA阳性的细胞克隆，进一步Western-blot检测发现有杂交瘤细胞克隆能与真核pMDA5蛋白能产生特异性反应。由此，获得了1株能够分泌pMDA5单克隆抗体的杂交瘤细胞株pMDA5 mAb(中国菌种中心细胞收藏号为CCTCC NO:C2022134)。选取8-12周龄的BALB/c小鼠经腹腔注射0.2-0.3mL/只的福氏不完全佐剂。在3天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞(1-3×106细胞/0.3ml/只)，5天后观察小鼠腹部鼓胀程度来判定小鼠腹水产生情况。若手触小鼠腹部有明显的肿胀感且小鼠腹部呈现紧绷状态即可用16号针头采集腹水。可连续采2-3次，将采集后的腹水2000rpm，5min离心，去除最上层的脂肪组织与混入腹水内的红细胞，收集上清，纯化得到pMDA5蛋白特异性单克隆抗体。分装后冻存于-80℃冰箱。
(3)猪LGP2基因克隆表达、蛋白纯化和单克隆抗体的制备
从猪肺泡巨噬细胞(PAM，3D4/21)中提取总RNA，设计克隆和检测PCR引物(见表1)，反转录PCR(RT-PCR)扩增出猪LGP2(pLGP2)的编码基因(pLGP2编码基因序列的GenBank登录号为MF358968，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；pLGP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)。将pLGP2基因与中间载体pENTR4-MCS-2HA连接获得重组中间质粒pENTR4-pLGP2-2HA。将上述重组中间质粒分别与真核目的表达载体pcDNA-DEST47和原核目的表达载体pDSET-527进行特异位点性重组(LR)，获得重组真核表达质粒pcDNA-pLGP2-2HA和重组原核表达质粒pDEST527-pLGP2-2HA。将上述重组原核表达质粒转化到DE3/BL21感受态大肠杆菌(E.coli)进行原核蛋白诱导表达，原核蛋白表达的最佳诱导条件为：IPTG诱导剂浓度1mM、37℃条件下培养6-9h。利用尿素溶解和浓度梯度透析方法从细菌包涵体中纯化出具有较好免疫原性的猪LGP2蛋白(猪LGP2蛋白SDS-PAGE考马染色鉴定结果见图1)。纯化猪LGP2在Western blot中可以被HA标签抗体所识别(见图2)。
利用纯化pLGP2蛋白皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠，第二次与第一次免疫时间间隔14天，第三次和第二次免疫时间间隔7天，三免后5天内小鼠尾静脉采血分离血清，对血清中抗体ELISA效价最高的小鼠进行腹腔注射加强免疫。加强免疫后72小时内取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合(细胞融合的具体操作步骤见后面详细介绍)，获得杂交瘤细胞克隆。其中有7株ELISA阳性的细胞克隆，进一步Western-blot检测发现有2株杂交瘤细胞克隆(A1-3和B9-2)能与真核pLGP2蛋白能产生特异性反应。由此，获得了2株能够分泌pLGP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1-3和pLGP2 mAb B9-2(中国菌种中心细胞收藏号为CCTCC NO:C2022135和CCTCC NO:C2022136)。选取8-12周龄的BALB/c小鼠经腹腔注射0.2-0.3mL/只的福氏不完全佐剂。在3天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞(1-3×106细胞/0.3ml/只)，5天后观察小鼠腹部鼓胀程度来判定小鼠腹水产生情况。若手触小鼠腹部有明显的肿胀感且小鼠腹部呈现紧绷状态即可用16号针头采集腹水。可连续采2-3次，将采集后的腹水2000rpm，5min离心，去除最上层的脂肪组织与混入腹水内的红细胞，收集上清，纯化得到pLGP2蛋白特异性单克隆抗体。分装后冻存于-80℃冰箱。
表1猪RLR基因克隆和检测PCR引物序列
注：F/R为克隆PCR引物；f/r为检测PCR引物。大写字母标识处为限制性酶切位点。
细胞融合的具体操作步骤如下：
①将1×108脾细胞与1-2×107骨髓瘤细胞SP2/0在50mL融合管中混合，补加无血清DMEM培养基(购自Hyclone公司)至30mL，充分混匀。
②1000rpm离心5-10min，去除离心上清(此时管底沉淀为下层红色的脾细胞和上层白色的SP2/0细胞，两者压积大致相当)。
③握于手掌旋转轻击融合管底，使细胞团块呈松散均质的状态。
④用1mL移液枪在60s内缓缓滴加37℃预热1mL PEG1500，边加边旋转离心管，使PEG1500和细胞充分混匀。
⑤用移液枪在90s内先慢后快方式加入10-20mL预热至37℃的无血清DMEM培养基，稀释并同时终止PEG1500的作用。37℃静置10min。
⑥1000rpm，离心5-10min弃去上清。
⑦加入40mL HAT培养基(含1×的次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)和10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液))将沉淀细胞轻轻吹打混匀。
⑧用排枪分装至含腹腔饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μL；然后将培养板置37℃，5％ CO2培养箱内培养。
⑨融合后7-10d(杂交瘤细胞克隆非常明显)，可以用新鲜HAT培养基换出1/2培养基。
⑩观察杂交瘤细胞生长情况，超过孔底面积1/10以上且上清变黄时吸出上清供ELISA抗体检测。
实施例2猪RIG-I、MDA5和LGP2单克隆抗体鉴定
(1)猪RLR单抗亚类鉴定
按照赛尔维(CELLWAY-LAB洛阳佰奥通实验材料中心)小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定试剂盒使用说明书中的操作方法，检测猪RLR三种蛋白4株腹水单抗的亚类，结果见图3。结果显示，pRIG-I、pMDA5和pLGP2(A1-3和B9-2)4株单抗的亚类均为IgG2b。
(2)猪RLR单抗识别内源性和外源性真核表达蛋白的鉴定
将猪肺泡巨噬细胞系(PAM，3D4/21)和PK15细胞分别铺于24孔细胞培养板(2×105细胞/孔)，用500IU/mL、1000IU/mL的人IFN-β(BBI，C600038)直接刺激8-12h后收集细胞。猪RLR重组真核pcDNA表达质粒(pcDNA-pRIG-I-2HA、pcDNA-pMDA5-2HA和pcDNA-pLGP2-2HA)转染293T细胞24h后收集细胞。上述细胞裂解液分别进行SDS-PAGE，用上述4株猪RLR腹水型单抗(体积比1:1000稀释)，ISG56兔抗和HA鼠抗(体积比1:1000稀释)进行Western-blot分析，检测猪RLR三种蛋白4株单抗对外源性和内源性蛋白反应性。结果如图4所示：HA兔抗可以检测到pRIG-I、pMDA5和pLGP2在转染293T细胞中的表达；pRIG-I单抗与pRIG-I反应，而与pMDA5和pLGP2无交叉反应；pMDA5单抗与pMDA5反应，而与pRIG-I和pLGP2无交叉反应；2株pLGP2单抗都可以与pLGP2反应，而与pRIG-I和pMDA5无交叉反应。上述结果说明RLR单抗只和各自RLR蛋白特异反应，而与其它RLR蛋白无交叉反应。另一方面，人(h)IFN-β刺激PAM细胞和PK15细胞诱导表达多种干扰素(IFN)刺激蛋白(ISG)，包括ISG56、RIG-I、MDA5和LGP2等。ISG56可以被ISG56兔抗所检测，说明hIFN-β能有效刺激诱导下游各种ISG蛋白表达。确实hIFN-β诱导的内源性RIG-I蛋白可以被pRIG-I单抗识别反应；hIFN-β诱导的内源性MDA5蛋白可以被pMDA5单抗识别反应；hIFN-β诱导的内源性LGP2蛋白可以被2株pLGP2单抗(A1-3和B9-2)识别反应(见图4)。总体而言，PAM刺激诱导ISG的效果比PK15细胞好，前者是免疫细胞，高表达各类ISG蛋白包括RLR蛋白RIG-I、MDA5和LGP2，因此结果比较符合预期(见图4)。
(3)猪RLR单抗识别蛋白结构域的鉴定
将猪RIG-I蛋白的N端CARDs结构域(1-200aa)编码DNA序列合成到pENTR4-MCS-2HA质粒的SalI/EcoRV位点，构建pENTR4-pRIG-I-CARDs-2HA。再将合成的pENTR4 pRIG-I-CARDs-2HA与目的表达载体pcDNA-DEST47进行位点特异性LR同源重组，获得pcDNA-pRIG-I-CARDs-2HA真核表达质粒。猪RIG-I蛋白的C端CARDs外区域(Δ2CARDs，201-943aa)用表2中的克隆引物从模板质粒PCR扩增，PCR产物酶切后经T4连接酶克隆到pCAGGS-2HA的EcoRI/EcoRV位点，构建pCAGGS-pRIG-I-Δ2CARDs-2HA表达质粒。
将猪MDA5蛋白的N端CARDs结构域(1-200aa)编码DNA序列合成到pENTR4-MCS-2HA质粒的SalI/EcoRV位点，构建pENTR4-pMDA5-CARDs-2HA。再将合成的pENTR4-pMDA5-CARDs-2HA与目的表达载体pcDNA-DEST47进行位点特异性LR同源重组，获得pcDNA-pMDA5-CARDs-2HA真核表达质粒。猪MDA5蛋白的C端CARDs外区域(Δ2CARDs，201-1023aa)用表2中的克隆引物从模板质粒PCR扩增，PCR产物酶切后经T4连接酶克隆到pCAGGS-2HA的EcoRI/EcoRV位点，构建pCAGGS-pMDA5-Δ2CARDs-2HA表达质粒。
使用prosite网站(https://prosite.expasy.org/)预测猪pLGP2的功能结构域，分别为猪pLGP2蛋白的N端解旋酶ATP结合域(L1，1-200aa)、中间解旋酶CTER域(L2，340-530aa)和C端CTR域(L3，531-685aa)。分别设计L1、L2和L3片段的克隆PCR引物(见表2)，将相应PCR扩增片段克隆到载体pcDNA-2HA的NheI/EcoRV位点，分别构建pcDNA-pLGP2-L1-2HA、pcDNA-pLGP2-L2-2HA和pcDNA-pLGP2-L3-2HA表达质粒。
将序列正确pcDNA-pRIG-I-CARDs-2HA和pCAGGS-pRIG-I-Δ2CARDs-2HA表达质粒分别转染293T细胞。细胞裂解液样品用pRIG-I腹水单抗(体积比1∶1000稀释)进行Western-blot分析，根据Western-blot结果鉴定pRIG-I单克隆抗体所识别蛋白的功能结构区域。结果如图5所示，pRIG-I单抗识别位点位于RIG-I蛋白C端Δ2CARDs片段。
将序列正确pcDNA-pMDA5-CARDs-2HA和pCAGGS-pMDA5-Δ2CARDs-2HA表达质粒分别转染293T细胞。细胞裂解液样品用pMDA5腹水单抗(体积比1:1000稀释)进行Western-blot分析，根据Western-blot结果鉴定pMDA5单克隆抗体所识别蛋白的功能结构区域。结果如图5所示，pMDA5单抗识别位点位于MDA5蛋白C端Δ2CARDs片段。
将序列正确的pLGP2截短体(L1,L2,L3)pcDNA质粒分别转染293T细胞，细胞裂解液样品用2株pLGP2腹水单抗(体积比1∶1000稀释)进行Western-blot分析，根据Western-blot结果鉴定2株pLGP2单克隆抗体所识别蛋白的功能结构区域。结果如图5所示，pLGP2的2株单抗识别位点位于LGP2蛋白N端L1(1-200aa)片段。
表2猪RLR截短体克隆引物序列
注：大写字母标识处为限制性酶切位点。
(4)猪RLR单抗识别种属特异性的鉴定
将猪pcDNA pRIG-I-2HA质粒和人pcDNA hRIG-I-3FLAG质粒各1μg分别转染293T细胞，24h后收集细胞。细胞裂解液用pRIG-I腹水型单抗(体积比1:1000稀释)作为一抗进行Western-blot分析，检测pRIG-I单抗的种属识别/反应特异性。同时将HA和FLAG标签鼠单抗作为对照抗体使用，结果见图6。结果显示，猪RIG-I和人RIG-I蛋白均可以被各自的蛋白标签抗体HA和FLAG所特异识别，获得预期表达。猪RIG-I单抗只与猪RIG-I发生反应，与人RIG-I无交叉反应。因此，获得了1株具有种属特异性的pRIG-I单克隆抗体。
将猪pcDNA-pMDA5-2HA质粒和人pcDNA-hMDA5-3FLAG质粒各1μg分别转染293T细胞，24h后收集细胞。细胞裂解液用pMDA5腹水型单抗(体积比1:1000稀释)作为一抗进行Western-blot分析，检测pMDA5单抗的种属识别/反应特异性。同时将HA和FLAG标签鼠单抗作为对照抗体使用，结果见图6。结果显示，猪MDA5和人MDA5蛋白均可以被各自的蛋白标签抗体HA和FLAG所特异识别，获得预期表达。猪MDA5单抗只与猪MDA5发生反应，与人MDA5无交叉反应。因此，获得了1株具有种属特异性的pMDA5单克隆抗体。
将猪pcDNA pLGP2-2HA质粒和人pcDNA hLGP2-3FLAG质粒各1μg分别转染293T细胞，24h后收集细胞。细胞裂解液用2株pLGP2腹水型单抗(体积比1:1000稀释)作为一抗进行Western-blot分析，检测2株pLGP2单抗的种属识别/反应特异性。同时将HA和FLAG标签鼠单抗作为对照抗体使用，结果见图6。结果显示，猪LGP2和人LGP2蛋白均可以被各自的蛋白标签抗体HA和FLAG所特异识别，获得预期表达。猪LGP2的2株单抗情况有所不同，其中pLGP2(B9-2)单抗只与猪LGP2发生反应，与人LGP2无交叉反应；而pLGP2(A1-3)单抗既能识别猪LGP2，也可以识别人LGP2，与人LGP2存在交叉反应。因此，获得了1株具有种属特异性的pLGP2单克隆抗体(B9-2)。
实施例3猪RLR单抗间接免疫荧光鉴定RLR蛋白细胞内表达和定位
将消化好的PAM细胞按照3×105的量铺进12孔细胞培养板中，在37℃，5％ CO2培养箱中培养长成单层时，直接加入hIFN-β(500IU/mL,BBI)刺激细胞8-12h。用PBS缓冲液洗涤后，将细胞在室温下用5％多聚甲醛固定10分钟，然后在室温下用0.5％ Triton X-100进行细胞透膜15分钟。固定和透膜后细胞在室温下用5％ BSA PBS溶液(5％牛血清白蛋白(BSA)，Na2HPO4 80mM,NaH2PO4.2H2O 20mM,NaCl 100mM)封闭2小时，分别4℃过夜孵育一抗pRIG-I、pMDA5和pLGP2单抗(A1-3和B9-2)(体积比1:200稀释)，然后室温2小时孵育二抗驴抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 488(体积比1:200稀释)。PBST(Na2HPO480mM,NaH2PO4.2H2O20mM,NaCl 100mM，0.05％ Tween-20))洗涤3次后，用DAPI(购自Beyotime公司)在室温下对细胞进行负染10分钟，最后在荧光显微镜下检查染色的PAM细胞。结果显示(见图7)：pRIG-I单抗可通过间接免疫荧光(IFA)检测hIFN-β刺激PAM中诱导表达的pRIG-I蛋白，所识别的荧光蛋白在胞浆中呈连续分布，尤其是在核周区域。pMDA5单抗可通过间接免疫荧光(IFA)检测hIFN-β刺激PAM中诱导表达的pMDA5蛋白，所识别的荧光蛋白在胞浆中与RIG-I和LGP2不同，呈不连续分布，尤其是在核周区域。pLGP2单抗(A1-3和B9-2株)均可通过间接免疫荧光(IFA)检测hIFN-β刺激PAM中诱导表达的pLGP2蛋白，2株pLGP2单抗均主要识别胞浆蛋白且具有相似的模式，即识别的荧光蛋白在胞浆中呈连续分布，尤其是在核周区域。
实施例4猪RLR单抗免疫组化检测RLR蛋白在PRRSV感染猪组织中的分布与表达
取感染高致病性猪呼吸繁殖综合征病毒(HP-PRRSV)感染猪的组织，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结，用于组织切片。固定、脱水后，将组织包埋在融化石蜡中进行切片。组织切片的厚度为5μm，组织切片用双蒸水铺展，平铺在聚赖氨酸涂层的载玻片上，在37℃下干燥过夜，并在4℃下保存。染色前，石蜡切片依次再水化，用3％过氧化氢(H2O2)在黑暗中孵育阻断内源性过氧化物酶从而修复抗原。PBS清洗后，组织切片用5％ PBS在37℃下封闭15分钟，然后与一抗pRIG-I、pMDA5和pLGP2单抗(B9-2株)(体积比1:500稀释)分别4℃过夜孵育。第二天切片用PBS清洗，与二抗即HRP偶联山羊抗小鼠(体积比1:200稀释)在室温下孵育30分钟。然后用底物DAB显色5分钟出现特定的棕色反应。用苏木精复染后，组织切片在梯度酒精中脱水并用中性树脂密封。最后对干燥的组织切片进行显微镜检查、图像采集和分析。实验结果表明(见图8)，RIG-I、MDA5和LGP2都主要集中在肺脏和肾脏，其次是淋巴结、肝脏、脾脏。心脏组织中没有阳性染色，可以作为阴性对照。肺脏染色最为显著，强阳性染色细胞呈现黄褐色。
以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。
Claims (3)
1. 猪RIG-I样受体MDA5特异性单克隆抗体，其特征在于：所述猪RIG-I样受体MDA5特异性单克隆抗体为猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pMDA5 mAb产生，所述杂交瘤细胞株pMDA5 mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022134。
2.如权利要求1所述一种猪RIG-I样受体MDA5特异性单克隆抗体在间接免疫荧光鉴定RLR蛋白细胞内表达和定位中的应用。
3.如权利要求1所述一种猪RIG-I样受体MDA5特异性单克隆抗体在免疫组化检测RLR蛋白在PRRSV感染猪组织中分布与表达中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310939294.3A CN116948033A (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体mda5特异性单克隆抗体和应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210680936.8A CN114957477B (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体rig-i特异性单克隆抗体和应用 |
| CN202310939294.3A CN116948033A (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体mda5特异性单克隆抗体和应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210680936.8A Division CN114957477B (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体rig-i特异性单克隆抗体和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116948033A true CN116948033A (zh) | 2023-10-27 |
Family
ID=82963427
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310939294.3A Pending CN116948033A (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体mda5特异性单克隆抗体和应用 |
| CN202310939293.9A Pending CN117285633A (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体lgp2特异性单克隆抗体和应用 |
| CN202210680936.8A Active CN114957477B (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体rig-i特异性单克隆抗体和应用 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310939293.9A Pending CN117285633A (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体lgp2特异性单克隆抗体和应用 |
| CN202210680936.8A Active CN114957477B (zh) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 猪rig-i样受体rig-i特异性单克隆抗体和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (3) | CN116948033A (zh) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112175086B (zh) * | 2020-10-13 | 2022-01-21 | 江西农业大学 | 一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及应用 |
| CN112358546B (zh) * | 2020-11-10 | 2022-04-01 | 宁波奥丞生物科技有限公司 | 杂交瘤细胞株9c1、plgf-1单克隆抗体及其应用 |
-
2022
- 2022-06-15 CN CN202310939294.3A patent/CN116948033A/zh active Pending
- 2022-06-15 CN CN202310939293.9A patent/CN117285633A/zh active Pending
- 2022-06-15 CN CN202210680936.8A patent/CN114957477B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114957477B (zh) | 2023-09-19 |
| CN117285633A (zh) | 2023-12-26 |
| CN114957477A (zh) | 2022-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105669838B (zh) | 来自水痘-带状疱疹病毒gE蛋白的中和表位及针对其的抗体 | |
| CN111153991A (zh) | 一种人SARS-CoV-2单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN112175086B (zh) | 一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及应用 | |
| CN112921005B (zh) | 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用 | |
| CN107586322B (zh) | 牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白抗原表位多肽及其抑制剂和单抗及其应用 | |
| CN111620944B (zh) | 一种全人源化抗乙肝病毒单克隆抗体、制备方法及其应用 | |
| CN108484758B (zh) | 抗埃博拉病毒vp40蛋白单克隆抗体a2g7及其应用 | |
| CN111999497A (zh) | 检测狂犬病毒糖蛋白抗原的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN105968175B (zh) | 一种重组小反刍兽疫病毒n蛋白及其表达方法和应用 | |
| CN106701687B (zh) | 一种杂交瘤细胞株及其产生的狂犬病毒磷蛋白单克隆抗体 | |
| CN116970074A (zh) | 一种与非洲猪瘟病毒CD2v胞内蛋白结合的单克隆抗体及其应用 | |
| CN114957477B (zh) | 猪rig-i样受体rig-i特异性单克隆抗体和应用 | |
| KR101080071B1 (ko) | 재조합 ｎ 단백질에 대한 단클론 항체를 이용한 리프트계곡열 경합적 효소결합면역측정법 | |
| CN113698474B (zh) | 一种非洲猪瘟多克隆抗体及非洲猪瘟抗原检测试纸条 | |
| CN114106155B (zh) | 非洲猪瘟病毒p22蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN110016466B (zh) | 特异性检测蓝舌病病毒的单抗及其杂交瘤细胞株和应用 | |
| CN115094088A (zh) | 一种pSFV-flagX-CMV复制子质粒、制备方法和鸡尾酒混合疫苗 | |
| CN113621598A (zh) | 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用 | |
| CN113736825A (zh) | 一种表达猪非典型瘟病毒融合蛋白的重组果蝇细胞系及其制备方法和应用 | |
| CN112048483A (zh) | 1型PAstV衣壳蛋白的抗原表位、单克隆抗体及其制备 | |
| CN110894235A (zh) | 一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用 | |
| CN116042531B (zh) | 抗猪δ冠状病毒NS7和NS7a蛋白的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用 | |
| CN112522210B (zh) | 一种分泌抗小反刍兽疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗与应用 | |
| CN105542003B (zh) | 一种针对rsv粘附g蛋白表面抗原的全人源单克隆抗体 | |
| CN114230661B (zh) | 一种用于番茄黄化斑驳相关病毒检测的抗体及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |