JPWO2018062199A1 - 人工組換えロタウイルスの作製方法 - Google Patents
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Abstract
（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程、および（３）宿主細胞を培養する工程を含むレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法を提供する。本発明は、従来法よりウイルス作製効率が向上したレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であり、ヘルパーウイルスを使用せずに人工組換えロタウイルスを作製することができる。
Description
本発明は、レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法に関するものであり、特に人工組換えロタウイルスの作製方法に関するものである。
レオウイルス科に属するロタウイルスは、乳幼児の下痢症の原因ウイルスとして知られている。ロタウイルスが感染、発症しやすいのは生後６か月から２歳の乳幼児であり、５歳までにほぼ１００％が感染する。ロタウイルスに対するワクチンは実用化されており、その予防効果も確認されている。しかし一方で、より安価で防御効果の高い次世代ワクチンの開発研究が進められている。
人工的にウイルスを作製できるリバースジェネティクス（ＲＧ）系は多くのＲＮＡウイルスで確立されており、ウイルス学的基礎研究、およびウイルスベクターやワクチンベクター開発等の応用研究の発展に大いに貢献している。しかし、１０〜１２本の分節二本鎖ＲＮＡゲノムを有するレオウイルス科におけるＲＧ系は、その分節ゲノムの複雑さから、他のＲＮＡウイルスと比較して開発が遅れている。
レオウイルス科において、オルビレオウイルス属ブルータングウイルス、アフリカ馬疫ウイルスでは、ウイルスＲＮＡを細胞に導入することで組換えウイルスを作製できるＲＮＡベースのＲＧ系が開発されている（非特許文献１，２）。オルソレオウイルス属哺乳類オルソレオウイルスでは、完全なｃＤＮＡからなるＤＮＡベースのＲＧ系が開発されている（非特許文献３）。ロタウイルス属ロタウイルスでは、ヘルパーウイルスを用いた部分的なＤＮＡベースのＲＧ系が報告されている（非特許文献４，５）。しかし、ヘルパーウイルスを用いるＲＧ系は、ヘルパーウイルスから目的のウイルスを選別する強力な方法が必要であること、限られた分節遺伝子（ＶＰ４遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子）にしか変異を導入できないこと、作製効率が低いことが問題である。そこで、ヘルパーウイルスを必要としない、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのみの導入によりロタウイルスを作製できる完全なＲＧ系の開発が待ち望まれている。
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レオウイルス科に属するウイルスのリバースジェネティクス系を改良し、従来法よりウイルス作製効率が向上したレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法を提供することを課題とする。また、ヘルパーウイルスを必要としない人工組換えロタウイルスの作製方法を提供することを課題とする。さらに、ウイルス分節ゲノムに変異を導入したワクチン候補の人工組換えロタウイルスを提供することを課題とする。
本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、
（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程、および
（３）宿主細胞を培養する工程
を含むことを特徴とする作製方法。
［２］人工組換えウイルスが、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されていること、および／または、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれていることを特徴とする前記［１］に記載の作製方法。
［３］ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である前記［１］または［２］に記載の作製方法。
［４］キャッピング酵素が、宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのキャッピング酵素である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の作製方法。
［４−１］キャッピング酵素が、ポックスウイルス科に属するウイルスのキャッピング酵素である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の作製方法。
［５］分節ＲＮＡゲノムの発現カセットが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ウイルス分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡおよび自己切断作用を有するリボザイムをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の作製方法。
［６］ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターであり、宿主細胞が組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞であることを特徴とする前記［５］に記載の作製方法。
［７］リボザイムが、Ｄ型肝炎ウイルスリボザイムである前記［５］または［６］に記載の作製方法。
［８］宿主細胞とウイルス高感受性細胞を共培養することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の作製方法。
［９］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスが、人工組換えロタウイルスである前記［１］〜［８］のいずれかに記載の作製方法。
［１０］宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることを特徴とする前記［９］に記載の作製方法。
［１１］人工組換えロタウイルスが、外来遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスであり、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターに代えて、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットのＮＳＰ１遺伝子内に外来遺伝子が挿入され、かつ、ＮＳＰ１遺伝子の１００〜１５５０塩基が欠失している発現カセットを含むベクターを用いることを特徴とする前記［９］または［１０］に記載の作製方法。
［１２］ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞にウイルスを感染させて培養することを特徴とするウイルス複製促進方法。
［１３］ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である前記［１２］に記載の方法。
［１４］ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されていることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１５］外来遺伝子を発現することを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１６］リアソータントであることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１７］前記［１４］〜［１６］のいずれかに記載の人工組換えロタウイルスを含有するワクチン。
［１８］ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットを導入し、培養することを特徴とする人工組換えロタウイルスの作製方法。
［１９］宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする前記［１８］に記載の作製方法。
［２０］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットが導入された宿主細胞に、ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする作製方法。
［１］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、
（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程、および
（３）宿主細胞を培養する工程
を含むことを特徴とする作製方法。
［２］人工組換えウイルスが、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されていること、および／または、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれていることを特徴とする前記［１］に記載の作製方法。
［３］ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である前記［１］または［２］に記載の作製方法。
［４］キャッピング酵素が、宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのキャッピング酵素である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の作製方法。
［４−１］キャッピング酵素が、ポックスウイルス科に属するウイルスのキャッピング酵素である前記［１］〜［３］のいずれかに記載の作製方法。
［５］分節ＲＮＡゲノムの発現カセットが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ウイルス分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡおよび自己切断作用を有するリボザイムをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれかに記載の作製方法。
［６］ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターであり、宿主細胞が組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞であることを特徴とする前記［５］に記載の作製方法。
［７］リボザイムが、Ｄ型肝炎ウイルスリボザイムである前記［５］または［６］に記載の作製方法。
［８］宿主細胞とウイルス高感受性細胞を共培養することを特徴とする前記［１］〜［７］のいずれかに記載の作製方法。
［９］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスが、人工組換えロタウイルスである前記［１］〜［８］のいずれかに記載の作製方法。
［１０］宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることを特徴とする前記［９］に記載の作製方法。
［１１］人工組換えロタウイルスが、外来遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスであり、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターに代えて、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットのＮＳＰ１遺伝子内に外来遺伝子が挿入され、かつ、ＮＳＰ１遺伝子の１００〜１５５０塩基が欠失している発現カセットを含むベクターを用いることを特徴とする前記［９］または［１０］に記載の作製方法。
［１２］ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞にウイルスを感染させて培養することを特徴とするウイルス複製促進方法。
［１３］ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である前記［１２］に記載の方法。
［１４］ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されていることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１５］外来遺伝子を発現することを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１６］リアソータントであることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１７］前記［１４］〜［１６］のいずれかに記載の人工組換えロタウイルスを含有するワクチン。
［１８］ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットを導入し、培養することを特徴とする人工組換えロタウイルスの作製方法。
［１９］宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする前記［１８］に記載の作製方法。
［２０］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットが導入された宿主細胞に、ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする作製方法。
本発明により、従来のリバースジェネティクス系より人工組換えウイルスの作製効率が向上したレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法を提供することができる。また、従来実現していなかったヘルパーウイルスを必要としない人工組換えロタウイルスの作製方法を提供することができる。さらに、ウイルス分節ゲノムに変異を導入したワクチン候補の人工組換えロタウイルスを提供することができる。
〔人工組換えウイルスの作製方法〕
本発明は、レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法（以下、「本発明の作製方法」と記す）を提供する。本発明の作製方法は、以下の工程（１）、（２）および（３）を含むものであればよい。
（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程
（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程
（３）宿主細胞を培養する工程
本発明は、レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法（以下、「本発明の作製方法」と記す）を提供する。本発明の作製方法は、以下の工程（１）、（２）および（３）を含むものであればよい。
（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程
（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程
（３）宿主細胞を培養する工程
レオウイルス科に属するウイルスは、１０〜１２本に分節した直鎖二本鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスであり、そのビリオンは直径６０〜８０ｎｍの正二十面体構造を示す。レオウイルス科に属するウイルスには、哺乳類オルソレオウイルス、ネルソンベイレオウイルス、トリレオウイルス等のオルソレオウイルス属（Genus Orthoreovirus）、アフリカ馬疫ウイルス、ブルータングウイルス等のオルビウイルス属（Genus Orbivirus）、ロタウイルス等のロタウイルス属（Genus Rotavirus）、コロラドダニ熱ウイルス等のコルチウイルス属（Genus Coltivirus）、アクアレオウイルスＡ等のアクアレオウイルス属（Genus Aquareovirus）、細胞質多角体病ウイルス等のサイポウイルス属（Genus Cypovirus）、イネ南方黒すじ萎縮病ウイルス等のフィジウイルス属（Genus Fijivirus）、イネ萎縮病ウイルス等のフィトレオウイルス属（Genus Phytoreovirus）およびイネラギッドスタントウイルス（Rice ragged stunt virus）等のオリザウイルス属（Genus Oryzavirus）が含まれる。なかでも、本発明の作製方法は、哺乳類オルソレオウイルスおよびロタウイルスの人工組換えウイルスに適用することが好ましい。
ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットは、ウイルス分節ゲノムである二本鎖ＲＮＡの鋳型となる一本鎖プラス鎖ＲＮＡ（ウイルスｍＲＮＡ）を発現可能な構造を有するものであれば特に限定されない。好ましい発現カセットとしては、例えば上流から順にＲＮＡポリメラーゼプロモーター、分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡ（分節ＲＮＡゲノムのｃＤＮＡ）および自己切断作用を有するリボザイムをコードするＤＮＡから構成される発現カセットが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターの場合は、Ｔ７ターミネーター配列が発現カセットに含まれる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがポリメラーゼＩ由来プロモーターの場合は、そのプロモーターに対応するターミネーター配列が発現カセットに含まれる。ポリメラーゼＩＩ由来のプロモーターの場合は、ポリアデニレーションシグナル配列が発現カセットに含まれる。
ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡ（分節ＲＮＡゲノムのｃＤＮＡ）のみから構成されていてもよい。このような発現カセットを含むベクターにおいて、分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡの３’末端を、例えば制限酵素で切断することにより、直鎖状ベクターの切断パターンがウイルスゲノム３’末端のみをコードし、ベクター由来の配列が転写されない構造を有する状態で使用することができる。
分節ＲＮＡゲノムのｃＤＮＡは、ウイルスからＲＮＡを抽出し、得られた二本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲにより取得することができる。プライマーセットは、目的の分節ＲＮＡゲノムの塩基配列に基づいて特異的なプライマーセットを設計することができる。ウイルスの分節ＲＮＡゲノムの塩基配列は、公知のデータベース（GenBank等）から取得することができる。また、市販のシークエンサーを用いて公知の方法により、ウイルスの分節ＲＮＡゲノムの塩基配列を決定してもよい。
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ポリメラーゼＩ由来プロモーター、ポリメラーゼＩＩ由来のＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどを好適に用いることができる。好ましくはＴ７プロモーターである。
自己切断作用を有するリボザイムは、公知の自己切断作用を有するリボザイムを適宜選択して用いることができる。自己切断作用を有するリボザイムとしては、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、リボヌクレアーゼＰのＭ１サブユニット、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、Ｖａｒｋｕｄ ｓａｔｅｌｌｉｔｅリボザイムなどが挙げられる。好ましくはＨＤＶリボザイムである。
分節ＲＮＡゲノム発現カセットを挿入するベクターとしては、公知のクローニングベクター、哺乳動物細胞用発現ベクター、各種ウイルスベクター（ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）などを好適に用いることができる。
１つのベクターに、１つの分節ＲＮＡゲノム発現カセットが含まれている場合、ウイルスの分節数と同数のベクターが１セットになる。２つ以上の分節ＲＮＡゲノム発現カセットが１つのベクターに含まれているポリシストロニックベクターを使用してもよい。１つのベクターに含まれる分節ＲＮＡゲノム発現カセットの数は限定されず、１つのベクターに全分節の発現カセットが含まれてもよい。人工組換えウイルスの作製効率の観点から、ベクター数は少ない方が好ましい。
宿主細胞に導入するための一本鎖ＲＮＡはプラス鎖ＲＮＡであり、分節ＲＮＡゲノムの発現カセットからインビトロ転写することにより取得することができる。インビトロ転写は、例えば市販の試薬（例えば、in vitro Transcription T7 Kit（タカラバイオ）等）を用いて行うことができる。使用するＲＮＡはインビトロ転写後、キャップアナログ（例えば、Ribo m7G Cap Analog（プロメガ）等）を用いてキャッピングすることが望ましい。一本鎖ＲＮＡのセットは、ウイルスの分節数と同数である。
ＦＡＳＴ（fusion-associated small transmembrane）タンパク質としては、レオウイルス科オルソレオウイルス属の膜融合性（Fusogenic）レオウイルスグループに属する既知のウイルスおよび今後新規に分離されるウイルスのＦＡＳＴタンパク質を使用することができる。具体的には、例えばネルソンベイレオウイルス（Nelson Bay reovirus）のｐ１０（GenBank ACCESSION: BAJ52806）、トリレオウイルス（Avian reovirus）のｐ１０（GenBank ACCESSION: AGO32037）、ブルームウイルス（Broome reovirus）のｐ１３（GenBank ACCESSION: YP_003717780）、爬虫類レオウイルス（Reptilian reovirus）のｐ１４（GenBank ACCESSION: AAP03134）、ヒヒレオウイルス（Baboon reovirus）のｐ１５（GenBank ACCESSION: YP_004769555）、ソウギョレオウイルス（Grass carp reovirus）のｐ１６（GenBank ACCESSION: ABV01045）、タイセイヨウサケレオウイルス（Atlantic salmon reovirus）のｐ２２（GenBank ACCESSION: ACN38055）などが挙げられる。好ましくはネルソンベイレオウイルスのｐ１０またはトリレオウイルスのｐ１０である。
ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターは、例えばｐＣＡＧＧＳプラスミド（図１０参照）のような公知の哺乳動物細胞用発現ベクターや公知のウイルスベクターに、上記ＦＡＳＴタンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、作製することができる。ＦＡＳＴタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、ウイルスゲノムの塩基配列情報から取得することができる。ウイルスゲノムの塩基配列情報は公知のデータベース（GenBank等）に登録されているものを使用することができる。ネルソンベイレオウイルスのｐ１０をコードする遺伝子の塩基配列として、例えば配列番号２６の塩基配列を使用することができ、トリレオウイルス（Avian reovirus）のｐ１０をコードする遺伝子の塩基配列として、例えば配列番号２７の塩基配列を使用することができる。
ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターに代えて、ＦＡＳＴタンパク質をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡを用いることができる。ＦＡＳＴタンパク質をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡは、例えばＦＡＳＴタンパク質発現ベクターからインビトロ転写することにより取得することができる。インビトロ転写は、例えば市販の試薬（例えば、in vitro Transcription T7 Kit（タカラバイオ）等）を用いて行うことができる。使用するＲＮＡはインビトロ転写後、キャップアナログ（例えば、Ribo m7G Cap Analog（プロメガ）等）を用いてキャッピングすることが望ましい。
キャッピング酵素としては、細胞質でｍＲＮＡのキャッピング反応を触媒できる酵素であれば特に限定されず、宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのキャッピング酵素を好適に用いることができる。宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスのキャッピング酵素としては、例えば、ポックスウイルス科に属するウイルスがコードするキャッピング酵素、アスファウイルス科に属するウイルスがコードするキャッピング酵素などが挙げられる。宿主細胞の細胞質内で複製するＲＮＡウイルスのキャッピング酵素としては、トガウイルス科のウイルスのｎｓｐ１タンパク質などが挙げられる。好ましくは、ポックスウイルス科またはアスファウイルス科に属するウイルスがコードするキャッピング酵素である。ポックスウイルス科のウイルスがコードするキャッピング酵素としては、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を好適に用いることができる。アスファウイルス科に属するウイルスがコードするキャッピング酵素としてはアフリカ豚コレラウイルスのＮＰ８６８Ｒを好適に用いることができる。ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いる場合、キャッピング酵素ラージサブユニット（GenBank ACCESSION: YP_232988）をコードする遺伝子（Ｄ１Ｒ）およびスモールサブユニット（GenBank ACCESSION: YP_232999）をコードする遺伝子（Ｄ１２Ｌ）を、例えばｐＣＡＧＧＳプラスミド（図１０参照）のような公知の哺乳動物細胞用発現ベクターや公知のウイルスベクターにそれぞれ挿入することにより、キャッピング酵素発現ベクターを作製することができる。ワクシニアウイルスキャッピング酵素のラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列として、例えば配列番号２９の塩基配列を使用することができ、スモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列として例えば配列番号３０の塩基配列を使用することができる。ＦＡＳＴタンパク質発現カセットとキャッピング酵素サブユニット発現カセットが１つのベクターに含まれているポリシストロニックベクターを使用してもよい。
キャッピング酵素発現ベクターに代えて、キャッピング酵素の各サブユニットをコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡを用いることができる。キャッピング酵素の各サブユニットをコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡは、例えばキャッピング酵素の各サブユニットの発現ベクターからインビトロ転写することにより取得することができる。インビトロ転写は、例えば市販の試薬（例えば、in vitro Transcription T7 Kit（タカラバイオ）等）を用いて行うことができる。使用するＲＮＡはインビトロ転写後、キャップアナログ（例えば、Ribo m7G Cap Analog（プロメガ）等）を用いてキャッピングすることが望ましい。
宿主細胞には、レオウイルス科に属するウイルスに対する感受性が高く、かつ遺伝子導入効率が高い細胞を好適に用いることができる。このような細胞として、ＢＨＫ細胞、ＭＡ１０４細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＶ１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ９２９細胞、２９３Ｔ細胞Ａ５４９細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記各細胞由来の改変細胞（新たにクローニングされた細胞や外来遺伝子を導入した細胞など）も宿主細胞として好適に用いることができる。
分節ＲＮＡゲノム発現カセットのプロモーターにＴ７プロモーターを用いる場合、宿主細胞として組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞を使用することができる。組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞は、例えば宿主細胞として使用可能な細胞に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（GenBank ACCESSION: ADJ00046）をコードする遺伝子が挿入された哺乳動物細胞用発現ベクターをトランスフェクションし、薬剤選択等の手段を用いて組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを安定発現する細胞を選択することにより、作製することができる。また、例えば宿主細胞として使用可能な細胞に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が挿入された各種ウイルスベクター（ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）を感染させて、組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを一過性、もしくは持続的に発現する細胞を作製することもできる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば「T7RNA polymerase vector pGemT7cat」の塩基配列（GenBank ACCESSION: HM049174）の８９４位〜３５４５位の塩基配列を使用することができる。また、公知の組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞（例えばBHK/T7-9: Ito, N et al., (2003) Microbiology and immunology 47, 613-617）を使用することができる。
工程（１）におけるＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターの宿主細胞への導入、工程（２）におけるウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットの宿主細胞への導入は、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知のトランスフェクション手段を用いて行うことができる。また、市販のトランスフェクション試薬（例えば、TransIT-LT1（商品名、Mirus）等）を用いて行うことができる。
本発明の作製方法において、工程（１）と工程（２）を別々に行ってもよく、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）を別々に行う場合は、工程（１）の後に工程（２）を行ってもよく、工程（２）の後に工程（１）を行ってもよい。好ましくは工程（１）と工程（２）を同時に行うことである。つまり、本発明の方法は、以下の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含むことが好ましい。
（Ｉ）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクター、ならびに、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターまたは該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを、同時に宿主細胞に導入する工程
（ＩＩ）宿主細胞を培養する工程
（Ｉ）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクター、ならびに、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターまたは該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを、同時に宿主細胞に導入する工程
（ＩＩ）宿主細胞を培養する工程
ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターが導入された宿主細胞は、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を一過性に発現する細胞でもよく、持続的に発現する細胞でもよい。宿主細胞として、上記の組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞を使用する場合は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに加えて、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を持続的に発現する細胞を用いることができる。ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を持続的に発現する細胞は、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを導入し、薬剤選択等の手段を用いてＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を安定発現する細胞を選択することにより、作製することができる。また、持続発現細胞は、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を常時発現している細胞でもよく、例えばＴｅｔ ｏｎ／ｏｆｆシステム等により、発現を制御できる細胞でもよい。また、例えば宿主細胞として使用可能な細胞に、ＦＡＳＴタンパク質をコードする遺伝子および／またはキャッピング酵素をコードする遺伝子が挿入された各種ウイルスベクター（ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）を感染させて、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を一過性、もしくは持続的に発現する細胞を作製することもできる。
トランスフェクションに用いる核酸量は、使用する培養プレートの大きさ、宿主細胞の種類、播種細胞数等に応じて適切な量を選択することが好ましい。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ安定発現ＢＨＫ細胞を宿主細胞とし、６ウェルプレートに８×１０５個／ウェルで播種し、翌日にトランスフェクションを行う場合、各分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量はそれぞれ０．５〜１．０μｇが好ましく、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターのＤＮＡ量は０．００２〜０．０２μｇが好ましく、キャッピング酵素発現ベクターのＤＮＡ量は０．５〜１．０μｇが好ましい。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ安定発現ＢＨＫ細胞を宿主細胞とし、１２ウェルプレートに４×１０５個／ウェルで播種し、翌日にトランスフェクションを行う場合、各分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量はそれぞれ０．２５〜０．５μｇが好ましく、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターのＤＮＡ量は０．０００１〜０．０１μｇが好ましく、キャッピング酵素発現ベクターのＤＮＡ量は０．２５〜０．５μｇが好ましい。
宿主細胞の培養には、宿主細胞に適した培地を適宜選択して用いることができる。宿主細胞に細胞変性が観察されれば、人工組換えウイルスが作製されたと判断することができる。細胞変性が確認されたプレートまたはウェルの培地と細胞を回収し、細胞溶解液を調製して、これをウイルス試料とすることができる。また、この細胞溶解液からプラーク法によりウイルスを単離し、多量培養後、ウイルス粒子を精製してウイルス試料としてもよい。ウイルス粒子の精製は、公知の方法（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離等）により行うことができる。
宿主細胞に数日培養した後、細胞変性の有無に関わらず上記のように細胞溶解液を調製し、この細胞溶解液を他の細胞に添加してウイルスを継代してもよい。他の細胞としては、ウイルス高感受性細胞が好ましく、作製しようとするウイルスに対する高感受性細胞がより好ましい。例えば人工組換えロタウイルスを作製する場合は、ＭＡ１０４細胞またはＣＶ１細胞が好ましい。細胞溶解液を添加した他の細胞を培養し、細胞変性が観察されれば、人工組換えウイルスが作製されたと判断することができる。
あるいは、宿主細胞に各ベクター等をトランスフェクションした数日後に、宿主細胞の培養プレートまたはウェルに上記のウイルス高感受性細胞を播種し、共培養を行ってもよい。共培養を行う場合、添加する他の細胞の播種細胞数はトランスフェクションに供した細胞の１／５〜１／２０程度が好ましい。細胞添加後、トリプシン（例えば、約0.5μg/ml）を添加した無血清培地で約３〜５日程度培養した後、細胞溶解液を調製してウイルス高感受性細胞に添加し継代する。継代したウイルス高感受性細胞を上記のトリプシン添加無血清培地で培養し、細胞変性が観察されれば、人工組換えウイルスが作製されたと判断することができる。細胞変性が確認されたプレートまたはウェルの培地と細胞を回収し、細胞溶解液を調製して、これをウイルス試料とすることができる。また、この細胞溶解液からプラーク法によりウイルスを単離し、多量培養後、ウイルス粒子を精製してウイルス試料としてもよい。ウイルス粒子の精製は、公知の方法（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離等）により行うことができる。
本発明の作製方法において、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されている人工組換えウイルス、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれている人工組換えウイルス、または、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されかつ分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれている人工組換えウイルスを作製することができる。このような人工組換えウイルスは、分節ＲＮＡゲノムの発現カセットに所望の変異を導入すること、および／または、所望の外来遺伝子を組み込むことにより作製することができる。分節ＲＮＡゲノムの発現カセットへの変異導入や外来遺伝子の組み込みは、公知の遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。
本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１に欠失変異を導入した自立増殖が可能な人工組換えロタウイルス、ＮＳＰ３に欠失変異を導入した自立増殖が可能な人工組換えロタウイルスおよびＮＳＰ４にアミノ酸置換変異を導入した自立増殖が可能な人工組換えロタウイルスの作製に成功している。また、増殖に必須のウイルスタンパク質遺伝子を一部欠失させ、自立増殖できない人工組換えロタウイルスを作製することができる。すなわち、増殖に必須のウイルスタンパク質遺伝子を一部欠失させ、変異タンパク質を発現するように改変した宿主細胞を用いることにより、自立増殖できない人工組換えウイルスを作製することができる。このようにして作製された人工組換えウイルスは、変異ウイルスタンパク質に対応する正常ウイルスタンパク質を発現する細胞でのみ増殖することができる。したがって、当該人工組換えウイルスは、１回感染型のウイルス様粒子の作製に応用でき、ワクチンとして有用であると考えられる。さらに、既知の強毒化、弱毒化に関与するウイルスタンパク質遺伝子に変異を加えて、弱毒化ワクチン候補の人工組換えウイルスを作製することもできる。
また、本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１遺伝子にルシフェラーゼ遺伝子（Ｎｌｕｃ遺伝子）を組み込んで、ルシフェラーゼを発現する人工組換えロタウイルスの作製に成功している。さらに、本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１遺伝子に緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子）を組み込んで、ＺｓＧｒｅｅｎを発現する人工組換えロタウイルスの作製に成功している。外来遺伝子は、ロタウイルスのいずれの分節ゲノムにも組み込むことが可能であると考えられる。外来遺伝子は、Ｎｌｕｃ遺伝子（配列番号３１）やＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子（配列番号３３）のような５００ｂｐ以上のサイズの遺伝子に限定されず、短いペプチドをウイルスタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。２以上の外来遺伝子を有する場合、外来遺伝子は異なる２以上の分節ゲノムにそれぞれ１つの外来遺伝子が組み込まれていてもよく、１つの分節ゲノムに２以上の外来遺伝子が組み込まれていてもよい。分節ゲノムの変異と外来遺伝子の組み合わせも特に限定はなく、適宜選択して組み合わせることができる。
外来遺伝子発現ベクターとして、外来遺伝子をロタウイルスのＮＳＰ１遺伝子に挿入すると共に、ＮＳＰ１遺伝子の一部を欠失させた分節ゲノム発現カセットを含むベクターを用いることが好ましい。外来遺伝子の挿入位置は特に限定されないが、通常ＮＳＰ１遺伝子の５’末端（非翻訳領域を含む）の約３０塩基〜約２００塩基より下流、かつ、ＮＳＰ１遺伝子の３’末端（非翻訳領域を含む）の約３０塩基〜約２００塩基より上流の範囲に外来遺伝子の挿入することが好ましい。より好ましくはＮＳＰ１遺伝子の５’末端（非翻訳領域を含む）から約８０塩基〜約１５０塩基の範囲、さらに好ましくはＮＳＰ１遺伝子の５’末端（非翻訳領域を含む）から約１００塩基〜約１３０塩基の範囲に外来遺伝子を挿入する。ＮＳＰ１遺伝子の欠失部位は特に限定されないが、外来遺伝子挿入位置より下流であることが好ましい。ただし、ＮＳＰ１遺伝子の３’末端（非翻訳領域を含む）領域を残すことが好ましく、少なくとも約３０塩基以上、約５０塩基以上、約１００塩基以上、約２００塩基以上を残すことが好ましい。欠失させる塩基数は特に限定されず、１５５０塩基以下、１２００塩基以下、１０００塩基以下、８００塩基以下、７００塩基以下、６００塩基以下、５００塩基以下、４００塩基以下であってもよい。また、欠失させる塩基数は、１００塩基以上、２００塩基以上、３００塩基以上であってもよい。このような外来遺伝子発現ベクターを用いることにより、外来遺伝子を長期間安定に保持し、外来遺伝子産物を長期間安定に発現する人工組換えロタウイルスを作製することができる。
本発明の作製方法により作製された変異を有する人工組換えウイルスや外来遺伝子を発現するウイルスは、ウイルスタンパク質の機能解析に有用であると共に、ワクチンやワクチンベクターの開発に有用である。また、変異を有する人工組換えウイルスや外来遺伝子を発現するウイルスをワクチンとして使用できると考えられる。
本発明の作製方法により人工組換えロタウイルスを作製する場合、宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることにより、人工組換えロタウイルスの作製効率を向上させることができる。ＮＳＰ２遺伝子産物およびＮＳＰ５遺伝子産物のどちらか一方を宿主細胞に過剰発現させてもよく、両方を宿主細胞に過剰発現させてもよい。ＮＳＰ２遺伝子産物とＮＳＰ５遺伝子産物の両方を宿主細胞に過剰発現させることが好ましい。
ＮＳＰ２遺伝子産物を発現するベクター（以下、「ＮＳＰ２発現ベクター」と記す）およびＮＳＰ５遺伝子産物を発現するベクター（以下、「ＮＳＰ５発現ベクター」と記す）を作製し、これらの一方または両方を宿主細胞に導入することにより、宿主細胞にＮＳＰ２遺伝子産物および／またはＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることができる。ＮＳＰ２発現ベクターおよびＮＳＰ５発現ベクターは、ＮＳＰ２遺伝子（GenBank ACCESSION: LC178571、配列番号１８）およびＮＳＰ５遺伝子（GenBank ACCESSION: LC178574、配列番号２１）を、例えばｐＣＡＧＧＳプラスミド（図１０参照）のような公知の哺乳動物細胞用発現ベクターや公知のウイルスベクターにそれぞれ挿入することにより作製することができる。
ＮＳＰ２発現ベクターに挿入するＮＳＰ２遺伝子およびＮＳＰ５発現ベクターに挿入するＮＳＰ５遺伝子は、作製しようとする人工組換えロタウイルスと同一株のＮＳＰ２遺伝子およびＮＳＰ５遺伝子であってもよく、異なる遺伝子型、異なる血清群または異なる動物（ヒト、サル、ウマ、トリ、イヌ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等）のロタウイルスのＮＳＰ２遺伝子およびＮＳＰ５遺伝子であってもよい。ＮＳＰ２発現カセット、ＮＳＰ５発現カセットが１つのベクターに含まれているポリシストロニックベクターを使用してもよい。
ＮＳＰ２発現ベクターに代えて、ＮＳＰ２をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡを用いることができる。同様に、ＮＳＰ５発現ベクターに代えて、ＮＳＰ５をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡを用いることができる。これらの一本鎖プラス鎖ＲＮＡは、例えばＮＳＰ２発現ベクターおよびＮＳＰ５発現ベクターからインビトロ転写することにより、それぞれ取得することができる。インビトロ転写は、例えば市販の試薬（例えば、in vitro Transcription T7 Kit（タカラバイオ）等）を用いて行うことができる。使用するＲＮＡはインビトロ転写後、キャップアナログ（例えば、Ribo m7G Cap Analog（プロメガ）等）を用いてキャッピングすることが望ましい。
ＮＳＰ２発現ベクターおよび／またはＮＳＰ５発現ベクターを使用せずに、セグメント８（ＮＳＰ２遺伝子）を発現する分節ＲＮＡゲノム発現ベクター（セグメント８発現ベクター）および／またはセグメント１１（ＮＳＰ５遺伝子）を発現する分節ＲＮＡゲノム発現ベクター（セグメント１１発現ベクター）の宿主細胞への導入量を、他のセグメントを発現する分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより増量することにより、宿主細胞にＮＳＰ２遺伝子産物および／またはＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることができる。宿主細胞に導入するセグメント８発現ベクターおよび／またはセグメント１１発現ベクターのＤＮＡ量は、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより多ければ特に限定されず、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量の約１．５倍〜約１０倍であってもよく、約２倍〜約５倍であってもよい。ロタウイルスの各分節ゲノム（セグメント）については、実施例２の表２を参照のこと。
さらに本発明者らは、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を発現する宿主細胞を使用しなくても、人工組換えロタウイルスを作製できることを確認した（実施例１０参照）。すなわち本発明は、ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットを導入し、培養することを特徴とする人工組換えロタウイルスの作製方法を提供する。
当該作製方法の第一の実施形態は、ＮＳＰ２発現ベクターおよび／またはＮＳＰ５発現ベクターを導入した宿主細胞を用いる方法である。当該作製方法の第二の実施形態は、宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットのみを導入する方法である。第２の実施形態において、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセット中、セグメント８発現ベクターおよび／またはセグメント１１発現ベクターの宿主細胞への導入量を、他のセグメントを発現する分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより増量することが好ましい。宿主細胞に導入するセグメント８発現ベクターおよび／またはセグメント１１発現ベクターのＤＮＡ量は、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより多ければ特に限定されず、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量の約１．５倍〜約１０倍であってもよく、約２倍〜約５倍であってもよい。
ロタウイルスのＮＳＰ２とＮＳＰ５はウイルス感染細胞内にウイルス封入体（Viral inclusion body）を形成し、ウイルス複製の場として機能することが知られている（Hu L, Crawford S, Hyser J, Estes M, and Prasad V (2012): Rotavirus non-structural proteins: Structure and Function Current Opinion in Virology 2(4): 380-388.）。ウイルス封入体は、レオウイルス科に属するウイルスに共通して見られる構造であり、レオウイルス科オルソレオウイルス属（哺乳類オルソレオウイルス、ネルソンベイレオウイルス、トリレオウイルス等）のＭ３遺伝子にコードされるμＮＳおよびＳ３遺伝子またはＳ４遺伝子にコードされるσＮＳ、レオウイルス科オルビウイルス属（アフリカ馬疫ウイルス、ブルータングウイルス等）のセグメント８にコードされるＮＳ２が同様にウイルス封入体を形成し、ウイルス複製の場として機能することが知られている（Thomas CP, Booth TF, Roy P (1990): Synthesis of bluetongue virus-encoded phosphoprotein and formation of inclusion bodies by recombinant baculovirus in insect cells: it binds the single-stranded RNA species. Journal of General Virology, 71 (Pt 9): 2073-2083.）。そこで、本発明らは、哺乳類オルソレオウイルスの人工組換えウイルス作製の際に、μＮＳ発現ベクターおよびσＮＳ発現ベクターを導入した宿主細胞を用いたところ、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することを確認した（実施例１３参照）。
したがって、本発明は、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットが導入された宿主細胞に、ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とするレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法を提供する。宿主細胞には、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を発現する宿主細胞を用いてもよく、ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞を用いてもよい。ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物としては、オルソレオウイルス属ウイルスのＭ３遺伝子にコードされるμＮＳ、オルソレオウイルス属ウイルスのＳ３遺伝子またはＳ４遺伝子にコードされるσＮＳ、オルビウイルス属のセグメント８にコードされるＮＳ２などが挙げられ、これらを単独または組み合わせて用いることができる。
ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させるために、該遺伝子発現ベクターを宿主細胞に導入してもよく、該遺伝子をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターのＤＮＡ量を、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより増量して宿主細胞に導入してもよい。該遺伝子をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターのＤＮＡ量は、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量の約１．５倍〜約１０倍であってもよく、約２倍〜約５倍であってもよい。
〔人工組換えロタウイルスおよびワクチン〕
本発明は、ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されている人工組換えロタウイルスを提供する。本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１のＣ末端領域の１０８アミノ酸を欠失した人工組換えロタウイルスの作製に成功している。ＮＳＰ１のＣ末端領域は自然免疫の抑制に重要な働きをすることが知られているので（Barro, M., and Patton, J.T. (2005). Rotavirus nonstructural protein 1 subverts innate immune response by inducing degradation of IFN regulatory factor 3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 4114-4119.）この人工組換えロタウイルスは複製能を保持した弱毒ウイルスであり、ワクチンとして有用であると考えられる。さらに本発明者らは、ＮＳＰ３に欠失変異を有する人工組換えロタウイルスおよびＮＳＰ３にアミノ酸置換変異を有する人工組換えロタウイルスを作製し、ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４にそれぞれ変異を有する人工組換えロタウイルスが、野生型人工組換えロタウイルスと比較して増殖が低下していることを確認している。したがって、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４にそれぞれ変異を有する人工組換えロタウイルスも複製能を保持した弱毒ウイルスであり、ワクチンとして有用であると考えられる。このようなＮＳＰ１１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されている人工組換えロタウイルスを含有するワクチンも本発明に含まれる。
本発明は、ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されている人工組換えロタウイルスを提供する。本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１のＣ末端領域の１０８アミノ酸を欠失した人工組換えロタウイルスの作製に成功している。ＮＳＰ１のＣ末端領域は自然免疫の抑制に重要な働きをすることが知られているので（Barro, M., and Patton, J.T. (2005). Rotavirus nonstructural protein 1 subverts innate immune response by inducing degradation of IFN regulatory factor 3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 4114-4119.）この人工組換えロタウイルスは複製能を保持した弱毒ウイルスであり、ワクチンとして有用であると考えられる。さらに本発明者らは、ＮＳＰ３に欠失変異を有する人工組換えロタウイルスおよびＮＳＰ３にアミノ酸置換変異を有する人工組換えロタウイルスを作製し、ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４にそれぞれ変異を有する人工組換えロタウイルスが、野生型人工組換えロタウイルスと比較して増殖が低下していることを確認している。したがって、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４にそれぞれ変異を有する人工組換えロタウイルスも複製能を保持した弱毒ウイルスであり、ワクチンとして有用であると考えられる。このようなＮＳＰ１１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されている人工組換えロタウイルスを含有するワクチンも本発明に含まれる。
本発明は、外来遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスを提供する。外来遺伝子は特に限定されないが、例えば、ワクチン抗原をコードする外来遺伝子を用いることにより、作製された人工組換えロタウイルスをワクチンとして使用することができる。ワクチン抗原としては、例えば経口または粘膜感染症であるノロウイルス抗原、アデノウイルス抗原、Ａ型肝炎抗原、サポウイルス抗原、手足口病ウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、ＨＩＶ抗原、サルモネラ抗原、カンピロバクター抗原、腸炎ビブリオ抗原、大腸菌Ｏ１５７抗原、コレラ抗原、腸チフス抗原、赤痢抗原等が挙げられる。これらのワクチン抗原は、エピトープペプチドであってもよい。異なる外来ワクチン抗原を発現する人工組換えロタウイルスを複数組み合わせて、ワクチンを構成してもよい。
外来遺伝子として、異種または異株のロタウイルスの抗原タンパク質（例えばＶＰ４、ＶＰ７等）をコードする遺伝子を１つ以上発現させることにより、ロタウイルスの多価ワクチンとして使用可能な人工組換えロタウイルスを提供することができる。抗原タンパク質は、エピトープペプチドであってもよい。
レポーター遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスは、ウイルス量を容易に可視化できるので、抗ロタウイルス薬のスクリーニングに利用することができる。レポーター遺伝子は公知のレポーター遺伝子から適宜選択することができる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子などを好適に選択することができる。
本発明は、リアソータントである人工組換えロタウイルスを提供する。ロタウイルスのリアソータントとは、異種または異株のロタウイルス間で分節ゲノムの組換えが生じた新しい遺伝子型構成を持つロタウイルスを意味する。リアソータントは遺伝子再集合体とも称される。本発明の作製方法を用いれば、全てのロタウイルス種間で人工組換えリアソータントロタウイルスのデザイン、作製が可能である。異なるウイルス株同士の遺伝子分節の交換は自然感染においても認められ、ロタウイルスのような分節ゲノムをもつウイルスにとって重要な進化の方法であると考えられている。このような種または株が異なるロタウイルス間のリアソータントは、分節ゲノムの機能解析に有用であると共に、ワクチン候補の人工組換えロタウイルスとして極めて有用である。例えば、血清型が異なるロタウイルスのＶＰ４遺伝子分節ゲノムまたはＶＰ７遺伝子分節ゲノムを含むリアソータントは、二価のロタウイルスワクチンとして使用できる。また、これらを複数混合することにより、多価ロタウイルスワクチンを構成することができる。
〔ウイルス複製促進方法〕
本発明は、ウイルス複製促進方法を提供する。本発明のウイルス複製促進方法は、ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞にウイルスを感染させて培養することを特徴とする。感染させるウイルスは特に限定されないが、レオウイルス科に属するウイルスが好ましい。なかでも、哺乳類オルソレオウイルスおよびロタウイルスが好ましい。ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞として使用可能な細胞に、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターを導入することにより作製することができる。ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターは、上記本発明の作製方法において説明したＦＡＳＴタンパク質発現ベクターを使用することができる。宿主細胞および宿主細胞への各ベクターの導入方法も、上記本発明の作製方法と同じ方法で行うことができる。ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞は、ＦＡＳＴタンパク質を一過性に発現する細胞でもよく、ＦＡＳＴタンパク質を持続的に発現する細胞でもよい。
本発明は、ウイルス複製促進方法を提供する。本発明のウイルス複製促進方法は、ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞にウイルスを感染させて培養することを特徴とする。感染させるウイルスは特に限定されないが、レオウイルス科に属するウイルスが好ましい。なかでも、哺乳類オルソレオウイルスおよびロタウイルスが好ましい。ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞として使用可能な細胞に、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターを導入することにより作製することができる。ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターは、上記本発明の作製方法において説明したＦＡＳＴタンパク質発現ベクターを使用することができる。宿主細胞および宿主細胞への各ベクターの導入方法も、上記本発明の作製方法と同じ方法で行うことができる。ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞は、ＦＡＳＴタンパク質を一過性に発現する細胞でもよく、ＦＡＳＴタンパク質を持続的に発現する細胞でもよい。
トランスフェクションに用いる核酸量は、使用する培養プレートの大きさ、宿主細胞の種類、播種細胞数等に応じて適切な量を選択することが好ましい。例えば、Ｖｅｒｏ細胞を宿主細胞とし、６ウェルプレートに８×１０５個／ウェルで播種し、翌日にトランスフェクションを行う場合、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターのＤＮＡ量は０．００２〜０．０２μｇが好ましい。トランスフェクションに用いるＤＮＡ量は、用いるプレートに適した播種細胞数に比例するように適宜変更することができる。
宿主細胞へのウイルスの感染は、宿主細胞の培地にウイルス試料を添加することで行うことができる。ウイルス感染量は特に限定されないが、ＭＯＩ０．１〜０．０００１が好ましい。培養期間は特に限定されないが、１６〜４８時間がより好ましい。
本発明のウイルス複製促進方法は、増殖（複製）能が低いウイルスに適用することでウイルスの増殖（複製）を促進することができる。また、高いウイルス力価を有するウイルスストックを作製する際に有用である。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：哺乳類オルソレオウイルスリバースジェネティクス系の改良〕
哺乳類オルソレオウイルス（MRV）はレオウイルス科のモデルウイルスとして解析が進んでおり、プラスミドのみを用いたリバースジェネティクス（RG）系がレオウイルス科で最初に開発された（非特許文献３）。レオウイルス科のRG系の改良を目的に膜融合性（Fusogenic）レオウイルスグループがコードするFASTタンパク質ならびにワクシニアウイルスがコードするキャッピング酵素を用いて人工組換えウイルス作製効率の増強能について検討した。
哺乳類オルソレオウイルス（MRV）はレオウイルス科のモデルウイルスとして解析が進んでおり、プラスミドのみを用いたリバースジェネティクス（RG）系がレオウイルス科で最初に開発された（非特許文献３）。レオウイルス科のRG系の改良を目的に膜融合性（Fusogenic）レオウイルスグループがコードするFASTタンパク質ならびにワクシニアウイルスがコードするキャッピング酵素を用いて人工組換えウイルス作製効率の増強能について検討した。
＜材料および方法＞
（１）ウイルス
哺乳類オルソレオウイルスtype1 Lang株（以下、「MRV T1L株」と記す）を使用した。MRV T1L株はATCCから購入することができる（ATCC VR-230）。MRV T1L株の10個の各分節RNAゲノムの遺伝子名およびGenBank ACCESSIONを表１に示す。
（１）ウイルス
哺乳類オルソレオウイルスtype1 Lang株（以下、「MRV T1L株」と記す）を使用した。MRV T1L株はATCCから購入することができる（ATCC VR-230）。MRV T1L株の10個の各分節RNAゲノムの遺伝子名およびGenBank ACCESSIONを表１に示す。
（２）MRV T1L株の各分節RNAゲノム発現カセットを含むプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）の作製
MRV T1L株の10個の分節RNAゲノム（L1〜3、M1〜3、S1〜4）のcDNAを含むプラスミドは、参考文献１（Kobayashi et al. Virology. 2010 Mar 15;398(2):194-200）に記載の方法に従って作製した。すなわち、ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（各分節RNAゲノムのcDNA）をp3E5EGFP（Watanabe et al., (2004) Journal of virology, 78, 999-1005）にクローニングした。これにより、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された発現カセットを有するプラスミドを得た。得られたプラスミドは、図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に各分節RNAゲノムをコードするcDNAが挿入された構造を有する。
MRV T1L株の10個の分節RNAゲノム（L1〜3、M1〜3、S1〜4）のcDNAを含むプラスミドは、参考文献１（Kobayashi et al. Virology. 2010 Mar 15;398(2):194-200）に記載の方法に従って作製した。すなわち、ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（各分節RNAゲノムのcDNA）をp3E5EGFP（Watanabe et al., (2004) Journal of virology, 78, 999-1005）にクローニングした。これにより、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された発現カセットを有するプラスミドを得た。得られたプラスミドは、図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に各分節RNAゲノムをコードするcDNAが挿入された構造を有する。
次に、L1をクローニングしたプラスミド（pT7-L1T1L）にM2の発現カセットを挿入して、バイシストロニックなプラスミド（pT7-L1-M2T1L）を作製した。同様に、L2をクローニングしたプラスミド（pT7-L2 T1L）にM2の発現カセットを挿入して、バイシストロニックなプラスミド（pT7-L2-M3T1L）を作製し、L3をクローニングしたプラスミド（pT7-L3 T1L）にS3の発現カセットを挿入して、バイシストロニックなプラスミド（pT7-L3-S3T1L）を作製した。さらに、S2をクローニングしたプラスミド（pT7-S2T1L）にS3、S4およびM1の発現カセットをそれぞれ挿入して、テトラシストロニックなプラスミド（pT7-S1-S2-S4-M1T1L）を作製した。
（３）FASTタンパク質発現ベクターの作製
FASTタンパク質発現ベクターは、ネルソンベイレオウイルスp10遺伝子（GenBank ACCESSION: AB908284 参照）のタンパク質コード領域DNA（配列番号26）またはトリレオウイルスp10遺伝子（GenBank ACCESSION: AF218358 参照）のタンパク質コード領域DNA（配列番号27）を、図１０に示すpCAGGSプラスミド（5699bp、配列番号28、Matsuo et al., 2006, Biochem Biophys Res Commun 340(1): 200-208）に挿入して作製した。各コード領域DNAは、配列番号27の塩基配列および配列番号28の塩基配列に基づいて、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-p10（ネルソンベイレオウイルスp10発現ベクター）およびpCAG-ARVp10（トリレオウイルスp10ベクター）を得た。
FASTタンパク質発現ベクターは、ネルソンベイレオウイルスp10遺伝子（GenBank ACCESSION: AB908284 参照）のタンパク質コード領域DNA（配列番号26）またはトリレオウイルスp10遺伝子（GenBank ACCESSION: AF218358 参照）のタンパク質コード領域DNA（配列番号27）を、図１０に示すpCAGGSプラスミド（5699bp、配列番号28、Matsuo et al., 2006, Biochem Biophys Res Commun 340(1): 200-208）に挿入して作製した。各コード領域DNAは、配列番号27の塩基配列および配列番号28の塩基配列に基づいて、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-p10（ネルソンベイレオウイルスp10発現ベクター）およびpCAG-ARVp10（トリレオウイルスp10ベクター）を得た。
（４）キャッピング酵素発現ベクターの作製
キャッピング酵素発現ベクターは、ワクシニアウイルスD1R遺伝子のタンパク質コード領域DNA（GenBank ACCESSION: NC006998の93948位〜96482位、配列番号29）およびワクシニアウイルスD12L遺伝子のタンパク質コード領域DNA（GenBank ACCESSION: NC006998の107332位〜108195位、配列番号30）を、上記pCAGGSプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、配列番号29の塩基配列および配列番号30の塩基配列に基づいて、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-D1R（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素ラージサブユニット発現ベクター）およびpCAG-D12L（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素スモールサブユニット発現ベクター）を得た。
キャッピング酵素発現ベクターは、ワクシニアウイルスD1R遺伝子のタンパク質コード領域DNA（GenBank ACCESSION: NC006998の93948位〜96482位、配列番号29）およびワクシニアウイルスD12L遺伝子のタンパク質コード領域DNA（GenBank ACCESSION: NC006998の107332位〜108195位、配列番号30）を、上記pCAGGSプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、配列番号29の塩基配列および配列番号30の塩基配列に基づいて、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-D1R（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素ラージサブユニット発現ベクター）およびpCAG-D12L（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素スモールサブユニット発現ベクター）を得た。
（５）宿主細胞
T7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。BHK-T7/P5細胞は、CAGプロモーターの下流にT7RNAポリメラーゼをコードするDNAを挿入したpCAGGSプラスミドをBHK細胞（Baby Hamster Kidney Cells）にトランスフェクションし、ピューロマイシン含有培地で培養して選択することにより作製した。
T7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。BHK-T7/P5細胞は、CAGプロモーターの下流にT7RNAポリメラーゼをコードするDNAを挿入したpCAGGSプラスミドをBHK細胞（Baby Hamster Kidney Cells）にトランスフェクションし、ピューロマイシン含有培地で培養して選択することにより作製した。
（６）人工組換えウイルスの作製
トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を2×105個/ウェルで24ウェル培養プレートに播種した。分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）各0.4、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10またはpCAG-ARVp10）0.05μg、0.005μgまたは0.0005μg、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）各0.2μgを、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μlのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解したものをウイルス試料としてプラークアッセイに供し、ウイルスタイターを測定した。
トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を2×105個/ウェルで24ウェル培養プレートに播種した。分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）各0.4、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10またはpCAG-ARVp10）0.05μg、0.005μgまたは0.0005μg、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）各0.2μgを、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μlのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解したものをウイルス試料としてプラークアッセイに供し、ウイルスタイターを測定した。
（７）プラークアッセイ
プラークアッセイは以下の手順で行った。
(a) マウスL929細胞を、1.2×106個/ウェル/2ml MEM培地で6ウェル培養プレートに播種し、一夜培養。
(b) 上記ウイルス試料110μlをゼラチン含有生理食塩水1mlに添加して攪拌し、10倍希釈液を調製。この手順を繰り返して、段階希釈ウイルス試料を調製。
(c) 培地を除去し、各希釈段階のウイルス試料100μl/ウェルを添加（1試料につき2ウェル）。時々攪拌しながら、室温で60分間インキュベーション。
(d) 保温した2×199培地/ager（2%アガロースと2×199培地の等量混合物）3ml/ウェルを添加し、37℃2日間インキュベート。
(e) (d)の2日後に2×199培地/agerを2ml/ウェルで重層し、37℃4日間インキュベート。
(f) (e)の2日後にニュートラルレッド含有2×199培地/agerを2ml/ウェルで重層し、37℃一夜インキュベート。
(g) プラークカウント。
プラークアッセイは以下の手順で行った。
(a) マウスL929細胞を、1.2×106個/ウェル/2ml MEM培地で6ウェル培養プレートに播種し、一夜培養。
(b) 上記ウイルス試料110μlをゼラチン含有生理食塩水1mlに添加して攪拌し、10倍希釈液を調製。この手順を繰り返して、段階希釈ウイルス試料を調製。
(c) 培地を除去し、各希釈段階のウイルス試料100μl/ウェルを添加（1試料につき2ウェル）。時々攪拌しながら、室温で60分間インキュベーション。
(d) 保温した2×199培地/ager（2%アガロースと2×199培地の等量混合物）3ml/ウェルを添加し、37℃2日間インキュベート。
(e) (d)の2日後に2×199培地/agerを2ml/ウェルで重層し、37℃4日間インキュベート。
(f) (e)の2日後にニュートラルレッド含有2×199培地/agerを2ml/ウェルで重層し、37℃一夜インキュベート。
(g) プラークカウント。
＜結果＞
結果を図１に示した。MRV T1L株の４種の分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）のみを導入した細胞のウイルスタイターと比較して、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10、0.005μg）を共導入した細胞のウイルスタイターは約600倍に増加した。また、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）を共導入した細胞のウイルスタイターは約100倍に増加した。さらに、FASTタンパク質発現ベクターとキャッピング酵素発現ベクターの両方を共導入した細胞のウイルスタイターは約1200倍に増加した。この結果から、FASTタンパク質発現ベクターおよびキャッピング酵素発現ベクターの少なくとも一方と、分節RNAゲノム発現ベクターとを宿主細胞に共導入することにより、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することが示された。ただし、宿主細胞に導入するFASTタンパク質発現ベクターのDNA量が0.05μgの場合はウイルスタイターが検出されず、0.0005μgの場合にはウイルスタイターの大幅な増加は認められなかった。したがって、宿主細胞にFASTタンパク質を共発現させる場合は、適切な発現量になるように、導入するFASTタンパク質発現ベクターのDNA量を調整する必要があることが示された。
結果を図１に示した。MRV T1L株の４種の分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）のみを導入した細胞のウイルスタイターと比較して、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10、0.005μg）を共導入した細胞のウイルスタイターは約600倍に増加した。また、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）を共導入した細胞のウイルスタイターは約100倍に増加した。さらに、FASTタンパク質発現ベクターとキャッピング酵素発現ベクターの両方を共導入した細胞のウイルスタイターは約1200倍に増加した。この結果から、FASTタンパク質発現ベクターおよびキャッピング酵素発現ベクターの少なくとも一方と、分節RNAゲノム発現ベクターとを宿主細胞に共導入することにより、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することが示された。ただし、宿主細胞に導入するFASTタンパク質発現ベクターのDNA量が0.05μgの場合はウイルスタイターが検出されず、0.0005μgの場合にはウイルスタイターの大幅な増加は認められなかった。したがって、宿主細胞にFASTタンパク質を共発現させる場合は、適切な発現量になるように、導入するFASTタンパク質発現ベクターのDNA量を調整する必要があることが示された。
図を示していないが、FASTタンパク質発現ベクターとしてpCAG-ARVp10を用いた場合も、図１と同様の結果が得られた。さらに、本発明者らは、哺乳類オルソレオウイルスtype3 Dearing株（MRV T3D株）の人工組換えウイルスについても、MRV T3D株の分節RNAゲノム発現ベクター（非特許文献３参照）と、FASTタンパク質発現ベクターおよびキャッピング酵素発現ベクターの少なくとも一方とを宿主細胞に共導入する実験を行い、MRV T1L株と同様に、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することを確認した。
また、本発明者らは、ネルソンベイレオウイルスの人工組換えウイルス作製において、ネルソンベイレオウイルスの分節RNAゲノム発現ベクター以外にキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入すれば、人工組換えネルソンベイレオウイルスの作製効率が大幅に向上することを確認した。なお、ネルソンベイレオウイルスは自身のp10遺伝子によりFASTタンパク質を発現している。
〔実施例２：ロタウイルスリバースジェネティクス系の開発〕
＜材料および方法＞
（１）ウイルス
サルロタウイルスSA11株を使用した。本発明者らは、このウイルス株の11個の各分節RNAゲノムの塩基配列を決定し、登録している。本実験に使用したサルロタウイルスSA11株（以下、「SA11株」と記す）の11個の各分節RNAゲノムの名前およびGenBank ACCESSIONを表２に示す。
＜材料および方法＞
（１）ウイルス
サルロタウイルスSA11株を使用した。本発明者らは、このウイルス株の11個の各分節RNAゲノムの塩基配列を決定し、登録している。本実験に使用したサルロタウイルスSA11株（以下、「SA11株」と記す）の11個の各分節RNAゲノムの名前およびGenBank ACCESSIONを表２に示す。
（２）SA11株の各分節RNAゲノム発現カセットを含むプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）の作製
SA11株の11個の分節RNAゲノムのcDNAを含むプラスミドを作製した。ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（各分節RNAゲノムのcDNA）を図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に挿入し、各分節RNAゲノムの発現カセットを含むプラスミドを得た。各分節RNAゲノムの発現カセットは、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された構造を有する。作製したプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）を、それぞれpT7-VP1SA11、pT7-VP2SA11、pT7-VP3SA11、pT7-VP4SA11、pT7-VP6SA11、pT7-VP7SA11、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11、pT7-NSP4SA11およびpT7-NSP5SA11と称する。
SA11株の11個の分節RNAゲノムのcDNAを含むプラスミドを作製した。ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（各分節RNAゲノムのcDNA）を図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に挿入し、各分節RNAゲノムの発現カセットを含むプラスミドを得た。各分節RNAゲノムの発現カセットは、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された構造を有する。作製したプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）を、それぞれpT7-VP1SA11、pT7-VP2SA11、pT7-VP3SA11、pT7-VP4SA11、pT7-VP6SA11、pT7-VP7SA11、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11、pT7-NSP4SA11およびpT7-NSP5SA11と称する。
（３）マーカー変異導入プラスミドの作製
KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）を用いて、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11およびpT7-NSP4SA11にマーカー変異を導入した。具体的には、pT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の1053位のTをC、1059位のTをCに変異させ、pT7-NSP2SA11のNSP2遺伝子（配列番号18）の409位のAをT、418位のTをCに変異させ、pT7-NSP3SA11のNSP3遺伝子（配列番号17）の406位のAをG、412位のAをTに変異させ、pT7-NSP4SA11のNSP4遺伝子（配列番号20）の389位のGをA、395位のAをGに変異させた。その結果、NSP1遺伝子（配列番号15）の1049位〜1054位がBamHI認識配列、NSP2遺伝子（配列番号18）の413位〜418位がEcoRV認識配列、NSP3遺伝子（配列番号17）の408位〜413位がEcoRI認識配列、NSP4遺伝子（配列番号20）の393位〜398位がMluI認識配列になったマーカー変異導入プラスミド（それぞれpT7-NSP1SA11 /BamHI、pT7-NSP2SA11 /EcoRV、pT7-NSP3SA11 /EcoRI、pT7-NSP4SA11 /MluIと称する）を作製した（図２参照）。
KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）を用いて、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11およびpT7-NSP4SA11にマーカー変異を導入した。具体的には、pT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の1053位のTをC、1059位のTをCに変異させ、pT7-NSP2SA11のNSP2遺伝子（配列番号18）の409位のAをT、418位のTをCに変異させ、pT7-NSP3SA11のNSP3遺伝子（配列番号17）の406位のAをG、412位のAをTに変異させ、pT7-NSP4SA11のNSP4遺伝子（配列番号20）の389位のGをA、395位のAをGに変異させた。その結果、NSP1遺伝子（配列番号15）の1049位〜1054位がBamHI認識配列、NSP2遺伝子（配列番号18）の413位〜418位がEcoRV認識配列、NSP3遺伝子（配列番号17）の408位〜413位がEcoRI認識配列、NSP4遺伝子（配列番号20）の393位〜398位がMluI認識配列になったマーカー変異導入プラスミド（それぞれpT7-NSP1SA11 /BamHI、pT7-NSP2SA11 /EcoRV、pT7-NSP3SA11 /EcoRI、pT7-NSP4SA11 /MluIと称する）を作製した（図２参照）。
（４）FASTタンパク質発現ベクター
FASTタンパク質発現ベクターには、実施例１で作製したpCAG-p10（ネルソンベイレオウイルスp10発現ベクター）を使用した。
FASTタンパク質発現ベクターには、実施例１で作製したpCAG-p10（ネルソンベイレオウイルスp10発現ベクター）を使用した。
（５）キャッピング酵素発現ベクター
キャッピング酵素発現ベクターには、実施例１で作製したpCAG-D1R（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素ラージサブユニット発現ベクター）およびpCAG-D12L（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素スモールサブユニット発現ベクター）を使用した。
キャッピング酵素発現ベクターには、実施例１で作製したpCAG-D1R（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素ラージサブユニット発現ベクター）およびpCAG-D12L（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素スモールサブユニット発現ベクター）を使用した。
（６）宿主細胞
宿主細胞には、実施例１と同じT7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。
宿主細胞には、実施例１と同じT7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。
（７）人工組換えウイルスの作製
野生型人工組換えウイルスの作製には、上記（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターを用いた。１個のマーカー変異を有する人工組換えウイルス（rsSA11）の作製には、pT7-NSP4SA11に代えてpT7-NSP4SA11/MluIを用いた。３個のマーカー変異を有する人工組換えウイルス（rsSA11-3）の作製には、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11/BamHIを用い、pT7-NSP2SA11に代えてpT7-NSP2SA11/EcoRVを用い、pT7-NSP3SA11に代えてpT7-NSP3SA11/EcoRIを用いた。
野生型人工組換えウイルスの作製には、上記（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターを用いた。１個のマーカー変異を有する人工組換えウイルス（rsSA11）の作製には、pT7-NSP4SA11に代えてpT7-NSP4SA11/MluIを用いた。３個のマーカー変異を有する人工組換えウイルス（rsSA11-3）の作製には、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11/BamHIを用い、pT7-NSP2SA11に代えてpT7-NSP2SA11/EcoRVを用い、pT7-NSP3SA11に代えてpT7-NSP3SA11/EcoRIを用いた。
トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を8×105個/ウェルで6ウェル培養プレートに播種した。11種類の分節RNAゲノム発現ベクター各0.8μg、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10）0.015μg、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）各0.8μgを、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μLのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、サルMA104細胞（ATCC CRL-2378.1）に継代した。具体的には、前記細胞溶解液約0.5mlをトリプシン0.5μg/ml 存在下で、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に添加した。MA104細胞の培養にはFBS不含DMEM培地を使用した。継代後7日間培養し、その間に細胞変性が認められた場合に人工組換えウイルスが作製されたと判断した。本実施例では、野生型SA11、rsSA11およびrsSA11-3のいずれの発現ベクターを導入した細胞にも細胞変性が認められたので、人工組換えロタウイルスの作製に成功したと判断した。
（８）マーカー変異の確認
細胞変性が観察されたウェルの培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製した。野生型SA11、rsSA11およびrsSA11-3の細胞溶解液から、Trizol試薬（Thermo Scientific）を用いて、それぞれウイルスゲノムRNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。逆転写酵素には、SuperScript III 逆転写酵素（Thermo Scientific）を用いた。野生型SA11およびrsSA11-3のNSP1の増幅産物、NSP2の増幅産物およびNSP3の増幅産物をそれぞれBamHI、EcoRVおよびEcoRIで処理し、1.2％アガロース電気泳動に供した。野生型SA11およびrsSA11のNSP46の増幅産物をMluIで処理し、1.2％アガロース電気泳動に供した。
細胞変性が観察されたウェルの培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製した。野生型SA11、rsSA11およびrsSA11-3の細胞溶解液から、Trizol試薬（Thermo Scientific）を用いて、それぞれウイルスゲノムRNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。逆転写酵素には、SuperScript III 逆転写酵素（Thermo Scientific）を用いた。野生型SA11およびrsSA11-3のNSP1の増幅産物、NSP2の増幅産物およびNSP3の増幅産物をそれぞれBamHI、EcoRVおよびEcoRIで処理し、1.2％アガロース電気泳動に供した。野生型SA11およびrsSA11のNSP46の増幅産物をMluIで処理し、1.2％アガロース電気泳動に供した。
＜結果＞
結果を図３に示した。（Ａ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP1の増幅産物をBamHIで処理した結果、（Ｂ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP2の増幅産物をEcoRVで処理した結果、（Ｃ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP3の増幅産物をEcoRIで処理した結果、（Ｄ）が野生型SA11およびrsSA11のNSP46の増幅産物をMluIで処理した結果の電気泳動像である。rsSA11-3およびrsSA11のゲノムRNAにはマーカー変異が導入されており、いずれも対応する制限酵素で切断されることが確認できた。したがって、本ロタウイルスリバースジェネティクス系によって得られたウイルスは、分節RNAゲノム発現ベクター由来の人工組換えロタウイルスであることが明らかになった。
結果を図３に示した。（Ａ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP1の増幅産物をBamHIで処理した結果、（Ｂ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP2の増幅産物をEcoRVで処理した結果、（Ｃ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP3の増幅産物をEcoRIで処理した結果、（Ｄ）が野生型SA11およびrsSA11のNSP46の増幅産物をMluIで処理した結果の電気泳動像である。rsSA11-3およびrsSA11のゲノムRNAにはマーカー変異が導入されており、いずれも対応する制限酵素で切断されることが確認できた。したがって、本ロタウイルスリバースジェネティクス系によって得られたウイルスは、分節RNAゲノム発現ベクター由来の人工組換えロタウイルスであることが明らかになった。
〔実施例３：欠失変異を有する人工組換えロタウイルスの作製〕
宿主自然免疫反応の抑制因子であるNSP1の部分的欠失変異を有する人工組換えロタウイルスの作製を試みた。
宿主自然免疫反応の抑制因子であるNSP1の部分的欠失変異を有する人工組換えロタウイルスの作製を試みた。
＜材料および方法＞
（１）欠失変異NSP1遺伝子を有するプラスミドの作製
pT7-NSP1SA11を鋳型として、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）および特異的プライマーを用いて、NSP1遺伝子（配列番号15）の1192位〜1490位の299塩基が欠失した変異NSP1遺伝子（図４参照）を有するプラスミドを作製した。このプラスミド（pT7-NSP1SA11ΔC108と称する）は、NSP1のC末端側108アミノ酸を欠失したNSP1タンパク質を発現する。
（１）欠失変異NSP1遺伝子を有するプラスミドの作製
pT7-NSP1SA11を鋳型として、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）および特異的プライマーを用いて、NSP1遺伝子（配列番号15）の1192位〜1490位の299塩基が欠失した変異NSP1遺伝子（図４参照）を有するプラスミドを作製した。このプラスミド（pT7-NSP1SA11ΔC108と称する）は、NSP1のC末端側108アミノ酸を欠失したNSP1タンパク質を発現する。
（２）人工組換えウイルスの作製および変異の確認
欠失変異ロタウイルス（rsSA11/NSP1ΔC108）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11ΔC108を用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。同時に野生型人工組換えウイルスを実施例２と同じ方法で作製した。細胞変性が観察されたMA104細胞のウェルから培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、rsSA11/NSP1ΔC108および野生型SA11の細胞溶解液からそれぞれウイルスゲノムRNAを抽出し、SDS-PAGEに供した。
欠失変異ロタウイルス（rsSA11/NSP1ΔC108）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11ΔC108を用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。同時に野生型人工組換えウイルスを実施例２と同じ方法で作製した。細胞変性が観察されたMA104細胞のウェルから培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、rsSA11/NSP1ΔC108および野生型SA11の細胞溶解液からそれぞれウイルスゲノムRNAを抽出し、SDS-PAGEに供した。
＜結果＞
結果を図５に示した。図５から明らかなように、rsSA11/NSP1ΔC108の各ゲノムRNAのバンドは、NSP1以外すべて野生型人工組換えウイルスと同じ位置に確認された。一方NSP1ΔC108のバンドの位置は、野生型のバンドの位置と異なり、NSP1ΔC108のゲノムRNAが野生型より短いことが確認された。NSP1のC末端領域は自然免疫の抑制に重要な領域であることから、本実施例で作製された変異ロタウイルスは、複製能を保持した弱毒ウイルスとして優れたワクチン候補であると考えられる。
結果を図５に示した。図５から明らかなように、rsSA11/NSP1ΔC108の各ゲノムRNAのバンドは、NSP1以外すべて野生型人工組換えウイルスと同じ位置に確認された。一方NSP1ΔC108のバンドの位置は、野生型のバンドの位置と異なり、NSP1ΔC108のゲノムRNAが野生型より短いことが確認された。NSP1のC末端領域は自然免疫の抑制に重要な領域であることから、本実施例で作製された変異ロタウイルスは、複製能を保持した弱毒ウイルスとして優れたワクチン候補であると考えられる。
〔実施例４：ルシフェラーゼ発現ロタウイルスの作製〕
ロタウイルスをワクチンベクターとして利用する目的で外来遺伝子発現ロタウイルスの作製を試みた。
ロタウイルスをワクチンベクターとして利用する目的で外来遺伝子発現ロタウイルスの作製を試みた。
＜材料および方法＞
（１）ルシフェラーゼ遺伝子挿入NSP1発現プラスミドの作製
ルシフェラーゼ遺伝子として、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼ遺伝子であるNluc遺伝子を用いた。pNL1.1ベクター（プロメガ、GenBank ACCESSION: KM359774、3817 bp）のNlucタンパク質コード領域である815位〜1330位（配列番号31）をPCRで増幅し、増幅産物をpT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の128位と129位の間に挿入して、ルシフェラーゼ遺伝子挿入NSP1遺伝子発現プラスミド（pT7-NSP1SA11-Nlucと称する）を作製した（図６参照）。
（１）ルシフェラーゼ遺伝子挿入NSP1発現プラスミドの作製
ルシフェラーゼ遺伝子として、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼ遺伝子であるNluc遺伝子を用いた。pNL1.1ベクター（プロメガ、GenBank ACCESSION: KM359774、3817 bp）のNlucタンパク質コード領域である815位〜1330位（配列番号31）をPCRで増幅し、増幅産物をpT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の128位と129位の間に挿入して、ルシフェラーゼ遺伝子挿入NSP1遺伝子発現プラスミド（pT7-NSP1SA11-Nlucと称する）を作製した（図６参照）。
（２）人工組換えウイルスの作製およびルシフェラーゼ発現の確認
ルシフェラーゼ発現ロタウイルスは、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11-Nlucを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。MA104細胞に継代7日後に培地および細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製して、プラークアッセイに供した。プラークアッセイには、CV-1細胞（ATCC CCL-70）を使用した。CV-1細胞の培養には、FBS不含DMEM培地を使用した。MA104細胞の細胞溶解液を10倍段階希釈し、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のCV-1細胞に添加してウイルスを感染させた。60分間インキュベーションした後、培地を除去し、0.8％アガロースゲルおよび0.5μg/mlのトリプシンを含有するDMEM培地を細胞に重層した。ウイルス感染から4日後にプラークの発光を確認した。すなわち、Nano-Glo Luciferase Assay System（商品名、プロメガ）の基質原液をFBS不含DMEM培地で約500倍に希釈して各ウェルに添加し、インビボイメージングシステム（IVIS Spectrum、Xenogen社製）で発光を検出した。続いて、10%ホルムアルデヒドで細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色してプラークを可視化した。
ルシフェラーゼ発現ロタウイルスは、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11-Nlucを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。MA104細胞に継代7日後に培地および細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製して、プラークアッセイに供した。プラークアッセイには、CV-1細胞（ATCC CCL-70）を使用した。CV-1細胞の培養には、FBS不含DMEM培地を使用した。MA104細胞の細胞溶解液を10倍段階希釈し、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のCV-1細胞に添加してウイルスを感染させた。60分間インキュベーションした後、培地を除去し、0.8％アガロースゲルおよび0.5μg/mlのトリプシンを含有するDMEM培地を細胞に重層した。ウイルス感染から4日後にプラークの発光を確認した。すなわち、Nano-Glo Luciferase Assay System（商品名、プロメガ）の基質原液をFBS不含DMEM培地で約500倍に希釈して各ウェルに添加し、インビボイメージングシステム（IVIS Spectrum、Xenogen社製）で発光を検出した。続いて、10%ホルムアルデヒドで細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色してプラークを可視化した。
＜結果＞
結果を図７に示した。左が細胞をクリスタルバイオレットで染色してプラークを観察した画像であり、右は同一ウェルの発光を観察した画像である。プラークの位置と同じ位置が発光していることから、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスが作製できたことが示された。この結果はロタウイルスのゲノムに外来遺伝子を挿入できることが実証するものであり、人工組換えロタウイルスはワクチンベクターとして応用可能であると考えられる。なお、自立増殖可能な外来遺伝子発現ウイルスの作製における外来遺伝子挿入部位として、NSP1遺伝子の他に、NSP3遺伝子（Montero H, Arias CF, Lopez S. Rotavirus Nonstructural Protein NSP3 Is Not Required for Viral Protein Synthesis. Journal of Virology. 2006;80(18):9031-9038. doi:10.1128/JVI.00437-06.）も使用可能と考えられる。
結果を図７に示した。左が細胞をクリスタルバイオレットで染色してプラークを観察した画像であり、右は同一ウェルの発光を観察した画像である。プラークの位置と同じ位置が発光していることから、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスが作製できたことが示された。この結果はロタウイルスのゲノムに外来遺伝子を挿入できることが実証するものであり、人工組換えロタウイルスはワクチンベクターとして応用可能であると考えられる。なお、自立増殖可能な外来遺伝子発現ウイルスの作製における外来遺伝子挿入部位として、NSP1遺伝子の他に、NSP3遺伝子（Montero H, Arias CF, Lopez S. Rotavirus Nonstructural Protein NSP3 Is Not Required for Viral Protein Synthesis. Journal of Virology. 2006;80(18):9031-9038. doi:10.1128/JVI.00437-06.）も使用可能と考えられる。
〔実施例５：FASTタンパク質発現ベクターおよびキャッピング酵素発現ベクターのいずれか一方による人工組換えロタウイルスの作製〕
＜材料および方法＞ 実施例２＜材料および方法＞（２）で作製したサルロタウイルスSA11株の11種類の分節RNAゲノム発現ベクター、実施例１＜材料および方法＞（３）で作製したFASTタンパク質発現ベクターpCAG-p10、（４）で作製したキャッピング酵素発現ベクターpCAG-D1RおよびpCAG-D12Lを表３に記載の組み合わせで、BHK-T7/P5細胞（実施例１参照）に導入し、人工組換えロタウイルスが作製できるか否かを確認した。具体的には、トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を4×105個/ウェルで12ウェル培養プレートに播種し、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いて各ベクターを表３に記載のDNA量でBHK-T7/P5細胞に導入した。2日後に、MA104細胞（4×104個/ウェル）を加え３日間培養した。培地および細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製した。この細胞溶解液約0.5mlをトリプシン0.5μg/ml 存在下で、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に添加し、7日間培養した。
＜材料および方法＞ 実施例２＜材料および方法＞（２）で作製したサルロタウイルスSA11株の11種類の分節RNAゲノム発現ベクター、実施例１＜材料および方法＞（３）で作製したFASTタンパク質発現ベクターpCAG-p10、（４）で作製したキャッピング酵素発現ベクターpCAG-D1RおよびpCAG-D12Lを表３に記載の組み合わせで、BHK-T7/P5細胞（実施例１参照）に導入し、人工組換えロタウイルスが作製できるか否かを確認した。具体的には、トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を4×105個/ウェルで12ウェル培養プレートに播種し、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いて各ベクターを表３に記載のDNA量でBHK-T7/P5細胞に導入した。2日後に、MA104細胞（4×104個/ウェル）を加え３日間培養した。培地および細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製した。この細胞溶解液約0.5mlをトリプシン0.5μg/ml 存在下で、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に添加し、7日間培養した。
＜結果＞
キャッピング酵素発現ベクターのみを共発現させたＡ群、FASTタンパク質発現ベクターのみを共発現させたＢ群、キャッピング酵素発現ベクターとFASTタンパク質発現ベクターの両方を共発現させたＣ群のいずれの群においても、細胞変性を観察することができた。すなわち、キャッピング酵素発現ベクターおよびFASTタンパク質発現ベクターのいずれか一方のみの共発現で、人工組換えロタウイルスを作製できることが示された。
キャッピング酵素発現ベクターのみを共発現させたＡ群、FASTタンパク質発現ベクターのみを共発現させたＢ群、キャッピング酵素発現ベクターとFASTタンパク質発現ベクターの両方を共発現させたＣ群のいずれの群においても、細胞変性を観察することができた。すなわち、キャッピング酵素発現ベクターおよびFASTタンパク質発現ベクターのいずれか一方のみの共発現で、人工組換えロタウイルスを作製できることが示された。
〔実施例６：FASTタンパク質による哺乳類オルソレオウイルス（MRV）、ロタウイルス（RV）複製能の増強〕
＜材料および方法＞
24ウェルプレートでコンフルエントな状態のVero細胞に、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10）または空ベクター（pCAG empty）を、それぞれ0、0.25、0.5、1、2μgでトランスフェクションした。トランスフェクション試薬には、TransIT-LT1（商品名、Mirus）を用いた。2時間後、培地を新鮮な5%FBS含有DMEMに交換し、MOI 0.001で、哺乳類オルソレオウイルス（MRV T1L株）またはサルロタウイルス（SA11株）を感染させた。37℃で1時間吸着させた後、PBSで細胞を6回洗浄し、MRV感染細胞は5%FBS含有DMEMで、RV感染細胞はFBS不含DMEMで培養した。感染16時間後に培地および細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して調製した細胞溶解液をプラークアッセイに供した。プラークアッセイは、実施例１と同じ方法で行った。
＜材料および方法＞
24ウェルプレートでコンフルエントな状態のVero細胞に、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10）または空ベクター（pCAG empty）を、それぞれ0、0.25、0.5、1、2μgでトランスフェクションした。トランスフェクション試薬には、TransIT-LT1（商品名、Mirus）を用いた。2時間後、培地を新鮮な5%FBS含有DMEMに交換し、MOI 0.001で、哺乳類オルソレオウイルス（MRV T1L株）またはサルロタウイルス（SA11株）を感染させた。37℃で1時間吸着させた後、PBSで細胞を6回洗浄し、MRV感染細胞は5%FBS含有DMEMで、RV感染細胞はFBS不含DMEMで培養した。感染16時間後に培地および細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して調製した細胞溶解液をプラークアッセイに供した。プラークアッセイは、実施例１と同じ方法で行った。
＜結果＞
結果を図８に示した。（Ａ）はMRVの結果、（Ｂ）はRVの結果である。MRVでは、pCAG-p10を0.5μg以上トランスフェクションした場合、空ベクター（mock）と比べて複製能が増強した。RVでは、pCAG-p10を1μg以上トランスフェクションした場合、空ベクター（mock）と比べて複製能が増強した。これらの結果から、FASTタンパク質を発現する細胞を宿主細胞とすることにより、ウイルスの複製能が向上することが示された。
結果を図８に示した。（Ａ）はMRVの結果、（Ｂ）はRVの結果である。MRVでは、pCAG-p10を0.5μg以上トランスフェクションした場合、空ベクター（mock）と比べて複製能が増強した。RVでは、pCAG-p10を1μg以上トランスフェクションした場合、空ベクター（mock）と比べて複製能が増強した。これらの結果から、FASTタンパク質を発現する細胞を宿主細胞とすることにより、ウイルスの複製能が向上することが示された。
〔実施例７：サルロタウイルスおよびヒトロタウイルスのモノリアソータントロタウイルスの作製〕
サルロタウイルスを基盤として、NSP4遺伝子分節のみヒトロタウイルスのNSP4遺伝子をもつ人工組換えロタウイルス（SA11/KUNSP4）の作製を試みた。
サルロタウイルスを基盤として、NSP4遺伝子分節のみヒトロタウイルスのNSP4遺伝子をもつ人工組換えロタウイルス（SA11/KUNSP4）の作製を試みた。
＜材料および方法＞
（１）ヒトロタウイルス
ヒトロタウイルスKU株（Urasawa, S., Urasawa, T., Taniguchi, K., and Chiba, S. (1984). Serotype determination of human rotavirus isolates and antibody prevalence in pediatric population in Hokkaido, Japan. Archives of virology 81, 1-12.）を使用した。
（１）ヒトロタウイルス
ヒトロタウイルスKU株（Urasawa, S., Urasawa, T., Taniguchi, K., and Chiba, S. (1984). Serotype determination of human rotavirus isolates and antibody prevalence in pediatric population in Hokkaido, Japan. Archives of virology 81, 1-12.）を使用した。
（２）ヒトロタウイルスNSP4遺伝子を有するプラスミドの作製
KU株のNSP4分節RNAゲノム（GenBank ACCESSION: AB022772、配列番号32）のcDNAを含むプラスミドを作製した。ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、ヒトNSP4分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（NSP4分節RNAゲノムのcDNA）を図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に挿入し、NSP4分節RNAゲノムの発現カセットを含むプラスミドを得た。各分節RNAゲノムの発現カセットは、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された構造を有する。作製したプラスミドを、pT7-NSP4KUと称する。
KU株のNSP4分節RNAゲノム（GenBank ACCESSION: AB022772、配列番号32）のcDNAを含むプラスミドを作製した。ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、ヒトNSP4分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（NSP4分節RNAゲノムのcDNA）を図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に挿入し、NSP4分節RNAゲノムの発現カセットを含むプラスミドを得た。各分節RNAゲノムの発現カセットは、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された構造を有する。作製したプラスミドを、pT7-NSP4KUと称する。
（３）人工組換えウイルスの作製および変異の確認
NSP4モノリアソータントロタウイルス（SA11/KUNSP4）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP4SA11に代えてpT7-NSP4KUを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。細胞変性が観察されたMA104細胞のウェルから培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、SA11/KUNSP4からウイルスゲノムRNAを抽出し、野生型SA11株および野生型KU株より抽出したウイルスゲノムRNAとともにSDS-PAGEに供した。
NSP4モノリアソータントロタウイルス（SA11/KUNSP4）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP4SA11に代えてpT7-NSP4KUを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。細胞変性が観察されたMA104細胞のウェルから培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、SA11/KUNSP4からウイルスゲノムRNAを抽出し、野生型SA11株および野生型KU株より抽出したウイルスゲノムRNAとともにSDS-PAGEに供した。
＜結果＞
結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、SA11/KUNSP4の各ゲノムRNAのバンドは、NSP4（図中g10KU）以外すべて野生型SA11株と同じ位置に確認された。一方SA11/KUNSP4のNSP4分節の位置は、野生型KU株のNSP4のバンドと同じ位置に確認された。この結果から、本発明の作製方法を用いれば、様々な動物種由来のロタウイルスの分説ゲノムRNAを自由に組み換えたリアソータントロタウイルスを作製できると考えられた。
結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、SA11/KUNSP4の各ゲノムRNAのバンドは、NSP4（図中g10KU）以外すべて野生型SA11株と同じ位置に確認された。一方SA11/KUNSP4のNSP4分節の位置は、野生型KU株のNSP4のバンドと同じ位置に確認された。この結果から、本発明の作製方法を用いれば、様々な動物種由来のロタウイルスの分説ゲノムRNAを自由に組み換えたリアソータントロタウイルスを作製できると考えられた。
〔実施例８：ルシフェラーゼ発現ロタウイルスを利用した抗ロタウイルス薬のスクリーニング試験〕
実施例４で作製したルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスを用いて、既知の抗ロタウイルス薬として知られるリバビリン（Smee, D.F., Sidwell, R.W., Clark, S.M., Barnett, B.B., and Spendlove, R.S. (1982). Inhibition of rotaviruses by selected antiviral substances: mechanisms of viral inhibition and in vivo activity. Antimicrobial agents and chemotherapy 21, 66-73.）によるロタウイルス増殖抑制効果の可視化を試みた。
実施例４で作製したルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスを用いて、既知の抗ロタウイルス薬として知られるリバビリン（Smee, D.F., Sidwell, R.W., Clark, S.M., Barnett, B.B., and Spendlove, R.S. (1982). Inhibition of rotaviruses by selected antiviral substances: mechanisms of viral inhibition and in vivo activity. Antimicrobial agents and chemotherapy 21, 66-73.）によるロタウイルス増殖抑制効果の可視化を試みた。
＜材料および方法＞
感染実験前日に、CV-1細胞を1×105個/ウェルで96ウェル培養プレートに播種した。野生型SA11株および実施例４で作製したルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスをMOI 0.001でCV-1細胞に感染させた。37℃で1時間吸着させた後、培養上清を除去し、リバビリン（Sigma Aldrich）を0、1、5、10、50、100または200μMを含むDMEM（FBS不含、0.5μg/mlトリプシン含）を加え、37℃で14時間培養した。培養終了後、Nano-Glo Luciferase Assay System（商品名、プロメガ）の基質原液を培地に添加し、インビボイメージングシステム（IVIS Spectrum、Xenogen社製）で発光を検出した。
感染実験前日に、CV-1細胞を1×105個/ウェルで96ウェル培養プレートに播種した。野生型SA11株および実施例４で作製したルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスをMOI 0.001でCV-1細胞に感染させた。37℃で1時間吸着させた後、培養上清を除去し、リバビリン（Sigma Aldrich）を0、1、5、10、50、100または200μMを含むDMEM（FBS不含、0.5μg/mlトリプシン含）を加え、37℃で14時間培養した。培養終了後、Nano-Glo Luciferase Assay System（商品名、プロメガ）の基質原液を培地に添加し、インビボイメージングシステム（IVIS Spectrum、Xenogen社製）で発光を検出した。
＜結果＞
結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、リバビリンを添加したウェルでは、リバビリン濃度に依存して発光強度が減少し、リバビリン濃度50μM以上のウェルでは、発光が観察されなかった。この結果は、ルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスを用いることにより、ウイルス増殖量を簡便に可視化できることを示すものである。したがって、ルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスは、未知の抗ロタウイルス薬のスクリーニングに有用であると考えられる。
結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、リバビリンを添加したウェルでは、リバビリン濃度に依存して発光強度が減少し、リバビリン濃度50μM以上のウェルでは、発光が観察されなかった。この結果は、ルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスを用いることにより、ウイルス増殖量を簡便に可視化できることを示すものである。したがって、ルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスは、未知の抗ロタウイルス薬のスクリーニングに有用であると考えられる。
〔実施例９：ロタウイルスリバースジェネティクス系の改良（１）〕
実施例２において人工組換えロタウイルスの作製に成功したロタウイルスRG系の改良を目的に、NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物の過剰発現系を用いて人工組換えロタウイルスの作製効率を検討した。
実施例２において人工組換えロタウイルスの作製に成功したロタウイルスRG系の改良を目的に、NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物の過剰発現系を用いて人工組換えロタウイルスの作製効率を検討した。
＜材料および方法＞
分節RNAゲノム発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、キャッピング酵素発現ベクターは、実施例２と同じものを使用した。
NSP2発現ベクターおよびNSP5発現ベクターは、サルロタウイルスSA11株のNSP2遺伝子（GenBank ACCESSION:LC178571、配列番号18）のタンパク質コード領域DNAおよびNSP5遺伝子（GenBank ACCESSION:LC178574、配列番号21）のタンパク質コード領域DNAを、それぞれ図１０に示すpCAGGSプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのEcoRI切断部位に挿入して、pCAG-NSP2、pCAG-NSP5を得た。
宿主細胞には、T7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。BHK-T7/P5細胞は、CAGプロモーターの下流にT7RNAポリメラーゼをコードするDNAを挿入したpCAGGSプラスミドをBHK細胞（Baby Hamster Kidney Cells）にトランスフェクションし、抗生物質含有培地で培養して選択することにより作製した。
分節RNAゲノム発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、キャッピング酵素発現ベクターは、実施例２と同じものを使用した。
NSP2発現ベクターおよびNSP5発現ベクターは、サルロタウイルスSA11株のNSP2遺伝子（GenBank ACCESSION:LC178571、配列番号18）のタンパク質コード領域DNAおよびNSP5遺伝子（GenBank ACCESSION:LC178574、配列番号21）のタンパク質コード領域DNAを、それぞれ図１０に示すpCAGGSプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのEcoRI切断部位に挿入して、pCAG-NSP2、pCAG-NSP5を得た。
宿主細胞には、T7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。BHK-T7/P5細胞は、CAGプロモーターの下流にT7RNAポリメラーゼをコードするDNAを挿入したpCAGGSプラスミドをBHK細胞（Baby Hamster Kidney Cells）にトランスフェクションし、抗生物質含有培地で培養して選択することにより作製した。
トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を24ウェル培養プレートに播種した（2×105個/ウェル）。分節RNAゲノム発現ベクター（T7-VP1SA11、pT7-VP2SA11、pT7-VP3SA11、pT7-VP4SA11、pT7-VP6SA11、pT7-VP7SA11、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11、pT7-NSP4SA11およびpT7-NSP5SA11）、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-FAST p10）、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）、NSP2発現ベクター（pCAG-NSP2）およびNSP5発現ベクター（pCAG-NSP5）を、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いて、表４に記載のDNA量でBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μLのトランスフェクション試薬を使用した。
BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100 units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、サルMA104細胞（ATCC CRL-2378.1）に継代した。具体的には、前記細胞溶解液約0.5mlをトリプシン0.5μg/ml 存在下で、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に添加した。MA104細胞の培養にはFBS不含DMEM培地を使用した。継代後7日間培養し、その間に細胞変性が認められた場合に人工組換えロタウイルスが作製されたと判断した。
＜結果＞
結果を表５に示した。
ロタウイルスの11個の分節ゲノム発現プラスミドに加えて、キャッピング酵素発現ベクターとFASTタンパク質発現ベクターを共発現させたＡ群、キャッピング酵素発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、NSP2発現ベクターを共発現させたＢ群、キャッピング酵素発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、NSP5発現ベクターを共発現させたＣ群、キャッピング酵素発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、NSP2発現ベクター、NSP5発現ベクターを共発現させたＤ群のすべての群で細胞変性が観察され、人工組換えロタウイルスを作製できることが示された。作製効率は、Ａ群と比較してＢ群が３倍、Ｃ群が等倍、Ｄ群が８倍の上昇が認められた。この結果から、NSP2遺伝子産物および／またはNSP5遺伝子産物の過剰発現は作製効率を向上させることが明らかとなった。
結果を表５に示した。
〔実施例１０：ロタウイルスリバースジェネティクス系の改良（２）〕
FASTタンパク質発現ベクター、キャッピング酵素発現ベクターを使用せずにロタウイルスの作製を試みた。
FASTタンパク質発現ベクター、キャッピング酵素発現ベクターを使用せずにロタウイルスの作製を試みた。
＜材料および方法＞
分節RNAゲノム発現ベクター、NSP2発現ベクター、NSP5発現ベクター、トランスフェクション試薬および宿主細胞は実施例９と同じものを使用した。トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を12ウェル培養プレートに播種した（4×105個/ウェル）。各ベクターを表６に記載のDNA量でBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μLのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養およびサルMA104細胞への継代は、実施例９と同様に行った。継代後7日間培養し、その間に細胞変性が認められた場合に人工組換えロタウイルスが作製されたと判断した。
分節RNAゲノム発現ベクター、NSP2発現ベクター、NSP5発現ベクター、トランスフェクション試薬および宿主細胞は実施例９と同じものを使用した。トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を12ウェル培養プレートに播種した（4×105個/ウェル）。各ベクターを表６に記載のDNA量でBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μLのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養およびサルMA104細胞への継代は、実施例９と同様に行った。継代後7日間培養し、その間に細胞変性が認められた場合に人工組換えロタウイルスが作製されたと判断した。
＜結果＞
キャッピング酵素発現ベクターとFASTタンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入しなくても、NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物を過剰発現させた場合、人工組換えロタウイルスを作製することができた。NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物を宿主細胞に過剰発現させる手段としては、Ｘ群のようにNSP2発現ベクターおよびNSP5発現ベクターを別途に導入してもよく、Ｙ群のようにNSP2およびNSP5をコードする分節RNAゲノム発現ベクターの導入DNA量を増加させてもよいことが示された。特にＹ群は、ロタウイルスの11個の分節RNAゲノム発現ベクターのみを宿主細胞に導入して培養すれば、人工組換えロタウイルスが作製できることを実証したものである。
キャッピング酵素発現ベクターとFASTタンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入しなくても、NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物を過剰発現させた場合、人工組換えロタウイルスを作製することができた。NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物を宿主細胞に過剰発現させる手段としては、Ｘ群のようにNSP2発現ベクターおよびNSP5発現ベクターを別途に導入してもよく、Ｙ群のようにNSP2およびNSP5をコードする分節RNAゲノム発現ベクターの導入DNA量を増加させてもよいことが示された。特にＹ群は、ロタウイルスの11個の分節RNAゲノム発現ベクターのみを宿主細胞に導入して培養すれば、人工組換えロタウイルスが作製できることを実証したものである。
〔実施例１１：NSP4タンパクへの変異導入による人工組換え弱毒化ウイルスの作製〕
NSP4に人工的なアミノ酸変異を導入することによる人工組換え弱毒化ロタウイルスの作製を試みた。
NSP4に人工的なアミノ酸変異を導入することによる人工組換え弱毒化ロタウイルスの作製を試みた。
＜材料および方法＞
（１）アミノ酸変異NSP4遺伝子を有するプラスミドの作製
pT7-NSP4SA11（実施例２参照）を鋳型として、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）および特異的プライマーを用いて、NSP4遺伝子（配列番号20）の55位のシトシン（C）をグリシン（G）に置換した変異NSP4遺伝子を有するプラスミドを作製した。このプラスミド（pT7-NSP4SA11-L5Sと称する）は、NSP4タンパクの5番目のロイシン（L）がセリン（S）に置換した変異型NSP4タンパク質を発現する。
（１）アミノ酸変異NSP4遺伝子を有するプラスミドの作製
pT7-NSP4SA11（実施例２参照）を鋳型として、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）および特異的プライマーを用いて、NSP4遺伝子（配列番号20）の55位のシトシン（C）をグリシン（G）に置換した変異NSP4遺伝子を有するプラスミドを作製した。このプラスミド（pT7-NSP4SA11-L5Sと称する）は、NSP4タンパクの5番目のロイシン（L）がセリン（S）に置換した変異型NSP4タンパク質を発現する。
（２）NSP4変異を有する人工組換えウイルスの作製
NPS4変異を有する人工組換えロタウイルス（rsSA11/NSP4-L5S）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP4SA11-L5Sを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。同時に野生型人工組換えロタウイルス（野生型SA11）を実施例２と同じ方法で作製した。
NPS4変異を有する人工組換えロタウイルス（rsSA11/NSP4-L5S）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP4SA11-L5Sを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。同時に野生型人工組換えロタウイルス（野生型SA11）を実施例２と同じ方法で作製した。
（３）NSP4変異を有する人工組換えロタウイルスの複製能の確認
12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に、rsSA11/NSP4-L5Sもしくは野生型SA11をMOI 0.01で感染させた。37℃で1時間吸着させた後、PBSで細胞を1回洗浄し、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで培養した。感染48時間後に培地および細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して調製した細胞溶解液をプラークアッセイに供した。プラークアッセイは、実施例１と同じ方法で行った。
12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に、rsSA11/NSP4-L5Sもしくは野生型SA11をMOI 0.01で感染させた。37℃で1時間吸着させた後、PBSで細胞を1回洗浄し、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで培養した。感染48時間後に培地および細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して調製した細胞溶解液をプラークアッセイに供した。プラークアッセイは、実施例１と同じ方法で行った。
＜結果＞
結果を図１３に示した。rsSA11/NSP4-L5Sの増殖は野生型SA11に比べ8.7倍低下していた（21500000 vs 2450000）。NSP4に人工的な変異を加えることによる弱毒化ロタウイルスの作製はこれまで報告されておらず、本実施例で作製されたNSP4変異ロタウイルスは、複製能を保持した弱毒ウイルスとして優れたワクチン候補であると考えられる。
結果を図１３に示した。rsSA11/NSP4-L5Sの増殖は野生型SA11に比べ8.7倍低下していた（21500000 vs 2450000）。NSP4に人工的な変異を加えることによる弱毒化ロタウイルスの作製はこれまで報告されておらず、本実施例で作製されたNSP4変異ロタウイルスは、複製能を保持した弱毒ウイルスとして優れたワクチン候補であると考えられる。
また、図を示していないが、本発明者らは、実施例３で作製したNSP1欠失変異ロタウイルス（rsSA11/NSP1ΔC108）および別途作製したNSP3欠失変異ロタウイルスについても、野生型ロタウイルスに比べ増殖が低下していることを確認している。したがって、NSP1またはNSP3に人工的な変異を加えて作製した人工組換えロタウイルスも、複製能を保持した弱毒ウイルスとして優れたワクチン候補であると考えられる。
〔実施例１２：安定的に緑色蛍光タンパク質を発現する人工組換えロタウイルスの作製〕
緑色蛍光タンパク質であるZsGreenを発現する組換えロタウイルスの作製を試みた
緑色蛍光タンパク質であるZsGreenを発現する組換えロタウイルスの作製を試みた
＜材料および方法＞
（１）緑色蛍光タンパク質遺伝子挿入NSP1発現プラスミドの作製
緑色蛍光タンパク質遺伝子として、ZsGreen（以下ZsGと称する）遺伝子を用いた。pZsGreenベクター（クロンテック）のZsGタンパク質コード領域（配列番号33）をPCRで増幅し、増幅産物をpT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の111位と112位の間に挿入して、ZsG遺伝子挿入NSP1遺伝子発現プラスミド（pT7-NSP1SA11-ZsG-Fullと称する）を作製した。さらにその変異体として、 pT7-NSP1SA11-ZsG-Fullプラスミドを元に、NSP1遺伝子の134-465位、134-855位または134-1243位をそれぞれ欠失したプラスミド（それぞれpT7-NSP1SA11-ZsG-Δ332、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ722、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ1110と称する）を作製した（図１４参照）。
（１）緑色蛍光タンパク質遺伝子挿入NSP1発現プラスミドの作製
緑色蛍光タンパク質遺伝子として、ZsGreen（以下ZsGと称する）遺伝子を用いた。pZsGreenベクター（クロンテック）のZsGタンパク質コード領域（配列番号33）をPCRで増幅し、増幅産物をpT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の111位と112位の間に挿入して、ZsG遺伝子挿入NSP1遺伝子発現プラスミド（pT7-NSP1SA11-ZsG-Fullと称する）を作製した。さらにその変異体として、 pT7-NSP1SA11-ZsG-Fullプラスミドを元に、NSP1遺伝子の134-465位、134-855位または134-1243位をそれぞれ欠失したプラスミド（それぞれpT7-NSP1SA11-ZsG-Δ332、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ722、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ1110と称する）を作製した（図１４参照）。
（２）人工組換えウイルスの作製およびZsG発現の確認
ZsG発現ロタウイルスは、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11-ZsG-Full、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ332、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ722またはpT7-NSP1SA11-ZsG-Δ1110を用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。それぞれのZsG発現プラスミドを用いて作製したウイルスを、それぞれrsSA11/ZsG-Full、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722およびrsSA11/ZsG-Δ1110と称する。作製したウイルスをそれぞれMA104細胞に感染させ、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光（ZsG発現）の有無を確認した。
ZsG発現ロタウイルスは、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11-ZsG-Full、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ332、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ722またはpT7-NSP1SA11-ZsG-Δ1110を用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。それぞれのZsG発現プラスミドを用いて作製したウイルスを、それぞれrsSA11/ZsG-Full、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722およびrsSA11/ZsG-Δ1110と称する。作製したウイルスをそれぞれMA104細胞に感染させ、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光（ZsG発現）の有無を確認した。
（３）ZsG発現ロタウイルスにおけるウイルス継代後のZsG遺伝子の保持率の確認
24ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に、rsSA11/ZsG-Full、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722またはrsSA11/ZsG-Δ1110をMOI 0.0001で感染させ、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで培養した。感染後72時間の培養上清から得られたウイルス株をP1ストックとした。それぞれのウイルスのP1ストックの1μLを、24ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に感染させ、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで72時間培養し、P2ストックを得た。同様にウイルス感染実験を繰返し、P10までのウイルスストックを得た。12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に各ウイルスのP1、P5およびP10ストックをMOI 0.01でそれぞれ感染させ、5%FBS不含DMEMで培養した。感染16時間後に、細胞を10％ホルマリンで24時間固定し、ウイルス抗原を対象とした免疫染色に供した。固定後の細胞はPBSで2回洗浄し、0.1%Triton-X-100で細胞膜を透過させ、ウサギ抗ロタウイルスNSP4抗体および、抗ウサギIgG抗体-Alexa594コンジュゲートを反応させ、ウイルス抗原の検出を試みた。免疫染色後の細胞は、蛍光顕微鏡による観察を行い、ウイルス抗原陽性細胞におけるZsG発現率を測定した。
24ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に、rsSA11/ZsG-Full、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722またはrsSA11/ZsG-Δ1110をMOI 0.0001で感染させ、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで培養した。感染後72時間の培養上清から得られたウイルス株をP1ストックとした。それぞれのウイルスのP1ストックの1μLを、24ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に感染させ、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで72時間培養し、P2ストックを得た。同様にウイルス感染実験を繰返し、P10までのウイルスストックを得た。12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に各ウイルスのP1、P5およびP10ストックをMOI 0.01でそれぞれ感染させ、5%FBS不含DMEMで培養した。感染16時間後に、細胞を10％ホルマリンで24時間固定し、ウイルス抗原を対象とした免疫染色に供した。固定後の細胞はPBSで2回洗浄し、0.1%Triton-X-100で細胞膜を透過させ、ウサギ抗ロタウイルスNSP4抗体および、抗ウサギIgG抗体-Alexa594コンジュゲートを反応させ、ウイルス抗原の検出を試みた。免疫染色後の細胞は、蛍光顕微鏡による観察を行い、ウイルス抗原陽性細胞におけるZsG発現率を測定した。
＜結果＞
結果を図１５に示した。rsSA11/ZsG-FullにおけるZsGの発現率は、P1が100%、P5が57.1%、P10が8.6%であり、継代を繰り返すごとにZsGの発現が低下することが明らかとなった。一方、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722、rsSA11/ZsG-Δ1110はいずれも、P1、P5、P10とも99-100%のZsG発現率を示し、NSP1遺伝子を332-1110塩基欠失させることでZsG遺伝子が安定的に保持されることが明らかになった。
結果を図１５に示した。rsSA11/ZsG-FullにおけるZsGの発現率は、P1が100%、P5が57.1%、P10が8.6%であり、継代を繰り返すごとにZsGの発現が低下することが明らかとなった。一方、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722、rsSA11/ZsG-Δ1110はいずれも、P1、P5、P10とも99-100%のZsG発現率を示し、NSP1遺伝子を332-1110塩基欠失させることでZsG遺伝子が安定的に保持されることが明らかになった。
〔実施例１３：哺乳類オルソレオウイルスリバースジェネティクス系の改良〕
ロタウイルスのNSP2およびNSP5と同じ機能を有する哺乳類オルソレオウイルのμNSおよびσNSを共発現させることにより、人工組換え哺乳類オルソレオウイルスの作製効率が向上するか検討した。
ロタウイルスのNSP2およびNSP5と同じ機能を有する哺乳類オルソレオウイルのμNSおよびσNSを共発現させることにより、人工組換え哺乳類オルソレオウイルスの作製効率が向上するか検討した。
＜材料および方法＞
（１）μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターの作製
μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターは、哺乳類オルソレオウイルスT1L株のμNS遺伝子（表１のM3遺伝子、GenBank ACCESSION:AF174382、配列番号6）のタンパク質コード領域DNAおよびσNS遺伝子（表１のS3遺伝子、GenBank ACCESSION:M14325、配列番号9）のタンパク質コード領域DNAを、それぞれ図１０に示すpCAGPMプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGPMプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-μNST1L（哺乳類オルソレオウイルスμNS発現ベクター）およびpCAG-σNST1L（哺乳類オルソレオウイルスσNS発現ベクター）を得た。
（１）μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターの作製
μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターは、哺乳類オルソレオウイルスT1L株のμNS遺伝子（表１のM3遺伝子、GenBank ACCESSION:AF174382、配列番号6）のタンパク質コード領域DNAおよびσNS遺伝子（表１のS3遺伝子、GenBank ACCESSION:M14325、配列番号9）のタンパク質コード領域DNAを、それぞれ図１０に示すpCAGPMプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGPMプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-μNST1L（哺乳類オルソレオウイルスμNS発現ベクター）およびpCAG-σNST1L（哺乳類オルソレオウイルスσNS発現ベクター）を得た。
（２）人工組換えウイルスの作製
トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を2×105個/ウェルで24ウェル培養プレートに播種した。実施例１で作製した分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）各0.4μg、μNS発現ベクター（pCAG-μNST1L）および／またはσNS発現ベクター（pCAG-σNST1L）各0.4μgを、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μgのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解したものをウイルス試料としてプラークアッセイ（実施例１参照）に供し、ウイルスタイターを測定した。
トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を2×105個/ウェルで24ウェル培養プレートに播種した。実施例１で作製した分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）各0.4μg、μNS発現ベクター（pCAG-μNST1L）および／またはσNS発現ベクター（pCAG-σNST1L）各0.4μgを、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μgのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解したものをウイルス試料としてプラークアッセイ（実施例１参照）に供し、ウイルスタイターを測定した。
＜結果＞
MRV T1L株の４種の分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）のみを導入した細胞のウイルスタイターと比較して、μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターを共導入した細胞のウイルスタイターは約8.2倍に増加した。また、μNS発現ベクターのみを共導入した細胞のウイルスタイターは約6.4倍に増加した。この結果から、μNS発現ベクターもしくはμNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターと、分節RNAゲノム発現ベクターとを宿主細胞に共導入することにより、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することが示された。
MRV T1L株の４種の分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）のみを導入した細胞のウイルスタイターと比較して、μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターを共導入した細胞のウイルスタイターは約8.2倍に増加した。また、μNS発現ベクターのみを共導入した細胞のウイルスタイターは約6.4倍に増加した。この結果から、μNS発現ベクターもしくはμNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターと、分節RNAゲノム発現ベクターとを宿主細胞に共導入することにより、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することが示された。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
Claims (20)
- レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、
（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程、および
（３）宿主細胞を培養する工程
を含むことを特徴とする作製方法。 - 人工組換えウイルスが、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されていること、および／または、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれていることを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
- ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である請求項１または２に記載の作製方法。
- キャッピング酵素が、宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのキャッピング酵素である請求項１〜３のいずれかに記載の作製方法。
- 分節ＲＮＡゲノムの発現カセットが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ウイルス分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡおよび自己切断作用を有するリボザイムをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の作製方法。
- ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターであり、宿主細胞が組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞であることを特徴とする請求項５に記載の作製方法。
- リボザイムが、Ｄ型肝炎ウイルスリボザイムである請求項５または６に記載の作製方法。
- 宿主細胞とウイルス高感受性細胞を共培養することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の作製方法。
- レオウイルス科に属する人工組換えウイルスが、人工組換えロタウイルスである請求項１〜８のいずれかに記載の作製方法。
- 宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることを特徴とする請求項９に記載の作製方法。
- 人工組換えロタウイルスが、外来遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスであり、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターに代えて、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットのＮＳＰ１遺伝子内に外来遺伝子が挿入され、かつ、ＮＳＰ１遺伝子の１００〜１５５０塩基が欠失している発現カセットを含むベクターを用いることを特徴とする請求項９または１０に記載の作製方法。
- ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞にウイルスを感染させて培養することを特徴とするウイルス複製促進方法。
- ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である請求項１２に記載の方法。
- ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されていることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
- 外来遺伝子を発現することを特徴とする人工組換えロタウイルス。
- リアソータントであることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
- 請求項１４〜１６のいずれかに記載の人工組換えロタウイルスを含有するワクチン。
- ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットを導入し、培養することを特徴とする人工組換えロタウイルスの作製方法。
- 宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする請求項１８に記載の作製方法。
- レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットが導入された宿主細胞に、ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする作製方法。
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