CN103421732A - 表达副猪嗜血杆菌表面抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌性疾病基因工程疫苗领域，具体涉及一种无抗性标记表达副猪嗜血杆菌表面抗原基因HbpB的重组猪霍乱沙门氏菌减毒疫苗株的构建、疫苗制备及应用。获得一株无抗性标记的表达副猪嗜血杆菌表面抗原HbpB的重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB(保藏号为CCTCC NO：M2013052)。该重组菌缺失了猪霍乱沙门氏菌基因组上的asd基因，含有能在该菌株中表达asd基因和副猪嗜血杆菌外膜抗原HbpB基因的重组质粒pYA-HbpB。还公开了重组菌株asd^-C500/pYA-HbpB的构建方法与相应弱毒疫苗的制备方法，及在制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌疫苗中的应用。

Description

表达副猪嗜血杆菌表面抗原的猪霍乱沙门氏菌减毒疫苗

技术领域

本发明属于动物细菌性疾病基因工程疫苗领域，具体涉及一种无抗性标记表达副猪嗜血杆菌表面抗原基因的重组猪霍乱沙门氏菌减毒疫苗菌株的构建、疫苗制备以及应用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是常规饲养猪群上呼吸道中的一种常在菌，但在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征(

，1910)。近年来鉴于饲养技术的不断调整以及新型呼吸道综合征的不断发生，副猪嗜血杆菌病日趋流行，对国内外养猪业造成了巨大危害。现今副猪嗜血杆菌病的主要防制手段是药物控制和疫苗接种。但是抗生素的长期添加和不合理使用势必会导致耐药菌株不断增多、耐药谱日益扩大以及严重的药物残留，对食品安全和人类健康造成严重威胁(周学利，2009)。商用灭活苗和自家苗可在一定程度上控制副猪嗜血杆菌的感染，然而血清型多样性以及占很大比例的不能分型菌株影响了商品苗的防制效果，因此常常在大规模免疫时失败。自家苗的保护可能更有针对性，但也经常因为分离到的副猪嗜血杆菌不是真正的致病菌株或不是主要致病血清型而造成免疫无效。

近年来基因工程产业飞速发展，使得疫苗的研发无论在方法上还是在观念上部发生了重大转变。当前应用基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多联活疫苗等已成为研究热点。研究表明减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有诸多优点：具有联合免疫作用，可以稳定表达外源基因，且载体疫苗本身不致病，却可作为仔猪副伤寒活疫苗；通过自然感染途径如口服或鼻内接种，可以激发机体的系统免疫和粘膜免疫反应；减毒沙门氏菌可侵入淋巴系统，能更有效激发宿主的体液免疫和细胞免疫，并可产生细胞毒性T细胞杀伤反应；所表达靶抗原无需提纯，可直接用于动物体免疫保护，显著降低疫苗制作成本；另外具有载体菌的免疫佐剂作用、减毒活疫苗的免疫持续性等特点。

20世纪60年代初，中国兽药监察所房晓文等将猪霍乱沙门氏菌强毒株接种含醋酸铊的培养基中传数百代后筛选出一株免疫原性好的弱毒株，命名为猪霍乱沙门氏菌C500。后来该菌株在全国推广使用，使我国仔猪副伤寒得到有效控制。如今人们已经研制出多种不含抗生素抗性标记的沙门氏菌疫苗系统，其中应用最广的是asd质粒载体平衡致死系统。沙门氏菌asd(aspartate semialdehyde dehydrogenase)基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶，该酶是二氨基庚二酸(DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个重要组分。asd基因缺失株在无外源DAP条件下不能形成完整细胞壁导致溶菌死亡。将目的基因插入含asd的转移质粒，转化至asd^-受体菌后形成互补，asd^-沙门氏菌在动物体内不能生存，只有含asd转移质粒的重组沙门氏菌才能存活，并可稳定地在体内体外表达外源抗原。由于以asd质粒载体平衡致死系统代替抗生素抗性标记，因此应用起来也更加安全。

鉴于猪霍乱沙门氏菌asd质粒载体平衡致死系统具有外源基因表达稳定、不需纯化、无抗生素抗性标记等诸多优点，同时基于副猪嗜血杆菌外膜蛋白HbpB的良好免疫原性，将猪霍乱沙门氏菌C500菌株开发为能够表达副猪嗜血杆菌保护性抗原基因HbpB的重组弱毒活疫苗具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术缺陷获得一种免疫原性佳和安全性好的可以表达副猪嗜血杆菌HbpB抗原的重组猪霍乱沙门氏菌菌株。

本发明的第二个目的是利用表达副猪嗜血杆菌HbpB基因的重组猪霍乱沙门氏菌菌株制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗。

本发明的第三个目的是利用表达副猪嗜血杆菌HbpB基因的重组猪霍乱沙门氏菌菌株制备的猪霍乱沙门氏菌副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人获得了一株不含抗性标记的表达副猪嗜血杆菌HbpB基因的重组猪霍乱沙门氏菌株，命名为猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA-HbpB，于2013年1月24日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2013052。

本发明主要技术路线涉及如下方面：

1.表达副猪嗜血杆菌HbpB基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-HbpB的构建。

2.重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB菌株的生物学鉴定及疫苗安全性评估。

3.重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB弱毒活疫苗的制备及其应用前景描述。

更具体的技术路线详见《具体实施方式》。

本发明的主要优点是：

1.本发明制备的猪霍乱沙门氏菌重组疫苗是利用仔猪副伤寒商品疫苗菌株猪霍乱沙门氏菌C500作为亲本菌株，它所插入的外源抗原基因HbpB为源自副猪嗜血杆菌重要的免疫原性基因片段，该抗原不仅具有良好的免疫保护性，且在副猪嗜血杆菌的主要血清型中均保守存在。因此，本发明制备的基因工程疫苗能同时抵抗仔猪副伤寒和副猪嗜血杆菌病，具有广阔的应用前景。

2.本发明制备的基因工程疫苗可经自然免疫途径进行大规模接种，操作方便，且能够诱导机体产生良好的体液免疫、细胞免疫以及粘膜免疫效力。

3.本发明制备的基因工程菌株无抗性标记，完全符合国家疫苗生物安全性要求。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的副猪嗜血杆菌HbpB基因片段的核苷酸序列，序列全长为1695bp，其中序列的1-1695是编码区(CDS)。

序列表SEQ IDNO：2是副猪嗜血杆菌HbpB基因片段的的蛋白质序列，其编码564个氨基酸。

图1：是本发明的主要技术路线图。

图2：是本发明制备的转移质粒pREasd12的图谱及其酶切鉴定结果。其中A为转移质粒pREasd12的物理图谱；B为酶切鉴定结果，其中泳道M为DNA分子Marker，泳道1为pREasd12双酶切产物。

图3：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500缺失突变株的PCR鉴定图谱。泳道M1为2000bp的DNA分子Marker，泳道M2为15000bp DNA分子Marker，泳道1-7为缺失株asd^-C500，泳道8-12为亲本菌株C500对照，泳道13为pREasd12质粒对照，泳道14为空白对照。

图4：是本发明所使用表达载体pYA3493的质粒图谱。

图5：是本发明构建的重组质粒pYA-HbpB的双酶切鉴定图谱。泳道M为2000bp的DNA分子Marker，泳道1、2为重组质粒pYA-HbpB的酶切产物。

图6：是本发明中重组菌株asd^-C500/pYA-HbpB的PCR鉴定图谱。泳道M为2000plus DNA分子Marker，泳道1、2为asd^-C500/pYA-HbpB的PCR产物，显示条带为InvA基因，泳道C1为阴性对照，泳道3、4为asd^-C500/pYA-HbpB的PCR产物，显示条带为HbpB基因，泳道C2为阴性对照。

图7：是本发明重组菌株的SDS-PAGE图谱。泳道M为蛋白分子量Marker，泳道1为重组蛋白HbpB，泳道2为asd^-C500，泳道3为重组菌asd^-C500/pYA-HbpB，其中箭头所示为外源蛋白条带。

图8：是本发明重组菌株asd^-C500/pYA-HbpB的Western-blot分析图谱。泳道M为蛋白分子量Marker，泳道1为asd^-C500，泳道2为重组菌asd^-C500/pYA-HbpB，其中箭头所示为外源蛋白条带，泳道3为阳性对照重组蛋白HbpB。

图9：是重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB与亲本菌株asd^-C500的生长曲线。

图10：是本发明重组菌遗传稳定性PCR分析图谱。泳道M为2000plus的DNA分子Marker，泳道1-10为重组菌asd^-C500/pYA-HbpB原代、10代、20代、30代、40代、50代、60代、70代、80代、90代及100代的PCR产物，泳道C为对照菌株asd^-C500的PCR产物。

图11：是本发明的重组菌免疫小鼠诱导的HbpB特异性抗体水平示意图。

图12：是本发明所使用自杀质粒pRE112的质粒图谱。

图13：是本发明载体质粒pBluescriptSK(+)载体质粒的物理图谱。

具体实施方式

实施例1   猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失菌株asd^-C500的构建

1.主要实验材料

猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500购自中国兽医药品监察所。pBluescriptSK(+)载体质粒(该质粒图谱见附图13)购自美国Stratagene公司。自杀性质粒pRE112(其质粒图谱见附图12)、大肠杆菌χ7213由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠。

Taq酶等PCR相关试剂、BamH I和Hind III等核酸内切酶及相关Buffer、T4连接酶及Buffer、DH5α感受态细胞等均为宝生物工程(大连)有限公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天津天根生化科技(北京)有限公司。UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司。DNA Marker(2K或2K Plus)、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit均为北京全式金生物技术有限公司产品。DAP、氯霉素等购自美国Sigma公司。

2.引物设计

参照鼠伤寒沙门氏菌LT2株asd基因(GenBank No：AE008863)上下游序列设计2对引物pa1/pa2和pa3/pa4(见表1)，从猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500基因组中分别扩增asd基因上下游片段asd1和asd2，扩增片段大小分别为2112bp和2069bp(其中上游基因在NCBI中的位置是NC_012125.1：3638301..3640412，下游基因在NCBI中的位置是NC_012125.1：3641589..3643657)上臂两端分别引入Xba I和BamH I酶切位点，下臂两端分别引入BamHI和Kpn I酶切位点。另设计pa5/pa6引物对(见表1)用于进行猪霍乱沙门氏菌C500亲本株和asd缺失株的鉴定。上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1：相关PCR引物

表1说明：引物序列中带有下划线的核苷酸序列为酶切位点。

3.asd基因上游片段asd1与下游片段asd2的克隆

将猪霍乱沙门氏菌C500冻干粉在LB固体平板上划线，37℃培养16h。挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃200r/min培养16h。按细菌基因组提取试剂盒(天津天根生化科技(北京)有限公司产品)按照说明书介绍的方法，提取猪霍乱沙门氏菌C500全基因组作为PCR模板。

目的基因asd1和asd2的PCR扩增反应均在25μL体系中进行，反应体系如下：模板DNA1μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs1μL，2U/μL Taq酶0.5μL，10×Buffer2.5μL，双蒸水16μL。asd1和asd2扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，57℃1min，72℃2.5min。30个循环后，72℃延伸10min。所扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，片段大小与预期大小相当，分别为2112bp和2069bp。

4.pREasd12转移质粒的构建

用Xba I和BamH I双酶切asd1和pBluescriptSK(+)载体，回收纯化后用T4DNA ligase连接(连接产物命名为pSKasd1)，16℃水浴12h，转化DH5α感受态细菌，37℃在固体LB培养基培养12h，挑菌到液体LB培养基，于37℃、225r/min振摇培养12h。使用质粒小提试剂盒少量提取并获得质粒pSKasd1，再用BamH I和Kpn I双酶切asd2与质粒pSKasd1。回收后用T4DNA Ligase连接(连接产物命名为pSKasd12质粒)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min培养12h，小量提取质粒从而获得pSKasd12质粒。用XbaI和KpnI双酶切转移质粒pSKasd12与自杀性质粒pRE112(来源美国圣路易斯密苏里州，华盛顿大学Dr.Roy CurtissIII教授惠赠)，回收asd1-asd2片段和质粒pRE112，用T4DNA Ligase连接，16℃水浴12h，电转化(参数：电压2.0KV；电容5μF；脉冲电阻200Ω；时间4ms)大肠杆菌χ7213(来源美国圣路易斯密苏里州，华盛顿大学Dr.Roy CurtissIII教授惠赠；Edwards，R.A.，L. H.Keller，and D.M.Schifferli.1998.Improved allelic exchange vectors and their use toanalyze 987P fimbria gene expression.Gene207：149-157.)构建重组菌株χ7213/pREasd12，37℃培养12h挑菌到LB液体培养基，37℃下225r/min培养12h，小量制备质粒从而获得pREasd12转移质粒(其物理图谱见图2中的A)。鉴定结果证实构建的转移质粒pREasd12是正确的(见图2中的B)。

5.asd基因缺失株的构建

以χ7213/pREasd12为供体菌，猪霍乱沙门氏菌C500为受体菌进行接合转移。供体菌和受体菌分别在LB培养基中培养过夜，用无菌PBS缓冲液(pH7.4，成分：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O2.9g，KH₂PO₄0.2g，加蒸馏水至1000mL)洗两遍，调整菌浓度至OD₅₉₅为0.8，各取100μL菌悬液混合。将无菌硝酸纤维膜(NC膜)贴于含DAP的固体LB平板上，再将混合菌液滴于NC膜上，37℃培养12h，同时做供体和受体对照。用无菌PBS洗下滤膜上菌液，重复两遍，涂布含30μg/ml氯霉素的固体LB平板，37℃培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5％蔗糖的LB平板，挑取阳性克隆然后提取基因组，用引物pa5/pa6扩增鉴定。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中培养12h，连续10倍稀释，涂布含5％蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5％蔗糖的固体平板，筛选Cm敏感菌落。提取基因组，再次用引物pa5/pa6扩增鉴定，鉴定结果见图3。缺失asd基因的C500突变株失去了合成DAP的能力，所以不能在无外源DAP的培养基上生长。因而，所构建的asd基因缺失株asd^-C500是正确的。申请人将该asd基因缺失株命名猪霍乱沙门氏菌Δasd C500^-，Salmonella choleraesuis asd^-ΔasdC500^-(该菌株通常也简写作asd^-C500)，该菌株于2012年9月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO M2012346。

实施例2：副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因HbpB的克隆

1.主要实验材料

NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、DAB显色诊断试剂盒均为Sigma公司产品，新生牛血清是杭州四季青生物制品有限公司产品。TSB、TSA为Difco^TM产品。其余主要实验材料参考实施例1。

2.目的基因分析及引物设计

本发明所涉目的抗原HbpB的序列登录号及其在副猪嗜血杆菌SH0165菌株(蔡旭旺，副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究，2006年6月，华中农业大学博士论文，中国国家图书馆，中国国家数字图书馆http://res4.nlc.gov.cn/home/search.trs？method＝showDetail&channelid＝3&id＝003448570)中所处位置为HbpB＞gi|219692392；2142475..2144169[Haemophilus parasuis SH0165](其中带有下划线的为HbpB蛋白在Genebank中的登录号，分号显示的足HbpB基因在副猪嗜血杆菌SH0165菌株全基因组中的位置，括号后显示加粗斜体字的为本发明涉及的副猪嗜血杆菌菌株号)。

利用SignalP软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对抗原蛋白HbpB进行氨基酸序列分析，结果表明HbpB共编码564个氨基酸，最可能的信号肽切割位置在第24至25个氨基酸之间。鉴于载体质粒PYA3493中多克隆位点上游包含信号肽，因此我们对其余序列进行引物设计。应用Primer5.0软件设计用于扩增HbpB基因的引物(见表2)。另设计引物对pi1/pi2(见表2)，用以扩增沙门氏菌属特异性基因InvA(Gene ID：1254419)。上述引物对均由上海生工生物技术有限公司合成。

表2：HbpB和InvA基因的扩增引物

表2说明：引物序列中带有下划线的核苷酸序列为酶切位点。

3.副猪嗜血杆菌基因组制备

将副猪嗜血杆菌菌种SH0165株接种于含有10％灭活新生牛血清及0.1％NAD的TSA固体培养基上，挑取单个菌落接种于含有10％灭活新生牛血清及0.1％NAD的TSB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。收集菌体，按照细菌基因组提取试剂盒(天津天根生化科技(北京)有限公司产品)说明书提供的操作方法提取副猪嗜血杆菌基因组DNA。

4.目的基因HbpB的PCR扩增及产物回收

本发明中目的基因HbpB扩增的PCR反应体系如下所示：全基因组模板4μL，上下游引物各2μL，10mM dNTPs4μL，Taq酶(5U/μL)0.5μL，10×Taq Buffer5μL，添加ddH₂O调整反应总体积至50μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，58℃退火1min30sec，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。用0.8％的琼脂糖胶电泳，进行鉴定回收。PCR结果见图5，扩增的HbpB核苷酸序列见SEQ ID NO：1。

采用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，具体操作按照试剂盒说明书的步骤进行。

实施例3：重组猪霍乱沙门氏菌asd-C500/pYA-HbpB菌株构建

1.主要实验材料

大肠杆菌χ6097(ara^Δ(lac-pro)rpslΔasdA4Δ[zhf-2.∵Tn10]thiΦ80d/lacZΔM15)由美国华盛顿大学Dr.RoyCurtissIII惠赠。CaCl₂、甘油等试剂是上海国药集团化学试剂有限公司产品。其余主要实验试剂见实施例1。

2.χ6097感受态的制备(CaCl₂法)

采用CaCl₂法制备大肠杆菌χ6097(ara^Δ(lac-pro)rpslΔasdA4Δ[zhf-2.∵Tn10] thiΦ80d/lacZΔM15)感受态细胞，具体步骤如下：从-80℃冰箱取出大肠杆菌χ6097(大肠杆菌χ6097，Escherichia coliχ6097于2012年9月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNO：M2012344)冻干粉，解冻后将之在LB平板上划线，37℃恒温倒置培养16-18h；挑取单菌落接种至5mL含50μg/mLDAP的LB培养液中，37℃、230r/min恒温培养过夜；按体积比1∶100比例将培养物接种至适量LB培养液(含50μg/mL DAP)中，于37℃、230r/min振荡培养3-4h；取出100-200μL培养物检测OD₆₀₀，当OD₆₀₀介于0.3-0.4之间时，将培养物冰浴30min，后在4℃，5000-6000r/min下离心10min收集菌体，弃上清；加入约1/2-1/5菌液体积的冰浴CaCl₂溶液(含100mmol/L，10％(V/V)甘油，下同)，轻轻吹打充分重悬菌体沉淀，冰浴15min；重复上述步骤2次；再于4℃，5000r/min离心10min收集菌体，弃上清；加入约1/50-1/25原培养物体积的CaCl₂溶液，轻轻吹打重悬菌体；分装至无菌EP管中，每管100μL，-80℃贮存备用。

3.表达质粒pYA-HbpB的构建

将实施例2中所得HbpB基因与质粒pYA3493(质粒图谱如图4所示)使用限制性内切酶BamH I和HindIII进行酶切，回收酶切产物，并将两者进行16℃水浴连接。次日将连接产物转化步骤1制备的χ6097感受态细胞，37℃下在无抗性LB固体培养基上培养。随机能在平皿上生长的单菌落若干，分别放入LB液体培养基中37℃培养12小时。再分别少量提取质粒，酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，命名为pYA-HbpB。重组质粒pYA-HbpB双酶切图谱见图5。

4.猪沙门氏菌asd-C500感受态细胞制备

从-80℃冰箱取出猪霍乱沙门氏菌asd^-C500冻干粉，以无菌铂丝直接蘸取并于含50μg/mL DAP的LB平板表面划线接种，37℃倒置培养16-18h；挑取单菌落接种至4mL含50μg/mL DAP的LB培养液中，37℃180r/min培养过夜；按体积比1∶100将培养物转接至50mL LB培养液(含50μg/mL DAP)中，37℃、230r/min振荡培养2-3h；取出100-200μL培养物检测OD₆₀₀，当OD₆₀₀介于0.8左右时，冰浴菌液使之冷却到0℃；然后在4℃条件下5000r/min离心10min收集菌体，弃上清；用2-5mL10％灭菌甘油洗涤沉淀菌体，重复3次，再用10％灭菌甘油重悬细胞，100μL/管分装，做好标记后置-80℃冰箱冻存备用。

5.重组质粒的电转化

取2-3μL已除盐重组质粒pYA-HbpB加入到步骤3制备的感受态细胞asd^-C500中，轻轻混匀并立即转移到预冷的0.2cm电转杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪(BioRad GenePulser)样品槽中；按照以下条件进行电转化：电压2.0KV；电容5μF；脉冲电阻200Ω；时间，4ms。电击后，马上取出电转杯，迅速加入预热至37℃的LB培养基(含50μg/mL DAP)，并将菌液转移到无菌EP管中；37℃120r/min震荡培养60min，取100-150μL菌液涂布于LB固体培养基表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培养16-18h，待平皿表面有菌落长出后进行鉴定。

另外，取2-3μL已除盐pYA3493质粒加入到步骤3制备的感受态细胞asd^-C500中，轻轻混匀并立即转移到预冷的0.2cm电转杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪(BioRad GenePulser)样品槽中；按照以下条件进行电转化：电压2.0KV；电容5μF；脉冲电阻200Ω；时间，4ms。电击后，马上取出电转杯，迅速加入预热至37℃的LB培养基(含50μg/mL DAP)，并将菌液转移到无菌EP管中；37℃120r/min震荡培养60min，取100-150μL菌液涂布于LB固体培养基表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培养16-18h，待平皿表面有菌落长出后进行鉴定。所得重组菌株命名为猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA3493，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA3493，该菌株已于2013年1月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013051。

6.重组菌株asd^-C500/pYA-HbpB的获得

挑取能在LB平皿表面生长的菌落，分别以pi1/pi2、ph1/ph2作为引物进行PCR鉴定。跑胶结果显示所选菌株能够扩增出沙门氏菌特异条带(580bp)和外源基因条带(1620bp)，重组菌株构建成功(见图6)。将重组质粒pYA-HbpB成功电转至asd^-C500感受态细胞后所构建的重组菌株恢复了在不含DAP的LB培养基上生长的能力，这说明重组质粒pYA-HbpB在asd^-C500宿主菌株内能够表达asd基因并与后者的asd缺失表型形成互补。

至此，获得了一株不含抗性标记的表达副猪嗜血杆菌HbpB基因的重组猪霍乱沙门氏菌株，命名为猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA-HbpB，该菌株已于2013年1月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013052。

实施例4：重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-HbpB的生物学特性

1.重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-HbpB的表达特性

将重组菌asd^-C500/pYA-HbpB接种于无抗性液体LB培养基中，37℃振摇培养15-16h后，离心收集菌体。加入适量PBS(pH7.4)重悬菌体沉淀，加入等体积2×SDS上样Buffer，煮沸10min后冰浴，以备进行SDS-PAGE。注意同时处理asd^-C500/pYA3493菌体作为阴性对照。

参照萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版(萨姆布鲁克，黄培堂译，科学出版社，2002年版)的方法进行SDS-PAGE凝胶的配制、电泳、染色以及脱色。具体步骤如下：

SDS-PAGE的配制及电泳：

10％分离胶的配制：ddH₂O1.9mL，30％丙烯酰胺溶液1.7mL，1.5mol/L Tris-Base溶液(pH8.8)1.3mL，10％SDS0.05mL，10％过硫酸铵0.05mL和TEMED0.003mL。将各成分加入后迅速混匀，立刻添加到制胶板中，其上缓慢铺上少量ddH₂O。5％浓缩胶的配制：纯化水0.68mL，30％丙烯酰胺溶液0.17mL，1.0mol/L Tris-Base溶液(pH6.8)0.13mL，10％SDS0.01mL，10％过硫酸铵0.01mL，TEMED0.001mL，添加上述各成分后迅速混合，加入制胶板的分离胶上面，灌满后插入加样梳(加浓缩胶前须彻底吸净上层水)。待浓缩胶凝固后取下梳子，将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，向加样孔中分别加入各样品；电泳时先设置电压为80V，电流保持在20mA-40mA范围内，电泳约30min后，至所有样品进入分离胶层后调整电压至120V，直至溴酚蓝泳出胶底面时终止电泳。

SDS-PAGE的染色与脱色：

卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸，0.25％的考马斯亮蓝R250)染色4-6h，然后再用脱色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸)进行脱色，观察结果。

首先配制10％分离胶，待之凝固后配制上层5％浓缩胶然后进行上样跑胶。电泳完成后卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染液染色4-6h，然后进行脱色观察。SDS-PAGE分析结果见图7所示。

Western-blot分析

重组菌株asd^-C500/pYA-HbpB的Western-blot分析是先按上述方法进行SDS-PAGE凝胶电泳。其后步骤如下：

1)转膜：切出6张Whatman3M滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC膜)，滤纸和NC膜的大小要完全等于或略小于凝胶；将NC膜在ddH₂O中浸泡5min，滤纸浸泡于转移缓冲液中。然后按如下步骤安装转膜仪：平放石墨电极的底座(阳极)，依次放3层滤纸、NC膜、SDS-PAGE凝胶和3层滤纸，彻底排除各层间气泡；将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65mA/cm²-1.0mA/cm²的参数设置电流，电泳转移0.5h-2h。

2)封闭：转膜完全后取下NC膜，置于封闭液中，室温封闭2h；

3)洗涤：弃封闭液，用TBST洗NC膜3遍，每次5min；

4)一抗孵育：将NC膜放入1∶100倍稀释的小鼠抗HPS SH0165感染血清(来源于感染了副猪嗜血杆菌SH0165后存活的小鼠血清)中，37℃孵育2h；

5)洗涤：取出NC膜，用TBST洗膜3次，每次5min；

6)二抗孵育：将NC膜转入用封闭液1∶5000倍稀释的羊抗鼠IgG抗体(HRP标记)中，37℃孵育2h；

7)洗涤：取出NC膜，用TBST洗膜5次，每次5min；

8)显色：将NC膜置于新配置的DAB显色液中，避光显色，待目的带颜色深度达到要求后，迅速用TBST冲洗以终止反应。

重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB菌株的Western-blot分析结果见图8。

2.重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-HbpB的生长特性

将重组菌株asd^-C500/pYA-HbpB与对照菌株asd^-C500划线接种无抗性LB平板上，挑取单克隆分别接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养10h后，调整菌液OD₅₉₅值，取50μL接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养，每隔1h测定菌液OD₅₉₅值。结果如图9所示，表明重组菌株asd^-C500/pYA-HbpB与对照菌株asd^-C500/pYA3493生长趋势很相似，不同点在于从对数后期开始前者的生长速度一直略慢于后者。

3.重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-HbpB的遗传稳定性

将重组菌asd^-C500/pYA-HbpB在LB液体培养基中连续传代，分别取第0代、10代、20代、30代、40代、50代、60代、70代、80代、90代、100代菌液进行PCR鉴定。结果表明：各株重组菌的不同代次均能扩增出外源基因片段条带(1620bp，见图11)。传代100次后挑取的重组菌测序结果与初代外源片段序列依旧一致，表明重组质粒能在asd^-C500/pYA-HbpB中稳定遗传。

4.重组猪霍乱沙门氏菌菌株asd^-C500/pYA-HbpB的致病力评估

重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-HbpB的致病力及安全性是通过感染SPF级昆明小鼠来评估。将梯度剂量的重组菌asd^-C500/pYA-HbpB腹腔注射4-5周龄雌性昆明系小鼠，观察21天并记录实验动物的存活情况。按照Reed-Muench法计算小鼠半数致死剂量(LD₅₀)，评价重组菌株与对照菌株asd^-C500/pYA3493相比毒力变化以及作为疫苗应用对小鼠是否安全。小鼠腹腔注射感染重组菌asd^-C500/pYA-HbpB与阴性对照菌株的安全性实验结果见表4，表明重组菌asd^-C500/pYA-HbpB与阴性对照菌株asd^-C500/pYA3493致病力相当，安全性较好。

表3   本发明的重组猪霍乱沙门氏菌菌株对小鼠半数致死剂量LD₅₀的测定

实施例5：重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-HbpB疫苗的制备

将本发明的重组沙门氏菌菌株asd^-C500/pYA-HbpB在无抗性LB固体培养基上培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，至活菌数目达1×10¹⁰CFU/mL时，将菌液与15％灭活脱脂乳(灭活脱脂乳配制方法是将每100mL去离子水中加脱脂奶粉15g，充分混匀后，置105℃灭菌30min，冷却后置4℃保存备用)以1∶1(V∶V)比例进行充分混合，于灭菌冻干瓶中按每瓶2.0mL的规格进行分装，置冷冻干燥机中冻干。冻干36-40h后压盖，置-20℃保存备用，以作为能够同时抵抗副猪嗜血杆菌病和仔猪副伤寒的二联动物基因工程弱毒活疫苗。

实施例6：重组猪霍乱沙门氏菌株疫苗asd^-C500/pYA-HbpB对小鼠的免疫效力试验

1试验分组及免疫

选取4周龄雌性昆明小鼠36只，平均分为3组，即免疫asd^-C500/pYA-HbpB的试验组、免疫asd^-C500/pYA3493的阴性对照组、以及免疫PBS对照组，每组12只。口服免疫，免疫剂量为0.2mL/只。初次免疫两周后进行加强免疫1次，具体操作同一免。免疫前禁食24h，禁水4h，并先以100μL10％NaHCO3中和胃酸，30min后用12号灌胃针口服疫苗100μL，待所有实验组完成1h后恢复饮水和饲料。

2血清特异性抗体的检测

各组小鼠在首免后第28天采血收集免疫血清，每组6只，用于检测各组小鼠的HbpB特异性抗体水平(具体操作方法参考文献6)。小鼠血清抗体的ELISA检测结果见图11，结果表明相比阴性对照组和空白对照组，重组菌asd^-C500/pYA-HbpB免疫组小鼠产生了较高水平的针对HbpB的特异性抗体。

3免疫小鼠攻毒保护性试验

加强免疫后第14天对小鼠进行攻毒试验。将每组免疫小鼠分两批进行，每批6只。其中一批采用副猪嗜血杆菌强毒株HPS SH0165进行攻毒，攻毒途径是腹腔注射，攻毒剂量为40亿CFU/0.2ml/只；另一批采用猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1(菌株来源：中国兽医药品监察所)进行攻毒试验，攻毒方式是灌胃，攻毒剂量为500万CFU/0.1mL/只。攻毒后连续观察14天，记录各组小鼠的临床特征及死亡情况。

具体攻毒保护结果见表5，显示无论是进行副猪嗜血杆菌还是猪霍乱沙门氏菌强毒株攻毒试验，重组菌免疫组小鼠均具有良好的免疫保护力，保护率明显高于空白对照，也高于阴性对照。重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-HbpB能够同时抵抗猪霍乱沙门氏菌和副猪嗜血杆菌感染，具有良好的应用前景。

表4免疫小鼠的SH0165、C78-1攻毒保护结果

参考文献

1.Kielstein P，Rapp-Gabrielson VJ.Designation of 15 serovars of Haemophilus parasuis on the basis ofimmunodiffusion using heat-stable antigen extracts.J Clin Microbiol，1992；30(4)：862-865

2.Nielsen R.Pathogenicity and immunity studies of Haemophilus parasuis serotypes.Acta Vet Scand，1993，34(2)：193-198

3.Cai X，Chen H，Blackall PJ，et al.，Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates fromChina.Vet Microbiol，2005，111(3-4)：231-236

4.Kang，H，et al.，Immune responses to recombinant pneumococcal PspA antigen delivered by liveattenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine.Infect.Immun.，2002，70：1739-1749

5.房晓文等，仔猪副伤寒弱毒菌苗的研究，畜牧兽医学报，1981(2)：29-36

6.赵建平等，猪链球菌-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗在小鼠的免疫效力分析，畜牧兽医学报，2012，43(10)：1639-1644

7.赵战勤等，猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500株的生物学特性及作为活疫苗表达载体的应用，生物工程学报，2009，25(1)：29-36

Claims (7)

1.一株表达副猪嗜血杆菌表面抗原HbpB基因的重组猪霍乱沙门氏菌菌株asd^-C500/pYA-HbpB，Salmonella choleraesuis asd^- C500/pYA-HbpB，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2013052。

2.如权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌菌株asd^- C500/pYA-HbpB，其特征包括如下特征：

1)所述菌株基因组缺失了猪霍乱沙门氏菌细胞壁合成必需的asd基因；

2)所述菌株内含表达副猪嗜血杆菌表面抗原HbpB基因的重组质粒pYA-HbpB，所述的质粒能够复制表达asd基因。

3.一种无抗性标记的重组质粒pYA-Hbp B，其特征在于，所述的重组质粒含有副猪嗜血杆菌表面抗原Hbp B基因，且能在宿主菌内表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种无抗性标记的重组质粒pYA-HbpB，其蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种表达副猪嗜血杆菌表面抗原基因HbpB的重组猪霍乱沙门氏菌的制备方法，其包括如下步骤：

1)构建猪霍乱沙门氏菌C500菌株asd基因缺失株asd^-C500；

2)设计引物对，通过PCR扩增方法得到副猪嗜血杆菌表面抗原HbpB基因片段，该基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

3)将步骤2)中扩增的基因片段HbpB插入到原核表达载体pYA3493的BamH I和HindIII位点之间，得到表达质粒pYA-HbpB；

4)将步骤3)获得的表达质粒pYA-HbpB电转化至宿主菌株猪霍乱沙门氏菌asd^-C500，筛选得到表达副猪嗜血杆菌表面抗原HbpB的猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-HbpB，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA-HbpB，其保藏号为CCTCC NO：M2013052；

其中：

步骤2)所述的引物对的DNA序列如下所示：

上游引物：cgtggatcc gccaataccagattcaggaacattgaac，

下游引物：ggc aagctt ttaaaatgttttaattgcagataaccaaaa。

6.权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗中的应用。

7.权利要求3或4所述的pYA-HbpB重组质粒在制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗中的应用。

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