CN110592189B - 一种单核细胞增生李斯特氏菌的多位点基因分型方法 - Google Patents

一种单核细胞增生李斯特氏菌的多位点基因分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及单核细胞增生李斯特氏菌检测技术领域，具体涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌的多位点基因分型方法。本发明提供与单核细胞增生李斯特氏菌基因分型相关的7个SNP位点，利用这7个SNP位点的组合可以较为准确地进行单增李斯特菌的基因分型，对于单增李斯特菌的种间区分度较高，并且分型结果与传统的MLST分型结果可相互对应。本发明提供的多重PCR‑反向线点杂交对单增李斯特菌进行基因分型的方法能够实现高效快速的单增李斯特菌的基因分型，大大提高了单增李斯特菌检测和分型的工作效率。

Description

一种单核细胞增生李斯特氏菌的多位点基因分型方法
技术领域
本发明涉及单核细胞增生李斯特氏菌检测技术领域，具体涉及与单增李斯特菌基因分型相关的SNP位点，检测该SNP位点的特异性引物和探针，以及利用多重PCR-反向线点杂交快速进行单增李斯特菌多位点基因分型的方法。
背景技术
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，简称单增李斯特菌)是一种人畜共患病的病原菌。单增李斯特菌作为一种食源性病原菌，可引起发热性胃肠炎、孕妇流产、死产及严重的弥散性感染(如败血症、脑膜炎等疾病)。人群中的李斯特菌病主要是由于摄入污染单增李斯特菌的食物引起的，其发病率相对较低，但该病在免疫缺陷者、老人、孕妇、新生儿等人群中致死率较高，可达20％～30％。
研究表明，细菌的ST型与其致病性具有一定的相关性，许多致病菌的强毒株都集中于某几个ST型或克隆群。单增李斯特菌的ST9型、ST8型、ST87型、ST122型4种ST型别的菌株占食品来源菌株总数的一半以上，是食品来源单增李斯特菌的优势型别。通过分析单增李斯特菌毒力基因的位点多态性，快速确定单增李斯特菌菌株的基因分型，能够大大提高临床和食品检测的工作效率，因此具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供与单增李斯特菌基因分型相关的SNP位点，检测该SNP位点的特异性引物和探针，以及利用多重PCR-反向线点杂交快速进行单增李斯特菌多位点基因分型的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明通过对从食品中分离得到的264株单增李斯特菌进行全基因组测序分析，发现在单增李斯特菌基因组的多个位点存在单核苷酸多态性(SNP)。利用软件分析进行SNP位点的初步筛选；对于初步筛选得到的SNP位点的上下游序列的突变情况进行分析并结合各SNP位点在菌株之间的区分度进行进一步筛选；对进一步筛选得到的SNP位点进行不同单增李斯特菌的分离菌株间的区分度和遗传稳定性进行验证，保留具有较高的种间区分度和遗传稳定性的SNP位点。最终发现在单增李斯特毒力基因hly中存在7个能使蛋白质发生变异的、区分度较高且遗传稳定的SNP位点，这些SNP位点与单增李斯特菌的ST分型存在一定的对应关系，可以用于单增李斯特菌种以下水平的分型。
hly基因编码的LLO蛋白是一种由529个氨基酸组成的具有溶血活性的成孔蛋白，属于胆固醇依赖性溶血素家族成员。LLO蛋白对于单增李斯特菌从初级或次级噬菌体中逃逸，以及在宿主细胞质中的繁殖过程都起到重要作用，是单增李斯特菌最重要的毒力因子之一。本发明进一步针对上述筛选得到的7个SNP位点设计了检测引物和探针，并在此基础上开发了检测上述SNP位点的多次PCR-反向线点杂交方法。
具体地，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供与单核细胞增生李斯特氏菌基因分型相关的SNP位点，所述SNP位点包含位于如SEQ ID NO.1所示序列的如下SNP位点中的一个或多个：
(1)第91位，A/C；
(2)第104位，C/T；
(3)第1153位，A/G；
(4)第1312位，G/A；
(5)第1362位，C/G；
(6)第1568位，A/G；
(7)第1569位，A/T。
如SEQ ID NO.1所示的序列为单增李斯特菌hly基因的核苷酸序列，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述SNP位点的位置参考序列CP025567基因组的205468-207057。
上述7个SNP位点对应hly基因编码蛋白的6个氨基酸位点差异，分别为第31位N/H，第35位S/L，第385位I/V，第438位V/I，第454位S/R和第523位K/S。
在进行单增李斯特菌的基因分型时，可采用上述7个SNP位点中的任意一个或多个SNP位点的组合。采用上述7个SNP位点的组合进行单增李斯特菌的基因分型能够获得更准确的基因分型结果。
本发明通过利用上述7个SNP位点的组合对从食品中分离得到的264株单增李斯特菌进行基因分型，证明该分型方法具有较高的种间区分度和准确性，且分型结果能够与MLST分型结果相互对应。
第二方面，本发明提供用于检测上述SNP位点的特异性引物。
具体地，用于检测上述SNP位点的特异性引物包含序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物、序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物或序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物与序列如SEQ IDNO.5-6所示的引物的组合。
其中，序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物可用于检测上述(1)、(2)的SNP位点。序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物可用于检测上述(3)～(7)中的SNP位点。
第三方面，本发明提供用于检测所述SNP位点的探针。
具体地，用于检测所述SNP位点的探针包含序列如SEQ ID NO.7-18所示的探针中的一个或多个。
其中，序列如SEQ ID NO.7-8所示的探针用于检测上述(1)中的SNP位点；序列如SEQ ID NO.9-10所示的探针用于检测上述(2)中的SNP位点；序列如SEQ ID NO.11-12所示的探针用于检测上述(3)中的SNP位点；序列如SEQ ID NO.13-14所示的探针用于检测上述(4)中的SNP位点；序列如SEQ ID NO.15-16所示的探针用于检测上述(5)中的SNP位点；序列如SEQ ID NO.17-18所示的探针用于检测上述(6)、(7)中的SNP位点。
上述特异性引物和探针可组合为引物探针组合，配合使用进行所述SNP位点的检测。
上述特异性引物和探针可用于采用多重PCR-反向线点杂交(mPCR-RLB)检测方法，在用于该方法检测时，上述特异性引物的5’端可采用生物素等标记，上述探针的5’端可采用氨基的基团标记。
第四方面，本发明提供用于单核细胞增生李斯特氏菌基因分型或检测的试剂盒，其包含用于检测所述SNP位点的特异性引物和/或探针。
优选地，所述试剂盒还包含PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶等。
第五方面，本发明提供所述SNP位点或用于检测所述SNP位点的特异性引物或用于检测所述SNP位点的探针或所述试剂盒在单核细胞增生李斯特氏菌基因分型中的应用。
第六方面，本发明提供所述SNP位点或用于检测所述SNP位点的特异性引物或用于检测所述SNP位点的探针或所述试剂盒在单核细胞增生李斯特氏菌检测中的应用。
第七方面，本发明提供所述SNP位点或用于检测所述SNP位点的特异性引物或用于检测所述SNP位点的探针或所述试剂盒在单核细胞增生李斯特氏菌毒力鉴定或耐药性鉴定中的应用。
第八方面，本发明提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的基因分型方法，其为利用多重PCR-反向线点杂交方法检测待测单核细胞增生李斯特氏菌中所述SNP位点的多态性，根据SNP位点的多态性对单核细胞增生李斯特氏菌进行基因分型。
具体地，所述利用多重PCR-反向线点杂交方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法包括如下步骤：
(1)多重PCR：以待测单核细胞增生李斯特氏菌的基因组DNA为模板，利用序列如SEQ ID NO.3-6所示的特异性引物扩增含有所述SNP位点的DNA片段；
(2)探针标记：将序列如SEQ ID NO.7-18所示的探针固定于杂交膜上，得到探针标记的杂交膜；
(3)反向线点杂交：将步骤(1)得到的所述DNA片段与步骤(2)得到的所述探针标记的杂交膜进行杂交，经显色后，分析所述SNP位点的多态性。
优选地，上述步骤(1)中，所述多重PCR的反应程序如下：95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸8min。
优选地，上述步骤(1)中，所述多重PCR的50μL反应体系如下：
2×HotStart Taq PCR MasterMix 25μL，2个正向引物和2个反向引物各0.5μL(终浓度为100pmol/L)，待测单增李斯特菌DNA模板3μL，加水至50μL。
优选地，上述步骤(2)中，采用NaHCO3溶液稀释所述探针，至终浓度为10μmol/L；室温下将尼龙膜于EDAC中孵育，超纯水洗膜；将膜固定后分别依次加入已稀释的探针，以NaHCO3溶液作为阴性对照；室温孵育后将膜放入NaOH溶液中于室温孵育；2×SSPE洗膜，然后用60℃的2×SSPE/0.1％SDS将膜孵育，此步骤重复一次；采用EDTA室温孵育后，密封4℃保存。
优选地，上述步骤(3)中反向线点杂交的具体方法如下：取步骤(1)中得到的PCR产物与2×SSPE/0.1％SDS混匀，99℃处理10min，立刻置于冰上；将所述探针标记的杂交膜放入预热的2×SSPE/0.1％SDS中，并置于60℃杂交炉中清洗5min；在探针标记的杂交膜上依次加入准备好的PCR样品，60℃杂交60min；采用2×SSPE/0.5％SDS洗膜；将杂交后的膜在2×SSPE/0.5％SDS和POD混合液中，42℃孵育60min；采用2×SSPE/0.5％SDS洗膜；室温下用2×SSPE洗膜后，加入ECL显影剂于膜上，孵育2min，利用化学发光法进行显影。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了可用于单增李斯特菌基因分型的位于hly基因的7个SNP位点，利用这7个SNP位点的组合可以较为准确地进行单增李斯特菌的基因分型，对于单增李斯特菌的区分度较高，并且分型结果与传统的MLST分型结果存在一定的对应关系；
(2)本发明提供的针对7个SNP位点的特异性引物和探针，以及多重PCR-反向线点杂交检测方法能够实现高效快速的单增李斯特菌分型和检测，可以通过一次检测同时获得7个SNP位点序列信息，操作简单，可同时进行大量样品的检测，较基因芯片法的成本更低，且准确性更高，大大提高了单增李斯特菌分型和检测的工作效率，为单增李斯特菌的种以下水平的分型、hly毒力基因的突变检测以及不同毒力菌株的鉴定、毒力分析和耐药性分析提供了有效方法。
附图说明
图1为本发明实施例1中7个SNP位点的基因分型与MLST分型的对应关系分析结果。
图2为本发明实施例3中14株单增李斯特菌的多重PCR扩增产物的电泳检测结果；其中，泳道1为DNA Marker D2000，2-15为14株单增李斯特菌的PCR扩增产物，泳道16为阴性对照，泳道17为DNA Marker 1。
图3为本发明实施例3中7株单增李斯特菌的RLB杂交检测结果；其中，1-7分别代表7株单增李斯特菌的临床分离菌株，N31w、N31H、S35w、S35L、I385w、I385V、V438w、V438I、S454w、S454R、K523w和K523S分别代表6对探针。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1用于单增李斯特菌基因分型的SNP位点的获得
从北京市场上流通的生肉中分离获得264株单增李斯特菌，对264株单增李斯特菌进行全基因组测序，并对测序结果进行分析。测序分析发现单增李斯特菌基因组的多个位点存在单核苷酸多态性(SNP)。通过利用软件分析进行SNP位点的初步筛选；在此基础上对SNP位点的上下游序列的突变情况进行分析并结合各SNP位点在菌株之间的区分度进行进一步筛选；对进一步筛选得到的SNP位点进行不同单增李斯特菌的分离菌株间的区分度和遗传稳定性进行验证，保留具有较高的种间区分度和遗传稳定性的SNP位点。最终发现在单增李斯特毒力基因hly中存在7个能使蛋白质发生变异的、区分度较高且遗传稳定的SNP位点。这7个SNP位点分别位于如SEQ ID NO.1所示的hly基因序列的第91位，A/C；第104位，C/T；第1153位，A/G；第1312位，G/A；第1362位，C/G；第1568位，A/G；第1569位，A/T。
上述7个SNP位点多态性分别对应hly编码蛋白的6个氨基酸位点差异：第31位N/H，第35位S/L，第385位I/V，第438位V/I，第454位S/R和第523位K/S。
利用这7个SNP位点的组合对264株单增李斯特菌进行基因分型，分型结果如表1和表2所示，hly基因有三个主要(高频)变异类型：group1:SNP位点的基因型为ACAGCAA，对应的氨基酸变异型为NSIVSK；group2：SNP位点的基因型为ATAACGT，对应的氨基酸变异型为NLIISS；group3：SNP位点的基因型为ACAACGT，对应的氨基酸变异型为NSIISS。此外，hly基因还有三个低频变异类型，分别为ACGGCAA、CTAACGT、ATAAGGG；对应的氨基酸变异型分别为NSVVSK、HLIISS、NLIIRS。
表1 7个SNP位点的位置和多态性
第91位 第104位 第1153位 第1312位 第1362位 第1568位 第1569位
A C A G C A A
A C G G C A A
A C A A C G T
A T A A C G T
C T A A C G T
A T A A G G G
表2 7个SNP位点的对应的HLY氨基酸突变位点
第31位 第35位 第385位 第438位 第454位 第523位
N S I V S K
N S V V S K
N S I I S S
N L I I S S
H L I I S S
N L I I R S
进一步地，将上述264株单增李斯特菌进行MLST分型，菌株ST分型与将上述7个SNP位点进行的单增李斯特菌基因分型的对应关系如图1所示，其中，基因分型为Group1和Group2的菌株属于LineageⅡ，而基因分型为Group3的菌株属于LineageI。结果表明，利用本发明的7个SNP位点对单增李斯特菌进行基因分型与ST分型具有一定的对应关系。
实施例2多重PCR-反向线点杂交检测方法的建立
1、特异性引物和探针的设计
针对实施例1中最终筛选得到的单增李斯特菌hly基因的7个SNP位点，利用在线Primer3软件设计特异性引物；同时根据SNP位点的序列特征设计特异性探针。利用在线的Sigma OligoEvaluator软件分析引物和探针的特性，包括引物和探针的长度、Tm值、GC含量，有无二级结构及是否会形成二聚体等，并通过NCBI的BLASTn确定引物及探针的特异性。经过上述计算机辅助设计、筛选和人工筛选、优化，最终得到序列如SEQ ID NO.3-6所示的特异性引物和序列如SEQ ID NO.7-18所示的特异性探针，引物和探针序列如表3所示，其中，引物对hly-1F和hly-1R用来扩增第91位和104位的SNP位点，片段长度为216bp；引物对hly-2F和hly-2R用来同时扩增第1153位、1312位、1362位、1568位1569位的SNP位点，片段长度为674bp。
上述的探针的5’端用氨基标记，使其能够共价结合在后续杂交使用的尼龙膜上，上述引物的5’端用生物素Biotin标记，引物和探针由生工生物工程有限公司合成。
表3单增李斯特菌2对特异性引物和6对特异性探针相关信息
Figure BDA0002217037300000091
Figure BDA0002217037300000101
注：F，上游引物；R，下游引物。探针表示方法为第一个字母表示野生型氨基酸种类缩写，中间数字表示该氨基的位置，最后的字母表示突变型的氨基酸种类缩写，标注小写w的探针为检测野生型产物的探针，未标注小写w的为检测突变型产物的探针；探针序列中下划线粗体标记的碱基为SNP位点。
2、多重PCR反应
提取待测单增李斯特菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用表3中所示的特异性引物对(SEQ ID NO.3-6)含有7个SNP位点的单增李斯特菌的目的基因片段进行多重PCR扩增反应。
50μl反应体系如下：2×HotStart Taq PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)25μL，2个正向引物和2个反向引物各0.5μL(终浓度为100pmol/L)，DNA模板3μL，加水至50μL。
PCR反应程序如下：95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环；最后72℃延伸8min。
3、探针标记
用0.5mol/L NaHCO3稀释表3中所示的单增李斯特菌的特异性探针(SEQ ID NO.7-18)，至终浓度为10μmol/L。室温下将尼龙膜于16％EDAC中孵育10min，超纯水洗膜1-2min。将膜固定于Miniblotter，分别依次加入已稀释的探针约160μL，在其它道加入0.5mol/LNaHCO3作为阴性对照；室温孵育5min。将膜放入0.1mol/L NaOH中，室温孵育9min。2×SSPE洗膜1-2min。用60℃的2×SSPE/0.1％SDS将膜孵育5min，重复此步骤一次。加入20mmol/L的EDTA，室温孵育15min后，密封4℃保存。
4、RLB(reverse line blot)杂交
取30μL步骤2扩增得到的PCR产物与150μL的2×SSPE/0.1％SDS混匀，99℃煮10min，立刻置于冰上。将探针标记的杂交膜放入250ml预热的2×SSPE/0.1％SDS中，并置于60℃杂交炉中清洗5min。将膜置于Miniblotter中，依次加入准备好的PCR样品，60℃，60min，使带有生物素标记的PCR产物与尼龙膜上标记的特异性探针充分杂交。2×SSPE/0.5％SDS，60℃洗膜2次，每次10min，。将杂交后的尼龙膜置于2×SSPE/0.5％SDS和POD混合液中，42℃，孵育60min，使POD充分结合到PCR产物上。采用42℃的2×SSPE/0.5％SDS洗膜2次，每次10min。室温下用2×SSPE洗膜2次，每次5min。加入ECL显影剂于膜上，孵育2min。化学发光法显影，分别在1s，3s，10s，30s及60s时采集图片。
实施例3利用多重PCR-反向线点杂交方法进行单增李斯特菌的基因分型
本实施例以14株单增李斯特菌的临床分离菌株为例，利用实施例2建立的多重PCR-反向线点杂交方法进行单增李斯特菌的基因分型。
在进行多重PCR扩增后，利用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳条件为110V，30min。电泳检测结果如图2所示。
实验结果显示，利用实施例2建立的多重PCR-反向线点杂交方法能够对上述14株单增李斯特菌进行基因分型，其中7株单增李斯特菌的7个SNP位点的杂交检测结果如图3所示，1号与2号菌株的SNP分型为ACAGCAA，对应的氨基酸突变型为NSIVSK；3号与4号菌株的SNP分型为ATAACGT，对应的氨基酸突变型为NLIISS；5号菌株的SNP分型为ATAAGGG，对应的氨基酸突变型为NLIIRS；6号菌株的SNP分型为CTAACGT，对应的氨基酸突变型为HLIISS；7号菌株的SNP分型为ACGGCAA，对应的氨基酸突变型为NSVVSK。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所）
中国科学院微生物研究所
首都儿科研究所
中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种单核细胞增生李斯特氏菌的多位点基因分型方法
<130> KHP191114894.8
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60
caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120
ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180
atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240
gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300
gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360
atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420
caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480
atgactaatc aagacaataa aatcgttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540
gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600
agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660
tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720
gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780
aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840
gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900
caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960
gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020
tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080
ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140
ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200
aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260
atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320
gatcctgaag gtaacgaaat tgttcaacat aaaaactgga gcgaaaacaa taaaagcaag 1380
ctagctcatt tcacatcgtc catctatttg ccaggtaacg cgagaaatat taatgtttac 1440
gctaaagaat gcactggttt agcttgggaa tggtggagaa cggtaattga tgaccggaac 1500
ttaccacttg tgaaaaatag aaatatctcc atctggggca ccacgcttta tccgaaatat 1560
agtaataaag tagataatcc aatcgaataa 1590
<210> 2
<211> 529
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu
1 5 10 15
Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys
20 25 30
Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser
35 40 45
Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr
50 55 60
Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly
65 70 75 80
Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn
85 90 95
Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn
100 105 110
Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly
115 120 125
Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val
130 135 140
Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly
145 150 155 160
Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser
165 170 175
Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys
180 185 190
Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp
195 200 205
Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala
210 215 220
Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser
225 230 235 240
Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr
245 250 255
Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys
260 265 270
Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn
275 280 285
Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu
290 295 300
Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp
305 310 315 320
Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn
325 330 335
Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro
370 375 380
Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile
385 390 395 400
Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp
405 410 415
Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn
420 425 430
Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val
435 440 445
Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe
450 455 460
Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr
465 470 475 480
Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile
485 490 495
Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp
500 505 510
Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile
515 520 525
Glu
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctaccaatt gcgcaacaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggcacatttg tcactgcatc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgtaagcgg aaaatctgtc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgtgtgtgt taagcggttt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcatctgca ttcaataaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcatctgca ttccataaag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aattcaattt catccatggc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aatttaattt catccatggc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggagttcc cattgcttat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggagttcc cgttgcttat 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gggatgaagt aaattatgat cc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gggatgaaat aaattatgat cc 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaactggagc gaaaacaata 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaactggagg gaaaacaata 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtaataaagt agataatcca atcg 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtaatagtgt agataatcca atcg 24

Claims (8)

1.用于单核细胞增生李斯特氏菌基因分型或检测的特异性引物和探针，其特征在于，其包含序列如SEQ ID NO.3-4所示的引物、序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物以及序列如SEQ ID NO.7-18所示的特异性探针。
2.用于单核细胞增生李斯特氏菌基因分型或检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的特异性引物和探针。
3.权利要求1所述的特异性引物和探针或权利要求2所述的试剂盒在非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌基因分型中的应用。
4.权利要求1所述的特异性引物和探针或权利要求2所述的试剂盒在非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌检测中的应用。
5.权利要求1所述的特异性引物和探针或权利要求2所述的试剂盒在非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌毒力鉴定或耐药性鉴定中的应用。
6.一种非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌的基因分型方法，其特征在于，利用权利要求1所述的特异性引物和探针进行多重PCR-反向线点杂交，对单核细胞增生李斯特氏菌进行基因分型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）多重PCR：以待测单核细胞增生李斯特氏菌的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的特异性引物和探针中的特异性引物扩增DNA片段；
（2）探针标记：将权利要求1所述的特异性引物和探针中的探针固定于杂交膜上，得到探针标记的杂交膜；
（3）反向线点杂交：将步骤（1）得到的DNA片段与步骤（2）得到的探针标记的杂交膜进行杂交，经显色后，对单核细胞增生李斯特氏菌进行基因分型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述多重PCR的反应程序如下：95℃预变性10min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃延伸8min。
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