CN102272302A

CN102272302A - 增强重组蛋白表达的方法

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Publication number: CN102272302A
Application number: CN2009801532582A
Authority: CN
Inventors: 井上诚; 佐伯晃一; 游军; 田畑寿晃; 岩崎仁; 朱亚峰; 长谷川护
Original assignee: Dnavec Corp
Current assignee: Dnavec Corp
Priority date: 2008-10-31
Filing date: 2009-10-30
Publication date: 2011-12-07
Anticipated expiration: 2029-10-30
Also published as: CN102272302B; EP2363472A4; JPWO2010050586A1; EP2363472B1; EP2363472A1; WO2010050586A1; US20120088819A1

Abstract

本发明提供了增强从RNA病毒载体的蛋白表达的方法和具有增强的蛋白表达能力的RNA病毒载体。本发明人通过将蛋白与AB5B蛋白融合从RNA病毒载体表达成功地显著增加了蛋白表达水平。可通过使用本发明的基因转移RNA病毒载体实现有效的基因治疗、基因接种、单克隆抗体制备等。

Description

增强重组蛋白表达的方法

技术领域

本发明涉及增强重组蛋白从RNA病毒载体的表达的方法，通过使用上述方法制备可用于药物等的重组蛋白的方法，表达所述重组蛋白的RNA病毒载体，等等。

背景技术

目前许多重组蛋白和肽被用作药物组合物。人们认为生物药(biopharmaceuticals)的类型和数量会在将来增加，且将占所有药物的较大一部分。已提出许多生物活性蛋白和肽可作为药物组合物的候选。在这样的情况下，通过增加蛋白和肽的表达水平而简化其制备，可极大地提高它们的可利用性和适用性。

对于基因治疗等中使用的基因转移RNA病毒载体也是如此。当使用基因转移RNA病毒载体将基因施用于基因疗法、基因疫苗、单克隆抗体制备物等时，插入基因的表达水平与载体功能直接相联系。因此，载体性能可通过增加表达水平来提高，这导致蛋白的可利用性和适用性的极大提高。

由细菌产生的AB5毒素是由产毒素细菌产生并分泌至细菌细胞之外的蛋白质性外毒素。AB5毒素由一个具有毒性的活性亚基(A亚基)和五个具有细胞结合活性的结合亚基(B亚基)组成。霍乱毒素是AB5毒素。已报道了将非毒性霍乱毒素B亚基(CTB)作为分子佐剂应用于感染和慢性疾病，例如，用于流感病毒疫苗(Isaka M.等，Microbiol.Immunol.52(2)：55-63，2008)，百日咳疫苗(Isaka M.等，Vaccine，21(11-12)：1165-73，2003)，呼吸道合胞(respiratory syncytial)(RS)病毒疫苗(Singh S.R.等，Viral Immunol.20(2)：261-75，2007；Oien N.L.等，Vaccine，Jun.12(8)：731-5，1994)，癌症疫苗(Wakabayashi A.等，J Immunol.180(6)：4000-10，2008)和阿尔茨海默氏病疫苗(Maier M.等，Vaccine，23(44)：5149-59，2005)。然而，并无报道描述通过RNA病毒载体来表达重组蛋白或通过使用RNA病毒载体来增强重组蛋白的表达。

现有技术文献

非专利文献

[非专利文献1]Isaka M.等，Microbiol Immunol.2008；52(2)：55-63

[非专利文献2]Isaka M.等，Vaccine.2003；21(11-12)：1165-73

[非专利文献3]Singh S.R.等，Viral Immunol.2007；20(2)：261-75

[非专利文献4]Oien N.L.等，Vaccine.1994Jun；12(8)：731-5

[非专利文献5]Wakabayashi A.等，J Immunol.2008；180(6)：4000-10

[非专利文献6]Maier M.等，Vaccine.2005；23(44)：5149-59

发明内容

发明所要解决的问题

本发明正是鉴于上述状况而提出的，本发明的一个目的是提供增强可用作药物组合物的重组蛋白和肽从RNA病毒载体表达的方法，以简化重组蛋白和肽的制备，并通过将上述技术应用于RNA病毒来源的基因转移载体，在基因治疗、基因接种、单克隆抗体制备等应用中提供可产生治疗基因高表达的更有效的基因转移载体。

解决问题的手段

本发明人发现当从RNA病毒表达蛋白或肽时，在不少情况下由于待表达的蛋白或肽的性质，所述蛋白或肽表达水平低下，且制备困难。具体而言，本发明人发现当从RNA病毒载体表达短肽、低溶解性蛋白等时表达效率极低。

同时，AB毒素B亚基(AB5B)是超过10KD的蛋白。其三维结构分析表明其形成五聚体McCann J.A.等，Biochemistry.36(30)：9169-78，1997；PickensJ.C.等，Chem Biol.11(9)：1205-1215，2004)。属于AB5B的霍乱毒素B(CTB)已用作佐剂。然而，并不知道当使用CTB时，蛋白表达水平是否改变。在将重组蛋白作为CTB融合蛋白表达的过程中，本发明人发现当重组蛋白作为CTB融合蛋白使用仙台病毒表达时，与当单独表达该重组蛋白时相比，其表达水平显著增加。

为了更加具体地分析该现象，本发明人选择了多种类型的重组蛋白作为实例，并评价了其与AB5B融合时表达水平的变化(增加或减少)。此外，为了衡量AB5B与其他载体蛋白(融合蛋白)之间的差异，选择了假单胞菌外毒素A(PEDI)的受体结合域(Ia)和白介素-4(IL-4)，并比较了它们与AB5B的融合。

所得的结果具有高度说服力。所有测试的大小为120个氨基酸或更少的肽，包括促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)，内皮缩血管肽-1(ET-1)，神经肽Y(NPY)，胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和淀粉状蛋白β-42(Aβ42：淀粉状蛋白β)，当与AB5B融合时，显示显著增加水平的表达(几十倍或更多)。此外，将AB5B与其他载体如PEDI和IL-4蛋白相比，显示AB5B具有显著更强的表达增强作用。AB5B的作用比球状蛋白质如IL-4更有效这一点是非常重要的。

当从RNA病毒载体表达时，链长较短的蛋白仅以非常不良的表达效率表达。因此，以充足的水平表达此类蛋白是困难的。然而，基于本发明，甚至对于链长短的蛋白也可通过将其作为AB5B融合蛋白来表达而显著增加其表达水平。

增加重组蛋白的表达水平对于制备该重组蛋白本身是有利的。当表达此种重组蛋白/肽时，在一些情况下可不经任何修饰而使用。然而，在其他情况下，优选将AB5B去除。在此类情况下，通过预先在AB5B和目标重组蛋白/肽之间引入蛋白酶切割位点如肠激酶识别序列(DDDDK↓)，因子Xa识别序列(IEGR↓)，凝血酶识别序列(LVPR↓GS)或HRV 3C蛋白酶识别序列(LEVLFQ↓GP)，AB5B可以被切去(cleave off)。或者，霍乱毒素(CTB)可通过使用Ni柱来亲和纯化，因为其对Ni柱显示弱的亲和力(M.T.Dertzbaugh和L.M.Cox，Protein Engineering，11：577-581，1998；美国专利6008329号)。

此外，与AB5B的融合是在使用基因转移RNA病毒载体进行基因治疗、基因接种、单克隆抗体制备等中增强重组蛋白的体内、离体或体外表达的有效方式。增强的表达直接与载体功能相联系，并因此可提高载体性能。

具体而言，本发明涉及通过将重组蛋白与AB5B融合来增强重组蛋白从RNA病毒载体的表达的方法，通过使用上述方法制备可用于药物的重组蛋白的方法，编码AB5B融合蛋白的RNA病毒载体等。更具体而言，本发明涉及：

[1]编码重组蛋白的RNA病毒载体，其中所述蛋白作为与AT5毒素B亚基的融合蛋白被编码；

[2][1]的载体，其中所述AB5毒素B亚基为霍乱毒素B(CTB)；

[3][1]或[2]的载体，其中所述重组蛋白是具有120个或更少氨基酸的肽；

[4][3]的载体，其中所述重组蛋白是具有50个或更少氨基酸的肽；

[5][1]至[4]中任一项的载体，其中所述重组载体是神经肽或内分泌肽；

[6][1]至[5]中任一项的载体，其中所述重组蛋白是具有低溶解性的蛋白；

[7][1]至[6]中任一项的载体，其中所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；

[8]药物组合物，包含[1]至[7]任一项的载体和药学上可接受的担载体；

[9]引入了[1]至[7]中任一项的载体的细胞；

[10]产生重组蛋白的方法，包括表达[1]至[7]中任一项的载体的步骤；

[11]产生表达重组蛋白的能力增强的RNA病毒载体的方法，所述方法包括产生编码融合蛋白的RNA病毒载体的步骤，所述融合蛋白中重组蛋白与AB5毒素B亚基融合；

[12][11]的方法，其中所述AB5毒素B亚基是霍乱毒素B(CTB)；

[13][11]或[12]的方法，其中所述重组蛋白是120个或更少氨基酸的肽；

[14][13]的方法，其中所述重组蛋白是50个或更少氨基酸的肽；

[15][11]至[14]中任一项的方法，其中所述重组蛋白是神经肽或内分泌肽；

[16][11]至[15]中任一项的方法，其中所述重组蛋白是低溶解性蛋白；

[17][11]至[16]中任一项的方法，其中所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；

[18]增加重组蛋白从RNA病毒载体的表达水平的方法，包括将重组蛋白作为与AB5毒素B亚基的融合蛋白从RNA病毒载体表达的步骤；

[19][18]的方法，其中所述AB5毒素B亚基为霍乱毒素B(CTB)；

[20][18]或[19]的方法，其中所述重组蛋白是120个或更少氨基酸的肽；

[21][20]的方法，其中所述重组蛋白是50个或更少氨基酸的肽；

[22][18]至[21]任一项的方法，其中所述重组蛋白是神经肽或内分泌肽；

[23][18]至[22]任一项的方法，其中所述重组蛋白是低溶解性蛋白；

[24][18]至[23]任一项的方法，其中所述RNA病毒载体是负链RNA病毒载体；

[25]包含[1]至[7]任一项的载体的病毒样颗粒；等。

而且，将在上述各项中的引用同一项的各项所述的发明2个或2个以上任意组合而得到的发明，在它们所引用的上位项所述的发明中已经意图。此外，本说明书中记载的任意发明要素、技术要素及其任意组合，均是本说明书所意图的。此外，在这些发明中，除本说明书所述的任意要素或其任意组合以外的发明，也是本说明书所意图的。此外，对本说明书而言，在说明书中以优选的形式记载了某特定实施方式的情况下，不仅公开了其本身，还公开了本说明书中公开的包含该实施方式的更上位的发明中的、除该实施方式以外的发明。

发明的效果

本发明使得增加重组蛋白从RNA病毒载体的表达水平成为可能。在重组蛋白中，特别是仅以低水平从RNA病毒载体表达的肽，如短肽蛋白和低溶解性蛋白，可通过使用本发明从所述RNA病毒载体以增加的表达水平有效地表达。此外，本发明的RNA病毒载体能够用作基因转移载体来实现有效的基因治疗、基因接种、单克隆抗体制备等等。

附图说明

[图1]显示SeV cDNA(pSeV18+CTB-mCRF/ΔF、pSeV18+CTB-mET1/ΔF、pSeV18+CTB-mPYY/ΔF、pSeV18+CTB-mGLP2/ΔF、pSeV18+mCRF/ΔF、pSeV18+mET1/ΔF、pSeV18+mPYY/ΔF和pSeV18+mGLP2/ΔF)结构的概略图。将CTB-mCRF、CTB-mET1、CTB-mPYY、CTB-mGLP2、mCRF、mET1、mPYY、mGLP2基因中的每一个从pCI的NotI位点切出，然后插入pSeV18+NotI/ΔF的NotI位点。

[图2]Aβ42NotI片段的结构的示意图。

[图3]Aβ42NotI片段构建的示意图。

[图4]CTB-Aβ42NotI片段结构的示意图。

[图5]显示CTB-mCRF和mCRF在BHK21细胞的细胞裂解物和培养上清中表达量的图。

[图6]显示CTB-mET1和mET1在BHK21细胞的细胞裂解物和培养上清中表达量的图。

[图7]显示CTB-mPYY和mPYY在BHK21细胞的细胞裂解物和培养上清中表达量的图。

[图8]显示CTB-mGLP-2和mGLP-2在BHK21细胞的细胞裂解物和培养上清中表达量的图。

[图9]显示BHK21细胞的细胞裂解物和培养上清中Aβ42、IL-4-Aβ42、PEDI-Aβ42、CTB-Aβ42的表达量的图。

[图10]CTB-Aβ15NotI片段构建的示意图。

[图11]CTB-Aβ15x2，CTB-Aβ15x4，CTB-Aβ15x8NotI片段构建的示意图。

[图12]显示携带CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或CTB-Aβ15x8基因的SeV载体感染的BHK细胞的细胞裂解物和培养上清中的Aβ抗原量的Western印迹照片。

[图13]显示携带CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8基因的SeV载体感染的BHK细胞的细胞裂解物和培养上清中的针对GM1的结合活性的图。

[图14]显示肌肉内施用携带CTB-Aβ42、CTB-Aβ15x8、或GFP基因的SeV载体的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图15]显示肌肉内、皮内、或鼻内施用携带CTB-Aβ15x8基因的SeV载体的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图16]显示鼻内施用携带CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或CTB-Aβ15x8基因的SeV载体的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图17]显示肌肉内施用携带CTB-Aβ42基因的SeV载体、并用从大肠杆菌中纯化的CTB-Aβ42蛋白进行了加强免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图18]显示肌肉内施用携带CTB-Aβ15x8基因的SeV载体、并用同一SeV载体进行了加强免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图19]显示肌肉内施用了携带CTB-Aβ42或CTB-Aβ15x8基因的SeV载体、并用同一SeV载体进行了加强免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。小图B中仅显示了小图A中的携带CTB-Aβ42基因的SeV载体的结果。

[图20]显示鼻内施用了携带CTB-Aβ15x8基因的SeV载体，并用同一SeV载体进行了加强免疫的C57BL/6N小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图21]显示肌肉内施用携带CTB-Aβ15x8、CTB-Aβ42或GFP基因的SeV载体，并用CTB-Aβ42蛋白进行了加强免疫的Tg2576小鼠的抗Aβ抗体效价的图。

[图22]显示肌肉内施用携带CTB-Aβ15x8、CTB-Aβ42或GFP基因的SeV载体，并用CTB-Aβ42蛋白进行了加强免疫的Tg2576小鼠的脑内Aβ量的图。

[图23]显示脑组织病理标本上的6E10免疫染色阳性区域的分布的照片对于对照的SeV18+GFP/ΔF组(A)，在嗅球、海马、和大脑新皮质散在性地确认了数量众多的6E10染色阳性的Aβ沉积(棕色)，与此相对，对于SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF施用组(B)，Aβ沉积数明显较少。

[图24]6E10免疫染色标本的图像解析图表。与对照的SeV18+GFP/ΔF组(左栏)相比，在SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF施用组(右栏)中，在脑的各部位中可见明显的面积百分比减少倾向，特别是在海马中差异巨大。

发明的具体实施方式

本发明涉及编码重组蛋白的RNA病毒载体，其中所述重组蛋白作为与AB5毒素B亚基(AB5B)蛋白的融合蛋白被编码，还涉及产生所述载体的方法，包含此类载体的组合物，使用所述载体提高重组蛋白表达水平的方法等。本发明人揭示了目标蛋白的表达可通过使用编码AB5B的核酸与RNA病毒载体的组合而显著增强。具体而言，目标蛋白从RNA病毒载体的表达水平可通过将所述蛋白作为AB5B融合蛋白来表达而显著增加。

本发明中，RNA病毒是指具有RNA基因组、且在其生命周期中不具有DNA阶段的病毒。本发明的RNA病毒不具有逆转录酶(即，RNA病毒不包括逆转录病毒)。即，病毒的增殖通过病毒基因组的RNA依赖性RNA聚合酶复制来实现，而不通过DNA介导。RNA病毒包括单链RNA病毒(包含正链RNA病毒和负链RNA病毒)和双链RNA病毒。此外，包括具有包膜的病毒(有包膜病毒；enveloped viruses)和不具有包膜的病毒(无包膜病毒；non-enveloped viruses)，优选使用源自有包膜病毒的载体。本发明中，RNA病毒具体包括属于以下的科的病毒。

包括拉沙病毒等的沙粒病毒科(Arenaviridae)

包括流感病毒等的正粘病毒科(Orthomyxoviridae；包括甲型、乙型、丙型流感病毒和索戈托样病毒等)

包括SARS病毒等的冠状病毒科(Coronaviridae)

包括风疹病毒等的披膜病毒科(Togaviridae)

包括腮腺炎病毒、麻疹病毒、仙台病毒、RS病毒等的副粘病毒科(Paramyxoviridae)

包括小核糖核酸病毒、柯萨奇病毒、艾可病毒等的微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)

包括马尔堡病毒、埃博拉出血热病毒等的纤维病毒科(Filoviridae)

包括黄热病病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒、庚型肝炎病毒等的黄病毒科(Flaviviridae)

布尼亚病毒科(Bunyaviridae；包括布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属和白蛉病毒属等)

包括狂犬病病毒等的弹状病毒科(Rhabdoviridae)

呼肠孤病毒科(Reoviridae)。

本发明中，病毒载体是指具有来源于病毒的基因组核酸，用于表达插入该基因组核酸中的基因的载体(运载体)。此外，本发明的病毒载体还包括感染性病毒粒子、病毒核心、病毒基因组与蛋白质的复合体、以及非感染性病毒粒子(非感染性病毒粒子或病毒样粒子)等复合体，这些复合体具有在导入细胞中后表达其插入的基因的能力。例如，在RNA病毒中，由病毒基因组及与之结合的病毒蛋白质构成的核糖核蛋白(病毒核心)能够在被导入细胞中后在细胞内表达插入基因(WO00/70055)。本发明的病毒载体也包括这样的核糖核蛋白(RNP)。载体对细胞的导入可以使用适当的转染试剂等来进行。

将含有病毒基因组RNA或非感染性病毒颗粒(病毒样颗粒(VLP))的RNP引入细胞的具体方法包括本领域技术人员已知的那些，如利用磷酸钙(Chen，C.&Okayama，H.BioTechniques 6：632-638，1988；Chen，C.和Okayama，H.，Mol.Cell.Biol.7：2745，1987)，DEAE-右旋糖酐(Rosenthal，N.MethodsEnzymol.152：704-709，1987)，多种基于脂质体的转染试剂(Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY))或电穿孔(Ausubel，F.等(1994)In CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，NY)，Vol.1，Ch.5 and 9)的方法。可将氯喹添加至转染物以抑制在内体中的降解(Calos，M.P.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：3015，1983)。转染试剂包括例如DOTMA(Roche)，Superfect Transfection Reagent(QIAGEN，Cat No.301305)，DOTAP，DOPE，DOSPER(Roche #1811169)，TransIT-LT1(Mirus，Product No.MIR 2300)，CalPhosTM Mammalian Transfection Kit(Clontech #K2051-1)和CLONfectinTM(Clontech#8020-1)。已知具包膜的病毒可在病毒粒体形成过程中纳入宿主细胞来源的蛋白，且此类蛋白当引入细胞时可潜在地引起抗原性和细胞毒性(J.Biol.Chem.272：16578-16584，1997)。因此使用不具包膜的RNP是有利的(WO 00/70055)。

本发明优选的RNA病毒载体包括例如负链RNA病毒载体。负链RNA病毒载体是指来源于包含负链(编码病毒蛋白质的反义链)的RNA作为基因组的病毒的病毒载体。负链RNA也称作阴性链RNA。本发明的负链RNA病毒具体包括单链负链RNA病毒(也称非分节型(non-segmented)负链RNA病毒)。“单链阴性链RNA病毒”是指具有单链阴性链[即负链]RNA作为基因组的病毒。作为这样的病毒，包括属于副粘病毒科(Paramyxoviridae；包括副粘病毒属、麻疹病毒属、腮腺炎病毒属和肺病毒属等)、弹状病毒科(Rhabdoviridae；包括水疱病毒属、狂犬病毒属和短暂热病毒属等)、纤丝病毒科(Filoviridae)等科的病毒，其在分类学上属于单分子负链RNA病毒目(Mononegavirales)(Virus第57卷第1期pp29-36、2007；Annu.Rev.Genet.32，123-162，1998；Fields virology fourth edition，Philadelphia，Lippincott-Raven，1305-1340，2001；Microbiol.Immunol.43，613-624，1999；Field Virology，Thirdedition pp.1205-1241，1996)。

本发明中，作为负链RNA病毒载体，特别可以列举出副粘病毒载体。副粘病毒载体是来源于属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒的病毒载体。这样的病毒可以列举出例如属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)病毒的仙台病毒(Sendai virus)。这样的病毒还包括例如新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、麻疹病毒(Measles virus)、呼吸道合胞(RS)病毒(Respiratory syncytial virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、瘟热病毒(distemper virus)、猴副流感病毒(SV5)、人副流感病毒1，2，3型、属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的流感病毒(Influenza virus)、和属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)的水疱性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus)及狂犬病病毒(Rabies virus)等。

可在本发明中使用的病毒还包括例如仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)、尼帕病毒(Nipah)、人副流感病毒-2(HPIV-2)、猴副流感病毒5(SV5)、人副流感病毒-4a(HPIV-4a)、人副流感病毒-4b(HPIV-4b)、腮腺炎病毒(Mumps)和新城疫病毒(NDV)等。更优选地，本发明的病毒包括选自仙台病毒(SeV)、人副流感病毒-1(HPIV-1)、人副流感病毒-3(HPIV-3)、海豹瘟热病毒(PDV)、犬瘟热病毒(CDV)、海豚麻疹病毒(DMV)、小反刍动物瘟疫病毒(PDPR)、麻疹病毒(MV)、牛瘟病毒(RPV)、亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)中的病毒。

本发明中使用的载体包括属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属、腮腺炎病毒属和麻疹病毒属)的病毒或其衍生物，例如属于呼吸道病毒属(genusRespirovirus)(也称副粘病毒属(genus paramyxovirus))的病毒或其衍生物。衍生物包括被遗传修饰或化学修饰的病毒，但这些修饰不损害病毒的基因转移能力。作为可适用于本发明的呼吸道病毒属病毒，包括例如人副流感病毒1型(HPIV-1)、人副流感病毒3型(HPIV-3)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、仙台病毒(也称小鼠副流感病毒1型)和猴副流感病毒10型(SPIV-10)等。

本发明的病毒载体可以来源于天然株、野生型株、突变株、实验室传代株和人工构建株等。此外，本发明的病毒载体可以具有传染性，也可以不具有传染性。这里，传染性是指当病毒载体感染宿主细胞时，在该细胞中复制病毒、产生感染性病毒粒子的能力。病毒载体可以是具有与从自然界分离的病毒相同的结构的病毒载体，也可以是通过基因重组进行人工修饰而得到的病毒载体。例如，这样的病毒载体可以是野生型病毒所具有的某些基因中存在突变、缺损的病毒。此外，还可以使用不完全病毒如DI粒子(J.Virol.68：8413-8417，1994)等。例如，优选使用编码病毒的包膜蛋白质或外壳蛋白质的基因中的至少1个中具有突变或缺损的病毒。这样的病毒载体能够复制其基因组，例如在感染细胞中，但不能形成感染性病毒粒子。这样的复制能力缺损型病毒载体没有将感染扩散的风险，因而安全性高。例如，可以使用缺失编码包膜蛋白质(如F、H、HN、G、M、或M1等)或突刺蛋白质的基因中的至少1个，或2个以上、3个以上或者4个以上的任意组合的负链RNA病毒载体(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。如果基因组RNA编码基因组复制所必需的蛋白质(例如N、P、和L蛋白质)，则基因组能够在感染细胞中扩增。为了制造缺损型病毒，例如可以将病毒基因组中的某些基因缺损，并外源性地对病毒产生细胞供给缺损的基因产物或能够补偿该基因产物的蛋白质(WO00/70055和WO00/70070；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569(2000))。此外，不需完全补偿缺损的病毒蛋白质、而以非感染性病毒粒子(VLP)的形式回收病毒载体的方法也是已知的(WO00/70070)。此外，通过以RNP(例如由N、L、P蛋白质和基因组RNA构成的RNP)的形式回收病毒载体，能够制造载体而无需补偿包膜蛋白质。

此外，在制作包膜病毒来源的病毒载体的情况下，可以制作包膜中包含与病毒本来具有的包膜蛋白质不同的蛋白质的病毒载体。例如，通过在制造病毒时使病毒产生细胞表达希望的外源性包膜蛋白质，能够制造含该外源性包膜蛋白质的病毒。对于这样的蛋白质没有特殊限制，可以使用对哺乳动物细胞赋予感染能力的希望的粘附因子、配体、受体等蛋白质。具体地，可以列举出例如水疱性口腔炎病毒(Vesicular stomatitis virus；VSV)的G蛋白(VSV-G)。VSV-G蛋白可以来源于任意的VSV株，例如可以使用Indiana血清型株(J.Virology 39：519-528(1981))来源的VSV-G蛋白，但不限于此。

本发明的RNA病毒载体以与AB5毒素B亚基的融合蛋白的形式编码重组蛋白。本发明中，AB5毒素是指一种许多病原性细菌共有的毒素，该毒素由1个拷贝的A亚基和5个拷贝的B亚基组成(Merritt E，and Hol W，″AB5toxins″，Curr Opin Struct Biol 5(2)：165-71，1995；Lencer W，and Saslowsky D，″Raft trafficking of AB5subunit bacterial toxins″，Biochim Biophys Acta 1746(3)：314-21，2005)。所述AB5毒素包括例如：空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)的肠毒素(enterotoxin)、霍乱毒素(霍乱弧菌)、不耐热肠毒素(heat-labileenterotoxins)(例如LT和LT-II)(大肠杆菌)、百日咳毒素(pertussis toxin)(百日咳博德特氏菌)、志贺毒素(shiga toxin)(痢疾志贺氏菌)以及其它的肠道出血性细菌产生的志贺样毒素或Vero毒素(verotoxin)。一般认为，这些毒素的毒性由A亚基承担，而B亚基形成五聚体，参与对细胞的粘附。

本发明中特别优选的AB5毒素包括霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素，两者在结构上和功能上均极为类似(Hovey BT等，J Mol Biol.，285(3)：1169-78，1999；Ricci S.等，Infect Immun.68(2)：760-766，2000；Tinker J.K.等，InfectImmun.73(6)：3627-3635，2005)。作为霍乱毒素和大肠杆菌不耐热肠毒素的具体的B亚基，可以列举出包含登录号ZP_01954889.1，ZP_01976878.1，NP_231099.1，P13811.1，ABV01319.1，或P32890，以及SEQ ID NO：68、或者它们的成熟型蛋白质(除去N末端的21个氨基酸的；例如22～124位氨基酸)的蛋白质等。作为编码这样的蛋白质的核苷酸序列，可以列举出包含核苷酸序列NZ_AAWE01000267.1、NC_002505.1、M17874.1、EU113246.1和M17873.1，或者它们的成熟型蛋白质的序列(例如除去最5′端的63个核苷酸而得到的)的序列等。作为本发明优选的AB5毒素B亚基，可以列举出包含如上所述的氨基酸序列或由如上所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列者，或者与上述的氨基酸序列具有高相似性者。

这样的AB5毒素B亚基不仅可以包括天然序列，还可以包括突变。可以使用例如添加、缺失、取代、和/或插入了1个或少数个氨基酸(例如数个、3个以内、5个以内、10个以内、15个以内、或20个以内的氨基酸)而得到的氨基酸序列的B亚基，只要与使用天然型的B亚基的情况相比，不会显著地降低融合蛋白质的表达量。此外，也可以使用N末端和/或C末端具有1个～数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸缺失或添加而得到的多肽、以及具有1个～数个残基(例如2、3、4、5、6、10、15或20个残基)的氨基酸取代而得到的多肽等。可以使用的变体包括例如天然蛋白质的片段、类似物、衍生物以及天然蛋白质与其它多肽(例如含有额外的异源信号肽或抗体片段的多肽)的融合蛋白质。具体地，包含在野生型B亚基的氨基酸序列中取代、缺失、以及/或添加1个或多个氨基酸而得到的序列，且具有与野生型B亚基相当的增加融合重组蛋白表达的活性的多肽，可以作为本发明的AB5毒素B亚基使用。这样的修饰型AB5毒素B亚基的优选保持形成五聚体的活性。在使用野生型蛋白质的片段的情况下，其通常包含野生型多肽(分泌蛋白质的情况下为成熟型的形式)的70％以上、优选80％以上、更优选90％以上(或95％以上)的连续区域。

氨基酸序列的变体例如可以通过在编码天然多肽的DNA中导入突变来制备(Walker and Gaastra，eds.Techniques in Molecular Biology(MacMillanPublishing Company，New York，1983)；Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-492，1985；Kunkel等，Methods Enzymol.154：367-382，1987；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Plainview，N.Y.)，1989；U.S.Pat.No.4,873,192)。关于如何进行氨基酸取代而不影响生物学活性的指导，包括例如Dayhoff等(1978)in Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))。AB5B包括例如大肠杆菌肠毒素LT的R192G突变体(Lemere等，Neurobiol.Aging，23：991-1000，2002；Seabrook等，Neurobiol.Aging，25：1141-1151，2004；Seabrook等，Vaccine，22：4075-7083，2004)。

对于进行修饰的氨基酸的数目没有特殊限制，例如是天然多肽的成熟型的全部氨基酸的30％以内、优选25％以内、更优选20％以内、更优选15％以内、更优选10％以内、5％以内、3％以内或1％以内，例如15个氨基酸以内、优选10个氨基酸以内、更优选8个氨基酸以内、更优选5个氨基酸以内、更优选3个氨基酸以内。在对氨基酸氨基酸进行取代时，通过取代成侧链性质相似的氨基酸可以期待保持蛋白质的活性。这样的取代在本发明中称作保守取代。保守取代包括在同组内的氨基酸之间的取代，例如碱基性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β支链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。此外，保守性取代还可以包括例如，BLOSUM62取代矩阵(S.Henikoffand J.G.Henikoff，Proc.Acad.Natl.Sci.USA 89：10915-10919，1992)中给出正值(例如+1以上、+2以上、+3以上或+4以上)的氨基酸之间的取代。

经修饰的蛋白质与野生型蛋白质的氨基酸序列之间显示高同源性。高同源性的氨基酸序列包括具有例如70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、95％以上或96％以上的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可以使用例如BLASTP程序(Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990)来确定。例如，可以在NCBI(National Center for BiothchnologyInformation)的BLAST的网页上，使用默认参数来进行检索(Altschul S.F.等，Nature Genet.3：266-272，1993；Madden，T.L.等，Meth.Enzymol.266：131-141，1996；Altschul S.F.等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Zhang J.&Madden T.L.，Genome Res.7：649-656，1997)。例如，通过blast2sequences程序(Tatiana A等，FEMS Microbiol Lett.174：247-250，1999)进行2个序列的比较，制作2个序列的比对，可以确定序列的同一性。空位按错配对待。例如，计算天然型蛋白质(分泌后的成熟型的形式)的比对区域内的整个氨基酸序列上的同一性的值。具体地，通过计算出野生型蛋白质(对分泌蛋白质而言为成熟型)的全部氨基酸数中的相同氨基酸数的比例来确定序列同一性。

此外，AB5毒素B亚基包括与编码野生型蛋白质的基因的编码区域的一部分或全部在严格条件下杂交的核酸所编码的、具有与野生型蛋白质相当的活性(增加RNA病毒中表达的活性)的蛋白质。该蛋白质优选形成五聚体。在杂交中，例如，可以从包含野生型蛋白质基因的编码序列或其互补序列的核酸、或作为杂交对象的核酸中的任何一方制备探针。鉴定可以通过检测其是否与其他核酸杂交来实现。严格杂交的条件包括例如在含5xSSC、7％(W/V)SDS、100μg/ml变性鲑鱼精子DNA、5x Denhardt液(1x Denhardt溶液含0.2％聚乙烯基吡咯烷酮、0.2％牛血清白蛋白以及0.2％Ficoll)的溶液中，于50℃、优选60℃、更优选65℃进行杂交，然后在与杂交相同的温度下，于2xSSC中、优选1xSSC中、更优选0.5xSSC中、更优选0.1xSSC中振荡洗涤2小时的条件。

AB5毒素B亚基本来具有的信号肽(典型地是最初的21个氨基酸)可以完整地与重组蛋白质融合。或者也可以将其除去，例如在N末端添加真核细胞来源的蛋白质的信号肽，或者替换原有的信号肽(参照实施例)。具体地，可以使用免疫球蛋白kappa轻链、白细胞介素(IL)-2或组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)等希望的分泌蛋白质的信号序列，但所述信号肽序列不限于此。

此外，融合蛋白质可以还包含标签、接头、和间隔序列。例如，目标重组蛋白与AB5毒素B亚基可以直接连接在一起，也可以通过接头(或间隔序列)连接在一起。对接头/间隔序列的序列没有特殊限制，但所述序列可以由例如1～15个氨基酸、优选1～8个氨基酸、例如2～6个氨基酸、例如约4个氨基酸组成，具体地说，所述序列包括但不限于KK(赖氨酸-赖氨酸)、GP(甘氨酸-脯氨酸)、GPGP(甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-脯氨酸)、GGS(甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)、GGGS、GGGGS、它们的重复、和它们的各种组合。一般而言，目标重组蛋白与AB5B的融合通常使得AB5B位于目标重组蛋白的N末端侧，亦即目标重组蛋白位于AB5B的C末端侧。

待与AB5毒素B亚基融合的重组蛋白并无具体限制；然而，具体而言，其可能能够显著增加难以以充足的水平从RNA病毒载体表达的蛋白的表达。这样的蛋白包括例如短肽链的蛋白。短多肽包括，例如由300个氨基酸或更少，优选250、220、210、200、180、160、140、120、100、90、80、75、70、65、62、60、55、50、45、40、35、30、25或20个氨基酸，或少于这些数目任一的数目的氨基酸(氨基酸数排除AB5毒素B亚基的部分)所组成的肽。待表达的重组蛋白由例如，7个氨基酸或更多，优选8、10或15个氨基酸或更多(例如20个或更多、25个或更多、30个或更多、40个或更多或41个或更多)氨基酸组成。

更具体而言，本发明提供了编码重组蛋白的RNA病毒载体，所述重组蛋白是由例如120个或更少个氨基酸，或50个或更少个氨基酸组成的肽，且作为与AB5毒素B亚基的融合蛋白被编码。本文中“重组蛋白”指与AB5毒素B亚基融合的蛋白。即，AB5毒素B亚基并不包括在重组蛋白的长度中。举例而言，重组蛋白的长度为融合蛋白排除AB5毒素B亚基的部分的长度。

还优选将具有低水溶性的蛋白/肽作为重组蛋白。具体而言，根据本发明可有效地增加由短肽链组成的、具有低溶解性的蛋白从RNA病毒载体的表达。“具有低水溶性的蛋白”意指当在20±5℃每五分钟剧烈涡旋振荡30秒时，在30分钟之内溶解1mg的蛋白所需的水或生理盐水的体积为1mL或更多，优选在30分钟之内溶解1mg的蛋白所需的水或生理盐水的体积为10mL或更多，且更优选100mL或更多。

在本发明中，待与AB5B融合的蛋白具体包括神经肽和内分泌肽。

将重组蛋白作为AB5B融合蛋白表达的本发明的RNA病毒载体的特征在于，它们将重组蛋白从所述RNA病毒载体表达的表达水平增加至相同重组蛋白不经AB5B融合从相同RNA病毒载体单独表达的表达水平的例如1.5倍或更多，优选两倍或更多，2.5倍或更多，3倍或更多，3.5倍或更多，4倍或更多，4.5倍或更多，5倍或更多，6倍或更多，7倍或更多，8倍或更多，9倍或更多，或10倍或更多。宿主细胞可适当地选择，且其包括例如BHK21细胞(ATCC CCL-10)。

本发明为高表达难以从RNA病毒载体实现高表达的蛋白成为可能。目标蛋白包括难以从RNA病毒载体实现高表达的期望蛋白。此类蛋白包括例如具有如下特征的蛋白：将从包含于RNA病毒载体中的编码该蛋白的核酸表达该蛋白的表达水平与使用携带相同的该蛋白的编码核酸作为插入物的表达质粒载体表达该蛋白的表达水平的比值(即，从RNA病毒载体的表达水平/从质粒载体的表达水平)，与用例如编码小鼠IL-4的核酸(SEQ ID NO：81和82)确定的比值进行比较时，相对比例为0.8或更小，优选0.75或更小，0.7或更小，0.65或更小，0.6或更小，0.55或更小，0.5或更小，0.45或更小，0.4或更小，0.35或更小，0.3或更小，0.25或更小或0.2或更小。表达质粒载体包括例如具有CMV启动子的，例如pcDNA^TM3.1(Invitrogen)。将载体在适当的条件下转染(例如，将1μg质粒在24孔板中使用Lipofectamine^TM 2000(Invitrogen))转染。同时，将RNA病毒载体例如以MOI＝3引入相同的宿主细胞。在基因转染之后72小时收获细胞。当目标重组蛋白是分泌蛋白时，测定培养上清中蛋白的浓度。或者，测定表达的蛋白的量相对于细胞中蛋白的总量。针对小鼠IL-4和目标蛋白测定蛋白的浓度或量，并可对这两个值进行比较。

本发明的载体还可以在插入编码与AB5毒素B亚基的融合蛋白的基因的位点以外的任何位点处携带其它外源基因。对于这样的外源基因没有限制，且包括例如用于监测载体的感染的标记基因，或者也可以是调节免疫性细胞因子、激素、受体、抗体，及其片段，或其它基因。

重组RNA病毒载体可以利用公知方法来重构。具体地，载体可以通过下述步骤来制造：(a)在构成包含病毒基因组RNA的RNP的病毒蛋白质的存在下，将以与AB5毒素B亚基的融合蛋白的形式编码重组蛋白的RNA病毒的基因组RNA或编码其互补链的RNA导入细胞或者使其在细胞中转录的步骤；和(b)回收生成的毒或包含该基因组RNA的RNP的步骤。上述“构成RNP的病毒蛋白质”典型地是指与病毒基因组RNA一起形成RNP，并构成核壳的蛋白质。它们是基因组的复制和基因表达所必需的一组蛋白质，对负链RNA病毒而言，它们典型地是N(核壳，又称核蛋白(NP))、P(磷)和L(大)蛋白质。其表记因病毒种类而异，但相应的各组蛋白质是本领域技术人员所公知的(Anjeanette Robert等，Virology 247：1-6(1998))。

病毒载体的产生可以使用希望的哺乳动物细胞、鸟类细胞等，具体地，这样的细胞包括例如：培养细胞，如猴肾来源的LLC-MK₂细胞(ATCCCCL-7)、CV-1细胞(例如ATCC CCL-70)、和仓鼠肾来源的BHK细胞(例如ATCC CCL-10)等、以及人来源细胞等。此外，为了大规模地获得病毒载体，可通过用从上述宿主得到的病毒载体感染鸡胚胎蛋来扩增载体。使用鸡蛋制造病毒载体的方法已经建立起来(Nakanishi，et al.，ed.(1993)，“State-of-the-Art Technology Protocol in Neuroscience Research III，MolecularNeuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。具体来说，将受精卵放入孵化器中，在37-38℃的条件下，培养9-12天，使胎胚成长。将病毒载体接种到尿囊腔中，进一步将鸡蛋培养数日(例如3天)使病毒载体繁殖，回收包含病毒的尿囊液。可用常规方法从尿液中分离、纯化病毒载体(Tashiro，M.，“Virus Experiment Protocol”，Nagai，Ishihama，ed.，Medical View Co.，Ltd.，pp.68-731995)。

粒子形成所必需的病毒蛋白质可以由转录后的病毒基因组RNA表达，也可以从基因组RNA以外的来源反式供给。例如，为了重构负链RNA病毒载体，可以通过将表达N、P和L蛋白的质粒导入细胞等方法来供给N、P和L蛋白质。让转录出的基因组RNA在这些病毒蛋白质的存在下复制，形成感染性病毒粒子。为了在细胞内表达病毒蛋白质和RNA基因组，将在适当的启动子的下游连接编码所述蛋白质或基因组的DNA而得到的载体导入宿主细胞。这样的启动子包括例如CMV启动子(Foecking，M.K，and HofstetterH.Gene 45：101-105，1986)、逆转录病毒LTR(Shinnik，T.M.，Lerner，R.A.&Sutcliffe，Nature，293，543-548，1981)、EF1-α启动子、CAG启动子(Niwa，H.etal.Gene.108：193-199，1991、特开平3-168087(公开未审查的日本专利申请)等。

在制造缺损包膜蛋白质等的基因的缺损型病毒的情况下，可以通过在病毒产生细胞中表达所缺损的蛋白质和/或能够补偿其功能的其它病毒蛋白质等，来补偿所产生的病毒的感染性(WO00/70055、WO00/70070、WO03/025570；Li，H.-O.等，J.Virol.74(14)6564-6569，2000)。例如，也可以使用与病毒载体的基因组来源病毒不同的来源的负链RNA病毒的包膜蛋白质来将病毒进行假型化。作为这样的包膜蛋白质，可以使用例如水泡性口腔炎病毒(Vesicularstomatitis virus；VSV)的G蛋白质(VSV-G)(J.Virology 39：519-528(1981))(Hirata，T.等，2002，J.Virol.Methods，104：125-133；Inoue，M.等，2003，J.Virol.77：6419-6429；Inoue M.等，J Gene Med.2004；6：1069-1081)。要从基因组中缺损的基因包括例如，F、HN、H、G等刺突蛋白质基因、M等包膜衬里蛋白质基因、或它们的任意组合。刺突蛋白质基因的缺失可有效使得负链RNA病毒载体成为非传染性，而M蛋白等包膜衬里蛋白质基因的缺失则可有效地使感染细胞不能形成粒子。例如，优选使用F基因缺陷型负链RNA病毒载体(Li，H.-O.等，J.Virol.74，6564-6569，2000)、M基因缺陷型负链RNA病毒载体(Inoue，M.等，J.Virol.77，6419-6429，2003)等。此外，缺损F、HN(或H)以及M中的至少2个基因的任意组合的载体的安全性更能得到保障。例如，M和F基因双缺失型的载体没有传染性且病毒粒子形成缺陷，同时保持高水平的感染性及基因表达能力。

例如，作为F基因缺失型的重组病毒的制造的一个例子，将表达F基因缺损的负链RNA病毒基因组或其互补链的质粒与表达F蛋白质的表达载体、以及N、P、和L蛋白质的表达载体一起转染宿主细胞。或者，使用F基因已整合入其染色体的宿主细胞，则能够更有效率地制造病毒(WO00/70070)。在这种情况下，优选使用Cre/loxP、FLP/FRT等序列特异性重组酶及其靶标序列，以使得F基因能够被诱导表达(参照WO00/70055、WO00/70070；Hasan，M.K.等，J.General Virology 78：2813-2820，1997)。具体地，例如，将包膜蛋白质基因整合到具有重组酶靶标序列的载体，如Cre/loxP诱导型表达质粒pCALNdlw(Arai，T.等，J.Virology 72，p1115-1121，1998)中。表达的诱导通过例如以MOI 3～5感染腺病毒AxCANCre来进行(Saito等，Nucl.Acids Res.23：3816-3821(1995)；Arai，T.等，J.Virol 72，1115-1121，1998)。

此外，对于本发明的载体而言，载体中包含的任意病毒基因均可以在野生型基因的基础上进行改变，例如为了降低病毒蛋白质的免疫原性、或者为了提高RNA的转录效率或复制效率。具体地，例如在负链RNA病毒载体中，可以考虑对复制因子基因N、P和L中的至少一个进行修饰，来提高转录或复制的功能。此外，作为包膜蛋白质之一的HN蛋白质具有血凝素(hemagglutinin)活性与神经氨酸酶(neuraminidase)活性。例如，减弱血凝素的活性能够提高血液中的病毒的稳定性，而通过对神经氨酸酶的活性进行修饰，则能够调节感染能力。此外，通过对F蛋白质进行改变，能够调节膜融合能力。此外，例如，对可以充当细胞表面抗原分子的F蛋白质或HN蛋白质的抗原呈递表位等进行解析，而该信息可以用来制作这些蛋白质的抗原性减弱的病毒载体。而且，可以在病毒基因中导入温度敏感性突变，以抑制二次释放粒子(或VLP，病毒样粒子)的释放(WO2003/025570)。

病毒蛋白质的突变的具体实例包括SeV P蛋白质的86位的Glu(E86)的突变、SeV P蛋白质的511位的Leu(L511)到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒的P蛋白的同源位点的取代。具体例子包括86位的Lys取代、511位的Phe取代等。此外，对于L蛋白，例子包括SeV L蛋白的1197位的Asn(N1197)和/或1795位的Lys(K1795)到其它氨基酸的取代、或其它负链RNA病毒的L蛋白中的同源位点的取代，具体的例子包括1197位的氨基酸到Ser的取代和1795位的氨基酸到Glu的取代等。P基因和L基因的突变能够显著地提高持续感染性、次级病毒粒子释放的抑制、或细胞毒性的抑制的效果。例如，可以导入下列突变：对M基因，可导入G69E、T116A、和A183S突变，对HN基因，可导入A262T、G264、K461G突变，但可导入的突变不限于此(具体情况参照WO2003/025570)。

负链RNA病毒的制造可以例如利用以下的公知方法来实施(WO97/16539；WO97/16538；WO00/70055；WO00/70070；WO01/18223；WO03/025570；WO2005/071092；WO2006/137517；WO2007/083644；WO2008/007581；Hasan，M.K.等，J.Gen.Virol.78：2813-2820，1997，Kato，A.等，1997，EMBO J.16：578-587；Yu，D.等，Genes Cells 2：457-466，1997；Durbin，A.P.等，Virology 235：323-332，1997；Whelan，S.P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：8388-8392，1995；Schnell.M.J.等，EMBO J.13：4195-4203，1994；Radecke，F.等，EMBO J.14：5773-5784，1995；Lawson，N.D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-4481；Garcin，D.等，EMBO J.14：6087-6094，1995；Kato，A.等，Genes Cells 1：569-579，1996；Baron，M.D.andBarrett，T.，J.Virol.71：1265-1271，1997；Bridgen，A.and Elliott，R.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：15400-15404，1996；Tokusumi，T.等，Virus Res.8633-38，2002；Li，H.-O.等，J.Virol.74：6564-6569)，2000。通过这些方法，可以从DNA重构包括副流感病毒、水疱性口腔炎病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、仙台病毒等在内的负链RNA病毒。

作为制造正(+)链RNA病毒的方法，可以列举出以下的例子。

1)冠状病毒

Enjuanes L，Sola I，Alonso S，Escors D，Zuniga S.

Coronavirus reverse genetics and development of vectors for geneexpression.

Curr Top Microbiol Immunol.287：161-97，2005.综述。

2)披膜病毒

Yamanaka R，Zullo SA，Ramsey J，Onodera M，Tanaka R，Blaese M，Xanthopoulos KG.

Induction of therapeutic antitumor antiangiogenesis by intratumoralinjection of genetically engineered endostatin-producing Semliki Forest virus.

Cancer Gene Ther.2001 Oct；8(10)：796-802.

Datwyler DA，Eppenberger HM，Koller D，Bailey JE，Magyar JP.

Efficient gene delivery into adult cardiomyocytes by recombinant Sindbisvirus.

J Mol Med.1999Dec；77(12)：859-64.

3)微小核糖核酸病毒

Lee SG，Kim DY，Hyun BH，Bae YS.

Novel design architecture for genetic stability of recombinant poliovirus：themanipulation of G/C contents and their distribution patterns increases the geneticstability of inserts in a poliovirus-based RPS-Vax vector system.

J Virol.2002Feb；76(4)：1649-62.

Mueller S，Wimmer E.

Expression of foreign proteins by poliovirus polyprotein fusion：analysis ofgenetic stability reveals rapid deletions and formation of cardioviruslike openreading frames.

J Virol.1998Jan；72(1)：20-31.

4)黄病毒

Yun SI，Kim SY，Rice CM，Lee YM.

Development and application of a reverse genetics system for Japaneseencephalitis virus.

J Virol.2003Jun；77(11)：6450-65.

Arroyo J，Guirakhoo F，Fenner S，Zhang ZX，Monath TP，Chambers TJ.

Molecular basis for attenuation of neurovirulence of a yellow feverVirus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine(ChimeriVax-JE).

J Virol.2001Jan；75(2)：934-42.

5)呼肠病毒

Roner MR，Joklik WK.

Reovirus reverse genetics：Incorporation of the CAT gene into the reovirusgenome.

Proc Natl Acad Sci U S A.2001Jul 3；98(14)：8036-41.Epub 2001 Jun 26.

关于其它的RNA病毒的增殖方法和重组病毒的制造方法，可以参照Experimental Virology，Detailed Discussion，2nd Edition (Ed.Students’Association of The National Institute of Health；Maruzen，1982)。

本发明还涉及产生重组蛋白的方法，其包括从RNA病毒载体表达作为与AB5毒素B亚基的融合蛋白编码的重组蛋白，并收集表达的蛋白。具体而言，将载体引入细胞，并从所述细胞中的载体表达所述融合蛋白。通过收集表达的融合蛋白，可将所述重组蛋白作为融合蛋白获得。若需要，也可以通过将重组蛋白从融合蛋白切割而仅收集重组蛋白。如上所述，AB5B部分可通过在目标蛋白和AB5B之间引入序列特异性的蛋白酶剪切序列如肠激酶识别序列(DDDDK↓)，因子Xa识别序列(IEGR↓)，凝血酶识别序列(LVPR↓GS)或HRV 3C蛋白酶识别序列(LEVLFQ↓GP)而切去。对所述细胞并无限制，只要本发明载体可以引入它们即可。此类细胞包括培养的哺乳动物细胞(来源于小鼠、大鼠、猴和人的细胞)如LLC-MK₂细胞(ATCC CCL-7)，CV-1细胞(例如，ATCC CCL-70)和BHK细胞(或例如，ATCC CCL-10)。或者，可以使用鸡蛋来表达所述蛋白以制备大量的病毒载体(Nakanishi等编(1993)“State-of-the-Art Technology Protocol in Neuroscience Research III，MolecularNeuron Physiology”，Koseisha，Osaka，pp.153-172)。

本发明还涉及包含本发明的载体或引入了所述载体的细胞的组合物。本发明的组合物可用于需要重组蛋白高水平表达(因为其使得所述蛋白能够高效地表达)的任何目的。具体而言，将本发明的组合物用于增强蛋白表达或实现增强的蛋白表达。在本发明的组合物的制造中，载体或细胞视需要可以与药理学可接受的希望的担载体(carrier)或介质(vehicle)组合。“药学上可接受的担载体或介质”包括能够在其中悬浮载体或细胞的希望的溶液，例如磷酸缓冲生理盐水(PBS)、氯化钠溶液、Ringer’s溶液、培养基等。在用鸡蛋增殖载体等情况下，可以包含尿囊液。此外，包含所述载体的组合物可以包含去离子水、5％葡萄糖水溶液等担载体或介质。而且，除此之外还可以含有植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、杀生物剂等。还可以添加防腐剂或其它添加剂。本发明的组合物可用作所需的试剂或药物组合物。

此外，本发明的组合物还可以组合生物聚合物等有机物、羟基磷灰石等无机物作为担载体，具体包括胶原基质、聚乳酸聚合物或共聚物、聚乙二醇聚合物或共聚物及其化学衍生物等。

本发明还提供了编码AB5毒素B亚基用于增强蛋白表达的用途。本发明还提供了用于增强蛋白表达的试剂，其包含AB5毒素B亚基或编码该亚基的核酸。本发明还提供了表达增强剂，其包含AB5毒素B亚基或编码该亚基的核酸。将编码AB5毒素B亚基的核酸与编码目标蛋白的核酸合框连接以获得编码由这两者组成的融合蛋白的核酸。所得的核酸可例如使用RNA病毒载体来表达以与单独表达该蛋白相比显著地增加该蛋白的表达水平。

此外，本发明提供了增加重组蛋白表达水平的方法，其包括将重组蛋白作为与AB5毒素B亚基的融合蛋白表达的步骤。此种AB5毒素B亚基可为例如霍乱毒素B(CTB)。同时，如上所述，所述重组蛋白可为例如，120个氨基酸或更少的肽，或50个氨基酸或更少的肽。所述重组蛋白可为神经肽或内分泌肽。在本文中，“重组蛋白”指与AB5毒素B亚基融合的蛋白。或者，所述重组蛋白可为例如，具有低溶解性的蛋白。所述重组蛋白是从例如RNA病毒载体表达的，优选地，例如，是从负链RNA病毒载体表达的。

本发明还提供了AB5毒素B亚基或其编码核酸用于增加蛋白表达的用途。本发明还涉及用于增加蛋白表达的AB5毒素B亚基及其编码核酸。本发明还涉及用于增强蛋白表达的组合物，其包含所述亚基或其编码核酸。表达水平是否增加可例如通过从相同载体表达不含CTB融合的重组蛋白，并将其与重组蛋白的表达水平相比较来进行测试。

此外，本发明涉及编码重组蛋白与AB5毒素B亚基之间的融合蛋白的RNA病毒的基因组RNA，或其互补链(反基因组RNA)，或编码两者至少任一的DNA，在产生具有增加的重组蛋白表达的RNA病毒载体，引入该载体的细胞，或包含两者之中任一的组合物中的用途。本发明还涉及编码RNA病毒的基因组RNA或其互补链(反基因组RNA)的DNA用于增加所述重组蛋白表达水平的用途，所述RNA病毒编码重组蛋白与AB5毒素B亚基的之间融合蛋白。

此外，本发明涉及实现重组蛋白增强表达的组合物，其包含编码所述重组蛋白作为与AB5毒素B亚基的融合蛋白的RNA病毒载体。本发明还涉及编码所述重组蛋白作为与AB5毒素B亚基的融合蛋白的RNA病毒载体用于增强所述重组蛋白表达中的用途。本发明还提供了用于增强重组蛋白表达的试剂(表达增强剂)，其包含编码所述重组蛋白作为与AB5毒素B亚基的融合蛋白的RNA病毒载体。本发明还提供了编码所述重组蛋白作为与AB5毒素B亚基的融合蛋白的RNA病毒载体在产生表达重组蛋白的能力增强的药剂、试剂和/或药物中的用途。

包含本发明的载体的组合物或包含引入所述载体的细胞的组合物可在体外使用，用于体内给药，或用于通过细胞的离体给药。在通过细胞给药RNA病毒载体时，将其引入适当的培养细胞、从接种目标动物收获的细胞等。为了用所述RNA病毒在体外感染细胞(例如，在试管或培养皿中)，感染在体外(或离体)进行，例如，在期望的生理水溶液如培养基、生理盐水、血液、血浆、血清或体液中进行，其中，感染复数(MOI；平均每个细胞感染性病毒的数量)的范围优选为1至1,000，更优选2至500，再更优选3至300，进一步更优选5至100。

本发明组合物的剂量取决于疾病、患者体重，年龄，性别，以及症状，给药目的，待导入的组合物的剂量形式，给药方法，待引入的基因等而变动；然而，本领域技术人员可确定给药途径。此外，给药剂量可基于待给药的动物类型，给药的位置或频率等进行选择。待施用包含本发明载体的组合物的受试者优选包括哺乳动物(包括人和非人哺乳类)。具体而言，此类哺乳动物包括人，非人灵长类如猴，啮齿类如小鼠和大鼠，兔，山羊，绵羊，猪，牛，犬，猫以及所有其他哺乳动物。

本发明的载体可优选用作病毒样颗粒(VLP)，且还可以以与常规的病毒颗粒相同的方式使用。

实施例

以下，在实施例的语境下对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限制。而且，本文中引用的文献全部并入作为本说明书的一部分。

[实施例1]携带mCRF基因的SeV载体的构建。

使用附有Igκ分泌信号的人Aβ42基因(SEQ ID NO：1)作为模板，通过PCR合成mCRF片段(SEQ ID NO：3)，其中Igκ分泌信号附接于小鼠CRF肽基因(登录号NM 205769)。所用的引物示于SEQ ID NO：4至8。然后，使用CTB-Aβ42NotI片段(实施例10；SEQ ID NO：14)作为模板，进行PCR以合成EcoRV-EIS片段(SEQ ID NO：9)。所用的引物示于SEQ ID NO：10和11。接着，用XhoI和EcoRV消化mCRF片段，并用EcoRV和NotI消化EcoRV-EIS片段。将所得的片段亚克隆入pCI载体(Promega)以构建mCRF基因NotI片段，其附有仙台病毒转录信号(pCI-mCRF)(SEQ ID NO：12)。

将F基因缺陷SeV载体(WO 00/70070)(pSeV18+NotI/ΔF)的cDNA用NotI消化，并将mCRF基因NotI片段(SEQ ID NO：12)插入NotI位点以构建携带所述mCRF基因的F基因缺陷SeV cDNA(pSeV18+mCRF/ΔF)(图1)。

[实施例2]携带mCRF和CTB的融合基因的SeV载体的构建

使用CTB-Aβ42NotI片段(实施例10；SEQ ID NO：14)作为模板，进行PCR以合成CTB-mCRF片段(SEQ ID NO：16)。所用的引物示于SEQ IDNO：3、4、5、17和18。接着，用XhoI和EcoRV消化CTB-mCRF片段，并用XhoI和EcoRV消化上述制备的pCI-mCRF。构建了附有仙台病毒转录信号的CTB-mCRF基因NotI片段(SEQ ID NO：19)。

将F基因缺陷的SeV载体(WO 00/70070)(pSeV18+NotI/ΔF)的cDNA用NotI消化，并将CTB-mCRF基因NotI片段(SEQ ID NO：19)插入NotI位点以构建携带CTB-mCRF基因的F基因缺陷的Sev cDNA(pSeV18+CTB-mCRF/ΔF)(图1)。

[实施例3]携带mET-1基因的SeV载体的构建

使用附有Igκ分泌信号的人Aβ42基因(SEQ ID NO：1)作为模板，通过PCR合成了mET1片段(SEQ ID NO：21)，其中Igκ分泌信号附于小鼠ET1肽基因(登录号NP_034234)。所用的引物示于SEQ ID NO：7、22、23和24。接着，使用CTB-Aβ42NotI片段(SEQ ID NO：14)作为模板，进行PCR以合成EcoRV-PstI-EIS片段(SEQ ID NO：25)。所用的引物示于SEQ ID NO：11和26。接着用XhoI和EcoRV消化mET1片段，并用EcoRV和NotI消化EcoRV-PstI-EIS片段。将所得的片段亚克隆入pCI载体以构建附接有仙台病毒转录信号的mET1基因NotI片段(pCI-mET1)(SEQ ID NO：27)。

将F基因缺陷的SeV载体(WO 00/70070)(pSeV18+NotI/ΔF)的cDNA用NotI消化，并将mET1基因NotI片段(SEQ ID NO：27)插入NotI位点以构建携带mET1基因的F基因缺陷的SeV cDNA(pSeV18+mET1/ΔF)(图1)。

[实施例4]携带mET-1与CTB的融合基因的SeV载体的构建

使用CTB-Aβ42NotI片段(SEQ ID NO：14)作为模板，进行PCR以合成CTB-mET1片段(SEQ ID NO：29)。所用的引物示于SEQ ID NO：17、22、23和30。接着，用XhoI和EcoRV消化CTB-mET1片段，并用XhoI和EcoRV消化上述制备的pCI-mET1。构建了附有仙台病毒转录信号的CTB-mET1基因NotI片段(SEQ ID NO：31)。

用NotI消化F基因缺陷的SeV载体(WO 00/70070)(pSeV18+NotI/ΔF)的DNA，并将CTB-mET1基因NotI片段(SEQ ID NO：31)插入NotI位点以构建携带CTB-mET1基因的F基因缺陷的SeV cDNA(pSeV18+CTB-mET1/ΔF)(图1)。

[实施例5]携带mPYY基因的SeV载体的构建

使用附接有Igκ分泌信号的人Aβ42基因(SEQ ID NO：1)作为模板，通过PCR合成了mET1片段(SEQ ID NO：33)，其中Igκ分泌信号附于小鼠PYY肽基因(登录号NM_145435.1)。所用的引物示于SEQ ID NO：7、34、35、36和37。接着，用XhoI和EcoRV消化mPYY片段，并用EcoRV和NotI消化EcoRV-EIS片段(SEQ ID NO：9)。将所得的片段亚克隆入pCI载体以构建mPYY基因NotI片段，其附接有仙台病毒转录信号(pCI-mET1)(SEQ IDNO：38)。

将F基因缺陷的SeV载体(WO 00/70070)(pSeV18+NotI/ΔF)的cDNA用NotI消化，并将mPYY基因NotI片段(SEQ ID NO：38)插入NotI位点以构建携带mPYY基因的F基因缺陷SeV cDNA(pSeV18+mPYY/ΔF)(图1)。

[实施例6]携带mPYY与CTB的融合基因的SeV载体的构建

使用CTB-Aβ42NotI片段(SEQ ID NO：14)作为模板，进行PCR以合成CTB-mPYY片段(SEQ ID NO：40)。所用的引物示于SEQ ID NO：17、34、35、36和41。接着，用XhoI和EcoRV消化CTB-mPYY片段，并用EcoRV和NotI消化EcoRV-EIS片段(SEQ ID NO：9)。将所得的片段亚克隆入pCI载体以构建CTB-mPYY基因NotI片段，其附接有仙台病毒转录信号(SEQ IDNO：42)。

用NotI消化F基因缺陷的SeV载体(WO 00/70070)(pSeV18+NotI/ΔF)的DNA，并将CTB-mPYY基因NotI片段(SEQ ID NO：42)插入NotI位点以构建携带CTB-mPYY基因的F基因缺陷的SeV cDNA(pSeV18+CTB-mPYY/ΔF)(图1)。

[实施例7]携带mGLP-2基因的SeV载体的构建

使用附接有Igκ分泌信号的人Aβ42基因(SEQ ID NO：1)作为模板，通过PCR合成了mGLP-2片段(SEQ ID NO：44)，其中Igκ分泌信号附接于小鼠GLP-2肽基因(登录号NM_175681.2)。所用的引物示于SEQ ID NO：7、45、46、47和48。接着，用XhoI和EcoRV消化mGLP-2片段，并用EcoRV和NotI消化EcoRV-PstI-EIS片段(SEQ ID NO：25)。将所得的片段亚克隆入pCI载体以构建mGLP-2基因NotI片段，其附着仙台病毒转录信号(pCI-mET1)(SEQ ID NO：49)。

将F基因缺陷的SeV载体(WO 00/70070)(pSeV18+NotI/ΔF)的cDNA用NotI消化，并将mGLP-2基因NotI片段(SEQ ID NO：49)插入NotI位点以构建携带mGLP-2基因的F基因缺陷的SeV cDNA(pSeV18+mGLP-2/ΔF)(图1)。

[实施例8]携带GLP-2与CTB的融合基因的SeV载体的构建

使用CTB-Aβ42NotI片段(SEQ ID NO：14)作为模板，进行PCR以合成CTB-mGLP-2片段(SEQ ID NO：51)。所用的引物示于SEQ ID NO：17、45、46、47和52。接着，用XhoI和EcoRV消化CTB-mGLP-2片段，并用EcoRV和NotI消化EcoRV-PstI-EIS片段(SEQ ID NO：25)。将所得的片段亚克隆入pCI载体以构建CTB-mGLP-2基因NotI片段，其附接有仙台病毒转录信号(SEQ ID NO：53)。

用NotI消化F基因缺陷的SeV载体(WO 00/70070)(pSeV18+NotI/ΔF)的DNA，并将CTB-mGLP-2基因NotI片段(SEQ ID NO：53)插入NotI位点以构建携带CTB-mGLP-2基因的F基因缺陷的SeV cDNA(pSeV18+CTB-mGLP-2/ΔF)(图1)。

[实施例9]携带Aβ42基因的SeV载体的构建

(1)Aβ42基因的Not I片段的构建

利用覆盖人淀粉样蛋白β肽序列(1-42)(SEQ ID NO：55)全长的多个引物进行PCR，组装成Aβ42基因。在考虑人密码子用法的基础上对人Aβ42的核苷酸序列进行了最优化。所得的序列具有这样的结构，其中在N端侧附接有Igκ分泌信号，在C端侧添加有仙台病毒的转录信号(图2，SEQ IDNO：56)。

构建方法如图3所示。首先，将覆盖Igκ信号与Aβ42整个区域的6种长引物F1(SEQ ID NO：58)，F2(SEQ ID NO：59)，R1(SEQ ID NO：60)，R2(SEQID NO：61)，R3(SEQ ID NO：62)，R4(SEQ ID NO：63)混合起来。使用该混合物不加入模板而进行PCR。以所得PCR产物作为模板进行第二轮PCR，使用导入了限制酶EcoRI的识别序列的2个引物F1-1(SEQ ID NO：64)和R4-1(SEQ ID NO：65)。然后，将所得的PCR产物用限制酶EcoRI切割，亚克隆至pCI表达质粒(Promega公司)的EcoRI位点中，通过测序，选择出正确具有正确序列的克隆。

以选择出的质粒作为模板，用添加了NotI识别序列的引物NotI-Aβ-F(SEQ ID NO：66)和添加了仙台病毒转录信号和NotI识别序列的引物NotI-polyA-R(SEQ ID NO：67)进行PCR，所得的PCR产物用限制酶NotI消化，构建了目的Aβ42NotI片段(图2，SEQ ID NO：56)。

(2)携带Aβ42基因的仙台病毒cDNA的构建

将F基因缺失型SeV载体(WO00/70070)的cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用NotI消化，在其NotI位点插入Aβ42NotI片段，构建了携带Aβ42基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+Aβ42/ΔF)。

[实施例10]携带Aβ42与CTB的融合基因(CTB-Aβ42)的SeV载体的构建

(1)CTB-Aβ42基因的NotI片段的构建

CTB-Aβ42的NotI片段具有下述结构：包含分泌信号的霍乱毒素B亚基序列(SEQ ID NO：68)藉由GPGP氨基酸接头连接到人淀粉样蛋白β序列(1-42)的序列的N末端，而仙台病毒的转录信号(图4，SEQ ID NO：69)添加到其C末端。而且，为了增加表达效率，对于CTB和Aβ的碱基序列，按照人的密码子用法进行了核苷酸序列的变更，但氨基酸序列不变。

基因的构建通过使用覆盖基因全长的长引物进行PCR来合成基因全长。具体地，合成了8种覆盖CTB-Aβ区域的全长的长引物：CTB-AβF-1(SEQ IDNO：71)，F-2(SEQ ID NO：72)，F-3(SEQ ID NO：73)，F-4(SEQ ID NO：74)，R-1(SEQ ID NO：75)，R-2(SEQ ID NO：76)，R-3(SEQ ID NO：77)，R-4(SEQ IDNO：78)]。使用这8种引物的混合物进行PCR，从而得到了对应于从N端到Aβ42的片段。为了合成含仙台病毒转录信号的C端侧的片段，以pCI质粒(Promega公司)为模板、用2种引物CTB-AβF1-2(SEQ ID NO：79)和CTB-AβR5-2(SEQ ID NO：80)进行PCR。PCR得到了覆盖CTB-Aβ全长的PCR片段。将该PCR片段通过TA克隆亚克隆至pGEM-T Easy质粒(Promega公司)中，确认核苷酸序列后，扩增质粒，将该质粒用限制酶NotI进行消化，制备了目的CTB-Aβ42NotI片段(SEQ ID NO：69)。

(2)携带CTB-Aβ42基因的仙台病毒cDNA的构建

将F基因缺失型SeV载体(WO00/70070)的cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用NotI消化，在其NotI位点插入CTB-Aβ42NotI片段，构建了携带CTB-Aβ42基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+CTB-Aβ42/ΔF)。

[实施例11]携带Aβ42与IL-4的融合基因的SeV载体的构建

(1)Aβ42与IL-4的融合基因的NotI片段的构建

Aβ42基因与小鼠IL-4的融合采用基于部分重叠的组装PCR方法进行。

利用含有Aβ42EcoRI片段(实施例9：图3)的质粒制备Aβ42基因。同时，通过下列程序将小鼠IL-4基因(SEQ ID NO：81)制备为cDNA。从小鼠(BALB/cA)的脾脏抽提mRNA，使用IL-4特异性引物进行逆转录，用PCR进行扩增，并亚克隆至克隆质粒。将所得的具有小鼠IL-4cDNA作为插入序列的质粒用于构建。

具体地，以小鼠IL-4质粒为模板，用2种引物NotI-IL4-F(SEQ ID NO：83)和引物IL4-R(SEQ ID NO：84)进行PCR。同时，以Aβ42质粒为模板，用引物Aβ42-F(SEQ ID NO：85)和引物NotI-Aβ42-R(SEQ ID NO：86)进行PCR，得到了IL-4与Aβ42的PCR片段。引物IL4-R和Aβ42-F被设计成一部分相互重叠。这样，通过将IL-4与Aβ42的PCR片段混合作为模板，并用引物NotI-IL4-F和引物NotI-Aβ42-R进行PCR，使2个基因融合为一个融合基因。将所得的PCR片段亚克隆至克隆质粒中。确认核苷酸序列后，用限制酶NotI进行切割，从而构建了含有Aβ42与IL-4的融合基因的目的NotI片段(SEQ IDNO：87)。

(2)携带Aβ42基因的仙台病毒cDNA的构建

将F基因缺失型SeV载体(WO00/70070)的cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用NotI消化，在其NotI部位插入上述制作的mIL4-Aβ42NotI片段，构建了携带Aβ42基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+mIL4-Aβ42/ΔF)。

[实施例12]仙台病毒载体的重构与扩增

病毒的重构和扩增按照Li等的报道(Li，H.-O.等，J.Virology 74.6564-6569，2000；WO00/70070)及其改进方法(WO2005/071092)进行。由于使用的载体为F基因缺失型，利用了通过Cre/loxP表达诱导系统表达F蛋白质的F蛋白辅助细胞。该系统利用了pCALNdLw质粒(Arai，T.等，J.Virol.72：1115-1121(1988))，该质粒是设计为通过Cre DNA重组酶诱导表达基因产物。按照Saito等方法(Saito，I.等，Nucl.Acid.Res.23，3816-3821，1995；Arai，T.等，J.Virol.72，1115-1121，1998)，用表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒(AxCANCre)感染该质粒的转化子，来表达插入基因。

采用上述方法，制备了携带CTB-mCRF、CTB-mET1、CTB-mPYY、CTB-mGLP2、mCRF、mET1、mPYY、mGLP2、Aβ42、CTB-Aβ42、或mIL4-Aβ42的各基因的F基因缺失型SeV载体(分别为SeV18+CTB-mCRF/ΔF，SeV18+CTB-mET1/ΔF，SeV18+CTB-mPYY/ΔF，SeV18+CTB-mGLP2/ΔF，SeV18+mCRF/ΔF，SeV18+mET1/ΔF，SeV18+mPYY/ΔF，SeV18+mGLP2/ΔF，SeV18+Aβ42/ΔF，SeV18+CTB-Aβ42/ΔF，SeV18+mIL4-Aβ42/ΔF)。

[实施例13]携带Aβ42与PEDI的融合基因的SeV载体的构建

(1)携带Aβ42-PEDI融合基因的SeV载体cDNA的构建

通过使用下列10种引物PCR扩增了PEDI基因：PEDI-1F (SEQ IDNO：89)、PEDI-2R(SEQ ID NO：90)、PEDI-3F(SEQ ID NO：91)、PEDI-4R(SEQID NO：92)、PEDI-5F(SEQ ID NO：93)、PEDI-6R(SEQ ID NO：94)、PEDI-7F(SEQ ID NO：95)、PEDI-8R(SEQ ID NO：96)、PEDI-9F(SEQ ID NO：97)和PEDI-10R(SEQ ID NO：98)。通过下列程序将PEDI基因和Aβ42融合在一起并插入SeV载体。以携带Aβ42SeV的载体作为模板、使用引物SeVF6(SEQID NO：99)和S-PEDI-C(SEQ ID NO：100)进行PCR得到片段1。以同一模板使用引物PEDI-Ab-N(SEQ ID NO：101)和SEVR280(SEQ ID NO：102)进行PCR得到片段3。以PEDI基因为模板、使用引物PEDI-N(SEQ ID NO：103)和PEDI-C(SEQ ID NO：104)进行PCR得到片段2。使用这些片段作为模板，通过重叠PCR制备PEDI-Aβ42NotI片段(SEQ ID NO：105)。将所得的片段插入pSeV18+/ΔF的NotI位点，制备携带PEDI-Aβ42融合基因的F缺失型SeV载体的cDNA。

(2)携带PEDI-Aβ42的F缺失型SeV载体的重构

如实施例4所述，根据Li等的方法(Li，H.-O.等，J.Virology 74.6564-6569(2000)，WO00/70070)及其改进方法(WO2005/071092)，重构了携带PEDI-Aβ42基因的SeV载体(SeV18+PEDI-Aβ42/ΔF)。

[实施例14]CTB融合对mCRF表达的作用：SeV载体用于CTB-mCRF融合蛋白表达和SeV载体用于mCRF表达的表达能力的比较

(1)将BHK21细胞用SeV18+mCRF/ΔF和SeV18+CTB-mCRF/ΔF感染，以评价mCRF和CTB-mCRF肽的表达水平。将BHK21细胞以1x10⁶个播种于胶原包被的6孔板，用使用无血清培养基(VPSFM)稀释成MOI为10的各SeV载体进行感染。1小时后向板中加入含10％FBS的GMEM。24小时后更换为无血清培养基(VPSFM)，48小时后回收培养上清和细胞，制备了细胞裂解物。未感染的细胞用作对照。

(2)利用ELISA进行定量

使用CRF ELISA试剂盒(Yanaihara Institute Inc.)对CRF进行定量。表达水平的评价通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来进行。

结果如图5所示。结果显示CTB-mCRF的表达水平显著增加，而mCRF表达水平可忽略。

[实施例15]CTB融合对mET-1表达的作用：SeV载体用于CTB-mET-1融合蛋白表达和SeV载体用于mET-1表达的表达能力的比较

(1)将BHK21细胞用SeV18+mET-1/ΔF和SeV18+CTB-mET-1/ΔF感染，以评价mET-1和CTB-mET-1肽的表达水平。将BHK21细胞以1x10⁶个播种于胶原包被的6孔板，用使用无血清培养基(VPSFM)稀释成MOI为10的各SeV载体进行感染。1小时后向板中加入含10％FBS的GMEM。24小时后更换为无血清培养基(VPSFM)，48小时后回收培养上清和细胞，制备了细胞裂解物。未感染的细胞用作对照。

(2)ELISA定量

ET1的定量如下进行：通过在将样品直接固化于96孔板并用1％BSA/TBS-T缓冲液封闭所述板之后，用抗小鼠ET1抗体和过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体进行检测。表达水平的评价通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来进行。

结果如图6所示。CTB-mET-1的表达水平显著增加，而mET-1表达水平可忽略。

[实施例16]CTB融合对mPYY表达的作用：SeV载体用于CTB-mPYY融合蛋白表达和SeV载体用于mPYY表达的表达能力的比较

(1)将BHK21细胞用SeV18+mPYY/ΔF和SeV18+CTB-mPYY/ΔF感染，以评价mPYY和CTB-mPYY肽的表达水平。将BHK21细胞以1x10⁶个播种于胶原包被的6孔板，用使用无血清培养基(VPSFM)稀释成MOI为10的各SeV载体进行感染。1小时后向板中加入含10％FBS的GMEM。24小时后更换为无血清培养基(VPSFM)，48小时后回收培养上清和细胞，制备了细胞裂解物。未感染的细胞用作对照。

(2)利用ELISA进行定量

使用大鼠PYY ELISA试剂盒(Yanaihara Institute Inc.)对mPYY进行定量。表达水平的评价通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来进行。

结果如图7所示。CTB-mPYY的表达水平显著增加，而mPYY的表达水平可忽略。

[实施例17]CTB融合对mGLP-2表达的作用：SeV载体用于CTB-mGLP-2融合蛋白表达和SeV载体用于mGLP-2表达的表达能力的比较

(1)将BHK21细胞用SeV18+mGLP-2/ΔF和SeV18+CTB-mGLP-2/ΔF感染，以评价mGLP-2和CTB-mGLP-2肽的表达水平。将BHK21细胞以1x10⁶个播种于胶原包被的6孔板，用使用无血清培养基(VPSFM)稀释成MOI为10的各SeV载体进行感染。1小时后向板中加入含10％FBS的GMEM，24小时后更换为无血清培养基(VPSFM)，48小时后回收培养上清和细胞，制备了细胞裂解物。未感染的细胞用作对照。

(2)利用ELISA进行定量

使用GLP-2ELISA试剂盒(Yanaihara Institute Inc.)对mGLP-2进行定量。表达水平的评价通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来进行。

结果如图8所示。CTB-mGLP-2的表达水平显著增加，而mGLP-2的表达水平可忽略。

[实施例18]CTB融合、PEDI融合、IL-4融合的效果的比较：用于表达CTB-Aβ42融合蛋白的SeV载体、用于表达PEDI-Aβ42融合蛋白的SeV载体和用于表达IL-4-Aβ42融合蛋白的SeV载体的表达能力的比较

(1)将BHK21细胞用SeV18+Aβ42/ΔF、SeV18+IL-4-Aβ42/ΔF、SeV18+PEDI-Aβ42/ΔF、和SeV18+CTB-Aβ42/ΔF感染，进行了Aβ42抗原水平的评价。将BHK21细胞以1x10⁶个/孔播种于胶原包被的6孔板，用使用无血清培养基(VPSFM)稀释成MOI 10的各SeV载体进行感染。1小时后向板中加入含10％FBS的GMEM，24小时后更换为无血清培养基(VPSFM)，48小时后回收培养上清和细胞，制备了细胞裂解物。

(2)利用ELISA进行定量

Aβ42使用和光纯药工业的人Aβ42 ELISA试剂盒来定量。表达水平的评价通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来进行。

结果如图9所示。Aβ42基本上未表达，而IL-4-Aβ42、PEDI-Aβ42、CTB-Aβ42表达增加。细胞内的表达水平分别是kkAβ42的1395倍、171.5倍、12608倍。

[实施例19]CTB融合对Aβ42表达的效果：单独表达Aβ42的SeV载体和表达CTB-Aβ42融合蛋白的SeV载体的表达能力的比较

将前一天播种的汇合的BHK-21细胞(3x10⁵个细胞/孔播种，12-孔板)用携带单独Aβ42的SeV载体或携带CTB-Aβ42的SeV载体以MOI 10进行感染，然后在VP-SFM培养基(1ml/孔)中以37℃、5％CO₂进行培养。在第4天回收培养上清和细胞裂解物。将培养上清通过丙酮沉淀浓缩10倍，用1xSDS上样缓冲液从其制备样品。细胞裂解物使用150μl/孔的1x SDS上样缓冲液进行了制备。将制备好的培养上清和细胞裂解物于98℃加热10分钟。然后，进行SDS-PAGE(使用15％Wako凝胶)/Western印迹(使用6E10抗体)，并以1、0.5、0.25、0.125ng/泳道的Aβ42肽作为对照进行了蛋白定量。单独携带Aβ42的SeV载体的Aβ的表达量在细胞裂解物中只有4.4ng/孔，在上清中只有7.2x10^-3ng/孔。另一方面，携带Aβ42-CTB融合基因的SeV载体的Aβ表达量在细胞裂解物中是2500ng/孔、在上清中是200ng/孔。即，分别在裂解物中大幅提高至568倍，在上清中大幅提高至27778倍。

[实施例21]携带Aβ15与CTB的融合基因(CTB-Aβ15)、以及Aβ15的串联型与CTB的融合基因(CTB-Aβ15x2，CTB-Aβ15x4，或者CTB-Aβ15x8)的SeV载体的构建

(1)CTB-Aβ15基因NotI片段的构建

CTB-Aβ15基因的NotI片段是以CTB-Aβ42基因为基础构建的(图10)。

以含有CTB-Aβ42基因NotI片段的质粒作为模板，使用添加了EcoRV限制位点的2种引物Aβ15-EcoR-R(SEQ ID NO：107)和Aβ15-EcoR-F(SEQID NO：108)进行反向PCR，将所得的PCR产物用限制酶EcoRV进行切割。然后，通过自连接得到含有CTB-Aβ15片段的质粒。通过将该质粒用限制酶NotI进行切割，得到了目的CTB-Aβ15基因的NotI片段(SEQ ID NO：109)。

(2)CTB-串联型Aβ15基因(CTB-Aβ15x2，CTB-Aβ15x4，或者CTB-Aβ15x8)的NotI片段的制备

CTB-串联Aβ15基因的NotI片段是利用2种基因构建的(图11)。

该方法除去含有CTB-Aβ42的质粒的Aβ42区域，并向质粒中导入限制酶位点。然后通过PCR向该位点中插入添加有限制酶位点的串联Aβ15片段。

具体地，以含有来自CTB-Aβ42的NotI片段(实施例10；SEQ ID NO：69)的质粒作为模板，使用添加有限制酶SmaI位点的2种引物CTB-SmaI-R(SEQID NO：111)和CTB-SmaI-F(SEQ ID NO：112)进行反向PCR，将所得的PCR产物用SmaI进行切割，通过自连接得到了Aβ42缺损的质粒。然后，在该质粒的SmaI位点插入Aβ15串联片段。

串联Aβ15片段是以含有Aβ15的8串联NotI片段(SEQ ID NO：113)的质粒为基础通过下述方法制作的。以该质粒为模板，使用添加限制酶位点的2种引物Aβ15-SmaI-F(SEQ ID NO：115)和Aβ15-EcoRV-R(SEQ ID NO：116)进行PCR，得到Aβ15的重复数不同的PCR产物。对这些产物进行TA克隆。确认核苷酸序列后，用2种限制酶SmaI、EcoRI进行切割，得到平滑末端的串联Aβ15片段。将该片段插入Aβ42缺损质粒的SmaI位点。扩增得到的质粒，并用限制酶NotI进行切割，得到了目的CTB-Aβ15x2NotI片段(SEQ IDNO：117)，CTB-Aβ15x4NotI片段(SEQ ID NO：119)和CTB-Aβ15x8NotI片段(SEQ ID NO：121)。

(3)携带CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4或CTB-Aβ15x8基因仙台病毒cDNA的构建

将F基因缺失型SeV载体(WO00/70070)的cDNA(pSeV18+NotI/ΔF)用NotI消化，并在其NotI位点分别插入CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8片段，构建了携带CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或CTB-Aβ15x8基因的F基因缺失型SeV cDNA(pSeV18+CTB-Aβ15/ΔF、pSeV18+CTB-Aβ15x2/ΔF、pSeV18+CTB-Aβ15x4/ΔF、pSeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF)。

[实施例22]Aβ肽表达能力的比较

(1)Western印迹

通过Western印迹法评价了构建的载体的感染力和表达。

将感染了SeV载体的细胞的匀浆液和培养上清与等量的SDS-PAGE样品缓冲液混合，于98℃加热热变性5分钟。用15％的丙烯酰胺凝胶对混合物进行SDS-PAGE，然后采用半干转印法转印到PVDF膜上。用5％牛乳/TBS-T进行封闭后，将膜与抗Aβ抗体(6E10)温育，然后与作为第二抗体的HRP标记抗小鼠IgG温育。使用化学发光底物SuperSignal West Femto通过CCD照相机进行检测。

结果显示，CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、CTB-Aβ15x8在BHK细胞内被表达并分泌到培养基中。还显示：CTB-Aβ15x8的表达水平高于CTB-Aβ42，CTB-Aβ15x8向培养基中的分泌的量也明显多于CTB-Aβ42(图12)。

(2)GM1-ELISA

使用固定化有神经节苷脂GM1的平板评价了CTB对GM1的结合。

将神经节苷脂GM1(5μg/mL)固定化于96孔板(Nunc，MaxiSorp plate)的各孔，用20％BlockingOne(NACALAI TESQUE)封闭后，向孔中加入感染了SeV载体的细胞的培养上清(20倍～2000000倍稀释)。与HRP标记的抗体6E10温育后，使用TMB生色试剂进行检测。结合量的评价通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来进行。

其结果显示：向培养基中分泌的CTB-Aβ42、CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、和CTB-Aβ15x8均与GM1结合。CTB-Aβ15x8的结合量为CTB-Aβ42的10倍，CTB-Aβ15的结合量为CTB-Aβ15x8的100倍，这提示Aβ15的重复数增加，则对GM1的结合能力降低(图13)。

[实施例23]构建的各种SeV载体在正常小鼠中诱导抗Aβ抗体的能力的评价

(1)正常小鼠(肌肉内施用CTB-Aβ42与CTB-Aβ15x8的比较)

对于C57BL/6N小鼠以各5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了CTB-Aβ42基因、CTB-Aβ15x8基因、或GFP基因的SeV载体，以评价抗体效价。上述处置14天后，从小鼠采集血液，以测定血浆中的抗Aβ抗体水平。将Aβ1-42肽(5μg/mL)固定化于96孔板(Nunc，MaxiSorp plate)的各孔。用20％BlockingOne(NACALAI TESQUE)进行封闭后，加入小鼠血浆(300～300000倍稀释)，与过氧化物酶标记的小鼠IgG抗体反应后，使用TMB生色试剂进行检测。Aβ抗体效价的评价通过使用读板器进行吸光度测定(O.D.450)来进行。使用抗Aβ抗体(6E10)作为标准抗体。

结果显示，在CTB-Aβ42基因施用组(n＝6)和CTB-Aβ15x8基因施用组(n＝6)中抗Aβ抗体效价提高，而作为对照的GFP基因施用组(n＝6)未见抗Aβ抗体效价的提高(图14)。CTB-Aβ15x8基因施用组的抗体效价为CTB-Aβ42基因施用组的12.23倍。

(2)正常小鼠(肌肉内、皮内、鼻内施用)

对于C57BL/6N小鼠，以5x10⁶CIU/只或5x10⁷CIU/只的滴度鼻内、皮内、和肌肉内(右后肢)施用携带了CTB-Aβ15x8基因的SeV载体；作为对照组，以5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了GFP基因的SeV载体，以评价抗体效价。上述处置14天后，从小鼠采集血液，测定抗Aβ抗体的血浆水平。

结果显示，除对照组外，全部的施用组中抗Aβ抗体效价均提高。皮内施用组的抗体效价比其它施用组低。鼻内施用组的抗体效价比同滴度的肌肉内施用组高(图15)。

(3)正常小鼠(鼻内施用)

对于C57BL/6N小鼠，以5x10⁷CIU/只的滴度鼻内施用携带了CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x2、CTB-Aβ15x4、或CTB-Aβ15x8的SeV载体、以及作为对照的携带GFP基因的SeV载体，进行了抗体效价的评价。

结果显示，所有施用组中与对照组相比抗体效价均显著地提高。特别地，与CTB-Aβ15x8施用组相比，在CTB-Aβ15、CTB-Aβ15x4施用组中获得了更高的抗Aβ抗体效价(图16)。

[实施例24]构建的各种SeV载体对正常小鼠中抗Aβ抗体诱导的加强效果的评价

(1)正常小鼠(肌肉内施用)：利用纯化CTB-Aβ42蛋白进行的加强免疫

对于C57BL/6N小鼠，以各5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了CTB-Aβ42基因的SeV载体。14和28天后，分别以20μg/PBS/只、100μg/PBS/只、或100μg/IFA(弗氏不完全佐剂)/只肌肉内施用(右后肢)大肠杆菌生产的CTB-Aβ42蛋白，以评价抗体效价。上述处置后每14天一次从小鼠采集血液，测定血浆中的抗Aβ抗体水平。

其结果显示，在用CTB-Aβ42基因进行免疫、并用CTB-Aβ42蛋白加强免疫的组中抗Aβ抗体的水平显著地提高(图17)。2次加强免疫后的Aβ抗体效价在20μg加强免疫组中为32μg/ml、100μg加强免疫组中为107μg/ml、[100μg+IFA]加强免疫组中为25.9μg/ml。

(2)正常小鼠(肌肉注射)：利用SeV载体进行的加强免疫[1]

对于C57BL/6N小鼠，以5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了CTB-Aβ42基因或CTB-Aβ15x8基因的SeV载体，56天后以相同滴度肌肉内施用(右后肢)相同SeV载体，以评价抗体效价。

上述处置14、28天后，从小鼠采集血液，测定抗Aβ抗体的血浆水平。

其结果显示，在CTB-Aβ15x8基因加强免疫组中抗Aβ抗体效价得到了显著的提高(图18)。同时，在CTB-Aβ42基因加强免疫组中Aβ抗体效价的提高少于上述的CTB-Aβ15x8基因加强免疫组。

(3)正常小鼠(肌肉注射)：利用SeV载体进行加强免疫[2]

对于C57BL/6N小鼠，以5x10⁶CIU/只或5x10⁷CIU/只的滴度肌肉内施用(右后肢)携带了CTB-Aβ15x8基因或CTB-Aβ42基因的SeV载体，56天后以相同滴度肌肉内施用(右后肢)相同SeV载体，以评价抗体效价。

上述处置14和28天后，从小鼠采集血液，测定抗Aβ抗体的血浆水平。

其结果显示，两种载体均产生了加强免疫的效果，尤其是在CTB-Aβ15x8基因加强免疫组中Aβ抗体效价的提高更显著(图19)。

(4)正常小鼠(鼻内施用)：利用SeV载体进行的加强免疫

对于C57BL/6N小鼠，以5x10⁶CIU/只或5x10⁷CIU/只的滴度鼻内施用携带了CTB-Aβ15x8基因的SeV载体，56天后以相同滴度鼻内施用相同SeV载体，以评价抗体效价。

其结果显示，在CTB-Aβ15x8基因加强免疫组中，以3/3的比例得到了显著的Aβ抗体效价的提高(图20)。

[实施例25]利用构建的各种SeV载体进行的在APP模型小鼠中的有效性评价：肌肉注射

(1)抗Aβ抗体效价

对于作为阿尔茨海默病模型小鼠的APP转基因小鼠(Tg2576)(13个月龄)，以5x10⁷CIU/只肌肉内施用(右后肢)SeV18+CTB-Aβ18x5/ΔF(也记作CTB-Aβ15x8)、或SeV18+CTB-Aβ42/ΔF(也记作CTB-Aβ42)、或作为对照的携带了GFP基因的SeV载体(SeV18+GFP/ΔF；以下也记作“GFP”)。14和28天后，对于CTB-Aβ42基因施用组中的一半小鼠肌肉内施用(右后肢)大肠杆菌生产的CTB-Aβ42蛋白。SeV载体施用起14、28、42、56天后，测定了血浆中的抗Aβ抗体效价。

其结果显示，在CTB-Aβ15x8基因施用组中观察到了显著的抗Aβ抗体效价的提高。在CTB-Aβ42基因施用组中，一半的小鼠的抗Aβ抗体效价升高几乎可以忽略。抗Aβ抗体效价的提高也比CTB-Aβ15x8基因施用组小。在CTB-Aβ42蛋白加强免疫组中，加强免疫未增加抗Aβ抗体的效价(图21)。

(2)脑内Aβ水平：ELISA

SeV载体施用开始56天后，从上述APP小鼠取脑组织，通过ELISA测定脑组织左半球中的Aβ水平。将脑组织在TBS中进行超声波匀浆，35,000g离心1小时后，采集上清作为Aβ可溶性级分。将沉淀在10％甲酸中进行超声波匀浆，然后用1M Tris进行中和。采集其作为Aβ不溶性级分。使用和光纯药工业的Aβ42ELISA试剂盒和Aβ40ELISA试剂盒，测定了脑内Aβ的水平。其结果显示，与GFP基因施用组中相比，在CTB-Aβ15x8基因施用组中，不溶性级分中的Aβ水平降低至80％左右。在CTB-Aβ42基因施用组中未见Aβ水平的降低。同时，在CTB-Aβ42蛋白加强免疫组中Aβ水平仅有稍微降低。在CTB-Aβ15x8基因施用组中，与GFP基因施用组相比，可溶性级分中的Aβ水平降低至50％左右。在CTB-Aβ42基因施用组中Aβ水平未降低。在CTB-Aβ42蛋白加强免疫组中，Aβ水平降低至60～70％(图22)。

(3)SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF消除老年斑的效果

将仙台病毒载体肌肉内施用给小鼠。在施用后8周(15个月龄)的时间点上将各组中的小鼠解剖。为了组织病理学检验，将右脑半球浸渍于10％中性缓冲福尔马林液中加以固定，石蜡包埋后，从距离脑正中裂约2mm的位置处的脑组织制备纵剖切片。用70％甲酸进行处理上述组织切片以便检测Aβ蛋白和老年斑。用5％H₂O₂灭活内源性过氧化物酶活性。与抗Aβ抗体(6E10抗体、1000倍稀释)进行反应后，加入过氧化物酶标记的第二抗体，进行DAB生色。此外，使用与显微镜相连接的3CCD照相机获取图像。对每个样品的20-30张图像文件进行合并(图23)，使用图像解析软件NIH image，对于全部样品采用相同的条件测定了嗅球、大脑新皮质和海马各区域中Aβ蓄积部分所占的面积，计算出Aβ蓄积区域在各测定区中所占的比例。此外，对此测定中使用的老年斑的个数进行了比较。如图24所示，其结果显示老年斑面积百分比有减少倾向，特别是在海马中。

(4)施用SeV18+CTB-Aβ15x8/ΔF的安全性评估

如(3)中描述的那样，获得来源于处理组和对照组的施用后8周时(15个月龄)的HE染色和抗Iba-1抗体(小胶质)染色的石蜡切片样品，评估了其中枢神经系统中的炎症细胞浸润和小胶质活化情况。其结果显示，对于对照组和处理组，在脑的任何部位均完全检测不到浸润的炎症细胞。这证实了本发明的载体不引起中枢神经系统中的炎症。

此外，在两组动物的老年斑周围观察到了小胶质的活化，然而，在载体施用组的动物中，存在老年斑数目减少的倾向，与之平行地，也存在小胶质所占面积比率减少的倾向。

工业实用性

本发明使得增加从RNA病毒载体的重组蛋白的表达水平成为可能。可通过使用本发明的基因转移RNA病毒载体来实现有效的基因治疗、基因接种、单克隆抗体制备等。