CN105849270B - 用于病毒疗法的新型流感病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了重组流感病毒载体，其包含编码相应的野生型NS1蛋白的N‑端的至少73个和多达122个氨基酸的截短NS1蛋白的NS基因，其中所述载体在IFN‑敏感肿瘤细胞中复制并且不在正常、非肿瘤细胞中复制，并且表达异源性免疫刺激多肽。本发明还提供了包含所述流感病毒载体的药物组合物、其在治疗癌症患者中的用途以及制备所述流感病毒疫苗的方法。

Description

用于病毒疗法的新型流感病毒载体
本发明提供了新型重组流感病毒载体，其包含编码相应的野生型NS1蛋白的N-端的多达123个氨基酸，特别地多达117个氨基酸的截短NS1蛋白的NS基因，其中所述载体在IFN-敏感肿瘤细胞中高效复制同时在正常、非肿瘤细胞中是减毒的(attenuated)且为复制缺陷的，并且表达异源性免疫刺激多肽。
本发明特别地可用于治疗性癌症疫苗领域并且涉及治疗性疫苗载体，更特别地涉及衍生自基因修饰的甲型流感病毒株的载体。
背景
晚期转移癌大部分无法治愈，因为癌症获取多种不同途径侵占信号传导(signalling)途径以获得生长优势。因此，不太可能出现对单一分子靶标进行药理学攻击会显著影响恶性肿瘤的长期进展的情况(Jones等人，2008,Science 321:1801-1806)。此外，肿瘤细胞由于它们在其微环境的选择压力下演化而变得非常异质(Subarsky,P andHill,RP,2003,Clin Exp Metastasis 20:237-250)。
尽管我们的免疫系统具有快速反应的能力并且具有识别通过肿瘤细胞呈现的抗原性变体的潜能(Cheever等人，2009,Clin Cancer Res 15:5323-5337)，但特别地晚期肿瘤是高度免疫抑制性的。创建免疫抑制环境的能力允许癌症细胞避免被免疫系统发现。它们通过分泌细胞因子和抑制T细胞扩增必需的共刺激分子的表达的其他分子来抑制局部专职抗原呈递细胞的成熟(Strobl,H and Knapp,W.,1999,Microbes Infect 1:1283-1299；Fiorentino,DF et al.,,1991,JImmunol 146:3444-3451)。肿瘤还直接抑制T细胞并且许多肿瘤表达共抑制分子而非共刺激分子。一些肿瘤自身可能不表达抑制分子，但募集诸如T-调节细胞的抑制细胞类型。晚期肿瘤是高度免疫抑制性的事实表明了免疫系统在该背景下的重要性。除了创建免疫抑制环境之外，肿瘤细胞还通过不充足或甚至不呈递肿瘤抗原至效应器T细胞而避开免疫系统(Maeurer,MJ et al.,1996,Clin Cancer Res 2:641-652)。
所有这些性质使癌症成为复杂的疾病并且使癌症的治疗极具挑战性。
病毒具有两个重要的性质以克服肿瘤的异质性和免疫逃逸机制。
首先，病毒可利用与恶性进展期间肿瘤细胞激活相同的途径用于它们自己的生长——导致肿瘤破坏(Bergmann M等人，2001,Cancer Res.,61:8188-93；Muster T等人，2004,Int J Cancer110:15-21；Kim等人，2010,Oncogene 29:3990-3996；Mansour M等人，2011.J.Virol.85:6015-6023)。
其次，病毒能够激活对抗肿瘤的固有和适应性免疫反应(Prestwich,RJ等人，2009,Clin Cancer Res 15:4374-4381；Kim等人，2010；Immunol.Letters,134(1),Nov 30；134(l):47-54,Ramírez等人，2010,Discov Med 10:387-393)。
重要地，病毒的这些固有免疫原性特性可通过将免疫刺激分子诸如细胞因子和肿瘤相关抗原引入至病毒内而进一步增强。
病毒作为“双重机制癌症疗法”——既杀死癌症细胞又诱导抗肿瘤免疫反应——代表治疗癌症最有前景的新策略之一。病毒疗法减小肿瘤体积并且通过激活toll-样受体和表达转基因免疫增强细胞因子而调节免疫抑制环境。免疫增强细胞因子激活并刺激癌症特异性T-细胞，其随后消灭可能抵抗病毒裂解的残留和转移的肿瘤细胞。越来越清楚的是，在肿瘤的其他免疫抑制环境中通过溶瘤病毒触发的固有和适应性免疫反应是这些治疗剂的临床受益的关键部分。调节肿瘤的免疫抑制环境的潜能归因于许多病毒是T-细胞介导的免疫反应的强诱导物的固有能力：体内T-细胞数量维持在动态平衡稳态，除非被感染或淋巴细胞减少所干扰。对大多数病原体的炎症反应起因于通过固有免疫系统细胞如树突状细胞(DC)和自然杀伤(NK)细胞上的受体识别病原体相关分子模式。例如，toll-样受体识别诸如双链RNA的独特的病原体结构，并且toll-样受体连接用信号表示募集和诱导对感染的病原体特异性的T细胞扩增的细胞因子以及趋化因子的产生。与不表达病原体相关分子模式因而不能激活固有免疫系统的肿瘤细胞相反，大多数病毒编码数种有效激活固有免疫的toll-样受体配体。特别地，RNA病毒是固有免疫反应的强诱导剂，因为它们在复制过程中产生双链RNA，其与toll-样受体有效相互作用(Diebold等人，2003,.Nature 424:324-8；Shi,Z等人，2011,J Biol Chem 286:4517-4524；Ahmed,M等人，2009,J Virol 83:2962-2975；Appledorn等人，2011,Clin Vaccine Immunol 18:150-160)。因此，在肿瘤内递送时，仅仅是病毒在肿瘤内的存在就可充当“危险信号”以警告和激活免疫系统(Gallucci andMatzinger,2001,Curr Opin Immunol 13:114-119)。
有报道NS1基因中有删除的流感病毒的溶瘤性质和它们在正常细胞中缺乏复制。然而，突变体局限于干扰素途径中有缺陷的肿瘤细胞(WO2009/007244A2)。WO2009/007244A2中描述的突变体的特征在于完全缺乏功能性RNA-结合位点。
不局限于IFN途径中有缺陷的肿瘤细胞的其他突变体只轻微减毒(WO2004111249A2)。据报道，通过WO2004111249A2中描述的载体的异源基因的有效复制和表达在IFN感受态细胞中不受限制或者对IFN的效应敏感。
然而，WO2004111249A2的载体在正常(IFN感受态)细胞和动物中也有效生长。重要地，与本发明中描述的载体相比，它不具有最佳的条件复制表型。因此，它不满足病毒治疗方法的重要要求。
流感病毒粒子由包含单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋形核衣壳)和内侧衬有基质蛋白(Ml)的外部脂蛋白包膜构成。甲型和乙型流感病毒的分段基因组由八个片段组成，丙型流感由七个片段组成，所述片段是线性、负极性的单链RNA的片段，所述线性、负极性的单链RNA编码十一种多肽(一些甲型流感株十种多肽)，包括RNA-依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核衣壳的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(分别为乙型流感的M1、M2或BM2)；从包含包膜的脂质突出的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)和核输出蛋白(NEP)。乙型流感病毒还编码NB，一种可能具有离子通道活性的膜蛋白，而大多数甲型流感株还编码被认为具有促凋亡性质的第十一蛋白(PB1-F2)。基因组的转录和复制在细胞核中发生并且通过在质膜上出芽发生装配。在混合感染过程中病毒可重配基因。流感病毒通过HA吸附至细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸寡糖。在病毒粒子的内吞之后，HA分子中的构象变化在细胞内体内发生，这促进了膜融合，从而触发病毒脱壳。核衣壳迁移至细胞核，在那里病毒mRNA被转录。病毒mRNA通过独特的机制被转录和加工，其中病毒核酸内切酶从细胞异源性mRNA中切割戴帽5’-端，然后其充当用于通过病毒转录酶从病毒RNA模板转录的引物。转录本(trascript)在距它们的模板末端15至22碱基的位点处终止，其中寡聚(U)序列充当用于添加聚(A)段(tract)的信号。在如此产生的甲型流感病毒的八种病毒RNA分子之中，六种是直接翻译成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白、PB2、PB1和PA的蛋白的单顺反子信使。其他两种转录本经过剪接，各自产生在不同读码框中翻译的两种mRNA以产生Ml、M2、NS1和NEP。在大多数甲型流感病毒中，片段2还编码表达自重叠的读码框的第二蛋白(PB1-F2)。换言之，八种病毒RNA片段编码十一种蛋白：九种结构蛋白和2种非结构(NS1、PB1-F2)蛋白。
对病毒疗法有不断且未满足的需要，所述病毒疗法有效破坏各种肿瘤细胞和肿瘤，但在正常细胞或组织中充分减毒。
发明简述
通过本发明解决上述问题。
本发明提供了不局限于治疗IFN途径中有缺陷的肿瘤细胞的病毒。该病毒不仅保留在IFN-敏感肿瘤细胞中的复制能力，而且在正常细胞中充分减毒并且是复制缺陷的。
除了用于病毒疗法的病毒的共同优势(如通过诱导I型IFN和趋化因子而具有强免疫刺激性质，以及由于它们在抗病毒和细胞凋亡途径中的缺陷产生的针对癌症细胞的病毒特异性)之外，本发明提供的病毒疗法基于具有特征的流感病毒，所述特征允许通过结合以下功能特性充分开发病毒疗法对抗癌症的潜力：
(i)构建在它们的NS1蛋白中具有不同删除的流感病毒。NS1蛋白的长度与减毒水平逆相关。该delNS1病毒特征允许选择NS1蛋白的长度，其与高效的肿瘤破坏有关但仍在宿主中充分减毒以允许病毒的安全应用。特别地，与依赖干扰素途径中有缺陷的肿瘤细胞的其他方法相比，NS突变体被确定其还允许靶向干扰素途径无缺陷的癌症细胞。
(ii)对于流感病毒，存在多种血清学定义的亚型。在本发明中，可通过交换病毒的抗原性表面-糖蛋白获得不同的溶瘤流感病毒亚型。这样的变体的可用性帮助有效重复给药。重要地，不同流感病毒类型(甲型、乙型和丙型流感)的可用性不仅允许避开对载体的B-细胞介导的免疫反应而且还允许避开对载体的T-细胞介导的免疫反应。
本发明的突变体对于抗癌的病毒疗法具有最佳条件复制表型。具体地，尽管在正常细胞中减毒是病毒疗法方法的先决条件，但该突变体不局限于用于对抗在干扰素途径中有缺陷的肿瘤细胞。它具有在干扰素敏感和干扰素抗性的肿瘤细胞中复制的能力。重要地，载体的复制是表达嵌入的细胞因子必需的。诱导肿瘤组织中的细胞因子有益于激活固有和适应性免疫反应并且病毒复制允许它自身以及异源性基因的表达以及允许通过溶解直接破坏癌症细胞。
本发明用于病毒疗法的病毒载体具有在正常细胞中减毒以及具有在IFN-敏感(IFN-感受态)肿瘤细胞中也有效复制和表达外源基因的能力之间的最佳平衡，并且特征在于包含NS1蛋白，其(i)保留功能RNA结合位点(aa 1-73)和(ii)根据野生型序列的氨基酸编号(SEQ ID NO.1)缺乏效应器结构域的必需部分(aa 123-207，特别地117-207)。
因此，本发明提供了重组流感病毒载体，其包含编码相应的野生型NS1蛋白的N-端的多达122个且不大于122个氨基酸，特别地多达117个氨基酸的截短NS1蛋白的NS基因和编码免疫刺激多肽的异源性、非病毒序列，其中所述载体
(i)在IFN-敏感肿瘤细胞中复制并且不在正常、非肿瘤细胞中复制，以及
(ii)表达异源性免疫刺激多肽。
根据本发明的一个具体实施方案，流感病毒为甲型流感病毒。
在本发明的其他实施方案中，所述截短NS1蛋白包含相应的野生型NS1蛋白的N-端的至少73个氨基酸。
在本发明的其他实施方案中，所述流感病毒具有IFN诱导表型。
具体地，流感病毒载体包括包含NS1蛋白的N-端的多达122个氨基酸、优选多达121个氨基酸、优选多达120个氨基酸、优选多达119个氨基酸、优选多达118个氨基酸、优选多达117个氨基酸、优选多达116个氨基酸、优选多达115个氨基酸、优选多达114个氨基酸、优选多达113个氨基酸、优选多达112个氨基酸、优选多达111个氨基酸、优选多达110个氨基酸、优选多达109个氨基酸、优选多达108个氨基酸、优选多达107个氨基酸、优选多达106个氨基酸、优选多达105个氨基酸、优选多达104个氨基酸、优选多达103个氨基酸、优选多达102个氨基酸、优选多达101个氨基酸、优选多达100个氨基酸、优选多达99个氨基酸、优选多达98个氨基酸、优选多达97个氨基酸、优选多达96个氨基酸、优选多达95个氨基酸、优选多达94个氨基酸、优选多达93个氨基酸、优选多达92个氨基酸、优选多达91个氨基酸、优选多达90个氨基酸、优选多达89个氨基酸、优选多达88个氨基酸、优选多达87个氨基酸、优选多达86个氨基酸、优选多达85个氨基酸、优选多达84个氨基酸、优选多达83个氨基酸、优选多达82个氨基酸、优选多达81个氨基酸、优选多达80个氨基酸、优选多达79个氨基酸、优选多达78个氨基酸、优选多达77个氨基酸、优选多达76个氨基酸、优选多达75个氨基酸、优选多达74个氨基酸、优选多达73氨基酸的截短NS1蛋白。
根据本发明的一具体实施方案，流感病毒包含NS1蛋白，该NS1蛋白为100至117个氨基酸、特别地100个至110个氨基酸长度，更特别地它包含NS1蛋白的N-端的106个氨基酸和异源性免疫刺激多肽。在一具体的实施方案中，它为流感病毒delNS106-GM-CSF，因此所述流感病毒NS基因编码NS1蛋白的N-端106个氨基酸和GM-CSF。
根据本发明的实施方案，IFN-敏感肿瘤细胞选自黑素瘤细胞。
根据本发明的实施方案，通过非编码区中的突变进一步修饰流感病毒载体的NS1基因。
根据本发明的实施方案，流感病毒载体包括编码NA和/或HA蛋白的基因的修饰。
根据本发明的其他实施方案，流感病毒包括编码PB1、PB2和/或PA蛋白的聚合酶基因的修饰。
根据本发明的其他实施方案，流感病毒包括编码M和/或NP蛋白的基因的修饰。
根据本发明的其他实施方案，异源性多肽选自肿瘤相关抗原、细胞因子、IL2、IL15、GM-CSF、IL-15、MIP 1α和MIP3α。
本发明还提供了包含根据本发明的流感病毒和生理学可接受的赋形剂的免疫原性制剂。
根据本发明，流感病毒载体可用于制备治疗处理一主体的药物。具体地，它可用于治疗癌症。
本发明还提供了用于制备流感病毒载体的方法，其中在肿瘤细胞的存在下培养所述病毒。
本发明提供了制备本发明的流感病毒的替代方法，其中所述病毒表达细胞因子并且其中通过在肿瘤细胞上传代所述流感病毒获得所述病毒。
本发明还提供了至少两种根据本发明的流感病毒载体的组合，其中所述病毒为不同类型。
本发明的实施方案还包括用于初免加强免疫(prime boost immunization)，特别地用于结合免疫调节分子使用的本发明的流感病毒的组合。
本发明的实施方案还包括本发明的流感病毒的组合，其中免疫调节分子为蛋白，特别地为抗体，更特别地为CTLA-4、PD-1或4-1BB21的拮抗剂。
附图说明
图1：将干扰素拮抗剂NS1在C-端截短至106个氨基酸，从而使病毒在干扰素-感受态细胞中减毒。通过衍生自口蹄疫病毒的2A肽将鼠GM-CSF的开放读码框融合至NS106的C-端。在翻译NS106-2A-mGM-CSF融合蛋白时，自切割2A肽释放mGM-CSF，允许它通过ER-Golgi途径分泌。
图2：将干扰素拮抗剂NS1在C-端截短至106个氨基酸，从而使病毒在干扰素-感受态细胞中减毒。通过衍生自口蹄疫病毒的2A肽将绿色荧光蛋白(GFP)的开放读码框融合至NS106的C-端。在翻译NS106-2A-mGFP融合蛋白时，自切割2A肽释放GFP。
图3：免疫印迹：感染指示病毒的Vero细胞上清液中的mGM-CSF。泳道1：delNS106-2A-GFP；泳道2：delNS106-2A-mGM-CSF；泳道3和4：在大肠杆菌(E.coli)中表达的1ng和5ng重组mGM-CSF。
图4：显示嵌合NS片段的遗传稳定性的传代病毒的RT-PCR分析。在Vero细胞中将从转染获得的嵌合病毒连续传代七次。通过使用与NS片段同源的寡核苷酸从分离自细胞培养基上清液的病毒RNA实施RT-PCR。通过使用各自的嵌合delNS106病毒质粒DNA作为模板纳入PCR对照。1：delNS106-2A-GFP；2：delNS106-2A-GFP RT-阴性对照；3：pHW-delNS106-2A-GFP质粒对照；4：pHW-delNS106-2A-mGM-CSF质粒对照；5：delNS106-2A-mGM-CSF；6：delNS106-2A-mGM-CSF RT-阴性对照。
图5：人黑素瘤细胞和正常人表皮黑素细胞中的病毒生长。在0.1的MOI下使细胞受感染，并通过在Vero细胞上的TCID50检验分析72h之后收获的上清液的感染滴度。
图6：核苷酸序列delNS106-2A-mGM-CSF(SEQ ID NO.2)。
图7：NS106-2A-mGM-CSF的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)。粗体字母表示截短的NS1，带下划线字母表示2A肽且斜体字母表示mGM-CSF。
图8：核苷酸序列delNS106-2A-GFP(SEQ ID NO.4)。
图9：NS106-2A-mGM-CSF的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)。粗体字母表示截短的NS1，带下划线字母表示2A肽且斜体字母表示GFP。
图10：野生型流感病毒PR8NS1的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)。
发明详述
编码包含RNA结合位点的NS1基因的至少前73个氨基酸但不编码包含所谓的效应器结构域的来自氨基酸第123至161位的N-端氨基酸的流感病毒结合对于病毒疗法候选高度理想的表型。尽管缺乏阻断IFN表达的能力，但这些构建体保留了在干扰素感受态肿瘤细胞中复制的能力。因此，在肿瘤组织中诱导IFN的同时病毒复制允许它的基因表达和肿瘤细胞的破坏。出人意料地，尽管该突变体仍在IFN感受态肿瘤细胞中生长，但与在IFN感受态肿瘤细胞中的复制速度相比，它显示出在诸如黑素细胞或任何其他非肿瘤细胞的正常细胞中复制速度降低至少90倍，特别地至少100倍，特别地至少110倍，特别地至少120倍，特别地至少130倍，特别地至少140倍，更特别地至少150倍。
本发明的突变体病毒具有在IFN敏感和IFN感受态肿瘤细胞中充分复制和在正常细胞中减毒或甚至为复制缺陷之间的最佳平衡。这是允许它在患者中使用的重要安全特性。
根据本发明，术语“充分减毒”是指降低IFN-敏感肿瘤细胞和诸如但不限于原代黑素细胞的正常细胞之间至少100倍的生长速度。
根据本发明的实施方案，测定流感病毒的复制-缺陷的方法如下：在黑素细胞感染(输出病毒)后约72小时(60至96小时)在上清液中测定的感染病毒量必须低于在用于感染(输入病毒)所述细胞的接种物中使用的感染病毒的量。作为实例，但不局限于本发明的范围，如果4,7logTCID50的接种物被用于病毒感染并在感染之后在感染的细胞的上清液中获得3,4logTCID50，则清楚表明病毒为复制缺陷型。
由此提供了包含编码相应的野生型NS1蛋白的N-端的多达122个氨基酸、特别地多达117个氨基酸的截短NS1蛋白的分离NS基因和编码异源性免疫刺激蛋白的连续开放读码框的重组流感病毒载体，其中所述载体
(i)在IFN-敏感肿瘤细胞中复制并且在正常细胞中不复制或具有高度降低的复制速度，并且
(ii)表达异源性免疫刺激多肽。
由此提供了允许外源蛋白的稳定高表达的流感病毒。
根据本发明产生的病毒载体特别适用于多种目的，例如在肿瘤微环境中表达转基因的溶瘤病毒载体、诱导对抗病原分子的免疫力的抗原载体和遗传稳定疫苗骨干(backbone)病毒。
术语“分离”是指诸如本发明的载体、质粒或病毒的核酸分子的纯化的体外制备、分离和/或纯化，使得它不与体内物质相连，或者基本上纯化自体外物质。通常通过体外培养和繁殖获得分离的病毒制剂并且其基本上不含其它传染剂。
“重组”病毒是例如使用重组DNA技术体外操作以将改变引入病毒基因组，或者人工生成。
根据本发明，关于IFN-敏感肿瘤细胞的术语“IFN-敏感”定义为与在没有IFNα-2a时的细胞增殖水平相比，在IFNα-2a的存在下细胞增殖减少至少25％。为了测定IFNα-2a-介导的肿瘤细胞系细胞生长的降低，使用5,000I.U./ml IFNα-2a将总共2,500个细胞孵育4天。通过WST-1增殖试验(Muster等人，2004)测定细胞增殖。
如在本发明中使用的，术语“多肽”是指氨基酸的聚合物并且并不是指产物的具体长度；因此，肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义内。该术语也不是指或排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。例如，包括在该定义内的是包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如，非自然氨基酸等)的多肽，自然存在和非自然存在的具有取代的连接键的多肽以及具有本领域已知的其他修饰的多肽。
如本申请中使用的，术语“氨基酸”是指构成蛋白质的自然存在的氨基羧酸之一。本文描述的术语“多肽”是指通过肽键连接的氨基酸残基的聚合物，不论是自然存在的还是合成的。少于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。
“蛋白质”是包含一条或多条多肽链的大分子。蛋白质还可包含诸如糖基团的非肽组分。可通过产生蛋白质的细胞将糖类和其他非肽取代基添加至蛋白质，并且糖类和其他非肽取代基将随细胞类型而改变。蛋白质在本文根据它们的氨基酸主链结构定义；通常，并未规定诸如糖基团的取代基，但仍然可存在。
“衍生自”指定的核酸序列的多肽或氨基酸序列是指具有与在序列中编码的多肽相同的氨基酸序列的多肽，或者其部分，其中所述部分由至少15个氨基酸、优选至少20个氨基酸、更优选至少30个氨基酸、且甚至更优选至少50个氨基酸构成，或者其为使用在序列中编码的多肽可免疫识别的。该术语还包括表达自指定的核酸序列的多肽。通过NS基因序列编码的各异源性多肽的最大长度为600个氨基酸、特别地500个、特别地400个、特别地300个、特别地200个、特别地150、特别地100个氨基酸。
通常，通过抗原与免疫系统的细胞的相互作用产生对抗原的免疫反应。免疫反应可大致分为两类：体液和细胞介导的免疫反应(例如，通常分别以抗体和细胞效应器的保护机制为特征)。这些反应类别被称为Th1-类型反应(细胞介导的反应)和Th2-类型免疫反应(体液反应)。
免疫反应的刺激可产生自免疫系统的细胞或组分对暴露于免疫原的直接或间接反应。可以许多方法检测免疫反应，包括免疫系统的细胞(例如，B细胞、T细胞、树突状细胞、APC、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞等)的激活、增殖或分化；标志物和细胞因子的上调或下调表达；IgA、IgM或IgG滴度的刺激；脾肿大(包括增大的脾细胞结构)；各个器官中的增生和混合细胞浸润物。关于免疫刺激，可进行评估的免疫系统的其他反应、细胞和组分是本领域已知的。
已知细胞因子谱可测定免疫反应中的T细胞调节和效应器功能。在一些实施方案中，可诱导Th1-类型细胞因子，因此，本发明的免疫刺激多肽可促进Th1-类型抗原特异性免疫反应包括细胞毒性T-细胞。然而在其他实施方案中，可诱导Th2-类型细胞因子，从而促进Th2-类型抗原特异性免疫反应。
术语“免疫刺激或免疫刺激性多肽”是指任何免疫原性多肽，其可以是但不限于趋化因子，特别地细胞因子、造血生长因子、肿瘤相关抗原、黑素瘤免疫原等。
术语“细胞因子”或“趋化因子”是指衍生自细胞并且能够影响诸如生长、迁移、杀伤力、分化、分泌等的细胞行为的生物活性分子。
最初衍生自化学引诱物细胞因子的趋化因子实际上包括大于50个成员并且代表在免疫监视和炎性过程期间发挥决定性作用的低分子量(以它们的单体形式6-12kDa)的小、可诱导和分泌的蛋白家族。依赖它们在免疫力和炎症中的功能，可将它们分为两类。通过许多不同的组织细胞以及通过响应细菌毒素和炎性细胞因子如IL-1、TNF和干扰素的迁移的白细胞产生炎性趋化因子。另一方面，在淋巴样组织的限定区域中组成性地表达归巢趋化因子。它们指挥免疫系统内淋巴细胞和树突状细胞的运输和归巢。如通过BCA-1、SDF-1或SLC例示的，在成熟、分化、激活的背景下这些趋化因子控制淋巴细胞的迁移和再循环并且确保它们在次级淋巴样器官中正确归巢。
根据本发明，已经证实生物活性细胞因子或趋化因子或其衍生物或片段可通过本流感病毒载体稳定和高效表达。
根据本发明，蛋白质可选自但不限于IL2、IL15、GM-CSF、MIP 1α、MIP3α或其功能片段或衍生物。
可通过多达20个氨基酸长度的短接头序列将编码异源性多肽的核苷酸序列直接融合至编码截短NS1蛋白的基因的3’末端。所述接头序列可为但不限于病毒2A序列。所述2A肽可来自诸如口蹄疫病毒(FMDV)和马鼻炎A病毒(ERAV)的小核糖核酸病毒家族，和诸如猪捷申病毒-1(teschovirus-1)和昆虫病毒Thosea asigna病毒(TaV)3的其他病毒。取决于起源病毒，2A序列是约20个氨基酸长度的相对短的肽，并且可包含共有基序Asn-Pro-Gly-Pro。
特别地，流感病毒衍生自甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
流感病毒的NS1蛋白是由230个至280个氨基酸构成的多功能蛋白并在感染早期大量合成。它抗衡细胞抗病毒活性并且是毒力因子。通过其羧基末端区域的活性，NS1蛋白能够抑制宿主mRNA的加工机制。
此外，它通过与细胞翻译起始因子直接相互作用而促进病毒mRNA的优先翻译。通过结合至dsRNA和与推定的细胞激酶相互作用，NS1蛋白能够防止干扰素(IFN)可诱导的dsRNA-激活的激酶(PKR)、2’5’-寡腺苷酸合成酶系统和细胞因子转录因子的激活。
NS1的N端部分结合至RIG-I并且抑制IRF-3的下游激活，防止IFN-β的转录诱导。因此，NS1蛋白抑制IFN-α或IFN-β基因的表达，延迟感染的细胞中细胞凋亡的发展并且防止邻近细胞中抗病毒状态的形成。
根据本发明的流感病毒载体的NS1蛋白包括功能RNA结合结构域。位于NS1蛋白的氨基末端(氨基酸1-73)的该结构域的主要功能是结合dsRNA和抑制2’5’寡(A)合成酶/RNA酶L途径(Min J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci,2006,103:7100-7105；Chien等人，Biochemistry,2004,43(7):1950-62)以及细胞质RNA解旋酶、RIG-I、视黄酸-可诱导的蛋白质I的激活(Yoneyama M.等人，Nat.Immunol.,2004,5:730-737)。
在GenBank中可找到甲型流感病毒/波多黎各/8/34(PR8)NS基因片段(例如，GenBank编号AF389122.1GI21693177)。PR8NS1的开放读码框来自核苷酸27至719。在具体的实施方案中，将NS1ORF进一步经密码子优化(而不改变蛋白质序列)以例如，避免重复序列、以增加蛋白质表达和/或以增加NS基因片段的稳定性。密码子优化技术是本领域已知的。
具体地，流感病毒载体包括包含N-端的多达122个氨基酸、优选多达121个氨基酸、120个氨基酸、优选多达119个氨基酸、优选多达118个氨基酸、优选多达117个氨基酸、优选多达116个氨基酸、优选多达115个氨基酸、优选多达114个氨基酸、优选多达113个氨基酸、优选多达112个氨基酸、优选多达111个氨基酸、优选多达110个氨基酸、优选多达109氨基酸、优选多达108个氨基酸、优选多达107个氨基酸、优选多达106个氨基酸、优选多达105个氨基酸、优选多达104个氨基酸、优选多达103个氨基酸、优选多达102个氨基酸、优选多达101个氨基酸、优选多达100个氨基酸、优选多达99个氨基酸、优选多达98个氨基酸、优选多达97个氨基酸、优选多达96个氨基酸、优选多达95个氨基酸、优选多达94个氨基酸、优选多达93个氨基酸、优选多达92个氨基酸、优选多达91个氨基酸、优选多达90个氨基酸、优选多达89个氨基酸、优选多达88个氨基酸、优选多达87个氨基酸、优选多达86个氨基酸、优选多达85个氨基酸、优选多达84个氨基酸、优选多达83个氨基酸、优选多达82个氨基酸、优选多达81个氨基酸、优选多达80个氨基酸、优选多达79个氨基酸、优选多达78个氨基酸、优选多达77个氨基酸、优选多达76个氨基酸、优选多达75个氨基酸、优选多达74个氨基酸、优选多达73氨基酸的截短NS1蛋白。
根据优选的实施方案，流感病毒为de1NS106病毒，因此包含NS1蛋白的N-端的106个氨基酸并且进一步表达异源性多肽，特别地细胞因子或其功能衍生物。根据其他实施方案，本发明的流感病毒载体包含编码106个氨基酸的截短NS1蛋白和异源性免疫刺激多肽的NS基因，其中所述多肽可在相同的读码框内。
本发明还提供了包含编码全长NS1蛋白的N-端的73个至122个氨基酸、特别地95个至117个氨基酸、特别地100个至110个氨基酸、特别地106个氨基酸的截短NS1蛋白的第一核苷酸序列和编码异源性免疫刺激多肽的第二核苷酸序列的质粒或任何其他表达构建体。在其他实施方案中，所述核苷酸序列可构成编码截短NS1蛋白和异源性免疫刺激蛋白的单一开放读码框，任选通过多达100个核苷酸的接头序列分隔。
根据本发明的其他实施方案，删除诸如流感病毒载体的NS1蛋白的PKR相互作用位点的效应器结构域的必需部分(Mok等人，J Virol.,86:12605)。该效应器结构域与细胞蛋白相互作用以抑制mRNA核输出。效应器结构域位于NS1蛋白的C端部分。根据Schultz等人，效应器结构域特别地位于氨基酸残基117至161之间，其他文献将效应器结构域定位于134至161之间。
根据本发明的实施方案，流感基因片段可衍生自相同或不同的流感株，或是流行性毒株或是流行间(interpandemic)毒株。这可产生重配流感病毒，其将实际流行间病毒的表面糖蛋白血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA)的基因与编码来自减毒主要菌株(masterstrain)的其他蛋白质的五个或六个或七个RNA片段(即分别是包含循环菌株的HA、NA和M片段的6/2组合或7/1重配株或5/3重配株)相结合。
甲型流感病毒的实例包括亚型H10N4、H10N5、H10N7、H10N8、H10N9、H1 1N1、H11N13、H1 1N2、H1 1N4、H1 1N6、H1 1N8、H1 1N9、H12N1、H12N4、H12N5、H12N8、H13N2、H13N3、H13N6、H13N7、H14N5、H14N6、H15N8、H15N9、H16N3、H1Nl、H1N2、H1N3、H1N6、H1N9、H2N1、H2N2、H2N3、H2N5、H2N7、H2N8、H2N9、H3N1、H3N2、H3N3、H3N4、H3N5、H3N6、H3N8、H3N9、H4N1、H4N2、H4N3、H4N4、H4N5、H4N6、H4N8、H4N9、H5N1、H5N2、H5N3、H5N4、H5N6、H5N7、H5N8、H5N9、H6N1、H6N2、H6N3、H6N4、H6N5、H6N6、H6N7、H6N8、H6N9、H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N7、H7N8、H7N9、H8N4、H8N5、H9N1、H9N2、H9N3、H9N5、H9N6、H9N7、H9N8和H9N9。特别优选地为H1N1、H1N2、H3N2和H5N1。
HA糖蛋白质可为任何亚型，特别地它为亚型H1和H3。
根据本发明，术语“IFN-诱导表型”是指在含有病毒载体的感染细胞的上清液中可检测到大量的IFN。
肿瘤细胞可为参与肿瘤生长和转移的任何细胞，特别地衍生自或源自实体瘤。特别地，所述细胞可选自黑素瘤细胞，诸如但不限于SK-Mel 28和SK-Mel 1细胞、518A2，结肠癌细胞如例如COCA 2细胞、胶质瘤细胞、肺癌细胞或乳腺癌细胞。
在IFNα-2a的存在下，在细胞生长中，诸如但不限于518A2的“IFN敏感肿瘤细胞”减少至大于50％。在其生长中，诸如但不限于SK-Mel1的“抗干扰素肿瘤细胞”被抑制至低于50％。为了测定细胞生长，在5,000I.U./ml IFNα-2a的存在下将细胞孵育4天并测定细胞增殖。在没有IFN-α-2a的情况下，认为细胞增殖为100％。
具体地，NS1基因的非编码区中的修饰可为但不限于位于5’和3’端的前8个核苷酸，然而不局限于保守区。
流感病毒载体可进一步包含编码NA和/或HA、M或NP蛋白质的基因的修饰、编码PB1、PB2和/或PA蛋白质的聚合酶基因的修饰。具体地，所述修饰导致所述蛋白质内的氨基酸的删除或置换或插入，其可导致如此修饰的蛋白质的功能性、抗原性、二级结构的修饰。
本发明的流感病毒载体可配制为任选包含药学上可接受的添加剂、载运体(carrier)和/或稳定剂的药物制剂。
术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府的管理机构批准的或在美国登记的。
术语“载运体”是指与药物组合物(例如，免疫原性或疫苗制剂)一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载运体，特别地用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯，二醇(glycol)、水、乙醇等。合适的药物载运体的实例在E.W.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)”中描述。应该根据给药方式选择制剂。特殊制剂还可取决于病毒是否是活的或灭活的。
术语佐剂是指增强对抗原的免疫反应的化合物或混合物。术语“稳定剂”是指可增加本发明的病毒的稳定性的任何试剂，例如它可为牛血清白蛋白、糖类、壳聚糖、葡聚糖、PEG等。
给药方法包括但不限于瘤内、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、鼻内、硬膜外或口服途径。
在优选的实施方案中，可能期望通过任何合适的途径将药物引入至肺。还可采用肺部给药，使用例如吸入器或雾化器或使用雾化剂来配制它。
还可使用控释系统如泵递送药物制剂。
或者，提供即用型输注溶液。或者，制剂可配制为粉末，在应用前立即将该粉末在合适的水溶液中溶解。
本发明的流感病毒载体可用于制备用于主体的治疗处理的药物，特别地它可用于病毒疗法，特别地用于肿瘤治疗或癌症的溶瘤治疗。
有效治疗特定病症或疾病状态的本发明的药物组合物的量取决于病症或疾病状态的性质，并且可通过标准临床技术确定。此外，任选地体外试验可用于帮助确定最佳剂量范围。将在制剂中使用的精确剂量还取决于给药途径和疾病或病症的严重性，并且应根据执业医生的判断和每个患者的情况确定。然而，用于给药的合适剂量范围通常为约104-5×108pfu并且可给药一次或根据需要的频率以一定的时间间隔给药多次。可瘤内、鼻内、气管内、肌内或皮下给药包含104-5×108pfu的本发明病毒的本发明药物组合物。可从体外或动物模型试验系统获得的剂量反应曲线推测有效剂量。
术语“癌症的溶瘤治疗”是指使用诸如特别地杀死癌症细胞，而不损害正常细胞的病毒的试剂治疗癌症细胞。
还包括至少两种根据本发明的流感病毒载体的组合，其中所述病毒为不同类型。此外，三种或多种的组合也包括在本发明的实施方案中。
病毒载体的具体组合可为甲型和乙型流感病毒的组合或甲型和丙型流感病毒的组合或乙型和丙型流感病毒的组合。
术语“初免加强免疫”是指给予多次，即至少两次、至少三次、至少四次、至少五次免疫。初免-加强免疫可通过给予相同的流感病毒载体或其组合(同源初免加强)实施，然而，作为替代方案，可以异源初免加强形式给药不同的流感病毒载体或其组合。还可将所述流感病毒载体与免疫调节分子结合，所述免疫调节分子优选地选自但不限于酶、诸如抗体的免疫球蛋白超家族的成员和诸如Fab、Fv或scFv的抗体结构域或片段、细胞因子、疫苗抗原、生长因子和肽或诸如CTLA-4、PD-1或4-1BB21的免疫调节拮抗剂。
为了形成修饰的流感病毒株的重配株和/或表达修饰的流感病毒株，可使用Vero细胞上的反向遗传学系统。该技术已经是本领域熟知的(Pleschka S.等人，1996,J.Virol.,70(6),4188-4192；Neumann and Kawaoka,1999,Adv.Virus Res.,53,265-300；Hoffmann等人，2000,Proc Natl Acad Sci U S A.,97:6108-13)。或者，如由Enami和Enami描述的(J.Virol,2000,74,12,pp.5556-5561)，基于RNP的技术可用于形成重配株。
用于制备流感病毒的方法也包括在本发明的实施方案中，其中所述病毒表达细胞因子，并且其中通过在肿瘤细胞上传代所述流感病毒获得所述病毒。
更具体地，所述方法可通过在肿瘤细胞中传代流感病毒、使用增加的繁殖速度选择流感病毒载体以及分离和测序相应的高生长流感病毒的步骤进行描述。
此外，本发明包括下列项目：
1.重组流感病毒载体，其包含编码相应的野生型NS1蛋白的N-端的至少73个氨基酸和多达122个氨基酸、特别地多达117个氨基酸的截短NS1蛋白的NS基因，其中所述载体
(i)在IFN-敏感肿瘤细胞中复制并且在正常、非肿瘤细胞中是减毒和复制缺陷的，以及
(ii)表达异源性免疫刺激多肽。
2.根据项目1所述的流感病毒，其中所述病毒为甲型流感病毒。
3.根据项目1或2所述的流感病毒，其中所述截短NS1蛋白包含相应的野生型NS1蛋白的N-端的至少73个氨基酸。
4.根据项目1至3中任一项所述的流感病毒，其中所述流感病毒具有IFN诱导表型。
5.根据项目1至4中任一项所述的流感病毒载体，其中所述截短NS1蛋白包含N-端的多达120个氨基酸、优选多达115个氨基酸、优选多达110个氨基酸、优选多达105个氨基酸、优选多达100个氨基酸、优选多达95个氨基酸、优选多达90个氨基酸、优选多达85个氨基酸、优选多达80个氨基酸、优选多达75个氨基酸。
6.根据项目1至5中任一项所述的流感病毒载体，其中所述IFN-敏感肿瘤细胞选自黑素瘤细胞。
7.根据项目1至6中任一项所述的流感病毒载体，其中通过非编码区中的突变进一步修饰所述NS1基因。
8.根据项目1至7中任一项所述的流感病毒载体，其包含编码NA和/或HA蛋白的基因的修饰。
9.根据项目1至8中任一项所述的流感病毒载体，其包含编码PB1、PB2和/或PA蛋白的聚合酶基因的修饰。
10.根据项目1至9中任一项所述的流感病毒载体，其包含编码M和/或NP蛋白的基因的修饰。
11.根据项目1至10中任一项所述的流感病毒载体，其中所述异源性多肽选自肿瘤相关抗原、细胞因子、IL2、IL15、GM-CSF、MIP 1α、MIP3α。
12.药物制剂，其包含根据项目1至10中任一项所述的流感病毒载体。
13.免疫原性制剂，其包含根据项目1至11中任一项所述的流感病毒和生理学可接受的赋形剂。
14.根据项目1至11中任一项所述的流感病毒载体，其用于制备用于治疗处理主体的药物。
15.根据项目1至11中任一项所述的流感病毒载体，其用于抗癌的病毒疗法、肿瘤治疗、溶瘤治疗。
16.用于制备根据项目1至11中任一项所述的流感病毒载体的方法，其中在肿瘤细胞的存在下培养所述病毒。
17.至少两种根据项目1至11中任一项所述的流感病毒载体的组合，其中所述病毒为不同类型。
18.根据项目15或16所述的流感病毒载体与免疫调节分子的组合。
19.根据项目18所述的组合，其中所述免疫调节分子为蛋白质。
20.根据项目19所述的组合，其中所述蛋白质为抗体。
21.根据项目18至20中任一项所述的组合，其中所述免疫调节分子为CTLA-4、PD-1或4-1BB21的拮抗剂。
22.用于初免加强免疫的根据项目17至21中任一项所述的组合。
23.用于制备根据项目1至11中任一项所述流感病毒的方法，其中所述病毒表达细胞因子并且其中通过在肿瘤细胞上传代所述流感病毒获得所述病毒。
本文描述的实施例例示本发明并不旨在限制本发明。已根据本发明描述本发明的不同实施方案。在不违背本发明的实质和范围的情况下可对本文描述和例示的技术进行许多修改和改变。因此，应当理解，实施例仅为例示性的并不限制本发明的范围。
实施例
实施例1
细胞和病毒
使人黑素瘤细胞系SK-MEL 28(ATCC,Manassas,VA)和518A2在补充有10％FCS(GibcoBRL)的DMEM(Gibco BRL,Rockville,MD)中生长。在包含10％FCS、0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠和厄尔(Earle’s)BBS的最低必需培养基(MEM,Earle)(Gibco BRL)中培养人黑素瘤细胞系SK-MEL1(ATCC)。在黑素细胞生长培养基(Clonetics Cambrex,EastRutherford,NJ)中使原代黑素细胞细胞系NHEM(SzaboScandic,Vienna,Austria)生长。在无血清AIMV培养基(Gibco BRL)中维持适合在无血清培养基(ATCC)上生长的Vero细胞。野生型流感病毒包含转染的NS wt基因片段并且编码230个氨基酸的野生型NS1蛋白。NS1-106包含具有前106个C-端氨基酸的NS基因片段。delNS1病毒包含NS基因片段的完全删除。为了繁殖病毒，在0.1的感染复数(m.o.i.)下感染Vero细胞并在37℃下在包含5ug/ml胰蛋白酶(Sigma)的AIMV培养基(Gibco BRL)中孵育3天。通过Vero细胞上的噬菌斑试验测定病毒浓度。
病毒复制
使用PBS洗涤细胞并在0.1的m.o.i.下使用野生型病毒和相应的NS1删除突变体感染细胞。在孵育30min后，去除接种物，使用PBS洗涤细胞，使用包含2.5ug/ml胰蛋白酶(Sigma)的无血清AIMV培养基覆盖并在37℃下孵育48hr。测定上清液的Vero细胞上的感染病毒颗粒。为了评价IFN对病毒生长的影响，在37℃下，在不存在或存在5,000I.U./ml IFN-2α的情况下将106个细胞孵育16hr。此后进行病毒感染。在感染后48hr，在上清液中测定病毒滴度。
IFN-感受态、IFN-缺陷肿瘤细胞和正常(非恶性)细胞中NS1-删除突变体的复制
使用不同的NS1删除突变体感染IFN-敏感和IFN抗性的肿瘤细胞系以及诸如黑素细胞的正常细胞，并测定感染的细胞系上清液中的子代病毒滴度。对比不同NS1删除突变体的生长性质。病毒生长与IFN-敏感性良好相关。在大多数IFN-敏感(IFN-感受态)肿瘤细胞系518-A2和SK-MEL28中，delNS1病毒一点儿也不生长。相比之下，野生型和删除突变体NS1-106在这些细胞上高效生长。在被认为是IFN抗性细胞系的SK-MEL1中，delNS1突变体也生长，虽然生长程度低于野生型和其他NS删除突变体。这些结果表明，delNS1复制依赖于IFN抗性而NS1-106的复制并不是这样。
用作治疗剂的条件复制病毒的一个要求是它在非恶性细胞中的受限制生长。重要地，在培养的原代黑素细胞NHEM和原代角质形成细胞(其为正常人皮肤中存在的细胞)中，只有野生型高效复制，而NS删除突变体NS1-106和delNS1并不高效复制。在这些细胞中，使用这些突变体的感染都不导致感染性颗粒释放至上清液中。相比之下，这些细胞系支持野生型病毒的病毒复制。
使用抗原上不同的候选的初免/加强
在B16小鼠黑素瘤模型(Overwijk WW,Restifo NP 2001)中，使用甲型载体将小鼠处理3次，随后使用乙型载体处理3次。属于不同流感病毒类型的载体组合的抗肿瘤活性比使用任何一种单独的载体处理显著更好。
实施例2
描述了表达小鼠GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的甲型流感H1N1NS1删除病毒的产生和表征。将干扰素拮抗剂NS1在C-端截短至106个氨基酸，从而使病毒在干扰素-感受态细胞中减毒。
通过衍生自口蹄疫病毒的2A肽将鼠GM-CSF的开放读码框融合至NS106的C-端(图1)。在翻译NS106-2A-mGM-CSF融合蛋白时，自切割2A肽释放mGM-CSF，允许通过内质网-高尔基体(ER-Golgi)途径分泌。或者，将绿色荧光蛋白(GFP)的ORF插入delNS106片段(图2)。
通过Vero细胞的八质粒转染产生delNS106-2A-mGM-CSF病毒和delNS106-2A-GFP病毒。
如通过RT-PCR和测序评估的，嵌合delNS106片段被证明在Vero细胞中的七次连续病毒传代期间是遗传稳定的。
通过ELISA(111+/-14ng/ml)和免疫印迹法证实mGM-CSF大量分泌至感染的delNS106-2A-mGM-CSF病毒Vero细胞的上清液中。类似地，观察到使用delNS106-2A-GFP病毒感染的Vero细胞的强GFP表达。
如通过组织培养感染剂量50(TCID50)测定法评价的，两种病毒在Vero细胞中生长至高滴度(对于delNS106-2A-mGM-CSF为7,9+/-0,3log10/ml及对于delNS106-2A-GFP为8,6+/-0,2log10/ml)。
综上所述，产生了遗传稳定的甲型流感H1N1NS1删除病毒，其表达大量的鼠GM-CSF和GFP并且在Vero细胞中生长至高滴度。
细胞培养
在37℃和5％CO2下，在无血清条件下，使Vero细胞在补充有2mM GlutaMax I(LifeTechnologies)的OptiPro SFM(Life Technologies)中生长。为了繁殖病毒，将5μg/ml猪胰蛋白酶(Sigma Aldrich)和250ng/ml两性霉素B(Sigma Aldrich)添加至培养基(Roethl等人,2011,Antimycotic-antibiotic amphotericin B promotes influenza virusreplication in cell culture(在细胞培养中抗霉菌-抗生素两性霉素B促进流感病毒复制).J Virol 85,11139-11145)。
病毒产生和繁殖
如前所述，通过Vero细胞的八-质粒转染拯救delNS106-2A-mGM-CSF和delNS106-2A-GFP病毒(Hoffmann等人，2000，A DNA transfection system for generation ofinfluenza A virus from eight plasmids(用于从八质粒产生甲型流感病毒的DNA转染系统).Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 97(美国国家科学院院刊)97,6108-6113；Romanova等人，2009,Preclinicalevaluation of a replication-deficient intranasal DeltaNS1H5N1influenzavaccine(复制缺陷型鼻内δNS1H5N1流感疫苗的临床前评价).PloS one 4,e5984；Wacheck等人，2010，A novel type of influenza vaccine:safety and immunogenicity ofreplication-deficient influenza virus created by deletion of the interferonantagonist NS1(新类型的流感疫苗：通过干扰素拮抗剂NS 1删除产生的复制缺陷型流感病毒的安全性和免疫原性).The Journal of infectious diseases 201,354-362)。病毒片段衍生自IVR-116疫苗株(WHO)。它们源自A/Puerto Rico/8/34(甲型/波多黎各/8/34)(PA、PB2、NP、M和NS)、A/Texas/1/77(甲型/德克萨斯/1/77)(PB1)和A/New Caledonia/20/99(甲型/新喀里多尼亚/20/99)H1N1(HA，NA)。通过基因合成(Geneart)获得嵌合片段delNS106-2A-mGM-CSF和delNS106-2A-GFP并克隆到pHW2000中。简略地，将Vero细胞用胰蛋白酶处理并再悬浮于Nucleofector溶液中。在添加八种编码相应病毒片段的pHW2000衍生物(Hoffmann等人，2000)之后，根据制造商说明书，使用Nucleofector II装置(Lonza)实施电穿孔。在6-孔板中接种转染的细胞并在37℃和5％CO2下孵育。一旦观察到完整细胞病变效应，就将病毒在-80℃下冷冻直至进一步使用。在6-孔板中实施Vero细胞中的病毒传代。
GM-CSF表达的分析
在约5的感染复数下，在37℃下将Vero细胞在OptiPro培养基中感染3小时。随后，添加胎牛血清达到2,5％v/v的最终浓度以防止GM-CSF降解。
通过ELISA(Ebioscience)根据制造商说明书和免疫印迹法实施GM-CSF的分析，所述免疫印迹法使用多克隆兔抗小鼠-GM-CSF抗体(Abcam)和次级抗兔IgG碱性磷酸酶缀合物。
病毒RNA的RT-PCR分析
使用QIAmp病毒RNA迷你试剂盒(Qiagen)从感染的Vero细胞上清液中分离病毒RNA。使用Superscript III逆转录酶和Uni 12寡核苷酸(5’-AGCAAAAGCAGG-3’，SEQ IDNO.6)将RNA逆转录。作为阴性对照，在不添加逆转录酶的情况下加工RNA样本。使用寡核苷酸NSRTLen(5’-AGCAAAAGCAGGGTGACAAAG-3’，SEQ ID NO.7)和NS834(5’-CTCTTGCTCCACTTCAAGC-3’，SEQ ID NO.8)，用Phusion HF聚合酶(Thermo Scientific)实施PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，使用GeneJet试剂盒(Thermo Scientific)进行凝胶提取，并且在VBC Biotech(Vienna,Austria)自定义测序。下列引物用于测序：NSRTLen、NS834、NSGFP383s：5’-CTTAAACTTGCAGGAGATGTG-3’，SEQ ID NO.9和NSGFP1208as：5’-GATGAGGACTCCAACTGC-3’，SEQ ID NO.10。
病毒滴定
在感染前一天，在以1.5×10E4/孔的密度下接种的Vero细胞中测定50％组织培养感染剂量(TCID50)/ml中的感染病毒滴度。制备十倍病毒稀释液。在三天后，以显微镜检查所述孔并通过确定存在或不存在细胞病变效应将孔评分为感染或非感染。根据Reed和Muench方法(Reed&Muench,1938)计算病毒滴度。
结果和讨论
通过包含每一个病毒片段的八种pHW2000衍生物的电穿孔转染Vero细胞。在转染后已经4天，对于delNS106-2A-mGM-CSF和delNS106-2A-GFP二者都观察到完整的细胞病变效应，表明病毒的高生长潜力。
为了评价mGM-CSF表达，在约5的MOI下使用delNS106-2A-mGM-CSF或delNS106-2A-GFP病毒感染Vero细胞并孵育24h。通过ELISA分析上清液。尽管对于使用delNS106-2A-mGM-CSF病毒感染的细胞检测到111+/-14ng/ml mGM-CSF的浓度，但在使用delNS106-2A-GFP病毒感染的细胞中没有检测到mGM-CSF表达。
为了验证mGM-CSF的正确加工，使用对mGM-CSF特异性的抗体通过免疫印迹法分析上清液。
图3显示免疫印迹：感染指示病毒的Vero细胞上清液中的mGM-CSF。泳道1：delNS106-2A-GFP；泳道2：delNS106-2A-mGM-CSF；泳道3和4：在大肠杆菌中表达的1ng和5ng重组mGM-CSF。
由于糖基化，mGM-CSF迁移为在约15kDa至25kDa的范围中的几条带。相比之下，缺乏聚糖的大肠杆菌-衍生的mGM-CSF迁移为约14kDa的一条带。
类似地，在感染delNS106-2A-GFP病毒的Vero细胞中检测到GFP的强表达。
为了评价嵌合NS片段的遗传稳定性，在Vero细胞中通过七次连续传代繁殖两种病毒。将病毒RNA分离并使用对NS片段具有特异性的寡核苷酸进行RT-PCR。如4所示，两种病毒的NS RT-PCR产物迁移在与它们相应的质粒对照相同的高度，表明嵌合NS片段的遗传稳定性。对于两种病毒，RT阴性对照为阴性的，排除了PCR产物从衍生自转染的残余质粒DNA中扩增的可能性。测序证实两种病毒缺乏嵌合delNS片段中的突变(数据未示出)。
图4显示传代病毒的RT-PCR分析，表明嵌合NS片段的遗传稳定性。在Vero细胞中将从转染获得的嵌合病毒连续传代七次。通过使用与NS片段同源的寡核苷酸，由分离自细胞培养基上清液的病毒RNA进行RT-PCR。通过使用相应的嵌合delNS106病毒质粒DNA作为模板纳入PCR对照。1：delNS106-2A-GFP；2：delNS106-2A-GFP RT-阴性对照；3：pHW-delNS106-2A-GFP质粒对照；4：pHW-delNS106-2A-mGM-CSF质粒对照；5：delNS106-2A-mGM-CSF；6：delNS106-2A-mGM-CSF RT-阴性对照。
重要地，两种病毒都能够生长至高滴度。通过TCID50试验分析从传代7获得的上清液。对于delNS106-2A-mGM-CSF，检测到7,9+/-0,3log10TCID50/ml且对于delNS106-2A-GFP，检测到8,6+/-0,2log10TCID50/ml。
实施例3
细胞
在37℃和5％CO2下，在补充有10％FCS(Invitrogen)和2mM GlutaMax I补充物(Invitrogen)的DMEM/F12培养基(Invitrogen)中培养人黑素瘤细胞系SK-MEL 1(ATCC,Manassas,VA)和518A2。
在37℃和5％CO2下，在补充的MBM-4基础培养基(Clonetics)说明书中，根据制造商说明书培养成年正常人表皮黑素细胞(NHEM-Ad；Clonetics)。
在补充有2mM GlutaMax I补充物的无血清OptiPro培养基中维持适合在无血清培养基(ATCC)上生长的Vero细胞。
病毒产生
为了产生病毒，将包含来自Puerto Rico/8/34(波多黎各/8/34)的片段PA、PB2、M和NP、来自A/Texas/1/77(甲型/德克萨斯/1/77)的PB1和来自A/New Caledonia/20/99(甲型/新喀里多尼亚/20/99)H1N1的HA、NA以及编码甲型流感PR8NS1的蛋白质表达质粒(pCAGGS-NS1(SAM)；(Salvatore等人，2002,J Virol.76:1206-12))的七种pHW2000衍生物(Hoffmann等人，2000,Proc Natl Acad Sci U S A.97:6108-13)连同包含delNS106-GFP片段或delNS1片段的pHW2000衍生物一起用于Vero细胞的共转染。在转染之后，为支持病毒复制，在5μg/ml胰蛋白酶的存在下，在无血清培养基(OptiPro；Invitrogen)中培养Vero细胞。在转染之后4天，观察到100％CPE并将拯救的病毒冷冻或在Vero细胞中进一步扩增。
人黑素瘤细胞和正常人黑素细胞中的病毒复制
在感染前一天，在6孔板中接种贴壁518A2细胞。在感染之前，使用PBS将细胞洗涤两次并使用包含2mM GlutaMax I补充物和5μg/ml胰蛋白酶的无血清OptiPro培养基覆盖。
使用PBS将SK-Mel-1悬浮细胞洗涤两次，重悬于包含2mM GlutaMax I补充物和5μg/ml胰蛋白酶的OptiPro培养基中并在6孔板中接种。
在感染之前4天，将NHEM-Ad接种在补充的MBM-4基础培养基中，使用PBS洗涤两次并使用包含2mM GlutaMax I补充物和0,5μg/ml胰蛋白酶的OptiPro培养基覆盖。
使用delNS106-GFP或delNS1病毒，在0,1的感染复数(MOI)下感染细胞并在37℃下孵育72小时。通过TCID50测定法，在Vero细胞中测定上清液的感染病毒颗粒。
在大多数IFN-敏感(IFN-感受态)肿瘤细胞系518-A2中，delNS106-GFP病毒生长至大于4,9log TCID50/ml而delNS1病毒仅达到1,7log TICD50/ml的滴度(图xx)。在干扰素抗性的细胞系SK-Mel-1中，delNS106-GFP病毒生长至6,1log TCID50/ml而delNS1产生4,5logTCID50/ml的滴度。
在正常人表皮黑素细胞中，delNS106-GFP生长至2.8log TCID50/ml的滴度，出人意料地，其比在干扰素-敏感518-A2细胞中低超过两个log TCID50/ml。该结果表明，该病毒具有最佳条件复制表型。由于在黑素细胞中，在感染后，接种物的滴度高于上清液中的滴度，因此认为该病毒是复制缺陷的。DelNS1病毒达到1.6log TCID50/ml，与干扰素-敏感518-A2细胞(1.7log TCID50/ml)中的水平相似，因此认为其没有最佳条件复制表型。
图5：人黑素瘤细胞和正常人表皮黑素细胞中的病毒生长。在0.1的MOI下使细胞受感染，并且通过对Vero细胞的TCID50测定法分析72h之后收获的上清液的感染滴度。
Figure IDA0001031089300000011
Figure IDA0001031089300000021
Figure IDA0001031089300000041
Figure IDA0001031089300000051

Claims (17)

1.重组甲型流感病毒载体，其包含编码截短的NS1蛋白的NS基因，所述截短的NS1蛋白由野生型NS1蛋白的N-端的106个氨基酸组成，其中所述载体
(i)在IFN-敏感肿瘤细胞和IFN-抗性肿瘤细胞中复制并且在正常细胞中减毒，以及
(ii)表达异源性免疫刺激多肽，所述异源性免疫刺激多肽是细胞因子。
2.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其中所述重组甲型流感病毒载体具有IFN诱导表型。
3.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其中所述IFN-敏感肿瘤细胞为黑素瘤细胞。
4.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其中通过非编码区中的突变进一步修饰所述NS1基因。
5.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其包括编码NA和/或HA蛋白的基因的修饰。
6.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其包括编码PB1、PB2和/或PA蛋白的聚合酶基因的修饰。
7.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其包括编码M和/或NP蛋白的基因的修饰。
8.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其中所述细胞因子选自IL2、GM-CSF、IL-15、MIP1α、MIP3α。
9.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其用于制备用于治疗处理主体的药物。
10.根据权利要求1所述的重组甲型流感病毒载体，其用于针对癌症的病毒疗法。
11.药物制剂，其包含权利要求1至10中任一项所述的重组甲型流感病毒载体。
12.免疫原性制剂，其包含权利要求1至10中任一项所述的重组甲型流感病毒载体和生理学可接受的赋形剂。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的重组甲型流感病毒载体与免疫调节分子的组合。
14.根据权利要求13所述的组合，其中所述免疫调节分子为抗体。
15.根据权利要求13所述的组合，其中所述免疫调节分子为CTLA-4、PD-1或4-1BB21的拮抗剂。
16.根据权利要求13所述的组合，其用于初免加强免疫。
17.制备根据权利要求1-10中任一项所述的重组甲型流感病毒载体的方法，其中所述重组甲型流感病毒载体表达细胞因子并且其中通过在体外肿瘤细胞上传代所述重组甲型流感病毒载体获得所述重组甲型流感病毒载体。
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