CN103881982A - 一种h9n2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗株rDEV-HA9的构建活载体疫苗中的应用。该疫苗株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201403。本发明的构建方法为：在鸭肠炎病毒人工染色体质粒pBAC-C-KCE中插入了H9N2亚型禽流感病毒ha基因的片段得到重组质粒pBAC-C-KCE-HA9；其中：质粒pBAC-C-KCE的基因结构组成如如图7所示；质粒pBAC-C-KCE-HA9的基因结构组成如图15所示。

Description

一种H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗构建及应用。 

背景技术

鸭病毒性肠炎（Duck Virus Enteritis,DEV）又名鸭瘟（Duck Plague,DP），是由鸭肠炎病毒（Duck Enteritis Virus,DEV）引起的鸭、鹅等雁形目禽类的一种急性、接触性传染病，各年龄的禽类均可发病。鸭病毒性肠炎在很多国家都有该病的报道，在我国也广泛流行。由于其传播迅速，发病和死亡率高，达50-100%，成鸭甚至在90%以上，已经成为危害养鸭业的主要疫病之一。近几年，陆续有关于鸭肠炎病毒基因组的研究报道；2009年，鸭肠炎病毒基因组序列已经公布并登陆在Genbank(Li Y et al.,2009)，为研究DEV的基因和蛋白功能提供了有力的参考数据。其基因组大小约为150kb，编码78个蛋白质，其中有67个蛋白与α-疱疹病毒有同源性，1个蛋白与γ-疱疹病毒同源，5个与禽疱疹病毒同源。将疱疹病毒的整个基因组克隆到BAC质粒中，然后在细菌中重组其他病毒的具有免疫源性的外源基因，从而构建二价疫苗。 

对于疱疹病毒这样的大基因组病毒（大于100kb），体外操作的难度很大，常规的体外酶切和连接的方法不适合。构建重组病毒的经典方法是将带有目的基因的转移载体与病毒基因组共转染哺乳动物细胞，经细胞内同源重组获得重组病毒。由于存在野生型病毒的干扰，一般需要经过多轮空斑纯化才能筛选得到纯的重组病毒（Domi A et al.,2005;Horsburgh B C et al.,1999），这是一项极为繁琐的工作，有时还会遇到重组病毒传代不稳定的问题。为了克服这种方法的局限，研究人员尝试在大肠杆菌中直接对病毒基因组进行修饰。首先尝试的是大肠杆菌Cosmid载体。由于病毒基因很大，而此载体容量有限（约40kb），必须将病毒基因组分成几段，构成一套重叠的载体，经细胞内的多次同源重组组装成完整的病毒基因组，产生重组毒。Cosmid载体在大肠杆菌中不稳定，共转染的效率低，此外，这些载体在细胞内要经过多次同源重组，其精确性很难保证，发生缺失突变的较高，因而对分离到的重组病毒尚需进一步分析鉴定，不是一种很好的方法。 

在基因组学研究工作的需要下，研究人员开发了一系列适用于大片段克隆的载体和宿主系统，如酵母人工染色体载体（YAC）、大肠杆菌的F因子衍生的细菌人工染色体载体（BAC）和以噬菌体复制子为基础的载体（PAC）。BAC载体可以克隆大至300kb的片段，而且可以在大肠杆菌中稳定的复制（McGeochD J et al.,1994）。近年来，一系列大的双链病毒基因组陆续被BAC化（Adler H et al.,2000;Borst E M et al.,1999;Azab W et al.,2002;Smith B N et al.,2000）。这些BAC化的病毒基因组转染细胞后，在细胞中能产生感染性病毒粒子，这使得利用细菌的遗传工具操作病毒成为可能。但是，由于某些未知原因，位于基因组中BAC载体部分不太稳定，BAC化的病毒基因组转染细胞后，载体及其两侧病毒基因组序列会发生不同程度的缺失。为了解决这个问题，BAC载体两侧各引入了一个loxP位点，该载体转入表达Cre重组酶的动 物细胞中，Cre酶会催化在两个位点之间的重组反应，从而使原核来源的载体骨架部分从病毒基因组上去除，仅留下34bp的loxP的序列，保证了基因组的保真性和完整性，尽可能的避免了原核来源对插入位置邻近的病毒基因表达的影响，这样利用BAC克隆的细菌遗传工具操作大基因组病毒更趋完善，该方法成功的用于伪狂犬病毒的BAC克隆（Smith G A et al.,2000）。同源重组和位点特异性重组是广泛被用于修饰BAC克隆的方法。RecA同源重组系统是最早为人们熟知的大肠杆菌同源重组系统。然而，由RecA介导的同源重组所需同源区长达1000bp左右，操作的难度大，相对耗时费力，从而使其应用受到很大程度的限制。RecE/RecT同源重组系统可以催化同源反应在20-25bp的同源区间发生，同源重组效率较高（Muyrers J P et al.,2000;Muyrers J P et al.,2000a）。Red-gam系统与RecE/RecT类似，且重组效率更高（Muyrers J P et al.,2000b;Jamsai D et al.,2003）。至此，人们把这两种重组技术结合起来（Red/ET）实现了直接以PCR产物作为供体分子对目的序列的打靶修饰，可以有效地对BAC克隆上的任意基因进行点突变、插入和缺失等修饰。位点特异性重组是由位点特异性重组酶介导特定位点间的发生位点特异性重组。通用的系统有P1噬菌体的Cre-loxP系统（Smith G A et al.,2000），入噬菌体的Int-att系统（Suzuki Y et al.,2005），和酵母的Flp-FRT系统（Cherepanov P P et al.,1995）。位点特异性重组技术靶向性强、重组效率高，也是修饰BAC克隆的有效工具。这整个过程都是在细菌体内进行的，在很大程度上能避免了离体操作对大分子的损伤。2005年，Li M Z et al.开发了一个有效的方法，用于同源重组方法在体内构建重组DNA分子—交配辅助遗传整合克隆(MAGIC)（Li M Z et al.,2005）。 

禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的病毒性烈性传染病,是目前危害世界及我国养禽业最重要的疫病之一。禽流感（Avian influenza,AI）是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种急性传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。1878年该病首次在意大利出现并不断蔓延；2003年末至2004年初又在亚洲地区发生大规模流行：而1997年和2004年分别发生在香港和越南的禽流感,突破了种间障碍直接感染人并引起死亡。近年来禽流感频繁爆发，给世界养禽业造成毁灭性打击。仅东南亚国家因销毁感染家禽的损失就超过1000亿美元，我国销毁家禽数千万羽，损失达几百亿元。2005年爆发于青海湖的高致病性禽流感，已经严重威胁到野生迁徙鸟类的安全，并迅速传遍了欧洲，造成了巨大的危害。H5N1禽流感病毒造成全球553人感染，323人死亡,死亡率达58.4%，我国40人感染，26人死亡。高致病性禽流感已突破种间屏障可直接传染给人，严重危害着人类健康。H9亚型禽流感病毒最早由Hommee and Easterday(1970)从火鸡体内分离到。1994年，陈伯伦等从病蛋鸡体内分离到H9亚型AIV。此后，H9亚型AIV在我国广泛存在，多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势。至1997年,H9亚型AIV广泛分布于各大洲。韩国、爱尔兰、意大利等国都有H9禽流感暴发的报道,说明其已在家禽中建立了稳定的种系。1998年从香港的家猪体内分离到2株H9亚型流感病毒，这是首次从哺乳动物体内分离到H9亚型流感病毒。1999从香港患流感的女孩体内分离到两株H9流感病毒，对这两株病毒的分析表明其所有的基因片段与AIV-A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9)高度同源，是典型的禽源流感病毒，该毒株是香港人感染H5N1和H9亚型密切相关的分支代表株。2000-2001年，对中国南方地区的水禽(主要是家鸭)进行流感病毒监测发现约10%水禽被H9感染，感染率是20世纪70年代的4倍。尽管还没有充分的证据表明H9亚型流感病毒能在人与人之间传播，但其已经成为目前严重危害人类健康的重要传染病之一。 

当前，疫苗免疫接种可能是防止禽流感疫情和鸭病毒性肠炎大范围流行的最经济的方法。但是采用传 统方法构建H5与H9亚型禽流感疫苗株的操作比较困难，利用细菌人工染色体技术等基因操作手段，构建含有流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗，为禽类疫苗的研制提供了新的技术手段。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种含有H9N2亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗。首先我们构建得到鸭肠炎病毒细菌人工染色体的质粒，即鸭肠炎病毒（DEV）疫苗株（C-KCE）的细菌人工染色体质粒，在此基础上提供一种表达H9N2亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗及其应用。本发明利用大肠杆（例如DH10B）以及鸡胚成纤维细胞（CEF细胞）重新快速拯救出DEV。进一步地，本发明构建表达H9N2亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗，可以利用质粒pRTHGA1，插入H9N2亚型禽流感病毒ha基因，利用交配辅助遗传整合克隆（即MAGIC方法）重组，即可获得含有H9N2亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗株。 

实现本发明的主要技术方案和步骤如下所述： 

（1）将鸭肠炎病毒（C-KCE）的全基因组（GenBank ID:KF263690）通过同源重组的方法插入到BAC质粒上得到一种鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE。含有该质粒的大肠杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE，Escherichia coli DH10B-1S2/BAC-C-KCE，于2013年8月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013377； 

（2）将质粒pRThGA改造为pRTHGA1，即在pRTHGA1质粒上分别插入H5N1亚型禽流感病毒ha基因（temporary GenBank accession NO:KJ003987）和H9N2亚型禽流感病毒ha基因（GenBank ID:DQ465400.1）得到重组质粒pRTHGA-HA5（其结构如图11所示）和重组质粒pRTHGA-HA9（其结构如图12所示）； 

（3）运用MAGIC的方法分别将质粒pRTHGA-HA5和pRTHGA-HA9中的禽流感病毒ha基因快速稳定的插入鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE中，从而得到含有禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组质粒pBAC-C-KCE-HA5和pBAC-C-KCE-HA9（其中pBAC-C-KCE-HA5质粒的结构见图16所示，其核苷酸序列全长为169,784bp；pBAC-C-KCE-HA9质粒的结构见图17，其核苷酸序列全长为169,766bp）。含有重组质粒pBAC-C-KCE-HA5的大肠杆菌DH10B-1S₂/BAC-C-KCE-HA，Escherichia coli DH10B-1S₂/BAC-C-KCE-HA，于2013年8月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013378。含有重组质粒pBAC-C-KCE-HA9的大肠杆菌DH10B-1S₂/BAC-C-KCE-HA9，Escherichia coli DH10B-1S₂/BAC-C-KCE-HA9，于2013年12月31日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013740。 

（4）分别将重组质粒pBAC-C-KCE-HA5和pBAC-C-KCE-HA9转染CEF细胞剔除BAC骨架后，即可分别获得表达H5N1亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗株rDEV-HA5（于2014年1月2日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：V201404）和表达H9N2亚型禽流感病毒ha基因的重组鸭肠炎病毒活载体疫苗株rDEV-HA9（于2014年1月2日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：V201403）。 

（5）利用步骤（4）所得的疫苗株分别制备H5N1亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗和H9N2 亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗。 

本发明制备的H5N1亚型和H9N2亚型禽流感病毒的重组的鸭肠炎病毒活载体疫苗可以应用在控制鸭群中H5N1亚型和H9N2亚型禽流感和鸭病毒性肠炎上，可以有效的控制鸭群中H5N1亚型和H9N2亚型禽流感和鸭病毒性肠炎的问题。 

更详细的技术方案参见《具体实施方式》。 

本发明的有益效果在于： 

1、利用本发明中的鸭肠炎病毒细菌人工染色体大大缩短了获得重组病毒的周期。 

2、本发明中的鸭肠炎病毒细菌人工染色体重组外源基因后对载体进行了剔除，无功能性外源序列插入，对基因组亦无影响，不存在遗传物质发生跨物种转移的可能。 

3、利用本发明中的重组病毒疫苗rDEV-HA5和rDEV-HA9可以达到同时预防鸭病毒性肠炎和H5亚型流感或H9亚型流感的效果。由此类推，利用本发明中的鸭肠炎病毒细菌人工染色体重组外源基因可以达到一针同时防两病甚至多种疾病的目的。 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是重组质粒pBlue-UL26-UL27的核苷酸序列，长度12545bp，其中下划线标记的序列分别为限制性内切酶SalI、PacI、NotI的核苷酸序列。其中，1-6401是PBlue-lox载体的部分核苷酸序列，长度为6401bp，6394-6401是限制性内切酶NotI的核苷酸序列，长度为8bp，6402-6435是LoxP的部分核苷酸序列，长度为34bp，6436-7679是UL26的核苷酸序列，长度为1244bp，7680-7687是限制性内切酶PacI的核苷酸序列，长度为8bp，7688-9519是amp复制子的核苷酸序列，长度为1832bp，9520-9527是限制性内切酶PacI的核苷酸序列，长度为8bp，9528-10694是UL27的核苷酸序列，长度为1167bp，10695-12503是红色荧光基因的核苷酸序列，长度为1809bp，12504-12511是限制性内切酶SalI的核苷酸序列，长度为8bp，12512-12545是LoxP的部分核苷酸序列，长度为34bp。 

序列表SEQ ID NO：2是质粒pCAGGS的chickenβ-actin promotor和rabbitβ-globin ployA的表达框和同源臂的核苷酸序列，长度为2380bp。 

序列表SEQ ID NO：3是Loxp序列，长度为644bp，从第485-518bp是切除BAC骨架后仅留下一个34bpLoxp位点的序列。 

序列表SEQ ID NO：4是序列表SEQ ID NO：3中切除BAC骨架后仅留下一个Loxp位点的序列，序列长度为34bp。 

序列表SEQ ID NO：5是pRTHGA1的序列，序列长度为4263bp，在该序列的3687—3642位，以及3698—3703位分别为限制性内切酶位点SmalI和XhoI。其中，在酶切位点SmalI和XhoI之间插入禽流感病毒毒株A/Duck/Hubei/xn/2007（H5N1）的HA序列（核苷酸长度为1704bp）即可得到重组质粒pRTHGA-HA5（核苷酸序列长度为5961bp）；在酶切位点SmalI和XhoI之间插入禽流感病毒毒株A/Duck/HuBei/W1/2004(H9N2)的HA序列（核苷酸长度为1685bp）即可得到重组质粒pRTHGA-HA5（核苷酸序列长度为5943bp）。图1：是本发明的转移载体pBlue-UL27-UL26的构建流程图。 

图2:是本发明的构建转移载体pBlue-UL27-UL26过程中pcDNA3.1+质粒示意图。 

图3：是本发明的转移载体pBlue-UL27-UL26的基因结构组成示意图。 

图4：是本发明的构建转移载体pBlue-UL27-UL26过程中载体pBlue-lox示意图。图中的CMV Promoter是CMV启动子。 

图5：是本发明的转移载体pBlue-UL27-UL26质粒示意图。 

图6：是本发明的转移载体pBlue-UL27-UL26重组到鸭肠炎病毒上在鸡的成纤维细胞上增殖的示意图。其中：图6A为转移载体pBlue-UL27-UL26重组到鸭肠炎病毒上在鸡的成纤维细胞上单独形成空斑的照片； 

图6B为转移载体pBlue-UL27-UL26重组到鸭肠炎病毒上，并且经过多次空斑纯化后在鸡的成纤维细胞增殖的示意图。 

图7：是本发明的鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE的基因组成示意图，是通过用鸭肠炎病毒C-KCE的全长核苷酸序列DEV替换转移载体pBlue-UL27-UL26中的DNA片段（UL26+UL27+amp^r）得到。 

图8：是本发明鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE的示意图，其中CMV.P是CMV启动子，RFP是红色荧光蛋白基因。 

图9：是本发明pRThGA载体改造成重组质粒pRTHGA1的示意图。其中：图9中的左上图中的CMVPromoter是CMV启动子；图9中的右上图及下中图中的Chicken beta-actin promoter是Chicken beta-actin启动子，CMV.IE enhancer是CMV.IE增强子。 

图10：是本发明构建重组质粒pRTHGA-HA5和pRTHGA-HA9的流程图。其是在质粒pRTHGA1的限制性内切酶位点SmalI和XhoI之间分别插入H5亚型禽流感病毒和H9亚型禽流感病毒的ha基因获得。 

图11：是本发明构建的重组质粒pRTHGA-HA5的示意图。其中，图中的Chicken beta-actin promoter是Chicken beta-actin的启动子，CMV.IE enhancer是CMV.IE增强子；质粒带有Amp（氨苄青霉素）抗性。 

图12：是本发明构建的重组质粒pRTHGA-HA9的示意图。 

图13：是本发明的rDEV-HA5疫苗株与rDEV-HA9疫苗株的构建流程图。 

图14：是本发明构建的含有H5亚型禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组质粒pBAC-C-KCE-HA5的基因组成示意图。是将质粒pBAC-C-KCE的红色荧光蛋白基因（RFP）替换为H5亚型禽流感病毒的ha基因而获得。 

图15：是本发明构建的含有H9亚型禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组质粒pBAC-C-KCE-HA9的基因组成示意图。是将质粒pBAC-C-KCE的红色荧光蛋白基因（RFP）替换为H9亚型禽流感病毒的ha基因而获得。 

图16：是本发明构建的含有H5亚型禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组质粒pBAC-C-KCE-HA5的示意图，其核苷酸序列全长为169,784bp。 

图17：是本发明构建的含有H9亚型禽流感病毒ha基因和鸭肠炎病毒基因的重组质粒pBAC-C-KCE-HA9的示意图，其核苷酸序列全长为169,766bp。 

图18：是运用Western Blot检测rDEV-HA5和rDEV-HA9表达ha基因的结果。在图18的下图中rDEV-HA重组毒株与DEV毒株与内参GAPDH的单抗都发生反应产生明显的条带呈阳性，证明该实验有效。图18的上图中rDEV-HA5重组毒株与抗HA的单抗发生反应产生明显的条带呈阳性，而DEV毒株则呈阴性，证明rDEV-HA5重组毒株构建成功。图18的中图中rDEV-HA9重组毒株与抗HA的单抗发生反应产生明显的条带呈阳性，而DEV毒株则呈阴性，证明rDEV-HA9重组毒株构建成功。 

图19：是本发明中雏鸭免疫rDEV-HA5疫苗前后对高致病性禽流感病毒H5N1（XN）的HI抗体效价的监测示意图。 

图20：是本发明中雏鸭免疫rDEV-HA5疫苗前后对鸭肠炎病毒血清抗体的ELISA监测示意图。 

图21：是本发明中rDEV-HA5疫苗对H5亚型高致病性禽流感病毒的保护率示意图。 

图22：是本发明中rDEV-HA5疫苗对鸭肠炎病毒的保护率示意图。 

图23：是本发明中雏鸭免疫rDEV-HA9疫苗前后对禽流感病毒H9N2（W1）的HI抗体效价的监测示意图。 

图24：是本发明中雏鸭免疫rDEV-HA9疫苗前后对鸭肠炎病毒血清抗体的ELISA监测示意图。 

图25：是本发明中rDEV-HA9疫苗对H9亚型禽流感病毒的保护率示意图。 

图26：是本发明中rDEV-HA9疫苗对鸭肠炎病毒的保护率示意图。 

具体实施方式

实施例1BAC同源臂的构建和多拷贝的形成 

1、鸭病毒性肠炎（DEV）病毒基因组的提取 

将冻存的鸭肠炎病毒疫苗株C-KCE（该生物材料已经发表，参见文献16（Chen et al.Wei Zou et al. 

Construction of a full-length infectious bacterial artificial chromosome clone of duck enteritis virus vaccine strain.Virology Journal2013,10:328）其基因组DNA序列已提交，见GenBank ID:KF263690。该毒株是华中农业大学农业微生物学国家重点实验室于2010年在中国湖北省咸宁市某鸭场采集病料。制备方法如下：将采集到的鸭场病料加入0.9%的生理盐水后进行匀浆并将离心后的上清接种鸡胚，盲传三代后收集鸡胚尿囊液得到鸭肠炎病毒疫苗株C-KCE）的病变细胞连续冻融3次，4℃8000rpm离心20min沉淀细胞碎片。收集上清，30％(w/w)蔗糖溶液垫底，4℃16000rpm离心60min沉淀病毒粒子。弃掉上清，加入双蒸水将病毒粒子悬浮。加入蛋白酶K至终浓度500μg/rnL，十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度l％。置56℃水浴l h。将消化后产物用等体积的V(苯酚)：V(氯仿)=体积比为l：l和氯仿各抽提一次，16000rpm离心15min。取上清液向其中加入有加入等体积的异丙醇轻轻混匀，-20℃沉淀核酸2h。4℃16000rpm离心20min沉淀DNA，70％冷乙醇洗涤一次，回收核酸沉淀，重悬于TER(含有RNA酶的TE)室温作用10min，充分消化RNA，消化完毕后用作模板使用。 

2.在UL26和UL27（UL26和UL27是鸭肠炎病毒的部分基因组序列，GenBank:EU082088.2）之间插入BAC载体：UL26两端引入NotI和PacI的酶切位点（上下游引物分别为UL26-F和UL26-R，引物具体序 列见表1），UL27上游引入Pac I的酶切位点（上下游引物分别为UL27-F和UL27-R，引物具体序列见表1）。以C-KCE的基因组为模板将同源臂用PCR扩增下来。以pcDNA3.1（如图2所示，该质粒由湖北大学生命科学学院马立新教授赠送）为模板扩增amp复制子，并且在两端引入Pac I的酶切位点（上下游引物分别为Amp-F和Amp-R，引物具体序列见表1）。以pRTRA质粒（由湖北大学生命科学学院马立新教授赠送）为模板扩增RFP基因，并在下游引入Sal I的酶切位点（上下游引物分别为RFP-F和RFP-R，引物具体序列见表1）。PCR扩增体系：Easy-Taq0.25μL；10xbuffer2.5μL，dNTP2μL，模板2μL，上下游引物（UL26-F和UL26-R，或UL27-F和UL27-R，或Amp-F和Amp-R，或RFP-F和RFP-R）各1μL，ddH₂O补齐25μL，混匀后按以下程序进行反应：95℃预变性5min，94℃变性30s，按各引物退火温度，40s，延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。 

采用重叠PCR方法（PCR扩增体系：Easy-Taq0.25μL；10xbuffer2.5μL，dNTP2μL，模板2μL，三对上下游引物（UL26-F和UL26-R，UL27-F和UL27-R，RFP-F和RFP-R）各1μL，ddH₂O补齐25μL，混匀后按以下程序进行反应：95℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火，40s，72℃延伸5min，30个循环，最后72℃延伸10min）将三者连接在一起，然后克隆到Sal I，Not I酶切的pBlue-lox载体（如图4所示，由湖北大学生命科学学院马立新教授赠送）上，获得重组pBlue质粒。将amp复制子克隆到PacI酶切的重组pBlue质粒中得到带有amp复制子的转移载体pBlue-UL27-UL26（长度为12545bp，构建流程见图1，其基因结构组成见图3，质粒图见图5）。 

表1PCR及重叠PCR引物 

引物中带下划线部分表示为Loxp部分序列，带点式下划线部分为各引物中的限制性内切酶序列。 

实施例2重组病毒的筛选和纯化 

1.CEF细胞的制备 

取9-10日龄的SPF鸡胚（购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司），用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭气室部脱碘后无菌取出鸡胚，放置到无菌的玻璃瓶皿中，并去除头、四肢和内脏用眼科剪剪碎。用灭菌的磷酸盐缓冲液(简称PBS，配方：Na₂CO₃1.59g,NaHCO₃2.93g,用ddH₂O定容至1000ml,调pH为7.4）在细菌瓶中洗涤两次，加入适量0.25％的胰酶37℃水浴消化30min后，吸弃胰酶，用适量的含胎牛血清（10％）与双抗生素（青霉素100u/mL，链霉素100u/mL）的DMEM培养基（购自GIBCO公司），吹打使细胞分散，用六层纱布过滤后，以适量的密度（10⁷）接入细胞瓶备用。 

2.重组病毒的筛选和纯化 

以10MOI在六孔板中接入DEV病毒（鸭肠炎病毒疫苗株C-KCE，来源及序列同实施例1），两个小时后转染用Pac1酶切线性化的rBAC同源臂载体（长度为10705bp，线性化的DNA同源重组效率更高），转染后6小时换opti-MEN（购买自GIBCO公司），24小时后收取病毒粒子。 

将收取的病毒粒子10^-4、10^-5、10^-6接到长满约90％的CEF细胞（见实施案例2中CEF细胞的制备）上，37℃，CO₂培养箱中静置两个小时后，把等体积的2％的低熔点的琼脂糖和不含酚红的2X DMEM（购自GIBCO公司）混合，分别按1％的终浓度加入含上述1％双抗的血清，降到适当的温度（例如37℃）后每孔加入2mL琼脂糖，4℃静置10min后放置细胞培养箱3天等待空斑的形成。 

将形成的空斑放置荧光显微镜下，寻找带有红色荧光的蚀斑。将带有红色荧光的蚀斑做下一轮的纯化，直到完全是红色荧光的蚀斑（如图6所示）。 

实施例3将重组病毒电转入大肠杆菌DH10B-IS 

1.DH10B-IS感受态的制备：将-80℃保存的大肠杆菌（DH10B-IS，湖北大学生命科学院马立新教授赠送）划线在LB平板上,37℃培养过夜。将活化的大肠杆菌单菌落接入LB或加入相应的抗生素（氯霉素（Cam），34pg/mL，链霉素（Str）50pg/mL）的LB液体培养基中,37℃200～250r/min震荡培养过夜转移0.2～1mL过夜培养物至装有200mL LB的三角瓶中。37℃下剧烈振荡培养2～6小时，定时检测OD₆₀₀值。当OD₆₀₀值达到0.7～1.0时，从摇床中取出锥形瓶，置于冰水混合物中，冰浴15min。用预冷的无菌离心管收集菌体，4℃6000r/min离心10min，弃上清液。用预冷的10%的无菌甘油溶液重新悬浮细胞，离心，小心弃去上清液。重复步骤上述步骤一次。用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为1mL。将细胞按100μL等份装入微量离心管，于-80℃冰箱备用。 

2.大肠杆菌电转化：在无菌的1.5mL离心管内加入待转化的环化的DEV重组病毒基因组DNA5μg（其基因构成如图7所示），加入20μL的电转感受态细胞，轻柔混匀，冰浴1～2min。将DNA和感受态细胞混合物吸入到0.1μm的冰冷灭菌的电转杯中，轻轻敲击电转杯使混合物均匀进入电转杯的底部，冰浴3-5min。电转条件设定为1500V、200Ω、25μF。用吸水纸将电转杯四周的水珠吸干，立即放入电击室中，按一下pulse键，听到蜂鸣声并看到电击完成后显示屏上的电击参数，立即在电转杯中加入37℃的lmL的SOC培养基(LB培养基，含有0.2mmol/L葡萄糖，0.1mmol/L MgSO₄，0.1mmol/L MgCl₂)，重悬细胞后，吸出转移到1.5mL无菌Eppendorf管中，37℃、225转／分摇菌复苏l h，取20μL转化产物加200μLSOC涂板，每100μL涂布于1个含氯霉素(Cam，34pg/mL)和链霉素(Str50pg/mL)的双抗性LB培养基平板上，37℃培养24h查看转化结果。 

实施例4含有DEV病毒全基因组的BAC质粒的鉴定 

1.含有DEV病毒全基因组的BAC质粒(pBAC-C-KCE)的提取 

将用普通凝胶电泳法初步鉴定BAC分子克隆化病毒克隆，用Qiagen plasmid Midi kit试剂盒（QIAGEN中量提取试剂盒，购自Qiagen公司）纯化：将初步鉴定BAC分子克隆化病毒的阳性克隆，划线于含氯霉素(Cam34pg/mL)的抗性LB培养基平板上，37℃培养24h，挑取阳性克隆，小瓶摇菌16h后再用中瓶摇菌200mL，摇菌16h到18h，按试剂盒说明书和改进的方法提取BAC分子克隆化病毒的质粒，用500mL灭菌离心瓶，4℃，6000转离心15min；尽量弃上清，加入P1溶液(含LyseBlue和RNaseA酶，购自Qiagen公司)10mL，彻底混匀。加入P2溶液（购自Qiagen公司）15mL，立即轻轻混匀，直到蓝色均匀。加入P3（购自Qiagen公司）溶液15mL，立即轻轻混匀，到蓝色彻底消失为止。4℃，20000转离心30min，将上清过柱子，用Wash Buffer（购自Qiagen公司）洗涤两次，加入200μL TE洗脱下来备用。 

2.病毒的拯救 

将提取的质粒pBAC-C-KCE运用磷酸钙的方法（具体见参考文献13）转染CEF细胞，3到4天后观察病变，把能产生病变的质粒pBAC-C-KCE送到上海南方基因公司测序，证明其具有完整的DEV基因组，我们将验证正确的BAC-C-KCE质粒命名为鸭肠炎病毒人工染色体质粒pBAC-C-KCE（如图8所示），我们将保藏的生物材料样品的名称命名为：大肠杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE，Escherichia coli DH10B-1S₂/BAC-C-KCE，于2013年8月20日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013377。 

实施例5pRThGA载体的改造 

以质粒pCAGGS（由湖北大学生命科学学院马立新教授赠送）为模板，以pCAGGS-ISce1-H1F（核苷酸序列为：AAATAGGGATAACAGGGTAATGTTGAGCCTTTTTGTGGAGTGGGTTAAATTGTACTAGCGCGTTTCGCTTTGCAGT ACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA）和pCAGGS-ISce1-H1R（核苷酸序列为：AAATAGGGATAACAGGGTAATTA GCATGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCGGCCGCCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC）为引物扩增CMV.IE enhancer到rabbit beta-globin polyA的区域，在两端分别引入同源臂H1(序列为GTTGAGCCT TTTTGTGGAGTGGGTTAAATTGTACTAGCGCGTTTCGCTTT)、H2（序列为GCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATA CGAAGTTATGCATGCTA）和I-SceI的酶切位点，得到产物1。 

以pRThGA质粒（湖北大学生命科学学院马立新教授赠送，见图9的左上图）为模板，以Amp t(ISceI)F和oriT R6K(ISceI)R为引物扩增oriI到I-SceI的区域，分别两端引入I-SceI的酶切位点，得到产物2。所用的引物如表2（pCAGGS-ISceI-H1F和pCAGGS-ISceI-H1R）。PCR扩增体系：Easy-Taq0.25μL；10xbuffer2.5μL，dNTP2μL，模板2μL，上下游引物（pCAGGS-ISceI-H1F和pCAGGS-ISceI-H1R）各1μL，ddH₂O补齐25μL，混匀后按以下程序进行反应：95℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火，40s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。 

将以上产物1和产物2用I-SceI酶切、回收、连接、转化（参见文献14）。将测序鉴定正确的质粒命名为pRTHGA1（其核苷酸序列见SEQ ID NO：5，见图9的下图）。 

表2PCR反应的引物设计 

实施例6将HA构建到pRTHGA1 

本实施例中提取禽流感病毒毒株A/Duck/Hubei/xn/2007（H5N1），简称为xn/07（该生物材料已经发表，参见文献17（文献：Wei Zou et al.The antigenic property of the H5N1avian influenza viruses isolated in central China.Virology Joumal2012,9:148，其基因组DNA序列已提交，temporary GenBank accession NO：KJ003984～KJ003991。属于H5N1亚型，该毒株是华中农业大学农业微生物学国家重点实验室于2007年在中国湖北省咸宁市某鸭场采集病料中分离得到，方法是在采集到的鸭场病料中，加入0.9%的生理盐水后进行匀浆并将离心后的上清接种鸡胚，盲传三代后收集鸡胚尿囊液得到禽流感病毒毒株A/duck/Hubei/xn/2007（H5N1）。 

本实施例中提取禽流感病毒毒株A/Duck/HuBei/W1/2004(H9N2)，简称为W1/04（该生物材料已经发表，参见文献18：（文献：Xiao-Juan Xu et al.Evolutionary characterization of influenza virus A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)isolated from central China.Virus Genes(2008)36:79–83））其基因组DNA序列已提交，见GenBank ID:DQ465400。属于H9N2型，该毒株是华中农业大学农业微生物学国家重点实验室于2004年在中国湖北省咸宁市某鸭场采集病料，加入0.9%的生理盐水后进行匀浆并将离心后的上清接种鸡胚，盲传三代后收集鸡胚尿囊液得到禽流感病毒毒株A/Duck/HuBei/W1/2004(H9N2)。 

按照常规方法，提取禽流感病毒毒株xn/07和W1/04的RNA后通过RT-PCR进行鉴定，鉴定正确后，将上述毒种xn/07和W1/04冻存于-80℃，通过RT-PCR反应获得两株病毒的目标基因片段HA，反应所用的引物见表3，扩增得到两株病毒的HA序列(序列参见temporary GenBank accession NO:KJ003987和GenBank ID:DQ465400.1)。具体构建过程如下： 

表3RT-PCR反应的引物 

1.RNA提取及cDNA的合成 

将禽流感病毒毒株xn/07和W1/04尿囊液样品置于12000rpm/min离心10min，取上清200μL，加入1mL TRIZOL（试剂）溶液（购自宝生物工程大连有限公司）充分混匀，备用。具体方法参照TRIZOL试剂的说明书，具体步骤如下： 

（1）取已处理好的样品约1.2mL，加入200μL氯仿，剧烈震荡，于混匀状态下约20s；立即冰浴10min，4℃条件下12000g离心10min； 

（2）取上清，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放置10min，12000g离心10min； 

（3）彻底弃净上清，加入1mL75%乙醇，混匀，4℃条件下7500g离心10min； 

（4）重复洗涤一次； 

（5）弃上清，室温下干燥5～10min，勿过分干燥，用30μL无RNase H2O溶解，置10min左右； 

取上述RNA产物25μL，加入如下试剂：AMV(50U/μL)1μL，RRI(40U/μL)0.5μL，5×buffer8μL，dNTP4μL，U12(10pmol)1μL，ddH₂O补齐40μL。反应条件为42℃1h，94℃，5min。反应产物直接用于PCR或-20℃保存。 

2.PCR扩增及产物回收 

取上述RT-PCR产物(cDNA)3μL，加入如下试剂：Easy-Taq0.25μL，10xbuffer2.5μL，dNTP2μL，上下游引物（H5SmalI F和H5XhoI R或者H9SmalI F和H9XhoI R）各1μL，ddH₂O补齐25μL，混匀后按以下程序进行反应：95℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火，40s，延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR扩增产物与pRTHGA1载体分别用SmaI和XhoI双酶切后，通过0.8%-1.5%琼脂糖凝胶电泳，经试剂盒（GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自上海捷瑞生物工程有限公司）回收目标片段。 

3.目标片段HA与载体pRTHGA1的连接、转化 

连接反应体系为10μL，其中加入3μL回收产物HA5或HA9、1μL回收产物pRTHGA1、1μL T4DNA ligase，5μL2xRapid ligation Buffer（连接试剂盒购自Promega公司）。16℃水浴连接过夜。将连接产物（pRTHGA-HA）转化到供体菌E.coli strainDH10β中并接种至添加了100pg/mL Amp的LB液体培养基中，筛选阳性克隆并测序验证，将验证正确的质粒分别命名为pRTHGA-HA5（如图11所示）和pRTHGA-HA9（如图12所示）。 

实施例7MAGIC介导HA重组到DEV上替代红色荧光蛋白 

分别将含有重组质粒pRTHGA-HA5和pRTHGA-HA9的供体菌E.coli strainDH10B接种至添加了100pg/mL Amp的LB液体培养基中，将受体菌E.coli DH10B-IS(含有质粒pML300+pBAC-C-KCE)接种至添加了壮观霉素(50pg/mL)和卡那霉素（kan）(50pg/mL)和0.2%(w/v)葡萄糖的LB液体培养基中，30℃培养过夜；次日离心收集受体菌，用2倍体积LB液体培养基洗涤该菌体两次，将供体菌（含有重组质粒 pRTHGA-HA或pRTHGA-HA9）和受体菌均按1:25、l:50、l:100或l:200的体积比，用添加了0.2%(w/v)鼠李糖的LB液体培养基进行稀释，然后在30℃下培养2h，直至OD₆₀₀达到0.15-0.25；根据OD₆₀₀的值，将供体菌和受体菌按体积比1:1的体积比混合，37℃静置培养2h，然后振荡培养2h；将混合物稀释100倍涂布加了Cam(34pg/mL)和0.2%(W/V)Amp的LB固体培养基平板，42℃培养过夜（技术流程如图13所示）。将PCR鉴定所得重组HA的质粒命名为pBAC-C-KCE-HA5（如图14和图16所示），将PCR鉴定所得重组HA9的质粒命名为pBAC-C-KCE-HA9（如图15和图17所示）。 

实施例8重组病毒的拯救 

分别将提取的BAC-C-KCE-HA5质粒和BAC-C-KCE-HA9质粒运用磷酸钙的方法(具体见参考文献13)转染CEF细胞，3到4天后观察病变，把能产生病变的BAC-C-KCE-HA5质粒和BAC-C-KCE-HA9质粒送到上海南方基因公司测序，证明其具有完整的DEV及HA基因组，将验证正确的BAC-C-KCE-HA5质粒命名为含有表达流感病毒H5亚型血凝素的鸭肠炎病毒细菌人工染色体质粒pBAC-C-KCE-HA5，我们送交保藏的生物材料样品的命名为大肠杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA，Escherichia coli DH10B-1S₂/BAC-C-KCE-HA，于2013年8月20日送至中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013378。将验证正确的BAC-C-KCE-HA9质粒命名为含有表达流感病毒H5亚型血凝素的鸭肠炎病毒人工染色体pBAC-C-KCE-HA9质粒，我们将送交保藏的生物材料命名为大肠杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9，Escherichia coli DH10B-1S₂/BAC-C-KCE-HA9，于2013年12月31日送至中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2013740。 

实施例9Cre-Loxp重组介导的BAC骨架的删除 

参见文献：JichunWang et al.,2011报道的方法，将pCAGGS-NLS/cre的真核表达质粒转染CEF细胞，12小时后以1个MOI（multiplicity of infection，复合感染剂量）分别接种含有pBAC-C-KCE-HA5或pBAC-C-KCE-HA9的病毒，24小时后空斑纯化，用PCR的方法鉴定（引物F：TTTATTCAACAGTGGCGAGTTC，R：TATGCCGGCGTACACCGAGA，95℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min）BAC骨架是否被切除，3到4轮后得到不含BAC骨架，仅仅留下一个34bpLoxp位点（其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO：3和4所示）的rDEV-HA5病毒或rDEV-HA9病毒。 

实施例10利用Western Blot方法检测HA的表达 

将上述rDEV-HA5与rDEV-HA9纯化的重组病毒以及DEV病毒接CEF细胞达到50％病变时收集细胞蛋白进行SDS-PAGE电泳（操作方法参见文献14）。当SDS-PAGE电泳将结束时，用蒸馏水淋洗石墨板，用不被吸收的纸巾擦干。戴上手套，剪6张3MM滤纸和1张硝酸纤维素滤膜。滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶（否则两滤纸边缘的接触会造成电流短路），把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水的上面，先借毛细作用使膜从下往上润湿后，将膜完全浸没于水中，浸泡5min除去滤膜上残留的气泡，用软铅笔在滤膜一角做标记。在一托盘中加入少量电转缓冲液（称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱， 0.37g SDS，加200mL甲醇，加水至总量为1000mL），把6张滤纸浸泡于其中。戴上手套安装转移装置，平放底部电极（阳极），石墨一边朝上，在这一电极上放置3张浸泡过的滤纸，精确对齐，用玻璃棒赶出气泡，把硝酸纤维素滤膜放在滤纸上，保证对齐，没有气泡。从电泳槽上取下凝胶，转移到去离子水中略略漂洗一下，然后精确平放于硝酸纤维素滤膜上，凝胶左下角与滤膜标记对齐，戴手套排除气泡。把最后3张滤纸放在凝胶上方，同样保证精确对齐不留气泡。将上方的电极（阴极）盖于夹层物上，石墨一边朝下，连接电源，根据凝胶面积按0.65mA～1.0mA/cm²接通电流，电转移1.5～2h。 

Western-blot方法：转印或自然晾干结束后，将上述所得NC膜置于TBST(Tris-base2.42g，NaCl8.77g，调pH至7.2-7.4，定容至1000mL，再加Tween-202Ml)中，漂洗一下，再放入封闭液（TBST+1%（w/v）牛血清白蛋白，即BSA）中，37℃平缓摇动1-2h或4℃过夜。然后将NC膜取出，与TBST稀释的一抗（鼠源HA的单抗，兔源gB的多抗，内参GAPDH的单抗均购自武汉晟亚生物有限责任公司）37℃反应1h，TBST洗涤4-6次，每次5min，加入二抗（鼠二抗和兔二抗，购自武汉晟亚生物有限责任公司）37℃反应1h，TBST洗4-6次，每次5min，将膜置于干净的滤纸上吸干表面的水分用于化学发光（ECL，enhanced chemiluminescen）显色。 

ECL显色：按2mL/膜加入ECL，并在Kodak2000MM上获取Western Blot结果（见图18）。 

实施例11对重组疫苗rDEV-HA5对雏鸭的免疫效果评价 

1.rDEV-HA5疫苗的制备 

将重组rDEV-HA病毒及DEV病毒接种CEF细胞（见实施例2中的CEF细胞制备），当细胞病变达到80%以上时，无菌收获病毒，进行空斑计数（PFU），达到3x10⁷PFU左右即可作为疫苗种子液。 

2.rDEV-HA5疫苗的安全性试验 

从非疫区购进7日龄健康雏半番鸭（湖北鸿翔农业发展有限公司）45只，饲养到14日龄时随机分成3组，每组15只雏鸭，分别为PBS（磷酸酸盐缓冲液配方：NaCl：8g，KCl：0.2g，Na₂HPO4.12H₂O：2.9g，KH₂PO₄：0.2g，用ddH₂O定容至1000mL(pH=7.4)）对照组、rDEV-HA5高剂量组、rDEV–HA5低剂量组。分别经腿肌注射500μL/只PBS、500μL/只高剂量疫苗液（100x10⁵PFU）、500μL/只低剂量疫苗液（10⁵PFU）；连续观察14天，雏鸭精神状况良好，无不良反应，均健康存活，证明本发明涉及疫苗对免疫动物是安全的。 

3.rDEV-HA5疫苗的免疫保护效果 

从非疫区购进7日龄健康雏半番鸭45只，饲养到14日龄时随机分成3组，每组15只雏鸭，分别为PBS对照组、rDEV-HA5组、DEV组。分别经腿肌注射PBS500μL/只、rDEV-HA5疫苗液500μL/只（10⁵PFU）、DEV疫苗液500μL/只（10⁵PFU）进行免疫，连续观察数天，雏鸭精神状况良好，无不良反应，均健康存活。免疫前以及免疫后每周采血一次收集血清用于禽流感病毒H5N1（XN）及鸭肠炎病毒的抗体水平检测。 

3.1对禽流感病毒H5N1（XN）的抗体HI检测 

方法参考国际动物卫生组织(OIE)的HI实验，具体步骤如下：在96孔血凝板中加PBS液30μL/孔，再在第一孔中加病毒尿囊液30μL，倍比稀释，加入1%鸡红细胞30μL/孔，震荡混匀，室温放置30min，待 未凝集血球完全沉淀后记录HA效价。在HI试验时，将病毒稀释至4个血凝单位，然后在96孔血凝板中加PBS液30μL/孔，再在第一孔中加待检血清30μL，倍比稀释，加4个HA单位病毒稀释液30μL/孔，震荡混匀，室温静置30min，加人1%鸡红细胞30μL/孔，震荡混匀，室温静置30min，待未凝集血球完全沉淀后记录HI效价，结果见图19。抗体水平监测显示，免疫两周后高致病性禽流感病毒H5N1（XN）抗体水平逐渐升高并稳定，9周后抗体水平下降。 

3.2鸭肠炎病毒的抗体水平检测（间接ELISA方法） 

3.2.1试剂的准备： 

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液）：Na₂CO₃：1.59g，NaHCO₃：2.93g,用ddH₂O定容至1000mL(pH9.6)。 

10倍洗涤液：NaCl：80g，KCl：2g，Na₂HPO4.12H₂O：29g，KH₂PO₄：2g，Tween-20：5mL，用ddH₂O定容至1000mL(pH=7.4)。 

封闭液：5g脱脂乳溶于100mL洗涤液。 

底物液：分为底物A液和底物B液。具体组成如下： 

底物A液：0.006%浓度的H₂O₂缓冲液。 

底物B液：取Na₂HPO₄.12H₂O：14.2g，柠檬酸：10.5g，用ddH₂O定容至500mL配成0.1mL磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH=5.0)，然后按终浓度为20mg/L添加联苯二胺(TMB)（使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用）。 

终止液（终浓度0.025%氢氟酸溶液）：取浓度为40%氢氟酸溶液625μL，用ddH2O定容至100mL。 

3.2.2间接ELISA操作步骤 

（1）包被抗原的制备：将DEV病毒接种CEF细胞，当细胞病变达到80%以上时，无菌收获病毒，反复冻融3次后,取病毒上清液于4℃10000r/min离心60min,收集上清液；300g/L的蔗糖溶液垫底，4℃30000r/min离心60min,沉淀用适量PBS缓冲液悬浮。 

（2）包被：以纯化包被抗原最佳包被浓度（50μg/mL）包被酶标板为100μL/孔，37℃孵育1h后置4℃过夜。 

（3）洗板：弃包被液，PBST洗涤液，200μL/孔，洗涤3次，每次3min。（4）封闭：拍干酶标板，加入封闭液，200μL/孔，37℃孵育2h，封闭非特异性结合位点。 

（5）洗板：弃封闭液，同步骤（4）。 

（6）加待检血清：拍干酶标板，加入待检血清，100μL/孔，设阴性对照，37℃孵育30min。 

（7）洗板：弃待检样品液，同步骤（4）。 

（8）加酶标抗体：拍干酶标板后加入HRP标记的酶标二抗（购自美国KPL公司），体积比为1∶1000倍稀释，100μL/孔，37℃放置30min。 

（9）洗板：弃酶标抗体，同步骤（3）。 

（10）显色：每孔加入新配的底物A液、底物B液各50μL，室温避光显色10min。 

（11）终止反应：每孔加入50μL终止液终止反应； 

（12）测定OD630值：酶标仪测定波长为630nm时OD值。若OD630值≥0.3，判定为阳性，OD630值＜0.3，判定为阴性。 

3.2.3鸭肠炎病毒血清抗体检测结果 

14日龄首免的雏鸭，免疫两周后抗体逐渐升高并保持稳定，监测12周后仍有抗体存在（如图20所示）。4疫苗免疫保护力评价 

对免疫3天后的雏鸭进行疫苗免疫保护力评价。每组随机挑取5只雏鸭分别腿肌接种100LD₅₀剂量的进行高致病性禽流感病毒（A/duck/Hubei/XN/2007(H5N1)）以及鸭肠炎病毒的攻毒保护试验。每组雏鸭分别腿肌注射100LD₅₀剂量的XN毒和鸭肠炎病毒DEV。结果显示，免疫rDEV-HA5r的雏鸭对XN毒具有80%的保护率，免疫DEV的雏鸭对XN毒具有50%的保护率，而PBS对照组一周后全部死亡（如图21所示）；免疫rDEV-HA5与DEV的雏鸭对DEV毒具有100%的保护率，而PBS对照组攻毒一周后全部死亡（如图22所示）。结果表明，rDEV-HA5疫苗能够对高致病性禽流感病毒H5亚型以及鸭肠炎病毒产生有效保护。 

实施例12重组疫苗rDEV-HA9对雏鸭的免疫效果评价 

1.rDEV-HA9疫苗的制备 

将重组rDEV-HA9病毒及DEV病毒接种CEF细胞，当细胞病变达到80%以上时，无菌收获病毒，进行空斑计数（PFU），达到3x10⁷PFU左右即可作为疫苗种子液。 

2.rDEV-HA9疫苗的安全性试验 

从非疫区购进7日龄健康雏半番鸭45只，饲养到14日龄时随机分成3组，每组15只雏鸭，分别为PBS对照组、rDEV-HA9高剂量组、rDEV–HA9低剂量组。分别经腿肌注射500μL/只PBS、500μL/只高剂量疫苗液（100x10⁵PFU）、500μL/只低剂量疫苗液（10⁵PFU）；连续观察14天，雏鸭精神状况良好，无不良反应，均健康存活，证明本发明涉及疫苗对免疫动物是安全的。 

3.rDEV-HA9疫苗的免疫保护效果 

从非疫区购进7日龄健康雏半番鸭45只，饲养到14日龄时随机分成3组，每组15只雏鸭，分别为PBS对照组、rDEV-HA9组、DEV组。分别经腿肌注射PBS500μL/只、rDEV-HA9疫苗液500μL/只（10⁵PFU）、DEV疫苗液500μL/只（10⁵PFU）进行免疫，连续观察数天，雏鸭精神状况良好，无不良反应，均健康存活。免疫前及免疫后每周采血一次收集血清用于禽流感病毒H9N2（W1）及鸭肠炎病毒的抗体水平检测。 

3.1对禽流感病毒H9N2（W1）的抗体HI检测 

详细方法及步骤见实施例11中的3.1，结果见图23。抗体水平监测显示，免疫一周后禽流感病毒H9N2（W1）抗体水平逐渐升高并稳定，监测12周后抗体仍然存在。 

3.2鸭肠炎病毒血清抗体水平检测（间接ELISA方法）。 

详细方法及步骤见实施例11中的3.2，结果见图24。14日龄免疫的雏鸭，免疫一周后抗体逐渐升高并保持稳定，监测12周后仍有抗体存在。 

4疫苗免疫保护力评价 

对免疫3天后的雏鸭进行疫苗免疫保护力评价。每组随机挑取5只雏鸭分别腿肌接种100LD₅₀剂量的进行禽流感病毒（A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)）以及鸭肠炎病毒的攻毒保护试验。每组雏鸭分别腿肌注 射100LD₅₀剂量的W1毒和鸭肠炎病毒DEV。结果显示，免疫rDEV-HA9的雏鸭对W1毒具有100%的保护率，免疫DEV的雏鸭对W1毒具有60%的保护率，而PBS对照组，一周后全部发病或死亡（如图25所示）；免疫rDEV-HA9和DEV的雏鸭对DEV病毒具有100%的保护率，而PBS对照组攻毒一周后全部死亡（如图26所示）。结果表明，rDEV-HA9疫苗能够对H9亚型禽流感病毒以及鸭肠炎病毒产生有效保护。 

在本说明书中其它未详细说明的部分均为现有技术，本领域的技术人员通过本说明书、序列表和说明书附图以及通过本发明提示的现有技术能够详细理解本发明，并能够实施本发明。 

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。 

参考文献： 

1.Li Y,Huang B,Ma X,Wu J,Li F,Ai W,Song M,Yang H.Molecular characterization of the genome of duck enteritis virus[J].Virology,2009,391(2):151-161. 

2.Domi A,Moss B.Engineering of a vaccinia virus bacterial artificial chromosome in Escherichia coli by bacteriophage lambda-based recombination[J].Nat Methods,2005,2(2):95-97. 

3.Adler H,Messerle M,Wagner M,Koszinowski U H.Cloning and mutagenesis of the murine gammaherpesvirus68genome as an infectious bacterial artificial chromosome[J].J Virol,2000,74(15):6964-6974. 

4.Smith B N,Banfield B W,Smeraski C A,Wilcox C L,Dudek F E,Enquist L W,Pickard G E.Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein:A tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(16):9264-9269. 

5.Smith G A,Enquist L W.A self-recom bining bacterial artificial chromosome and its application for analysis of herpesvirus pathogenesis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2000,97(9):4873-4878. 

6.Muyrers J P,Zhang Y,Benes V,Testa G,Ansorge W,Stewart A F.Point mutation of bacterial artificial chromosomes by ET recombination[J].EMBO Rep,2000a,1(3):239-243. 

7.Muyrers J P,Zhang Y,Buchholz F,Stewart A F.RecE/RecT and Redalpha/Redbeta initiate double-stranded break repair by specifically interacting with their respective partners[J].Genes Dev,2000b,14(15):1971-1982. 

8.Jamsai D,Orford M,Nefedov M,Fucharoen S,Williamson R,Ioannou P A.Targeted modification of a human beta-globin locus BAC clone using GET Recombination and an I-Scei counterselection cassette[J].Genomics,2003,82(1):68-77. 

9.Suzuki Y,Kagawa N,Fujino T,Sumiya T,Andoh T,Ishikawa K,Kimura R,Kemmochi K,Ohta T,Tanaka S.A novel high-throughput(HTP)cloning strategy for site-directed designed chimeragenesis and mutation using the Gateway cloning system[J].Nucleic Acids Res,2005,33(12):e109. 

10.Cherepanov P P,Wackernagel W.Gene disruption in Escherichia coli:TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant[J].Gene,1995,158(1):9-14. 

11.Li M Z,Elledge S J.MAGIC,an in vivo genetic method for the rapid construction of recombinant DNA molecules[J].Nat Genet,2005,37(3):311-319. 

12.Chowdhury,S.I.,and W.Batterson.1994.Transinhibition of herpes simplex virus replication by an inducible cell-resident gene encoding a dysfunctional VP19c capsid protein.Virus Res.33:67–87. 

13.JichunWang,Nikolaus Osterrieder.2011.Generation of an infectious clone of duck enteritis virus(DEV)and of a vectored DEV expressing hemagglutinin of H5N1avian in?uenza virus.Virus Res.159(1):23-31. 

14.萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆试验指南.金冬雁，黎孟枫，侯云德等.第二版.北京：科学出版社，2002 

15.高艳利等.SDS-PAGE电泳技术分析蛋白质的研究[J].辽宁化工.2007(07) 

16.Chen et al.Wei Zou et al.Construction of a full-length infectious bacterial artificial chromosome clone of duck enteritis virus vaccine strain.Virology Journal2013,10:328 

17.Wei Zou et al.The antigenic property of the H5N1avian influenza viruses isolated in central China.Virology Joumal2012,9:148 

18.Xiao-Juan Xu et al.Evolutionary characterization of influenza virus A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)isolated from central China.Virus Genes(2008)36:79–83 

Claims (4)

1.一株H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗株rDEV-HA9，其特征在于，该疫苗株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201403，它是在鸭肠炎病毒人工染色体质粒pBAC-C-KCE中插入了H9N2亚型禽流感病毒ha基因得到重组质粒pBAC-C-KCE-HA9构建而成；所述质粒pBAC-C-KCE的结构如图8所示；所述质粒pBAC-C-KCE-HA9的结构如图17所示。

2.一种由权利要求1疫苗株所表达的H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒活载体疫苗。

3.权利要求1所述的疫苗株在制备H9N2亚型禽流感和鸭瘟感染疫苗中的应用。

4.一株表达H9N2亚型禽流感病毒与鸭肠炎病毒的大肠杆菌DH10B-1S2/BAC-C-KCE-HA9，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2013740。

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