JPH05246888A - コンポーネントワクチン - Google Patents
コンポーネントワクチンInfo
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- JPH05246888A JPH05246888A JP22285891A JP22285891A JPH05246888A JP H05246888 A JPH05246888 A JP H05246888A JP 22285891 A JP22285891 A JP 22285891A JP 22285891 A JP22285891 A JP 22285891A JP H05246888 A JPH05246888 A JP H05246888A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明はオーエスキー病のワクチンを、感染
防御に有効で工業的にも大量生産することができ、しか
も有効成分の定量が可能で安定して優れた効果の得られ
るコンポーネントワクチンとする。 【構成】 ブタヘルペス１ウイルス感染細胞を非イオン
界面活性剤で可溶化し、その遠心上清を陰イオン交換体
にかけて膜糖蛋白ｇＸを除去し、さらにヘパリン結合カ
ラムにかけることで膜糖蛋白ｇIII をヘパリンナトリウ
ムに結合させ、ｇIII を大量に含みかつｇＸの除去され
た分画を得て、これにオイルアジュバントを添加してコ
ンポーネントワクチンとする。
防御に有効で工業的にも大量生産することができ、しか
も有効成分の定量が可能で安定して優れた効果の得られ
るコンポーネントワクチンとする。 【構成】 ブタヘルペス１ウイルス感染細胞を非イオン
界面活性剤で可溶化し、その遠心上清を陰イオン交換体
にかけて膜糖蛋白ｇＸを除去し、さらにヘパリン結合カ
ラムにかけることで膜糖蛋白ｇIII をヘパリンナトリウ
ムに結合させ、ｇIII を大量に含みかつｇＸの除去され
た分画を得て、これにオイルアジュバントを添加してコ
ンポーネントワクチンとする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明はオーエスキー病に有効
なコンポーネントワクチンおよびその製造方法に関す
る。
なコンポーネントワクチンおよびその製造方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】オーエスキー病は、ヘルペスウイルス科
のアルファヘルペスウイルス亜科に属するブタヘルペス
１ウイルス（別名、仮性狂犬病ウイルス、以下これをＰ
ＲＶと略記する）によって引き起こされる伝染病であ
り、ブタを初めとしてウシ、ヒツジ、ネコ、イヌなど多
種の哺乳動物が感染する疾病である。このようなＰＲＶ
に感染すると、幼弱豚では重篤な症状を呈し、死亡する
こともある。成豚では一過性の呼吸器症状及び軽度の発
熱を示し、耐過或いは不顕性感染の経過をたどることが
多い。又、ブタ体内にウイルスの潜伏感染が成立し、新
しい感染源になったり、妊娠豚に感染すると高率に死・
流産を起こすこともある。
のアルファヘルペスウイルス亜科に属するブタヘルペス
１ウイルス（別名、仮性狂犬病ウイルス、以下これをＰ
ＲＶと略記する）によって引き起こされる伝染病であ
り、ブタを初めとしてウシ、ヒツジ、ネコ、イヌなど多
種の哺乳動物が感染する疾病である。このようなＰＲＶ
に感染すると、幼弱豚では重篤な症状を呈し、死亡する
こともある。成豚では一過性の呼吸器症状及び軽度の発
熱を示し、耐過或いは不顕性感染の経過をたどることが
多い。又、ブタ体内にウイルスの潜伏感染が成立し、新
しい感染源になったり、妊娠豚に感染すると高率に死・
流産を起こすこともある。
【０００３】したがって、畜産界特に養豚業者にとって
は、本病の蔓延を未然に防いで被害を最小限に止めるた
め、有効なワクチンを得る必要があった。また、有効な
ワクチンであってもマーカーのないワクチンを一旦接種
すれば、その後の本病の感染を自然感染かまたはワクチ
ンによる感染か識別できず、自然感染豚のみ選択して処
分することができなくなる可能性がある。このため、前
記ワクチンには、標識能を付帯させる必要があり、我国
の防疫対策要領もこれを規定する。
は、本病の蔓延を未然に防いで被害を最小限に止めるた
め、有効なワクチンを得る必要があった。また、有効な
ワクチンであってもマーカーのないワクチンを一旦接種
すれば、その後の本病の感染を自然感染かまたはワクチ
ンによる感染か識別できず、自然感染豚のみ選択して処
分することができなくなる可能性がある。このため、前
記ワクチンには、標識能を付帯させる必要があり、我国
の防疫対策要領もこれを規定する。
【０００４】ＰＲＶに対するワクチンとしては、弱毒化
ワクチン、ウイルスを不活化した不活化ワクチンおよび
ウイルス感染細胞を界面活性剤で可溶化した抗原のコン
ポーネントワクチンがある。前記弱毒化ワクチンは、あ
る程度、発症を防止し得るが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換
えが起こる可能性や弱毒化の定義が不鮮明であることな
どの欠点がある。一方、コンポーネントワクチンは、有
効成分としてＰＲＶ感染細胞に共通して出てくる細胞表
面の膜糖蛋白を有効成分としたものであり、糖蛋白とし
てはｇｐ５０、ｇII、ｇIII 、ｇＩ、ｇＸ等がある。ｇ
ｐ５０は、蛋白量当たりの有効成分量が極めて少なく、
採集効率に劣る。一方、ｇＩ、ｇＸは、前記有効成分量
が比較的多いものの、ｇＩ抗体またはｇＸ抗体が抗ウイ
ルス作用を全く示さないため、ｇＩ、ｇＸ抗原をコンポ
ーネントワクチンの有効成分として採用することはでき
ない。また、ｇIIを抗原とするサブユニットワクチン
（特開平２−１０１０２３）もあるが、モノクロナール
抗体との親和性を利用したアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製されるもので大量生産ができない。
膜糖蛋白ｇIII は、蛋白量当たりの有効成分量は多いが
ｇｐ５０抗体に比べて抗体の抗ウイルス作用が若干劣る
ため、本病に対するサブユニットワクチンまたはコンポ
ーネントワクチンの主要成分として採用されることがな
かった。
ワクチン、ウイルスを不活化した不活化ワクチンおよび
ウイルス感染細胞を界面活性剤で可溶化した抗原のコン
ポーネントワクチンがある。前記弱毒化ワクチンは、あ
る程度、発症を防止し得るが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換
えが起こる可能性や弱毒化の定義が不鮮明であることな
どの欠点がある。一方、コンポーネントワクチンは、有
効成分としてＰＲＶ感染細胞に共通して出てくる細胞表
面の膜糖蛋白を有効成分としたものであり、糖蛋白とし
てはｇｐ５０、ｇII、ｇIII 、ｇＩ、ｇＸ等がある。ｇ
ｐ５０は、蛋白量当たりの有効成分量が極めて少なく、
採集効率に劣る。一方、ｇＩ、ｇＸは、前記有効成分量
が比較的多いものの、ｇＩ抗体またはｇＸ抗体が抗ウイ
ルス作用を全く示さないため、ｇＩ、ｇＸ抗原をコンポ
ーネントワクチンの有効成分として採用することはでき
ない。また、ｇIIを抗原とするサブユニットワクチン
（特開平２−１０１０２３）もあるが、モノクロナール
抗体との親和性を利用したアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製されるもので大量生産ができない。
膜糖蛋白ｇIII は、蛋白量当たりの有効成分量は多いが
ｇｐ５０抗体に比べて抗体の抗ウイルス作用が若干劣る
ため、本病に対するサブユニットワクチンまたはコンポ
ーネントワクチンの主要成分として採用されることがな
かった。
【０００５】また、これらサブユニットワクチンまたは
コンポーネントワクチンに添加されるアジュバントとし
ては、フロイントのアジュバント、水酸化アルミニウム
ゲル等が添加されていた。
コンポーネントワクチンに添加されるアジュバントとし
ては、フロイントのアジュバント、水酸化アルミニウム
ゲル等が添加されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかし、膜糖蛋白ｇII
を抗原とするサブユニットワクチンは、抗原成分が単一
であるから、その抗原特有の効果しか望めず、多成分含
有ワクチンであるコンポーネントワクチンに比べて有効
性に劣り、一方、多成分のコンポーネントワクチンとす
れば有効成分の定量が容易でないという問題点がある。
また、前記サブユニットワクチンは、モノクロナール抗
体との親和性を利用したアフィニティークロマトグラフ
ィーによって得られるため、製造効率が低く、工業生産
性を充分に満足したものとはいえないものであった。さ
らに、ワクチンに添加するアジュバントは、接種部位に
よってワクチンの効力が変動するため信頼性に欠けると
いう問題点がある。
を抗原とするサブユニットワクチンは、抗原成分が単一
であるから、その抗原特有の効果しか望めず、多成分含
有ワクチンであるコンポーネントワクチンに比べて有効
性に劣り、一方、多成分のコンポーネントワクチンとす
れば有効成分の定量が容易でないという問題点がある。
また、前記サブユニットワクチンは、モノクロナール抗
体との親和性を利用したアフィニティークロマトグラフ
ィーによって得られるため、製造効率が低く、工業生産
性を充分に満足したものとはいえないものであった。さ
らに、ワクチンに添加するアジュバントは、接種部位に
よってワクチンの効力が変動するため信頼性に欠けると
いう問題点がある。
【０００７】この発明は、上記した従来のオーエスキー
病のワクチンにおける問題点を解決し、感染防御に有効
で工業的にも大量生産することができ、しかも、有効成
分の定量が可能でありかつ安定して優れた効果の得られ
るコンポーネントワクチンとすることを課題としてい
る。
病のワクチンにおける問題点を解決し、感染防御に有効
で工業的にも大量生産することができ、しかも、有効成
分の定量が可能でありかつ安定して優れた効果の得られ
るコンポーネントワクチンとすることを課題としてい
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段および作用】上記の課題を
解決するため、この発明においては、ブタヘルペス１ウ
イルスの膜糖蛋白ｇIII を主成分とするコンポーネント
ワクチンとしたのである。
解決するため、この発明においては、ブタヘルペス１ウ
イルスの膜糖蛋白ｇIII を主成分とするコンポーネント
ワクチンとしたのである。
【０００９】または、上記コンポーネントワクチンは、
マーカーとして膜糖蛋白ｇＸが除去されたものであって
もよい。
マーカーとして膜糖蛋白ｇＸが除去されたものであって
もよい。
【００１０】上記コンポーネントワクチンは、ブタヘル
ペス１ウイルス感染細胞を界面活性剤で可溶化し、その
遠心上清をヘパリン結合カラムおよび陰イオン交換体カ
ラムにかけて膜糖蛋白ｇIII を主成分としかつ膜糖蛋白
ｇＸが除去された分画とし、この分画にオイルアジュバ
ントを添加して製造することができる。
ペス１ウイルス感染細胞を界面活性剤で可溶化し、その
遠心上清をヘパリン結合カラムおよび陰イオン交換体カ
ラムにかけて膜糖蛋白ｇIII を主成分としかつ膜糖蛋白
ｇＸが除去された分画とし、この分画にオイルアジュバ
ントを添加して製造することができる。
【００１１】この発明のコンポーネントワクチンは、ブ
タヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白のうち、ｇIII を主成
分としていればよく、主成分以下の含有量でｇII、ｇｐ
５０等を含むものであってよい。膜糖蛋白のうちｇIII
は、中和抗体を誘起し、細胞障害性Ｔ細胞の標的抗原で
あることから、両免疫機構に働きかけてＰＲＶ感染防御
に有効に作用する。また、ｇIII は、マウスの赤血球に
対して凝集性を示すので、成分の定量が可能である。
タヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白のうち、ｇIII を主成
分としていればよく、主成分以下の含有量でｇII、ｇｐ
５０等を含むものであってよい。膜糖蛋白のうちｇIII
は、中和抗体を誘起し、細胞障害性Ｔ細胞の標的抗原で
あることから、両免疫機構に働きかけてＰＲＶ感染防御
に有効に作用する。また、ｇIII は、マウスの赤血球に
対して凝集性を示すので、成分の定量が可能である。
【００１２】この発明のコンポーネントワクチンを製造
するには、まず、ＰＲＶを感受性細胞に接種し、採取し
た感染細胞を界面活性剤で可溶化する。感染細胞となる
ＰＲＶに感受性の高い細胞としては、ＰＫ−１５細胞、
ＣＰＫ細胞、ＢＨＫ２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＢＫ
細胞、ＨｍＬｕ細胞などが挙げられる。界面活性剤とし
ては、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００などの非イオン性界面活性剤が好ましい。
するには、まず、ＰＲＶを感受性細胞に接種し、採取し
た感染細胞を界面活性剤で可溶化する。感染細胞となる
ＰＲＶに感受性の高い細胞としては、ＰＫ−１５細胞、
ＣＰＫ細胞、ＢＨＫ２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＢＫ
細胞、ＨｍＬｕ細胞などが挙げられる。界面活性剤とし
ては、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００などの非イオン性界面活性剤が好ましい。
【００１３】次に、前記可溶化液を遠心分離し、上清を
陰イオン交換体にかけてｇＸを効果的に除去し、さらに
ヘパリン結合カラムにかけて、ｇIII をヘパリンナトリ
ウムに結合させｇIII を大量に含む分画を回収する。こ
れをオイルアジュバントと混合してワクチンとする。
陰イオン交換体にかけてｇＸを効果的に除去し、さらに
ヘパリン結合カラムにかけて、ｇIII をヘパリンナトリ
ウムに結合させｇIII を大量に含む分画を回収する。こ
れをオイルアジュバントと混合してワクチンとする。
【００１４】陰イオン交換体はジエチルアミノヘチル基
を有するＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂも
しくはＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−トヨパール６５０が好
ましい。ヘパリン結合カラムはＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ヘ
パリントヨパール６５０もしくはＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂが好ましい。両カラムにか
ける順番はどちらが先でもよい。ワクチンはカラムにか
けた溶液をオイルアジュバントと５：５〜７：３（容量
比）の割合で混合したものであってよい。
を有するＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂも
しくはＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡＥ−トヨパール６５０が好
ましい。ヘパリン結合カラムはＴＳＫｇｅｌ ＡＦ−ヘ
パリントヨパール６５０もしくはＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂが好ましい。両カラムにか
ける順番はどちらが先でもよい。ワクチンはカラムにか
けた溶液をオイルアジュバントと５：５〜７：３（容量
比）の割合で混合したものであってよい。
【００１５】なお、前記マーカーとしては、膜糖蛋白ｇ
Ｘに代えて、またはこれと共に他の膜糖蛋白を除去する
こともできる。
Ｘに代えて、またはこれと共に他の膜糖蛋白を除去する
こともできる。
【００１６】
（ウイルスの感染と感染細胞の可溶化）回転培養瓶等で
増殖させたＰＫ−１５細胞或いはＨｍＬｕ細胞にＰＲＶ
岩手株を接種し、細胞の変性がピークになったときに細
胞を集める。これに１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含
む０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
を加え、１２時間以上撹拌して可溶化し、１０，０００
０×ｇで遠心した上清を得た。
増殖させたＰＫ−１５細胞或いはＨｍＬｕ細胞にＰＲＶ
岩手株を接種し、細胞の変性がピークになったときに細
胞を集める。これに１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含
む０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
を加え、１２時間以上撹拌して可溶化し、１０，０００
０×ｇで遠心した上清を得た。
【００１７】（ｇIII を主成分とした分画の回収）上記
上清を陰イオン交換体（ファルマシア−ＬＫＢ社製：Ｄ
ＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ）および、ヘ
パリン結合カラム（ＴＯＳＯＨ社製：ＴＳＫｇｅｌ Ａ
Ｆ−ヘパリントヨパール６５０）を連結した両カラムに
かけた。そして、両カラムに吸着されない成分を洗い流
した後、０．２Ｍ ＮａＣｌを含んだ０．０１Ｍ Ｔｒ
ｉｓＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０でＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに吸着している成分（ｇＸを含まな
い）を溶出し、これをＴＳＫｇｅｌヘパリントヨパール
６５０に吸着させた。次に連結していたカラムをはず
し、ＴＳＫｇｅｌヘパリントヨパール６５０に吸着して
いる成分を２Ｍ ＮａＣｌを含んだ０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。この分画をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノブロッティン
グで解析した結果を図１に、その濃度分布のパターンを
図２に示した。
上清を陰イオン交換体（ファルマシア−ＬＫＢ社製：Ｄ
ＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ）および、ヘ
パリン結合カラム（ＴＯＳＯＨ社製：ＴＳＫｇｅｌ Ａ
Ｆ−ヘパリントヨパール６５０）を連結した両カラムに
かけた。そして、両カラムに吸着されない成分を洗い流
した後、０．２Ｍ ＮａＣｌを含んだ０．０１Ｍ Ｔｒ
ｉｓＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０でＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ＣＬ−６Ｂに吸着している成分（ｇＸを含まな
い）を溶出し、これをＴＳＫｇｅｌヘパリントヨパール
６５０に吸着させた。次に連結していたカラムをはず
し、ＴＳＫｇｅｌヘパリントヨパール６５０に吸着して
いる成分を２Ｍ ＮａＣｌを含んだ０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）で溶出した。この分画をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動及びイムノブロッティン
グで解析した結果を図１に、その濃度分布のパターンを
図２に示した。
【００１８】図１および図２の結果から明らかなよう
に、大部分の成分がｇIII で全体の６０％以上を含み、
ｇII、ｇｐ５０は少量検出されるのみで他のウイルス成
分は殆ど検出されなかった。
に、大部分の成分がｇIII で全体の６０％以上を含み、
ｇII、ｇｐ５０は少量検出されるのみで他のウイルス成
分は殆ど検出されなかった。
【００１９】（ワクチン抗原量の規定）ＰＲＶの糖蛋白
のうちｇIII のみがマウスの赤血球を凝集する性質を利
用してワクチン抗原量を規定した。すなわち、前記溶出
液をＶ字型アッセイプレート上で０．２％牛血清アルブ
ミンを含んだゼラチン−ベロナール緩衝液で階段希釈し
た。この２５μｌの希釈抗原液に等量の０．２％牛血清
アルブミンを含んだゼラチン−ベロナール緩衝液を加
え、同緩衝液で０．５％濃度になるように調整したマウ
ス赤血球を５０μｌ添加混合して室温で２時間感作し
た。赤血球が凝集し、Ｖ字型ウェルの底に沈降していな
いものを陽性とし、逆に沈降しているものを陰性とし
た。この溶出液中のｇIII 抗原量は陽性と判定されたウ
ェルの最大希釈倍数の逆数をもって表した。なお、３回
試験を行ない最低の値をそのワクチンに含まれているｇ
III 抗原量とし、そのうち５つのサンプルを表１に示
し、その抗原蛋白量も同表中に併記した。
のうちｇIII のみがマウスの赤血球を凝集する性質を利
用してワクチン抗原量を規定した。すなわち、前記溶出
液をＶ字型アッセイプレート上で０．２％牛血清アルブ
ミンを含んだゼラチン−ベロナール緩衝液で階段希釈し
た。この２５μｌの希釈抗原液に等量の０．２％牛血清
アルブミンを含んだゼラチン−ベロナール緩衝液を加
え、同緩衝液で０．５％濃度になるように調整したマウ
ス赤血球を５０μｌ添加混合して室温で２時間感作し
た。赤血球が凝集し、Ｖ字型ウェルの底に沈降していな
いものを陽性とし、逆に沈降しているものを陰性とし
た。この溶出液中のｇIII 抗原量は陽性と判定されたウ
ェルの最大希釈倍数の逆数をもって表した。なお、３回
試験を行ない最低の値をそのワクチンに含まれているｇ
III 抗原量とし、そのうち５つのサンプルを表１に示
し、その抗原蛋白量も同表中に併記した。
【００２０】
【表１】
【００２１】（アジュバントの添加およびマウスおよび
ブタにおける免疫効果と感染防御試験）コンポーネント
ワクチンの場合、アジュバントの助けがないとその効果
は、ワクチン抗原を非常に大量に生体内にいれなければ
現われない。そこで前記抗原とオイルアジュバントを
３：７の割合で混合し、マウス或いはブタに投与して免
疫効果及び防御効果を調べた。ここで、オイルアジュバ
ントの混合比は、親水性物質であるワクチン抗原を親油
性物質であるオイルアジュバントが効率的に包含する比
率とした。
ブタにおける免疫効果と感染防御試験）コンポーネント
ワクチンの場合、アジュバントの助けがないとその効果
は、ワクチン抗原を非常に大量に生体内にいれなければ
現われない。そこで前記抗原とオイルアジュバントを
３：７の割合で混合し、マウス或いはブタに投与して免
疫効果及び防御効果を調べた。ここで、オイルアジュバ
ントの混合比は、親水性物質であるワクチン抗原を親油
性物質であるオイルアジュバントが効率的に包含する比
率とした。
【００２２】マウスを用いた試験：ワクチン抗原量を前
記方法で測定し、１：３００００と１：３０００のｇII
I抗原をオイルアジュバントと３：７の割合で混合し、
２週間に期間を開けて２回、４週令のマウスの腹側皮下
に投与した。次の週に１０ＬＤ50のＰＲＶを腹腔内に投
与、攻撃した。この結果、それぞれ８０％、３０％の生
存率を示した。なお、主成分であるｇIII のみの成分量
を変えることは、製造方法上不可能なので全体の量を変
化させた。
記方法で測定し、１：３００００と１：３０００のｇII
I抗原をオイルアジュバントと３：７の割合で混合し、
２週間に期間を開けて２回、４週令のマウスの腹側皮下
に投与した。次の週に１０ＬＤ50のＰＲＶを腹腔内に投
与、攻撃した。この結果、それぞれ８０％、３０％の生
存率を示した。なお、主成分であるｇIII のみの成分量
を変えることは、製造方法上不可能なので全体の量を変
化させた。
【００２３】ブタを用いた試験：ワクチン中のｇIII 抗
原量を１：１５００００、１：１５０００に調製し、マ
ウスを用いたときと全く同様にオイルアジュバントと混
合してワクチンとした。
原量を１：１５００００、１：１５０００に調製し、マ
ウスを用いたときと全く同様にオイルアジュバントと混
合してワクチンとした。
【００２４】６週令の豚の頚部筋肉内に２週間の期間を
開けて２回接種した。次の週に１０００００ＴＣＩＤ50
または１０6 ＴＣＩＤ50のウイルスで経鼻攻撃した。そ
の後２週間、鼻粘膜スワブを採取しウイルス分離に供試
した。また、攻撃後２週目に殺処分し、扁桃からのウイ
ルス回収に供試した。この結果、ｇIII 抗原１：１５０
０００を含んだワクチン接種群は臨床症状を示さず耐過
生存し、鼻粘膜スワブ及び扁桃からウイルスは分離され
なかった。一方、１：１５０００のｇIII を含んだワク
チン接種群では一過性に臨床症状を示したが、耐過生存
した。鼻粘膜スワブ及び扁桃からは一部分離された。な
お、主成分であるｇIII のみの成分量を変えることは製
造方法上不可能なので全体の量を変化させた。
開けて２回接種した。次の週に１０００００ＴＣＩＤ50
または１０6 ＴＣＩＤ50のウイルスで経鼻攻撃した。そ
の後２週間、鼻粘膜スワブを採取しウイルス分離に供試
した。また、攻撃後２週目に殺処分し、扁桃からのウイ
ルス回収に供試した。この結果、ｇIII 抗原１：１５０
０００を含んだワクチン接種群は臨床症状を示さず耐過
生存し、鼻粘膜スワブ及び扁桃からウイルスは分離され
なかった。一方、１：１５０００のｇIII を含んだワク
チン接種群では一過性に臨床症状を示したが、耐過生存
した。鼻粘膜スワブ及び扁桃からは一部分離された。な
お、主成分であるｇIII のみの成分量を変えることは製
造方法上不可能なので全体の量を変化させた。
【００２５】次に、前記製法で得られたコンポーネント
ワクチンを接種した豚と、自然感染した豚を血清中の抗
体の有無によって識別する実験を行なった。
ワクチンを接種した豚と、自然感染した豚を血清中の抗
体の有無によって識別する実験を行なった。
【００２６】上記識別実験法としては、当該ワクチンに
含まれていないｇＸを抗原とした酵素免疫測定法（Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｄｓｏｒｂ
ｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）を採用し、豚の血清
中のｇＸに対する抗体価を測定した。判定は陽性となっ
た場合、自然感染であり、陰性の場合は感染がなかった
か或いはワクチン接種豚とした。
含まれていないｇＸを抗原とした酵素免疫測定法（Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｄｓｏｒｂ
ｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）を採用し、豚の血清
中のｇＸに対する抗体価を測定した。判定は陽性となっ
た場合、自然感染であり、陰性の場合は感染がなかった
か或いはワクチン接種豚とした。
【００２７】〔識別実験〕 （ｇＸ抗原の精製）用いる細胞はワクチン抗原の製造に
用いた細胞と異なるＲＫ−１３細胞を用いた。ＰＲＶを
接種して２４〜４８時間後に培養液を採取し、１０，０
０００×ｇの遠心をかけ、上清を得た。この上清を７０
％飽和硫安で塩析濃縮し、０．０１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ
緩衝液ｐＨ８．０中でゲル濾過をした。次にＤＥＡＥ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂを充填したカラムにか
け、吸着した成分を０．３ＭＮａＣｌを含んだ０．０１
Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出させ
た。最後に０．４Ｍ ＮａＣｌを含んだ同緩衝液で溶出
させ、この分画をｇＸ抗原とした。
用いた細胞と異なるＲＫ−１３細胞を用いた。ＰＲＶを
接種して２４〜４８時間後に培養液を採取し、１０，０
０００×ｇの遠心をかけ、上清を得た。この上清を７０
％飽和硫安で塩析濃縮し、０．０１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ
緩衝液ｐＨ８．０中でゲル濾過をした。次にＤＥＡＥ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂを充填したカラムにか
け、吸着した成分を０．３ＭＮａＣｌを含んだ０．０１
Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で溶出させ
た。最後に０．４Ｍ ＮａＣｌを含んだ同緩衝液で溶出
させ、この分画をｇＸ抗原とした。
【００２８】（ＥＬＩＳＡによる抗体測定）ｇＸ抗原を
０．５μｇ／５０μｌ／ｗｅｌｌになるように０．０５
Ｍ炭酸緩衝液で調製し、固相とした。１％牛血清アルブ
ミンを含むリン酸緩衝食塩液３００μｌ／ｗｅｌｌを加
え、３７℃、１時間インキュベートした。次に０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだリン酸緩衝食塩液（Ｔ−ＰＢ
Ｓ）でプレートを洗浄後、希釈した豚血清を５０μｌ加
え、３７℃、１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで
洗浄後、同緩衝液で希釈したペルオキシダーゼ標識抗ブ
タＩｇＧを５０μｌ加え、３７℃、１時間インキュベー
トした。反応後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、基質（ＡＢＳ
Ｔ）液を１００μｌ加え、２５℃、１時間インキュベー
トした。反応を同量の０．４Ｍ ＮａＯＨを加えて停止
させ、マイクロプレートオートリーダーを用いて４９２
ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．値）を測定し、結果を図３に示
した。
０．５μｇ／５０μｌ／ｗｅｌｌになるように０．０５
Ｍ炭酸緩衝液で調製し、固相とした。１％牛血清アルブ
ミンを含むリン酸緩衝食塩液３００μｌ／ｗｅｌｌを加
え、３７℃、１時間インキュベートした。次に０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだリン酸緩衝食塩液（Ｔ−ＰＢ
Ｓ）でプレートを洗浄後、希釈した豚血清を５０μｌ加
え、３７℃、１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで
洗浄後、同緩衝液で希釈したペルオキシダーゼ標識抗ブ
タＩｇＧを５０μｌ加え、３７℃、１時間インキュベー
トした。反応後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、基質（ＡＢＳ
Ｔ）液を１００μｌ加え、２５℃、１時間インキュベー
トした。反応を同量の０．４Ｍ ＮａＯＨを加えて停止
させ、マイクロプレートオートリーダーを用いて４９２
ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．値）を測定し、結果を図３に示
した。
【００２９】図３の結果から明らかなように、ワクチン
免疫豚の血清（●印）のＯＤ値は、０．３以下であっ
て、実験感染豚の血清（〇印）およびワクチン免疫豚の
実験感染後の血清（×印）のＯ．Ｄ．値と明瞭に区別で
きた。このようにして、豚血清中の中和抗体価とｇＸに
対するＥＬＩＳＡのＯＤ値測定との関係から、ワクチン
接種豚であるか、自然感染豚であるかの識別ができた。
免疫豚の血清（●印）のＯＤ値は、０．３以下であっ
て、実験感染豚の血清（〇印）およびワクチン免疫豚の
実験感染後の血清（×印）のＯ．Ｄ．値と明瞭に区別で
きた。このようにして、豚血清中の中和抗体価とｇＸに
対するＥＬＩＳＡのＯＤ値測定との関係から、ワクチン
接種豚であるか、自然感染豚であるかの識別ができた。
【００３０】
【効果】この発明は、以上説明したように、中和抗体の
誘起や細胞障害性Ｔ細胞の標的抗原であるブタヘルペス
１ウイルスの膜糖蛋白ｇIII を主成分とする多成分のコ
ンポーネントワクチンであるため、両免疫機構に充分に
働きかけてＰＲＶ感染防御に有効であり、しかも赤血球
凝集反応を示すので、有効成分の定量が可能である。ま
た、オイルアジュバントの添加が効率的であるため、生
体への安全性が高いものであり、しかもワクチン接種豚
と自然感染豚との識別も確実であり、理想的なオーエス
キー病のコンポーネントワクチンとして、本病の蔓延防
止に大きく貢献するものであるといえる。
誘起や細胞障害性Ｔ細胞の標的抗原であるブタヘルペス
１ウイルスの膜糖蛋白ｇIII を主成分とする多成分のコ
ンポーネントワクチンであるため、両免疫機構に充分に
働きかけてＰＲＶ感染防御に有効であり、しかも赤血球
凝集反応を示すので、有効成分の定量が可能である。ま
た、オイルアジュバントの添加が効率的であるため、生
体への安全性が高いものであり、しかもワクチン接種豚
と自然感染豚との識別も確実であり、理想的なオーエス
キー病のコンポーネントワクチンとして、本病の蔓延防
止に大きく貢献するものであるといえる。
【図１】イムノブロッティングで解析したＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動像
アクリルアミドゲル電気泳動像
【図２】図１の濃度分布のパターンを示すグラフ
【図３】ＥＬＩＳＡ ＯＤ値と中和抗体価の関係を示す
グラフ
グラフ
Claims (3)
- 【請求項１】 ブタヘルペス１ウイルスの膜糖蛋白ｇII
I を主成分とするコンポーネントワクチン。 - 【請求項２】 マーカーとして膜糖蛋白ｇＸが除去され
た請求項１記載のコンポーネントワクチン。 - 【請求項３】 ブタヘルペス１ウイルス感染細胞を界面
活性剤で可溶化し、その遠心上清をヘパリン結合カラム
および陰イオン交換体カラムにかけて膜糖蛋白ｇIII を
主成分としかつ膜糖蛋白ｇＸが除去された分画とし、こ
の分画にオイルアジュバントを添加する請求項１または
２記載のコンポーネントワクチンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22285891A JPH05246888A (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | コンポーネントワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22285891A JPH05246888A (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | コンポーネントワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05246888A true JPH05246888A (ja) | 1993-09-24 |
Family
ID=16789000
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22285891A Pending JPH05246888A (ja) | 1991-09-03 | 1991-09-03 | コンポーネントワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05246888A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997023502A1 (fr) * | 1995-12-21 | 1997-07-03 | Solvay (Societe Anonyme) | Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique |
| BE1010344A3 (fr) * | 1996-06-12 | 1998-06-02 | Solvay | Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique. |
-
1991
- 1991-09-03 JP JP22285891A patent/JPH05246888A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JOURNAL OF VIROLOGY=1984 * |
| JOURNAL OF VIROLOGY=1990 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997023502A1 (fr) * | 1995-12-21 | 1997-07-03 | Solvay (Societe Anonyme) | Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique |
| BE1010344A3 (fr) * | 1996-06-12 | 1998-06-02 | Solvay | Vaccin plasmidique contre le virus pseudorabique. |
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