PT100245B - Sequencia de adn que codifica um derivado de factor viii humano recombinante, biologicamente activo, vector de expressao recombinante, celula hospedeira, processo de producao de um derivado de factor vii e derivado de factor viii - Google Patents

Sequencia de adn que codifica um derivado de factor viii humano recombinante, biologicamente activo, vector de expressao recombinante, celula hospedeira, processo de producao de um derivado de factor vii e derivado de factor viii Download PDF

Info

Publication number
PT100245B
PT100245B PT100245A PT10024592A PT100245B PT 100245 B PT100245 B PT 100245B PT 100245 A PT100245 A PT 100245A PT 10024592 A PT10024592 A PT 10024592A PT 100245 B PT100245 B PT 100245B
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
factor viii
derivative
kda
human factor
dna
Prior art date
Application number
PT100245A
Other languages
English (en)
Other versions
PT100245A (pt
Inventor
Eva Maria Hellstroem
Peter Lind
Helena Inga Sandberg
Jack Spira
Mona Sydow-Backman
Annelie B Almstedt
Catherine Ljung
Helena Wiman
Original Assignee
Pharmacia & Upjohn Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pharmacia & Upjohn Ab filed Critical Pharmacia & Upjohn Ab
Publication of PT100245A publication Critical patent/PT100245A/pt
Publication of PT100245B publication Critical patent/PT100245B/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 100 245
REQUERENTE:KABI PHARMACIA AB, sueca, com sede em S-112
Stockholm, Suécia
EPÍGRAFE: Derivados de factor VIII humano recombinante e seu processo de produção
INVENTORES: Annelie B. Almstedt, Eva Maria Hellstróm,
Peter Lind, Catherine Ljung, Helena Inga Sand berg, Jack Spira, Mona Sydow-Bãckman e Helena Wiman
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Suécia em 15 de Março de 1991 sob ο ηθ 9100799-7.
MOD Ί3 RF 16732
720
LG/2928206
PATENTE N2 100 245
Derivados de factor VIII humano recombinante e seu processo de produção
RESUMO presente invento refere-se a uma sequência de ADN que codifica um derivado de factor VIII humano, recombinante, biologicamente activo, compreendendo um primeiro segmento de ADN que codifica a cadeia de 90 kDa do factor VIII humano e um segundo segmento de ADN que codifica a cadeia de 80 kDa do factor VIII humano, sendo os referidos segmentos interligados por um segmento de ADN ligador codificando um péptido ligador de 2 a 10 resíduos de aminoácido seleccionados de entre lisina e arginina.
O invento refere-se ainda a um vector de expressão recombinante compreendendo essa sequência de ADN; a células hospedeiras de origem animal transformadas com esse vector de expressão recombinante; a um processo para a produção de um derivado do factor VIII humano recombinante; e a um derivado do factor VIII humano contendo a cadeia pesada e a cadeia leve ligadas por uma ligação de ião metálico.
720
LG/2928206
MEMÓRIA DESCRITIVA
O presente invento refere-se a sequências de ADN que codificam derivados de factor VIII humano, recombinantes, biologicamente activos, a vectores de expressão recombinantes contendo as referidas sequências de ADN, a células hospedeiras transformadas com os referidos vectores de expressão recombinantes, e a processos para a produção dos derivados de factor VIII humano recombinantes. 0 invento também abrange derivados de factor VIII humano compreendendo dois polipéptidos ligados por uma ponte de ião metálico.
ANTECEDENTES DO INVENTO
A hemofilia clássica ou hemofilia A é a mais comum das doenças hemorrágicas hereditárias. Resulta de uma deficiência do factor VIII da coagulação sanguínea ligada ao cromossoma X, e afecta quase exclusivamente o sexo masculino, com uma incidência entre um a dois indivíduos por cada 10 000. 0 defeito no cromossoma X é transmitido pelas mulheres portadoras, as quais não são, elas próprias, hemofílicas. A manifestação clínica da hemofilia A é uma tendência hemorrágica anormal, e antes do tratamento com concentrados de factor VIII ter sido introduzido, a expectativa de vida para uma pessoa com hemofilia era inferior a 20 anos. 0 uso de concentrados de factor VIII do plasma melhorou consideravelmente a situação para os doentes hemofílicos. A expectativa média de vida aumentou amplamente, fornecendo à maior parte deles a possibilidade de viverem uma vida praticamente normal. No entanto, surgiram alguns problemas com os concentrados derivados do plasma e com o seu uso, sendo os mais sérios de entre eles a transmissão de vírus. Até ao momento, os vírus causadores de SIDA, hepatite B, e hepatite não A não B, atingiram seriamente a população. Embora tenham sido recentemente desenvolvidos processos para a inactivação dos diferentes vírus e novos concentrados de factor VIII altamente purificados, não podem ser dadas quaisquer garantias sobre a ausência de contaminação virai. Além disso, os concentrados de factor VIII são bastante dispendiosos dado o abastecimento
720
LG/2928206
-3limitado de matéria prima de plasma humano.
Um produto de factor VIII derivado de material recombinante provavelmente resolverá uma grande parte dos problemas associados com o uso de concentrados de factor VIII derivados do plasma no tratamento da hemofilia A, e vários grupos estão presentemente a trabalhar no desenvolvimento de um tal produto. No entanto, o desenvolvimento de um factor VIII recombinante encontrou algumas dificuldades, por exemplo, o problema da obtenção de níveis de produção com rendimentos suficientemente elevados, em particular no què se refere à molécula de comprimento total.
No plasma fresco preparado na presença de inibidores da protease, o factor VIII mostrou possuir uma massa molecular de 280 kDa e ser composto por duas cadeias polipeptídicas de 200 kDa e 80 kDa, respectivamente (Andersson, L-O., et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 2979-2983). Estas cadeias são mantidas juntas por pontes de ião metálico. Formas mais ou menos proteoliticamente degradadas da molécula de factor VIII podem ser encontradas como fragmentos activos no material de factor VIII purificado dos concentrados comerciais (Andersson, L-0. et al., ibid.; Andersson, L-O. et al. (1985) EP 0197901). A forma fragmentada de factor VIII possuindo massas moleculares de 260 kDa até 170 kDa, é constituída por uma cadeia pesada com uma massa molecular variando de 180 kDA até 90 kDa, onde todas as variantes apresentam terminais amino idênticos, em combinação com uma cadeia leve de 80 kDa. A região do terminal amino da cadeia pesada é idêntica à do polipéptido de factor VIII de cadeia simples que pode ser deduzida a partir dos dados da sequência de nucleótidos do ADNc do factor VIU (Wood, W.I. et al. (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G.A. et al. (1984) Nature 312, 337-342).
A forma activa mais pequena de factor VIII, com uma massa molecular de 170 kDA, é constituída por uma cadeia de 90 kDA e por uma cadeia de 80 kDA, pode ser activada pela trombina no mesmo grau que as formas de massa molecular mais elevada, e
720
LG/2928206
-4consequentemente representa uma forma não activada. Também se mostrou que apresenta actividade biológica integral in vivo tal como avaliado em cães hemofílicos (Brinkhous, K.M. et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 8752-8756). Assim, a eficácia hemostática da forma de 170 kDa é igual à das formas de factor VIII de massa molecular elevada.
facto de a região intermédia, densamente glicosada, da cadeia polipeptídica de factor VIII situada entre os aminoácidos Arg-740 e Glu-1649 não parecer ser necessária para a actividade biológica integral, impeliu diversos investigadores a tentarem produzir derivados de factor VIII recombinante sem esta região. Isto foi conseguido por delecção, parcial ou total, de uma porção do ADNc que codifica a região intermédia, densamente glicosada, do factor VIII.
Por exemplo, J.J. Toole et al. descreveram a construção e expressão do factor VIII sem os aminoácidos 982 a 1562, e 760 a 1639, respectivamente (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) 83, 5939-5942). D.L. Eaton et al. descreveram a construção e expressão do factor VIII sem os aminoácidos 797 a 1562 (Biochemistry (1986) 25, 8343-8347). R.J. Kaufman descreveu a expressão do factor VIII sem os aminoácidos 741 a 1646 (Pedido PCT na WO 87/04187). N. Sarver et al. descreveram a construção e expressão do factor VIII sem os aminoácidos 747 a 1560 (DNA (1987) 6, 553-564). M. Pasek descreveu a construção e expressão do factor VIII sem os aminoácidos 745 a 1562, e sem os aminoácidos 741 a 1648, respectivamente (Pedido PCT n2 88/00831). K-D. Lagner descreveu a construção e expressão do factor VIII sem os aminoácidos 816 a 1598, e sem os aminoácidos 741 a 1689, respectivamente (Behring Inst. Mitt. (1988) N282, 16-25, EP 295597). P. Meulien et al. descreveram a construção e expressão do factor VIII sem os aminoácidos 868 a 1562, e sem os aminoácidos 771 a 1666, respectivamente (Protein Enqineerinq (1988) 2(4), 301-306, EP 0 303 540 Al). Aquando da expressão destas formas com delecção do ADNc do factor VIII em células de mamífero, o nível de produção é tipicamente 10 vezes mais elevado quando comparado com o do factor VIII de comprimento
720
LG/2928206
-5total.
Além disso, foram feitas tentativas para expressar as cadeias de 90 kDa e de 80 kDa separadamente a partir de dois derivados do ADNc diferentes, na mesma célula (Burke, R.L. et al. (1986), J. Biol. Chem., 261, 12574-12578; Pavirani, A. et al. (1987), Biochem. Biophvs. Res. Comm. , 145, 234-240). No entanto, neste sistema, a reconstituição in vivo parece apresentar uma eficiência limitada em termos de actividade do factor VIII:C recuperada.
Este invento descreve moléculas de ADNc do factor VIII com delecção que codificam derivados do factor VIII recombinantes, correspondentes, no que se refere à massa molecular e a outras características bioquímicas, a uma forma previamente derivada do factor VIII plasmático presente nos concentrados comerciais em quantidades apreciáveis (Andersson, L-0. et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 2979-2983). Estes novos derivados do ADNc do factor VIII com delecção provavelmente fornecerão rendimentos suficientemente elevados de proteína de factor VIII recombinante para serem utilizados num processo industrial de preparação farmacêutica do factor VIII recombinante.
DEFINIÇÕES UTILIZADAS
Nas secções seguintes, o termo derivado do factor VIII por delecção é definido como uma ou mais cadeias polipeptídicas, apresentando actividade de factor VIII:C, derivadas do polipéptido de factor VIII de comprimento total com 2332 aminoácidos, por delecção de um segmento compreendendo os aminoácidos 741 a 1648, e por substituição do referido segmento por um segmento ligador constituído, pelo menos, por três aminoácidos básicos, isto é, seleccionados de entre lisina e arginina. 0 termo factor VIII:RE é definido como uma cadeia polipeptídica derivada do factor VIII de comprimento total sem os aminoácidos 741 a 1648. 0 termo factor VIII:QD é definido como uma cadeia polipeptídica derivada do factor VIII de comprimento total sem os aminoácidos 745 a 1562. O termo factor
720
LG/2928206 —6—
VIII:R3 é definido como um polipéptido sem os aminoácidos 741 a 1648, com o referido segmento substituído por dois resíduos de arginina. 0 termo factor VIII:R4 é definido como um polipéptido sem os aminoácidos 741 a 1648, com o referido segmento substituído por três resíduos de arginina. o termo factor VIII:R5 é definido como um polipéptido sem os aminoácidos 741 a 1648, com o referido segmento substituído por quatro resíduos de arginina.
DESCRIÇÃO DO INVENTO
O presente invento refere-se a técnicas para a produção de proteínas apresentando actividade de factor VIII:C. Mais especificamente, o presente invento proporciona sequências do ADNc do factor VIII modificadas, derivadas do ADNc do factor VIII de comprimento total, que por expressão em células animais originam a produção, em nível elevado, de proteínas com actividade de factor VIII:C, constutuídas essencialmente por duas cadeias polipeptídicas possuindo uma massa molecular de 90 kDa e de 80 kDa, respectivamente.
Assim, o presente invento proporciona uma sequência de ADN que codifica um derivado de factor VIII humano, recombinante, biologicamente activo, compreendendo um primeiro segmento de ADN que codifica a cadeia de 90 kDa do factor VIII humano e um segundo segmento de ADN que codifica a cadeia de 80 kDa do factor VIII humano, estando os referidos segmentos interligados por um segmento de ADN ligador codificando um péptido ligador de, pelo menos, 2 resíduos de aminoácido, seleccionados de entre lisina e arginina.
Embora o comprimento do péptido ligador codificado pelo referido segmento de ADN ligador não seja crítico, prefere-se que não contenha mais do que 10 resíduos de aminoácido.
É particularmente preferido que o péptido ligador seja constituído por 2, 3 ou 4 resíduos de aminoácido, particularmente 3 ou 4 resíduos de aminoácido. É especialmente
720
LG/2928206
preferido que o resíduo de aminoácido precedendo a Glu-1649 seja constituído por arginina.
De acordo com o presente invento é preferido que todos os resíduos de aminoácido que formam o péptido ligador sejam resíduos de arginina.
Deverá notar-se que o péptido ligador é construído a partir de aminoácidos básicos, nomeadamente resíduos de arginina e/ou lisina. De entre estes dois são preferidos os resíduos de arginina.
invento também se refere a um vector de expressão recombinante que contém uma unidade de transcrição compreendendo a sequência de ADN anteriormente delineada e, para além disso, um promotor e uma sequência de sinal de poliadenilação.
invento também se refere a células hospedeiras de origem animal transformadas com o vector de expressão recombinante definido como anteriormente.
Adicionalmente, o invento proporciona um processo para a produção de um derivado de factor VIII humano, recombinante, biologicamente activo como anteriormente descrito, compreendendo o referido processo a cultura de uma linha celular de origem animal, transformada com o vector de expressão recombinante definido como anteriormente, num meio nutriente que permite a expressão e secreção de um derivado de factor VIII humano composto pelo domínio de 90 kDa e, ligado a ele por uma ligação de ião metálico, o domínio de 80 kDa, sendo então o referido derivado expresso recuperado do meio de cultura.
Finalmente, o invento proporciona um derivado de factor VIII humano compreendendo a cadeia de 90 kDa e, ligada a ela, opcionalmente por meio do péptido ligador ou de uma sua parte, por uma ponte de ião metálico, a cadeia de 80 kDa do factor VIII humano.
720
LG/2928206
—8—
A fim de se obter uma proteína com actividade de factor VIII:C constituída pelas cadeias polipeptídicas anteriores, a cadeia polipeptídica simples criada durante a tradução in vivo tem de ser clivada por processamento pós-tradução durante o processo biossintético na célula produtora, por processamento proteolítico in vitro, ou por ambos. Dado que uma proteína com actividade de factor VIII:C, constituída por duas cadeias polipeptídicas com massa molecular de 200 kDa e de 80 kDa, pode ser isolada a partir do plasma humano, presume-se que existe um local de clivagem apropriado para o processamento pelos enzimas na cadeia simples do produto da tradução primário do factor VIII de comprimento total. Um local de processamento in vivo importante encontra-se muito provavelmente localizado no lado do terminal carboxilo da Arg-1648. Durante a maturação proteolítica, a clivagem na Arg-1648 origina uma proteína de factor VIII constituída pelas cadeias anteriores com massa molecular de 200 kDa e de 80 kDa. Dado que a Arg-1648 parece estar localizada numa fronteira entre domínios estruturais na molécula de factor VIII, pode constituir um alvo estereoquimicamente acessível para o processamento pelo enzima ou pelos enzimas. Pode existir um outro local de processamento na Arg-740, o qual originará a conversão in vitro da cadeia de 200 kDa numa cadeia de 90 kDa, originando assim a forma de 90 kDa e 80 kDa do factor VIII, presente nos concentrados comerciais de factor VIII derivados de plasma humano. De acordo com o presente invento, verificou-se que, a fim de produzir os derivados do factor VIII por delecção que podem ser processados, in vivo ou in vitro, em proteínas constituídas por duas cadeias polipeptídicas com massa molecular de 90 kDa e 80 kDa, a cadeia polipeptídica de 908 aminoácidos que interliga Arg-740 e Glu-1649 na proteina de factor VIII de comprimento total, pode ser substituída por, pelo menos, três resíduos de aminoácidos básicos, isto é, resíduos de lisina ou arginina ou ambos. Preferivelmente, o aminoácido no lado do terminal amino da Glu-1649 deve ser um resíduo de arginina.
A produção das proteínas de factor VIII, constituídas por duas cadeias polipeptídicas de acordo com o anteriormente
720
LG/2928206
-9exposto, em níveis elevados em células hospedeiras adequadas, exige a montagem dos ADNc dos derivados de factor VIII por delecção em unidades transcricionais eficientes em conjunto com elementos reguladores adequados num vector de clonagem, que pode ser propagado em E. coli de acordo com processos conhecidos dos peritos na arte. Elementos reguladores transcricionais eficazes podem ser derivados de vírus que têm células animais como os seus hospedeiros naturais ou do ADN cromossómico de células animais. Preferivelmente, podem ser utilizadas combinações de promotor-intensificador derivadas do Vírus de Símio 40, adenovírus, vírus de polioma de BK, citomegalovírus humano, ou da repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous, ou combinações de promotor-intensificador incluindo genes transcritos constitutivamente de modo forte em células animais como betaactina ou GRP78. A fim de se conseguirem atingir níveis elevados estáveis de ARNm transcrito a partir dos ADNc de factor VIII, a unidade transcricional deve conter, na sua parte proximal 3', uma região de ADN codificando uma sequência transcricional de terminação-poliadenilação. Preferivelmente, esta sequência deriva da região transcricional precoce do Vírus de Símio 40, do gene da beta-globina de coelho ou do gene do activador do plasminogénio tissular humano.
Os ADNc de factor VIII assim montados em unidades transcricionais eficazes são de seguida introduzidos num organismo hospedeiro adequado para expressão das diferentes proteínas de factor VIII. Preferivelmente este organismo deve ser uma linha de células animais de origem vertebrada a fim de assegurar a conecção da dobragem, formação de ligações dissulfeto, glicosação ligada à asparagina e de outras modificações pós-tradução, bem como a secreção para o meio de cultura. Exemplos de outras modificações pós-tradução incluem a O-sulfatação da tirosina e o processamento proteolítico da cadeia polipeptídica nascente essencial para a formação das moléculas de factor VIII com duas cadeias de 90 kDa e 80 kDa. Exemplos de linhas celulares que podem ser utilizadas incluem células COS de macaco, células L de ratinho, células C127 de ratinho, células BHK-21 de hamster, células 293 de rim embrionário humano e, preferivelmente, células de CHO.
720
LG/2928206 —10—
As unidades transcricionais que codificam os ADNc de factor VIII podem ser introduzidas na linha de células animais de diferentes maneiras. Por exemplo, podem ser criados recombinantes das unidades de transcrição anteriores e vectores baseados em vírus de animais diferentes. Exemplos destes são os vectores baseados em baculovírus, vírus da vacina, adenovírus, e preferivelmente vírus de papiloma de bovino.
As unidades de transcrição que codificam os ADNc de factor VIII também podem ser introduzidas em células animais em conjunto com outro gene recombinante que pode actuar como um marcador seleccionável dominante nestas células, a fim de facilitar o isolamento de clones de células específicos que integraram o ADN recombinante no seu genoma. Exemplos deste tipo de genes marcadores seleccionáveis dominantes incluem aminoglicósido-fosfotransferase de Tn5, conferindo resistência à Geneticina (G418), higromicina-fosfotransferase, conferindo resistência à higromicina e puromicina-acetil-transferase, conferindo resistência à puromicina. A unidade transcricional que codifica um tal marcador seleccionável pode localizar-se no mesmo vector que codifica o ADNc de factor VIII ou pode ser codificada num vector distinto, que é introduzido e integrado simultaneamente no genoma da célula hospedeira, originando frequentemente uma ligação física forte entre as diferentes unidades transcricionais.
Outros tipos de genes marcadores seleccionáveis que podem ser utilizados em conjunto com os ADNc de factor VIII baseiam-se em diversas unidades de transcrição que codificam a di-hidrofolato redutase (dhfr). Após a introdução deste tipo de gene em células sem actividade endógena de dhfr, preferivelmente células CHO (DUKX-B11, DG-44), ela habilita-las-à a cresceram num meio isento de nucleósidos. Um exemplo de um tal meio é o F12 de Ham sem hipoxantina, timidina e glicina. Estes genes de dhfr podem ser introduzidos em conjunto com as unidades transcricionais dos ADNc de factor VIII nas células CHO do tipo anterior, ligados no mesmo vector ou em vectores diferentes, criando desse modo linhas celulares positivas para dhfr,
720
LG/2928206
produtoras da proteína de factor VIII recombinante.
Se as linhas celulares anteriores são cultivadas na presença do inibidor da dhfr citotóxico metotrexato, surgirão novas linhas celulares resistentes ao metotrexato. Estas linhas celulares podem produzir proteína de factor VIII recombinante a uma taxa aumentada devido ao número amplificado de unidades transcricionais de dhfr e factor VIII ligadas. Aquando da propagação destas linhas celulares em concentrações crescentes de metotrexato (1-10000 nM), podem ser obtidas novas linhas celulares que produzem a proteína de factor VIII a taxas muito elevadas.
As linhas celulares anteriores produtoras da proteína de factor VIII podem ser cultivadas em grande escala, em cultura em suspensão ou em vários suportes sólidos. Exemplos destes suportes incluem microportadores baseados em matrizes de dextrano ou colagéneo ou suportes sólidos sob a forma de fibras ocas ou de vários materiais cerâmicos. Quando cultivadas em cultura em suspensão ou em microportadores, a cultura das linhas celulares anteriores pode ser executada como uma cultura em descontínuo ou como uma cultura em perfusão com produção contínua de meio condicionado durante períodos de tempo prolongados. Assim, de acordo com o presente invento, as linhas celulares anteriores estão bem adaptadas para o desenvolvimento de um processo industrial para a produção de factor VIII recombinante, que corresponde ao factor VIII autêntico de duas cadeias polipeptídicas (90 kDa e 80 kDa) que pode ser isolado a partir do plasma humano.
A proteína de factor VIII recombinante que se acumula no meio de células CHO do tipo anterior, pode ser concentrada e purificada por uma variedade de processos bioquímicos, incluindo processos que utilizam diferenças no tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade, afinidade específica, etc., entre a proteína de factor VIII recombinante e outras substâncias no meio de cultura das células.
720
LG/2928206
-12Um exemplo de uma tal purificação é a adsorção da proteína de factor VIII recombinante a um anticorpo monoclonal, que é imobilizado num suporte sólido. Depois da dessorção, a proteína de factor VIII pode ser adicionalmente purificada por uma variedade de técnicas cromatograficas baseadas nas propriedades anteriores.
As proteínas recombinantes com actividade de factor VIII descritas neste invento podem ser formuladas em preparações farmacêuticas para uso terapêutico. As proteínas de factor VIII purificadas podem ser dissolvidas em soluções tampão aquosas fisiologicamente compatíveis, convencionais, às quais podem ser adicionados, opcionalmente, adjuvantes farmacêuticos a fim de originar preparações farmacêuticas.
presente invento será adicionalmente descrito com maior detalhe nos exemplos seguintes, não limitativos. Esta descrição de concretizações específicas do invento será feita em conjunto com os desenhos em anexo, nos quais:
a Figura 1 é uma representação esquemática da relação entre o factor VIII de comprimento total e o factor VIII:R3, factor VIII:R4, e factor VIII:R5, respectivamente. Está representada a estrutura primária da região entre o terminal C da cadeia de 90 kDa (Arg-740) e o terminal N da cadeia de 80 kDa (Glu-1649);
a Figura 2 é uma ilustração do plasmídeo pKGE491 contendo o ADNc do factor VIII:R3 sob o controlo transcricional do promotor de citomegalovírus humano;
a Figura 3 é uma ilustração do plasmídeo pKGE674 contendo o ADNc do factor VIII:R4 sob o controlo transcricional do promotor GRP78 humano, e de uma unidade transcricional adicional codificando o ADNc de di-hidrofolato redutase de ratinho sob o controlo transcricional da repetição terminal longa do vírus de tumor mamário de ratinho;
a Figura 4 é uma ilustração do plasmídeo pKGE672 contendo o
720
LG/2928206
-13ADNc do factor VIII:R5 sob o controlo transcricional do promotor GRP78 humano, e a di-hidrofolato redutase de ratinho semelhante ao vector representado na Figura 3;
a Figura 5 é uma ilustração do plasmídeo pKGE327 contendo apenas a unidade transcricional do ADNc de di-hidrofolato redutase de ratinho (c.f. Figura 3);
a Figura 6 é uma ilustração da imunotransferência do factor VIII:R3, factor VIII:R4, factor VIII:R5 e factor VIII derivado do plasma, após electroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de sódio. Faixa A: factor VIII plasmático. Faixa B: factor VIII:R3. Faixa C: factor VIII:R4. Faixa D: factor VIII:R5. Faixa St: padrão de massa molecular de BRL, de gama elevada, pré-corado de Bethesda Research Laboratories;
a Figura 7 representa um diagrama sobre as alterações na actividade de factor VIII do factor recombinante VIII:R5 após incubação com α-trombina humana;
a Figura 8 ilustra as alterações nos padrões da SDS-PAGE e da imunotransferência do factor recombinante VIII:R5 após incubação com α-trombina humana (0,01 unidades NIH de trombina/1 IU de factor VIII:C).
EXEMPLO 1
Foi construída uma série de derivados por delecção do ADNc do factor VIII que codificam cadeias polipeptídicas desprovidas de todo o domínio B, mas contendo números diferentes de aminoácidos básicos ligando o terminal carboxilo da cadeia pesada ao terminal amino da cadeia leve. Estes derivados por delecção do factor VIII são submetidos a processamento proteolítíco in vivo do produto da tradução primário em duas cadeias polipeptídicas. Nos exemplos fornecidos abaixo, a nomenclatura dos aminoácidos refere-se a posições dadas na molécula de factor VIII de comprimento total sem a sequência de sinal.
720
LG/2928206 —14—
Mutaqénese do ADNc do factor VIII para criar o factor VIII:R3 por deleccão
Um fragmento de restrição de Kpnl-PstI de 627 pares de bases, obtido a partir do ADNc de um derivado por delecção do factor VIII (factor VIII:RE, M. Pasek, pedido PCT na WO 88/00831, ATCC 53517), que codifica os aminoácidos Leu-587 até Ala-1702 ligado por intermédio de uma fusão directa entre a Arg-740 e a Glu-1649 do factor VIII de comprimento total, foi introduzido no vector de bacteriófago M13mpl9 (Yanish-Perron, C. et al. (1985), Gene 33, 103-119) de acordo com processos comuns. Foi executada uma mutagénese dirigida ao oligonucleótido (Nakamaye, K. e Eckstein, F. (1986), Nucleic Acids Res. 14, 9679-9698) num molde de ADN de cadeia simples preparado a partir do bacteriófago recombinante anterior. Dez pg de ADN de fago de cadeia simples, circular, purificado, foram temperados (annealed”) com a 8 pmoles de um oligonucleótido fosforilado em 5' da sequência:
' -AACAATGCCATTGAACCAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACTACTCTTCAG-3 '
A segunda cadeia de ADN circular foi sintetizada sobre o molde resultante por adição de todos os quatro desoxinucleótidos, dCTPaS, 12 unidades do fragmento de Klenow da ADN-polimerase I, e 12 unidades da ADN-ligase de T4. Após incubação durante toda a noite a 16°C, a mistura reaccional foi enriquecida quanto ao ADN de cadeia dupla por filtração através de nitrocelulose na presença de NaCl 500 mM. Um quinto do ADN de cadeia dupla purificado foi entalhado (nicked) por incubação com 5 unidades do enzima de restrição Ncil, tratado por 50 unidades de Exonuclease III num grau tal que a cadeia do molde de ADN do fago foi parcialmente removida. O duplex parcial resultante foi transformado em cadeia dupla por tratamento com 3 unidades de ADN-polimerase I e 2 unidades de ADN-ligase de T4 na presença dos quatro desoxinucleótido-trifosfatos, a 16°C durante 3 horas. Um quarto da mistura resultante foi utilizado para transformar 300 pl de E. coli TG1 competente. Dos clones de fago mutagenizados resultantes, dez foram submetidos a sequenciamento do ADN por didesoxi (Sanger, F. et al. (1977),
720
LG/2928206
-15Proc. Natl Acad. Sei. USA 74, 5463-5467). Um dos clones de fago sequenciados continha uma inserção com a sequência de nucleótidos esperada ditada pelo iniciador mutagénico anterior. Assim, a inserção do fago é constituída por um fragmento de Kpnl-PstI de 630 pares de bases do ADNc do factor VIII que codifica uma fusão entre a Arg-740 e a Glu-1649 por meio de dois resíduos de Arg suplementares (factor VIII:R3).
Construção de um Vector de Expressão de Mamífero que codifica o factor VIII:R3 fragmento de Kpnl-PstI de 630 pares de bases que codifica a fusão do factor VIII:R3 de acordo com o que foi acima exposto, foi excisado da forma replicativa de cadeia dupla do ADN do fago M13mpl9 e introduzido no vector pKGE431. Este vector é constituído por um fragmento de Kpnl-Sphl de 2046 pares de bases do ADNc do factor VIII:RE (M. Pasek, pedido PCT n2 WO 88/00831, ATCC 53517), que codifica os aminoácidos Leu-587 até Met-2176 da proteína de factor VIII:RE no pUC19. 0 fragmento de 630 pares de bases que codifica a fusão do factor VIII:R3 de acordo com o que foi acima exposto, foi introduzido no pKGE431 que tinha sido completamente clivado por Kpnl e parcialmente clivado por PstI. 0 vector resultante, pKGE490, contém uma inserção de Kpnl-Sphl de 2052 pares de bases que codifica os aminoácidos Leu-587 até Met-2176 do factor VIII:RE. 0 pKGE490 foi digerido com Kpnl e Apal, e o fragmento de 1665 pares de bases correspondente que codifica desde Leu-587 até Ala-2047 da proteína de factor VIII:RE foi ligado ao fragmento grande do vector pKGE347 que tinha sido digerido com Kpnl e Apal. 0 vector pKGE347 que se baseia no vector de clonagem de E. coli pBR327, é constituído pelo intensificador/promotor de citomegalovírus humano codificado num segmento de ADN de 741 pares de bases (nucleótidos nas posições -671 a +71, Boshart, M. et al. (1985), Cell 41, 521-530) a montante do ADNc do Factor VIII:QD com o intrão do antigénio t de SV40 e a sequência de poliadenilação na porção proximal 3'. 0 vector resultante (pKGE491), que se encontra representado na Figura 2, contém o ADNc do factor VIII:R3 completo e é idêntico ao pKGE347, excepto no que se
720
LG/2928206
refere ao derivado por delecção do factor VIII diferente que é codificado.
Mutagénese do ADNc do factor VIII para criar o factor VIII:R4 por delecção
O fragmento de Kpnl-PstI de 630 pares de bases que codifica parte do ADNc do factor VIII:R3 de acordo com o anteriormente exposto, foi introduzido no vector pUC19 que tinha sido aberto pelos mesmos enzimas. O vector resultante, denominado pKGE657, foi então submetido a mutagénese dirigida ao local por extensão de sobreposição utilizando a reacção em cadeia de polimerase (Ho, S.N. et al. (1989), Gene 77, 51-59; Saiki, R.K. et al. (1988) Science 239, 487-491). Na primeira parte da reacção de mutagénese, foram executadas duas experiências paralelas. Na experiência número 1, 100 ng do plasmídeo pKGE657 foram misturados com 1 μΜ de cada um dos dois iniciadores seguintes:
'-ATTGAACCAAGAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACT-3·
5’-GATAACAATTTCACACA-3'
A isto, num volume reaccional final de 100 μΐ, foram adicionados KC1 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl2 1,5 mM, 0,01 % de gelatina, 200 μΜ de cada um dos quatro desoxinucleótidos, e 2,5 unidades de polimerase Taq. As amostras foram submetidas a 25 ciclos de desnaturação a 94°C durante 1 min., tempera a 50°C durante 2 min, e extensão a 72°c durante 3 min, utilizando um ciclizador térmico de ADN de acordo com as especificações do fabricante (Perkin Elmer Cetus). A análise dos produtos reaccionais com electroforese em gel de agarose e coloração com brometo de etídio de acordo com os procedimentos comuns, indicou a formação de um produto de ADN amplificado simples com o comprimento de 240 pares de bases. Na experiência número 2, a reacção em cadeia de polimerase foi executada duma forma idêntica, utilizando os dois iniciadores seguintes:
5·-AGTACGAGTTATTTCTCTTCTTCTTCTTGGTTCAAT-3'
5*-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3·
720
LG/2928206
A análise dos produtos reaccionais com electroforese em gel de agarose indicou a formação de um produto de ADN amplificado simples com o comprimento de 550 pares de bases. Na segunda parte da mutagénese, 10 μΐ de cada uma das misturas de produtos das duas experiências paralelas anteriores foram combinados numa terceira reacção em cadeia de polimerase num volume total de 100 μΐ, sob condições idênticas às anteriores, com a excepção de por terem sido utilizados apenas os dois iniciadores seguintes:
5·-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3·
5'-GATAACAATTTCACACA-3 7
A análise da mistura reaccional com electroforese em gel de agarose indicou a formação de um produto de ADN amplificado simples com o comprimento de 750 pares de bases. Este fragmento de ADN foi digerido com Kpnl e PstI, e introduzido no vector pUC19 aberto com os mesmos enzimas. Alguns dos plasmídeos resultantes tiveram o ADN sequenciado com o método de terminação da cadeia de didesoxi (Sanger, F. et al. , vide supra). e um plasmídeo com o fragmento de Kpnl-PstI de 633 pares de bases esperado com a sequência correcta foi denominado pKGE658. Assim, esta inserção de plasmídeo é constituída por um fragmento do ADNc do factor VIII:R4 que codifica uma fusão entre a Arg-740 e a Glu-1649 por meio de três resíduos Arg suplementares.
Construção de um Vector de Expressão de Mamífero que codifica o factor VIII:R4 fragmento de Kpnl-PstI de 633 pares de bases que codifica parte do ADNc do factor VIII:R4 foi excisado do vector pKGE658 e introduzido no vector pKGE490 que tinha sido completamente clivado por Kpnl e parcialmente clivado por PstI. o vector resultante, pKGE673, contém uma inserção de Kpnl-Sphl de 2055 pares de bases que codifica os aminoácidos Leu-587 até Met-2176 do factor VIII:R4. Um fragmento de Kpnl-Apal de 1668 pares de bases que codifica desde a Leu-587 até à Ala-2047 do factor VIII:R4 foi excisado do pKGE673 e transferido para o segmento grande do vector pKGEGOl, que tinha sido aberto pelos mesmos
720
LG/2928206
enzimas. O vector pKGE601, que se baseia no vector de clonagem de E. coli pML2, é constituído pelo intensificador/promotor GRP78 humano codificado num segmento de ADN de 443 pares de bases (nucleótidos nas posições 2 a 445, Ting, J. e Lee, A.S. (1988), DNA 7(4), 275-286) a montante do ADNc do factor VIII:R5 com o intrão do antigénio t de SV40 e a sequência de poliadenilação na região proximal 3'. A juzante desta região localiza-se uma unidade de transcrição que codifica o ADNc da di-hidrofolato-redutase de ratinho sob o controlo da repetição terminal longa do vírus de tumor mamário de ratinho, e utilizando o mesmo elemento de controlo 3' do SV40 que anteriormente. 0 vector resultante, pKGE674, encontra-se representado na Figura 3.
Mutagénese do ADNc do factor VIII para criar o factor VIII:R5 por deleccão vector pKGE657 foi submetido a mutagénese dirigida ao local por extensão de sobreposição utilizando a reacção em cadeia de polimerase duma forma análoga à do exemplo anterior referente ao factor VIII:R4. Como iniciadores na primeira das duas reacções paralelas foram utilizados os seguintes:
· -ATTGAACCAAGAAGAAGAAGAAGAGAAATAACTCGTACT-5 '
5·-GATAACAATTTCACACA-3·
A análise dos produtos reaccionais com electroforese em gel de agarose, como no exemplo anterior, indicou a formação de um produto reaccional de 240 pares de bases. Na segunda das duas reacções paralelas foram utilizados os seguintes iniciadores:
51-AGTACGAGTTATTTCTCTTCTTCTTCTTCTTGGTTCAAT-3·
5'-GTAACGCCAGGGTTTTCC-3 7
A análise dos produtos reaccionais com electroforese em gel de agarose, indicou um produto reaccional de 550 pares de bases. A segunda parte da experiência de mutagénese, análoga à do exemplo anterior, produziu um produto de ADN amplificado de 760
720
LG/2928206
-19pares de bases. Depois da digestão deste ADN com Kpnl e PstI, foi introduzido no pKGE490 que tinha sido completamente clivado por Kpnl e parcialmente clivado por PstI.
Um plasmídeo com o fragmento de Kpnl-PstI de 636 pares de bases esperado com a sequência correcta, tal como determinada pelo método de terminação da cadeia de didesoxi (Sanger, F. et al.. vide supra). foi denominado pKGE659, e contém no total uma inserção de Kpnl-Sphl de 2058 pares de bases constituída por um fragmento do ADNc do factor VIII:R5 que codifica uma fusão entre a Arg-740 e a Glu-1649 por meio de quatro resíduos de Arg suplementares.
Construção de um Vector de Expressão de Mamífero que codifica o factor VIII:R5
Um fragmento de Kpnl-Apal de 1668 pares de bases que codifica desde a Leu-587 até à Ala-2047 do factor VIII:R5, foi excisado do pKGE659 e transferido para o segmento grande do vector pKGE601 que tinha sido aberto pelos mesmos enzimas, duma forma semelhante àquela descrita anteriormente para o vector de expressão do factor VIII:R4, pKGE674. O vector resultante que codifica o factor VIII:R5 (pKGE672) encontra-se representado na Figura 4.
EXEMPLO 2
Derivação de Células de Ovário de Hamster Chinês produtoras do factor VIII:R3
Numa placa de cultura de células de 10 cm de diâmetro, 0,5 milhões de células de Ovário de Hamster Chinês deficientes em di-hidrofolato-redutase (CHO-DG44, obtidas junto do Dr. L.A. Chasin, Columbia University, Nova Iorque) foram semeadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco/F12 de Ham (1:1) suplementado com soro de vitela fetal a 10 %, e incubadas durante toda a noite a 37°C numa incubadora com dióxido de carbono a 5 %. No dia seguinte as células foram lavadas com meio fresco e subsequentemente transfectadas pelo método do fosfato de cálcio com 10 pg de uma mistura a 1:1 do vector de expressão do factor
720
LG/2928206 —20—
VIII:R3, pKGE491, e do vector da di-hidrofolato redutase, pKGE327, de acordo com os processos da arte. O vector pKGE327 contém uma unidade de transcrição constituída pela repetição terminal longa do vírus de tumor mamário de ratinho a montante do ADNc da di-hidrofolato redutase de ratinho com o antigénio t de SV40 e a sequência de poliadenilação na parte proximal 3 * clonados no vector pML2 no sentido retrógado (Figura 5). No dia 3, o meio foi removido, as células foram lavadas e divididas para novas placas de cultura. No dia 4, foi iniciada a selecção das células positivas para a di-hidrofolato-redutase por substituição do meio pelo meio de cultivo de células anterior isento de hipoxantina, glicina e timidina, e suplementado com soro de vitela fetal a 10 % cuidadosamente dializado. 0 meio foi trocado duas vezes por semana, e aproximadamente duas semanas depois as colónias de células positivas para a di-hidrofolato-redutase podiam ser recolhidas. Estas colónias foram reunidas e cultivadas adicionalmente em balões de cultura de células de 25 cm2 e após terem alcançado a subconfluência, o meio foi substituído por meio fresco contendo soro de vitela fetal a 3 %. Depois de um período de 24 horas, foi testada a actividade do factor VIII:C no meio de cultura utilizando o método do substrato sintético (Coatest Factor VIII:C, KABI-Pharmacia), tendo sido obtido um nível de expressão de 80 mU/ml. As células positivas para a di-hidrofolato-redutase reunidas foram submetidas a amplificação dos genes através de várias semanas de cultura em meio contendo o inibidor da di-hidrofolato-redutase, metotrexato. Após selecção por aumentos escalonados da concentração do metotrexato até 500 nM, foi obtida um conjunto de células resistentes que produziam o factor VIII:C a um nível de 1,0 U/ml em balões em movimento de rotação (roller bottles).
Derivação de Células de Ovário de Hamster Chinês produtoras do factor VIII:R4
Duma forma semelhante à transfecção anterior do vector de expressão que codifica o factor VIII:R3, células de Ovário de Hamster Chinês foram transfectadas com o vector de expressão que
720
LG/2928206
codifica o factor VIII:R4, pKGE674. Neste caso, a co-transfecção com o pKGE327 foi omitida, dado que se encontra presente neste vector uma unidade de transcrição que codifica o marcador de selecção e amplificação da di-hidrofolato-redutase. Após selecção em meio isento de hipoxantina, glicina e timidina, e suplementado com soro de vitela fetal a 10 % cuidadosamente dializado, semelhante ao anterior, foi obtida um conjunto de clones de células que produzia 400 mU/ml de actividade de factor VIII:C tal como medida pelo Coatest. A selecção quanto à amplificação do gene por cultivo em metotrexato 20 nM durante várias semanas originou um conjunto de células que produzia 500 mU/ml de factor VIII:C. A selecção adicional por cultura em meio contendo metotrexato 200 nM originou um conjunto de células que produzia 980 mU/ml de factor VIII:C. Estas células, quando cultivadas em balões com movimentos de rotação, produziram 800 mU/ml de factor VIII:C.
Derivação de Células de Ovário de Hamster Chinês produtoras do factor VIII;R4
À semelhança do anterior, células de Ovário de Hamster Chinês foram transfectadas com o vector de expressão que codifica o factor VIII:R5, pKGE672, o qual codifica o factor VIII:R5 e as unidades transcricionais da di-hidrofolato redutase no mesmo plasmídeo. Após selecção em meio isento de hipoxantina, glicina e timidina, e suplementado com soro de vitela fetal a 10 % cuidadosamente dializado, foi obtida um conjunto de clones de células que produzia 110 mU/ml de actividade de factor VIII:C tal como medida pelo Coatest. A selecção quanto à amplificação do gene por cultura em metotrexato 20 nM durante várias semanas originou um conjunto de clones de células resistentes que produzia 1,5 U/ml de factor VIII:C em balões com movimento de rotação.
720
LG/2928206
-22Caracterização Bioquímica do factor VIII:R3, do factor VIII:R4 e do factor VIII:R5
EXEMPLO 3
Os factor VIII:R3, factor VIII:R4 e factor VIII:R5 produzidos pelos respectivos conjuntos de linhas celulares de CH0-DG44 amplificadas tal como descrito no Exemplo 2, foram examinados quanto às suas caracteristicas bioquímicas. A purificação do material do meio de cultura foi realizada por cromatografia de imunoafinidade com a utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra o factor VIII, seguida por um passo de cromatografia de permuta iónica. A actividade específica do material purificado obtido situava-se na gama de 3000-4000 IU/A280, e a razão actividade de factor VlII/antigénio de factor VIII aproximava-se de 1 (a actividade foi medida pelo Coatest (KABI-Pharmacia), e o antigénio foi determinado por um ensaio ELISA com a utilização de anticorpos monoclonais dirigidos contra a cadeia de 80 kDa).
Os factor VIII:R3, factor VIII:R4 e factor VIII:R5 purificados foram submetidos a electroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e análise por transferência de Western. A SDS-PAGE foi executada de acordo com Laemmli (1970; Nature 227, 680-685). Os anticorpos policlonais de coelho anti-factor VIII humano (Andersson, L-O. et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sei USA 83, 2979-2983) foram utilizados para a análise por transferência de Western, executada essencialmente como descrito por Towbin, H. et al. (1979, Proc. Natl. Acad. Sei USA 76, 4350-4354). Os resultados estão representados na Figura
6. Faixa A: factor VIII plasmático contendo uma cadeia leve de 80 kDa e cadeias pesadas variando de 200 kDa a 90 kDa. Faixa B: factor VIII:R3. Faixa C: factor VIII:R4. Faixa D: factor VIII:R5. 0 factor VIII:R3 mostra bandas a 80 kDa, 90 kDa, 130 kDa e 170 kDa. As bandas de 80 kDa e de 90 kDa foram encontradas na mesma posição no gel que os péptidos 80 kDa e 90 kDa representando o complexo biologicamente activo mais pequeno do factor VIII plasmático. A banda de 170 kDa provavelmente representa o produto da tradução primária não
720
LG/2928206 processado e a banda de 130 kDa uma forma incorrectamente processada do factor VIII:R3. Assim, também foram obtidas cadeias polipeptídicas não autênticas para além das cadeias de 80 kDa e 90 kDa. Os factor VIII:R4 e factor VIII:R5 mostram bandas a 80 kDa e 90 kDa. Não estava, presente nestes materiais uma quantidade significativa de produto da tradução primário não processado (cadeia de 170 kDa). Isto significa que o processamento proteolítico in vivo do produto da tradução primário em duas cadeias polipeptídicas foi eficaz nestes casos. Assim, foi obtida em ambos os casos uma molécula de duas cadeias com cadeias peptídicas de massas moleculares correspondentes àquelas presentes na mais pequena forma activa de factor VIII plasmático. Além disso, a determinação da sequência do terminal N com degradação de Edman automatizada do factor VIII:R5 mostrou que os terminais amino das cadeias de 90 kDa e 80 kDa são idênticos aos do factor VIII derivado do plasma de 90 kDa mais 80 kDa.
Nas Figuras 7 e 8 estão representadas a curva de activação e o padrão de SDS-PAGE/transferência de Western obtidos após incubação do factor VIII:R5 com trombina (foi adicionada 0,01 U de trombina por 1 U de factor VIII). Foi utilizado um processo de formação de coágulo numa etapa (Mikaelsson, M. et al. (1983), Blood 62, 1006-1015) para o ensaio imediato de amostras da mistura reaccional. Foi obtida uma activação de 17 vezes em 2 minutos, a qual foi seguida de inactivação. Foi adicionado dodecil sulfato de sódio a 0,02 g/ml para parar a reacção nas amostras para análise por SADS-PAGE/transferência de Western. A electroforese e a análise por transferência de Western foram efectuadas em amostras retiradas a certos intervalos de tempo durante a reacção, tal como descrito para a Figura 6. Os resultados obtidos mostram uma alteração molecular dos péptidos de factor VIII idêntica à do factor VIII plasmático durante a incubação com trombina. Assim, o péptido de 90 kDa foi clivado pela trombina, e foi formado um péptido de 50 kDa mais um de 40 kDa. 0 péptido de 80 kDa foi clivado e foi formado um péptido de 70 kDa. Os estudos com a trombina mostram que o factor VIII:R5 se comporta como o factor VIII na interacção com este
720
LG/2928206
actividade biológica in vivo.
A interacção do factor VIII:R5 com o factor de von Willebrand humano foi estudada com a utilização da cromatografia de exclusão de tamanho em Sepharose CL-6B. Foram incubadas dez (10) IU de factor VIII:R5 com 30 U de factor de von Willebrand humano purificado a 37°C durante 20 minutos. A mistura de incubação foi, em seguida, aplicada a uma coluna cheia com Sepharose CL-6B. Todo o material com actividade de factor VIII eluiu no volume de vazios com o factor de von Willebrand. Quando foi aplicado à coluna factor VIII:R5 sem factor de von Willebrand adicionado, o material com actividade de factor VIII eluiu apenas nas fracções interiores numa posição onde também a forma de 90 kDa-80 kDa do factor VIII plasmático eluiu. Este resultado mostra que o factor VIII:R5 tem a capacidade de se ligar ao factor de von Willebrand, propriedade esta que é necessária para uma boa sobrevivência in vivo (Brinkhous, K.M. et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 8752-8756).
Os derivados de factor VIII do presente invento foram depositados no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen em 13 de Março de 1991. Em conformidade, ao factor VIII:R3 foi atribuído o número de depósito DSM 6415, ao factor VIII:R4 foi atribuído o número de depósito DSM 6417, e ao factor VIII:R5 foi atribuído o número de depósito DSM 6416.

Claims (11)

  1. REIVINDICACÕES
    1 - Sequência de ADN que codifica um derivado de factor VIII humano, recombinante, biologicamente activo, caracterizada por compreender um primeiro segmento de ADN codificando os aminoácidos 1 a 740 do factor VIII humano e um segundo segmento de ADN que codifica os aminoácidos 1649 a 2332 do factor VIII humano, sendo os referidos segmentos interligados por um segmento de ADN ligador que codifica um péptido ligador de pelo menos 2 resíduos de aminoácido que são seleccionados de entre lisina e arginina.
  2. 2 - Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o referido segmento de ADN ligador codificar até cerca de 10 resíduos de aminoácido.
  3. 3 - Sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizada, por o referido segmento de ADN ligador codificar 2, 3 ou 4 resíduos de aminoácido.
  4. 4 - Sequência de ADN de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada por o referido segmento de ADN ligador codificar 3 ou 4 resíduos de aminoácido, sendo o resíduo de aminoácido que precede Glu-1649 a arginina.
  5. 5 - Sequência de ADN de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizada por todos os resíduos de aminoácido do referido ligador serem arginina.
  6. 6 - Sequência de ADN de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por o referido segmento de ADN ligador codificar 3 ou 4 resíduos de aminoácido constituídos por arginina.
  7. 7 - Vector de expressão recombinante, caracterizado por conter uma unidade de transcrição que compreende a sequência de ADN de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, um promotor transcricional e uma sequência de poliadenilação.
    73 720
    LG/2928206
  8. 8 - Célula hospedeira de origem animal, caracterizada por ser transformada com o vector de expressão recombinante da reivindicação 7.
  9. 9 - Processo para a produção de um derivado de factor VIII humano recombinante, biologicamente activo, expresso por uma sequência de ADN de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado por se cultivar uma linha de células animal transformada com um vector de expressão recombinante de acordo com a reivindicação 7, num meio nutriente que permite a expressão e secreção de um derivado do factor VIII, humano composto por dois polipéptidos com massas moleculares de 90 kDa e 80 kDa, respectivamente, ligados um ao outro por uma ponte de ião metálico e por se recuperar o referido derivado do meio de cultura.
  10. 10 - Derivado do factor VIII humano, caracterizado por ser preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 9.
  11. 11 - Derivado do factor VIII humano de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender o domínio de 90 kDa e, opcionalmente ligado a ele, através do péptido ligador ou de uma sua parte, por ligação de ião metálico, o domínio de 80 kDa do factor VIII humano.
PT100245A 1991-03-15 1992-03-13 Sequencia de adn que codifica um derivado de factor viii humano recombinante, biologicamente activo, vector de expressao recombinante, celula hospedeira, processo de producao de um derivado de factor vii e derivado de factor viii PT100245B (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9100799A SE468050C (sv) 1991-03-15 1991-03-15 Rekombinant derivat av human faktor VIII

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PT100245A PT100245A (pt) 1993-07-30
PT100245B true PT100245B (pt) 1999-08-31

Family

ID=20382191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT100245A PT100245B (pt) 1991-03-15 1992-03-13 Sequencia de adn que codifica um derivado de factor viii humano recombinante, biologicamente activo, vector de expressao recombinante, celula hospedeira, processo de producao de um derivado de factor vii e derivado de factor viii

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0533862B1 (pt)
JP (1) JP2655752B2 (pt)
AR (1) AR247590A1 (pt)
AT (1) ATE186055T1 (pt)
AU (1) AU650730B2 (pt)
CA (1) CA2081659C (pt)
DE (1) DE69230206T2 (pt)
DK (1) DK0533862T3 (pt)
ES (1) ES2137182T3 (pt)
FI (1) FI107539B (pt)
GR (1) GR3032468T3 (pt)
IE (1) IE920814A1 (pt)
NO (1) NO308174B1 (pt)
PT (1) PT100245B (pt)
SE (1) SE468050C (pt)
WO (1) WO1992016557A1 (pt)
ZA (1) ZA921882B (pt)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595886A (en) * 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US6060447A (en) * 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US5364771A (en) * 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US5888974A (en) * 1992-04-07 1999-03-30 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5663060A (en) * 1992-04-07 1997-09-02 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
US5744446A (en) * 1992-04-07 1998-04-28 Emory University Hybrid human/animal factor VIII
KR950702635A (ko) 1992-07-31 1995-07-29 크리스틴 헬렌 수덴 감쇠 박테리아에서 재조합 융합 단백질의 발현(Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria)
SE9300509D0 (sv) * 1993-02-16 1993-02-16 Kabi Pharmacia Ab Peg treatment
SE504074C2 (sv) * 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
GB9401787D0 (en) * 1994-01-31 1994-03-23 Medeva Holdings Bv Vaccine compositions
SE9303601D0 (sv) * 1993-11-01 1993-11-01 Kabi Pharmacia Ab Improved cell cultivation method and medium
SE9403915D0 (sv) * 1994-11-14 1994-11-14 Annelie Almstedt Process A
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
US6197526B1 (en) * 1999-01-04 2001-03-06 Dyax Corp. Polypeptides for binding human factor VIII and fragments of human factor VIII
US7112438B2 (en) 1999-01-04 2006-09-26 Dyax Corp. Binding molecules for human factor VIII and factor VIII-like proteins
EP1038959A1 (en) 1999-03-17 2000-09-27 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Factor VIII without B-domain, comprising one or more insertions of a truncated intron I of factor IX
EP1048726B1 (en) * 1999-04-27 2006-07-26 Négrier, Claude Modified factor VIII cDNA
SE9901379D0 (sv) 1999-04-19 1999-04-19 Pharmacia & Upjohn Ab Receptor structures
EP1233064A1 (en) * 2001-02-09 2002-08-21 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Modified factor VIII cDNA and its use for the production of factor VIII
EP1284290A1 (en) * 2001-08-08 2003-02-19 Aventis Behring GmbH Increase of the expression levels of factor VIII by insertion of spliceable nucleotide sequences into factor VIII cDNA
EP1283263A1 (en) * 2001-08-08 2003-02-12 Aventis Behring GmbH Modified cDNA for high expression levels of factor VIII and its derivatives
CN102199626B (zh) 2003-09-30 2015-06-24 宾夕法尼亚大学托管会 腺伴随病毒(aav)进化支、序列、含有这些序列的载体及它们的应用
CN101203613B (zh) 2005-04-07 2012-12-12 宾夕法尼亚大学托管会 增强腺相关病毒载体功能的方法
CA2604299A1 (en) * 2005-04-14 2006-10-19 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factor viii with enhanced stability and its derivates
MX342858B (es) 2010-03-29 2016-10-13 The Trustees Of The Univ Of Pennsylvania * Sistema de ablacion transgenica inducida farmacologicamente.
US9315825B2 (en) 2010-03-29 2016-04-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Pharmacologically induced transgene ablation system
BRPI1105317A2 (pt) 2011-01-24 2013-04-30 Fundacco Hemoct De Ribeirco Preto produÇço estÁvel e em larga escala de fviii humano em linhagem celular humana sk-hep-1
EP2675902B1 (en) 2011-02-17 2019-03-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for altering tissue specificity and improving aav9-mediated gene transfer
US9719106B2 (en) 2013-04-29 2017-08-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tissue preferential codon modified expression cassettes, vectors containing same, and uses thereof
CN105017410B (zh) * 2014-04-18 2018-06-08 北京诺思兰德生物技术股份有限公司 一种b区部分缺失型重组人凝血因子ⅷ
CN115074366A (zh) 2015-04-16 2022-09-20 埃默里大学 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途
KR102553990B1 (ko) 2016-10-03 2023-07-10 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 Hspa5 유전자의 프로모터
KR20230042754A (ko) 2020-08-07 2023-03-29 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드 소포 표적화 단백질 및 이의 용도

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
JPS62181786A (ja) * 1985-08-12 1987-08-10 シンテツクス（ユ−・エス・エイ）インコ−ポレイテツド 融合蛋白質の製造法
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5451521A (en) * 1986-05-29 1995-09-19 Genetics Institute, Inc. Procoagulant proteins
NO872932L (no) * 1986-07-18 1988-01-19 Gist Brocades Nv Fremgangsmaate for fremstilling av proteiner med faktorviiiaktivitet ved hjelp av mikrobielle vertsceller, eksprimeringsvektorer, vertsceller, antibiotika.
NZ219516A (en) * 1987-02-10 1991-02-26 Wellcome Found Fusion proteins of hbcag (hepatitis b virus core antigen)
DE3720246A1 (de) * 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
KR927003812A (ko) * 1989-11-17 1992-12-18 노보 노르디스크 아크티에 셀스카브 인자 viii:c 활성을 갖는 단백질 복합체 및 그의 제조
SE465222C5 (sv) * 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
CA2078721A1 (en) * 1991-09-24 1993-03-25 Hiroshi Yonemura Process for preparing human coagulation factor viii protein complex

Also Published As

Publication number Publication date
CA2081659A1 (en) 1992-09-16
AR247590A1 (es) 1995-01-31
NO924395D0 (no) 1992-11-13
AU1351392A (en) 1992-10-21
NO924395L (no) 1993-01-13
IE920814A1 (en) 1992-09-23
SE468050C (sv) 1998-04-27
WO1992016557A1 (en) 1992-10-01
SE9100799L (sv) 1992-09-16
DE69230206D1 (de) 1999-12-02
DE69230206T2 (de) 2000-05-18
FI925131A0 (fi) 1992-11-11
AU650730B2 (en) 1994-06-30
SE9100799D0 (sv) 1991-03-15
EP0533862A1 (en) 1993-03-31
PT100245A (pt) 1993-07-30
NO308174B1 (no) 2000-08-07
ES2137182T3 (es) 1999-12-16
EP0533862B1 (en) 1999-10-27
SE468050B (sv) 1992-10-26
DK0533862T3 (da) 2000-01-17
FI107539B (fi) 2001-08-31
JPH05507420A (ja) 1993-10-28
FI925131A (fi) 1992-11-11
JP2655752B2 (ja) 1997-09-24
ZA921882B (en) 1992-11-25
ATE186055T1 (de) 1999-11-15
GR3032468T3 (en) 2000-05-31
CA2081659C (en) 2002-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT100245B (pt) Sequencia de adn que codifica um derivado de factor viii humano recombinante, biologicamente activo, vector de expressao recombinante, celula hospedeira, processo de producao de um derivado de factor vii e derivado de factor viii
ES2119769T5 (es) Derivado del factor viii humano recombinante.
US5661008A (en) Recombinant human factor VIII derivatives
US20030170825A1 (en) Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof
US20040197875A1 (en) Modified cDNA factor VIII and its derivatives
AU656311B2 (en) Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof
ES2319198T3 (es) Adnc modificado para niveles de expresion altos de factor viii y sus derivados.
EP1502921A1 (en) Recombinant mutated human factor VIII (FVIII) with improved stability
EP1454916A1 (en) Modified cDNA factor VIII and its derivatives

Legal Events

Date Code Title Description
BB1A Laying open of patent application

Effective date: 19930322

FG3A Patent granted, date of granting

Effective date: 19990521

PC3A Transfer or assignment

Free format text: 20020108 BIOVITRUM AB SE

PD3A Change of proprietorship

Owner name: PHARMACIA AKTIEBOLAG

Effective date: 20020108

MM4A Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent

Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES

Effective date: 20131121

MM4A Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent

Free format text: MAXIMUM VALIDITY LIMIT REACHED

Effective date: 20140521