DE2126713A1

DE2126713A1 - Antikoagulans-Isolierung

Info

Publication number: DE2126713A1
Application number: DE19712126713
Authority: DE
Inventors: Peter George Waukegan; Stried Gene Alan Zion; 111. Sesin (V.St.A.). A6Ik 27-00
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1970-06-01
Filing date: 1971-05-28
Publication date: 1971-12-09
Also published as: JPS5414163B1; FR2104751A1; FR2104751B1; ZA712888B; CA953212A; GB1302322A

Description

Dr. Ing. Walter Abitz .

Dr. Dieter F. Morf

Dr. Hans-A. Brauns _fin

8Mfachen86,n«wn«»r»tr.» 28. HA

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ABBOTT LABORATORIES North Chicago, 111. 60064, V.St.

Antikoagulans-Isclierung-

Ein neues, einstufiges· Verfahren zum Reinigen und Isolieren der Ehrombinähnlichen Fraktion des Giftes der malaiischen Grubenviper wird bereitgestellt. Gemäss diesem Verfahren wird eine verdünnte, gepufferte, klare Lösung des Giftes auf eine Gelfiltrationskolonne aufgegeben, die Kolonne wird mit einer wässrigen Lösung des gleichen Puffers eluiert, und die das aktive Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt.

Seit einigen Jahren ist es bekannt, dass das Gift der malayischen Grubenviper (Ancistrodon Rhodostoma) einen Bestandteil enthält, der als Antikoagulans nützlich ist. Kürzlich wurde gefunden, dass dieser Bestandteil tatsächlich ein Koagulans für Blut darstellt. Das thrombinähnliche Material, auf das die vorliegende Erfindung gerichtet ist, wirkt in der Weise, dass es ein nicht vernetztes Fibrinpolymeres bildet, das durch das Körper-

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retikuloendothel und/oder sein fibrinolytisches System leicht entfernt wird, so dass dadurch der Fibrinogenspiegel des Blutes erniedrigt oder der Fibrinogengehalt des Blutes erschöpft wird. Das thrömbinähnliche Material ruft daher eine antikoagulierende Wirkung hervor.

Leider lässt die zum Stand der Technik gehörende Reinigungsmethode viel zu wünschen übrig. Die beste, bis zum heutigen Tage bekannte Methode umfasst eine zweistufige, chromatographische Arbeitsweise, die zwei Kolonnen mit unterschiedlichen Packungen und zwei unterschiedlich gepufferte Lösungen mit unterschiedlichen Anforderungen für Extraktionslösungsmittel in den beiden Stufen erforderlich macht. Das Substrat, das für die erste Stufe dieser chromatographischen Methode am üblichsten ist, ist Triäthylaminoäthyl-Cellulose, die leider keine verlässlichen und .leicht reproduzierbaren Ergebnisse liefert. Und was das schlimmste ist, die so gereinigte Giftlösung enthält noch den gesamten hämorrhagischen Faktor, der der gefährlichste Bestandteil des Viperngiftes ist. In jedem Fall muss die so fraktionierte Giftlösung nach einer ähnlichen Arbeitsweise unter Verwendung einer anders gepufferten Lösung der aktiven Fraktion - -aus der ersten Trennung und eines anderen Kolonnensubstrats weiter gereinigt werden.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein vereinfachtes Verfahren zur Herstellung von reinem thrombinähnlichem Material aus dem Gift der malayischen Grubenviper bereitzustellen. Ein .weiteres Ziel ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Fraktionieren von Grubenvipergift. Ein noch anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer einfachen Isolierungsmethode für die thrömbinähnliche Aktivität aus Grubenvipergift in gereinigter Form.

Diese und andere Ziele werden dadurch erreicht, dass eine klare, verdünnte, wässrige Lösung von natürlichem Grubenvipergift, die

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auf einen pH-Wert von 7,0 + 0,5 gepuffert ist und so viel Natriumchlorid enthält, dass die Molarität an dem gesamten Salzgehalt 0,15 bis 0,5 beträgt, auf eine Säule, die ein Molekularsieb enthält, gebracht, die genannte Säule mit einer wässrigen Lösung, die den gleichen Typ und die gleiche Menge an Puffer und Salz wie die Giftlösung enthält, in kleinen Fraktionen eluiert wird und diejenigen Fraktionen, welche den thrombinähnlichen Bestandteil enthalten, vereinigt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Fraktionen, welche thrombinahnlich wirkendes Material enthalten, nur aus der ersten Fraktion, welche dieses Material enthält, bis zu derjenigen Fraktion, welche die höchste Menge an aktivem Material enthält, vereinigt und die nachfolgenden Fraktionen, welche das genannte aktive Koagulans enthalten, gesondert vereinigt. Dieses Material der zweiten Ernte kann nach dem Einengen in einer besonderen Stufe wieder chromatographiert werden, um die Gesamtausbeute des neuen Isolierverfahrens zu erhöhen, oder das beschriebene Material der "zweiten Ernte" kann mit einer frischen Charge von natürlichem Material, das gemäss dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelt werden soll, vereinigt werden.

Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck "natürliches" ("native") Gift soll dasjenige Gift definieren, das noch nicht zuvor nach anderen chromatographischen oder chemischen Arbeitsweisen behandelt worden ist. Infolgedessen enthält es andere Proteinmaterialien, die früher als Fraktionen I bis Viii bezeichnet wurden, einschliesslich des hämorrhagischen Faktors und Fraktionen V und VII. d. h. diejenigen Fraktionen, die ähnliche physikochemische Merkmale aufweisen.,: mit dem die vorliegende Isolierungsarbeitsweise zu tun hat. Diese unerwünschten Fraktionen und Bestandteile werden durch das erfindungsgemasse Verfahren vollständig aus dem natürlichen Gift entfernt, und es wird keine vorhergehende Ionenaustauschbehandlung benötigt.

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Andererseits versteht es sich, dass der oben definierte Ausdruck "natürlich" nicht impliziert, dass das Gift vor der erfindungsgemässen Fraktionierungsstufe praktisch unberührt sein muss: Es kann zur Entfernung von Ablagerungen zentrifugiert und zur Verbesserung der Stabilität lyophilisiert werden und muss natürlich gelöst werden, um die Anforderungen, dass es als klare, verdünnte, wässrige Lösung anwendbar sein soll, zu erfüllen.

Die wässrige Lösung des natürlichen Giftes kann zwischen 5 und 20 Gew.J6 Gift in der beschriebenen Pufferlösung enthalten. Eine praktische Konzentration sind etwa 10 Gew.JS Gift in Wasser, das einen Salzgesamtgehalt in einer Molarittät von 0,15 bis 0,5 aufweist, wobei das Salz aus 0 bis 100 % Natriumchlorid und 100 bis 0 % des gewünschten Puffers zusammengesetzt sein kann, damit sich eine Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 +^ 0,5 ergibt. Die gleiche Puffer/Natriumchlorid-Lösung mit der gleichen Konzentration an Jedem Bestandteil wird als die fraktionierende Flüssigkeit verwendet, aber selbstverständlich ohne Jeglichen Giftgehalt.

Wie erwähnt, muss die Giftlösung eine gewisse Salzgesamtkonzentration aufweisen. Diese Konzentration kann sich aus dem Puffer oder zum Teil aus Natriumchlorid aufbauen. Jeder der beiden Bestandteil kann allein verwendet werden; in einer bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemässen Verfahrens jedoch sind beide-Bestandteile vorhanden, wobei jeder etwa 50 % der gewünschtemWplarität der Pufferlösung beisteuert. Obwohl viele Puffer zur Erzielung eines pH-Wetes von 7»0 +, 0,5. verwendet werden können, wird ein Natriumphosphatpuffer bevorzugt, weil er physiologisch verträglich, leicht erhältlich und leicht zu handhaben ist. Dieser Puffer kann allein, d. h. ohne Natriumchlorid, als zusätzlichen Elektrolyten, verwendet werden, und umgekehrt kann das letztere allein verwendet werden, da Natriumchlorid eine Lösung innerhalb des richtigen pH-Bereiches ergibt.

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Das erfindungsgemässe Verfahren besteht im wesentlichen nur in einem einzelnen Schritt, einer Gelfiltration« Das bei dieser Arbeitsweise verwendete Gel kann aus inerten Stoffen» welche als Molekularsiebe verwendet werden, ausgewählt werden« Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Material, das in der Kolonne am geeignetsten zur Durchführung des neuen Verfahrens verwendet wird, ein teilweise vernetztes Dextrangel oder ein Polyacrylamidgel. Diese und andere ähnliche hochmolekulare Stoffe.sind leicht in Pulverform erhältlich; sie gelieren leicht, wenn sie in Wasser gebracht werden und besitzen die Fähigkeit, die im Schlangengift vorhandene Proteinmischung zu aktivieren.

Wie dem Fachmann wohlbekannt ist, wird zunächst das Fraktlonlerungslösungsmittel durch die Kolonne geleitet, um den leeren Raum in der Kolonne zu eliminieren« Dieses Volumen ist für Jedes Gel charakteristisch und hängt danach nur von den Abmessungen der Kolonne ab. Nachdem die leeren Räume zum Verschwinden gebracht worden sind, werden protelnhaltlge Fraktionen eluiert, die in kleinen Anteilen gesammelt und nach der von Esnouf und Tünnah in BrIt. J. Haemat«, Band 13 (1967), Seite 58I, beschriebenen Methode auf ihre koagullerende Aktivität untersucht werden. Diejenigen Fraktionen, welche die koagullerende Aktivität zeigen, werden vereinigt und dadurch von den anderen Proteinmaterialien, welche In dem natürlichen Gift vorhanden sind, isoliert« Bei einer bevorzugten Ausfuhrungsform werden die das thrombinähnliche Material enthaltenden Fraktionen quantitativ auf Ihre koagulierende Aktivität analysiert und nur aus der ersten diese Aktivität aufweisenden Fraktion fels zu derjenigen Fraktion, welche die maximale fcoagwllerende Aktivität zeigt, vereinigt. Diese Ansamm-

enthält etwa 6® % der anfangs vorhandenen ßesamtafctlvität weist einen hervorragenden Reinheitsgrad auf; die zweite enthält zusätzlich 2$ % de& anfangs in dem SIft Vor-

Materials·*

Zur Veratischaulichunß des erfindungsgemässen Verfahrens wird auf das folgende Beispiel hingewiesen» das jedoch die Erfindung in keinerlei Hinsichtbegrenzen soll.

B e i s ρ i e 1

(a) Durch Auflösen von 500 mg festen,-natürlichen Giftes der malayischen Grubenviper in einer wässrigen Pufferlösung, die 0,1 M Natriumphosphat vom pH-Wert 6,8, 0,1 M Natriumchlorid und 0,1 % Chlorbutanol enthielt, wurde eine lOiige Lösung hergestellt . Diese Lösung wurde durch Zentrifugieren bei 7000 Ü/Min. während 20 Minuten in einer gekühlten Zentrifuge geklärt, und die Ablagerung wurde verworfen.

(b) Eine Chromatogramm-Glaskolonne mit einem Durchmesser von

3j4 cm wurde bis zu einer Höhe von 112 cm mit einer Suspension eines teilweise vernetzten Dextrangels gepackt, das in folgender Weise hergestellt worden war: 100 g trockenes Sephadex G-iOO-Gelpulver .(vertrieben von der Firma.Pharmacia Ltd.) wurde in 5 1 einer Pufferlösung suspendiert, die durch Auflösen von 8,2 g Dinatriumphosphat, 5,8 g Natriumphosphat-Monohydrat, 5,85 g Natriumchlorid und 1,0 g Chlorbutanol je Liter pyrogenfreien, destillierten Wassers hergestellt worden war. Man Hess die Suspension über Nacht stehen. Das oben schwimmende Material wurde entfernt und das Gel mit dem gleichen 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) so lange gewaschen, bis es frei von Pyrogenen war. Dann wurde das Gel in die Kolonne gepackt und' wiederum mit der gleichen Pufferlösung so lange gewaschen, bis das Eluät und das Eluierungsmlttel denselben pH-Wert \mä dieselbe Leitfähigkeit zeigten.

(c) Die Lösung aus dem obenstehenden Abschnitt (a) wurde auf den oberen Teil der Gelsäule gegeben. Die Säul£ wurde mit Ö>1 Vt Phosphatpuffer (pH S₉By_x der 0*1 tf Natriumchlorid and OvI % Chlorbutanol enthielt, eluiert. Das Eluat wurde in 5-mi-Praktionen gesammelt* und jetfe Fraktion wurde unter

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Verwendung des oben beschriebenen Phosphatpuffers für den Blindve'rsuch auf die Absorption bei 280 mu geprüft. Das durch ein Absorptionsmaximum angezeigte Ausschliessungsvolumen betrug, wie gefunden wurde, etwa 1/3 des gesamten Kolonnenvolumens, und es folgte ihm das erste Hauptmaximum, das dem aktiven Bestandteil' entspricht. Die einzelnen, den aktiven Bestandteil enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, und die Lösung wurde durch eine 0,22 u. "millpore"-Membran steril filtriert. Für Kontrollprüfungen auf beispielsweise Wirksamkeit, Pyrogene, Sterilität in der Masse, Toxizität, hämorrhagische Aktivität, Trägerzusammensetzung und Identität wurden Proben entnommen. Es wurde festgestellt, dass, ausgehend von der ersten die koagulierende Wirksamkeit aufweisenden Fraktion, die Mengen an aktiven Bestandteilen mit jeder Fraktion zunahmen, bis die Aktivität in den nachfolgenden Fraktionen abzunehmen begann. Die Fraktionen mit zunehmender Menge an aktivem Material stellten 60 % der anfangs vorhandenen Aktivität dar, während diejenigen Fraktionen, welche der Maximalmenge folgten, etwa 25 % des anfangs vorhandenen, thrombinähnlichen Materials enthielten. Die getrennt aufgefangenen Ansammlungen wurden unabhängig geprüft.

Die erste thrombinähnliches Material enthaltende Ansammlung wurde mit einer zuvor identifizierten, reinen Probe des aus dem Grubenvipergift isolierten, thrombinähnlichen Materials verglichen, die durch früher angewandte Methoden erhalten worden war, und erwies sich als dieser Probe gleich nach der Polyacrylamidgel-Elektrophoresemethode unter Verwendung von 7»0 % Gelen bei einem pH-Wert von 8,9, die von Ornstein in Annals of N. Y. Acad. of Sciences, Band 121 (1964), Seite 321, beschrieben ist, indem sie gleiche R_f/Volumina nach der Ouchterlony-Geldiffusionsmethode zeigte, die in Arkiv Kerai. Mineral. Geol. Band 26B (19^8), Seite 1, bendhrieben ist, indem sich eine einzelne immunologische Bande in beiden Proben und keine Anregung zeigte, was ein Hinweis auf immunologische Identität ist, und bei Anwendung

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einer Ultrazentrifuge, die mit Abtastoptik ausgerüstet ist, welche den gleichen Sedimentationskoeffizienten zeigt, was auf die gleiche molekulare Grosse hinweist. Es wurde jedoch gefunden, dass die spezifische Aktivität der nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltenen Probe geringfügig geringer war, dass aber eine höhere Ausbeute erhalten wurde. Der Koagulierungsaktivitätstest nach der Methode der Thrombingerinnungszeit zeigte keinen Unterschied zwischen den beiden Proben, und der hämorrhagische Paktor fehlte gänzlich.

Wenn in dem oben beschriebenen Beispiel das 'Dextrangel durch ¹¹BiO-GeI", ein von der Firma Bio-Rad (Richmond, CaI.) vertriebenes Polyacrylamidgel, ersetzt wurde, wurde dieselbe Ausbeute an einem gleichermassen reinen, thrombinähnlichen Material erzielt.

•Es ist einzusehen, dass durch das erfindungsgemässe Verfahren die isolierung des aktiven Koagulierungsmittels aus Schlangengift stark vereinfacht wird. Insbesondere ist festzustellen, dass zur Erzielung eines reinen Materials, das früher nur durch eine zweistufige Methode erhältlich war, nur ein einziges Chromatogramm benötigt wird, das ein Material gleicher Wirksamkeit, molekularer Grosse und Antikoagulierungsaktivität liefert und es mit allen anderen physikalischen und chemischen Identifizierungsmethoden aufnimmt. Besonders bemerkenswert und überraschend ist, dass ein einziges Chromatogramm. das einzige Erfordernis.zur Erzeilung eines gereinigten, hochwirksamen, direkt verwendbaren thrombinähnlichen Materials aus zuvor unbehandeItem Schlangengift 1st.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene, isolierte Koagulansfraktion ist frei von dem hämorrhagisehen Paktor und kann zur Herstellung eines injizierbaren Materials in Üblicher Weise aufgearbeitet werden. Es kann sein, dass die erhaltene Lösung zu konzentriert 1st, so dass eine Verdünnung mit SaIz-

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wasser oder Wasser erforderlich Ist. Eine für die Injektion geeignete Konzentration liegt zwischen 50 und 200 Einheiten thrombinähnliches Material je ml Lösung, während das erfindungsgemässe Verfahren verschiedentlich Konzentrationen von 500 Einheiten/ml und darüber liefert.

In Anbetracht der überraschenden Leistungsfähigkeit der erfindungsgemässen Reinigungs- und Isolierungsarbeitsweise und der Tatsache, dass hämmorhagische Paktoren und andere ungeeignete Fraktionen fehlen, ist die erhaltenen Lösung für die letztliche Reinigung - abgesehen von der Einstellung der Konzentration - geeignet. Es versteht sich, dass der Puffer und Salzlösungen, welche der Giftlösung zugesetzt werden, pyrogen-frei sein sollten und dass als Puffer nichttoxische Salze verwendet werden sollten. Aus diesem Grunde werden als Puffer physiologisch annehmbare Salze in Mengen verwendet, welche eine physiologisch nützliche Konzentration liefernj ζ. Β. eine Isotonische Lösung. Wenn gewünscht, kann ein Konservierungsmittel der Giftlösung zugefügt werden, oder ein derartiger Bestandteil kann anschliessend der gereinigten, isolierten Koagulansfraktion zugesetzt werden* wenn diese Lösung für die Lagerung bestimmt Ist oder wenn ihre Lebensdauer verlängert werden soll. ,Zahlreiche Konservierungsmittel eignen sich für diesen Zweck, z. B. Benzylalkohol, Methyl- und/oder Propyl-phydroxybenzoat» Chlorbutanol und dergleichen. Gewöhnlich sind 0,05 und 1,0 Ji eines solchen Konservierungsmittels zur Befriedigung sämtlicher normalen Lagerungsanforderungen ausreichend.

Wie bemerkt, wird der pH-Wert, der für die Isolierung der Koagulansfraktion geeigneten Giftlösung auf 7,0 ± 0,5 gepuffert. Eine geringfügige Abweichung von diesem Bereich ist annehmbar! Jedoch sollte ein pH-Wert unterhalb etwa 6,0 und oberhalb 8,0 vermieden werden, um die Stabilität der Proteine des Giftes sicherzustellen*

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Isolieren von gereinigtem, thrombinähnlichem Material aus Grubenvipergift, dadurch gekennzeichnet, dass man eine klare, verdünnte, wässrige Lösung von natürlichem ßift, die auf einen pH-Wert von 7,0 +y.0,5 gepuffert ist und einen Gesamtgehalt an anorganischen Salzen in einer Molarität zwischen 0,15 und 0,5 aufweist, auf eine Kolonne bringt, die mit einem Molekularsieb gepackt ist, die genannte Kolonne mit einer wässrigen Lösung, welche den gleichen Typ und die gleiche Menge an anorganischen Salzen wie die Giftlösung enthält, in kleinen Fraktionen eluiert und die Fraktionen, welche thrombinähnliehe Aktivität aufweisen, vereinigt. -

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das

genannte Molekularsieb ein teilweise vernetztes Dextrangel ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man

die genannte Molarität der wässrigen Giftlösung dadurch erzielt, dass man 0 bis 100 % der gewünschten Molarität als Natriumchlorid und 100 bis 0 % der gewünschten Molarität als Natriumphosphatpuffer verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, dass man

das genannte Natriumchlorid und das genannte Natriumphosphat in etwa gleichen molaren Mengenverhältnissen verwendet.

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die genannten kleinen Fraktionen von der ersten Fraktion

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welche die genannte thrombinähnliche Aktivität aufweist, bis zu derjenigen Fraktion, welche den höchsten Betrag der genannnten Aktivität aufweist, vereinigt und diejenigen Fraktionen, welche auf die ersten vereinigten Fraktionen folgen, bis zu derjenigen Fraktion, welche nur einen geringeren Betrag an thrombinähnlicher Aktivität aufweist, gesondert vereinigt.

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