DE3239863C2 - Verfahren zur Herstellung eines subkultivierbaren Lymphokin-bildenden Human-T-Zell-Hybridoms - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Human-T-Zellenhybridomas, die subkultivierbar sind und Lymphokine bilden. Das Verfahren besteht aus den Stufen 1) Behandeln von humanen akuten Leukämiezellen mit einem Protein- und/oder RNA-Syntheseinhibitor; 2) unabhängig davon Aktivieren einer Human-T-Zelle mit einem Mitogen oder Antigen; 3) Fusionieren der so behandelten humanen akuten Leukämiezelle mit der so behandelten Human-T-Zelle in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers und 4) Isolieren der so gebildeten Hybridomas.

Description

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteinsyntheseinhibitor Emetin oder das Hydrochloridsalz davon und/oder Pactamycin eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als RNA-Syntheseinhibitor Actinonycin D, λ- Amanitin oder Adriamycin eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als humane akute Leukämiezelle T-Tumorzellen eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mitogen Phytohämagglutinin-P oder Koncanavalin A eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß 10⁶ bis 10⁷ Zellen/ral der humanen akuten Leukämiezelle mit 10~⁴ bis 10~⁵ M des Proteinsyntheseinhibitors behandelt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß 10* bis 10⁷ Zellen/ml der humanen akuten Leukämiezelle mit 10-⁴ bis 10~⁵ M des Proteinsyntheseinhibitors und 0,05 bis 0,2 μg Actinomycin D/ ml behandelt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, daß als Zeilfusionsbeschleuniger ein Polyethylengiykoi mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 4000 oder Sendai-Virus (HVJ) oder das inaktivierte Produkt des letzteren eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1,7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Zellfusion die Antigen- oder Mitogen-behandelte humane T-Zelle mit der humanen akuten Leukämiezelle in einem Zellanzahlverhältnis von 1 :1 bis 20 :1 behandelt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, daß dabei das Zellanzahlverhältnis 2 :1 bis 15 :1 ausmacht.

Das Phänomen der Zellfusion wurde von Y. Okada unter Verwendung von Sendai-Virus (HVJ) (Y. Okada, Biken J, 1 :103 (1958)) entdeckt. Seit der Entdeckung der Sendai Virusvermittelten Zellfusion wird diese Methode in großem Umfang auf dem Gebiet der somatischen Zellgenetik verwendet.

1975 gelang es Kohler und Milstein, die Zeilfusionstechnik auf dem Gebiet der Immunologie anzuwenden. Es

wurde von G. Kohler und C. Milstein in Nature, 256: S. 495 (1975) zum ersten Male berichtet, daß die Fusion von Milzzellen, die man aus mit HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin)-empfindlichen Mäusemyelomzellen immunisierten Mäusen erhalten hatte, die Bildung von Hybridomen, die in der Lage sind, permanent einen monoklonalen Antigen-spezifischen Antikörper zu bilden, ergab.

Lymphocyten, die in Human- und Tierimmunsystemen enthalten sind, werden grob in Zellen von Thymus (T-Zellen) und in Zellen aus Knochenmark (B-Zellen) eingeteilt.

B-Zellen sind Antikörper-produzierende Zellen. Die von G. Kohler et al. berichtete Zellfusion fand zwischen von Mäusen stammenden B-Zellen und HAT-sensitiven Mäuijmyelomzellen statt. Andererseits werden T-ZeI-len durch Differenzierung und Reifen von Stammzellen aus dem Knochenmark in Thymus gebildet. Weiterhin zirkulieren T-Zellen im Blutstrom durch die peripheren Organe wie Lymphknoten und Milz.

T-Zellen spielen eine bedeutende Rolle bei der Überwachung des Immunverhaltens eines lebenden Körpers. Es ist bekannt, daß man die Immunverhaltens-kontrollierende Funktion von T-Zellen d'irch einen löslichen Mediator, den man im allgemeinen als Lymphokin bezeichnet, und der von den T-Zellen abgegeben wird, beschleunigen kann (H. G. Kunkel und F. J. Dixon, Advances in Immunology, 29: S. 56(1980), Academic Press).

Es sind verschiedene Versuche bisher unternommen worden, verschiedene Krankheiten wie Krebs, Allergie und Infektionskrankheiten durch Kontrolle des Immunverhaltens eines lebenden Körpers zu heilen. Lymphokin, das spezifisch für verschiedene Immunzellen ist, kann als ein wirksameres immunotherapeutisches Mittel verwendet werden und man erwartet, daß es in großem Maße in der Medizin als klinisches Diagnostikum verwendet wird (Bernstein, I.D., D.E.Thor, B. Zbar und H.J. Rapp: Science 172 729 (1971) und Piessens, W.F. und W.H. Churchill: J. Immunol. 114 293 (1975)). Deshalb ist Lymphokin eine medizinisch sehr wichtige Substanz.

Mit den üblichen Methoden ist es jedoch unmöglich, große Mengen an Lymphokin herzusteilen, und außerdem war das in üblicher Weise hergestellte Lymphokin unrein, so daß die Anwendbarkeit von Lymphokin auf dem medizinischen Gebiet gering blieb.

Lymphokine sind Nicht-Antikörper-Proteinfaktorgruppen, die von den Lymphozythen z. B. aufgrund eines Antige-spezifischen Stimulus oder eines Mitogen-Stimulus produziert werden. Weiterhin werden Lymphokine

hauptsächlich von den T-Zellen gebildet. Typische Lymphokine und deren Wirkung werden nachfolgend gezeigt:

1. Lymphokine, die auf Phagozyten wirken

(1) MigrationsinhibierenderFaktor(MIF)

Wirkung: verhindert die Wanderung von Phagozyten in vitro

(2) Phagozyt-aktivierende Faktoren (MAF)

Wirkung: stimuliert Phagozytosis, die bakterizide Wirkung etc. von Phagozyten

(3) Monozyt-Phagozyt-chemotaktischer Faktor(MCF) Wirkung: verursacht Chemotaxis von Monozytphagozyten

2. Lymphokine, die auf polymorphonukleare Leukozyten wirken

(1) Leukozyten-Migration-inhibierender Faktor (LIF) Wirkung: verhindert die Migration von polymorphonuklearen Leukozyten in vitro

(2) Chemotaktischer Faktor

Wirkung: verursacht Chemotaxis von neutrophilen, eosinophilen und basophilen Leukozyten

3. Lymphokine, die auf Lymphozyten wirken

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" Wirkung: stimuliert die Teilung und Proliferation von T-Zellen, die durch ein Antigen oder Mitogen aktiviert sind.

4. Lymphokine, die auf andere Zellen wirken

(1) Lymphotoxin(LT)

Wirkung: schädigt und schält L-Zellen und HeLa-Zellen in vitro

(2) ^Interferon (IFN-^)

Wirkung: greift in die Viruspathogenizität ein

(3) Kolonie-stimulierender Faktor (CSF) Wirkung: ^virkt auf ICnochenmarklymphozytvorläuferzellen (GFU-C), beschleunigt deren Differenzierung und Proliferation zu Granulozyten oder Phagozyten

Die Aktivität der vorerwähnten Lvmphokine wird in vitro gemessen. Es wurde jedoch berichtet, daß es Lymphokine gibt, deren in vitro Akuvität der in vivo Aktivität entspricht. Beispielsweise inhibieren MIFs wahrscheinlich die Migration von Phagozyten (Takeo Kuroyanagi et al.: »Lymphokine« Shin Meneki Kagaku Sosho, Band 5, Seite 33^ Igakushoin Co, Ltd, Tokyo (1979)).

Weiterhin wird ein teleangiektatisches ödem, das durch einen chemischen Mediator auf dem Gebiet von z. B. der Tuberkulinreaktion verursacht wird, unter Ausbildung einer großen Akkumulation von Phagc^ten. beobachtet. Dies liegt daran, daß die Phagozyten, die als Ergebnis von MCF, das sich von sensibilisierten T-Zellen ableitet, wandern und sammeln, weiter durch MIF fixiert werden. Dies zeigt den Zusammenhang zwischen MCF und MIF bei der immunologischen Abwehr eines lebenden Körpers und erlaubt eine wirksame Behandlung von Fremdsubstanzen durch wirksame Akkumulation und Aktivierung von Phagozyten.

Lymphokine, von denen man erwartet, daß sie in Zukunft in der Medizin Verwendung finden, sind MAF, Lymphotoxin, Interleukin II, IFN-^₁ und CSF sowie auch MCF und MIF.

Typische Methoden zur Herstellung von Lymphokinen sind: (1) ein Verfahren zum Kultivieren von peripheren Blutlymphozyten, die mit einem Antigen sensibilisiert worden sind, zusammen mit dem Antigen (D. j. Cameron und W.H.Churchill, J.din. Invest. 63, S.977 (1979)); (2) ein Verfahren zum Kultivieren von peripheren Blutlymphozyten oder Milzzellen zusammen mit einem Mitogen (Weiser, W.Y, Greineder, D.K, Remold, H.G. et al:]. Immunol. 126, S. 1958 (1981) und (3) eine Methode zur Bildung eines Antigen-spezifischen T-Zellklons unter Verwendung des T-Zellwachstumsfaktors (IL-II) und Kultivierung des Klons (J. A. Green, S. R. Cooperband und

5. Kibrick: Science 164, S. 1415(1969)).

Die Methoden (1) und (2) benötigen eine große Blutmenge und ermöglichen es nur, begrenzte Mengen an Lymphokin zu gewinnen. Deshalb ist es schwierig, große Mengen an reinem Lymphokin nach den Methoden (1) und (2) herzustellen. Nach der Methode (3) kann man spezifische Lymphokine in Gegenwart von IL-II herstellen. Methode (3) hat jedoch den Nachteil, daß die Produktion von Lymphokinen aus T-Zellen schlecht ist, und daß es schwierig und teuer ist, Human-IL-II zu erhalten.

Die vorerwähnten Probleme treten ein, wenn man die üblichen Methoden anwendet, weil Lymphokin-bildende T-Zellen nicht subkultiviert werden können und deren Wachstum nur schlecht ist, selbst wenn man sie in Gegenwart eines Wachstumsfaktors, wie IL-II, kultiviert. Daher ist es z. Z. sehr schwierig, ausreichende Mengen an Lymphokin für den klinischen Gebrauch zu produzieren.

Als Mittel zum Lösen der vorerwähnten Probleme unter Verwendung der Zellhybridisierungstechnik hat man bereits T-Zellenhybridomas für Mäuse verwendet (M. Tanuguchi, T. Saito und T. Tada: Nature 278, S. 555 — 558 (1979)). Daher ist es jetzt möglich, die durch diese Zellen gebildeten Lymphokine zu analysieren. Die von Maus-T-Zellen-Hybridomas gebildeten Lymphokine können jedoch nicht für klinische Zwecke beim Menschen verwendet werden. Aus Gründen der Humanimmunologie und der Notwendigkeit einer klinischen Anwendung ist es wünschenswert, Lymphokin-bildende Human-T-Zellen-Hybridomas, die subkultivierbar sind, zur Verfühaben.

Man kann annehmen, daß die gleiche Methode, die man für die Mäuse-T-Zellen-Fusion verwendet, auch für die Fusion von Human-T-Zellen angewendet werden kann. Tatsächlich gibt es eine Methode, bei der man Lymphokin-bildende T-Zellen (nicht subkultivierbar) und HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin)-empfindliche T-Tumorzellen (subkultivierbar) in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers fusionierte. Anschließend wurden nur solche Zellen, die auf einem HAT-Medium wachsen konnten, isoliert und geklont, wobei man die gewünschten Lymphokin-bildenden T-Zellen-Hybridomas erhielt (s. G.Catherine et al. Nature, 2$2: S.842 (1981)).

Es bedarf jedoch eines sehr komplizierten und schwierigen Verfahrens, um HAT-Sensibilität gegenüber Human-T-Tumorzellen zu erzielen.

ίο Deshalb ist es Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines subkultivierbaren Lymphokin-bildenden Kuman-T-Zellhybridoms zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man die folgenden Stufen durchführt:

A) Aktivieren einer humanen T-ZeIIe mit einem Mitogen oder Antigen unter Erythrozyten-Transformation der humanen T-Zellen und Bildung des gewünschten Lymphokins;

B) unabhängig davon. Behandeln einer humanen akuten Leukämiezelle mit einem Proteinsyntheseinhibitor oder einer Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors und einem RNA-Syntheseinhibitor zur irreversiblen Inhibierung der Proteinsynthese der humanen akuten Leukämiezelle;

C) Fusion der so behandelten humanen akuten Leukämiezelle mit der so aktivierten humanen T-Zelle in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers und

D) Isolieren des so gebildeten Hybridoms.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt somit die Stufen (A), (B), (C) und (D).
Stufe A

Lymphozyten, die von humanem peripheren Blut abgetrennt waren, und die Milz oder Thymus, die aseptisch operativ exzisiert worden waren, werden mit einem Mitogen oder Antigen aktiviert. Anschließend wird das an die Zellen gebundene Mitogen oder Antigen entfernt, so daß ein möglichst niedriges Niveau an Mitogen oder Antigen vorliegt

Jedes Antigen oder Mitogen kann bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, solange es eine Substanz ist, die in der Lage ist, die Transformation von Human-T-Zellen zu induzieren, und es wird deshalb in geeigneter Weise je nach dem Typ des gewünschten Lymphokins ausgewählt. Beispiele für solche Mitogene schließen Phytohämagglutinin-P (PHA-P) und Concanavalin A (Con A) ein. Beispiele für geeignete Antigene schließen PPD (gereinigtes Proteinderivat, z. B. gereinigtes Tuberculinprotein, bakterielles Toxoid, virale Antigene und SK-KD (Streptokinase-Streptodornase) ein.

Stufe B

Humane akute Leukämiezellen werden mit einem Proteinsyntheseinhibitor oder einer Kombination eines Protein""yntheseinhibitors und einem RNA-Syntheseinhibitor behandelt. Anschließend wird der in dem Kulturmedium enthaltene Inhibitor durch Zentrifugieren entfernt.

Humane akute Leukämiezellen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind beispielsweise T-Tumorzellen.

Als Proteinsyntheseinhibitoren können bekannten Proteinsyntheseinhibitoren für eukaryotische Zellen, die die Proteinsynthese irreversibel inhibieren, verwendet werden. Emetin · HCl und Pactamycin sind bei der vorliegenden Erfindung bevorzugte Proteininhibitoren. Die Proteinsyntheseinhibitoren können alleine oder in Kombination mit RNA-Syntheseinhibitoren verwendet werden. Beispiele für solche RNA-Syntheseinhibitoren sind Λ-Amanitin und Adriamycin. Ein bevorzugter RNA-Syntheseinhibitor ist bei der vorliegenden Erfindung Actinomycin D.

Die Behandlung vr>n humanen akuten Leukämiezellen mit den Protein- oder RNA-Syntheseinhibitoren wird unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß sowohl die Teilung als auch das Wachstum der Zellen vollständig verhindert wird. Werden beispielsweise T-Tumorzellen (CEM) (2 χ 10⁶ Zellen/ml) bei 37⁰C während 2 h m:t Emetin - HCl allein behandelt, beträgt die Konzentration des Salzes zwischen ίθ-⁴ bis 10~^ä M, und wenn dau Salz i'i Kombination mit Actinomycin D verwendet wirJ, betragen die Konzentrationen des Salzes und von Actinomycin D vorzugsweise 10-⁴ bis 10-⁵ M bzw. 0,05 bis 2,0 μg/ml.

Stufe C

Die oben hergestellten Lymphokin-bildenden humanen T-Zellen und humane akute Leukämiezellen, deren Wachstum mittels eines Proteinsyntheseinhibitors oder einer Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors und

eines ftNA-Syntheseinhibitors inhibiert wurde, werden in Gegenwart eines geeigneten Fusiönsbesch'eunigers fusioniert.

Das Verhältnis der Anzahl der Zellen von Human-T-Zellen zu humanen akuten Leukämiezellen bei der

Fusionsstufe beträgt 1 :1 bis 20 :1 und vorzugsweise 2:1 bis 15:1.
Geeignete Fusionsbeschleuniger, die man erfindungsgemäß verwenden kenn, sind Polyethylenglykol (PEG), Polyvinylalkohol und Viren mit einer Zellfusionsfähirjkeit, insbesondere Paramyxoviren, zu denen Sendai-Virus (HVI) gehört und de s-ien inaktiviertes Produkt. Im allgemeinen wird PEG mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 bis 4000 verwendet.

Stufe D

Lebend-Zellen der oben erhaltenen fusionierten Zellen werden auf eine Konzentration von 10⁵ bis 2 χ ΙΟ⁶ Zellen/ml gebracht und auf einer »96Loch«-Kulturplatte enthaltend ein Nährmedium mit einer zugeführten Beschickungsschicht inkubiert.

Als Beschickungsschicht werden Humanzellen, deren Wachstum durch Antibiotika, wie Mitomycin C, oder durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen inhibiert wurde, verwendet.

Man kann jedes Nänrmedium verwenden, solange es ein Medium darstellt, auf dem humane akute Leukämiezellen wachsen können. Beispielsweise ist ein Medium geeignet, das man erhält, indem man I0°/oiges fötales Kalbsserum (FCS), 5 χ 10~⁵ M 2-Mercaptoethanol und 2 mMol Glutamin zu RPMI gibt (siehe Beispiel 1).

Eine Woche nach der Kultivierung sterben die humanen akuten Leukümiezellen und die Aufgabeschicht, die mit dem Inhibitor behandelt wurde, vollständig ab. und die fusionierten Zellen bleiben zurück, d. h. sie wachsen weiter.

Um die Bildung von fusionierten Zellen zu bestätigen, werden bekannte Methoden angewendet, nämlich (1) eine Analyse des Zelloberflächenantigens und (2) eine Analyse von Zeilkaryotypen.

Die überstehende Flüssigkeit über der Kultivierung, in welcher die fusionierten Zellen gewachsen sind, wird analysiert, um zu bestätigen, daß das gewünschte Lymphokin gebildet wurde.

Die so hergestellten fusionierten Zellen können während einer langen Zeit unter Aufrechterhaltung der

LyrnphokiriäkiiViiäi äübkümViert "werden. Durch KiCmcn rSi ei wciicf inn niügiii-ίι, ein enic »Suuiii'ic« wirksam bildendes Lymphokin zu erhalten.

Lymphokine erhält man durchi Kultivierung der Subline entweder in vitro oder in vivo. Diese Kultivierung kann in bekannter Weise durchgeführt werden. Beispiele für eine in vivo-Kultivierung schließen eine Rührkultiviermethode und eine stationäre Kultiviermethode unter Verwendung von Petrischalen und Rouxkolben ein.

Beispiele für eine in vivo-Kultivierung schließen Methoden ein, bei denen nackte Mäuse, nackte Ratten oder andere Tiere, denen man humane Tumorzcücn transplanticrt hatte, mit Hybridoma inokuliert unter Ausbildung eines festen Tumors oder eines Aszitentumors. Nach einer geeigneten Wachstumsperiode werden die Asziten und/oder Blut gesammelt. Bei einer weiteren Methode, die in der US-PS 42 76 282 beschrieben wird, wird ein Hamster, dessen Immunansprechung geschwächt ist, verwendet.

Subkultivierbare Lymphokin-bildende Human-T-Zellen-Hybridomas sind für die Massenherstellung von Lymphokinen geeignet, und weil die gewünschten Lymphokin-bildenden Zellen in großen Mengen verfügbar sind, kann man sie als Extraktionsquelle für Lymphokinproduktion-bezogene Gene (z. B. darin enthaltenen Messenger-RNA (mRNA)) anwenden. Es ist auch möglich, daß nach der Herstellung von Komplement-DNA (cDNA) aus dem extrahierten mRNA durch die Anwendung von Umkehrtranskriptase die Lymphokine unter Anwendung von Mikroorganismen (z. B. Bakterien, Hefe, Actinomyceten und Fungi) nach der üblichen genetischen Rekombinationstechnik zu gewinnen.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.

Beispiel 1
(1) Herstellung von Lymphokin-bildenden Human-T-Zel!en-Hybridomas

Humane periphere Blutlymphozyten (PBL) (HLA-A2, -Aw24, -B7, -Bw35, -Cw3, -Cw7) (10⁶ Zellen/ml) wurden mit 5 μg/ml ^DHA-P in einem RPMI-1640 Medium (Nissui Seiyaku Co, Ltd.), enthaltend 10% fötales Kalbsserum, 4 χ 10-⁵M 2-Mercaptoethanol und 2 mMol Glutamin (nachfolgend als RPMI-Medium bezeichnet) 2 Tage aktiviert Anschließend wurde das an die Zellen gebundene PHA-P entfernt, so daß das Niveau des vorliegenden PHA-P so niedrig wie möglich war.

10-⁵M Emetin· HCI wurde zu humanen akuten Leukämiezellen, CEM (HLA-Al, -Aw30, -B8, -B40) (2x10* Zellen/ml), die auf dem RPMI-1640-Medium (enthaltend 10% Serum von neugeborenem Kalb) gezüchtet worden sind, zugegeben. Nach einer 2-stündigen Behandlung bei 37° C wurde das in dem Medium enthaltende Emetin · HCI durch Zentrifugieren entfernt.

Das oben hergestellte PBL und CEM wurden in einem Verhältnis von 10:1 abgemischt, und die Mischung wurde dann unter Erhalt von Zellpellets zentrifugiert

Die Zellfusion wurde bei 37°C während 45 s durch Zugabe von 04 ml 46%igen Polyethylenglykols (PEG 1540), 15% Dimethylsulfoxid und 5 μg/ml Poly-L-arginin (Molekulargewicht: 60 000), durchgeführt Anschließend wurden 10 ml MEM-Medium enthaltend 25 mMol N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansuIfonsäure (HEPES)-puffer langsam zugegeben, und die Mischung wurde zentrifugiert und resuspendiert mit einem RPMI-Medium bis zu einer Zelldichte von 2 χ 10^s Zellen/ml.

Nach der Zellfusion wurde die Anzhal der Lebendzellen auf 2 χ 10⁵ Zellen/ml konzentriert und auf einer »96-Lochkulturplatte« enthaltend 0,2 ml RPMI-Medium pro Loch bei 37° C in einer Atmosphäre aus 5% CO₂ und 95% Luft kultiviert, wobei das RPMI-Medium als Aufgabeschicht CEM (8 χ 10⁴ Zellen/ml), die mit μπι/ml Mitomycin C bei 37° C während 30 min behandelt worden waren, enthielt (wenn nicht anders angegeben, erfolgt die Kultivierung der Zellen in allen nachfolgenden Beispielen bei 37° C in einer Atmosphäre aus 5% CO2 und 95% Luft). Eine Woche nach Beginn der Kultivierung wurde das Medium täglich gewechselt, um die Einflüsse, die durch die abgegebenen Substanzen verursacht wurden, auszuschalten.

Die Lymphokinaktivitlt wurde nach dem nachfolgend (2) beschriebenen Verfahren, gemessen unter Verwendung von Hybridomen aus einer der Vertiefungen in der Kulturplatte, bei denen man eine Proliferation beobachtet hatte.

Emetin-behandeltes CEM und Mitomycin-behandeltes CEM, die als Kontrolle verwendet wurden, starben innerhalb einer Woche vollständig ab.

(2) Kultivierung von Hybrido.nyis und Lymphotoxinaktivität £■

' I

Hybridome, die gemäß (I) erhalten worde waren, wurden in einem RPMI-Medium 1 1 ag in Gegenwart von ■■*■

20u.g/ml PHA-P kultiviert. Die Messung der Lymphotoxinaktivität in der überstehenden Flüssigkeit mit L-P3 (Si<~;ine von L-Zellen) als Targetzellen zeigte, daß zwei Hybridome (E-IO, F-8) aktiv waren. Diese Aktivitäten wurden langer als 3 Monate aufrechterhalten. Die Lymphotoxinaktivität wurde gemessen nach der von Y. Koto bayashi, J. Immunology, 122: 791 (1979) beschriebenen Methode. Hierzu wird eine Probe (25 μΙ) und 25 μΙ Actinomycin D (4 ng/ml) zu 50 μΐ von L-P3 (3 χ ΙΟ¹ Zellen), die zuvor auf einer Mikroplatte gebildet worden waren, gegeben und 20 bis 24 h bei 37°C kultiviert. Anschließend wurden die Zellen mit Glutaraldehyd fixiert und gefärbt und die morphologisch normalen Zellen wurden gezählt.

(3) Eigenschaftender Hybridome E-10 und F-8

(A) Analyse von Zelloberflächenantigen

Ϊ j I t_j3 131 L/C K(tl IM t, KJUU LIIK t~\ IiUIJrJL, 4.(1111,1 * S. I (T I. I IUUI If₁ tllll-J 1 IUVI V.Ji.1,11

nicht mit monoklonalem Antikörper OKT3 reagiert, daß jedoch humane T-Zellen mit OKT3 reagieren. Aufgrund dieser Feststellung wurde die OKT3-Reaktivität von Human-T-Zellhybridomas(E-10 und F-8) durch eine Zweistufenbindungsassay und einen Immunofluoreszenztest untersucht unter Verwendung von ^l23J-Protein A. Als Ergebnis wurde gefunden, daß CEM keine Reaktivität hatte, während E-IO und F-8 Reaktivitäten aufwiesen, die jeweils nahezu gleich der von PBL-T-Zellen und etwa 50% von PBL-T-Zellen betrug.

(2) Das HLA-Antigen für E-!0 und F-8 wurde durch Zwei-Stufenbindungsassay unter Verwendung von ¹²⁵]-Protein A untersucht. Es wurde festgestellt, daß PBL HLA-A2 und -Bw35 positiv war und daß CEM HLA-Al und-B8 positiv war, daß jedoch beide E-lOund F-8 HLA-Al,-A2 und-B8 positiv waren.

(B) Karyotyp-Analyse

Jie Anzahl der Chromosomen in CEM, E-10 und F-8 wurde bei 50 bis 80 Metaphasekernen gemessen. CEM enthielt 843 ± 0,9 (Mittelwert ± Standard) (Mittel aus 85) Chromosome. E-10 enthielt 95,5 ± 1,7(MiUeI aus 94) Chromosome. F-8 enthielt 81,5 ± 1,7 (Mittel aus 93) Chromosome. Es wurde somit sowohl bei E-10 als auch bei F-8 eine Erhöhung der Anzahl der Chromosomen um etwa 10 festgestellt.

Beispiel 2

Lymphokin-bildende Hybridom-Zellen E-10 (10⁶ Zellen/ml), die wie im Beispiel 1 erhalten wurden, wurden 1 Tag auf einem RPMI-Medium kultiviert. Die über der Kultur stehende Flüssigkeit wurde dann auf das Vierfache verdünnt. Die MIF-Aktivität der vierfach verdünnten Lösung wurde nach der Harrington-Methode, die von J.T. Harrington, Jr. et al. in J. Immunology, 110: S. 752 (1973) beschrieben wird, gemessen. Die Phagozytenmigrationsinhibierungsrate betrug für E-10 29,9%. Es wurde keine Aktivität für die über der Kultur stehenden Flüssigkeit von CEM, das unter den gleichen Bedingungen kultiviert worden war, festgestellt Die über der Kultur stehende Flüssigkeit, die durch eintägige Kultivierung von PBL (10⁷ Zellen/ml) auf einem HEPES-Puffer enthaltend Con A (10μg/ml) MEM-Medium erhalten worden war, zeigte eine Phagozytenmigrationsinhibierungsrate von 25,2%. Die MIF-Aktivität bei E-10 hielt langer als 6 Monate an.

Beispiel 3

5 x 10-⁵ M Emetin · HCl und 0,1 μg/ml Actinomycin D wurden bei 37°C im Laufe von 2 h zu CEM gegeben.

Das so behandelte CEM wurde mit PBL, das in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, fusioniert und dann wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 kultiviert. Emetin · HCl und Actinomycin D-behandeltes CEM starb vollständig ab, und man stellte nur eine Vervielfältigung von Hybridzellen fest

Die so erhaltenen Hybridom-Zellen wurden in gleicher Weise wie in Beispiel l-(2) kultiviert, und die Lymphotoxinaktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen. Man stellte fest, daß zwei Hybridom-zellinien (C-5, D-9) eine LT-Aktivität aufwiesen.

Beispiel 4

Lymphokin-bildende Hybridom-Zellinie E-10, erhalten wie in Beispiel 1, wurde durch die limitierte Verdünnugsmethode (0,5 Zellen/Vertiefung) in einem RPMI-1640-Medium, enthaltend eine Zugabeschicht CEM (2XlO⁵ Zellen/ml), die mit Mitomycin C wie in Beispiel 1 behandelt worden war und auch 20% Concanavalin A-

aktiviertes PBL als überstehende Flüssigkeit enthielt subkloniert unter Erhalt der Sublinie E-10-20.

Die so erhaltenen E-lO-20-ZeIIen wurden auf einem RPMI-Medium (10⁶ Zellen/ml) 1 Tag kultiviert, und die gebildete überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat (50 bis 100% gesättigt) ausgefällt und gegen Natriumphosphatpuffer, enthaltend 0,15 M NaCl (PBS, pH 7,2) dialysiert unter Erhalt einer Testprobe. Die MIF-Aktivität der Probe wurde wie im Beispie! 1 gemessen. Die Phagozytenmigrationsinhibierungsrate betrug 29,9%.

''■j Weiterhin wurde die MAF-Aktivität der Probe nach einem Verfahren gern, ssen, das eine Modifizierung der

C Methode von H.W. Murray et al. (J. Exp. Med. 153, S. 1690 (1981)) ist, also einem Verfahren, bei dem humane

j' Phagozyte-ähnliche Zellinie U937 (The Pharmaceutical Department of Tokyo University, Tokyo, Japan) umge-

0 setzt wird und die Freigabe von O2~ (Superoxidanion) nachgewiesen wird. Das heißt, daß im wesentlichen das

'.'■> gleiche Verfahren wie die Murray et al.-Methode wiederholt wurde mit der Ausnahme, daß 100 μΙ humane

'■■ Phagozyten-ähnliche Zellinie U937 (5 χ 10⁵ Zellen/ml) 48 h in Gegenwart oder in Abwesenheit der Testprobe

I:'. inkubiert wurdn. Es stellte sich heraus, daß 30% der gesamten U937-Zellen C^" in den Zellen abgaben,

\}-' wodurch gezeigt wird, daß diese Testprobe MAF enthielt.

!;<■; In gleicher Weise wie oben wurde CEM-Zellinie kultiviert und die über der Kultur stehende Flüssigkeit wurde

;.'; mit Ammoniumsulfat (50 bis 100%ige Sättigung) ausgefällt und gegen PBSdialysiert unter Erhalt einer weiteren

Probe. Die MIF-Aktivität dieser Probe wurde in gleicher Weise wie oben gemessen und betrug 9,9%. Ebenso wurde die MAF-Aktivität gemessen wie oben, wobei 21% der gesamten U937-Zellen O2~ in den Zellen freiga- ! ben.

Beispiel 5 (nachgereicht)

'. Die »subline« E-10-20, die gemäß Beispiel 4 erhalten worden war, wurde in einem RPMI-Medium bei einer

'!_ Zellpopulation von 10⁶ Zellen/ml während einem Tag kultiviert und die übersehende Flüssigkeit wurde mit |

:" Ammoniumsulfat (50 bis 100% Sättigung) ausgefällt und gegen PBS unter Erhalt einer Testprobe dialysiert. Die

[.■· MAF-Aktivität, ausgedrückt durch das Ansteigen der Tumorzellen Cytotoxizität, wurde nach der Methode von

j.' Cameron et al (Cameron, D.J. and W.H. Churchill; Journal of Clinical Investigation 63 977 (1979)) mit den unten

?>": angegebenen Modifizierungen bestimmt.

■' Bestimmung der MAF-Aktivität, ausgedrückt durch das Ansteigen der Tumorzelien

'.\ Cytotoxizität MAF-c-

; ' Das durch Ficoll-Urogafindichtegradienten-zentrifugieren gewonnene PBL wurde mit RPMI 1640 Medium,

I" enthaltend 20% Humanserum, auf 2,5 χ IO⁶ Zellen/ml verdünnt und ein Anteil von 200 μΐ wurde auf eine

V:. 96 Loch-Kulturplatte gegeben, die dann bei 37°C während 0,5 bis 2 Stunden inkubit-rt wurde und dann 3mal mit

j! RPMI-Medium gewaschen wurde.

fe Dann wurden die Phagozyten am Boden der Platte befestigt und RPMI 1640 Medium, enthaltend 20%

|r Humanserum, wurde in jedes Loch in einer Menge von 200 ml/Loch gegeben und 1 bis 7 Tage inkubiert. Nach

|- dem Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit und 2maligem Waschen mit RPMI-Medium, wurden 200 μΐ einer

Kj Probe auf das l.OOO.OOOfache mit RPMi 1640 Medium, enthaltend 20%iges Humanserium, verdünnt und 4 bis 24

1 Stunden zur Aktivierung der Phagozyten inkubiert. Die Anzahl der Phagozyten in jedem Loch betrug 2 χ 10⁴ bis I 1Ox 10⁴.

ε Außerdem wurden Target-Tumorzeüen (Humanleukemie T Zelünie TALL, Humanproerythroblastzellinie

pj K562 etc.) 20 Stunden in einem RPMI-Medium, enthaltend ³H-Thymidin, inkubiert, wobei man ³H-makierte

Target-Tumorzellen erhielt.

Dann wurden in ein Loch, enthaltend 2 χ IO⁴ bis 1Ox 10⁴ Zellen von aktivierten Phagozyten, ³H-markierte Target-Tumorzellen und RPMI-Medium so zugegeben, daß das Verhältnis der aktivierten Phagozyten (E) zu den ³H-markierten Target-Tumorzellen (T), d. h. E/T 5 bis 10 betrug, und das System wurde 2 Tage bei 37° C inkubiert Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert unter Verwendung einer Plattenzentrifuge und die überstehende Flüssigkeit von den Zellen abgetrennt. Dann wurde die Radioaktivität (cpm) der überstehenden Flüssigkeit unter Verwendung eines Flüssigkeitszintillationszählers gemessen. Die MAF-c Aktivität wurde nach folgender Gleichung berechnet

% MAF c = ^d'oaktivität der überstehenden Flüssigkeit — Radioaktivität der Kontrolle . -.
~~ Gesamtradioaktivität') — Radioaktivität der Kontrolle ²) ^x

') Gesamtradioaktivität: Radioaktivität (cpm) von 5 · 10⁵ Zellen der ³H-makierten Target-Tumorzellen. ^Μ

²J Radioaktivität der Kontrolle: Radioaktivität der überstehenden Flüssigkeit, die durch Zentrifugieren von RPMi-Medium,

enthaltend IO⁶Zellen und ³H-makierten Target-Tumorzellen, abzentriguriert worden war, und die 2 Tage bei 37⁰C kultiviert wurde.

Wurde eine TALL-Zellinie als Target-Tumorzelle in der Probe verwendet (1 000 000-fache Verdünnung) so zeigte sie eine M AG-c Aktivität von 88,1 %.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines subkultivierbaren Lymphokin-bildenden Human-T-Zell-Hybridoms unter Verwendung der Zellhybridisierungstechnik, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

A) Aktivieren einer humanen T-Zelle mit einem Mitogen oder Antigen unter Erythrozyten-Transformation der humanen T-Zellen und Bildung des gewünschten Lymphokins;

B) unabhängig davpn, Behandeln einer humanen akuten Leukämiezelle mit einem Proteinsyntheseinhibitor oder einer Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors und einem RNA-Syntheseinhibitor zur irreversiblen Inhibierung der Proteinsynthese der humanen akuten Leukämiezelle;

C) Fusion der so behandelten humanen akuten Leukämiezelle mit der so aktivierten humanen T-Zelle in Gegenwart eines Fusionsbeschleunigers und

D) Isolieren des so gebildeten Hybridoms.